CN110229219A

CN110229219A - 一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途

Info

Publication number: CN110229219A
Application number: CN201910547720.2A
Authority: CN
Inventors: 肖庚富; 张艳君; 朱圣淋; 张磊珂; 吴妍
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2019-06-21
Filing date: 2019-06-21
Publication date: 2019-09-13
Anticipated expiration: 2039-06-21
Also published as: CN110229219B

Abstract

本发明公开了一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途，涉及生物医药技术领域，该疫苗蛋白包括至少一种呼吸道合胞病毒的F蛋白以及至少一种呼吸道合胞病毒的SH蛋白组成的融合蛋白，该融合蛋白能有效刺激机体产生较高滴度的中和抗体以及SH蛋白特异性抗体，在病毒感染时，能够有效清除受试者肺部的病毒滴度，同时，也能减轻受试者肺部因病毒感染引起的病理损伤，此外，还能够降低被感染者肺部的促炎症因子含量。

Description

一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途。

背景技术

目前，呼吸道合胞病毒属于单股负链RNA病毒目，肺病毒科，正肺炎病毒属，根据病毒表面的抗原特性差异分为A和B两个亚型。病毒基因组为单链负义非分节的RNA，共包含10个基因，编码11个蛋白。呼吸道合胞病毒是引起婴幼儿下呼吸道疾病的重要病原体之一，婴幼儿时期感染呼吸道合胞病毒是引起支气管炎及哮喘的重要因素，而且呼吸道合胞病毒可以重复感染并引起相关的疾病症状。

由于接种福尔马林灭活的全病毒疫苗所造成的疫苗引起的疾病增强现象，严重阻碍了呼吸道合胞病毒的疫苗研究进展，呼吸道合胞病毒的疫苗设计面临着很多困难与挑战。截止到目前为止，并未有安全有效的呼吸道合胞病毒疫苗批准上市。

呼吸道合胞病毒的F糖蛋白参与病毒进入的膜融合过程，能够刺激引起机体有效的抗体应答反应。目前FDA批准的用于抑制呼吸道病毒感染的帕丽珠单抗所识别的抗原表位位于F糖蛋白表面，并且F蛋白的氨基酸在病毒的两个亚型中相对保守，因此F蛋白是呼吸道合胞病毒疫苗设计的重要靶位点之一。

目前，进入到临床阶段的呼吸道合胞病毒疫苗有约18种，其中有11种含有F蛋白抗原。F糖蛋白作为呼吸道合胞病毒疫苗的抗原之一，但是现有F蛋白亚单位疫苗刺激机体产生的中和抗体滴度较低。

发明内容

为了弥补现有F蛋白单位疫苗刺激机体产生的中和抗体滴度较低的技术问题，本发明提供了一种新的针对呼吸道合胞病毒的疫苗抗原，该疫苗抗原包括至少一种呼吸道合胞病毒的F蛋白以及至少一种呼吸道合胞病毒的SH蛋白。

本申请的发明人将F蛋白和SH蛋白组成的疫苗抗原作为新型疫苗，其能够由此刺激机体产生较高滴度的中和抗体以及SH蛋白特异性抗体，在病毒感染时，能够有效清除受试者肺部的病毒滴度，同时，也能减轻受试者肺部因病毒感染引起的病理损伤，此外，还能够降低被感染者肺部的促炎症因子含量。

优选地，本发明实施例提供的疫苗抗原为F蛋白和SH蛋白的融合蛋白。

更优选地，融合蛋白中的SH蛋白优选采用呼吸道合胞病毒的SH蛋白的胞外域(SHe)，组成的融合蛋白为融合蛋白F-SHe。具体地，融合蛋白F-SHe的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。编码该融合蛋白F-SHe的核酸分子的碱基序列如SEQ ID No.4所示。

相对于F蛋白与SH蛋白混合作为疫苗抗原进行的免疫，将融合蛋白F-SHe免疫机体，更能有效刺激机体的免疫应答，在病毒感染时，即能有效降低被感染者的肺部病理滴度，又能减轻被感染者肺部的病理损伤。

进一步地，本申请的发明人通过付出一系列创造性劳动，优化了上述融合蛋白的序列，通过密码子优化以及蛋白氨基酸序列的优化，有效提高了融合蛋白的表达水平。具体地，序列优化后，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码该优化后的融合蛋白的核酸分子的碱基序列如SEQ ID No.5所示。

