CN116327910A - 一种新冠病毒、流感病毒和/或rsv的联合疫苗、其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新冠病毒、流感病毒和/或RSV的联合疫苗、其制备方法与应用，所述联合疫苗包括：I、包括来自SARS‑CoV‑2的融合蛋白的新冠疫苗原液；II、包括来自流感病毒的血凝素的流感疫苗原液和III、包括来自RSV的融合蛋白的RSV疫苗原液中的至少两种，所述联合疫苗将野生型抗原进行突变，获得的融合蛋白具有更高的免疫原性、稳定性和安全性，多个病毒抗原联合应用，相互无抑制作用，并可以协同提高疫苗的免疫原性，广谱抗原，可同时刺激机体产生针对多种流行株的新型冠状病毒、多种亚型的流感病毒以及多种RSV亚型的体液或者细胞免疫保护效力。

Description

一种新冠病毒、流感病毒和/或RSV的联合疫苗、其制备方法与 应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及预防新型冠状病毒、流感病毒和RSV感染的新冠病毒、流感病毒和RSV的联合疫苗、其制备方法与应用。

背景技术

无论是下呼吸道感染还是上呼吸道感染，绝大部分是由病毒引起的，称病毒性呼吸道感染，常见的病毒包括新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、流感病毒和RSV。

新型冠状病毒(SARS-CoV-2，或者简称为新冠病毒)是一种单股正链的RNA病毒，基因组约为30KB，由内部的遗传物质RNA以及刺突蛋白(Spike Protein，S蛋白)、包膜蛋白(Envelop Protein，E蛋白)、膜蛋白(Membrane Protein，M蛋白)和核衣壳蛋白(Nucleoprotein，N蛋白)等构成。其中刺突蛋白(S蛋白)是形成病毒“冠状”形态的主要蛋白之一，介导SARS-CoV-2进入细胞，其在病毒粒子表面形成较大的皇冠状突起，高度糖基化，是病毒感染宿主细胞的武器。冠状病毒宿主特异性的重要决定因素就是位于囊膜表面的三聚体刺突糖蛋白。S蛋白可分为N端的S1亚单位和靠近病毒膜的C端S2区，跨膜区和一段小的胞内区。SARS-CoV-2的受体结合区(Receptor binding domain，RBD)位于S1的C端，约有240个氨基酸残基，可以与哺乳动物细胞上的受体ACE2(血管紧张素转换酶2，Angiotensinconverting enzyme 2)结合，并介导SARS-CoV-2病毒进入细胞，病毒进入细胞后，不断增殖的SARS-CoV-2病毒颗粒通过胞吐作用进入细胞外液中，进而感染其他宿主细胞。

流感病毒(Influenza virus)是流行性感冒病毒的简称。属于正黏液病毒科，为单链RNA膜病毒，其RNA含有八个片断。流感病毒的基因结构使其有不断交换基因片断进而形成优势变异的条件。根据核蛋白和膜表面蛋白抗原，它分为甲(A)、乙(B)、丙(C)和丁(D)型，流感病毒的外层有两种不同糖蛋白构成辐射状突起，即血凝素(H)和神经氨酸酶(N)。流感病毒的抗原变异就是指H和N抗原结构的改变。其中人类主要以甲型和乙型感染为主，甲型流感病毒最容易发生变异，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的。甲型流感病毒根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H可分为18个亚型(H1～H18)，N有11个亚型(N1～N11)。常见的乙型流感病毒包括BY和BV。

RSV是呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)的简称，于1955年首次被发现，属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)，肺炎病毒亚科(Pneumovirinae)，肺炎病毒属(Pneumovirus)，依据G蛋白的序列可分为A和B两个亚型。RSV为非节段性的负链RNA病毒，其基因组长度为15.2kb，有10个基因，共编码11种蛋白，包括非结构蛋白(NS1，NS2)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、RNA依赖RNA聚合酶(L)、转录延伸因子(M2-1)、调控因子(M2-2)和3种包膜糖蛋白(黏附蛋白(G)、融合蛋白(F)和小疏水蛋白(SH))。

RSV是引起呼吸道感染(Respiratory tract infection，RTI)的病毒性病原体，感染主要引起下呼吸道感染症状，其中严重症状的患者占有相当高的比例(如毛细支气管炎和肺炎)，需要住院治疗，具有较高的死亡率。RSV可以通过人与人之间接触传播，或者通过咳嗽或打喷嚏而吸入传播，也可通过接触污染物而获得感染，主要感染鼻腔以及肺部大、小气道的上皮细胞，也可能感染肺泡巨噬细胞和肺部其它类型的细胞，可引起细胞融合在一起形成合胞体。

根据现有的数据，新型冠状病毒、流感病毒和RSV的流行时间窗口有很大程度的重合。因而开发同时针对新型冠状病毒、流感病毒和RSV的联合疫苗将会在免疫接种方案和成本上提供极大的方便和优势。

然而，无论是SARS-CoV-2、流感病毒还是RSV，都是一种RNA病毒，容易在复制过程中出错，大量复制可引起多种变异，并且变异速度极快，因此经常会因为突变而出现免疫逃逸的现象，导致疫苗的保护性下降。随着新冠病毒、流感病毒和RSV的不断进化，现有疫苗的保护效果受到不同程度的影响。因此，研究和开发更为有效的、针对各种突变毒株的通用型疫苗对于预防新型冠状病毒、流感病毒和RSV感染具有重要的意义和广泛的临床应用前景。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种具有预防新型冠状病毒(SARS-CoV-2，或者简称为新冠病毒)、流感病毒和/或RSV感染，更为有效的、针对各种突变毒株的通用型疫苗，具体的，

本发明第一方面，提供一种联合疫苗，所述联合疫苗包括：I、包括来自SARS-CoV-2的融合蛋白的新冠疫苗原液；II、包括来自流感病毒的血凝素的流感疫苗原液和III、包括来自RSV的融合蛋白的RSV疫苗原液中的至少两种，其中，

I、所述来自SARS-CoV-2的融合蛋白包括SARS-CoV-2的刺突蛋白(S蛋白)RBD的突变蛋白，所述突变蛋白包括相对于野生型S蛋白RBD的突变，所述突变包括第28、99、126、128、134、142、166和/或168位中一个或者多个位点的突变；

II、所述血凝素来自至少一种流感病毒亚型；

III、所述来自RSV的融合蛋白包括pre-F蛋白的突变蛋白，所述突变蛋白包括相对于野生型pre-F蛋白的突变，所述突变包括第67、88、110、144、159、173、202、227、236、248、289、309、334、344、370、389、419和/或468位中一个或者多个位点的突变。

进一步的，所述组分I、II、III在下文进行更为详细的说明。

I、包括来自SARS-CoV-2的融合蛋白的新冠疫苗原液：

优选的，所述突变蛋白的突变包括取代、缺失和/或添加。

优选的，所述突变包括取代，更优选的，所述突变位点包括28、99、126、128、134、142、166和/或168位；

进一步优选的，所述突变蛋白包括选自下列残基取代的突变：R28T、K99N、K126T、G128S、L134R、N142K、E166A和/或F168V。

优选的，所述野生型S蛋白RBD参考序列如SEQ ID No.13所示，可以理解的是，不同亚型或者不同株病毒的野生型S蛋白RBD氨基酸不一定相同，可能会有替换、插入或者删除的突变，上述参考序列如SEQ ID No.13所示，但也可以是其它结构不同的野生型序列，其突变位点对应于SEQ ID No.13的上述位点，所述对应理解为基于氨基酸结构和/或功能分析后的对应关系。

更优选的，所述S蛋白RBD的突变蛋白包括下述任一种：

A1-I)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2-I)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1-I)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质，进一步优选的，所述氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加发生在第28、99、126、128、134、142、166和168位之外。

所述突变蛋白命名可为RBD8M蛋白。

本文所述取代可为保守性取代(也称为保守性替换)或非核心功能区的非保守性取代。本领域技术人员所公知，保守性取代或是在非核心功能区进行非保守取代，对蛋白质的功能通常不会产生质的影响。本文所述取代不包括本发明所述8个突变位点上的氨基酸残基的取代。

优选的，所述融合蛋白包括突变蛋白的N端和/或C端连接标签或信号肽。

本文所述连接标签包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、GST标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。

优选的，所述来自SARS-CoV-2的融合蛋白还包括多聚体标签蛋白(或者称之为多聚体标签)，所述多聚体标签蛋白使得突变蛋白与多聚体标签蛋白融合后形成多聚体。

所述多聚体优选为三聚体或二聚体。

所述三聚体标签蛋白可以使任意目的蛋白与三聚体标签蛋白融合后形成三聚体。

进一步地，所述三聚体标签蛋白可以使任意目的蛋白三聚体化，该目的蛋白与三聚体标签融合后形成的三聚体可以模拟其在体内生理状态发挥功能的结构，作为免疫原时针对这种三聚体结构产生的中和抗体更加有效。

进一步地，所述三聚体标签蛋白可为能够使本文任一所述突变蛋白或融合蛋白形成三聚体的任何多肽或蛋白质。

所述形成三聚体标签蛋白可为形成生物分子复合物，使三个相同的分子聚合成一个单一的三聚体。

所述三聚体标签蛋白包括但不限于T4噬菌体纤维蛋白(foldon)“折叠”三聚体结构域(T4Foldon)、源自酵母转录激活因子GCN4的异亮氨酸拉链和卷曲螺旋三聚体结构域、前胶原C－前肽结构域(Trimer-Tag)、大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase)的催化亚基、胶原蛋白XV的三聚体结构域、胶原蛋白XVIII的三聚体结构域、真核热休克转录因子的卷曲螺旋三聚体结构域等。

进一步地，所述三聚体标签蛋白具体可为T4噬菌体纤维蛋白(foldon)“折叠”三聚体结构域(T4Foldon)。

进一步地，所述T4Foldon的氨基酸序列可如SEQ ID No.4的第252-277位所示，或者上述序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.4的第252-277位所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。

优选的，所述多聚体标签蛋白可直接或通过接头连接在所述突变蛋白的N端或C端。

进一步地，所述三聚体标签蛋白可直接或通过接头连接在所述RBD8M蛋白的N端或C端。

进一步地，所述三聚体标签蛋白可通过接头连接在所述RBD8M蛋白的C端。

进一步地，所述接头(linker)可为柔性肽接头，如包括甘氨酸和/或丝氨酸残基的肽接头。所述接头可为GGGGS(SEQ ID No.9)、GSGSGSG(SEQ ID No.10)、GGGGSGGGGS(SEQ IDNo.11)或GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No.12)但不限于此。所述接头具体可为GSGSGSG(SEQID No.10)。

优选的，所述融合蛋白从N端到C端依次包括信号肽、突变蛋白、接头、多聚体标签蛋白和连接标签。

进一步地，所述来自SARS-CoV-2的融合蛋白可包括下述任一种：

B1-I)氨基酸序列包括SEQ ID No.4的第26-244位和第252-277位，或者包括SEQID No.4的第26-277位的蛋白质；

B2-I)将B1-I)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1-I)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

B3-I)在B1-I)或B2-I)的N端和/或C端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质；

其中优选，B3-I)所述融合蛋白质可包括下述任一种：

C1-I)氨基酸序列包括SEQ ID No.4的第1-277位的蛋白质或将SEQ ID No.4的第1-277位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ IDNo.4的第1-277位所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

C2-I)氨基酸序列包括SEQ ID No.4的蛋白质或将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.4所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。

B1-I)-B3-I)所述的融合蛋白命名可为RBD8M-T4Foldon三聚体融合蛋白(简称RBD8M-T4Foldon蛋白)。

SEQ ID No.4的第26-277位所示的RBD8M-T4Foldon蛋白是在SEQ ID No.1所示的RBD8M蛋白(SEQ ID No.4的第26-244位)的C端通过接头(GSGSGSG，SEQ ID No.10)(SEQ IDNo.4的第245-251位)融合三聚体标签T4Foldon(SEQ ID No.4的第252-277位)得到的三聚体融合蛋白。

B3-I)中所述信号肽的氨基酸序列可为SEQ ID No.4的第1-25位，所述信号肽的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第1-75位。

SEQ ID No.4的第1-277位所示的融合蛋白命名可为RBD8MFoldon蛋白，其是为了便于蛋白的分泌表达，在SEQ ID No.4的第26-277位所示的RBD8M-T4Foldon蛋白的N端融合了SEQ ID No.4的第1-25位所示的信号肽得到的融合蛋白。

SEQ ID No.4所示的融合蛋白命名可为RBD8MFoldon-his蛋白，其是为了便于蛋白的纯化和检测，在SEQ ID No.4的第1-277位所示的RBD8MFoldon蛋白的C端融合了His标签(8-HisTag，HHHHHHHH，SEQ ID No.8)得到的融合蛋白。其中，SEQ ID No.4的第1-25位为信号肽的氨基酸序列(即SEQ ID No.4的第1-25位)，SEQ ID No.4的第26-244位为RBD8M蛋白的氨基酸序列(即SEQ ID No.1)，SEQ ID No.4的第245-251位为接头序列(即GSGSGSG，SEQID No.10)，SEQ ID No.4的第252-277位为三聚体标签(T4Foldon)的氨基酸序列(即SEQ IDNo.4的第252-277位)，SEQ ID No.4的第278-285位为His标签序列(8-HisTag，即SEQ IDNo.8)。

所述联合疫苗中，来自SARS-CoV-2的融合蛋白(RBD8M-T4Foldon蛋白、RBD8MFoldon蛋白或RBD8MFoldon-his蛋白)的含量可为10-80μg/ml，可以是上述范围内的任一范围或者数值，例如具体可为10、12、15、18、20、25、30、35、40、42、45、48、50、55、60、65、68、72、76、80μg/ml，或者12-75、16-62、18-60、30-60μg/ml等等。

II、包括来自流感病毒的血凝素的流感疫苗原液:

优选的，所述流感病毒至少包括一种或者多种流感病毒亚型，更优选的，所述流感病毒来自甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒。

更优选的，所述流感病毒至少包括甲型流感病毒，例如H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8等等。

在一个具体的实施方式中，所述流感病毒至少包括H1N1和H3N2亚型；

更优选的，所述流感病毒包括甲型和乙型流感病毒。

在一个具体的实施方式中，所述流感病毒至少包括H1N1、H3N2亚型、乙型BY和BV亚型。

所述联合疫苗中，所述每种流感病毒亚型的血凝素含量为15-50μg/ml，可以是上述范围内的任一范围或者数值，例如具体可为15、18、20、22、25、18、30、35、40、45、48、50μg/ml。

III、包括来自RSV的融合蛋白的RSV疫苗原液：

所述来自RSV的融合蛋白包括pre-F蛋白的突变蛋白，所述突变蛋白包括相对于野生型pre-F蛋白的突变，所述突变包括第67、88、110、144、159、173、202、227、236、248、289、309、334、344、370、389、419和/或468位中一个或者多个位点的突变。

优选的，所述突变包括在第88位的突变，更优选的，所述突变包括在第88和289位的突变，或者包括在第88和389位的突变，进一步优选的，所述突变包括在第88、289、309和468位的突变；第67、88、144和389位的突变；或者在第67、88、110、144、289、309、389和468位的突变。

优选的，所述突变包括在第202和334位的突变，更优选的，所述突变包括在第202位、334和389位的突变，或者在第202位、289和334的突变；进一步优选的，所述突变包括在第159、202、248、334、344和389位，第67、110、144、202、227、248、334、344和389位，第159、202、289、334、344和468位，或者第67、110、144、159、202、236、248、289、309、334、370、389、419和468位的突变。

