CN114276423B

CN114276423B - 猪传染性胃肠炎病毒的s蛋白突变体及其应用

Info

Publication number: CN114276423B
Application number: CN202111573520.8A
Authority: CN
Inventors: 陈磊; 谢欣; 李丹彬; 吴超; 王琪; 赵氏璧; 方涛; 高腾森; 王聪; 苏斌; 戴敏; 黄佳笛; 王得荣; 周翔宇; 陈莉; 周臣飞; 杨香君; 常增辉; 张光莎; 丁晓雅
Original assignee: Yikang Biology Suzhou Co ltd
Current assignee: Yikang Biology Suzhou Co ltd
Priority date: 2021-12-21
Filing date: 2021-12-21
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2041-12-21
Also published as: CN114276423A

Abstract

本发明涉及生物医药领域，公开了一种猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的S蛋白突变体及其应用。本发明的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体与野生型S蛋白相比，包含了一个或多个氨基酸突变或剪切。所述猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体能够形成三聚体结构并维持在融合前体状态，且在使用哺乳动物细胞表达目标蛋白时产量显著提高，产生的蛋白质更加稳定和均一。其作为疫苗或者疫苗组分使用时免疫原性增加，能够诱导受免疫动物产生较高的中和抗体。本申请所述的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体能够用于制备TGEV重组蛋白疫苗，以预防和治疗TGEV引起或介导的疾病和病症。

Description

猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体及其应用。

背景技术

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病。1946年在美国首次被报道，随后日本、法国、马来西亚、英国等国家相继报道该病。我国于1956年在广东首次报道该病，随后全国大部分省份都发现该病的存在，近年来该病已成为引起猪群腹泻的重要病原，随着我国养猪业的发展，给养猪业带来了严重的经济损失。

猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)属于套氏病毒目，冠状病毒科、冠状病毒属。是一种全基因组约28.5kb的单股正链RNA病毒，包含9个开放性阅读框(ORFs)，编码5个非结构蛋白(复制酶1a，1b，3a，3b和ORF7蛋白)和4个结构蛋白(刺突蛋白S、小囊膜蛋白E、膜蛋白M、核衣壳蛋白N)。其中，S蛋白介导细胞附着和膜融合，能够诱导产生中和抗体，对病毒的毒力、组织嗜性、受体结合位点等有着重要的生物学活性功能，是当前猪传染性胃肠炎病毒基因工程疫苗的重要研究方向。

发明内容

为了解决所述技术问题，本申请提供了一种猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体，所述S蛋白突变体与野生型S蛋白相比，包含了一个或多个氨基酸突变或剪切。所述猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体能够形成三聚体结构并维持在融合前体状态，且在使用哺乳动物细胞表达目标蛋白时产量大幅提高，产生的蛋白质更加稳定和均一。其作为疫苗或者疫苗组分使用时免疫原性增加，能够诱导受免疫动物产生较高的中和抗体。本申请所述的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体能够用于制备TGEV重组蛋白疫苗，以预防和治疗TGEV引起或介导的疾病和病症。

本发明中的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体，该突变体具有如下性质：

1)使用哺乳动物细胞重组表达的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白能够形成保持融合前体构象的稳定三聚体形式；2)增加猪传染性胃肠炎病毒S蛋白三聚体的稳定性和均一性；3)与野生型猪传染性胃肠炎病毒S蛋白相比，使用哺乳动物细胞系表达的重组蛋白产量显著提高；4)使受免疫小鼠和猪体内产生中和抗体并有效抑制猪传染性胃肠炎病毒。

本发明的第一个目的是提供一种猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体，所述的突变体是将野生型猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白的氨基酸序列的一个或多个位点突变为脯氨酸以阻断蛋白质阿尔法螺旋结构的贯通。

进一步地，所述的突变体还包括将野生型猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白的氨基酸序列的一个或多个氨基酸突变为半胱氨酸(Cys)，以增加S蛋白单体内二硫键数量，保持融合前体的稳定。

进一步地，所述的突变体还包括删除猪传染性胃肠炎病毒S蛋白跨膜区的一个或多个氨基酸，使表达的S蛋白的溶解性增加，不容易发生沉淀，更加均一并提高产量。

进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白进行如下氨基酸突变：

将959位丙氨酸突变为脯氨酸，将1095位缬氨酸突变为脯氨酸，将1096位丙氨酸突变为脯氨酸，将1140位谷氨酸突变为脯氨酸，以及将1141位亮氨酸突变为脯氨酸；

和/或，将1119位谷氨酰胺突变为半胱氨酸，以及将1157位丙氨酸突变为半胱氨酸；

和/或，删除S蛋白C端从1385位至1448位的氨基酸，以去除跨膜区，增强蛋白质的水溶性和稳定性。

本发明的第二个目的是提供一种疫苗，包含所述的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体。

进一步地，所述的疫苗包含亚单位疫苗。

进一步地，所述的疫苗包含病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗。

进一步地，所述的病毒样颗粒疫苗还包含猪传染性胃肠炎病毒的结构蛋白。

本发明的第三个目的是提供一种核酸分子，所述的核酸分子编码所述的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体。

本发明的第四个目的是提供一种载体，所述的载体包含所述的核酸分子。

本发明的第五个目的是提供一种细胞，所述的细胞表达所述的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体或包含所述的载体。

本发明的第六个目的是提供一种药物组合物，所述的药物组合物包含所述的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体、所述的疫苗、所述的核酸分子或所述的载体。

本发明的第七个目的是提供所述的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体的制备方法，所述方法包括采用所述的细胞表达所述的核酸分子或所述的载体。

本发明的第八个目的是提供所述的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体、所述的疫苗、所述的核酸分子、所述的载体或所述的细胞在制备预防和/或治疗猪传染性胃肠炎病的药物中的应用。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本申请提供了一种猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体，所述S蛋白突变体与野生型S蛋白相比，包含了一个或多个氨基酸突变或剪切。所述猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体能够形成三聚体结构并维持在融合前体状态，且在使用哺乳动物细胞表达目标蛋白时产量大幅提高，产生的蛋白质更加稳定和均一。其作为疫苗或者疫苗组分使用时免疫原性增加，能够诱导受免疫动物产生较高的中和抗体。本申请所述的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体能够用于制备TGEV重组蛋白疫苗，以预防和治疗TGEV引起或介导的疾病和病症。

上述说明仅是本发明技术方案和部分结果的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明。

附图说明

图1显示的是凝胶过滤色谱纯化(GFC)结果，A为TG-WT S蛋白，B为TG-YK01 S蛋白突变体。

图2显示的是TGEV S蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)结果，A为TG-WT S蛋白，B为TG-YK01S蛋白突变体。

