CN115850400A

CN115850400A - 纳米颗粒通用新冠疫苗及其制备方法

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Publication number: CN115850400A
Application number: CN202211654637.3A
Authority: CN
Inventors: 王希良; 王亚丽; 程晋霞; 宋娅莉; 徐骁; 邵军超; 刘昕阳; 王莉; 李世崇; 司炳银; 王立博
Original assignee: Beijing Jinuo Sanitary Products Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Jinuo Sanitary Products Technology Co ltd
Priority date: 2022-12-22
Filing date: 2022-12-22
Publication date: 2023-03-28

Abstract

本发明公开了纳米颗粒通用新冠疫苗及其制备方法。本发明公开的纳米颗粒通用新冠疫苗，由序列表中SEQ ID No.7或SEQ ID No.10所示的蛋白质与铝佐剂、CpG佐剂混合得到。实验证明，本发明的纳米颗粒通用新冠疫苗免疫动物后血清中能够产生结合新型冠状病毒的抗体，本发明的疫苗针对不同新型冠状病毒变异株均能产生较好的交叉保护效果，并且在小鼠上抗原剂量只需要0.05μg即可。本发明的SEQ ID No.7或SEQ ID No.10所示的蛋白质及利用该蛋白质制备的疫苗具有很好的应用前景。

Description

纳米颗粒通用新冠疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域中，纳米颗粒通用新冠疫苗及其制备方法。

背景技术

冠状病毒是一类主要感染脊椎动物的有包膜的单股正链RNA病毒，因病毒包膜上有向四周伸出的突起，形如花冠而得名，广泛存在于人类、哺乳动物和鸟类宿主中。据悉，国际病毒分类委员会将冠状病毒分为四个属：α，β，γ和δ。β属冠状病毒又分A、B、C、D四个谱系，B谱系(又称Sarbecoviruses)包括新冠病毒(SARS-CoV-2)及其变异株、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)及其变异株、SARS相关的冠状病毒(SARSr-CoV)。

SARS-CoV-2席卷全球，给人类工作生活造成了巨大的影响，随着SARS-CoV-2在不同地区的传播，出现不同的变异株，疫情态势仍持续紧张。截至目前，传播力超强的变异株有alpha、beta、gamma、delta、lammda、omicron等变异株，未来很可能还有其它类型变异株出现。尽管研究表明接种新冠疫苗可有效预防发病和降低感染后重症率和死亡率，但国内外均出现疫苗接种后突破性感染的案例，有研究表明这些变异株对疫苗均有不同程度的免疫逃逸能力。研发高效广谱的β冠状病毒B谱系的通用疫苗。这样的疫苗不但能预防现在流行的SARS-CoV-2及其变异株的感染，也能预防未来再现的SARS-CoV感染或新发SARS相关冠状病毒的感染。

新冠病毒至今为止，中和表位主要集中在RBD区，NTD及S2区的中和表位只有1-2个，所以，利用S蛋白作为疫苗免疫原有机会活化RBD区外的NTD中和抗体，但一般难以活化针对S2的中和抗体，因为S2的中和表位太弱。但是S蛋白作为免疫原时，由于NTD将遮挡RBD区，导致中和抗体应答主要集中在RBD顶端的3-4个表位，而损失掉了另外4-5个中和表位，所以，总体而言是得不偿失；此外，由于S蛋白带入了大量的结合抗体表位，这些结合抗体基本上没有保护作用，有可能增加免疫致病风险，所以与基于S1亚单位、全长S蛋白及灭活和减毒疫苗相比，基于RBD的疫苗能在免疫动物体内诱导更高水平的中和抗体和T细胞免疫反应，和更低水平的非中和抗体或有害免疫反应。将来自于不同亚属β属冠状病毒的RBD进行串联或并联构成多特异性抗β属冠状病毒，拓宽免疫应答而增加攻击靶点，因而将更有效应对病毒的变异和逃逸，有可能成为预防新冠的通用疫苗。