更为优选的，所述突变包括在143和144之间插入半胱氨酸。

优选的，所述突变包括替换、插入和/或缺失。优选的，所述突变包括替换，或者插入，更优选的，所述突变包括如下a1-III)-a19-III)中至少一种突变后得到的蛋白：

a1-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第67位的异亮氨酸突变为天冬酰胺；

a2-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第88位的丝氨酸突变为天冬酰胺；

a3-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第110位的半胱氨酸突变为丙氨酸；

a4-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第143位和第144位氨基酸之间插入；

a5-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列在第144位天冬酰胺突变为半胱氨酸；

a6-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第159位的酪氨酸突变为半胱氨酸；

a7-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第173位的半胱氨酸缺失；

a8-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第202位的丙氨酸突变为半胱氨酸；

a9-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第227位的异亮氨酸突变为天冬酰胺；

a10-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第236位的丝氨酸突变为精氨酸；

a11-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第248位的丝氨酸突变为半胱氨酸；

a12-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第289位的谷氨酸突变为天冬酰胺；

a13-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第309位的丝氨酸突变为天冬酰胺；

a14-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第334位的精氨酸突变为酪氨酸；

a15-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第344位的天冬酰胺突变为谷氨酸；

a16-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第370位的丝氨酸突变为甘氨酸；

a17-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第389位的天冬酰胺突变为半胱氨酸；

a18-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第419位的半胱氨酸突变为酪氨酸；

a19-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第468位的精氨酸突变为天冬酰胺。

上述突变位点和突变类型可以进行任一的组合，例如：

a1-1)所述突变包括在第88位的丝氨酸突变为天冬酰胺；

a1-2)所述突变包括在第88位和第289位的突变为天冬酰胺；

a1-3)所述突变包括在第88位的丝氨酸突变为天冬酰胺和第389位的天冬酰胺突变为半胱氨酸；

a1-4)所述突变包括在第202位的丙氨酸突变为半胱氨酸和第334位的精氨酸突变为酪氨酸；

a1-5)所述突变包括在第202位的丙氨酸突变为半胱氨酸、第334位的精氨酸突变为酪氨酸和第389位的天冬酰胺突变为半胱氨酸；或者，

a1-6)所述突变包括在第202位的丙氨酸突变为半胱氨酸、第289位的谷氨酸突变为天冬酰胺和第334位的精氨酸突变为酪氨酸。

所述Pre-F蛋白(或者野生型Pre-F蛋白)氨基酸参考序列如SEQ ID No.14所示，可以理解的是，不同亚型或者不同株病毒的野生型Pre-F蛋白氨基酸不一定相同，可能会有替换、插入或者删除的突变，上述参考序列如SEQ ID No.14所示，但也可以是其它结构不同的野生型序列，其突变位点对应于SEQ ID No.14的上述位点，所述对应理解为基于氨基酸结构和/或功能分析后的对应关系。

在一个具体的实施方式中，所述Pre-F蛋白包括如下任一种：

(A1-III)SEQ ID No.15-22所示的蛋白；

(A2-III)在(A1-III)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(A3-III)将(A1-III)-(A2-III)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；

(A4-III)与(A1-III)-(A2-III)任一种具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白。

优选的，所述来自RSV的融合蛋白还包括铁蛋白突变体；

所述铁蛋白突变体为将野生型铁蛋白氨基酸序列进行如下b1-III)-b3-III)中至少一种突变后得到的蛋白：

b1-III)将野生型铁蛋白氨基酸序列第15位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺；

b2-III)将野生型铁蛋白氨基酸序列第96位的丝氨酸突变为天冬酰胺；

b3-III)将野生型铁蛋白氨基酸序列第119位的酪氨酸突变为精氨酸；

优选的，所述野生型铁蛋白氨基酸参考序列如SEQ ID No.23所示，可以理解是，不同亚型或者不同株病毒的野生型铁蛋白氨基酸不一定相同，可能会有替换、插入或者删除的突变，上述参考序列如SEQ ID No.23所示，但也可以是其它结构不同的野生型序列，其突变位点对应于SEQ ID No.23的第15、96和/或119，所述对应理解为基于氨基酸结构和/或功能分析后的对应关系。

在一个具体的实施方式中，所述铁蛋白包括如下任一种：

(B1-III)SEQ ID No.24所示的蛋白；

(B2-III)在(B1-III)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(B3-III)将(B1-III)-(B2-III)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；

(B4-III)与(B1-III)-(B2-III)任一种具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白。

更进一步的，所述来自RSV的融合蛋白包括如下任一种：

(C1-III)SEQ ID No.25-32所示的蛋白；

(C2-III)在(C1-III)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(C3-III)将(C1-III)-(C2-III)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；

(C4-III)与(C1-III)-(C2-III)任一种具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

上述(A2-III)或(B2-III)或(C2-III)所述的融合蛋白中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述(A3-III)或(B3-III)或(C3-III)所述的融合蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为在上述a1-III)-a19-III)或b1-III)-b3-III)所述氨基酸突变位点以外进行不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述任一所述蛋白或融合蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

所述来自RSV的融合蛋白的含量为1-10μg/ml，可以是上述范围内的任一范围或者数值，例如具体可为1.0、1.5、2.0、2.4、2.8、3.0、3.6、4.0、4.2、4.8、5.0、5.4、5、8、6.0、6.2、6.6、6.8、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10μg/ml等等。

优选的，所述联合疫苗还可包括IV、佐剂(adjuvant)和/或V、疫苗递送系统(vaccine delivery system)。

IV、佐剂

所述佐剂可为一种可以刺激机体产生针对与其一同接种的抗原更强烈体液和/或细胞免疫应答的物质。本文所述佐剂可以是本领域技术人员公知的，包括但不限于：植物佐剂(如烷基胺、酚类成分、奎宁、皂角素、倍半萜、蛋白质、多肽、多糖、糖脂、植物血凝素等)、细菌佐剂(如霍乱毒素、大肠埃希菌不耐热毒素、细菌脂多糖等)、铝佐剂及其他无机成分佐剂(如钙佐剂)、细胞因子和核酸佐剂(如单核细胞克隆刺激因子、白细胞因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ、CpG基序、核酸载体等)、乳剂佐剂(如弗氏佐剂)。所述佐剂可为药学上可以接受的佐剂。在本发明的一个或多个实施方案中，所述佐剂为氢氧化铝佐剂(AL(OH)3佐剂)、CpG1018佐剂(购自广州锐博生物技术有限公司，批号0210426)、CpG-cjx1佐剂(序列为5’-TGACTGAACGTTTTAACGTCAGACTGA-3’，SEQ ID No.5)、CpG7909佐剂(序列为5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’，SEQ ID No.6)中的至少任一种。

优选的，所述疫苗原液：佐剂质量比为1：(40-60)，可以是上述范围内的任意范围或者任意值，例如1:40、1:42、1:45、1:48、1:50、1:52、1:55、1:58、1:60等等。

优选的，所述佐剂包括铝佐剂和/或CpG佐剂，更优选的，所述CpG佐剂包括CpG1018佐剂、CpG-cjx1和/或CpG7909佐剂。

进一步地，所述佐剂可为AL(OH)3(氢氧化铝)佐剂。

进一步的，所述佐剂包括铝佐剂和CpG双佐剂，更优选的，所述双佐剂中，所述铝佐剂与CpG佐剂的质量比可为(22-28):1，具体可为22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1或28:1，优选为25:1。所述铝佐剂为AL(OH)3(氢氧化铝)，所述CpG佐剂为CpG-cjx1佐剂。

所述联合疫苗中，铝佐剂的含量可为400-600μg/m，可以是上述范围内的任一范围或者数值，例如具体可为400、420、450、480、500、520、550、580、600μg/ml。

所述联合疫苗中，CpG佐剂的含量可为10-30μg/ml，可以是上述范围内的任一范围或者数值，例如具体可为10、12、15、18、20、23、26、28、29、30μg/ml等等。

本领域技术人员所熟知的是，为了增强抗原蛋白的免疫原性，除了加入具有免疫增强作用的化合物作为佐剂外，还可通过调整基因组合使之表达成颗粒性结构；或在体外加以聚团化，包入脂质体或胶囊微球中。

V、疫苗递送系统：

所述疫苗递送系统可为一类能够将抗原物质携带至机体的免疫系统，并在其中较长时间存储和发挥其抗原作用的物质。本文所述疫苗递送系统可为吕盐凝胶佐剂疫苗递送系统、乳剂佐剂疫苗递送系统、脂质体佐剂疫苗递送系统或纳米佐剂疫苗递送系统。

进一步的，所述联合疫苗还包括一种或者是多种药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂但不限于此。

本发明所述用于预防新型冠状病毒感染的疫苗可为肌肉内液体注射剂、静脉内液体注射剂、鼻腔内液体注射剂、皮内液体注射剂或皮下液体注射剂。

在一个具体的实施方式中，所述联合疫苗包括：

①、I、来自SARS-CoV-2的融合蛋白和II、来自流感病毒的血凝素，或者，

②、I、来自SARS-CoV-2的融合蛋白和III、来自RSV的融合蛋白，或者，

③、II、来自流感病毒的血凝素和III、来自RSV的融合蛋白，或者，

④、I、来自SARS-CoV-2的融合蛋白、II、来自流感病毒的血凝素和III、来自RSV的融合蛋白。

优选的，所述I、来自SARS-CoV-2的融合蛋白包括SEQ ID No.4所示的第26-244和252-277位或者SEQ ID No.4所示的第26-277位，所述来自SARS-CoV-2的融合蛋白的含量为10-80μg/ml，

所述II、来自流感病毒的血凝素来自于H1N1、H3N2亚型、乙型BY和BV亚型，每种亚型的血凝素含量为15-50μg/ml，

所述III、来自RSV的融合蛋白包括SEQ ID No.15-22的任意序列或SEQ ID No.25-32的任意序列，所述来自RSV的融合蛋白的含量为1-10μg/ml。

所述IV佐剂包括铝佐剂和/或CpG佐剂，铝佐剂的含量可为400-600μg/m，所述CpG佐剂的含量可为10-30μg/ml。

优选的，所述来自SARS-CoV-2的融合蛋白包括RBD8M-T4Foldon蛋白(SEQ ID No.4的第26-277位)、RBD8MFoldon蛋白(SEQ ID No.4的第1-277位)或RBD8MFoldon-his蛋白(SEQ ID No.4)。

本发明第二方面，提供一种上述联合疫苗的制备方法，所述制备方法包括：

1)制备包括来自SARS-CoV-2的融合蛋白的新冠疫苗原液；

2)制备包括来自流感病毒的血凝素的流感疫苗原液，和/或，

3)制备包括来自RSV的融合蛋白的RSV疫苗原液。

步骤1)-3)的进一步详细说明如下：

步骤1)、制备包括来自SARS-CoV-2的融合蛋白的新冠疫苗原液：

优选的，所述制备步骤1)包括：编码所述S蛋白RBD的突变蛋白的核酸分子在宿主细胞中进行表达得到所述突变蛋白，或使编码本文中任一所述来自SARS-CoV-2的融合蛋白的核酸分子在宿主细胞中进行表达得到所述融合蛋白，

优选的，所述方法可包括如下步骤：

H1-I)构建含有编码所述突变蛋白的核酸分子的重组表达载体；

H2-I)将所述重组表达载体导入宿主细胞，得到重组细胞；

H3-I)培养所述重组细胞，经分离和/或纯化得到所述突变蛋白；

或，所述方法可包括如下步骤：

G1-I)构建含有编码本文中任一所述融合蛋白的核酸分子的重组表达载体；

G2-I)将所述重组表达载体导入宿主细胞，得到重组细胞；

G3-I)培养所述重组细胞，经分离和/或纯化得到所述融合蛋白；

在上述制备方法中，本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

D1-I)编码上述任一S蛋白RBD的突变蛋白(RBD8M蛋白)的核酸分子；

D2-I)编码上述任一来自SARS-CoV-2的融合蛋白的核酸分子；

D3-I)含有D1-I)和/或D2-I)所述核酸分子的表达盒；

D4-I)含有D1-I)和/或D2-I)所述核酸分子的重组载体、或含有D3-I)所述表达盒的重组载体；

D5-I)含有D1-I)和/或D2-I)所述核酸分子的重组微生物、或含有D3-I)所述表达盒的重组微生物、或含有D4-I)所述重组载体的重组微生物；

D6-I)含有D1-I)和/或D2-I)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有D3-I)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有D4-I)所述重组载体的重组宿主细胞；

优选，所述核酸分子包括下述任一种：

E1-I)、编码序列包括SEQ ID No.2全长或者包括SEQ ID No.3的第76-732和754-831位，例如是SEQ ID No.2全长、SEQ ID No.3的第76-831位、SEQ ID No.3的第1-831位或SEQ ID No.3全长的DNA分子；

E2-I)、核苷酸序列包括SEQ ID No.2全长或者包括SEQ ID No.3的第76-732和754-831位，例如是SEQ ID No.2全长、SEQ ID No.3的第76-831位、SEQ ID No.3的第1-831位、SEQ ID No.3或SEQ ID No.7全长的DNA分子。

E3-I)、E1-I)或E2-I)的互补或者简并序列；

E4-I)、与E1-I)、E2-I)、E3-I)具有至少75％以上的同一性，并能编码上述任意融合蛋白的DNA分子。

进一步地，D3-I)所述表达盒、D4-I)所述重组载体、D5-I)所述重组微生物和D6-I)所述重组宿主细胞均可表达D1-I)和/或D2-I)所述核酸分子。

SEQ ID No.2所示的DNA分子可为对RBD8M蛋白(SEQ ID No.1)的核苷酸进行密码子优化，得到的编码RBD8M蛋白的DNA分子，其命名可为RBD8M基因。

SEQ ID No.3的第76-831位所示的DNA分子可为对RBD8M-T4Foldon蛋白(SEQ IDNo.4的第26-277位)的核苷酸序列进行密码子优化，得到的编码RBD8M-T4Foldon蛋白的DNA分子，其命名可为RBD8M-T4Foldon基因。

SEQ ID No.3的第1-831位所示的DNA分子可为编码RBD8MFoldon蛋白(SEQ IDNo.4的第1-277位)的DNA分子，其命名可为RBD8MFoldon基因。

SEQ ID No.3所示的DNA分子可为编码RBD8MFoldon-his蛋白(SEQ ID No.4)的DNA分子，其命名可为RBD8MFoldon-his基因。

SEQ ID No.7所示的DNA分子可为对三聚体融合蛋白RBD8Mfoldon(RBD8MFoldon-his)的编码序列(SEQ ID No.3)经密码子优化，并在两端增加EcoR I和Not I识别位点，最终优化得到的DNA分子。其中：SEQ ID No.7的第1-6位为EcoR I识别位点序列，SEQ ID No.7的第7-15位为Kozak序列，SEQ ID No.7的第16-90位为信号肽核苷酸序列(即SEQ ID No.3的第1-75位)，SEQ ID No.7的第91-747位为RBD8M基因的核苷酸序列(即SEQ ID No.2)，SEQID No.7的第748-768位为接头(GSGSGSG，SEQ ID No.10)的核苷酸序列，SEQ ID No.7的第769-846位为三聚体标签(T4Foldon)的核苷酸序列，SEQ ID No.7的第847-870位为His标签(HHHHHHHH，SEQ ID No.8)的核苷酸序列，SEQ ID No.7的第871-876位为2个终止密码子序列，SEQ ID No.7的第877-884位为Not I识别位点序列。

SEQ ID No.7的第16-870位即为SEQ ID No.3所示的DNA分子(RBD8MFoldon-his基因)。

所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2、SEQ ID No.3的第76-831位、SEQ ID No.3的第1-831位、SEQ ID No.3或SEQ ID No.7所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明中，D4-I)所述重组载体可为PKSRBD8MFoldonhis。

所述重组载体PKSRBD8MFoldonhis的载体图谱如图1所示，重组载体PKSRBD8MFoldonhis表达氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的RBD8MFoldon-his蛋白。

D5-I)所述重组微生物可为TOP10/PKSRBD8MFoldonhis。所述TOP10/PKSRBD8MFoldonhis是将所述重组载体PKSRBD8MFoldonhis导入TOP10感受态细胞得到的重组微生物。

D6-I)所述重组宿主细胞可为CHO/PKSRBD8MFoldonhis。所述CHO/PKSRBD8MFoldonhis是将所述重组载体PKSRBD8MFoldonhis导入CHO-K1Q得到的重组宿主细胞。

所述导入可为通过化学转化法(如Ca2+诱导的转化法、聚乙二醇介导的转化法或金属阳离子介导的转化法)或电穿孔转化法等任何已知的转化方法将携带本发明DNA分子的载体转化宿主菌；也可为通过噬菌体转导的方法将本发明DNA分子转导进入宿主菌。所述导入还可为通过磷酸钙共沉淀法、脂质体介导法、电穿孔法或病毒载体法等任何已知的转染方法将携带本发明DNA分子的载体转染宿主细胞。

更优选，H1-I)中所述核酸分子可为SEQ ID No.2所示的DNA分子，

更优选，G1-I)中所述核酸分子包括SEQ ID No.3的第76-732和754-831位，例如可为SEQ ID No.3的第76-831位、SEQ ID No.3的第1-831位、SEQ ID No.3或SEQ ID No.7所示的DNA分子。

G1-I)中所述融合蛋白可为RBD8M-T4Foldon蛋白、RBD8MFoldon蛋白或RBD8MFoldon-his蛋白。

进一步地，编码RBD8M-T4Foldon蛋白(SEQ ID No.4的第26-277位)的核酸分子可为SEQ ID No.3的第76-831位所示的RBD8M-T4Foldon基因；编码RBD8MFoldon蛋白(SEQ IDNo.4的第1-277位)的核酸分子可为SEQ ID No.3的第1-831位所示的RBD8MFoldon基因；编码RBD8MFoldon-his蛋白(SEQ ID No.4)的核酸分子可为SEQ ID No.3所示的RBD8MFoldon-his基因。

