CN114507272A - 牛赤羽病病毒疫苗 - Google Patents

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CN114507272A CN202210291441.6A CN202210291441A CN114507272A CN 114507272 A CN114507272 A CN 114507272A CN 202210291441 A CN202210291441 A CN 202210291441A CN 114507272 A CN114507272 A CN 114507272A
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bovine
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akabane virus
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贺笋
李俊辉
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张伟
张淑琴
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Tiankang Pharmaceutical Suzhou Co ltd
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种牛赤羽病病毒疫苗。本发明提供制备牛赤羽病病毒疫苗的蛋白，包括牛赤羽病病毒的G1蛋白和牛赤羽病病毒的G2蛋白，其中，编码G1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码G2蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。该蛋白适用于真核细胞表达系统，改变了牛赤羽病病毒疫苗活性成分制备的工艺，同时降低了成本。并且，该蛋白具有广谱抗原性，可以实现良好的交叉保护效果。

Description

牛赤羽病病毒疫苗
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种牛赤羽病病毒疫苗。
背景技术
赤羽病又名阿卡斑病(Akabane disease)，是由赤羽病病毒(Akabane virus，AKAV)所引起的牛、绵羊和山羊的一种多型性传染病，以牛、羊的流产、早产、死产及先天性关节弯曲和积水性无脑症(Arthrogryposis–Hydraencephaly，AH综合症)为特征，是危害反刍动物最重要的传染性病毒之一。目前的牛赤羽病病毒疫苗主要有以下形式：1、活疫苗为30℃下在Hmlu-1细胞上致弱的弱毒疫苗；2、灭活疫苗是将OBE-1株AKAV接种Hmlu-1细胞，出现细胞病变时收集细胞培养液，3000rpm离心10min，取上清应用或置于8℃低温保存备用，制备疫苗时加入0.1％福尔马林。上述两种方法均为常规方法，生产工艺复杂，需要耗费较多的人力物力，且引入动物源蛋白，对疫苗的安全性存在潜在风险。
目前国内该疫病流行广泛，造成了重大的经济损失。尚无该产品上市，有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛赤羽病病毒疫苗及其制备方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种免疫原性组合物，包含牛赤羽病病毒G1蛋白和G2蛋白。
本发明中，编码G1蛋白和G2蛋白的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
优选地，牛赤羽病病毒G1蛋白和G2蛋白是利用哺乳动物细胞(如CHO细胞)表达系统制备得到的。
第二方面，本发明提供一种牛赤羽病病毒疫苗及其制备方法，包含所述免疫原性组合物和佐剂。
所述疫苗中牛赤羽病病毒G1蛋白的含量为20-80μg/mL，G2蛋白的含量为20-80μg/mL。
优选地，所述疫苗中牛赤羽病病毒G1蛋白的含量为60μg/mL，G2蛋白的含量为60μg/mL。
所述佐剂可以是氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel01、Gel02、纳米佐剂、蜂胶、ISA206或ISA760VG，优选矿物油佐剂。
所述免疫原性组合物与所述佐剂的质量比为1:1。
第三方面，本发明提供牛赤羽病病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)用PBS溶液将牛赤羽病病毒G1蛋白和G2蛋白分别稀释成浓度为120μg/mL、120μg/mL；
2)将G1蛋白和G2蛋白溶液按体积比1:1混匀即为抗原液；将抗原液与矿物油佐剂按质量比1:1配苗，在31±1℃条件下，以150-350r/min搅拌30-60分钟，乳化成水包油包水型疫苗。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供的免疫组合物，牛赤羽病病毒G1蛋白和G2蛋白适用于真核细胞表达系统，可以稳定高产量表达，纯度高，抗原免疫性强，可有效应用于该病的研究和诊断。
(二)本发明提供的牛赤羽病病毒疫苗，其制备方法简单，且中和抗体结果明显，可有效激活机体的免疫反应，该疫苗生产成本低，广谱性强，对牛赤羽病起到理想的免疫保护作用。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和载体构建、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规实验条件和方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
本发明实施例中用到的主要试剂及仪器信息如下：
表1试剂及仪器信息表
Figure BDA0003560447700000041
实施例1 G1蛋白和G2蛋白的载体构建及免疫原性验证