图3显示的是S蛋白负染电镜观察结果，A为TG-WT S蛋白结构，B为TG-YK01 S蛋白突变体结构。

图4显示的是TG-YK01 S蛋白突变体与TGEV中和抗体的结合情况。

图5显示的是小鼠免疫实验期间其体重变化率。

图6显示的是猪血清稀释100倍后抗TGEV重组蛋白IgG抗体水平ELISA检测。

图7显示的是小鼠血清稀释1000倍后抗TGEV重组蛋白IgG抗体水平ELISA检测。

图8显示的是TG-YK01 S蛋白突变体对小鼠免疫后分离的血清与病毒的中和实验。4周为2次加强免疫2周后的血清，6周为2次加强免疫4周后的血清。

图9显示的是TG-YK01 S蛋白突变体对猪免疫后分离的血清与病毒的中和实验结果。0周为免疫前的血清，4周为2次加强免疫2周后的血清，7周为2次加强免疫5周后的血清。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

术语定义：

在本申请中，术语“猪传染性胃肠炎病毒”或“TGEV”通常是指一种冠状病毒科，冠状病毒属，阿尔法亚属的病毒，所述病毒通常与猪传染性胃肠炎相关。所述猪传染性胃肠炎病毒可以包含具有囊膜包被的多种形态。所述猪传染性胃肠炎病毒基因组通常可以编码4种结构蛋白：S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白。

在本申请中，术语“蛋白突变体”通常可以指构成其的氨基酸序列或蛋白质结构与野生型蛋白质相比有一种或多种改变的蛋白质。所述改变可以包括：一个或多个氨基酸的删除、插入、替换、截短和/或缺失，蛋白质结构的加工或切割。在本申请中，蛋白质突变体指猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白突变体。

在本申请中，术语“氨基酸突变”通常是指对亲本氨基酸序列中的氨基酸进行的修饰。例如，所述修饰可以包括一个或多个氨基酸的替换、插入和/或缺失。在本申请中，所述氨基酸突变可以包括在氨基酸序列的指定位置缺失或替换至少一个氨基酸残基。在某些实施方式中，所述氨基酸突变能够使所述氨基酸序列构成的蛋白质的构象优化。可以使用本领域熟知的遗传方法或化学方法产生氨基酸突变。例如，遗传方法可以包括位点定向诱变、PCR和基因合成等。

在本申请中，术语“Alpha螺旋结构的贯通”是指存在两个弯折的Alpha螺旋结构在某种情况下弯折变化为一个线性的不再弯折的Alpha螺旋结构。

在本申请中，所述氨基酸突变包含通过密码子优化的氨基酸突变。术语“密码子优化”通常表示通过具有不同的相对使用频率的编码相同氨基酸残基的密码子，替换亲代多肽编码核酸中的一个或一个以上密码子，以改善编码多肽的核酸的表达。在本申请中，只要氨基酸的突变与本申请相同，编码该突变氨基酸的所有可能的密码子都在本申请的保护范围内。

在本申请中，术语“病毒样颗粒”、“virus-like particle”或“VLP”通常是指含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒。所述病毒样颗粒没有病毒核酸，不能自主复制。所述病毒样颗粒可以在形态上与真正病毒粒子相同或相似。

在本申请中。术语“三聚体”通常是指由三个同一类型或不同类型的蛋白亚单位共同组成的蛋白结构。例如，所述蛋白三聚体可以是冠状病毒三聚体S蛋白。例如，蛋白三聚体可以通过特殊的化学结构连接在一起。在本申请中，所述蛋白三聚体可以是猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白。

在本申请中，术语“同源三聚体”通常是指由三个同一类型的蛋白亚单位共同组成的蛋白结构。在本申请中，所述同源三聚体可以通过特殊的化学结构连接在一起。例如，所述化学结构可以是单体间二硫键。例如，所述同源三聚体包含一个基座。在本申请中，所述蛋白三聚体可以是猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白。

在本申请中，术语“构象变化”通常是指蛋白质分子的空间结构发生的改变。例如，所述构象变化可以包括蛋白质分子中化学键的改变、多肽的折叠方式发生改变。

在本申请中，术语“信号肽”通常是指一种存在于跨膜蛋白的N末端作为跨膜时的信号的氨基酸序列。例如，所述跨膜蛋白可以包括分泌蛋白质或细胞膜蛋白。例如，所述信号肽可以以前体物质多肽的形式合成于所述跨膜蛋白的N端。

在本申请中，术语“结构蛋白”通常是指构成病毒颗粒成分的蛋白质。所述结构蛋白可以包括冠状病毒的结构蛋白。本申请所述结构蛋白可以包括S蛋白、N蛋白、M蛋白和E蛋白。

在本申请中，术语“融合前体”通常是指病毒在感染宿主细胞前还未发生膜融合时的结构蛋白。一般来讲，野生型TGEV S蛋白的融合前体为一种亚稳定态的蛋白质，其构象在病毒感染宿主细胞并发生膜融合后进行不连续，逐步和不可逆的构象变化成一个较低能量稳定态的构象(融合后构象)。在本申请中，对TGEV S蛋白进行一系列改造，使得所述S蛋白三聚体能够稳定地处于融合前体状态。

在本申请中，蛋白突变位点的表述通常由“氨基酸+氨基酸位数+突变后的氨基酸”来表述。在本申请中，所述突变可以包括但不限于氨基酸的增加、替换、缺失和/或删除。例如，术语“A959P”通常指第959位氨基酸A突变为氨基酸P。

在本申请中，所述TGEV S蛋白突变体是以TGEV病毒株的S蛋白的氨基酸残基类型为基准突变得到。

在某些实施方式中，所述TGEV野生型病毒株的S蛋白氨基酸序列可以见GenBank登录号ACCESSION：QXI73430.1。

在本申请中，所述蛋白突变体包含S蛋白的单链，所述蛋白的单链的表述为一条完整的经修饰的S蛋白质亚基，其可以在分子力的作用下形成三聚体的形式。在某些实施方式中，具有三聚体高级结构的完整蛋白质为疫苗的有效组分。

在本申请中，术语“核酸分子”通常指任何长度的分离形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或从其天然环境分离的或人工合成的类似物。

在申请中，术语“载体”指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的或者协助目的原件整合至宿主细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体，蛋白外壳或者整合酶，但不仅仅只有这些物质。

在本申请中，术语“药物组合物”通常指用于预防/治疗疾病或病症的组合物。所述药物组合物可以包含本申请所述的TGEV S蛋白突变体、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。此外，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)佐剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下通常对接受者无毒。

在本申请中，术语“药学上可接受的载剂”通常包括药剂学可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。生理学可接受的载体可包括例如缓冲剂，抗氧化剂，低分子量(少于约10个残基)多肽，蛋白质，亲水性聚合物，氨基酸，单糖，二糖和其它碳水化合物，螯合剂，糖醇，成盐反荷离子，例如钠，和/或非离子表面活性剂。