进一步地，所述宿主细胞可为CHO-K1Q细胞。

进一步地，所述导入可通过电转方式导入。

步骤2)、制备包括来自流感病毒的血凝素的流感疫苗原液：

优选的，所述步骤2)包括流感病毒扩增、收获、裂解和灭活。

更优选的，所述收获后对收获液进行澄清和过滤，获得澄清液，所述过滤包括初过滤和精细过滤。进一步优选的，所述初过滤膜孔径为1.0-3.0μm，优选为2.0μm，所述精细过滤膜孔径小于1.0μm，例如0.8、0.6、0.45、0.3μm等等。

更优选的，所述过滤步骤后包括对澄清液进行超滤浓缩获得浓缩液。进一步优选的，所述超滤浓缩包括用450-550KD，优选500KD的超滤膜分别对单价病毒澄清液进行超滤浓缩，将单价病毒澄清液浓缩至1/40-1/60，优选1/51体积，补加缓冲液进行循环洗滤。洗滤至单价病毒澄清液原倍体积后停止洗滤，浓缩至原倍体积的1/40-1/60，优选1/51体积后收获病毒浓缩液。在一个具体的实施方式中，所述缓冲液为0.01mol/L PBS。

更优选的，所述超滤浓缩步骤后对浓缩液离心，更优选的，所述离心采用蔗糖密度梯度离心法对单价病毒浓缩液进行离心纯化。

更优选的，所述离心纯化步骤后对离心液进行脱糖，获得单价病毒梯度后液。在一个具体的实施方式中，选用450-550KD，优选500KD的超滤膜对单价病毒离心液进行洗滤脱糖。洗滤至单价病毒离心液的15-25，优选20倍体积，再浓缩至单价病毒浓缩液的原倍体积。即为单价病毒梯度后液。

更优选的，所述步骤2)还包括纯化步骤，所述纯化步骤可以在收获后、裂解后，或者灭活后。进一步优选的，所述纯化包括层析纯化，在一个具体的实施方式中，所述纯化步骤包括在脱糖步骤后进行层析纯化，进一步优选的，所述层析纯化中按照1：(3500-4500)，优选1:4000比例加入非离子型去污剂，例如吐温80进行层析纯化。

更优选的，所述裂解步骤包括用裂解剂对病毒液进行裂解，病毒液中蛋白浓度为0.5～2.5mg/ml。进一步优选的，所述裂解剂包括但不仅限于TritonX-100、去氧胆酸钠等等。

更优选的，所述灭活步骤包括灭活剂对病毒液进行灭活，获得单价原液，病毒液中蛋白浓度为0.5～2.5mg/ml。进一步优选的，所述灭火剂包括但不仅限于甲醛、β-丙内酯(BPL)等等。

更优选的，所述步骤2)还包括将单价原液进行混合获得裂解的多价流感疫苗原液。

步骤3)、制备包括来自RSV的融合蛋白的RSV疫苗原液：

优选的，所述步骤3)包括来自RSV的融合蛋白人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

更为优选的，生物表达的步骤包括：

H1-III)构建含有编码所述突变蛋白或者融合蛋白的核酸分子的重组表达载体；

H2-III)将所述重组表达载体导入宿主细胞，得到重组细胞；

H3-III)培养所述重组细胞，经分离和/或纯化得到所述突变蛋白或者融合蛋白。

在上述制备方法中，本发明还提供了以下生物材料：

本发明提供的生物材料为下述D1-III)-D5-III)中至少一种：

D1-III)编码上述突变蛋白或融合蛋白的核酸分子；

D2-III)含有D1-III)所述核酸分子的表达盒；

D3-III)含有D1-III)所述核酸分子的重组载体、或含有D2-III)所述表达盒的重组载体；

D4-III)含有D1-III)所述核酸分子的重组微生物、含有D2-III)所述表达盒的重组微生物、或含有B3-III)所述重组载体的重组微生物；

D5-III)含有D1-III)所述核酸分子的重组细胞系、含有D2-III)所述表达盒的重组细胞系、或含有D3-III)所述重组载体的重组细胞系。

所述突变蛋白或融合蛋白参见本发明第一方面III来自RSV的融合蛋白的定义。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA。

在一个具体的实施方式中，编码所述突变蛋白或融合蛋白的核酸分子包括E1-III)-E3-III)：

E1-III)、SEQ ID No.33-40任意序列的第1-1422或者全长所示的DNA分子；

E2-III)、E1-III)的互补或者简并序列；

E3-III)、与E1-III)或E3-III)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述融合蛋白的DNA分子。

进一步地，D2-III)所述表达盒、D3-III)所述重组载体、D4-III)所述重组微生物和D5-III)所述重组宿主细胞均可表达上述突变蛋白、融合蛋白和/或D1-III)所述核酸分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述蛋白或融合蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码上述突变蛋白或融合蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述突变蛋白或融合蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

所述同一性是指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.15-32所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，具有80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述蛋白或融合蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动上述蛋白或融合蛋白编码基因序列转录的启动子，还可包括终止上述蛋白或融合蛋白编码基因序列转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

上述步骤1)和3)的生物材料中，

本文所述载体是指能够把外源DNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒等)。在本发明的一个或多个实施方案中，所述载体为pUC57载体和/或pKS001载体。

本文所述微生物可为细菌、真菌、放线菌、原生动物、藻类或病毒。其中，所述细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)等但不限于此，例如所述细菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。在本发明的一个或多个实施方案中，所述微生物为TOP10感受态细胞。

本文所述宿主细胞(也称为受体细胞)可为植物细胞或动物细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在宿主细胞的范围中。合适的宿主细胞为本领域已知的，其中：所述植物细胞可为拟南芥(Arabidopsisthaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)等植物细胞但不限于此；所述动物细胞可为哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK细胞)、小鼠乳腺癌细胞(C127细胞)、人胚胎肾细胞(HEK293细胞)、人HeLa细胞、成纤维细胞、骨髓细胞系、T细胞或NK细胞等)、禽类细胞(例如鸡或鸭细胞)、两栖类细胞(例如非洲爪蟾(Xenopuslaevis)细胞或大鲵(Andrias davidianus)细胞)、鱼类细胞(例如草鱼、鲤鱼、虹鳟鱼或鲶鱼细胞)、昆虫细胞(例如Sf21细胞或Sf-9细胞)等但不限于此。在本发明的一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为CHO-K1Q细胞。

在一个具体的实施方式中，所述步骤1)或3)包括如下步骤：将编码所述来自新冠病毒或RSV的突变蛋白或融合蛋白的核酸分子导入CHO K1Q细胞，得到重组细胞；培养所述重组细胞，得到所述突变蛋白或融合蛋白。

更进一步的，所述蛋白或融合蛋白的核酸分子通过重组质粒导入CHO K1Q细胞。

所述重组质粒为将所述突变蛋白或融合蛋白的核酸分子插入载体质粒后得到的质粒。

在本发明的具体实施例中，所述载体质粒为pKS001载体质粒。所述重组质粒为重组质粒pKS001-RSV-PreF-A-NP、pKS001-RSV-PreF-B-NP、pKS001-RSV-PreF-C-NP、pKS001-RSV-PreF-D-NP、pKS001-RSV-PreF-E-NP、pKS001-RSV-PreF-F-NP、pKS001-RSV-PreF-G-NP或pKS001-RSV-PreF-H-NP。

优选的，所述制备方法还包括步骤4)、将步骤1)、2)和/或3)的疫苗原液至少两种原液混合后，添加佐剂和缓冲液，以获得预期的浓度。

优选的，所述疫苗原液：佐剂质量比为1：(40-60)，可以是上述范围内的任意范围或者任意值，例如1:40、1:42、1:45、1:48、1:50、1:52、1:55、1:58、1:60等等。

更优选的，所述佐剂如本发明第一方面所定义。

更优选的，所述缓冲液包括PBS等。

本发明第三方面，还提供一种上述任一联合疫苗应用，所述应用包括下述任一种：

F1)在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2、流感病毒和/或RSV感染引起的疾病的产品中的应用；

F2)在制备用于诱导SARS-CoV-2、流感病毒和/或RSV抗原免疫反应的产品中的应用；

F3)在预防和/或治疗SARS-CoV-2、流感病毒和/或RSV感染引起的疾病中的应用；

F4)在用于诱导SARS-CoV-2、流感病毒和/或RSV抗原免疫反应中的应用；

F5)在预防SARS-CoV-2、流感病毒和/或RSV感染中的应用。

本文所述产品可为试剂或药物。

F1)和F2)中所述产品可为SARS-CoV-2、流感病毒和/或RSV抗体，包括全长抗体或抗原结合片段(如Fab片段、Fv片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、单链抗体(ScFv)、纳米抗体(单域抗体)、双特异性抗体或最小识别单位(MRU)等但不限于此)。

进一步地，所述SARS-CoV-2抗体可为特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)受体结合区(receptor binding domain，RBD)的中和抗体。所述中和抗体可为针对多种流行株的新型冠状病毒的高滴度中和抗体。

上述应用中，所述SARS-CoV-2、流感病毒和/或RSV感染引起的疾病可包括呼吸系统感染、消化系统感染、心血管系统感染、和/或神经系统感染等，

优选，所述呼吸系统感染可包括呼吸道感染和/或肺部感染，

优选，所述消化系统感染可包括肠道疾病、纳差、恶心、呕吐、腹痛和/或腹泻，

更优选，所述呼吸道感染可包括严重急性呼吸道综合征、低氧性呼吸衰竭、脓毒症、脓毒性休克、鼻咽炎、鼻炎、咽喉炎、气管炎和/或支气管炎，

更优选，所述肺部感染可包括肺炎和/或肺损伤，

更优选，所述肺炎可包括新型冠状病毒肺炎(COVID-19，简称新冠肺炎)。

SARS-CoV-2可以与表达于消化道黏膜上皮细胞的ACE2受体结合，进而累及消化道(李明松，刘占举，董卫国，田德安.关于炎症性肠病患者有效预防和治疗SARS-CoV-2感染的共识.现代消化及介入诊疗2020，25(2)：146-149.)。

本发明第四方面，还提供了一种产生免疫应答的方法，所述方法可包括给受试者施用上述任一的联合疫苗。

上述方法中，给受试者施用所述联合疫苗后，可在受试者中引发针对SARS-CoV-2、流感病毒和/或RSV的免疫反应。所述免疫反应可为细胞免疫反应，或体液免疫反应，或细胞免疫反应和体液免疫反应。

所述细胞免疫反应可包括B细胞免疫反应和T细胞免疫反应。

本文所述受试者可为人类或非人类动物。

进一步地，所述非人类动物可为非人类哺乳动物。

所述非人类哺乳动物可为小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪，犬，羊，猴，兔、猫、牛、马中的任意一种但不限于此。

本文所述受试者包括但不限于健康受试者、有症状感染受试者、无症状感染受试者或康复受试者(SARS-CoV-2、流感病毒和/或RSV感染后恢复的受试者)。

本文所述施用包括但不限于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、静脉注射、动脉注射、腹腔注射、微针注射、粘膜给药、口服、口鼻腔喷入或雾化吸入。

本发明第五方面，还提供一种预防和/或治疗SARS-CoV-2、流感病毒和/或RSV感染引起的疾病的方法，所述方法可包括给受试者施用所述联合疫苗。

上述方法中，所述SARS-CoV-2、流感病毒和/或RSV感染引起的疾病可包括呼吸系统、消化系统、心血管系统和/或神经系统感染。

上述方法中，所述呼吸系统感染可包括呼吸道感染和/或肺部感染。

上述方法中，所述呼吸道感染可包括严重急性呼吸道综合征、低氧性呼吸衰竭、脓毒症、脓毒性休克、鼻咽炎、鼻炎、咽喉炎、气管炎和/或支气管炎，所述肺部感染可包括肺炎和/或肺损伤。

上述方法中，所述肺部感染可包括新型冠状病毒肺炎(COVID-19，简称新冠肺炎)。

上述方法中，所述消化系统感染可包括肠道疾病、纳差、恶心、呕吐、腹痛和/或腹泻。

上述方法中，给受试者施用所述联合疫苗后，可在受试者中引发针对SARS-CoV-2、流感病毒和/或RSV的免疫反应。所述免疫反应可为细胞免疫反应，或体液免疫反应，或细胞免疫反应和体液免疫反应。

所述细胞免疫反应可包括B细胞免疫反应和T细胞免疫反应。

本文所述受试者可为人类或非人类动物。

进一步地，所述非人类动物可为非人类哺乳动物。

所述非人类哺乳动物可为小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪，犬，羊，猴，兔、猫、牛、马中的任意一种但不限于此。

本文所述受试者包括但不限于健康受试者、有症状感染受试者、无症状感染受试者或康复受试者(SARS-CoV-2感染后恢复的受试者)。

本文所述施用包括但不限于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、静脉注射、动脉注射、腹腔注射、微针注射、粘膜给药、口服、口鼻腔喷入或雾化吸入。

本发明第六方面，还提供上述生物材料本身，包括：

来自SARS-CoV-2的融合蛋白，所述融合蛋白见本发明第一方面I、来自SARS-CoV-2的融合蛋白的定义；

来自RSV的融合蛋白，所述融合蛋白见本发明第一方面III、来自RSV的融合蛋白的定义；

D1-I)-D6-I)，D1-III)-D5-III)分别所定义的核酸分子、表达盒、重组载体、重组微生物、重组宿主细胞和/或重组细胞系。

本发明第七方面，提供上述生物材料或利用上述生物材料获得的突变蛋白、融合蛋白和/或疫苗在如下Y1)-Y4)任一种中的应用：

Y1)作为免疫原；

Y2)制备抗新冠、流感和/或呼吸道合胞病毒的产品；

Y3)制备预防和/或治疗新冠、流感和/或呼吸道合胞病毒感染的产品；

Y4)制备预防和/或治疗新冠、流感和/或呼吸道合胞病毒所致疾病的产品。

本发明第八方面，提供包含上述生物材料的产品，所述产品包括例如疫苗或者药物组合物等等。

优选的，所述疫苗或者药物组合物包括本发明第一方面定义的佐剂、递送系统或药学上可接受的载体。

需要说明的是，本发明中的任意形式的编号，例如I、II、III、A、B、a、b、①、②等形式的编号仅仅是为了区分彼此而进行的命名，并不表明时间或空间的先后顺序，有另外说明除外。

本发明疫苗中，

新冠疫苗的设计是基于新型冠状病毒原始病毒RBD区域的抗原表位序列，同时分析后期发现的变异病毒的RBD区域中的关键抗原表位，通过比对SARS-Cov-2不同亚型的基因序列，参考已报道的SARS-Cov RBD蛋白三聚体结构相关研究，对SARS-Cov-2 RBD基因做了进一步的改造，设计了8个重要位点突变，得到突变蛋白(RBD8M蛋白，SEQ ID No.1)，在此基础上，通过引入三聚体标签T4Foldon(SEQ ID No.4的第252-277位)获得三聚体融合蛋白RBD8M-T4Foldon(SEQ ID No.4的第26-277位)，同时，为了更便于蛋白的分泌表达，在RBD8M-T4Foldon蛋白(SEQ ID No.4的第26-277位)的N端融合了信号肽(SEQ ID No.4的第1-25位)，得到RBD8MFoldon蛋白(SEQ ID No.4的第1-277位)，进一步在RBD8MFoldon蛋白(SEQ ID No.4的第1-277位)的C端融合8-HisTag得到RBD8MFoldon-his蛋白(SEQ ID No.4)以便纯化和检测。

虽然本发明设计构建了三聚体融合蛋白RBD8M-T4Foldon、RBD8MFoldon和RBD8MFoldon-his，但本发明不限于该特定融合蛋白序列，本领域技术人员可对三聚体融合蛋白中的三聚体标签、接头、信号肽和/或纯化标签进行替换。例如采用本领域公知的其他三聚体标签(如源自酵母转录激活因子GCN4的异亮氨酸拉链和卷曲螺旋三聚体结构域、前胶原C－前肽结构域(Trimer-Tag)、大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase)的催化亚基、胶原蛋白XV的三聚体结构域、胶原蛋白XVIII的三聚体结构域或真核热休克转录因子的卷曲螺旋三聚体结构域等)，只要该三聚体标签能够使本文所述突变蛋白(RBD8M蛋白)形成三聚体，并且得到的三聚体复合物与本发明所述融合蛋白功能相同，均可视为与本发明融合蛋白等同的融合蛋白，这些等同的融合蛋白均未脱离本发明的保护范围。

本发明利用CHO真核细胞表达体系，表达纯化RBD8MFoldon三聚体蛋白，经SDS-PAGE检测蛋白表达成功。纯化的RBD8MFoldon三聚体蛋白作为抗原辅以佐剂后免疫小鼠获得抗体血清，通过Elisa，Elispot，以及假病毒中和试验加以认证。结果表明本发明制备的疫苗在动物体内有很好的保护效果，其能有效的阻断病毒的结合，中和病毒感染。

RSV疫苗中通过特异性的抗原突变设计增强了Pre-F蛋白的有效免疫原性、稳定性和安全性，并通过在纳米颗粒表面的展示将所需要的表位外露，进一步增强了免疫原性。通过实验证明：本发明制备的疫苗可以在低剂量时获得较好的免疫效果，其中，RSV-PreF-C-NP组中和效价可达到19836。