1.表达G1蛋白和G2蛋白细胞株的构建
1.1基因合成
1.1.1 G1基因合成
从Geenbank上选用的牛赤羽病基因序列进行比对分析，根据CHO细胞密码子的偏嗜性，将G1基因序列进行密码子优化和修饰，并设计酶切位点，在G1序列的C端添加不同的信号肽序列，并带上His标签，最终得到SEQ ID NO.1。
将上述编码G1蛋白的核苷酸序列通过BamHI和NotI位点，插入到真核转移载体pcDNA3.1上，用T4 DNA连接酶在16℃过夜连接，经大肠杆菌感受态DH5a转化后涂布于含有氨苄青霉素的LB平板中，37℃培养过夜后挑取阳性菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒，鉴定无误后备用。
1.1.2 G2基因合成
从Geenbank上选用的牛赤羽病基因序列进行比对分析，根据CHO细胞密码子的偏嗜性，将G2基因序列进行密码子优化和修饰，并设计酶切位点，在G2序列的C端添加不同的信号肽序列，并带上His标签，最终得到SEQ ID NO.2。
将上述编码G2蛋白的核苷酸序列通过BamHI和NotI位点，插入到真核转移载体pcDNA3.1上，用T4 DNA连接酶在16℃过夜连接，经大肠杆菌感受态DH5a转化后涂布于含有氨苄青霉素的LB平板中，37℃培养过夜后挑取阳性菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒，鉴定无误后备用。
2载体构建：采用常规重组质粒构建流程。
2.1细胞转染
将上述两种质粒分别转染至生长良好全悬浮的CHO细胞，3日后进行细胞传代，并在培养基内加入800μg/ml的G418，加压至活率在30％左右时，停止加压。用常规的培养基培养，换入新的贴壁培养基培养7天，当细胞活率达到90％以上时，再加压筛选一次，同样细胞活率达到90％。
2.2单克隆细胞筛选
阳性克隆挑选和检测：培养7天后的平板中，将贴壁生长的细胞挑至96孔板中，利用贴壁培养基培养7天后，加入100mL悬浮培养基MSX表达培养2天，96孔板中培养液用于点杂交检测，检测其表达情况，将其中高表达克隆转至24孔板，利用贴壁培养基培养2天后换为MSX培养，培养基用于蛋白质印迹法检测，根据实验结果最终G1获得3株高表达克隆细胞株，分别命名为AKAG1-1、AKAG1-2、AKAG1-3；G2获得4株高表达克隆细胞株，分别命名为AKAG2-1、AKAG2-2、AKAG2-3、AKAG2-4，应用HPLC进行蛋白含量的检测，所筛选细胞株表达量在1.1～1.4mg/ml(详见表2)，所有细胞的培养条件为37℃，含5％CO2培养环境中培养。
表2筛选阳性细胞株的表达量
细胞株 表达量(mg/ml)
AKAG1-1 1.24
AKAG1-2 1.3
AKAG1-3 1.18
AKAG2-1 1.38
AKAG2-2 1.12
AKAG2-3 1.4
AKAG2-4 1.28
2.3蛋白表达
将经过筛选的CHO细胞在CHO培养基(含25μM MSX)或其它适宜培养基重悬细胞，细胞接种密度为0.3×106～0.5×106VC/ml，接种细胞于合适体积的细胞摇瓶，并置于37±1℃，含5％CO2摇床中进行摇瓶培养48～72小时，继续传代扩增培养细胞。
根据需要进行逐级生物反应器培养发酵，一般进行5～8倍放大，放大到特定体积时进行抗原的表达，在37±1℃培养至第5日将温度降至32±1℃，pH调整至7.5±0.1，并以适宜转速进行培养，在第4日和第9日加入10％起始工作体积的EG1G1icient G1eed，每日检测葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于2.5g/L时，补充葡萄糖到3～4g/L。当蛋细胞活率低于80％时，收获上清即为所需抗原。
通过优化该细胞株的培养条件、补料时间，补料量最终获得了1.1～1.6mg/ml的G1、G2蛋白表达。
根据检测结果，确定中和抗体值最高的蛋白组合为牛赤羽病病毒疫苗抗原组合，即AKAG1-2、AKAG2-3的组合，最终得到编码本发明免疫组合物的G1蛋白的核酸分子(SEQ IDNO:1)、G2蛋白的核酸分子(SEQ ID NO:2)。
实施例2抗原比例的确定
去细胞碎片将表达的蛋白分别定量后，与适宜的佐剂混合制备成疫苗，最终疫苗成品中含有不同剂量的G1+G2蛋白(10μg+10μg、20μg+20μg、30μg+30μg、40μg+40μg、50μg+50μg、60μg+60μg、70μg+70μg、80μg+80μg)/mL，免疫3～4月龄犊牛(健康易感，AKAV抗体阴性)，2ml/头，免疫21天后，采血检测中和抗体以确定最佳免疫剂量，结果显示第五组(50μg+50μg)可产生良好的中和抗体，第六组、第七组、第八组(60μg+60μg、70μg+70μg、80μg+80μg)从中和抗体最高值、最低值、均值来分析，三者中和抗体滴度差异不显著，为确保该发明产品的有效性，将该发明中的抗原剂量确定为60μg+60μg/头份(中和抗体结果见表3)。
表3试验分组及结果
Figure BDA0003560447700000071
实施例3疫苗的免疫保护效力
去细胞碎片将表达的蛋白分别定量后，与适宜的佐剂混合制备成疫苗，最终疫苗成品中G1、G2蛋白含量为60μg+60μg/mL。用健康3～4月龄犊牛(健康易感，AKAV抗体阴性)10只，其中5头犊牛免疫2ml/头的疫苗，另5头犊牛免疫相同剂量的生理盐水作为对照组。免疫后7日、14日、21日，攻毒后7日、14日采集免疫组、对照组血液，分别测定牛赤羽病病毒中和抗体，试验结果见表4、5。
免疫后同时进行攻毒，检测攻毒后采集口拭子和肛拭子监测排毒情况，结果见表6。
表4疫苗免疫后中和抗体滴度(SN)
Figure BDA0003560447700000081
表5疫苗免疫攻毒后中和抗体滴度(SN)
Figure BDA0003560447700000082
表6攻毒后试验动物排毒情况
Figure BDA0003560447700000083
Figure BDA0003560447700000091
