JP4043054B2 - 変異麻疹ウイルス抗原及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents
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Description
本発明は、変異麻疹ウイルス抗原及びそれをコードする遺伝子に関する。更に詳細には、変異麻疹ウイルス株のHタンパク抗原及びFタンパク抗原から選ばれる少なくとも1種のタンパク抗原を含有する変異麻疹ウイルス抗原、ならびにそれら変異麻疹ウイルス抗原をそれぞれコードする遺伝子に関する。本発明の変異麻疹ウイルス抗原又はこれをコードする変異麻疹ウイルス遺伝子を用いると、流行株麻疹ウイルスに適合した弱毒生麻疹ワクチン又は遺伝子ワクチン、さらに流行株麻疹ウイルスによる感染を的確に検出できる診断剤を、効率的且つ経済的に提供することが可能である。
従来技術
(1)病原性:麻疹ウイルスは、麻疹の病原体であり、全世界に広く分布している。このウイルスは伝染性が極めて高く、ヒトに飛沫感染すると、主に呼吸器系と細網内皮組織を犯し、急性疾患を生じる。罹患すると、高熱、カタル、発疹など全身にわたる症状を呈し、重症例では細菌性肺炎、中耳炎、急性脳炎を合併する。尚、1996年の世界での麻疹の推計患者数は約4200万人、推計死亡者数は約101万人である[“The World Health Report 1997”,p.15,WHO(World Health Organization)1997年発行]。この様に麻疹は極めて重視すべき伝染病であり、ワクチンによる麻疹根絶は今や全世界で望まれている。この様な状況に呼応し、世界保健機構(WHO)による予防接種拡大計画(EPI:Expanded Program on Immunization)の一環として、麻疹の制圧を2010年とする目標の下で、麻疹根絶計画は既に着手されている。
(2)形態とゲノム構造:国際ウイルス分類委員会の第6回報告によれば、麻疹ウイルスはモノネガウイルス目パラミクソウイルス科モルビリウイルス属に属する。ビリオンは、直径が約150nmのほぼ球形であり、脂質二重膜からなるエンベロープを有する。そのエンベロープの全面にはH(hemagglutinin)タンパクとF(fusion)タンパクとがスパイク状に突起し、その基底はエンベロープ下面のMatrix膜タンパクで支持されている。エンベロープ内側に存在するヌクレオキャプシドは、麻疹ウイルスゲノムである全長約16kbの線状単鎖(−)センス(いわゆるmononega)の遺伝子RNAとタンパクからなる。該遺伝子RNAは、3’末端から5’末端方向に順に、N(nucleocapsid-assoiciated proteins),P/C/V(phosphoprotein/C protein/Vprotein:tricistronic gene),M(matrix protein),F(fusion protein),H(hemagglutinin protein)及びL(large putative polymerase protein)をそれぞれコードしている(“Virus Taxonomy:Sixth Report of the International Committee of Taxonomy of Viruses”,Archives of Virology,Supplement 10,pp.268-270,及びpp.271-272,1995)。
(3)従来の弱毒生麻疹ワクチン株ウイルス:従来の弱毒麻疹ウイルス株としては、例えば、次の株が知られている:CAM−70,Schwarz FF8,AIK−C,AIK−HDC,TD97,Moraten,Connaught,Schwarz,Edmonston B,Edmonston-Zagreb,Leningrad-16,Shanghai-191,Changchum-47,及びBeijing(“Vaccines”、第2版,pp.238-239,S.A.Plotokin及びE.A.Mortimer著,W.B.Saunders Company,1994年発行)。尚、ワクチン株ウイルスはいずれも、生ワクチンの有効成分としての安全性と有効性とを確保するために、分離株(野生の麻疹ウイルス)の継代に用いる宿主細胞、培養温度、培地のpHや組成等の条件を多様に工夫し、これ等の諸条件を組合せて継代を重ねることにより弱毒化された宿主域変異株あるいは温度変異株のウイルスである。