进一步地，发明人将F蛋白的第26～513位氨基酸(去除136～145位氨基酸，提高表达效率)与SH蛋白的26个氨基酸克隆到表达载体上，F蛋白与SH蛋白之间通过GS linker(接头序列)相连。GS linker的序列为CGGGS。

相对于没有去除融合肽的融合蛋白，去除了融合肽的融合蛋白能够更有效刺激机体产生较高滴度的中和抗体。去除了融合肽的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，编码去除了融合肽的融合蛋白的核酸分子的碱基序列如SEQ ID No.6所示。

需要说明的是，在上述优化前的融合蛋白的基础上，去除融合肽也在本发明的保护范围中。

本发明实施例还提供了一种表达载体，其包括有上述疫苗抗原的融合蛋白的编码序列，该表达载体用于转载上述疫苗抗原的编码序列。

优选地，该表达载体可以为PsecTag2A。

本发明实施例还提供了一种疫苗抗原的制备方法，其包括在使宿主细胞能够产生上述疫苗抗原的条件下，将一个或多个上述表达载体导入宿主细胞。

优选地，宿主细胞选自真核细胞。F蛋白为病毒的膜蛋白，采用真核细胞为宿主细胞具有表达优势，能够更有效地完成蛋白的翻译后修饰等过程。

优选地，宿主细胞采用真核悬浮细胞，悬浮细胞表达蛋白能够提高蛋白的表达产量，且悬浮细胞培养所使用的为无血清的培养基，方便进行后续的蛋白纯化工作，避免了血清等不明成分的蛋白干扰。需要说明的是，在一些实施例中，也可以通过其他的宿主细胞所代替，例如CHO-S细胞，昆虫细胞表达，以及其他的贴壁细胞。表达条件中所采用的转染试剂以及转染方法也可以用其他方法代替。

进一步地，上述将表达载体导入宿主细胞具体包括将表达载体与转染试剂混合后转染宿主细胞，转染试剂优选为PEI，转染试剂与表达载体的质量比为1.25：(4.1～5.5)。

进一步优选地，上述导入包括将转染试剂与表达载体混合后的混合物室温静置5～15min后转染宿主细胞，转染后4～6h，加入转染体系40％～60％体积的新鲜培养基和18～22mM的VPA。

进一步地，宿主细胞表达得到融合蛋白F-SHe后，制备方法还包括对F-SHe蛋白进行蛋白纯化。优选地，蛋白纯化包括将上述转染后得到的细胞溶液进行离心，收集细胞上清，对细胞上清通过透析、亲和层析纯化后，得到纯化后的融合蛋白。

进一步优选地，上述离心条件为：4800～5200rpm，0～6℃离心8～12min，以去除细胞；

上述透析的条件为：将离心后的细胞上清转移到7～14Mw的透析袋中，在90～110mM磷酸盐、140～160mM NaCl、pH7.0～7.6的溶液中2～6℃透析过夜；

上述亲和层析纯化的条件为：将透析后的细胞上清通过亲和层析进行富集，然后采用90～110mM磷酸盐，140～160mM NaCL,280～320mM咪唑(post-fusion F 280～320mM咪唑，pre-fusion F 80～120mM咪唑)pH 7.2～7.6进行洗脱。具体地，可以采用镍柱亲和层析来纯化，然后用300mM的咪唑洗脱，得到的蛋白通过SDS-PAGE鉴定其纯度。需要说明的是，采用镍柱亲和层析对融合蛋白F-SHe进行蛋白纯化取决于融合蛋白F-SHe所携带的标签，在其他实施例中，也可以通过更换标签选择其他的纯化方法。

进一步地，本发明实施例提供的制备方法包括对蛋白纯化后的融合蛋白继续拧浓缩，优选采用超滤管进行浓缩，浓缩后，将融合蛋白与佐剂混合，佐剂优选为MPL。

具体地，浓缩步骤包括将蛋白纯化后的融合蛋白F-SHe透析在PBS溶液中，通过超滤管进行浓缩，然后采用BCA蛋白定量试剂盒确定蛋白的浓度。

本发明实施例还提供一种免疫原性组合物，其包括至少一种上述的疫苗抗原。优选地，该免疫原性组合物还可以包括有佐剂，佐剂优选主要含有MPL(单磷酰脂质A，3-0-descyl-4’-monophosphoryl lipidA)。