本发明解决了野生抗原稳定性差的问题，本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白在进入生物体内之后能够诱导出具备中和活性的呼吸道合胞病毒抗体，从而赋予该机体相应的免疫保护。

本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白能够有效激发机体的细胞免疫机制，并且引起的免疫反应是Th1/Th2平衡的，可以避免Th2偏激所导致的免疫过激反应，具备较好的安全性。

本发明通过将RSV的Pre-F相关序列及铁蛋白纳米颗粒进行突变设计，并将Pre-F突变蛋白和铁蛋白突变体颗粒在真核细胞中进行融合表达，得到具备多个Pre-F在表面集中展示的铁蛋白-PreF融合蛋白纳米颗粒，该铁蛋白-PreF融合蛋白纳米颗粒通过稳定和暴露所需要展现的抗原表位，破坏或隐藏不需要的抗原表位，有效的提高了抗原的免疫原性、生产稳定性和安全性。通过实验表明：将本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白注射至小鼠，可以获取到高保护效价的血清，且小鼠血清针对真病毒可产生较高的中和效价，同时通过稳定性实验和安全性实验证明：本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白还具备足够的物理稳定性和较好的安全性。

概括来说，与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)联合疫苗中的新冠疫苗，引入三聚体标签T4Foldon，形成三聚体立体蛋白。

(2)联合疫苗中的新冠疫苗，本发明构建表达的三聚体融合蛋白使用非常小的剂量就能够引起小鼠特异性抗体的产生，对新型冠状病毒RBD蛋白具有特异性中和作用。为后期研发新型冠状病毒重组蛋白疫苗提供了实验基础。

(3)联合疫苗中的新冠疫苗，通过有选择性地选择关键抗原表位作为免疫原，可以精准产生具有病毒感染中和性的抗体，避免产生其他非中和性抗体，从而避免可能潜在的ADE风险，同时避免大量非中和抗体生成所导致过度“免疫消耗”。

(4)联合疫苗中的RSV疫苗，本发明对野生型Pre-F以及铁蛋白进行突变，增强了疫苗的有效免疫原性、稳定性和安全性，同时对铁蛋白进行突变，进一步提高了疫苗的抗原性和稳定性。

(5)联合疫苗中，广谱抗原，可同时刺激机体产生针对多种流行株的新型冠状病毒、多种亚型的流感病毒以及多种RSV亚型的高滴度中和抗体，能有效中和新冠原始毒株和各种变异毒株、各亚型流感病毒毒株和/或RSV毒株。

(6)联合疫苗中，采用佐剂包括铝佐剂和吉诺卫自主研发设计的全硫代修饰的线性CpG ODN佐剂，可同时刺激B细胞和T细胞免疫，微量蛋白即可激发小鼠非常高的免疫反应，短时间内即可达到良好的保护效果。

(7)联合疫苗中，两种或三种抗原组分疫苗之间没有相互抑制，能很好兼容，同时具备安全性和稳定性。

(8)联合疫苗中，两种或三种抗原组分疫苗之间还具有协同作用，能相互促进，增加机体产生对病毒的抗体滴度，提高体液或者细胞免疫保护效力。

(9)本发明的联合疫苗适用人群广，幼儿成人均有效，而目前上市的亚单位疫苗仅批准用于成人。

(10)本发明的联合疫苗预防的疾病均为季节性的呼吸道系统疾病，联合使用方便，减少受试者的疫苗接种次数，同时预防多种疾病，从而降低因多次来接种点而感染疾病的风险和多次接种所带来的不良反应的发生率，包括多次接种而导致的更多剂量的防腐剂及佐剂带来的不良反应，多次注射给婴儿和父母所带来的身体和心理的痛苦等等。

附图说明

图1为载体PKSRBD8MFoldonhis结构图。图中RBD8mFoldonhis即为本发明所述RBD8MFoldon-his基因(SEQ ID No.3)。

图2为实施例2中重组载体PKSRBD8MFoldonhis的酶切鉴定电泳图。

图3为实施例2中RBD8MFoldon三聚体融合蛋白SDS-PAGE检测结果图。

图4为实施例3中针对新冠原始株不同疫苗组合的ELISA效价检测结果。

图5为实施例3中针对新冠Delta株不同疫苗组合的ELISA效价检测结果。

图6为实施例3中针对新冠OmicronBa.4/5株不同疫苗组合的ELISA效价检测结果。

图7为实施例3中针对新冠Omicron BF.7株不同疫苗组合的ELISA效价检测结果。

图8为实施例3中针对新冠Omicron BQ.1.1株不同疫苗组合的ELISA效价检测结果。

图9为实施例3中针对新冠Omicron XBB株不同疫苗组合的ELISA效价检测结果。

图10为实施例3中不同疫苗处方的ELISpot检测结果。

图11为实施例6中pKS001载体的结构示意图。

图12为实施例6中铁蛋白-PreF融合蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果。A：泳道1是RSV-PreF-A-NP纯化后的洗脱产物，泳道2、泳道3分别是流穿和上清，泳道4是分子量标记物(Solarbio，货号：PR1910，下同)。B：泳道1是RSV-PreF-B-NP纯化后的洗脱产物，泳道2、泳道3分别是流穿和分子量标记物。C：泳道1是RSV-PreF-C-NP纯化后的流穿，泳道2是RSV-PreF-C-NP纯化后的洗脱产物，泳道3、泳道4分别是RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP纯化后的洗脱产物。D：泳道1是RSV-PreF-F-NP纯化后的洗脱产物，泳道2是分子量标记物。E：泳道1、泳道2分别是RSV-PreF-G-NP纯化后的流穿、洗脱产物。F：泳道1是分子量标记物，泳道2是RSV-PreF-H-NP纯化后的流穿，泳道3是间隔空白泳道，泳道4是RSV-PreF-H-NP纯化后的洗脱产物。

图13为实施例6纯化后铁蛋白-PreF融合蛋白的WB检测结果。从左往右第2-5和7-10列依次为RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-F-NP、RSV-PreF-G-NP、RSV-PreF-H-NP纯化产物的WB检测结果。

图14为实施例7铁蛋白-PreF融合蛋白的纳米颗粒形态图。A-H分别是RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-F-NP、RSV-PreF-G-NP、RSV-PreF-H-NP纯化产物对应的电镜照片。

图15为实施例8铁蛋白-PreF融合蛋白疫苗的免疫原性研究结果。

图16为实施例8铁蛋白-PreF融合蛋白免疫小鼠后的中和效价值的Log2。

图17为实施例10铁蛋白-PreF融合蛋白RSV-PreF-C-NP免疫后的小鼠血清中IgG1和IgG2a的ELISA效价及福尔马林灭活疫苗的对照效价。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1制备四价流感病毒裂解疫苗原液:

生产工艺流程：流感病毒株工作种子→接种9～11日龄鸡胚→收集尿囊液→2.0μm+0.45μm澄清处理后单价病毒收获液→500KD超滤膜超滤浓缩→蔗糖密度梯度离心→500KD超滤膜洗滤→Sepharose 4FF层析→裂解→30KD超滤膜洗滤→灭活→30KD超滤膜洗滤→0.22μm除菌→单价原液→半成品→成品。

1.1疫苗原液生产工艺的研究

1.1.1流感病毒株的来源

本研究用的流感病毒株及检测用抗血清具体见下表1：

表1：流感病毒株及检测用抗血清

经SPF鸡胚传代至工作种子批，经检定符合《中华人民共和国药典》(2015年版、三部)的质量标准要求，该毒株工作种子批经中国食品药品检定研究院检测，结果如下：

H1N1血凝滴度为1：320；病毒滴度为7.1lgEID50/ml。

H3N2血凝滴度为1：320；病毒滴度为7.4lgEID50/ml。

Bv血凝滴度为1：320；病毒滴度为7.7lgEID50/ml。

By血凝滴度为1：160；病毒滴度为6.6lgEID50/ml。

1.1.2鸡胚的来源

疫苗研究及生产采用的鸡胚为来源于封闭式房舍内，健康鸡群的9～11日龄无畸形、血管清晰、活动的鸡胚。鸡胚来源为吉林省九军牧业有限公司、吉林省广超牧业有限公司、吉林嘉鸿牧业有限公司等。

1.1.3流感病毒株于鸡胚内复制

参照《中华人民共和国药典》(2015年版、三部)流感病毒裂解疫苗制备规程，第2.3.2项病毒接种和培养的描述于鸡胚尿囊腔接种经适当稀释的工作种子批毒种(各型流感毒株应分别按工作种子批病毒稀释度的要求进行接种)，置33～35℃；培养48～72小时。

1.1.4生产工艺研究

1.1.4.1单价病毒收获液的澄清及过滤

鸡胚尿囊收获液的颜色呈微黄色、外观比较浑浊。因此我们采用了先经膜孔径为2.0μm滤膜进行粗滤，再经膜孔径为0.45μm滤膜进行精细过滤的串联方式澄清。

1.1.4.2单价病毒收获液的超滤浓缩

用500KD的超滤膜分别对单价病毒收获液进行超滤浓缩。将单价病毒收获液浓缩至1/51体积，补加0.01mol/L PBS缓冲液进行循环洗滤。洗滤至单价病毒收获液原倍体积后停止洗滤，浓缩至原倍体积的1/51体积后收获病毒浓缩液。

1.1.4.3浓缩液的离心

采用蔗糖密度梯度离心法对单价病毒浓缩液进行纯化。将4个型别单价病毒浓缩液经超速离心机转速30000rpm；离心3小时后，收获单价病毒离心液。

1.1.4.4单价病毒离心液的脱糖

单价病毒浓缩液经蔗糖密度梯度离心法纯化后，病毒液内的蔗糖浓度为40％左右。我们采用洗滤的方法降低蔗糖浓度，选用500KD的超滤膜对单价病毒离心液进行洗滤脱糖。洗滤至单价病毒离心液的20倍体积，再浓缩至单价病毒浓缩液的原倍体积。即为单价病毒梯度后液。

1.1.4.5单价病毒梯度后液的层析纯化

单价病毒梯度后液按1:4000的比例加入吐温80(吐温80是非离子型去污剂，它可以减少蛋白质之间的相互吸附力)。将单价病毒梯度后液置于20～25℃；作用2～3小时。用Sepharose 4FF凝胶过滤层析系统进行层析(流速50cm/h)。

1.1.4.6裂解条件的工艺研究

本研究选用TritonX-100作为流感病毒的裂解剂。确认蛋白浓度应在0.5～2.5mg/ml范围内，用Triton X-100溶液，一次性加入到病毒纯化液中，使Triton X-100最终浓度(M：V)为0.8％，20～25℃裂解2小时。应用40倍体积的PBS，选用30KD超滤膜洗滤去除裂解剂。

1.1.4.7灭活条件的工艺研究

本发明选用甲醛作为流感病毒的灭活剂。确认蛋白浓度应在0.5～2.5mg/ml范围内，加入甲醛溶液。按照终浓度为180μg/ml加入甲醛溶液。将灭活液密封放置于2～8℃，每天手动摇匀10分钟，灭活5天。应用20倍体积的PBS，选用30KD超滤膜洗滤去除甲醛。

1.1.4.8单价原液

将去除裂解剂及灭活剂的单价病毒灭活液经膜孔径为0.22μm的滤膜进行除菌过滤后，即为单价原液。

1.1.4.9四价流感裂解疫苗原液

各型别单价原液的血凝素含量应达到132μg/ml时，方可对四种单价原液进行混合，混合后进行分装，装量为每支0.5ml。即含各型流感病毒株血凝素应为16.5μg。

实施例2制备通用新冠疫苗(RBD8MFoldon)原液:

本发明疫苗的设计是基于新型冠状病毒原始病毒RBD区域的抗原表位序列，同时分析后期发现的变异病毒的RBD区域中的关键抗原表位。通过比对SARS-Cov-2不同亚型的基因序列，参考已报道的SARS-Cov RBD蛋白三聚体结构相关研究，对SARS-Cov-2 RBD基因做了进一步的改造，设计了8个重要位点突变，相对于野生型SARS-Cov-2 RBD(参考序列如SEQ ID No.13所示)，具在第28、99、126、128、134、142、166和/或168位具有突变修饰。

设计得到的突变蛋白命名为RBD8M蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码RBD8M蛋白的DNA分子命名为RBD8M基因，RBD8M基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在此基础上通过引入三聚体标签T4Foldon(其氨基酸序列如SEQ ID No.4的第252-277位所示)从而获得三聚体融合蛋白，命名为RBD8M-T4Foldon，其氨基酸序列如SEQID No.4的第26-277位所示。SEQ ID No.4的第26-277位所示的RBD8M-T4Foldon蛋白是在SEQ ID No.1所示的RBD8M蛋白的C端通过接头(GSGSGSG，SEQ ID No.10)融合三聚体标签T4Foldon(SEQ ID No.4的第252-277位)得到的三聚体融合蛋白。

进一步对RBD8M-T4Foldon三聚体融合蛋白(简称RBD8M-T4Foldon蛋白)的核苷酸序列进行密码子优化，得到编码RBD8M-T4Foldon蛋白的DNA分子，命名为RBD8M-T4Foldon基因，RBD8M-T4Foldon基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第76-831位所示。

同时，为了更便于蛋白的分泌表达，在RBD8M-T4Foldon蛋白的N端增加(融合)了信号肽，该信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第1-25位所示，核苷酸序列如SEQ ID No.3的第1-75位所示。将N端融合了信号肽的RBD8M-T4Foldon蛋白命名为RBD8MFoldon蛋白，三聚体融合蛋白RBD8MFoldon的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第1-277位所示，其编码基因命名为RBD8MFoldon基因，RBD8MFoldon基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第1-831位所示。

进一步地，为了便于蛋白的纯化和检测，在RBD8MFoldon蛋白(SEQ ID No.4的第1-277位)的C端融合His标签(HHHHHHHH，SEQ ID No.8)，得到命名为RBD8MFoldon-his的三聚体融合蛋白(简称RBD8MFoldon-his蛋白)。RBD8MFoldon-his蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示，其编码基因命名为RBD8MFoldon-his基因，RBD8MFoldon-his基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

RBD8MFoldon三聚体融合蛋白的制备方法如下：

1、RBD8MFoldon三聚体融合蛋白表达载体构建

1.1、含有目的基因(RBD8MFoldon-his基因)载体的获得

模板合成：三聚体融合蛋白RBD8Mfoldon(RBD8MFoldon-his)的编码序列(SEQ IDNo.3)经密码子优化，并在两端增加EcoR I和Not I识别位点，最终优化得到核苷酸序列为SEQ ID No.7的DNA分子(884bp)。将SEQ ID No.7所示的DNA分子克隆到pUC57载体中得到重组载体pUC57-RBD8Mfoldon，重组载体pUC57-RBD8Mfoldon由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。

重组载体pUC57-RBD8Mfoldon表达氨基酸序列为SEQ ID No.4的融合蛋白RBD8MFoldon-his，融合蛋白RBD8MFoldon-his中，SEQ ID No.4的第1-25位为信号肽的氨基酸序列(即SEQ ID No.4的第1-25位)，SEQ ID No.4的第26-244位为RBD8M蛋白的氨基酸序列(即SEQ ID No.1)，SEQ ID No.4的第245-251位为接头序列(即GSGSGSG，SEQ ID No.10)，SEQ ID No.4的第252-277位为三聚体标签(T4Foldon)的氨基酸序列(即SEQ ID No.4的第252-277位)，SEQ ID No.4的第278-285位为His标签序列(8-HisTag，即SEQ ID No.8)。

1.2、含有目的基因载体和基础载体质粒的双酶切

pKS001载体(购自中山康晟生物，货号A13201)和重组载体pUC57-RBD8Mfoldon分别使用Not I(购自NEB，货号R3189L)与EcoR I限制性核酸内切酶(购自NEB，货号R3101S双酶切，酶切体系见表2。

表2双酶切体系

按照表2配制双酶切体系，混匀后，37℃酶切1.5hr，进行核酸电泳鉴定，显示条带正确后，进行胶回收，测定DNA浓度，进行下一步试验。

双酶切pKS001载体得到pKS001载体片段(大片段)，双酶切重组载体pUC57-RBD8Mfoldon得到含有RBD8MFoldon-his基因(SEQ ID No.3)的DNA片段1。

1.3、连接与转化

(1)连接

将步骤1.2得到的DNA片段1与pKS001载体片段(大片段)连接，连接体系(20μl)如表3所示：

表3连接反应体系

混合反应液置于室温(25℃)反应5～10min，得到连接产物。

(2)连接产物的转化

将连接产物加入到50～100μl冰浴上融化的TOP10感受态细胞(购自北京全式金生物，货号CD101)中，在冰上静置30min，使得感受态细胞与连接产物充分混匀。将上述产物置于42℃中热激90s，然后迅速将其转移到冰上冰浴2min。在上述产物中加入400μl灭菌的LB培养基(不含抗生素)，将其混合均匀后置于37℃，220rpm摇床中培养1hr。将全部菌液吹匀后，均匀涂布于氨苄抗性的LB琼脂培养基。将平板倒置于37℃温箱，过夜培养。