(4)予防:麻疹予防のワクチンは、1960年代前半から実用に供され始めた。かかる初期の頃には、不活化麻疹ウイルスを有効成分して含有する不活化ワクチン(K;“killed virus vaccine”の略)が主に使用されていた。しかし、該ワクチンは、免疫効果が不十分な上に、重症の異型麻疹を誘発したため、1960年代後半に入り、弱毒麻疹ウイルスを有効成分として用いる生ワクチン(L;“live virus vaccine”の略)が次第に広く使用され始めた。この間、KL併用が行われたこともあるが、1970年代以降は、これらを一層弱毒化した高度弱毒生ワクチン(FL:further attenuated live vaccine)が世界で広く市販され、実用に供されている。尚、これ等の生ワクチンはいずれも、前述(3)の弱毒生麻疹ワクチン株ウイルスを有効成分として用いるものである。
(5)麻疹のワクチンと診断に関する課題:従来の弱毒生麻疹ワクチンによる免疫持続につき、1970年代前半頃から疑義が生じていた。これは、いわゆる二次ワクチン免疫不全(secondary vaccine failure)や修飾麻疹(modified measles)に関する報告であり、ワクチン接種を受けているにも拘らず麻疹に再感染し、自然感染とは異なる症状(通常は自然感染に比べ軽症であるが、稀に重症例)が観察されている。この様な再感染例は、1980年代後半から世界各地で散発し、1990年代には頻繁に報告されている。従って、再感染の予防と感染ウイルスの鑑別は、世界各国の国民のみならず、前述のWHOによる世界の麻疹根絶計画の上からも、急務且つ必須の検討課題である。しかし、現在流行している麻疹ウイルスの予防に有効なワクチンや診断剤は未だ知られていない。
発明の概要
本発明の筆頭発明者は、30余年に渡り、麻疹の臨床、疫学及びワクチン学の研究のみならず、ワクチン株、流行株、新鮮分離株等の多様な麻疹ウイルスに関して、ウイルス学及び免疫学の観点から研究を進めると共に、これ等の各ウイルス株の遺伝子を解析した。そして、従来の強毒株と、変異株である強毒株及び流行株との間の抗原性又は免疫原性の差異を確認し、かかる差異の要因を特定すべく鋭意研究を行った。その結果、変異株は、HタンパクとFタンパクの各タンパクをコードする遺伝子の特定領域において、アミノ酸置換を伴う変異を有するという驚くべき知見を得た。更に本発明者らは、Hタンパク及びFタンパクそれぞれの変異領域が変異麻疹ウイルス抗原として有用であることを知見した。本発明は、この新規な知見に基いて完成されたものである。
従って、本発明の主なる1つの目的は、流行株麻疹ウイルスワクチンや診断剤の作成に有効な変異麻疹ウイルスHタンパク抗原及び変異麻疹ウイルスFタンパク抗原から選ばれる少なくとも1種のタンパク抗原を含有する変異麻疹ウイルス抗原を提供することにある。
本発明の他の1つの目的は、流行株麻疹ウイルスに対する遺伝子ワクチンや診断剤の作成に有効な変異麻疹ウイルスHタンパク抗原をコードする遺伝子及び変異麻疹ウイルスFタンパク抗原をコードする遺伝子から選ばれる少なくとも1種の遺伝子を含有する変異麻疹ウイルス遺伝子を提供することにある。
本発明の上記及び他の諸目的、諸特徴並びに諸利益は、添付の配列表を参照しながら述べる次の詳細な説明及び請求の範囲の記載から明らかになる。
次に、本発明の基本的特徴を更に明らかにするために、本発明の完成に至る経緯を追いながら、本発明に包含される技術的諸特徴について説明する。
配列表の簡単な説明
以下に述べる各配列番号のアミノ酸配列において、左側端部がN−末端であり、右側端部がC−末端である。
配列番号1は、弱毒麻疹ウイルスCAM−70株のHタンパクをコードする遺伝子RNAに対応するcDNAの塩基配列と、該配列がコードするHタンパクの全長アミノ酸配列であり;
配列番号2は、弱毒麻疹ウイルスCAM−70株のHタンパクの全長アミノ酸配列であり;
配列番号3は、配列番号2の第93番〜第616番のアミノ酸からなる断片ペプチドのアミノ酸配列であり;
配列番号4は、配列番号2の第176番〜第316番のアミノ酸からなる断片ペプチドのアミノ酸配列であり;
配列番号5は、配列番号2の第172番〜第178番のアミノ酸からなる断片ペプチドのアミノ酸配列であり;
配列番号6は、配列番号2の第238番〜第244番のアミノ酸からなる断片ペプチドのアミノ酸配列であり;
配列番号7は、配列番号2の第277番〜第282番のアミノ酸からなる断片ペプチドのアミノ酸配列であり;