注：“－”AKA核酸阴性；“+”AKA核酸阳性
结果显示，免疫组免疫后21天中和抗体均不低于1:256，攻毒后14日中和抗体均不低于1:1024，对照组在攻毒后7日抗体逐步转阳，感染抗体不高于1:16(见表5)。攻毒结果显示：免疫组攻毒后从口腔、肛门拭子中均未检测出排毒；而对照组在攻毒结束时仅有一头显示停止排毒，其他时间均排毒。该发明从序列的优化、载体的构建、阳性表达细胞的筛选、蛋白的表达、最佳抗原含量的确定、疫苗制备一系列环节后，证明了该发明制备的疫苗具有良好的免疫原性，免疫动物感染后能阻止排毒(见表6)。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
序列表
<110> 天康制药（苏州）有限公司
<120> 牛赤羽病病毒疫苗
<130> 2
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2512
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ggattcagat gagcagggcc gccaccatgg gcgtgaaggt gctgttcgcc ctgatctgca 60
tcgccgtggc cgaggcctcc aaggatctcc acagtgccac aatccatgag tttatcgctg 120
ccaatctcta ccctaacaac ttcaagaagc acctgacacc agccggtcca gactccatcc 180
aatggcggac atacatccat aacaacaacc tgcacctgtg taacgaccat gtggtaaaaa 240
tgatctgtag atgtgtgatc aagcaggagg aatgtggctc tactactgtt gacgacggtg 300
aacaaatcgt gcattattac aagcgaaaca aggaatttta taaggccgat ctggagatac 360
tttatactgt catctcacgc gcaattcctg ggttggtggg caacctcctg cggcaagtct 420
tgaagtctca aaaatatgat gagtctctgc acgtccttaa taagatcaag aaagatgtat 480
ctaaggtgaa tcagctgaat ggtatcgtgg agtttctgat acatatcaac tcaaagaaca 540
tcaccgagga agtgcgggaa ctcagaatca agcctgattt gtccatccgg gggtccaaat 600
tcaccacgaa gaattctggc acccccaaca tcaaggagtg tcaaacacca ctgtttatca 660
cctgcactgg aaaaaggttc cggtccctga ccaaacagta catcgcttgt tccaatgggg 720
gtgtcaagct ttaccagcgc cctaataaac ccttgacgct ggtcggggat aagttgtgta 780
tcggtgataa gtattgtatg atcgcatttg accctgcagt cgtggacgag aatatccaga 840
agctcgactg ctacagtctg gctgctactg accagagcaa tggcatgttg aagcctgaaa 900
ggagcatcag gctgctcaag actggagaat gcaagatcgc cggcgtcctc tcccggatag 960
ccgtgtccat caaccagaag aactataagt atactacaat agtgcacaaa aagtcagact 1020
tggttgatga atactgtctg tccccaaatt gcgacgtcga ctgttatcct tattactcag 1080
gtaatctggc cgactgttct tggagtgaaa gcactcactc aaccttgagc cagaaggtga 1140
taagtcacac cgacattgaa agctttatct ctagcatcaa gctgagcctg cacaacgatt 1200
tgatccagca tcactttcgc cctctcagta atatgcccca tatcaagcct aattttaaga 1260
gtatcaatgt ccaggggact attagtggca gcaaaatcca ggactcctac atcaccttct 1320
ccatcccact gatgacaggt ctctctcaag ggttcacact gcaggaccat aagggtaaca 1380
cccttttcga tatcatcgca tatgtcaaaa gcgcaagggt ggtggctact tacaatcatg 1440
actacaagac tggccccaca gtgagcatca acgtgcagca caacgagcag tgtacaggaa 1500
gctgtccaag caacatccct aagaaggaca attggttgac tttctctcga gaacatacat 1560
ccacttgggg gtgcgaggag tggggctgcc tggcaatcgg aacaggttgc gtgtatggct 1620
cctgtcagga tgtcattagg gaggaggcca ctgtgatctc aagagtgaac aatgagcagc 1680
tggaagtgga attttgcgta agtgagccaa cggggaccat gtgcaatact ataaacgttc 1740
ttgaacctgt actgggggag cacatgcagt ttgaagttca cggggtgcag accaatttgc 1800
tgcccgaggt cgctttgatt aagaatagga gagtatataa gggaagcatt aacaaaaagg 1860