优选地，本实施例提供的免疫原性组合物中，佐剂由以下方法制得：在MPL中加入2％triethylamine生理盐水，v/v，溶解，溶解后MPL的浓度为2mg/ml，65℃水浴锅中溶解5min，并用涡旋仪振荡，以便MPL充分溶解。

进一步优选地，在免疫原性组合物中，佐剂和融合蛋白的质量比为1：(1～3)，优选为1：2。

此外，本发明实施例还提供一种在对象中产生针对呼吸道合胞病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予对象有效量的上述免疫原性组合物。

具体地，该方法包括给予患者有效量的免疫原性组合物，可通过粘膜、皮内、皮下、肌肉内和/或口服来给予免疫原性组合物，在某些方面，接种引起的免疫应答使得该对象可抵御一种或多种呼吸道合胞病毒的多种亚型。

优选地，该方法能够用于以非治疗诊断为目的应用中。

本发明实施例还提供了上述融合蛋白F-SHe在制备用于抑制促炎症因子降低的药物中的应用。

优选地，上述促炎症因子优选为IL-1β和MIP-1α。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例2中提供的F-SHe融合蛋白的免疫效果图，其中，附图1A为中和抗体滴度图，附图1B为针对SH蛋白胞外域的抗体滴度图；

图2为本发明实施例2中感染后小鼠肺部的病毒滴度(图2A)和体重的检测结果图(图2B)；

图3为本发明实施例2中感染后第7天，小鼠体重的检测结果图；

图4为本发明实施例2中病理损伤的实验结果图，其中，图4A为病理切片染色结果图，图4B为对疫苗对肺部的炎症状况的打分结果图；

图5为本发明实施例2中融合蛋白F-SHe对被感染者体内IL-1β的含量影响的结果图；

图6为本发明实施例2中融合蛋白F-SHe对被感染者体内MIP-1α的含量影响的结果图；

图7为本发明对比例1中优化制备工艺前后蛋白产量的检测图；

图8为本发明对比例2中融合蛋白F-SHe序列优化前后的蛋白表达量的差异结果图；

图9为本发明对比例3中融合蛋白F-She与F蛋白、SH蛋白混合的差异结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

定义

本发明提供的疫苗抗原能够在合适的表达系统中重组表达蛋白质后自发形成，生成特定疫苗抗原的方法在本领域中已知，并在下文中更详细地讨论。重组表达病毒蛋白后，疫苗抗原的存在能够采用本领域已知的常规技术进行检测，领域通过电子显微镜、生物物理和免疫学表征等。

本文所述的有效量为足以实现生物学效果所需的疫苗抗原剂量。组合物的有效量可以是获得所需结果的量，该量可以由本领域技术人员通过常规实验确定。

本文中“佐剂”是指当在制剂汇总与特定免疫抗原(疫苗抗原)组合使用时，能够增强或改良其所产生的的免疫应答的化合物。

实施例1

本实施例提供的一种呼吸道合胞病毒疫苗的制备方法，其包括以下步骤。

1.构建融合蛋白F-SHe的表达质粒：

将F蛋白的26～513(去除融合肽136～145氨基酸，提高表达效率)位氨基酸与SH蛋白的胞外域的26个氨基酸(F蛋白和SH蛋白的胞外域之间通过GS linker相连，GS linker的序列为：CGGGS)的融合蛋白克隆到PsecTag2A真核表达载体上，得到包含F-SHe的表达质粒，载体自带His标签。

融合蛋白F-SHe的碱基序列如SEQ ID No.6所示，融合蛋白F-SHe的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.融合蛋白F-SHe的表达和纯化：

将步骤1中构建好的的表达质粒瞬时转染到Freestyle 293-F真核细胞系中，所用转染试剂为PEI。

转染前24小时，将细胞传代，密度控制在1×10⁶个/ml。对细胞进行计数，取出转染所需的细胞(转染时细胞密度为1×10⁶个/ml，10ml的转染体系需10⁷个细胞)，100g离心5分钟，去除培养基上清，加入待转染体系一半体积的新鲜培养基(转染体系为10ml时加入5ml的新鲜培养基)，将细胞重悬吹打混匀，放置在细胞摇床中培养待用。