铁蛋白作为维持细胞内铁代谢平衡的重要蛋白，广泛存在于动物、植物、微生物等多种生物中，铁蛋白纳米颗粒由24个铁蛋白亚基自组装而成笼状结构，其中每三个亚基组成一个三聚体亚单位，铁蛋白的N端伸向纳米颗粒的外面，容易与其它基因融合表达或者其它蛋白连接组装。融合的抗原蛋白展示于其表面，促进抗原被抗原呈递细胞识别、摄取，进而诱导更强的免疫反应，而且还具有生物相容性好，稳定性强、毒性低，可修饰等优点，使其可作为一种理想的抗原尤其是多聚化抗原的呈递平台用于新型亚单位疫苗的开发。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备通用纳米颗粒新冠疫苗以及如何预防或治疗新型冠状病毒肺炎。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质(名称记为PanANP)，所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签和/或信号肽得到的融合蛋白质。

其中，所述标签可为His，免疫球蛋白Fc段，三聚体标签以及纳米颗粒中的一种或多种。优选，纳米颗粒可包括铁蛋白、mi3、I53-50中的一种或多种。

较优选，所述蛋白质可为氨基酸序列是SEQ ID No.7的蛋白质，或将SEQ ID No.7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

最优选，所述蛋白质可为氨基酸序列是SEQ ID No.10的蛋白质，或将SEQ IDNo.10所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

上述A2)中的PanANP蛋白质，为与SEQ ID No.1所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A3)中的PanANP蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A3)中的PanANP蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.2或SEQ ID No.8或SEQ IDNo.9的第16-3264位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，SEQ ID No.2所示的DNA分子编码SEQ ID No.1所示的蛋白质，SEQ ID No.8所示的DNA分子编码SEQ ID No.7所示的蛋白质，SEQ ID No.9的第16-3264位所示的DNA分子编码SEQ ID No.10所示的蛋白质。

本发明还提供了与PanANP相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)编码PanANP的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系、或含有B2)所述表达盒的细胞系。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下b11)-b18)中的任一种：

b11)序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子；

b12)序列表中SEQ ID No.8所示的DNA分子；

b13)序列表中SEQ ID No.9的第16-2778位所示的DNA分子；

b14)序列表中SEQ ID No.9的第16-3264位所示的DNA分子；

b15)序列表中SEQ ID No.9的第7-3273位所示的DNA分子；

b16)序列表中SEQ ID No.9所示的DNA分子；

b17)与b11)或b12)或b13)或b14)或b15)或b16)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；

b18)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)或b15)或b16)或b17)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码PanANP蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的PanANP蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码PanANP蛋白质且具有PanANP蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码PanANP蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％ SDS中漂洗。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，B2)所述的含有编码PanANP蛋白质的核酸分子的表达盒(PanANP基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达PanANP蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动PanANP基因转录的启动子，还可包括终止PanANP基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述PanANP基因表达盒的重组载体。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为PKS001载体。

B3)所述重组载体具体可为PKSpanANP。所述PKSpanANP为将HindIII和NotI酶切位点间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.9的第7-3279位所示的DNA片段得到的重组载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。

上述生物材料中，所述细胞系可为动物细胞系。在本发明的一个实施例中，所述细胞系为CHO-K1Q细胞。

所述细胞系可不包括繁殖材料，也可包括繁殖材料。

本发明还提供了一种产品，所述产品的活性成分为PanANP或所述生物材料。

上述产品可为疫苗。所述疫苗可为冠状病毒疫苗。

PanANP或所述生物材料或所述产品的制备方法，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了冠状病毒疫苗的制备方法，所述方法包括：将PanANP与佐剂混合，即得到疫苗。

所述佐剂可为铝佐剂(如氢氧化铝佐剂)和/或CpG佐剂。

所述方法具体可包括将PanANP利用缓冲液溶解后与所述佐剂混合，所述缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述缓冲液中的浓度分别为20mM组氨酸盐酸，0.02％(体积百分比)聚山梨酯80，氢氧化钠调节pH至6.0。

上文中，所述冠状病毒可为新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒或蝙蝠冠状病毒。

具体的，所述冠状病毒可为新型冠状病毒SARS-CoV-2、严重急性呼吸综合征冠状病毒SARS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、CCoV-HuPn-2018、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、蝙蝠冠状病毒RaGT-RBD-his或SCH014。