(3)重组质粒的鉴定

使用PCR方法对重组质粒进行检测鉴定。引物为适用于阳性pKS001载体鉴定的特异性引物PLHS，构建的质粒为模板，PCR扩增区域大小约为900bp。PCR鉴定结果显示片段大小约为900bp，与理论值相符，真核表达质粒构建完成。选择扩增出目的条带的菌株送去测序。

测序无误的质粒(重组载体)命名为PKSRBD8MFoldonhis(如图1所示)。

将测序无误的菌株在含有氨苄抗性的LB培养基中大量培养，使用去内毒素质粒提取试剂盒大量提取表达质粒，并通过酶切鉴定，结果如图2所示，其中图2从左到右第2-7列均为质粒酶切结果，根据图2可知，在约900bp获得的目的片段。

将含有上述重组载体PKSRBD8MFoldonhis的重组菌命名为TOP10/PKSRBD8MFoldonhis。所述TOP10/PKSRBD8MFoldonhis是将所述重组载体PKSRBD8MFoldonhis导入TOP10感受态细胞得到的重组微生物。

2、RBD8MFoldon三聚体融合蛋白的表达

(1)细胞系的维持与传代：CHO-K1Q细胞P3代细胞(购自中山康天晟合生物技术有限公司，货号A14101)复苏后置于含30mL CD04培养基(中山康晟生物有限公司，货号A11004)的125mL规格平底锥形瓶内，在37℃，5％CO2孵箱中125rpm摇动培养3～4天。而后每日吸取少量细胞加入台盼蓝染液，镜下计数并判断细胞活力。当细胞活力＞95％、细胞密度达到2×106～4×106cells/ml时进行传代扩增，细胞稀释至0.5×106cells/ml于相同条件进行培养3～4天。

(2)细胞转染：

1)将活力良好，处于对数生长期的CHO-K1Q细胞以浓度2×106cells/ml传代至含100ml CD04培养基(中山康晟生物有限公司，货号A11004)的500ml锥形瓶内，在37℃5％CO2孵箱中125rpm摇动培养过夜。次日收集细胞，去除细胞培养液。用PBS轻柔冲洗细胞一次，离心，去上清。用电转试剂调整细胞密度至1×107cells/ml，轻轻吹打细胞，使其形成单细胞悬液。混合质粒(PKSRBD8MFoldonhis)与电转试剂，于室温静置5min，将混合好的液体加入200μl细胞中，并立即轻柔混匀，吸取放入电转杯中，避免产生气泡。

2)选择合适的电穿孔方案，并按下触摸屏上的Start(开始)键。电脉冲释放后，触摸屏上会显示完成，提示电穿孔完成。

3)将脉冲好的样品立即转移至准备好的装有预热不含加压试剂

CHOCD04无血清培养基(购自QuaCell，货号A11004)的T75培养瓶中。细胞继续放置于37℃5％CO2孵箱，静置培养24-48h。

(3)换液：收集培养了24-48h转染细胞，离心，去上清，加入含有25uM MSX(L-Methionine Sulfoximine，购自Sigma，货号M5379-1G)的无血清加压培养基30ml，将细胞转入125ml摇瓶，37℃5％CO2摇动培养。观察细胞生长状态，每5～7天更换一次加压培养基，直至细胞开始扩增生长。

(4)细胞传代：定时观察细胞生长情况，待细胞生长密度大于2×106/ml时，即可进行细胞的传代或保株。一般3～5天即可传代一次，按照1：4进行细胞稀释，直至补充CD04培养基(中山康晟生物有限公司，货号A11004)至1L。

(5)添加补料：根据

FEED说明书推荐策略添加补料(购自QuaCell，货号A11952和A11902A)。每天取样计数，以确定补料策略。细胞活率小于60％时收获细胞。获得的细胞为重组细胞，命名为CHO/PKSRBD8MFoldonhis。

重组细胞CHO/PKSRBD8MFoldonhis是将所述重组载体PKSRBD8MFoldonhis导入CHO-K1Q细胞中得到的重组细胞。重组细胞CHO/PKSRBD8MFoldonhis含有SEQ ID No.3所示的DNA分子，表达氨基酸序列是SEQ ID No.4的RBD8MFoldon-his蛋白。

3、RBD8MFoldon三聚体融合蛋白的纯化及检测

重组抗原C端含有8×His标签，采用Ni离子亲和纯化的方式进行抗原的纯化。

培养重组细胞CHO/PKSRBD8MFoldonhis，离心收集上清，用0.45μm滤膜过滤，经镍柱亲和纯化后，对洗脱蛋白进行SDS-PAGE检测分析。将洗脱后的蛋白浓缩后，进行SDS-PAGE检测(图3)，其中M为Marker，“还”为RBD8MFoldon三聚体融合蛋白(还原)，“非”为RBD8MFoldon三聚体融合蛋白(非还原)。

实施例3、新冠疫苗组合物的筛选及免疫原性研究

本发明预防新型冠状病毒感染的通用三聚体重组蛋白疫苗是利用RBD8MFoldon三聚体融合蛋白(SEQ ID No.4的第1-277位)作为疫苗抗原，本实施例选用实施例2中制备的带有组氨酸标签的RBD8MFoldon三聚体融合蛋白(即实施例2中表达纯化的RBD8MFoldon-his蛋白)制备三聚体重组蛋白疫苗。

具体地，本实施例以实施例2制备的RBD8MFoldon-his蛋白作为免疫原，用含有20mM组氨酸盐酸盐、140mM精氨酸盐酸盐和体积百分比为0.02％的聚山梨酯80的缓冲液(pH6.0)稀释至蛋白终浓度为50μg/ml，室温条件下分别与氢氧化铝佐剂混悬液(铝含量500μg/ml)、CpG1018佐剂(购自广州锐博生物技术有限公司，批号0210426)、吉诺卫自主研发设计的全硫代修饰的线性CpG ODN佐剂——CpG-cjx1佐剂(序列为5’-TGACTGAACGTTTTAACGTCAGACTGA-3’，SEQ ID No.5)或CpG7909佐剂(序列为5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’，SEQ ID No.6)(上述两种佐剂通过生工生物SangonBiotech合成)混合均匀，分别制备成含铝佐剂疫苗溶液、含CpG佐剂疫苗溶液以及含铝佐剂和CpG佐剂的双佐剂疫苗溶液，然后放置于2～8℃。

将2～8℃上述疫苗溶液，无菌条件下分装入2ml西林瓶内(或预填充玻璃注射器内)，每瓶0.5ml(或1.0ml)，密封后放置于2～8℃避光保存。

取出上述疫苗溶液(即疫苗组合物)，以Balb/c小鼠(购自斯贝福(北京)生物技术有限公司)为动物模型进行免疫原性研究。

具体方法为：选择6-8周龄雌性Balb/c小鼠随机分3组，每组5只小鼠，肌肉注射上述疫苗组合物，并设置疫苗组、蛋白组和佐剂组，第0、3周免疫(每次免疫剂量为0.1ml)，第3、5周采血，第5周取脾脏。采用ELISA法检测血清中的抗新冠原始株RBD、Delta RBD、Omicron4/5RBD、Omicron BF.7、Omicron BQ.1.1和Omicron XBB蛋白的抗体滴度(即totalIgG)，以及假病毒中和试验测定针对新冠原始株、Delta株、Omicron4/5、Omicron BF.7、Omicron BQ.1.1和Omicron XBB株的中和效价；采用ELISPOT法检测脾细胞中的细胞免疫水平，主要IFN-γ的表达。

结果显示通过本发明提供的技术方案所获得的RBD8M蛋白所制备得到的疫苗组合物免疫原性非常好，可作为潜在的重组新冠疫苗抗原，具体操作如下：

一、ELISA方法

1、试剂配制

1.1、ELISA包被液(1×)配制：取ELISA包被液(10×)用无菌蒸馏水稀释至1×。

1.2、PBS配制：取出PBS powder(索莱宝公司产品，货号G0002)，每袋用2L无菌蒸馏水溶解。

1.3、洗液：PBST(含0.05％Tween-20的PBS)

量取1L过滤后的PBS到蓝盖瓶中，加入500μLTween-20，充分混匀，存于2～8℃备用。根据实际情况，按此方法配制所需体积的PBST(现用现配，当天使用)。

1.4、封闭液和样品稀释液(含5％脱脂奶粉的PBS)

称取PBS体积的5％的脱脂奶粉(奶粉质量/g＝PBS体积/mL×5％)，将从2～8℃取出的PBS平衡至室温，量取所需体积的PBS溶液至已加入奶粉的离心管中，然后充分溶解，备用。封闭液和样品稀释液现用现配，当天使用。

1.5、稀释羊抗鼠二抗

将规格为1mL的二抗(命名Anti-Mouse IgG，HRP-Linked Antibody，公司CST，货号7076S)平衡至室温，然后进行分装，放置在-20℃±5℃保存。每次使用之前取出，按1:4000进行稀释，此处稀释液为PBS。稀释后的二抗，当天使用。

1.6、终止液(购自索莱宝)

2、ELISA检测血清结合抗体滴度：

2.1、包被：取原始株RBD-his、Delta RBD-his、Omicron Ba.4/5RBD-his、OmicronBF.7、Omicron BQ.1.1、Omicron XBB蛋白抗原原液(以上蛋白均购自义翘神州，货号分别为：40592-V08H、40592-V08H90、40592-V08H130、40592-V08H140、40592-V08H143、40592-V08H144)用ELISA包被液(1×)稀释到1000ng/mL，包被酶标版，100μl/孔，4℃放置过夜。

2.2、封闭：将包被板从2～8℃取出后，洗板3次，每次洗液体积为300μl/孔，洗完后若孔内残留洗液，则要在吸水纸上拍干；然后在已包被孔中加入预先配制的封闭液，300μl/孔，盖封板膜，37℃，封闭60-90min。

2.3、血清稀释：在离心管内用样品稀释液将待检血清稀释至合适浓度。

2.4、加样：将封闭后的包被板洗板3次，每次洗液体积为300μl/孔，洗完后若孔内残留洗液，则要在吸水纸上拍干。将已稀释好的各个浓度的待检样品(即待检血清)依次加入至样品孔中，100μl/孔；加入100μl样品稀释液作为空白对照(Blk)，设置5个复孔，盖上封板膜，37℃孵育60min。

2.5、加二抗：弃去样品，洗板3次，每次洗液体积为300μl/孔，洗完后若孔内残留洗液，则要在吸水纸上拍干；加入稀释后的二抗，100μl/孔，盖封板膜，37℃孵育60min。

2.6、显色：将96孔板洗板3次，每次洗液体积为300μl/孔，洗完后若孔内残留洗液，则要在吸水纸上拍干，加单组分TMB显色液1(提前从2～8℃取出，平衡至室温)，100μl/孔，25℃避光显色，15min。

2.7、终止：显色后立即加入终止液终止反应，50μl/孔，轻晃混匀。

2.8、检测：将酶标板放入酶标仪，在450nm波长下测吸光度值。

2.9、判定：大于阴性小鼠OD值的2.1倍判为阳性。

以下检测结合抗体效价的ELISA方法都同上。

二、小鼠脾脏ELISPOT检测方法：

根据Murine IFN-γSingle-Color Enzymatic ELISPOT Assay(购自CTL(Cellular Technology Ltd.)，货号mIFNgp-2M/2)试剂盒说明书对二免14d小鼠的脾淋巴细胞检测。具体步骤如下：

1、脾脏组织加入5ml小鼠淋巴细胞分离液，轻轻研磨，200目尼龙网过滤至洁净离心管中，在液面以上轻轻加入1ml PBS，以800g，30min，升速快降速慢离心，收集中间淋巴细胞层。

2、加入5ml PBS洗涤细胞，500g，离心5min，弃上清。

3、CTL-Test Medium(补充L-谷氨酰胺终浓度3mM)培养基重悬细胞，细胞计数(流式细胞仪计数)后调整细胞浓度为5×10⁶/ml。

4、准备2倍终浓度的CTL-Test Medium：在1-9组，样本管分别加入原始株RBD-his、Delta RBD-his、Omicron Ba.4/5RBD-his、Omicron BF.7RBD-his、Omicron BQ.1.1RBD-his、Omicron XBB RBD-his蛋白混合物(2倍终浓度10μg/ml)，100μl/孔。铺到对应的ELISPOT板中，另外预留阴性对照孔(不加任何刺激物)和阳性对照孔(加入CellStimulation Cocktail细胞激活剂(PMA和Ionomycin)500X，购自eBioscience，货号00-4970-93。最终使用量根据配置体积将其稀释成1×)。37℃，5％CO₂孵育20min。

5、加入细胞100μl/孔，相当于5×105/孔，37℃，5％CO₂培养48h。

6、用200μl/孔PBS清洗板2次，再用200μl/孔0.05％Tween-PBS清洗板3次。

7、加入anti-murine IFN-γ检测液80μl/孔，室温孵育2h。

8、用200μl/孔0.05％Tween-PBS清洗板3次。

9、加入Tertiary solution 80μl/孔，室温孵育30min。

10、用200μl/孔0.05％Tween-PBS清洗板2次，再用200μl/孔纯水清洗板2次。

11、加入Blue Developer Solution 80μl/孔，室温孵育15min。

12、倒掉液体，用纯水冲洗孔板3次终止反应。

13、ELISPOT板读值。

三、中和实验

假病毒试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，详细信息见表4。

表4、假病毒试剂盒详细信息

1、筛选最佳的疫苗处方

取6-8周龄Balb/c雌性小鼠45只，随机分为9组，按表5设计的免疫方案免疫动物，第0，21d共免疫两次，通过检测1-9组二免14d ELISA效价以及通过ELISPOT检测1-9组二免14d脾淋巴细胞IFN-γ因子的表达，筛选到最佳疫苗处方。

表5、重组RBD8MFoldon疫苗不同处方免疫小鼠的免疫方案

表5中，RBD8MFoldon为实施例2中制备的RBD8MFoldon-his蛋白，i.m表示肌肉注射。

结果见图4-图9，从图4-9的ELISA结果可以看出，无论是总体抗体滴度(参见图4)，还是针对不同新冠突变体(参见图5-9)，所有治疗组均可以产生有效的抗体，单独添加铝佐剂可以显著性的增加抗体滴度，单独添加CpG佐剂，也可以显著性增加抗体滴度，但增加的幅度不如添加铝佐剂组，但在针对新冠Omicron XBB株时，添加CpG佐剂组优于添加铝佐剂组，而添加双佐剂(铝佐剂和CpG佐剂)组的抗体滴度均显著性的高于单佐剂组，以RBD8MFoldon 5μg+50μg AL(OH)3+2μgCpG-cjx1这种疫苗组合(第7组)针对原始株、Delta株、Omicron Ba.4/5株、Omicron BF.7株、Omicron BQ.1.1株、Omicron XBB株结合抗体效价最佳，优于单抗原组和单佐剂组。其中加铝佐剂组(7/8/9组)优于不加铝佐剂组(4/5/6)，从而得出铝佐剂主要在增强体液免疫方面发挥作用；从图10的ELISpot结果可以看出，治疗组均可以提高细胞免疫介导的IFN-γ的水平，添加CpG佐剂可以进一步显著提高IFN-γ的水平，而双佐剂组可以进一步显著性提高IFN-γ的水平，以RBD8MFoldon 5μg+50μg AL(OH)3+2μgCpG-cjx1这种疫苗表达IFN-γ因子细胞数最多，优于单抗原组和单佐剂组，其中筛选了3种CpG，结果CpG-cjx1优于CpG1018和CpG7909。CpG1018和CpG7909两种CpG佐剂之间无显著性差异。其中加CpG佐剂组(7/8/9)优于不加CpG佐剂组(2)，从而证实CpG佐剂主要在增强细胞免疫方面发挥作用，而且，单独添加铝佐剂虽然提高IFN-γ的水平效果不明显，但在双佐剂组却与CpG佐剂有协同作用，可以显著性的提高IFN-γ的水平。

2、双佐剂重组通用新冠疫苗假病毒中和抗体检测

取6-8周龄Balb/c雌性小鼠15只，随机分为3组，每组5只。按表6设计的免疫方案免疫动物，第0，21d共免疫两次，用假病毒中和试验方法分别检测小鼠二免14d血清针对原始株、Delta株、Omicron Ba.4/5株的中和抗体效价。