1×10⁶个细胞转染所需质粒为1.25μg，转染试剂PEI 5μg。将1.25μg质粒和5μgPEI分别溶解在25μl的150mM的NaCl溶液中去。将质粒与PEI等体积混匀后，室温静置10分钟，加入到已准备好的细胞中去。4-6小时候后，补加转染体系一半体积的新鲜培养基到已转染质粒的细胞中去，并加入20mM的VPA(丙戊酸)。

转染6-7天后，5000rpm，4℃离心10分钟，去除细胞，收集细胞上清，将上清转移到7-14Mw的透析袋中，在100mM磷酸盐，150mM NaCl,pH7.4的溶液中4℃透析过夜。透析结束后，细胞上清通过0.8μm的滤膜去除残留细胞残渣。

处理过的细胞上清通过镍亲和层析进行富集，通过100mM磷酸盐，150mM NaCL,300mM咪唑(post-fusion F 300mM咪唑，pre-fusion F 100mM咪唑)pH7.4进行洗脱。得到的融合蛋白F-SHe通过SDS-PAGE鉴定其纯度。

3.F-SHe蛋白疫苗的制备：

纯化后的融合蛋白F-SHe透析在PBS溶液中，通过超滤管进行浓缩，BCA蛋白定量试剂盒确定蛋白的浓度。

佐剂MPL，购买自Sigma，加入2％triethylamine生理盐水，v/v，溶解，储存浓度为2mg/ml，65℃水浴锅中溶解5min,并用涡旋仪振荡，以便MPL充分溶解。

将经过透析超滤之后的融合蛋白F-SHe与上述充分溶解后佐剂MPL以质量比为2：1混合，混合后置于4℃，以备使用。

实施例2

验证实施例1中提供的疫苗抗原的效果。

1.抗体滴度的检测

实验方法

采用实施例1中制备得到的融合蛋白F-SHe免疫BaLb/C雌性小鼠，对照设置3组对照例，2组对照例的信息请参照表1。间隔两周免疫一次，第二免疫结束后14天后，采集免疫小鼠血清，检测其抗体应答水平，包括针对SH蛋白胞外域的抗体滴度(图1B)，以及中和抗体的滴度(图1A)。

表1对照例的具体信息

实验结果

请参照附图1A和附图1B，F-SH融合蛋白相较F蛋白免疫对照组3(Post-fusion F)，产生了较高滴度的中和抗体，以及SHe蛋白胞外域特异性抗体。

2.肺部病毒滴度实验及体重变化实验

将步骤1中，第二次免疫结束后14天，F-SHe蛋白免疫小鼠及3组对照组小鼠，均采用滴鼻的方式感染6×10⁶PFU的RSV A2，感染后每天测量小鼠的体重变化以观察小鼠的病情反应，感染后第4天，处死小鼠，检测其肺部的病毒滴度。检测请参照附图2。

由图2和图3可知，和对照组相比，F-SHe蛋白疫苗组的小鼠肺部病毒滴度明显下降，感染病毒后体重减轻的现象也得到了很好的控制。

3.小鼠肺部组织的病理损伤情况

病毒感染后的第7天，处死小鼠，获取小鼠肺部组织，制备肺部组织的石蜡切片，并通过H&E染色及PAS染色来判断小鼠肺部组织的病理损伤情况。检测结果请参照附图4A和4B。图4A为病理切片染色结果图，图4B为对疫苗对肺部的炎症状况的打分结果图。

病毒感染后的第7天，也通过检测小鼠肺部中促炎症因子IL-1β及MIP-1α的含量来进一步判断小鼠肺部的炎症状况，检测结果请参照附图5和图6。

由图4A和图4B可知，和对照组相比，实施例1提供的F-SHe融合蛋白免疫能够明显减轻小鼠肺部因RSV感染引起的病理损伤。

由附图5和图6可知，与对照组相比，实施例1提供的免疫抗原F-SHe能显著降低被感染者的促炎症因子含量，尤其是显著降低被感染者体内IL-1β和MIP-1α的含量。

对比例1

验证实施例1中提供的制备方法的效果。

采用实施例1中提供的制备方法进行疫苗抗原(F-SHe)的制备，对照设置一组对比例，对比例1的制作条件如下：

(1)转染前24小时，将细胞传代，密度控制在1×10⁶个/ml。

(2)对细胞进行计数，取出转染所需的细胞(转染时细胞密度为1×10⁶个/ml，10ml的转染体系需10⁷个细胞)，100g离心5分钟，去除培养基上清，加入新鲜培养基。