PanANP或所述生物材料的下列F1)-F4)中的任一种应用，也属于本发明的保护范围：

F1)在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染引起的疾病的产品中的应用；

F2)在制备用于诱导冠状病毒抗原免疫反应的药剂中的应用；

F3)在制备预防冠状病毒感染引起的疾病的疫苗中的应用；

F4)在制备冠状病毒疫苗中的应用。

所述冠状病毒感染引起的疾病可为新型冠状病毒肺炎。

预防和/或治疗冠状病毒所致疾病的方法也属于本发明的保护范围，所述方法包括对动物施用PanANP或所述生物材料或所述疫苗，实现冠状病毒所致疾病的预防和/或治疗。

实验证明，本发明的PanANP免疫动物后血清中能够产生结合新型冠状病毒的抗体，利用PanANP与铝佐剂、CpG佐剂所得双佐剂疫苗针对不同新型冠状病毒变异株均能产生较好的交叉保护效果，并且在小鼠上抗原剂量只需要0.05μg即可。本发明的PanANP及所得疫苗具有很好的应用前景。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

附图说明

图1为PKSpanANP载体图谱。

图2为SDS-PAGE电泳检测目的蛋白。左侧泳道为目的蛋白的电泳(箭头所示为目的蛋白)，右侧泳道为蛋白分子量标准。

图3为纯化后的目的蛋白颗粒的透射电镜观察结果。

图4为针对新冠原始株假病毒RBD蛋白的结合抗体效价检测结果。

图5为针对新冠Delta株假病毒RBD蛋白的结合抗体效价检测结果。

图6为针对新冠Omicron Ba.4/5假病毒RBD蛋白的结合抗体效价检测结果。

图7为ELISpot结果。

图8为针对新冠原始株假病毒的中和试验结果。

图9为针对新冠Delta株假病毒的中和试验结果。

图10为针对新冠Omicron Ba.4/5假病毒的中和试验结果。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

PKS001载体：QuaCell产品，货号A13201。

CHO-K1Q细胞：QuaCell产品，货号A13101。

原始株假病毒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品，试剂盒名称为SARS-CoV-2-Fluc WT，货号为DD1746-01/02/03；

Delta株假病毒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品，试剂盒名称为SARS-CoV-2-Fluc B.1.617.2，货号为DD1754-01/02/03；

Omicron Ba.4/5假病毒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品，试剂盒名称为SARS-CoV-2-Fluc BA.4/BA.5，货号为DD1776-01/02/03。

实施例1、纳米颗粒疫苗的制备

本实施例采用SARSCoV2-RBD、SARS-RBD、两个蝙蝠冠状病毒RaGT-RBD、SCH014-RBD串联(SEQ ID No.1，其DNA序列为SEQ ID No.2)与幽门螺旋杆菌的铁蛋白(SEQ ID No.3，其DNA序列为SEQ ID No.4)融合表达自组装成纳米颗粒疫苗。将这段氨基酸序列加上信号肽序列(SEQ ID No.5，其DNA序列为SEQ ID No.6)后的融合蛋白记为PanANP，其序列为序列表中SEQ ID No.10，PanANP基因如序列表中SEQ ID No.9的第16-3279位所示。

SEQ ID No.10中，第1-24位为信号肽的氨基酸序列，第25-243位为SARSCoV2-RBD的氨基酸序列，第249-466位为SARS-RBD的氨基酸序列，第472-690位为RaGT-RBD的氨基酸序列，第696-913位为SCH014-RBD的氨基酸序列，第922-1083位为幽门螺旋杆菌的铁蛋白的氨基酸序列。

1、重组载体的构建

委托南京金斯瑞生物科技有限公司优化合成SEQ ID No.9所示的DNA分子，其包括酶切位点、Kozak序列、信号肽、目的基因以及终止密码子，全长共3287bp。该重组基因合成时进行了密码子优化以利于在中国仓鼠卵巢细胞Cricetulus griseus(CHO细胞)中表达。