配列番号8は、配列番号2の第301番〜第307番のアミノ酸からなる断片ペプチドのアミノ酸配列であり;
配列番号9は、強毒麻疹ウイルスNA株のHタンパクをコードする遺伝子RNAに対応するcDNAの塩基配列と、該配列がコードするHタンパクの全長アミノ酸配列であり;
配列番号10は、強毒麻疹ウイルスNA株のHタンパクの全長アミノ酸配列であり、
配列番号11は、配列番号10の第93番〜第616番のアミノ酸からなる断片ペプチドのアミノ酸配列であり;
配列番号12は、配列番号10の第176番〜第316番のアミノ酸からなる断片ペプチドのアミノ酸配列であり;
配列番号13は、配列番号10の第172番〜第178番のアミノ酸からなる断片ペプチドのアミノ酸配列であり;
配列番号14は、配列番号10の第238番〜第244番のアミノ酸からなる断片ペプチドのアミノ酸配列であり;
配列番号15は、配列番号10の第277番〜第282番のアミノ酸からなる断片ペプチドのアミノ酸配列であり;
配列番号16は、配列番号10の第301番〜第307番のアミノ酸からなる断片ペプチドのアミノ酸配列であり;
配列番号17は、弱毒麻疹ウイルスCAM−70株のFタンパクをコードする遺伝子RNAに対応するcDNAの塩基配列と、該配列がコードするFタンパクの全長アミノ酸配列であり;
配列番号18は、弱毒麻疹ウイルスCAM−70株のFタンパクの全長アミノ酸配列であり;
配列番号19は、強毒麻疹ウイルスNA株のFタンパクをコードする遺伝子RNAに対応するcDNAの塩基配列と、該配列がコードするFタンパクの全長アミノ酸配列であり;
配列番号20は、強毒麻疹ウイルスNA株のFタンパクの全長アミノ酸配列である。
発明の詳細な発明
本発明の1つの態様によれば、下記の(I)変異麻疹ウイルスHタンパク抗原及び(II)変異麻疹ウイルスFタンパク抗原よりなる群から選ばれる少なくとも1種のタンパク抗原を含有する変異麻疹ウイルス抗原が提供される。
(I)下記のアミノ酸配列(a)〜(f):
(a)配列番号2又は配列番号10に記載のアミノ酸配列;
(b)配列番号3又は配列番号11に記載のアミノ酸配列;
(c)配列番号4又は配列番号12に記載のアミノ酸配列;
(d)配列番号5、配列番号6、配列番号7又は配列番号8に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号13、配列番号14、配列番号15又は配列番号16に記載のアミノ酸配列;
(e)配列番号2又は配列番号10に記載のアミノ酸配列の第174番、第176番、第243番、第279番、又は第302番のアミノ酸を含み、且つ該アミノ酸に隣接する少なくとも6個のアミノ酸の配列からなる断片;及び
(f)配列番号2又は配列番号10に記載のアミノ酸配列の第93番、第157番、第169番、第175番、第211番、第252番、第276番、第284番、第285番、第296番、第316番、第338番、第387番、第416番、第455番、第481番、第484番、第505番、第546番、第592番、第600番、第603番、又は第616番のアミノ酸を含み、且つ該アミノ酸に隣接する少なくとも6個のアミノ酸の配列からなる断片よりなる群から選ばれる少なくとも1種の変異麻疹ウイルスHタンパク抗原。
(II)下記のアミノ酸配列(g)と(h):
(g)配列番号18又は配列番号20に記載のアミノ酸配列;及び
(h)配列番号18又は配列番号20に記載のアミノ酸配列の第11番、第52番、第107番、第165番、第398番、第417番、又は第523番のアミノ酸を含み、且つ該アミノ酸に隣接する少なくとも6個のアミノ酸の配列からなる断片よりなる群ら選ばれる少なくとも1種の変異麻疹ウイルスFタンパク抗原。
次に、本発明の理解を容易にするために、まず本発明の基本的特徴及び好ましい態様を列挙する。
1.下記の(I)変異麻疹ウイルスHタンパク抗原及び(II)変異麻疹ウイルスFタンパク抗原よりなる群から選ばれる少なくとも1種のタンパク抗原を含有する変異麻疹ウイルス抗原。
(I)下記のアミノ酸配列(a)〜(f):
(a)配列番号2又は配列番号10に記載のアミノ酸配列;
(b)配列番号3又は配列番号11に記載のアミノ酸配列;
(c)配列番号4又は配列番号12に記載のアミノ酸配列;
(d)配列番号5、配列番号6、配列番号7又は配列番号8に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号13、配列番号14、配列番号15又は配列番号16に記載のアミノ酸配列;