(3)1×10⁶个细胞转染所需质粒为1.25μg，转染试剂PEI 2-4μg。将1.25μg质粒和PEI分别溶解在25μl的表达培养基中。将质粒与PEI等体积混匀后，室温静置10分钟，加入到已准备好的细胞中去。

制备好后，对制备的F-SHe蛋白产量的检测，检测结果请参照附图7。由附图7可知，本实施例提供的制备方法制备的蛋白显著优于现有工艺。

对比例2

验证实施例1提供提供的疫苗抗原(融合蛋白F-SHe)与现有疫苗的区别。

实验方法

设置3组实施方案，实施方案1采用密码子未优化前的F-SHe融合蛋白(碱基序列SEQ ID No.4所示)。

实施方案2中采用密码子优化后的F-SHe融合蛋白(碱基序列SEQ ID No.5所示)；

实施方案3(实施例1)中采用密码子优化后且去除了融合肽(136-145未氨基酸)F-SHe融合蛋白(碱基序列SEQ ID No.6所示)。

采用实施例1中的转染步骤，转染后48h，收集细胞上清中的蛋白，通过WesternBlot印记检测蛋白的表达，检测结果请参照附图8。

实验结果

由附图8可知，优化后的融合蛋白F-SHe的表达量显著优于优化前的融合蛋白F-SHe的表达量，实施例1中的F-SHe表达量显著高于优化前的融合蛋白F-SHe的表达量。

对比例3

验证实施例1中提供的融合蛋白F-SHe与F蛋白、SH蛋白的混合的区别。

采用实施例1中提供的融合蛋白免疫小鼠，免疫方法同参照实施例2，检测融合蛋白刺激小鼠所产生的抗体滴度，对照设置一组对照例，对照例为F蛋白与SH蛋白混合免疫小鼠的效果。检测结果请参照附图9。

由附图9可知，融合蛋白F-SHe的免疫效果优于F和SH混合免疫的结果。

综上所述，该疫苗蛋白包括至少一种呼吸道合胞病毒的F蛋白以及至少一种呼吸道合胞病毒的SH蛋白组成的融合蛋白，该融合蛋白能有效刺激机体产生较高滴度的中和抗体以及SH蛋白特异性抗体，在病毒感染时，能够有效清除受试者肺部的病毒滴度，同时，也能减轻受试者肺部因病毒感染引起的病理损伤，此外，还能够降低被感染者肺部的促炎症因子含量。

本发明还提供了上述疫苗抗原的制备方法，包括上述疫苗抗原的表达载体、免疫原性组合物以及一种在对象中产生针对呼吸道合胞病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予患者有效量的免疫原性组合物，可通过粘膜、皮内、皮下、肌肉内和/或口服来给予免疫原性组合物，在某些情况下，接种本发明提供的免疫抗原引起的免疫应答使得接种对象可抵御一种或多种呼吸道合胞病毒的多种亚型。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院武汉病毒研究所

<120> 一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 516

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser

1 5 10 15

Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile

20 25 30

Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Lys Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp

35 40 45

Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala

50 55 60

Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Gln Ala Thr Asn Asn

65 70 75 80

Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn

85 90 95

Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe

100 105 110

Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala

115 120 125

Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser

130 135 140

Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val

145 150 155 160

Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys

165 170 175

Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile

180 185 190

Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile

195 200 205

Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr

210 215 220

Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro

225 230 235 240

Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val

245 250 255

Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu

260 265 270

Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys

275 280 285

Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly

290 295 300

Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn

305 310 315 320

Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln

325 330 335

Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser

340 345 350

Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys

355 360 365

Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser

370 375 380

Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser

385 390 395 400

Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr

405 410 415

Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr

420 425 430

Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro

435 440 445

Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp

450 455 460

Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe

465 470 475 480

Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu Cys Gly Gly Gly Ser Asn Lys Leu