SEQ ID No.9中，第1-6位为HindIII的识别序列，第3280-3287位为NotI的识别序列，第7-15位为Kozak序列，第16-87位为信号肽的DNA序列，第88-3273位为PanANP基因的序列。

将PKS001载体的HindIII和NotI酶切位点间的DNA片段替换为序列表中SEQ IDNo.9的第7-3279位所示的DNA片段，得到重组载体，将所得重组载体记为PKSpanANP(图1)，PKSpanANP能表达SEQ ID No.7所示的PanANP。

2、重组基因的表达

采用电转方式将目的DNA传递到CHO-K1Q细胞中，细胞按比例接种在96孔板中，通过添加筛选试剂，将未转进目的DNA的细胞杀死淘汰，最终含有目的基因的细胞会生成克隆池，通过ELISA法比较克隆池生物活性，挑选生物活性高的继续扩大培养；最后挑选活性较高的克隆池使用有限稀释法进行亚克隆，最终挑选出高表达的单克隆株，命名为A9。

将A9细胞株在从125mL摇瓶逐步放大到1L摇瓶中培养，当细胞活力为60％左右时停止培养收获细胞培养上清。

3、分离纯化

1)离心。将步骤2得到的高表达株的细胞培养液离心，8000转，20分钟，取上清液；

2)PBS预洗。用PBS将凝集素树脂(GNA)(EY LABORATORIES,INC，货号A-7401-2)清洗后，加入到上清液中(500ml上清液加入1ml GNA)，室温旋转2小时或4度过夜；

3)混合液倒在柱上；

4)用10mlPBS洗涤；

5)加入10ml洗脱缓冲液(1.0Mα-D-甲基甘露糖苷)，并在室温下旋转10-15分钟；

6)收集洗脱液并保存在冰上；

7)重复洗脱两次以上(一次洗脱得到>90％的产率，第二次洗脱可加入5ml；

8)合并所有洗脱液；

9)SDS-PAGE电泳检测洗脱液中目的蛋白。

目的蛋白条带大小为135KD，结果如图2所示，结果显示，所得洗脱液中含有目的蛋白PanANP，且具有较高的纯度。

4、纳米颗粒状态

将3中获得的纯化的目的蛋白采用透射电镜进行颗粒形态的拍摄。

为了拍摄电镜图片，纯化后的目的蛋白颗粒在上镜前进行了负染，具体负染操作如下：将超薄碳膜利用Harrick Basic Plasma Cleaner PDC-32G-2仪器进行预抽真空3min，然后medium挡位辉光放电30s，取出。移液枪取4μm样品滴到碳膜上，水平放置1min后，用滤纸吸干，然后滴加7μm 2％的醋酸铀，放置1min，用滤纸吸干，放置一分钟后进行电镜拍摄。

透射电镜观察结果图3所示，在放大至150000倍时，可观察到符合目标大小(粒径约15-20nm)的圆形颗粒，多数颗粒呈现出较为均匀的分布状态。

实施例2、疫苗组的筛选及免疫原性研究

本实施例以实施例1制备的融合蛋白PanANP为免疫原，检测其免疫原性。

1、疫苗的制备

将实施例1制备的融合蛋白PanANP利用缓冲液(20mM组氨酸盐酸，0.02％聚山梨酯80pH6.0)稀释后与氢氧化铝佐剂和/或CpG1018佐剂混合，得到疫苗1-7。疫苗1与2为单佐剂疫苗溶液，疫苗1的佐剂为氢氧化铝佐剂，疫苗2的佐剂为CpG1018佐剂；疫苗3-7为双佐剂疫苗溶液，佐剂均为氢氧化铝佐剂和CpG1018佐剂。含氢氧化铝佐剂疫苗溶液中的AL(OH)₃浓度均为500μg/mL，含CpG1018佐剂疫苗溶液中的CpG1018浓度均为100μg/mL。