在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。

本申请是在结构生物学的基础上，结合免疫学原理，设计出的安全性高、保护力广泛、制备工艺可靠的新型防护疫苗。本申请提供的重组蛋白疫苗的产量较野生型相比显著提升。所述TGEV S蛋白突变体能够稳定保持在融合前体状态，在动物的免疫试验中能够诱导较高的中和抗体水平。

本申请使用中国公开的TGEV流行毒株(QXI73430.1)的刺突蛋白(Spike protein)序列，在观察同源的不同毒株的S蛋白三维结构数据的基础上进行抗原蛋白的设计，对一些特定位点的氨基酸进行突变或者剪切。作为对照所表达的S蛋白命名为TG-WT，是在TGEV流行毒株(QXI73430.1)基础上，删除了C端的跨膜区Y1385-H1448得到。

本申请提供了一种源于猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白，所述S蛋白与野生型TGEV病毒S蛋白相比，包含一个或多个氨基酸突变或者剪切。

一方面，本申请提供了一种TGEV S蛋白突变体，所述突变体具有以下性质中的一种或多种：1)能够在形成S蛋白三聚体的情况下，使S蛋白三聚体保持在稳定的融合前体状态；2)与野生型S蛋白相比，其在哺乳动物细胞表达的产量具有显著提高；3)所述TGEV S蛋白突变体形成三聚体的稳定性较好；4)所述TGEV S蛋白突变体形成三聚体的均一性较好。

在本申请中，所述TGEV S蛋白突变体与QXI73430.1所示的氨基酸序列相比，包含一个或多个氨基酸突变。

在本申请中，所述TGEV S蛋白突变体可以包含TGEV S蛋白跨膜区一个至多个氨基酸的突变。例如，删除Y1385-H1448位置的氨基酸序列。

在本申请中，所述TGEV S蛋白突变体包含的氨基酸突变包括对猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的氨基酸序列进行一个或多个半胱氨酸突变。例如，将S蛋白的一个或多个位置处的氨基酸突变为半胱氨酸。在本申请中，所述半胱氨酸突变能够增加三聚体的S蛋白单体内部形成二硫键，通过共价键结合的方式增强S蛋白融合前体构象的稳定性并增加哺乳动物细胞表达目标蛋白的产量。在某些实施方式中，所述TGEV的S蛋白突变体包含以下氨基酸突变：Q119C和A1157C。

在本申请中，所述氨基酸突变包括对猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的氨基酸序列进行一个或多个脯氨酸突变。在本申请中，所述脯氨酸突变能够阻断融合前体蛋白质三维结构中关键阿尔法螺旋结构的贯通，阻碍S蛋白从融合前体向融合后体发生不可逆的构象变化，加强S蛋白融合前体构象的稳定性，增加抗原蛋白的哺乳动物细胞表达量。在本申请中，可以在选自下组的一个或多个氨基酸位置处包含脯氨酸突变：A959、V1095、A1096、E1140和L1141。

在某些实施方式中，所述TGEV S蛋白突变体包含选自下组的一组或多组氨基酸脯氨酸突变：A959P、V1095P、A1096P、E1140P和L1141P。

另一方面，本申请还提供了疫苗，所述疫苗可以包含本申请所述的TGEV S蛋白突变体。在本申请中，所述疫苗还可以包含其他活性成分。在本申请中，所述疫苗还可以包含佐剂。

在本申请中，术语“佐剂”通常是指辅助或调节药物作用的任何物质，包括但不仅限于免疫学佐剂，它使对抗原的免疫反应增强或免疫反应多样化。在本申请中，所述佐剂可以用来增强所述TGEV S蛋白突变体的抗原性。在某些实施方式中，所述佐剂可以包含矿物(例如明矾、氢氧化铝或磷酸盐)悬浮液。在某些实施方式中，所述佐剂可以包括水包油乳剂。

在本申请中，所述疫苗包含亚单位疫苗。在本申请中，所述疫苗包含病毒样颗粒(VLP)疫苗。

另一方面，本申请还提供了分离的核酸分子，其编码所述TGEV S蛋白突变体。在本申请中，所述核酸分子可以编码TGEV S蛋白突变体三聚体。在本申请中，所述核酸分子可以编码TGEV S蛋白突变体单体。

另一方面，本申请还提供了一种载体，其包含所述核酸分子。本发明是通过重组DNA构建体的质粒表达产生的重组猪传染性胃肠炎病毒蛋白。任何实施方案还可包括至少一种额外的抗原或TGEV感染性或非感染性DNA片段的组合。另一方面，本发明是包含猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的分离或纯化的三聚体重组蛋白。另一方面，本发明是包含猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的分离或纯化的病毒样颗粒。在某些实施方案中，分离或纯化的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的三聚体重组蛋白可用于制备具有药学上可接受的载体的免疫保护性疫苗。在一个实施方案中，分离或纯化的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的病毒样颗粒可用于制备具有药学上可接受的载体的免疫保护性疫苗。在另一个实施方案中，疫苗可以包括一种或多种其他抗原。在某些实施方案中，所述疫苗免疫动物能够有效产生对抗病毒感染的中和抗体。

另一方面，本申请提供了一种或多种细胞，所述细胞包含所述TGEV S蛋白突变体、所述分离的核酸分子、所述载体。例如，可将本申请所述的核酸分子或载体引入所述的细胞。所述细胞可以包括：原核细胞(例如，大肠杆菌细胞)和/或真核细胞(例如，HEK293T细胞、Expi293F细胞。在某些实施方式中，可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，所述方法可包括：热击转化法、瞬时转染法和/或稳定转染法。所述转染法可包括：电穿孔法、脂质体转染法和/或磷酸钙转染法等。在某些实施方式中，所述细胞可以包括通过本领域已知的方法(例如，瞬时转染)将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中使之表达(例如，瞬时表达)本申请所述TGEV S蛋白突变体。例如，在某些实施方式中，所述细胞(例如，Expi293F细胞)可以瞬时表达本申请所述TGEV S蛋白突变体。

另一方面，本申请提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本申请所述TGEVS蛋白突变体、所述疫苗、所述分离的核酸分子、所述载体、所述细胞和/或药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。在本申请中，所述药学上可接受的佐剂可以包括保护剂、稳定剂、防腐剂、杀菌剂、灭活剂、佐剂和/或缓冲剂。除非与本申请所述的TGEV S蛋白突变体、所述疫苗、所述分离的核酸分子、所述载体、所述细胞不相容，否则任何常规介质或试剂均可以考虑用于本申请的药物组合物中。

另一方面，本申请提供了一种制备所述TGEV S蛋白突变体的方法。所述方法可以包括所述TGEV S蛋白突变体、所述疫苗、所述分离的核酸分子、所述载体、所述细胞、所述药物组合物。例如，所述方法可以包括以下步骤：