485 490 495

Ser Glu Tyr Asn Val Phe His Asn Lys Thr Phe Glu Leu Pro Arg Ala

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Arg Val Asn Thr

515

<210> 2

<211> 516

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

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1 5 10 15

Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile

20 25 30

Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp

35 40 45

Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala

50 55 60

Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn

65 70 75 80

Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn

85 90 95

Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe

100 105 110

Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala

115 120 125

Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser

130 135 140

Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val

145 150 155 160

Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys

165 170 175

Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile

180 185 190

Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile

195 200 205

Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr

210 215 220

Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro

225 230 235 240

Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val

245 250 255

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260 265 270

Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys

275 280 285

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290 295 300

Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn

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370 375 380

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515

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser

1 5 10 15

Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile

20 25 30

Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp

35 40 45

Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala

50 55 60

Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn

65 70 75 80

Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn

85 90 95

Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Ala

100 105 110

Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu

115 120 125

Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val

130 135 140

Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu

145 150 155 160

Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser

165 170 175

Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn

180 185 190

Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val

195 200 205

Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser

210 215 220

Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser

225 230 235 240

Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile

245 250 255

Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly

260 265 270

Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr

275 280 285

Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg

290 295 300

Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala

305 310 315 320

Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn

325 330 335

Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe

340 345 350

Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser

355 360 365

Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys

370 375 380

Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe

385 390 395 400

Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser

405 410 415

Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu

420 425 430

Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe

435 440 445

Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile

450 455 460

Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu Cys Gly

465 470 475 480

Gly Gly Ser Asn Lys Leu Ser Glu Tyr Asn Val Phe His Asn Lys Thr

485 490 495

Phe Glu Leu Pro Arg Ala Arg Val Asn Thr

500 505

<210> 4

<211> 1548

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caaaacatca ctgaagaatt ttatcaatca acatgcagtg cagttagcaa aggctatctt 60

agtgctctga gaactggttg gtataccagt gttataacta tagaattaag taatatcaag 120

aaaaataagt gtaatggaac agatgctaag gtaaaattga taaaacaaga attagataaa 180

tataaaaatg ctgtaacaga attgcagttg ctcatgcaaa gcacacaagc aacaaacaat 240

cgagccagaa gagaactacc aaggtttatg aattatacac tcaacaatgc caaaaaaacc 300

aatgtaacat taagcaagaa aaggaaaaga agatttcttg gttttttgtt aggtgttgga 360

tctgcaatcg ccagtggcgt tgctgtatct aaggtcctgc acctagaagg ggaagtgaac 420

aagatcaaaa gtgctctact atccacaaac aaggctgtag tcagcttatc aaatggagtt 480

agtgttttaa ccagcaaagt gttagacctc aaaaactata tagataaaca attgttacct 540

attgtgaaca agcaaagctg cagcatatca aatatagaaa ctgtgataga gttccaacaa 600

aagaacaaca gactactaga gattaccagg gaatttagtg ttaatgcagg cgtaactaca 660

cctgtaagca cttacatgtt aactaatagt gaattattgt cattaatcaa tgatatgcct 720

ataacaaatg atcagaaaaa gttaatgtcc aacaatgttc aaatagttag acagcaaagt 780

tactctatca tgtccataat aaaagaggaa gtcttagcat atgtagtaca attaccacta 840

tatggtgtta tagatacacc ctgttggaaa ctacacacat cccctctatg tacaaccaac 900

acaaaagaag ggtccaacat ctgtttaaca agaactgaca gaggatggta ctgtgacaat 960

gcaggatcag tatctttctt cccacaagct gaaacatgta aagttcaatc aaatcgagta 1020

ttttgtgaca caatgaacag tttaacatta ccaagtgaag taaatctctg caatgttgac 1080

atattcaacc ccaaatatga ttgtaaaatt atgacttcaa aaacagatgt aagcagctcc 1140

gttatcacat ctctaggagc cattgtgtca tgctatggca aaactaaatg tacagcatcc 1200

aataaaaatc gtggaatcat aaagacattt tctaacgggt gcgattatgt atcaaataaa 1260

ggggtggaca ctgtgtctgt aggtaacaca ttatattatg taaataagca agaaggtaaa 1320

agtctctatg taaaaggtga accaataata aatttctatg acccattagt attcccctct 1380

gatgaatttg atgcatcaat atctcaagtc aacgagaaga ttaaccagag cctagcattt 1440

attcgtaaat ccgatgaatt attatgcggt ggaggctcaa acaagctgag cgagtacaac 1500

gtgttccaca acaagacctt cgagctgccc agagccagag tgaacacc 1548

<210> 5

<211> 1548

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cagaacatca ccgaggaatt ctaccagagc acctgtagcg ccgtgtccaa gggctacctg 60