表6、双佐剂重组通用新冠疫苗小鼠免疫方案

组别

免疫原

佐剂

免疫体积

免疫方式

免疫次数

动物数量

10

PBS

-

50μl

i.m

2

5

11

-

AL(OH)3+CpG-cjx1

50μl

i.m

2

5

12

RBD8MFoldon

AL(OH)3+CpG-cjx1

50μl

i.m

2

5

表6中，RBD8MFoldon为实施例2中制备的RBD8MFoldon-his蛋白，i.m表示肌肉注射。表6中免疫原和佐剂的量同表5中的组别7。

假病毒中和试验结果如表7-1和表7-2所示。

表7-1、针对不同新冠毒株假病毒中和抗体效价

表7-2、针对不同新冠毒株假病毒中和抗体效价

结果显示，采用AL(OH)3+CpG-cjx1双佐剂的三聚体重组蛋白疫苗诱导的抗体可以有效中和不同SARS-CoV-2病毒株，增强体液免疫，是一种广谱(通用)、有效的预防新型冠状病毒感染的疫苗。

实施例4：流感和新冠联合疫苗的制备

将实施例1和实施例2中制备的两种疫苗原液按最终疫苗抗原含量2倍等体积混合后，用选自注射用水、0.01MPBS(pH6.8-7.2)和含有氢氧化铝的0.01MPBS(pH 6.8-7.2)的溶液稀释，置于磁力搅拌器低速搅拌1h，最终H1N1、H3N2、BV、BY四种型别血凝素为16.5μg/剂/0.5ml(血凝素共66μg/剂/0.5ml)，RBD8MFoldon抗原为5μg/剂/0.5ml，其中含有浓度为50μg/剂/0.5ml的氢氧化铝。

实施例5：流感和新冠联合疫苗的免疫原性实验

1.联合疫苗的免疫原性实验

取6-8周龄Balb/c雌性小鼠30只，随机分为6组，将如实施例4所述制备的联合疫苗(流感新冠二联疫苗)，按照0.5ml剂量通过腹腔注射接种小鼠，进行疫苗的免疫原性研究。按表8设计的免疫方案免疫动物，第0，21d共免疫两次，通过检测二免21d血清针对HIN1/H3N2/BY/BV血抑效价(测定方法见国家流感中心出具的sop：红细胞凝集抑制试验鉴定流感/禽流感病毒方法，文件编号：CNICSOP07025)和针对Omicron BF.7、Omicron BQ.1.1、Omicron XBB假病毒中和抗体效价(假病毒试剂盒信息见表4)，筛选到最佳联合疫苗处方。

表8、疫苗不同处方免疫小鼠的免疫方案

结果见表9和表10：

表9：流感新冠联合疫苗免疫后抗流感抗体水平

由表9可知，免疫后42天(二免后21天)，流感和新冠联合疫苗(组别6、7)和流感疫苗组(组别3、5)相比，除了H3N2型流感病毒抗体滴度稍微下降(但没有显著性差异)，H1N1、BY、BV流感病毒抗体滴度均有所提高。以上试验说明，新冠疫苗组分对流感疫苗组分没有抑制作用，而且令人意想不到的是，本申请的流感和新冠联合疫苗还可以提高部分型别的流感病毒的抗体滴度，同时加佐剂的疫苗组(组别5、7)4个型别的抗体效价均比不加佐剂的疫苗组(组别3、6)有提高，说明佐剂对流感疫苗有免疫促进作用。

表10：流感新冠联合疫苗免疫后抗新冠Omicron流行株假病毒中和抗体水平

由表10可知，免疫后42天(二免后21天)，流感和新冠联合疫苗(组别6、7)和新冠疫苗(组别2、4)相比，针对Omicron BF.7、Omicron BQ.1.1、Omicron XBB假病毒中和抗体效价均有显著提高。加佐剂组(组别4、7)与不加佐剂组(组别2、6)相比，针对Omicron BF.7、Omicron BQ.1.1、Omicron XBB假病毒中和抗体效价有明显提高，说明佐剂对新冠疫苗有显著的免疫促进作用。以上试验说明，流感疫苗各组分对新冠疫苗组分没有抑制作用，反而可以协助提高针对新冠病毒的抗体滴度。

综上：本申请的四价流感裂解疫苗和新型冠状病毒疫苗的联合疫苗，联合后，两种抗原组分疫苗之间没有相互抑制，能很好兼容。令人意想不到的是，该联合疫苗对H1N1、BY、BV流感病毒抗体滴度和Omicron BF.7、Omicron BQ.1.1、Omicron XBB假病毒中和抗体效价相对于联合前单独使用均有提高，说明两者具有协同作用。

实施例6RSV铁蛋白-PreF融合蛋白的设计、制备与纯化

本实施例和下述实施例中的RSV病毒A型Long株记载于文献“Cultures of HEp-2cells persistently infected by human respiratory syncytial virus differ inchemokine expression and resistance to apoptosis as compared to lyticinfections of the same cell type”中。

本实施例和下述实施例中的RSV病毒B型BA9株记载于文献“Genetic Diversityand Molecular Epidemiology of Circulating Respiratory Syncytial Virus inCentral Taiwan,2008-2017”中。

本实施例和下述实施例中的强生公司开发的同类疫苗记载于文献“preFmmunogenicity and protective efficacy of adenoviral and subunit RSVvaccinesbased on stabilized prefusion F protein in preclinical models”中。

本实施例和下述实施例中的福尔马林灭活疫苗FI-RSV记载于文献“Enhancedpulmonary histopathology induced by respiratory syncytial virus(RSV)challengeof formalin-inactivated RSV-immunized BALB/c mice is abrogated by depletionof interleukin-4(IL-4)and IL-10”中。

将RSV的Pre-F相关序列进行突变与设计，得到Pre-F突变蛋白，并使其与铁蛋白相关序列进行融合，形成铁蛋白-PreF一体的亚单位，然后利用铁蛋白的自组装性能，成为具备良好Pre-F抗原展示效果的纳米颗粒。具体步骤如下：

一、铁蛋白-PreF融合蛋白的设计

1、RSV的Pre-F相关序列的设计

为了展示和稳定需要的表位，破坏或掩盖不需要的表位，将RSV的野生型Pre-F蛋白氨基酸序列(野生型Pre-F蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.14所示)进行如下1)-19)中至少一种突变，得到Pre-F突变蛋白：

1)将Pre-F蛋白氨基酸序列第67位的异亮氨酸(I)突变为天冬酰胺(N)。

2)将Pre-F蛋白氨基酸序列第88位的丝氨酸(S)突变为天冬酰胺(N)。

3)将Pre-F蛋白氨基酸序列第110位的半胱氨酸(C)突变为丙氨酸(A)。

4)将Pre-F蛋白氨基酸序列第143位和第144位氨基酸之间插入甘氨酸。

5)将Pre-F蛋白氨基酸序列在第144位天冬酰胺突变为半胱氨酸。

6)将Pre-F蛋白氨基酸序列第159位的酪氨酸(Y)突变为半胱氨酸(C)。

7)将Pre-F蛋白氨基酸序列第173位的半胱氨酸(C)缺失。

8)将Pre-F蛋白氨基酸序列第202位的丙氨酸(A)突变为半胱氨酸(C)。

9)将Pre-F蛋白氨基酸序列第227位的异亮氨酸(I)突变为天冬酰胺(N)。

10)将Pre-F蛋白氨基酸序列第236位的丝氨酸(S)突变为精氨酸(R)。

11)将Pre-F蛋白氨基酸序列第248位的丝氨酸(S)突变为半胱氨酸(C)。

12)将Pre-F蛋白氨基酸序列第289位的谷氨酸(E)突变为天冬酰胺(N)。

13)将Pre-F蛋白氨基酸序列第309位的丝氨酸(S)突变为天冬酰胺(N)。

14)将Pre-F蛋白氨基酸序列第334位的精氨酸(R)突变为酪氨酸(Y)。

15)将Pre-F蛋白氨基酸序列第344位的天冬酰胺(N)突变为谷氨酸(E)。

16)将Pre-F蛋白氨基酸序列第370位的丝氨酸(S)突变为甘氨酸(G)。

17)将Pre-F蛋白氨基酸序列第389位的天冬酰胺(N)突变为半胱氨酸(C)。

18)将Pre-F蛋白氨基酸序列第419位的半胱氨酸(C)突变为酪氨酸(Y)。

19)将Pre-F蛋白氨基酸序列第468位的精氨酸(R)突变为天冬酰胺(N)。

在本发明中，所述Pre-F突变蛋白分别为RSV-PreF-A、RSV-PreF-B、RSV-PreF-C、RSV-PreF-D、RSV-PreF-E、RSV-PreF-F、RSV-PreF-G和RSV-PreF-H(以下也可以分别简称为Pre-F突变蛋白A、B、C、D、E、F、G、H)。

其中，

RSV-PreF-A：包括第88位的突变修饰(SEQ ID No.15)；

RSV-PreF-B：包括第67、88、143与144位之间插入甘氨酸、144、389位的突变修饰(SEQ ID No.16)；

RSV-PreF-C：包括第88、289、309、468位的突变修饰(SEQ ID No.17)；

RSV-PreF-D：包括第67、88、110、143与144位之间插入甘氨酸、144、289、309、389和468位的突变修饰(SEQ ID No.18)；

RSV-PreF-E：包括第159、202、248、、334、344、370位的突变修饰(SEQ ID No.19)；

RSV-PreF-F：包括第67、110、143与144位之间插入甘氨酸、144、202、227、248、334、344和389位的突变修饰(SEQ ID No.20)；

RSV-PreF-G：包括第159、202、289、334、344和468位的突变修饰(SEQ ID No.21)；

RSV-PreF-H：包括第67、110、143与144位之间插入甘氨酸、144、159、202、236、248、289、309、334、370、389、419、468位的突变修饰(SEQ ID No.22)。

2、纳米颗粒序列的设计

为了提升颗粒的稳定性和完整度，将野生型铁蛋白氨基酸序列(野生型铁蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.23所示)进行如下1)-3)中至少一种突变，得到铁蛋白突变体：

1)将铁蛋白氨基酸序列第15位的天冬酰胺(N)突变为谷氨酰胺(Q)。

2)将铁蛋白氨基酸序列第96位的丝氨酸(S)突变为天冬酰胺(N)。

3)将铁蛋白氨基酸序列第119位的酪氨酸(Y)突变为精氨酸(R)。

在本发明中，铁蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.24所示。

二、铁蛋白-PreF融合蛋白的制备

1、重组质粒的构建

1)铁蛋白-PreF的基因融合设计

将Pre-F突变蛋白和铁蛋白突变体通过linker(SGSGGGSG，SEQ ID No.41)进行融合，制备铁蛋白-PreF融合蛋白，该铁蛋白-PreF融合蛋白自N端至C端依次由Pre-F突变蛋白、linker(SGSGGGSG，SEQ ID No.41)和铁蛋白突变体组成。

铁蛋白-PreF融合蛋白分别为RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-F-NP、RSV-PreF-G-NP和RSV-PreF-H-NP(以下也可以分别简称为融合蛋白A、B、C、D、E、F、G、H)，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.25-SEQ IDNo.32所示，编码基因序列分别如SEQ ID No.33-SEQ ID No.40所示。

委托南京金斯瑞生物科技有限公司分别合成含有上述各铁蛋白-PreF融合蛋白编码基因序列的质粒，并将其分别命名为质粒RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-F-NP、RSV-PreF-G-NP和RSV-PreF-H-NP(以下也可以分别简称为质粒A、B、C、D、E、F、G、H)。

2)重组质粒的构建

用限制性内切酶Hind III-HF和Not I-HF(NEB，货号分别为R3104V和R3189L)对pKS001载体质粒(中山康天晟合生物技术有限公司，货号为A14101)进行双酶切，得到骨架载体。pKS001载体质粒结构示意图如图11所示。

用限制性内切酶Hind III-HF和Not I-HF分别对质粒RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-B-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-E-NP、RSV-PreF-F-NP、RSV-PreF-G-NP和RSV-PreF-H-NP进行双酶切，分别得到目的片段。

用Quick连接酶(NEB，货号为M2200L)分别将骨架载体与各个目的片段连接后转化大肠杆菌感受态Trans10(北京全式金生物技术股份有限公司，货号为CD101)，筛选阳性克隆并提取质粒进行测序验证，将测序验证正确的质粒分别命名为重组质粒pKS001-RSV-PreF-A-NP、pKS001-RSV-PreF-B-NP、pKS001-RSV-PreF-C-NP、pKS001-RSV-PreF-D-NP、pKS001-RSV-PreF-E-NP、pKS001-RSV-PreF-F-NP、pKS001-RSV-PreF-G-NP和pKS001-RSV-PreF-H-NP(以下也可以分别简称为重组质粒A、B、C、D、E、F、G、H)。

测序结果表明：重组质粒A、B、C、D、E、F、G、H分别为将pKS001载体的Hind III-HF和Not I-HF酶切位点间的DNA片段分别替换为SEQ ID No.33-40所示的DNA分子，且保持pKS001载体其他序列不变后得到的质粒。

2、铁蛋白-PreF融合蛋白的表达

将上述重组质粒A、B、C、D、E、F、G、H分别在CHO K1Q细胞(康晟生物医药有限公司，货号为A14101)中进行电转和表达，并筛选高表达的细胞株。

使用苏州壹达生物科技有限公司的电转仪EBXP-F1进行电转，具体电转步骤如下：

1)电转前准备：电转前30min将Buffer、细胞培养液、D-PBS提前取出恢复至室温。

2)收集细胞、计数：细胞混悬均匀后置于离心管，进行计数。

3)离心：取所需培养液细胞置于一新的离心管内，在离心机(苏州市国飞实验室仪器有限公司，货号：TDL-5A)中1000rpm离心5min。

4)DPBS清洗：弃去上清培养液，获得所需细胞，加入1mL D-PBS(赛默飞Gibco，货号：2334304)重悬细胞，1000rpm离心5min。

5)DNA、细胞、buffer混合：弃去D-PBS，加入所需量电转缓冲液(苏州壹达生物科技有限公司，货号：H10305)和10μg质粒，轻轻吹打混匀。

6)电转：将混有质粒的细胞悬液按照200μl+DNA体积/杯，加入到H1电转杯(苏州壹达生物科技有限公司，货号：H10201)中，将电转杯插入基座内，按照表11所示电转条件进行电转。

表11：电转条件

7)培养：将电转后的细胞加入含有10mL CDO4培养基(康晟生物医药有限公司，货号：A11004)的T25方瓶(无锡耐思生命科技股份有限公司，货号：707003)培养48小时。

细胞克隆的培养与筛选的具体如下步骤：将上述T25方瓶中的细胞取样，使用细胞计数仪(赛诺菲，型号：Countess II FL)进行活率监控。在活率高于70％的情况下，按照每孔10000个细胞进行96孔板的铺板，在含有25mM MSX(Sigma，货号：M5379-1G)的CD04培养液中培养，通过ELISA方法选取阳性克隆，继续进行扩大培养至125mL(无锡耐思生命科技股份有限公司，货号：781011)摇瓶，在125mL摇瓶中培养，约5-7天后，使用计数仪检测活率下降至50-80％之间时，取上清液进行ELISA检测。

ELISA检测方法如下：上清液按照10倍、100倍、1000倍、10000倍进行稀释、包被，使用1500倍稀释的F蛋白抗体(普健生物(武汉)科技有限公司，货号：62814)作为一抗，羊抗人IgG-HRP(索莱宝，货号SE101-1ml)作为二抗，使用酶标仪(上海科华，货号：RD-SH-012)进行信号读取，选出信号最强的作为最高表达样品。收获最高表达样品的上清液进行下一步纯化。

三、铁蛋白-PreF融合蛋白的纯化

按照文献Flexible RSV Prefusogenic Fusion Glycoprotein ExposesMultiple Neutralizing Epitopes that May Collectively Contribute to ProtectiveImmunity中的方法，通过Capto Lentil Lectin(Cytiva，货号：17548902)、Q Sepharose FF(Cytiva，货号：17051060)、Capto Core 400(Cytiva，货号：17372402)、Superose6prepgrade(Cytiva，货号：10321079)，对表达细胞株培养液上清进行纯化。具体纯化步骤如下：

将选定的细胞上清培养液进行8000r/min高速离心20分钟，使用0.45um滤膜(津腾，货号：JTSF 025013/014)进行过滤，得到约100mL溶液，补平衡液至200mL。使用平衡液平衡QFF柱，A1泵上样，流速1.5mL/min。上样完成后，用平衡液冲洗至吸收值回落至上样前并稳定。洗脱液(20mM Tris，0.5M NaCl，pH8.5)梯度洗脱，流速2mL/min，0-100％B，50min。收集洗脱峰。将上清液浓缩5-10倍，在流速1mL/min的流速下过Superose 6prep grade柱子，收集吸收峰的样品，得到铁蛋白-PreF融合蛋白溶液，浓缩后用于SDS-PAGE和western blot分析。

SDS-PAGE分析具体步骤如下：向80μl铁蛋白-PreF融合蛋白溶液中加入5×蛋白上样loading 20μl，95℃处理10min后离心。取15μl上清用于SDS-PAGE分析，染色处理观察蛋白表达情况。