1)构建所述TGEV S蛋白突变体质粒；

2)将所述质粒转染至细胞；

3)收集细胞上清，纯化TGEV S蛋白突变体蛋白。

另一方面，本申请还提供了所述TGEV S蛋白突变体、所述疫苗、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述药物组合物在制备预防和/或治疗疾病和/或病症的药物中的应用。

另一方面，本申请还提供了一种预防和/或治疗疾病和/或病症的方法，所述方法包括施用所述TGEV S蛋白突变体、所述疫苗、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述药物组合物。

另一方面，本申请还提供了所述TGEV S蛋白突变体、所述疫苗、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述药物组合物，其用于预防和/或治疗疾病和/或病症。

在某些实施方式中，所述疾病和/或病症由猪传染性胃肠炎病毒引起或介导。

在某些实施方式中，所述疾病和/或病症包含猪传染性胃肠炎。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的TGEV S蛋白突变体、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。

实施例1：TGEV S蛋白突变体设计

通过观察TGEV S蛋白的结构，设计出表1中的S蛋白突变体

表1 蛋白的分子编号、突变位点

其中，TG-WT(TG-WT S蛋白)作为对照，是在TGEV流行毒株(QXI73430.1)基础上，删除了C端的跨膜区Y1385-H1448得到；

TG-YK01(TG-YK01 S蛋白突变体)为本实施例的一种S蛋白突变体，是在TGEV流行毒株(QXI73430.1)基础上删除了C端的跨膜区Y1385-H1448，并将959位丙氨酸突变为脯氨酸，将1095位缬氨酸突变为脯氨酸，将1096位丙氨酸突变为脯氨酸，将1140位谷氨酸突变为脯氨酸，将1141位亮氨酸突变为脯氨酸，将1119位谷氨酰胺突变为半胱氨酸，以及将1157位丙氨酸突变为半胱氨酸得到。

将以上设计的突变体氨基酸残基序列以human为宿主进行密码子优化和合成(委托GenScript进行)，然后克隆至pCDNA3.4载体中，抽提质粒以进行进一步转染。

ACCESSION：QXI73430.1(SEQ ID NO.1)

MKKLFVVLVVMPLIYGDNFPCSKLTNRTIGNHWNLIETFLLNYSSRLSPNSDVVLGDYFPTVQPWFNCIRNNSNDLYVTLENLKALYWDYAIENITSNHKQRLNVVVNGYPYSITVTTTRNFNSAEGAIICICKGSPPTTTTESSLTCNWGSECRLNHKFPICPSNSEANCGNMLYGLQWFADAVVAYLHGASYRISFENQWSGTVTLGDMRATTLETAGTLVDLWWFNPVYDVSYYRVNNKNGTTVVSNCTDQCASYVANVFTTQPGGFIPSDFSFNNWFLLTNSSTLVSGKLVTKQPLLVNCLWPVPSFEEAASTFCFEGAGFDQCNGAVLNNTVDVIRFNLNFTTNVQSGKGATVFSLNTTGGVTLEISCYNDTVSDSSFSSYGVMPFVVTDGPRYCYVLYNGTALKYLGTLPPVVKEIAISKWGHFYINGYNFFSTFPIDCISFNLTTGDSDVFWTIAYTSYTEALVQVENTAITKVTYCNSYVNNIKCSQLTANLNNGFYPVSSSEVGLVNKSVVLLPSFYTHTIVNITIGLGMKRSGYGQPIASTLSNITLPMQDDNTDVYCIRSDQFSVYVHSTCKSALWDNVFKRNCTDVLDATAVIKTGTCPFSFAKLNNYLTFNKFCLSLSPVGANCKFDVAARTRTNDQVVRSLYVIYEEGDNIVGVPSDNSGLHDLSVLHLDSCTDYNIYGRTGVGIIRKTNRTLLSGLYYTSLSGDLLGFKNVSDGVIYSVTPCDVSAQAAVIDGTIVGAITSINSELLGLTHWTTTPNFYYYSIYNYTNDRTRGTAIDSNDDCEPVITYSNIGVCKNGALVFINVTHSDGDVQPISTGNVTIPTNFTISVQVEYIQVYTTPVSIDCSRYVCNGNPRCNKLLTQYVSACQTIEQALAMGARLENMEVDSMLFVSENALKLASVEAFNSSETLDPIYKEWPNIGGSWLEGLKYILPSDNSKRKYRSAIEDLLFAKVVTSGLGTVDEDYKRCTGGYDIADLVCAQYYNGIMVLPGVSNADKMTMYTASLAGGITLGALGGGAVAIPFAVAVQARLNYVALQTDVLNKNQQILASAFNQAIGNITQSFGKVNDAIHQTSRGLATVAKALAKVQDVVNAQGQALSHLTVQLQNNFQAISSSISDIYNRLDELSADAQVDRLITGRLTALNAFVSQTLTRQAEVRASRQLAKDKVNECVRSQSQRFGFCGNGTHLFSLANAAPNGMIFFHTLLLPTAYETVTAWAGICALDGDRTFGLVVKDVQLTLFRNLDDKFYLTPRTMYQPRVATSSDFVQIEGCDVLFVNATVSDLPSIIPDYIDINQTVQDILENFRPNWTVPELTFDIFNATYLNLTGEIDDLEFRSEKLHNTTVELAILIDNINNTLVNLEWLNRIETYVKWPWYVWLLIGLVVIFCIPLLLFCCCSTGCCGCIGCLGSCCHSICSRRQFENYEPIEKVHVH

实施例2：TGEV S蛋白突变体的哺乳动物细胞大体积表达

使用生长快速、细胞形态状态良好的Expi 293细胞作为转染宿主进行大体积转染，转染前调整种子细胞的活细胞密度为每毫升3百万个，每个项目使用400mL的细胞液进行转染。每个项目使用400μg质粒和600μL的ExpiFectamine 293Reagent，分别使用18mLOPM-293CD05培养基稀释，轻柔混匀，然后将稀释的ExpiFectamine 293Reagent轻柔滴加到稀释的质粒中，室温静置孵育20分钟以制备质粒复合物。孵育结束后将制备的质粒复合物缓慢滴入待转染的细胞液中，并将细胞液放置于37℃，8％CO₂的摇床中以100rpm的转速进行培养。转染后18-22小时，在每瓶转染细胞中分别加入Enhancer1 1.2mL和Enhancer212mL，并每天监测细胞状态，当细胞活率下降至70％，收获细胞培养液并转移至纯化工段进行纯化。

实施例3：使用His和Strep标签大体积表达的S蛋白进行亲和色谱纯化

以4000rpm/min速度离心收获的细胞培养液50min后，收取上清液，使用0.22μm瓶顶过滤器进行过滤。并使用PALL的FILTRON CENTRAMATETM切向流超滤系统和OMEGA50kD TSERIES膜包将过滤的上清进行换液至0.01M磷酸盐缓冲液中。