gggtgttcaa tccacagtgc gggtcagtcc aatccttcga cgggaagctg tacggggttg 1920
gaaatcctaa gttcgactat atctgtcacg cactctcccg gaaagacatt gttgttagga 1980
agtgctacga gaaccactac tactcctgtg ctacacttaa ggaggctgtg gaaatcaaat 2040
ccaacatcac aaattcaaaa accatgctgt acaacgacaa tgcactcctt ggctccgcca 2100
gcatcaagat tatgctgggc gatctcatct accaacaggc ttccgtgcaa gaacgcgaca 2160
tccgcggtca cgccacttgt ggaggatgta ccgactgctt caatgatgtc gcctgtaagg 2220
tgagtatgac tagtaatggg gtgtaccagt gcccaatcgt ctcatcctgc gacagctaca 2280
tcaacaacgt ctacataaat gagggaacaa atgacgttag tctgaagttc cggtgcctca 2340
aggccgagat taaaatcagt atttgcggta aggagattcc agtgaaatca gaaatcataa 2400
aggacacaaa gaagctggac ctggccagcg ccgaccagac tagctacgtg aaggagtttg 2460
ataagaagtg tgcaacgtgg ttgtgcaggg catataacga gggggcggcc gc 2512
<210> 2
<211> 929
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ggattcagat gagcagggcc gccaccatgg gcgtgaaggt gctgttcgcc ctgatctgca 60
tcgccgtggc cgaggcctgt ttttatgggg gtaacatgtt cagacaaatc aacagtacaa 120
gccctatgag cgagatctgc gtccgggacg acatctctct tgtgaaatcc attggttacc 180
ataagctggc cgcaaatagg gaggtgatcg aatctagtat gtcctactat cgactgtact 240
acgtaaaaaa ctggtttgag tgcaatcccg tgcaagatat actgggaact tttatcgtgt 300
tcgatgtgaa tcacgagggc atcctcgcac caaaaacata cgcctgccgg gccacctgta 360
gcatcagcct ggagcgggat actggaaatg tagtgctgga atccccagcc ctgaaccact 420
acaccataca cggcactacc atcaagaatg ggtggttcaa gacaaaggtg agtatcgacc 480
tggacaacac ttgcgaagac cttcacatca cctgcgggca taagactctt aacgtccatg 540
catgtttcag acagcacaaa tcctgcatcc gctattttaa aggcagcatc ctccctgaga 600
ttatgatcga gtctatttgc acgaacgctg aattgatcct gttgtgttgc ttctccgcta 660
taagttgctt cgtcgctata atgctgacta aaacttacct tgtctatttg ctgattccta 720
tcttttaccc attcgtaaaa ctgtatggac tgctcctgct gagattctgc aaacagtgca 780
agaactgtct tcttcctatc cacccattct ccccttgccc aaccacctgt atctgtggaa 840
tggtttataa ctcatccgag gctctgaagg ttcatagaaa atgcctgaac tgcaccgggt 900
acaaaacctt gaccaagaca agggaattc 929

Claims (9)

1.免疫原性组合物，其特征在于，包含牛赤羽病病毒G1蛋白和G2蛋白，其中编码G1蛋白和G2蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述牛赤羽病病毒G1蛋白和G2蛋白利用哺乳动物细胞表达系统制备得到。
3.根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
4.牛赤羽病疫苗，其特征在于，包含权利要求1或2中所述的免疫原性组合物和佐剂。
5.根据权利要求3所述的牛赤羽病疫苗，其特征在于，所述疫苗中牛赤羽病病毒G1蛋白的含量为20-80μg/mL，G2蛋白的含量为20-80μg/mL。
6.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中牛赤羽病病毒G1蛋白的含量为60μg/mL，G2蛋白的含量为60μg/mL。
7.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel01、Gel02、纳米佐剂、蜂胶、ISA206或ISA760VG中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂为矿物油佐剂。
9.权利要求1-8中任一项所述的免疫原性组合物或牛赤羽病病毒疫苗在制备防治牛赤羽病病的药物制剂中的应用。
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