agcgccctgc ggaccggctg gtacaccagc gtgatcacca tcgagctgag caacatcaaa 120

gaaaacaagt gcaacggcac cgacgccaaa gtgaagctga tcaagcagga actggacaag 180

tacaagaacg ccgtgaccga gctgcagctg ctgatgcaga gcacccccgc caccaacaac 240

cgggccagac gggagctgcc ccggttcatg aactacaccc tgaacaacgc caaaaagacc 300

aacgtgaccc tgagcaagaa gagaaagcgg cggtttcttg gttttttgtt aggtgttgga 360

tctgccattg ctagcggagt ggccgtgtct aaggtgctgc acctggaagg cgaagtgaac 420

aagatcaagt ccgccctgct gagcaccaac aaggccgtgg tgtccctgag caacggcgtg 480

tccgtgctga ccagcaaggt gctggatctg aagaactaca tcgacaagca gctgctgccc 540

atcgtgaaca agcagagctg cagcatcagc aacatcgaga cagtgatcga gttccagcag 600

aagaacaacc ggctgctgga aattacccgc gagttcagcg tgaacgctgg cgtgaccacc 660

cccgtgtcca cctacatgct gaccaacagc gagctgctga gcctgatcaa cgacatgccc 720

atcaccaacg accagaaaaa gctgatgagc aacaacgtgc agatcgtgcg gcagcagagc 780

tactccatca tgtccatcat caaagaagag gtgctggcct acgtggtgca gctgcccctg 840

tacggcgtga tcgacacccc ctgctggaag ctgcacacca gccccctgtg caccaccaac 900

accaaagagg gcagcaacat ctgcctgacc cggaccgacc ggggctggta ctgcgataat 960

gccggcagcg tgtcattctt tccacaagcc gagacatgca aggtgcagag caaccgggtg 1020

ttctgcgaca ccatgaacag cctgaccctg ccctccgaag tgaacctgtg caacgtggac 1080

atcttcaacc ctaagtacga ctgcaagatc atgacctcca agaccgacgt gtccagctcc 1140

gtgatcacct ccctgggcgc catcgtgtcc tgctacggca agaccaagtg caccgccagc 1200

aacaagaacc ggggcatcat caagaccttc agcaacggct gcgactacgt gtccaacaag 1260

ggggtggaca ccgtgtccgt gggcaacacc ctgtactacg tgaacaaaca ggaaggcaag 1320

agcctgtacg tgaagggcga gcccatcatc aacttctacg accccctggt gttccccagc 1380

gacgagttcg acgccagcat cagccaggtc aacgagaaga tcaaccagag cctggccttc 1440

atcagaaaga gcgacgagct gctgtgcggt ggaggctcaa acaagctgag cgagtacaac 1500

gtgttccaca acaagacctt cgagctgccc agagccagag tgaacacc 1548

<210> 6

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cagaacatca ccgaggaatt ctaccagagc acctgtagcg ccgtgtccaa gggctacctg 60