氢氧化铝佐剂：长春生物制品研究所有限责任公司，批号：ZP18-003-202106。

CpG1018佐剂：广州锐博生物技术有限公司产品。

将各疫苗溶液无菌条件下分装入2ml西林瓶内(或预填充玻璃注射器内)，每瓶0.5ml(或1.0ml)，密封后放置于2～8℃避光保存。

2、动物免疫及免疫效果的检测

取出步骤1的疫苗溶液，以Balb/c小鼠(斯贝福(北京)生物技术有限公司)为动物模型进行免疫原性研究。具体步骤如下：

选择6-8周龄Balb/c雌性小鼠随机分组，设置疫苗1组、疫苗2组、疫苗3组、蛋白组和佐剂组，每组5只小鼠。疫苗1组小鼠肌肉注射(i.m)疫苗10.1ml进行免疫，疫苗2组小鼠肌肉注射疫苗20.1ml进行免疫，疫苗3组小鼠肌肉注射疫苗30.1ml进行免疫，蛋白组小鼠肌肉注射实施例1制备的融合蛋白PanANP(溶于PBS中)0.1ml进行免疫，佐剂组小鼠肌肉注射PBS0.1ml作为对照。第0、21天免疫，21天共免疫两次，第35天采血，采血后取脾脏。

表1、PanANP疫苗不同处方免疫小鼠的免疫方案

组别	免疫原	佐剂	免疫体量
				佐剂组	PBS	-	0.1ml
蛋白组	PanANP1μg		0.1ml
				疫苗1组	PanANP1μg	50μg AL(OH)<sub>3</sub>	0.1ml
疫苗2组	PanANP1μg	10μgCpG1018	0.1ml
				疫苗3组	PanANP1μg	50μg AL(OH)<sub>3</sub>+10μgCpG1018	0.1ml

采用ELISA方法检测血清中的抗原始株RBD-his、Delta RBD-his、Omicron4/5RBD-his蛋白的抗体滴度(即total IgG)，采用ELISPOT法检测脾细胞中的细胞免疫水平，主要IFN-γ的表达。具体操作如下：

ELISA检测血清结合抗体滴度：

1)包被：取原始株RBD-his、Delta RBD-his、Omicron Ba.4/5RBD-his、SARS-RBD-his、两个蝙蝠冠状病毒RaGT-RBD-his、SCH014-RBD-his蛋白抗原原液(RBD-his、DeltaRBD-his、Omicron4/5RBD-his均为义翘神州生物技术有限公司产品；SARS-RBD-his(由SEQID No.10的第249-466位连接8HIS标签得到)、RaGT-RBD-his(由SEQ ID No.10的第472-690位连接8HIS标签得到)、SCH014-RBD-his(由SEQ ID No.10的第696-913位连接8HIS标签得到)由申请人制备得到)用ELISA包被液(1×)分别稀释到1000ng/mL，包被酶标版，100μl/孔，4℃放置过夜。

2)封闭：将包被板从2-8℃取出后，洗板3次，每次洗液体积为300μl/孔，洗完后若孔内残留洗液，则要在吸水纸上拍干；然后在已包被孔中加入预先配制的封闭液，300μl/孔，盖封板膜，37℃，60-90min。

3)血清稀释：在离心管内用样品稀释液将待检血清稀释至合适浓度。

4)加样：将封闭后的包被板洗板3次，每次洗液体积为300μl/孔，洗完后若孔内残留洗液，则要在吸水纸上拍干。将已稀释好的各个浓度的待检样品依次加入至样品孔中，100μl/孔；加入100μl样品稀释液作为空白对照(Blk)，设置5个复孔，盖上封板膜，37℃孵育60min。

5)加二抗：弃去样品，洗板3次，每次洗液体积为300μl/孔，洗完后若孔内残留洗液，则要在吸水纸上拍干；加入稀释后的二抗(羊抗鼠IgG：金斯瑞，货号A00612)，100μl/孔，盖封板膜，37℃孵育60min。

6)显色：将96孔板洗板3次，每次洗液体积为300μl/孔，洗完后若孔内残留洗液，则要在吸水纸上拍干，加单组分TMB显色液1(提前从2-8℃取出，平衡至室温)，100μl/孔，25℃避光显色，15min。