根据蛋白设计的纯化标签种类，可将换液完成的上清使用HisPurTM Ni-NTAResin(ThermoFisher Scientific 500mL 88223)和重力柱进行亲和层析。每个项目使用10mL的填料，上清4摄氏度的条件过夜流经色谱柱后收集流穿，并使用10个柱体积的含10mmol/L咪唑的0.01M磷酸盐缓冲液淋洗杂质。最终使用含500mmol/L咪唑的0.01M磷酸盐缓冲液分次洗脱目的蛋白。使用nanodrop检测各阶段产物的280nM的紫外吸收结果，并将有明显吸收的洗脱产物使用30kDa的超滤管离心浓缩至4mL左右。根据浓缩后的产物吸收浓度(OD/mL)和产物体积计算产量，根据表达的体积将产量归一为每升的量以便进行不同S蛋白突变体的产量对比。同时浓缩获得的产物进行下一步凝胶过滤色谱(GFC)分离纯化。

根据蛋白设计的纯化标签种类，可将换液完成的上清使用streptactin高速层析介质4FF(北京博奥龙公司，BDTL0026)和重力柱进行亲和层析。每个项目使用10mL的填料，上清4摄氏度的条件过夜流经色谱柱后收集流穿，并使用10个柱体积的0.01M磷酸盐缓冲液淋洗杂质，最终使用含2.5mM脱硫生物素的0.01M磷酸盐缓冲液洗脱目的蛋白。使用nanodrop检测检测各阶段产物的280nm的紫外吸收结果，并将有明显吸收的洗脱产物使用30kDa的超滤管离心浓缩至4mL左右进行下一步凝胶过滤色谱(GFC)分离纯化。

表2 亲和纯化后的表达量

突变分子编号	亲和纯化后的表达量(mg/L)
		TG-WT	2.5
TG-YK01	6.2

亲和纯化的结果如表2所示，与TG-WT S蛋白分子的表达量每升2.5mg相比，通过结构生物学设计改良的TG-YK01 S蛋白突变体分子的表达量为每升6.2mg，产量得到了一定程度上的提高。

实施例4：使用凝胶过滤色谱进行目标蛋白的分离纯化

为了进一步分离分子量大小不同的蛋白，获得设计目的具有免疫作用的三聚体S蛋白，使用分子排阻色谱进一步精纯亲和色谱的产物。本实验室使用英赛斯蛋白纯化仪和GE公司的Superose 6Increase 10/300GL分子筛柱进行分离纯化。设置分子筛纯化参数为每分钟一毫升流速，压力报警值0.5兆帕斯卡，每管4mL的固定收集体积为运行参数。

上样前使用pH值为7.4，包含额外150mM氯化钠的0.01M的磷酸盐缓冲液平衡色谱柱系统至基线稳定，然后使用注射器加入4mL亲和色谱洗脱产物浓缩后的样品，待不同保留时间的产物流出后，收集三聚体S蛋白的目标馏分，并使用30kDa的超滤管离心浓缩至0.2OD以上以便进行蛋白凝胶电泳分析以及进一步的基于冷冻电镜拍照方法的蛋白构象分析。

凝胶过滤色谱纯化(GFC)结果如图1所示，其中A为TG-WT S蛋白，B为TG-YK01S蛋白突变体。TG-WT S蛋白的吸收峰较低，其他杂质峰显示亲和纯化的产物纯度较低，均一性较差。TG-YK01 S蛋白突变体的目标蛋白峰明显提高，均一性也获得改良。从重组蛋白疫苗的质量控制角度，设计改良的重组蛋白增加了目标产物的均一性，为生产工艺的开发奠定了基础。

实施例5：使用蛋白凝胶电泳分析S蛋白突变体的状态

为了确定分子筛纯化时不同馏分的蛋白组成和状态，对相应的目标馏分(主要选取不同峰的峰尖及相连峰的拐点)进行蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。对收集的不同馏分进行样品预处理，每个待分析样品各取2个40μL体积的样品，分别加入10μL变性(含DTT还原剂)和非变性两种蛋白电泳上样缓冲液，充分混合后，置于金属浴100℃加热15分钟。加热完成后瞬时离心使样品全部沉降于管底。完成预处理的样品使用预制胶(SurePAGETM,Bis-Tris,10x8,4-12％,12wells)中，标准对照marker上样3μL，其余每种样品各上样20μL(如组分浓度过高，则适量减少上样体积，反之增加)以180伏恒压进行约40分钟电泳(以条带完全跑出SDS-PAGE为准)。完成后分离SDS-PAGE电泳胶，清水洗涤，洗涤后使用Fastblue蛋白染色液染色，电泳后凝胶完全浸入染色液为准，微波炉加热至沸腾后取出低速振荡染色约15分钟，充分染色后去除染色液，清水洗涤凝胶，洗涤后加入脱色液将凝胶置于微波炉中加热至沸腾，脱色15-20分钟，反复2至3次，至蓝色染色液背景完全脱掉。将脱色后的凝胶置于白板进行条带观察和拍照。

蛋白凝胶电泳分析结果如图2所示，其中，A为TG-WT S蛋白，无明显目的条带，B为TG-YK01 S蛋白突变体，设计后的蛋白纯度和浓度明显提高，理论上由于二硫键的共价作用，突变体的三聚体结构更加稳定。

实施例6：使用样品负染后电子显微镜观察S蛋白的形态

根据凝胶色谱纯化和蛋白凝胶的结果确定预期设计的具有免疫作用的三聚体S蛋白所在的馏分阶段，对目的阶段的馏分进行合并，浓缩，得到最终目的蛋白。结合设计的目的，选择特定的分子进行冷冻电镜负染拍照。采用普通碳膜铜网经辉光放电(25s,15mA)方法对优选的样品进行冷冻电镜负染拍照。将特定的蛋白样品稀释至0.01-0.05mg/mL，吸取3μl蛋白样品滴加到铜网上，放置40s，滤纸吸去多余样品，立即滴加2.5μl的3％负染染料，染色40s，滤纸吸去多余染料后晾干。将晾干后的铜网放到200kv TF20电镜下观察，在62,000倍放大倍数(对应像素大小为

)下用CCD相机拍照并保存照片。

拍照结果如图3所示，其中，A为TG-WT S蛋白结构，B为TG-YK01 S蛋白突变体结构。TG-WT S蛋白和TG-YK01 S蛋白突变体形成的蛋白颗粒中存在多种聚体，且存在较为细长的融合后形态。突变体融合前体S蛋白三聚体的轮廓更加圆润立体，蛋白质形成的三聚体颗粒更加均一，绝大部分处于融合前体的状态。