agcgccctgc ggaccggctg gtacaccagc gtgatcacca tcgagctgag caacatcaaa 120

gaaaacaagt gcaacggcac cgacgccaaa gtgaagctga tcaagcagga actggacaag 180

tacaagaacg ccgtgaccga gctgcagctg ctgatgcaga gcacccccgc caccaacaac 240

cgggccagac gggagctgcc ccggttcatg aactacaccc tgaacaacgc caaaaagacc 300

aacgtgaccc tgagcaagaa gagaaagcgg cgggccattg ctagcggagt ggccgtgtct 360

aaggtgctgc acctggaagg cgaagtgaac aagatcaagt ccgccctgct gagcaccaac 420

aaggccgtgg tgtccctgag caacggcgtg tccgtgctga ccagcaaggt gctggatctg 480

aagaactaca tcgacaagca gctgctgccc atcgtgaaca agcagagctg cagcatcagc 540

aacatcgaga cagtgatcga gttccagcag aagaacaacc ggctgctgga aattacccgc 600

gagttcagcg tgaacgctgg cgtgaccacc cccgtgtcca cctacatgct gaccaacagc 660

gagctgctga gcctgatcaa cgacatgccc atcaccaacg accagaaaaa gctgatgagc 720

aacaacgtgc agatcgtgcg gcagcagagc tactccatca tgtccatcat caaagaagag 780

gtgctggcct acgtggtgca gctgcccctg tacggcgtga tcgacacccc ctgctggaag 840

ctgcacacca gccccctgtg caccaccaac accaaagagg gcagcaacat ctgcctgacc 900

cggaccgacc ggggctggta ctgcgataat gccggcagcg tgtcattctt tccacaagcc 960

gagacatgca aggtgcagag caaccgggtg ttctgcgaca ccatgaacag cctgaccctg 1020

ccctccgaag tgaacctgtg caacgtggac atcttcaacc ctaagtacga ctgcaagatc 1080

atgacctcca agaccgacgt gtccagctcc gtgatcacct ccctgggcgc catcgtgtcc 1140

tgctacggca agaccaagtg caccgccagc aacaagaacc ggggcatcat caagaccttc 1200

agcaacggct gcgactacgt gtccaacaag ggggtggaca ccgtgtccgt gggcaacacc 1260

ctgtactacg tgaacaaaca ggaaggcaag agcctgtacg tgaagggcga gcccatcatc 1320

aacttctacg accccctggt gttccccagc gacgagttcg acgccagcat cagccaggtc 1380

aacgagaaga tcaaccagag cctggccttc atcagaaaga gcgacgagct gctgtgcggt 1440

ggaggctcaa acaagctgag cgagtacaac gtgttccaca acaagacctt cgagctgccc 1500

agagccagag tgaacacc 1518

Claims

1.一种疫苗抗原，其特征在于，其包括至少一种呼吸道合胞病毒的F蛋白以及至少一种呼吸道合胞病毒的SH蛋白；

优选地，所述疫苗抗原为F蛋白和SH蛋白的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的疫苗抗原，其特征在于，所述SH蛋白为呼吸道合胞病毒的SH蛋白的胞外域；

优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求2所述的疫苗抗原，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。

4.一种编码如权利要求1～3任一项所述的疫苗抗原的核酸分子；

优选地，所述核酸分子的碱基序列如SEQ ID No.4所示；

优选地，所述核酸分子的碱基序列如SEQ ID No.5所示；

优选地，所述核酸分子的碱基序列如SEQ ID No.6所示。

5.一种表达载体，其特征在于，其包含有如权利要求4所述的核酸分子；优选地，所述表达载体为PsecTag2A。

6.一种疫苗抗原的制备方法，其特征在于，其包括：在使宿主细胞能够生产如权利要求1～3任一项所述的疫苗抗原的条件下，将一个或多个如权利要求5所述的表达载体导入所述宿主细胞；

优选地，所述宿主细胞选自真核细胞；

优选地，所述导入包括将所述表达载体与转染试剂混合后转染宿主细胞，所述转染试剂与所述表达载体的质量比为1.25：(4.1～5.5)，所述转染试剂为PEI；

进一步优选地，将所述表达载体与所述转染试剂混合后的混合物室温静置5～15min后转染宿主细胞，转染后4～6h，加入转染体系40％～60％体积的新鲜培养基和18～22mM的VPA。

7.根据权利要求6所述的疫苗抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将转染后得到的融合蛋白进行蛋白纯化；

优选地，所述蛋白纯化包括将转染后得到的细胞溶液进行离心，收集细胞上清，对细胞上清通过透析、亲和层析纯化后，得到纯化后的融合蛋白；

优选地，所述制备方法包括将纯化过后得到的融合蛋白进行浓缩，优选采用超滤管进行浓缩；

优选地，所述制备方法包括将浓缩后的融合蛋白与佐剂混合，所述佐剂优选为MPL。

8.采用如权利要求6或7所述的疫苗抗原的制备方法制备的疫苗抗原。

9.一种免疫原性组合物，其特征在于，其包括至少一种如权利要求1～3任一项所述的疫苗抗原。

10.一种在对象中产生针对呼吸道合胞病毒的免疫应答的方法，其特征在于，所述方法包括给予所述对象有效量的如权利要求9所述的免疫原性组合物；

优选地，所述方法用于以非治疗诊断为目的应用中。