7)终止：显色后立即加入终止液终止反应，50μl/孔，轻晃混匀。

8)检测：将酶标板放入酶标仪，在450nm波长下测吸光度值。

9)判定：大于阴性小鼠OD值的2.1倍判为阳性。

结果见表2和图4-6，从ELISA结果可以看出，PanANP 1μg+50μg AL(OH)₃+10μgCpG1018这种疫苗组合所得血清针对原始株、Delta株、Omicron Ba.4/5株RBD蛋白结合抗体效价最佳，优于单抗原组(蛋白组)和单佐剂组。其中加铝佐剂组(疫苗1组)和加CpG1018组(疫苗2组)优于单抗原组(蛋白组)，显示铝佐剂和CpG1018佐剂在增强体液免疫方面发挥重要作用。

此外，从表3的ELISA结果可以看出，PanANP 1μg+50μg AL(OH)₃+10μgCpG1018这种疫苗组合所得血清针对SARS、两个蝙蝠冠状病毒RaGT、SCH014均有较好的交叉保护效果。

表2、不同处方PanANP疫苗免疫小鼠针对不同新冠变异株ELISA结果

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表3、PanANP疫苗免疫小鼠针对不同冠状病毒ELISA结果

小鼠脾脏ELISPOT检测方法：

根据Murine IFN-γSingle-Color Enzymatic ELISPOT Assay(CTL，货号mIFNgp-2M/2)试剂盒说明书对二免14d小鼠的脾淋巴细胞检测。具体步骤如下：

1)脾组织加入5ml小鼠淋巴细胞分离液，轻轻研磨，200目尼龙网过滤至洁净离心管中，在液面以上轻轻加入1mlPBS，以800g，30min，升速快降速慢离心，收集中间淋巴细胞层。

2)加入5ml PBS洗涤细胞，500g，离心5min，弃上清。

3)CTL-Test Medium(补充L-谷氨酰胺终浓度3mM)培养基重悬细胞，细胞计数(流式细胞仪计数)后调整细胞浓度为5×10⁶/ml。

4)准备2倍终浓度的CTL-Test Medium：样本管加入原始株RBD-his+Delta-RBD-his+Omicron Ba.4/5-RBD-his混合物(2倍终浓度10μg/ml)。铺到对应的ELISPOT板中，另外预留阴性对照孔(不加任何刺激物)和阳性对照孔(加入PMA和Ionomycin)。37℃，5％CO₂孵育20min。

5)加入细胞100μl/孔，相当于5×10⁵/孔，37℃，5％CO₂培养48h。

6)用200μl/孔PBS清洗板2次，再用200μl/孔0.05％Tween-PBS清洗板3次。

7)加入anti-murine IFN-γ检测液80μl/孔，室温孵育2h。

8)用200μl/孔0.05％Tween-PBS清洗板3次。

9)加入Tertiarysolution80μl/孔，室温孵育30min。

10)用200μl/孔0.05％Tween-PBS清洗板2次，再用200μl/孔纯水清洗板2次。

11)加入Blue Developer Solution 80μl/孔，室温孵育15min。

12)倒掉液体，用纯水冲洗孔板3次终止反应。

13)ELISPOT板读值。

从图7ELISpot结果可以看出，PanANP 1μg+50μg AL(OH)₃+10μgCpG1018这种疫苗表达IFN-γ因子细胞数最多，优于单抗原组和单佐剂组，并且单佐剂CpG1018组(疫苗2组)优于单铝佐剂组(疫苗1组)和单抗原组(蛋白组)，从而进一步证明CpG1018佐剂在增强细胞免疫方面发挥重要作用，并且铝佐剂和cpg佐剂发挥了协同作用，进一步证明双佐剂疫苗无论在体液免疫还是细胞免疫方面都是最优的。