(e)配列番号2又は配列番号10に記載のアミノ酸配列の第174番、第176番、第243番、第279番、又は第302番のアミノ酸を含み、且つ該アミノ酸に隣接する少なくとも6個のアミノ酸の配列からなる断片;及び
(f)配列番号2又は配列番号10に記載のアミノ酸配列の第93番、第157番、第169番、第175番、第211番、第252番、第276番、第284番、第285番、第296番、第316番、第338番、第387番、第416番、第455番、第481番、第484番、第505番、第546番、第592番、第600番、第603番、又は第616番のアミノ酸を含み、且つ該アミノ酸に隣接する少なくとも6個のアミノ酸の配列からなる断片よりなる群から選ばれる少なくとも1種の変異麻疹ウイルスHタンパク抗原。
(II)下記のアミノ酸配列(g)と(h):
(g)配列番号18又は配列番号20に記載のアミノ酸配列;及び
(h)配列番号18又は配列番号20に記載のアミノ酸配列の第11番、第52番、第107番、第165番、第398番、第417番、又は第523番のアミノ酸を含み、且つ該アミノ酸に隣接する少なくとも6個のアミノ酸の配列からなる断片よりなる群ら選ばれる少なくとも1種の変異麻疹ウイルスFタンパク抗原。
2.下記の(I)の変異麻疹ウイルスHタンパク抗原をコードする遺伝子及び(II)変異麻疹ウイルスFタンパク抗原をコードする遺伝子よりなる群から選ばれる少なくとも1種の遺伝子を含有する変異麻疹ウイルス遺伝子。
(I)下記の塩基配列(a)〜(f):
(a)配列番号2又は配列番号10に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列;
(b)配列番号3又は配列番号11に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列;
(c)配列番号4又は配列番号12に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列;
(d)配列番号5、配列番号6、配列番号7又は配列番号8に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、あるいは配列番号13、配列番号14、配列番号15又は配列番号16に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列;
(e)配列番号2又は配列番号10に記載のアミノ酸配列の第174番、第176番、第243番、第279番、又は第302番アミノ酸を含み、且つ該アミノ酸に隣接する少なくとも6個のアミノ酸の配列からなる断片をコードする塩基配列;及び
(f)配列番号2又は配列番号10に記載のアミノ酸配列の第93番、第157番、第169番、第175番、第211番、第252番、第276番、第284番、第285番、第296番、第316番、第338番、第387番、第416番、第455番、第481番、第484番、第505番、第546番、第592番、第600番、第603番、又は第616番のアミノ酸を含み、且つ該アミノ酸に隣接する少なくとも6個のアミノ酸の配列からなる断片をコードする塩基配列よりなる群から選ばれる少なくとも1種の変異麻疹ウイルスHタンパク抗原をコードする遺伝子。
(II)下記の塩基配列(g)と(h):
(g)配列番号18又は配列番号20に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列;及び
(h)配列番号18又は配列番号20に記載のアミノ酸配列の第11番、第52番、第107番、第165番、第398番、第417番、又は第523番のアミノ酸を含み、且つ該アミノ酸に隣接する少なくとも6個のアミノ酸の配列からなる断片をコードする塩基配列よりなる群ら選ばれる少なくとも1種の変異麻疹ウイルスFタンパク抗原をコードする遺伝子。
3.配列番号2に示したCAM−70株のHタンパク質の一部を、配列番号10に示したNA株のHタンパク質の対応する部分で置換することによって得られる、組み換え変異麻疹ウイルス抗原。
4.配列番号2の176番〜316番アミノ酸を配列番号12のアミノ酸配列で置換することを特徴とする、前記3項に記載の組み換え変異麻疹ウイルス抗原。
5.配列番号2に示したCAM−70株のHタンパク質をコードする塩基配列の一部を、配列番号10に示したNA株のHタンパク質をコードする塩基配列の対応する部分で置換することによって得られる、組み換え変異麻疹ウイルス遺伝子。