实施例7：TGEV S蛋白与TGEV抗体的亲和力检测

基于生物膜光干涉原理的gatorTM分子互作检测仪测试TGEV中和抗体1AF10对设计的突变体的结合与解离。

使用PBS buffer平衡proteinA探针120S后，捕获1AF10约1纳米,平衡120S后与梯度稀释(从200ug/mL以5倍梯度稀释6次)的设计的TEGV S蛋白进行结合反应，然后在PBS中进行解离反应，测试设计的TEGV S蛋白与中和抗体的结合情况。

如图4所示，经过24S的捕获可以获得大约1.1纳米的响应。与最高浓度115nM的TG-YK01 S蛋白突变体进行结合时，可以获得0.9纳米的响应。且随着重组蛋白的浓度下降，呈现梯度结合的现象。说明设计的TG-YK01 S蛋白突变体与中和抗体结合良好。

实施例8：使用纯化的S蛋白抗原进行小鼠免疫和猪免疫

(1)小鼠免疫实验

为了进一步验证设计的突变体分子对于动物的保护效果，使用优选的突变体纯化样品免疫小鼠，然后采集免疫后的小鼠血清体外测试对于病毒侵染靶细胞的抵抗作用，确定对于动物潜在的保护作用。

小鼠免疫方法如下：

吸取TGEV重组蛋白与佐剂混合并乳化制得0.2μg/μL的TGEV重组蛋白疫苗。

将14只小鼠随机分成2组，在第0，14天肌内注射50μL免疫样品对小鼠进行免疫，对照组注射50μL的PBS。分别在第0(首次免疫前)、14(二次免疫前)、28、42天经眼眶采集200～300μL血液。血液室温静置两小时，以3000转/分钟离心10分钟，轻缓吸取上清评估免疫效果。

表3 小鼠免疫实验

图5为肌肉注射TGEV重组蛋白后小鼠的体重变化情况。此外41天实验期间，小鼠外观、行为、摄食、分泌物、排泄物等无异常，耐受性良好，这在小鼠实验上有较好安全性。

(2)猪免疫实验

取两月龄巴马香猪两头，在环境安静、通风良好、日照规律且相对隔离的条件下，采取每日饲料定量，自由饮水的方式进行饲养。

经一周的适应饲养后，按照200μg/头的剂量(TGEV重组蛋白与MS302水佐剂按照体积比1：1进行乳化配制)进行重组蛋白的首次免疫注射，注射方式为颈后部肌肉多点注射；2周后，以相同的注射方式，按照100μg/头的剂量进行重组蛋白的加强免疫注射。

实验过程中，在首次免疫前、首次免疫后两周以及加强免疫后两周分别进行前腔静脉采血；所得血液先在室温条件下静止两小时，再以10000g离心15分钟，轻轻吸取上清，以用于后续检测实验。

实施例9：免疫后小鼠/猪血清中抗TGEV重组蛋白IgG抗体水平ELISA检测

预包板：利用1×PBS将重组蛋白稀释至1μg/mL；将稀释后的重组蛋白溶液按照每孔100μL的体积量添加至平底96孔ELISA板中；将ELISA板用密封膜封住，放在4℃条件下过夜孵育。

封闭：按照每孔350μL的PBST加入至ELISA板中，96孔板震荡仪清洗5min，倒掉清洗液，并用吸水纸洗干净残留液体。重复清洗三次；每孔加入300μL的封闭液，用密封膜封住后，室温孵育1h。

标准品及样本孵育：利用封闭液将对照抗体从10μg/mL的浓度按照1:10进行梯度稀释。

利用封闭液将待检测血清按照1:100进行稀释。按照每孔350μL的PBST加入至ELISA板中，96孔板震荡仪清洗5min，倒掉清洗液，并用吸水纸洗干净残留液体，重复清洗三次。取100μL的稀释后标准品及样本依次加入至96孔板中，用密封膜封住后，37℃孵育1h。

二抗孵育：按照每孔350μL的PBST加入至ELISA板中，96孔板震荡仪清洗5min，倒掉清洗液，并用吸水纸洗干净残留液体，重复清洗三次。按照1：5000比例用封闭液将HRP偶联二抗稀释，每孔加入100μL二抗稀释溶液，用密封膜封住后，37℃孵育1h。

显色：按照每孔350μL PBST加入至ELISA板中，96孔板震荡仪清洗5min，倒掉清洗液，并用吸水纸洗干净残留液体，重复清洗三次；每孔加入50μL的TMB显色溶液，室温避光孵育20min；每孔加入50μL的TMB终止液。

数据读取及浓度计算：使用酶标仪读取450nm的吸光值，制作柱状图。

如图6和图7所示，免疫前猪及小鼠的血清中未检测出明显的抗TGEV重组蛋白IgG抗体，而2周及4周的检测结果可以看出经过本专利中优化的TGEV重组蛋白疫苗免疫后猪及小鼠体内的抗体水平显著提高。

实施例10：使用纯化的S蛋白抗原进行靶动物免疫，测试其血清的抗病毒活性

免疫后收集的血清进行2倍比稀释，取1:8、1:16、1:32稀释度的血清与100PFU的TGEV-华毒株等量混合孵育1小时，然后将中和后的液体接种已长成单层的ST细胞中，每一个梯度的中和液以200μL每孔接种8孔，同时设置病毒对照(100μL TGEV-华毒株+100μL细胞培养基)和健康细胞对照(200μL细胞培养基)。在37℃，5％CO₂的条件下孵育感染2小时，并每隔10分钟晃动一次，接着将培养基去除换成8％CMC半固体培养基，在37℃，5％CO₂的条件下培养三天后去除半固体培养基，用PBS清洗两次后每孔加入200微升4％多聚甲醛固定液固定30分钟以上，固定结束后用PBS清洗三次，加入300微升0.02％曲拉通缓冲液浸泡30分钟后再用PBS清洗三次，然后加入一抗孵育1.5小时，后用PBS清洗三次，加入二抗孵育1.5小时后，按使用说明用TrueBlue过氧化物酶底物(KPL,MD,USA)对板子进行染色。然后对空斑进行计数和记录并分析数据。

如图8、9及表4所示，以稀释倍数作为EC₅₀的数值，稀释的倍数越大，说明我们的中和抗体效价越高。我们从各组EC₅₀中可以得知，免疫后4周的BALB/C小鼠血清EC₅₀为22726，即血清稀释22726倍后血清里含的中和抗体对病毒的抑制率依然能达到50％，而对猪免疫后4周血清的EC₅₀为268673，即稀释后268673倍后依然能50％压制病毒的增殖，说明我们的疫苗对BALB/C小鼠以及猪进行免疫后，能产生非常强的保护效果，且在猪免疫后身上产生的中和抗体更高。

表4 TGEV-动物血清中和实验EC₅₀

免疫血清	小鼠-4周	小鼠-6周	猪-2周	猪-4周	猪-7周
						<![CDATA[EC<sub>50</sub>(稀释倍数)]]>	22726	9988	12676	268673	95748