以上结果显示，本发明获得的PanANP蛋白免疫原性非常好，可作为潜在的重组新冠疫苗抗原。

3、抗原剂量对免疫效果的影响

选择6-8周龄Balb/c雌性小鼠随机分组，设置疫苗4组、疫苗5组、疫苗6组、疫苗7组和佐剂组，每组5只小鼠。疫苗4组小鼠肌肉注射步骤1的疫苗4 0.1ml进行免疫，疫苗5组小鼠肌肉注射步骤1的疫苗5 0.1ml进行免疫，疫苗6组小鼠肌肉注射步骤1的疫苗60.1ml进行免疫，疫苗7组小鼠肌肉注射步骤1的疫苗7 0.1ml进行免疫，佐剂组小鼠肌肉注射PBS0.1ml作为对照(表4)。第0、21天免疫，21天共免疫两次，第35天采血，采血后取脾脏。

表4、PanANP疫苗不同处方免疫小鼠的免疫方案

组别	免疫原	佐剂	免疫体量
				佐剂组	PBS	-	0.1ml
疫苗4组	PanANP0.05μg	50μg AL(OH)<sub>3</sub>+10μgCpG1018	0.1ml
				疫苗5组	PanANP 0.1μg	50μg AL(OH)<sub>3</sub>+10μgCpG1018	0.1ml
疫苗6组	PanANP 0.5μg	50μg AL(OH)<sub>3</sub>+10μgCpG1018	0.1ml
				疫苗7组	PanANP 1μg	50μg AL(OH)<sub>3</sub>+10μgCpG1018	0.1ml

假病毒中和试验：

按照步骤2中ELISA检测血清结合抗体滴度的方法，将原始株RBD-his、Delta RBD-his、Omicron4/5RBD-his蛋白抗原原液分别替换为新冠原始株假病毒、Delta株假病毒、OmicronBa.4/5假病毒，其他步骤均不变，检测血清的中和效价。

结果见表5和图8-10，从假病毒中和试验结果可以看出，0.05μg PanANP就能达到很好的效果，针对新冠原始株假病毒中和抗体效价均值为6860，针对新冠Delta株假病毒中和抗体效价均值为5858，针对当前最为流行的新冠Omicron Ba.4/5株假病毒中和抗体效价均值为4158。由此可以看出，本发明的双佐剂疫苗针对不同新冠变异株均能产生较好的交叉保护效果，并且在小鼠上抗原剂量只需要0.05μg即可。

表5、PanANP疫苗不同处方免疫小鼠的假病毒中和效价结果

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.蛋白质，其特征在于，为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述标签为His，免疫球蛋白Fc段，三聚体标签以及纳米颗粒中的一种或多种；优选，纳米颗粒包括铁蛋白、mi3、I53-50中的一种或多种；

较优选，所述蛋白质为氨基酸序列是SEQ ID No.7的蛋白质，或将SEQ ID No.7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

最优选，所述蛋白质为氨基酸序列是SEQ ID No.10的蛋白质，或将SEQ ID No.10所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

3.与权利要求1或2所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)-b18)中的任一种：

b11)序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子；

b12)序列表中SEQ ID No.8所示的DNA分子；

b13)序列表中SEQ ID No.9的第16-2778位所示的DNA分子；

b14)序列表中SEQ ID No.9的第16-3264位所示的DNA分子；

b15)序列表中SEQ ID No.9的第7-3273位所示的DNA分子；

b16)序列表中SEQ ID No.9所示的DNA分子；

5.一种产品，其活性成分为权利要求1或2所述蛋白质或权利要求3或4所述生物材料。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：所述产品为疫苗；

优选的，所述疫苗为冠状病毒疫苗。

7.权利要求1或2所述蛋白质或权利要求3或4所述生物材料或权利要求5或6所述产品的制备方法。

8.冠状病毒疫苗的制备方法，包括：将权利要求1或2所述蛋白质与佐剂混合，即得到疫苗。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述佐剂为铝佐剂和/或CpG佐剂。

10.权利要求1或2所述蛋白质或权利要求3或4所述生物材料的下列F1)-F4)中的任一种应用：

F2)在制备用于诱导冠状病毒抗原免疫反应的药剂中的应用；

F3)在制备预防冠状病毒感染引起的疾病的疫苗中的应用；

F4)在制备冠状病毒疫苗中的应用。