Western blot(WB)分析具体步骤如下：

1、SDS-PAGE电泳：制备10％厚度为1.0mm的SDS-PAGE胶，在1×SDS电泳缓冲液中进行凝胶电泳，取20μl蛋白样品上样，使用80V电压待样品进入分离胶后，切换到130V。

2、半干法转膜：使用转移电泳槽(君意，货号：JY-ZY3)。准备1张与分离胶大小一致的PVDF膜和6张滤纸，并用1×膜转移缓冲液(39mM甘氨酸，48mM Tris，0.037％SDS，20％甲醇)浸湿，电泳结束后切掉多余浓缩胶和分离胶，按照阳极电极-三层浸湿滤纸-PVDF膜-蛋白胶-三层浸湿滤纸-阴极电极的方向搭建石墨电极-转移膜胶复合体，接通电源，根据凝胶面积按1.0mA/cm2恒流转膜60min。

3、封闭：用含有5％脱脂奶粉的PBST封闭缓冲液浸润膜，在37℃封闭1h。

4、一抗孵育：将封闭好的膜浸润到加有一抗(Invitrogen，RSV Fusion Protein

Polyclonal Antibody，货号：XD3556234B)的1×PBST缓冲液，置于37℃孵育60min。孵育结束后，使用1×PBST在70rpm摇床清洗膜三次，每次10min。

5、二抗孵育：加入1×PBST稀释的二抗(Bioworld，Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP，货号：AA092030)，37℃孵育45min。孵育结束后，使用1×PBST在70rpm摇床，清洗膜三次，每次10min。

6、显色：使用DAB显色试剂盒(Solarbio，货号：DA1016)进行显色。铁蛋白-PreF融合蛋白溶液的SDS-PAGE电泳检测结果如图12所示。WB检测结果如图13所示。

结果表明：上述重组质粒均分别在CHO K1Q细胞中成功表达得到大小约为74KD的目的蛋白(融合蛋白A、B、C、D、E、F、G、H)。

实施例7、铁蛋白-PreF融合蛋白的纳米颗粒形态分析

分别将实施例6中制备的融合蛋白A、B、C、D、E、F、G、H的纯化产物进行负染。具体负染操作如下：

将超薄碳膜利用Harrick Basic Plasma Cleaner PDC-32G-2仪器进行预抽真空3min，然后medium挡位辉光放电30s，取出。移液枪取4um样品滴到碳膜上，水平放置1min后，用滤纸吸干，然后滴加7um 2％的醋酸铀，放置1min，用滤纸吸干，放置数分钟后使用FEITecnai Arctica TEM D683透射电镜对负染后的纯化样品进行电镜观察。

结果如图14所示，结果表明：融合蛋白A、B、C、D、E、F、G、H的纯化产物样品在电镜中均可以观察到规则的纳米颗粒，并经过透射电镜分析，可以看到清晰的纳米颗粒形态，颗粒完整性较好。

实施例8、铁蛋白-PreF融合蛋白的免疫原性研究

一、免疫

1、实验材料与方法

实验材料：6-8周雌性Balb/c小鼠(斯贝福(北京)生物技术有限公司，货号：B201-02)。

实验方法：选取64只6-8周Balb/c小鼠，随机分成8组，每组8只，每组处理方法如下：

包含融合蛋白A、B、C、D、E、F、G或H的疫苗：分别在第0天、21天进行两次大腿肌肉注射所述疫苗，所述疫苗包括1μg的融合蛋白A、B、C、D、E、F、G或H，以及50μg氢氧化铝佐剂(长春生物制品研究所有限责任公司，批号：ZP18-003-202106)和100μl PBS缓冲液(Solarbio，货号P1020)。

二、ELISA法检测血清中的抗体

免疫后第28天(约6周)采取小鼠血清用于ELISA分析，ELISA分析具体步骤如下：使用每孔200ng的RSV的F蛋白(义翘神州，货号：11049-V08B)进行包被，小鼠血清作为一抗，按照250倍、1250倍、6250倍、31250倍、156250倍、781250倍、3906250倍进行梯度稀释，鼠二抗(Cell Signaling Technology，货号：7076S)作为二抗，使用酶标仪(上海科华，货号：RD-SH-012)进行信号读取。

经过2次免疫后的小鼠血清在ELISA中产生的效价检测结果如图15所示。结果表明：所有融合蛋白在不同浓度时均能产生一定的抗体滴度，在稀释到1250倍时，除了融合蛋白F，其它融合蛋白的ELISA OD值均能保持在0.34以上，稀释至6250倍时，融合蛋白G的ELISA OD值有所下降，但依然能保持在0.16左右，其它融合蛋白也能保持在0.32以上，即便是在稀释至781250倍时，融合蛋白D、C、B、E、H仍然有检测到ELISA信号。其中，融合蛋白C的ELISA效价最高，总体来说融合蛋白A、B、C、D、E、F、G、H均能维持一定的效价，除了融合蛋白F，其它融合蛋白均能维持稳定，高水平的效价。

三、小鼠血清CPE中和试验

使用Hep-2细胞在含有10％牛血清的DMEM培养基中培养RSV病毒A型Long株的TCID₅₀为2.81E+07。选取上述各组小鼠血清各8份，使用含有2％牛血清的DMEM培养基进行稀释。从40倍稀释开始，按照3倍稀释梯度稀释至29160倍，然后与等体积200TCID₅₀的病毒液混合，37℃放置1小时，每孔200μl铺到Hep-2细胞板，每只小鼠血清设置3个复孔，37℃培养5-7天，观察细胞病变情况。

结果如表12和图16所示。结果表明：融合蛋白C组中和效价均值最高，达到19836，RSV-PreF-C-NP组中和效价均值的Log2达到14.3。而且本发明中的融合蛋白A、D、C、E中和效价均超出了强生公司开发的同类疫苗免疫后第六周的针对A型毒株的最高效值的Log2(强生公司开发的同类疫苗免疫后第六周的针对A型毒株的最高效值的Log2约为11，换算效价约2100)。

表12、中和效价均值

编号	组别	中和效价均值
			1	RSV-PreF-A-NP	2143
2	RSV-PreF-D-NP	5217
			3	RSV-PreF-C-NP	19836
4	RSV-PreF-B-NP	1372
			5	RSV-PreF-E-NP	3343
6	RSV-PreF-G-NP	1372
			7	RSV-PreF-F-NP	361
8	RSV-Pre-H-FNP	1

按照上述实验方法，将RSV病毒A型Long株替换为RSV病毒B型BA9株，使用上述各组小鼠血清进行同样程序的效价分析。

表13、中和效价均值

结果如表13所示。结果表明：RSV-PreF-C-NP小鼠血清中和效价均值为10568，log2值为13.4。本发明中的RSV-PreF-A-NP、RSV-PreF-D-NP、RSV-PreF-C-NP、RSV-PreF-E-NP均接近或超过效价2100。

以上结果表明：将本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白注射至小鼠，可以获取到高保护效价的血清，且小鼠血清针对RSV主要流行毒株A型和B型均可产生较高的中和效价。

实施例9、铁蛋白-PreF融合蛋白的稳定性试验

为了验证本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白的稳定性，将纯化后的各组铁蛋白-PreF融合蛋白进行物理稳定性(物理环境挑战)试验，具体步骤如下：

将5份40μg/μl的铁蛋白-PreF融合蛋白溶液以及梯度稀释后的铁蛋白-PreF融合蛋白溶液分别放置在pH7.4(25℃)、pH3.8(25℃)、pH10(25℃)、50℃(pH7.4)、70℃(pH7.4)的环境中1小时(分别对应图中从左往右1-5列)，采用与细胞克隆筛选相同的方法进行ELISA分析。

结果表明：各组融合蛋白在不同pH和温度处理后的抗原结合活性均保持在原始未处理蛋白的75％以上。说明本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白均具备足够的物理稳定性。如表14所示为RSV-PreF-C-NP蛋白的稳定性结果，其他各组的结果类似。

表14、物理环境挑战后ELISA信号强度保留百分比

注：表中结果为10、100、1000、10000倍共4个稀释梯度的平均值。

实施例10、铁蛋白-PreF融合蛋白的安全性实验

为了验证本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白免疫后所引发的免疫反应中Th1\Th2的平衡性(参考文献：Immunological Lessons from Respiratory SyncytialVirusVaccine Development)，选择铁蛋白-PreF融合蛋白RSV-PreF-C-NP免疫后的小鼠血清进行了IgG1和IgG2a的ELISA分析，ELISA分析采用与血清ELISA检测相同的设置，二抗分别使用IgG1特异性二抗(abcam，货号：GR3395386-5)和IgG2a特异性二抗(abcam，货号：GR3413688-1)。同时以福尔马林灭活疫苗FI-RSV以及强生公司开发的同类疫苗作为对照。

结果如图17所示，结果表明：血清中IgG1和IgG2a的滴度达到了约6(见图17中的RSVNP IgG1和RSVNP IgG2a)，而且其比例约等于1，明显优于福尔马林灭活疫苗(见图17中的FI-RSVNP IgG1和FI-RSV IgG2a)，甚至优于强生公司开发的同类疫苗(IgG2a约5.8和IgG1约5)。说明本发明制备的铁蛋白-PreF融合蛋白注射后引起的免疫反应是Th1/Th2平衡的，可以避免Th2偏激所导致的免疫过激反应(简称VED)，具备较好的安全性。

实施例11流感和RSV联合疫苗的制备

将实施例1和实施例6中制备的两种疫苗原液按最终疫苗抗原含量2倍等体积混合后，用选自注射用水、0.01MPBS(pH6.8-7.2)和含有氢氧化铝的0.01MPBS(pH 6.8-7.2)的溶液稀释，置于磁力搅拌器低速搅拌1h，最终H1N1、H3N2、BV、BY四种型别血凝素为16.5μg/剂/0.5ml(血凝素共66μg/剂/0.5ml)，RSV-PreF-C-NP抗原为1μg/剂/0.5ml，其中含有浓度为50μg/剂/0.5ml的氢氧化铝。

实施例12流感和RSV联合疫苗的免疫原性实验

1.流感和RSV联合疫苗的免疫原性实验

取6-8周龄Balb/c雌性小鼠30只，随机分为6组，将如实施例11所述制备的联合疫苗(流感+RSV二联疫苗)，按照0.5ml剂量通过腹腔注射接种小鼠，进行疫苗的免疫原性研究。按表15设计的免疫方案免疫动物，第0，21d共免疫两次，通过检测二免21d血清针对HIN1/H3N2/BY/BV血抑效价(测定方法见国家流感中心出具的sop：红细胞凝集抑制试验鉴定流感/禽流感病毒方法，文件编号：CNICSOP07025)和针对RSV-A和RSV-B真病毒中和抗体效价，筛选到最佳联合疫苗处方。

表15、疫苗不同处方免疫小鼠的免疫方案

结果见表16和表17：

表16：流感RSV联合疫苗免疫后抗流感抗体水平

由表16可知，免疫后42天(二免后21天)，流感和RSV联合疫苗(组别6、7)和流感疫苗(组别3、5)相比，流感病毒抗体滴度基本相当；加佐剂组(组别5、7)抗体效价均比不加佐剂组(组别3、6)均略有提高。以上试验说明，RSV疫苗组分对流感疫苗组分没有影响，佐剂对流感疫苗有免疫促进作用。

表17：流感RSV联合疫苗免疫后抗RSV-A和RSV-B真病毒病毒中和抗体水平

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由表17可知，免疫后42天(二免后21天)，流感和RSV联合疫苗(组别6、7)和RSV疫苗组(组别2、4)相比，针对RSV-A、RSV-B真病毒中和抗体效价没有显著性差异。而加佐剂组(组别4、7)与不加佐剂组(组别2、6)相比，针对RSV-A和RSV-B真病毒中和抗体效价有明显提高，说明佐剂对RSV疫苗有显著的免疫促进作用。以上试验说明，流感疫苗各组分对RSV疫苗组分没有抑制作用。

综上：本发明为四价流感裂解疫苗和RSV纳米颗粒疫苗的联合疫苗，联合后，两种抗原组分疫苗之间没有相互抑制，能很好兼容，针对流感病毒四个型别和针对RSV两个型别均可以产生较高的中和抗体效价。

实施例13流感、新冠和RSV联合疫苗的制备

将实施例1、实施例2和实施例6中制备的三种疫苗原液按最终疫苗抗原含量3倍等体积混合后，用选自注射用水、0.01MPBS(pH6.8-7.2)和含有氢氧化铝的0.01MPBS(pH 6.8-7.2)的溶液稀释，置于磁力搅拌器低速搅拌1h，最终H1N1、H3N2、BV、BY四种型别血凝素为16.5μg/剂/0.5ml(血凝素共66μg/剂/0.5ml)，RBD8MFoldon抗原为5μg/剂/0.5ml，RSV-PreF-C-NP抗原为1μg/剂/0.5ml，其中含有浓度为50μg/剂/0.5ml的氢氧化铝。

实施例14流感、新冠和RSV联合疫苗的免疫原性实验

1.流感、新冠和RSV联合疫苗的免疫原性实验

取6-8周龄Balb/c雌性小鼠30只，随机分为6组，将如实施例13所述制备的联合疫苗(流感疫苗+新冠疫苗+RSV疫苗的三联疫苗)，按照0.5ml剂量通过腹腔注射接种小鼠，进行疫苗的免疫原性研究。按表18设计的免疫方案免疫动物，第0，21d共免疫两次，通过检测二免21d血清针对HIN1/H3N2/BY/BV血抑效价(测定方法见国家流感中心出具的sop：红细胞凝集抑制试验鉴定流感/禽流感病毒方法，文件编号：CNICSOP07025)和针对RSV-A和RSV-B真病毒中和抗体效价；针对Omicron BF.7、Omicron BQ.1.1、Omicron XBB假病毒中和抗体效价筛选到最佳联合疫苗处方，假病毒信息见实施例3中的表4。

表18、疫苗不同处方免疫小鼠的免疫方案

结果见表19、表20和表21：

表19：三价联合疫苗免疫后抗流感抗体水平

由表19可知，免疫后42天(二免后21天)，三联疫苗组(组别9、10)抗体效价比流感疫苗组(组别3、4)，除了H3N2流感病毒抗体滴度有略微降低外，其余3个型别的流感病毒滴度均有所提高，表明RSV疫苗和新冠疫苗组分对流感疫苗组分没有明显的抑制作用，三者联合还可以提高部分型别的流感病毒的抗体滴度；加佐剂组(组别4、10)和不加佐剂组(组别3、9)相比，佐剂对流感疫苗免疫略有促进作用。

表20：三价联合疫苗免疫后抗新冠Omicron流行株假病毒中和抗体水平

由表20可知，免疫后42天(二免后21天)，三联疫苗(组别9、10)和单价新冠疫苗(组别4、7)相比，针对Omicron BF.7、Omicron BQ.1.1、Omicron XBB假病毒中和抗体效价有提高，但相对于流感和新冠的二联疫苗，三联疫苗中Omicron BF.7和Omicron XBB中和抗体略有下降(但没有显著性差异)，可能是三联疫苗分子之间干扰略有影响其作用。加佐剂(组别7、10)与不加佐剂组(组别4、9)相比，针对Omicron BF.7、Omicron BQ.1.1、Omicron XBB假病毒中和抗体效价有明显提高，说明佐剂对新冠疫苗有显著的免疫促进作用。

表21：三价联合疫苗免疫后抗RSV-A和RSV-B真病毒病毒中和抗体水平

由表21可知，免疫后42天(二免后21天)，三联疫苗(组别9、10)和单价RSV疫苗(组别5、8)相比，针对对RSV-A和RSV-B真病毒中和抗体效价没有显著差异，相对于流感和RSV的二联疫苗(表17)，三联疫苗中针对RSV-A和RSV-B真病毒中和抗体略有降低(但没有显著性差异)，可能是三联疫苗分子之间干扰略有影响其作用。同时，加佐剂(组别8、10)与不加佐剂组(组别5、9)相比，针对RSV-A和RSV-B真病毒中和抗体效价有明显提高，说明佐剂对RSV疫苗有明显的免疫促进作用。

综上：本发明的四价流感裂解疫苗、重组新冠三聚体疫苗和RSV纳米颗粒疫苗的三联联合疫苗，联合后，抗原组分疫苗之间没有明显的相互抑制，能很好兼容，针对流感病毒四个型别和针对新冠病毒3种流行突变株可以协同产生较高的中和抗体效价。

实施例15三联联合疫苗制品的动物安全性评价

1：豚鼠的全身主动过敏反应性

方法：试验使用36只雌性豚鼠，随机分为4组，分别为阴性对照组、阳性对照组、供试品低、高剂量组，每组9只。阴性对照组给予氯化钠注射液；阳性对照组给予人血白蛋白；供试品低、高剂量组给予联苗供试品”(致敏：0.1和1剂/只；激发：0.2和2剂/只)。致敏采用肌肉注射给药，隔日1次，共3次，末次致敏后14天(D19)对每组前3只动物进行激发，末次致敏后21天(D26)对每组后6只动物进行激发，激发采用足部静脉注射给药，激发后观察各组动物是否出现过敏反应症状。