综上所述，通过结构生物学设计改良的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白融合前体三聚体重组蛋白疫苗具有安全、稳定、高效等优点，并且大幅提高了此重组蛋白的产量，具有非常良好的应用前景。

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 易康生物（苏州）有限公司

<120> 猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1448

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 1

Met Lys Lys Leu Phe Val Val Leu Val Val Met Pro Leu Ile Tyr Gly

1 5 10 15

Asp Asn Phe Pro Cys Ser Lys Leu Thr Asn Arg Thr Ile Gly Asn His

20 25 30

Trp Asn Leu Ile Glu Thr Phe Leu Leu Asn Tyr Ser Ser Arg Leu Ser

35 40 45

Pro Asn Ser Asp Val Val Leu Gly Asp Tyr Phe Pro Thr Val Gln Pro

50 55 60

Trp Phe Asn Cys Ile Arg Asn Asn Ser Asn Asp Leu Tyr Val Thr Leu

65 70 75 80

Glu Asn Leu Lys Ala Leu Tyr Trp Asp Tyr Ala Ile Glu Asn Ile Thr

85 90 95

Ser Asn His Lys Gln Arg Leu Asn Val Val Val Asn Gly Tyr Pro Tyr

100 105 110

Ser Ile Thr Val Thr Thr Thr Arg Asn Phe Asn Ser Ala Glu Gly Ala

115 120 125

Ile Ile Cys Ile Cys Lys Gly Ser Pro Pro Thr Thr Thr Thr Glu Ser

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Asn Trp Gly Ser Glu Cys Arg Leu Asn His Lys Phe

145 150 155 160

Pro Ile Cys Pro Ser Asn Ser Glu Ala Asn Cys Gly Asn Met Leu Tyr

165 170 175

Gly Leu Gln Trp Phe Ala Asp Ala Val Val Ala Tyr Leu His Gly Ala

180 185 190

Ser Tyr Arg Ile Ser Phe Glu Asn Gln Trp Ser Gly Thr Val Thr Leu

195 200 205

Gly Asp Met Arg Ala Thr Thr Leu Glu Thr Ala Gly Thr Leu Val Asp

210 215 220

Leu Trp Trp Phe Asn Pro Val Tyr Asp Val Ser Tyr Tyr Arg Val Asn

225 230 235 240

Asn Lys Asn Gly Thr Thr Val Val Ser Asn Cys Thr Asp Gln Cys Ala

245 250 255

Ser Tyr Val Ala Asn Val Phe Thr Thr Gln Pro Gly Gly Phe Ile Pro

260 265 270

Ser Asp Phe Ser Phe Asn Asn Trp Phe Leu Leu Thr Asn Ser Ser Thr

275 280 285

Leu Val Ser Gly Lys Leu Val Thr Lys Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys

290 295 300

Leu Trp Pro Val Pro Ser Phe Glu Glu Ala Ala Ser Thr Phe Cys Phe

305 310 315 320

Glu Gly Ala Gly Phe Asp Gln Cys Asn Gly Ala Val Leu Asn Asn Thr

325 330 335

Val Asp Val Ile Arg Phe Asn Leu Asn Phe Thr Thr Asn Val Gln Ser

340 345 350

Gly Lys Gly Ala Thr Val Phe Ser Leu Asn Thr Thr Gly Gly Val Thr

355 360 365

Leu Glu Ile Ser Cys Tyr Asn Asp Thr Val Ser Asp Ser Ser Phe Ser

370 375 380

Ser Tyr Gly Val Met Pro Phe Val Val Thr Asp Gly Pro Arg Tyr Cys

385 390 395 400

Tyr Val Leu Tyr Asn Gly Thr Ala Leu Lys Tyr Leu Gly Thr Leu Pro

405 410 415

Pro Val Val Lys Glu Ile Ala Ile Ser Lys Trp Gly His Phe Tyr Ile

420 425 430

Asn Gly Tyr Asn Phe Phe Ser Thr Phe Pro Ile Asp Cys Ile Ser Phe

435 440 445

Asn Leu Thr Thr Gly Asp Ser Asp Val Phe Trp Thr Ile Ala Tyr Thr

450 455 460

Ser Tyr Thr Glu Ala Leu Val Gln Val Glu Asn Thr Ala Ile Thr Lys

465 470 475 480

Val Thr Tyr Cys Asn Ser Tyr Val Asn Asn Ile Lys Cys Ser Gln Leu

485 490 495

Thr Ala Asn Leu Asn Asn Gly Phe Tyr Pro Val Ser Ser Ser Glu Val

500 505 510

Gly Leu Val Asn Lys Ser Val Val Leu Leu Pro Ser Phe Tyr Thr His

515 520 525

Thr Ile Val Asn Ile Thr Ile Gly Leu Gly Met Lys Arg Ser Gly Tyr

530 535 540

Gly Gln Pro Ile Ala Ser Thr Leu Ser Asn Ile Thr Leu Pro Met Gln

545 550 555 560

Asp Asp Asn Thr Asp Val Tyr Cys Ile Arg Ser Asp Gln Phe Ser Val

565 570 575

Tyr Val His Ser Thr Cys Lys Ser Ala Leu Trp Asp Asn Val Phe Lys

580 585 590

Arg Asn Cys Thr Asp Val Leu Asp Ala Thr Ala Val Ile Lys Thr Gly

595 600 605

Thr Cys Pro Phe Ser Phe Ala Lys Leu Asn Asn Tyr Leu Thr Phe Asn

610 615 620

Lys Phe Cys Leu Ser Leu Ser Pro Val Gly Ala Asn Cys Lys Phe Asp

625 630 635 640

Val Ala Ala Arg Thr Arg Thr Asn Asp Gln Val Val Arg Ser Leu Tyr

645 650 655

Val Ile Tyr Glu Glu Gly Asp Asn Ile Val Gly Val Pro Ser Asp Asn

660 665 670

Ser Gly Leu His Asp Leu Ser Val Leu His Leu Asp Ser Cys Thr Asp

675 680 685

Tyr Asn Ile Tyr Gly Arg Thr Gly Val Gly Ile Ile Arg Lys Thr Asn

690 695 700

Arg Thr Leu Leu Ser Gly Leu Tyr Tyr Thr Ser Leu Ser Gly Asp Leu

705 710 715 720

Leu Gly Phe Lys Asn Val Ser Asp Gly Val Ile Tyr Ser Val Thr Pro

725 730 735

Cys Asp Val Ser Ala Gln Ala Ala Val Ile Asp Gly Thr Ile Val Gly

740 745 750

Ala Ile Thr Ser Ile Asn Ser Glu Leu Leu Gly Leu Thr His Trp Thr

755 760 765

Thr Thr Pro Asn Phe Tyr Tyr Tyr Ser Ile Tyr Asn Tyr Thr Asn Asp

770 775 780

Arg Thr Arg Gly Thr Ala Ile Asp Ser Asn Asp Asp Cys Glu Pro Val

785 790 795 800

Ile Thr Tyr Ser Asn Ile Gly Val Cys Lys Asn Gly Ala Leu Val Phe

805 810 815

Ile Asn Val Thr His Ser Asp Gly Asp Val Gln Pro Ile Ser Thr Gly

820 825 830

Asn Val Thr Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Gln Val Glu Tyr

835 840 845

Ile Gln Val Tyr Thr Thr Pro Val Ser Ile Asp Cys Ser Arg Tyr Val

850 855 860

Cys Asn Gly Asn Pro Arg Cys Asn Lys Leu Leu Thr Gln Tyr Val Ser

865 870 875 880

Ala Cys Gln Thr Ile Glu Gln Ala Leu Ala Met Gly Ala Arg Leu Glu

885 890 895

Asn Met Glu Val Asp Ser Met Leu Phe Val Ser Glu Asn Ala Leu Lys

900 905 910

Leu Ala Ser Val Glu Ala Phe Asn Ser Ser Glu Thr Leu Asp Pro Ile

915 920 925

Tyr Lys Glu Trp Pro Asn Ile Gly Gly Ser Trp Leu Glu Gly Leu Lys

930 935 940

Tyr Ile Leu Pro Ser Asp Asn Ser Lys Arg Lys Tyr Arg Ser Ala Ile

945 950 955 960

Glu Asp Leu Leu Phe Ala Lys Val Val Thr Ser Gly Leu Gly Thr Val

965 970 975

Asp Glu Asp Tyr Lys Arg Cys Thr Gly Gly Tyr Asp Ile Ala Asp Leu

980 985 990

Val Cys Ala Gln Tyr Tyr Asn Gly Ile Met Val Leu Pro Gly Val Ser

995 1000 1005

Asn Ala Asp Lys Met Thr Met Tyr Thr Ala Ser Leu Ala Gly Gly Ile

1010 1015 1020

Thr Leu Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ala Val Ala Ile Pro Phe Ala Val

1025 1030 1035 1040

Ala Val Gln Ala Arg Leu Asn Tyr Val Ala Leu Gln Thr Asp Val Leu

1045 1050 1055

Asn Lys Asn Gln Gln Ile Leu Ala Ser Ala Phe Asn Gln Ala Ile Gly

1060 1065 1070

Asn Ile Thr Gln Ser Phe Gly Lys Val Asn Asp Ala Ile His Gln Thr

1075 1080 1085

Ser Arg Gly Leu Ala Thr Val Ala Lys Ala Leu Ala Lys Val Gln Asp

1090 1095 1100

Val Val Asn Ala Gln Gly Gln Ala Leu Ser His Leu Thr Val Gln Leu

1105 1110 1115 1120

Gln Asn Asn Phe Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile Ser Asp Ile Tyr Asn

1125 1130 1135

Arg Leu Asp Glu Leu Ser Ala Asp Ala Gln Val Asp Arg Leu Ile Thr

1140 1145 1150

Gly Arg Leu Thr Ala Leu Asn Ala Phe Val Ser Gln Thr Leu Thr Arg

1155 1160 1165

Gln Ala Glu Val Arg Ala Ser Arg Gln Leu Ala Lys Asp Lys Val Asn

1170 1175 1180

Glu Cys Val Arg Ser Gln Ser Gln Arg Phe Gly Phe Cys Gly Asn Gly

1185 1190 1195 1200

Thr His Leu Phe Ser Leu Ala Asn Ala Ala Pro Asn Gly Met Ile Phe

1205 1210 1215

Phe His Thr Leu Leu Leu Pro Thr Ala Tyr Glu Thr Val Thr Ala Trp

1220 1225 1230

Ala Gly Ile Cys Ala Leu Asp Gly Asp Arg Thr Phe Gly Leu Val Val

1235 1240 1245

Lys Asp Val Gln Leu Thr Leu Phe Arg Asn Leu Asp Asp Lys Phe Tyr

1250 1255 1260

Leu Thr Pro Arg Thr Met Tyr Gln Pro Arg Val Ala Thr Ser Ser Asp

1265 1270 1275 1280

Phe Val Gln Ile Glu Gly Cys Asp Val Leu Phe Val Asn Ala Thr Val

1285 1290 1295

Ser Asp Leu Pro Ser Ile Ile Pro Asp Tyr Ile Asp Ile Asn Gln Thr

1300 1305 1310

Val Gln Asp Ile Leu Glu Asn Phe Arg Pro Asn Trp Thr Val Pro Glu

1315 1320 1325

Leu Thr Phe Asp Ile Phe Asn Ala Thr Tyr Leu Asn Leu Thr Gly Glu

1330 1335 1340

Ile Asp Asp Leu Glu Phe Arg Ser Glu Lys Leu His Asn Thr Thr Val

1345 1350 1355 1360

Glu Leu Ala Ile Leu Ile Asp Asn Ile Asn Asn Thr Leu Val Asn Leu

1365 1370 1375

Glu Trp Leu Asn Arg Ile Glu Thr Tyr Val Lys Trp Pro Trp Tyr Val

1380 1385 1390

Trp Leu Leu Ile Gly Leu Val Val Ile Phe Cys Ile Pro Leu Leu Leu

1395 1400 1405

Phe Cys Cys Cys Ser Thr Gly Cys Cys Gly Cys Ile Gly Cys Leu Gly

1410 1415 1420

Ser Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Arg Arg Gln Phe Glu Asn Tyr Glu

1425 1430 1435 1440

Pro Ile Glu Lys Val His Val His

1445

Claims

1.一种猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体，其特征在于，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白进行如下氨基酸突变：

将959位丙氨酸突变为脯氨酸，将1095位缬氨酸突变为脯氨酸，将1096位丙氨酸突变为脯氨酸，将1140位谷氨酸突变为脯氨酸，以及将1141位亮氨酸突变为脯氨酸；以阻断蛋白质阿尔法螺旋结构的贯通；

和，将1119位谷氨酰胺突变为半胱氨酸，以及将1157位丙氨酸突变为半胱氨酸；以增加S蛋白单体内二硫键数量；

和，删除猪传染性胃肠炎病毒S蛋白跨膜区的1385位至1448位氨基酸。

2.一种疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体。

3.一种核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子编码权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体。

4.一种载体，其特征在于，所述的载体包含权利要求3所述的核酸分子。

5.一种细胞，其特征在于，所述的细胞表达权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体或包含权利要求4所述的载体。

6.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体、权利要求2所述的疫苗、权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的载体。

7.一种权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求5所述的细胞表达权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的载体。

8.权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒的S蛋白突变体、权利要求2所述的疫苗、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的细胞在制备预防和/或治疗猪传染性胃肠炎病的药物中的应用。