结果：试验期间，各组动物临床观察均未见异常反应，供试品高剂量组3/9的动物于D5可见体重降低，4/9的动物体重增长缓慢，考虑可能与供试品有关，其余各组动物体重呈增长趋势，未见明显异常改变。

末次致敏后14天(D19)及末次致敏后21天(D26)静脉激发后，阴性对照组、供试品低、高剂量组动物均未见过敏反应症状，过敏反应均呈阴性。末次致敏后14天静脉激发后，阳性对照组的前3只动物出现不同程度的过敏症状，包括竖毛、搔鼻、咳嗽、呼吸急促、排尿、排粪、哮鸣音、步态不稳、痉挛和潮式呼吸，其中有1只动物出现死亡，过敏反应呈阳性至强阳性。末次致敏后21天静脉激发后，阳性对照组的后6只动物出现不同程度的过敏症状，包括竖毛、搔鼻、咳嗽、排尿、排粪、呼吸困难、哮鸣音、步态不稳、痉挛和潮式呼吸，其中有2只动物死亡，过敏反应呈阳性至极强阳性。

结论：在本试验条件下，联苗(流感+新冠+RSV)以0.1和1剂/只的剂量肌肉注射致敏，以0.2和2剂/只剂量静脉注射激发，豚鼠过敏反应为阴性。

2三联联合疫苗单次肌肉注射给予SD大鼠的毒性试验

方法：试验共使用20只SD大鼠(10只/性别)，随机分为2组(5只/性别/组)，分别为阴性对照组和供试品组。阴性对照组动物单次肌肉注射给予0.9％氯化钠注射液；供试品组动物单次肌肉注射给予3剂/只的联合疫苗(见实施例13)。所有动物注射部位为双后肢腓肠肌和股四头肌，注射容量为1.5mL/只，上述所有动物每点注射量为0.25mL。试验期间，观察记录动物的死亡/濒死、临床症状、体重以及食量。

结果：试验期间，阴性对照组以及3剂/只的供试品组动物均未见死亡或濒死情况。所有动物临床观察和体重均未见明显与给药相关异常改变。供试品组动物于D1～D4可见食量减少，D4之后恢复正常。未见给药对动物摄食量造成影响；病理学大体解剖肉眼观察结果显示，各组动物主要脏器和组织均未见异常改变。表明联苗安全性较好，最大耐受剂量(MTD)大于或等于3剂/只。

同时对实施例4、11的二联联合疫苗的动物安全性做出评价，结果和三联联合疫苗相似。

结论：我们对联合疫苗进行了初步的安全性评价，从豚鼠的全身主动过敏反应性和单次肌肉注射给予SD大鼠的毒性试验结果可以看出，联合疫苗具有很好的安全性。

实施例16、三联联合疫苗制品的稳定性评价

通过初步稳定性试验，考察本品在不同环境条件(温度)下药品特性随时间变化的规律，以认识和预测药品的稳定性趋势，为药品生产、包装、贮存、运输条件的确定和有效期的建立提供科学依据。主要进行了加速试验和长期试验对稳定性进行考察。

加速试验是通过加速药物制剂的化学和物理变化，探讨药物制剂的稳定性，为处方设计、工艺改进、质量研究、包装改进、运输、贮存提供必要的资料。取供试品1批，对在温度37±2℃、相对湿度(RH)60±10％条件下放置2周；在第1周、第2周时取样检测并将结果和0天比较。在温度25±2℃、相对湿度(RH)60±10％放置6个月；在第1月、第3月、第6月时取样检测并将结果和0天比较。对各项质量指标检测以确定该制剂的稳定性。

长期试验是在接近药品实际贮存条件下进行，其目的是为制定药品的有效期提供依据，取供试品3批，，在温度5±3℃的条件下放置18月，分别在第0天、第6月、12月、18月进行关键指标检测，检测结果和0天比较。

表22 20220601批三联联合疫苗在37±2℃保存时各个指标的检测

结果：三联联合疫苗在温度37±2℃、相对湿度(RH)60±10％保存2周时，流感血凝素含量新冠抗原含量、RSV抗原含量均保持在有效剂量内(配制量的80％)，随着放置时间的延长，血凝素下降明显，在3周时H1N1、H3N2、Bv、By均降到了有效剂量以下；新冠抗原剂量和RSV抗原含量均下降明显，其他指标(无菌、异常毒性、内毒素)均符合要求。表明：三联联合疫苗在温度37±2℃、相对湿度(RH)60±10％条件下，可保存两周。

表23 20220601批三联联合疫苗在25±2℃保存时各个指标的检测

结果：三联联合疫苗在温度25±2℃、相对湿度(RH)60±10％保存1月时，流感血凝素含量新冠抗原含量、RSV抗原含量均保持在有效剂量内(配制量的80％)，随着放置时间的延长，血凝素下降明显，在3月时H1N1、H3N2、Bv、By均降到了有效剂量以下；新冠抗原剂量和RSV抗原含量均下降明显，其他指标(无菌、异常毒性、内毒素)均符合要求。表明：三联联合疫苗在温度25±2℃、相对湿度(RH)60±10％条件下，保存1月较为稳妥。

表24 20220601批三联联合疫苗在5±3℃保存时各个指标的检测

结果：三联联合疫苗在温度5±3℃的条件下放置6个月后，血凝素含量稳定，新冠和RSV抗原含量稳定。

可见无论是加速和长期保存，本发明的三联联合疫苗血凝素含量稳定，新冠和RSV抗原含量稳定，方便运输和储存。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗包括：I、包括来自SARS-CoV-2的融合蛋白的新冠疫苗原液；II、包括来自流感病毒的血凝素的流感疫苗原液和III、包括来自RSV的融合蛋白的RSV疫苗原液中的至少两种，其中，

I、所述来自SARS-CoV-2的融合蛋白包括SARS-CoV-2的刺突蛋白(S蛋白)RBD的突变蛋白，所述突变蛋白包括相对于野生型S蛋白RBD的突变，所述突变包括第28、99、126、128、134、142、166和/或168位中一个或者多个位点的突变；

II、所述血凝素来自至少一种流感病毒亚型；

III、所述来自RSV的融合蛋白包括pre-F蛋白的突变蛋白，所述突变蛋白包括相对于野生型pre-F蛋白的突变，所述突变包括第67、88、110、144、159、173、202、227、236、248、289、309、334、344、370、389、419和/或468位中一个或者多个位点的突变。

2.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，在I、所述来自SARS-CoV-2的融合蛋白中，所述突变蛋白的突变包括取代、缺失和/或添加，

优选的，所述S蛋白RBD的突变蛋白包括选自下列残基取代的突变：R28T、K99N、K126T、G128S、L134R、N142K、E166A和/或F168V，

更优选的，所述S蛋白RBD的突变蛋白包括下述任一种：

A1-I)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2-I)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1-I)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质，进一步优选的，所述氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加发生在第28、99、126、128、134、142、166和168位之外。

3.根据权利要求1-2任一所述的联合疫苗，其特征在于，在I、所述来自SARS-CoV-2的融合蛋白中，所述来自SARS-CoV-2的融合蛋白还包括多聚体标签蛋白，

优选的，所述多聚体为三聚体或二聚体，

更优选的，所述多聚体为三聚体，所述三聚体标签蛋白包括但不限于T4噬菌体纤维蛋白“折叠”三聚体结构域(T4Foldon)、源自酵母转录激活因子GCN4的异亮氨酸拉链和卷曲螺旋三聚体结构域、前胶原C－前肽结构域(Trimer-Tag)、大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase)的催化亚基、胶原蛋白XV的三聚体结构域、胶原蛋白XVIII的三聚体结构域、真核热休克转录因子的卷曲螺旋三聚体结构域，

进一步优选的，所述T4Foldon的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第252-277位所示，或者上述序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.4的第252-277位所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质，

优选的，所述多聚体标签蛋白直接或通过接头连接在所述突变蛋白的N端或C端，

更优选的，所述接头可为柔性肽接头，如包括甘氨酸和/或丝氨酸残基的肽接头，进一步优选的，所述接头为GGGGS(SEQ ID No.9)、GSGSGSG(SEQ ID No.10)、GGGGSGGGGS(SEQ IDNo.11)或GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No.12)。

4.根据权利要求1-3任一所述的联合疫苗，其特征在于，在I、所述来自SARS-CoV-2的融合蛋白中，来自SARS-CoV-2的融合蛋白可包括下述任一种：

B1-I)氨基酸序列包括SEQ ID No.4的第26-244位和第252-277位，或者包括SEQ IDNo.4的第26-277位的蛋白质；

B2-I)将B1-I)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1-I)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

B3-I)在B1-I)或B2-I)的N端和/或C端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质；

其中优选，B3-I)所述融合蛋白质可包括下述任一种：

C1-I)氨基酸序列包括SEQ ID No.4的第1-277位的蛋白质或将SEQ ID No.4的第1-277位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.4的第1-277位所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

C2-I)氨基酸序列包括SEQ ID No.4的蛋白质或将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.4所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

和/或，

在II、包括来自流感病毒的血凝素的流感疫苗原液中，所述流感病毒至少包括甲型流感病毒，例如H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8，优选的，所述流感病毒至少包括H1N1和H3N2亚型；或者所述流感病毒包括甲型和乙型流感病毒，优选的，所述流感病毒至少包括H1N1、H3N2亚型、乙型BY和BV亚型；

和/或，

在III、包括来自RSV的融合蛋白的RSV疫苗原液中，

所述突变包括在第88位的突变，优选的，所述突变包括在第88和289位的突变，或者包括在第88和389位的突变，进一步优选的，所述突变包括在第88、289、309和468位的突变；第67、88、144和389位的突变；或者在第67、88、110、144、289、309、389和468位的突变，或者，

所述突变包括在第202和334位的突变，优选的，所述突变包括在第202位、334和389位的突变，或者在第202位、289和334的突变；进一步优选的，所述突变包括在第159、202、248、334、344和389位，第67、110、144、202、227、248、334、344和389位，第159、202、289、334、344和468位，或者第67、110、144、159、202、236、248、289、309、334、370、389、419和468位的突变。

优选的，所述突变包括在143和144之间插入半胱氨酸，

优选的，所述突变包括替换、插入和/或缺失，

更优选的，所述突变包括如下a1-III)-a19-III)中至少一种突变后得到的蛋白：

a1-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第67位的异亮氨酸突变为天冬酰胺；

a2-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第88位的丝氨酸突变为天冬酰胺；

a3-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第110位的半胱氨酸突变为丙氨酸；

a4-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第143位和第144位氨基酸之间插入甘氨酸；

a5-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列在第144位天冬酰胺突变为半胱氨酸；

a6-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第159位的酪氨酸突变为半胱氨酸；

a7-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第173位的半胱氨酸缺失；

a8-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第202位的丙氨酸突变为半胱氨酸；

a9-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第227位的异亮氨酸突变为天冬酰胺；

a10-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第236位的丝氨酸突变为精氨酸；

a11-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第248位的丝氨酸突变为半胱氨酸；

a12-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第289位的谷氨酸突变为天冬酰胺；

a13-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第309位的丝氨酸突变为天冬酰胺；

a14-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第334位的精氨酸突变为酪氨酸；

a15-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第344位的天冬酰胺突变为谷氨酸；

a16-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第370位的丝氨酸突变为甘氨酸；

a17-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第389位的天冬酰胺突变为半胱氨酸；

a18-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第419位的半胱氨酸突变为酪氨酸；

a19-III)将Pre-F蛋白氨基酸序列第468位的精氨酸突变为天冬酰胺，

进一步优选的，所述pre-F蛋白的突变蛋白包括如下任一种：

(A1-III)SEQ ID No.15-22所示的蛋白；

(A2-III)在(A1-III)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(A3-III)将(A1-III)-(A2-III)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；

(A4-III)与(A1-III)-(A2-III)任一种具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白；

优选的，所述来自RSV的融合蛋白还包括铁蛋白突变体；

所述铁蛋白突变体为将野生型铁蛋白氨基酸序列进行如下b1-III)-b3-III)中至少一种突变后得到的蛋白：

b1-III)将野生型铁蛋白氨基酸序列第15位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺；

b2-III)将野生型铁蛋白氨基酸序列第96位的丝氨酸突变为天冬酰胺；

b3-III)将野生型铁蛋白氨基酸序列第119位的酪氨酸突变为精氨酸，

更优选的，所述来自RSV的融合蛋白包括如下任一种：

(C1-III)SEQ ID No.25-32所示的蛋白；

(C2-III)在(C1-III)所述蛋白的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(C3-III)将(C1-III)-(C2-III)任一种经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；

(C4-III)与(C1-III)-(C2-III)任一种具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白。

5.根据权利要求1-4任一所述的联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗还包括IV、佐剂和/或V、疫苗递送系统，优选的，所述佐剂包括铝佐剂和/或CpG双佐剂，更优选的，所述CpG佐剂包括CpG1018佐剂、CpG-cjx1和/或CpG7909佐剂，进一步优选的，所述疫苗原液：佐剂质量比为1：(40-60)。

6.根据权利要求1-5任一所述的联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗包括：

①、I、来自SARS-CoV-2的融合蛋白和II、来自流感病毒的血凝素，或者，

②、I、来自SARS-CoV-2的融合蛋白和III、来自RSV的融合蛋白，或者，

③、II、来自流感病毒的血凝素和III、来自RSV的融合蛋白，或者，

④、I、来自SARS-CoV-2的融合蛋白、II、来自流感病毒的血凝素和III、来自RSV的融合蛋白。

7.根据权利要求1-6任一所述的联合疫苗，其特征在于，所述I、来自SARS-CoV-2的融合蛋白包括SEQ ID No.4所示的第26-244和252-277位或者SEQ ID No.4所示的第26-277位，所述来自SARS-CoV-2的融合蛋白的含量为10-80μg/ml，

所述II、来自流感病毒的血凝素的流感疫苗原液来自于H1N1、H3N2亚型、乙型BY和BV亚型，每种亚型的血凝素含量为15-50μg/ml，

所述III、来自RSV的融合蛋白包括SEQ ID No.15-22的任意序列或SEQ ID No.25-32的任意序列，所述来自RSV的融合蛋白的含量为1-10μg/ml。

所述IV佐剂包括铝佐剂和/或CpG佐剂，铝佐剂的含量为400-600μg/m，所述CpG佐剂的含量为10-30μg/ml。

8.权利要求1-7任一所述的联合疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

1)制备包括来自SARS-CoV-2的融合蛋白的新冠疫苗原液；

2)制备包括来自流感病毒的血凝素的流感疫苗原液，和/或，

3)制备包括来自RSV的融合蛋白的RSV疫苗原液；

优选的，所述制备方法包括将编码所述来自SARS-CoV-2的融合蛋白和/或RSV的融合蛋白的核酸分子在宿主细胞中进行表达得到所述融合蛋白，

更优选的，所述编码来自SARS-CoV-2的融合蛋白的核酸分子包括下述任一种：

E1-I)、编码序列包括SEQ ID No.2全长或者包括SEQ ID No.3的第76-732和754-831位，例如是SEQ ID No.2全长、SEQ ID No.3的第76-831位、SEQ ID No.3的第1-831位或SEQID No.3全长的DNA分子；

E2-I)、核苷酸序列包括SEQ ID No.2全长或者包括SEQ ID No.3的第76-732和754-831位，例如是SEQ ID No.2全长、SEQ ID No.3的第76-831位、SEQ ID No.3的第1-831位、SEQID No.3或SEQ ID No.7全长的DNA分子。

E3-I)、E1-I)或E2-I)的互补或者简并序列；

E4-I)、与E1-I)、E2-I)、E3-I)具有至少75％以上的同一性，并能编码上述任意融合蛋白的DNA分子，

更优选的，所述编码RSV的融合蛋白的核酸分子包括E1-III)-E3-III)：

E1-III)、SEQ ID No.33-40任意序列的第1-1422或者全长所示的DNA分子；

E2-III)、E1-III)的互补或者简并序列；

E3-III)、与E1-III)或E3-III)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述融合蛋白的DNA分子；

优选的，所述步骤2)包括流感病毒扩增、收获、裂解和灭活。

9.权利要求1-7任一所述的联合疫苗的应用，其特征在于，所述应用包括下述任一种：

F1)在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2、流感病毒和/或RSV感染引起的疾病的产品中的应用；

F2)在制备用于诱导SARS-CoV-2、流感病毒和/或RSV抗原免疫反应的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂或药物组合物，优选的，所述F1)和F2)中所述产品包括SARS-CoV-2、流感病毒和/或RSV抗体，包括全长抗体或抗原结合片段，例如Fab片段、Fv片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、单链抗体(ScFv)、纳米抗体(单域抗体)、双特异性抗体或最小识别单位。

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