6.配列番号2の176番〜316番アミノ酸をコードする塩基配列を配列番号12のアミノ酸配列をコードする塩基配列で置換することを特徴とする、前記5項に記載の組み換え変異麻疹ウイルス遺伝子。
以下、本発明について具体的に説明する。
尚、本発明において、DNA塩基配列中のAはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tはチミンを示す。
また、本発明において、アミノ酸配列中のAlaはアラニン、Argはアルギニン、Asnはアスパラギン、Aspはアスパラギン酸、Cysはシステイン、Glnはグルタミン、Gluはグルタミン酸、Glyはグリシン、Hisはヒスチジン、Ileはイソロイシン、Leuはロイシン、Lysはリジン、Metはメチオニン、Pheはフェニルアラニン、Proはプロリン、Serはセリン、Thrはスレオニン、Trpはトリプトファン、Tyrはチロシン、Valはバリンである。
初めに、本発明の基本的特徴を更に明らかにするために、本発明の完成に至る経緯を追いながら、本発明に包含される技術的諸特徴について説明する。
従来の生ワクチンは全て、1950〜1960年代に流行したウイルスを弱毒化した株で製造されている。従って、従来のワクチン株ウイルスの抗原性は、約半世紀前の流行株のものである。
一方、近年及び最近の流行株ウイルスは、ウイルス感染が成立するための細胞へのビリオンの吸着・侵入に関与するHタンパク遺伝子及びFタンパク遺伝子に変異を有することが確認された。特に、Hタンパク遺伝子の変異は、該タンパクを構成する全617個のアミノ酸の配列の特定領域における17〜19個のアミノ酸の置換をもたらし、タンパクの立体構造を変化させるため、抗原変異(antigenic variation)が生じている。かかる抗原変異は、Hタンパクの抗原不連続変異(antigenic shift)に匹敵するほど大きく重大だと判断される。
そして、流行株の抗原変異(antigenic variation)は、前述の二次ワクチン免疫不全や修飾麻疹をもたらす重視すべき因子であることを知見した。
上記の知見に基づき、変異した麻疹ウイルスのゲノム、特にHタンパク遺伝子及びFタンパク遺伝子、並びにこれ等がコードする変異抗原(全長タンパク又はその断片ペプチド)を提供することに成功した。
更に、上記の遺伝子、変異抗原、そのエピトープ等の、次の(i)〜(iii)の用途を開発することに成功した。
(i)生ワクチン株ウイルスゲノムの改造:従来の生ワクチン株ウイルスのHタンパク遺伝子を、流行株ウイルスのHタンパク遺伝子と置換した組換えウイルスを作出する。これにより、流行株の抗原性に見合った生ワクチン用の弱毒ウイルス株が迅速に得られる。換言すれば、かかる組換えウイルスは、流行株感染の予防に優れた適格なワクチンの有効成分として用いることができる。この方法の更なる利点は、その経済性にある。即ち、ウイルスの弱毒化に要する時間・労力・経費等が大幅に短縮且つ節減できることである。尚、従来のウイルスの弱毒化方法は、前述の通り定まった方法がないため、主にウイルス継代によるものであり、生ワクチン用の弱毒株を確立するまでに少なくとも数年〜約10年を要していた。
(ii)遺伝子ワクチン(gene vaccine)用の有効成分の作出:流行株ウイルスのHタンパク遺伝子及びFタンパク遺伝子を、種々のベクター、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、シャトルベクター、非増殖型のウイルスベクター等に挿入連係することにより作出する。
例えば、非増殖型ウイルスゲノムに上記Hタンパク遺伝子及びFタンパク遺伝子のcDNAを挿入連係して作出した非増殖型組換えウイルスは、遺伝子ワクチンあるいはDNAワクチンの有効成分として、従来の生麻疹ワクチンと同様に体液性及び細胞性の両免疫を誘導する。特筆すべきことに、このようなワクチンは経鼻接種が可能である。
また、流行株ウイルスのHタンパク遺伝子の変異領域を含むcDNA断片を、例えばプラスミドベクターに挿入連係することにより、naked DNAを調製する。かかるDNAは、麻疹予防のDNAワクチンないしは遺伝子ワクチンの有効成分として使用できる。
(iii)流行株に最適な診断剤の調製:流行株ウイルスのHタンパク遺伝子及びFタンパク遺伝子の変異を考慮してPCRプライマーを合成する。かかるプライマーは、流行麻疹ウイルス株を同定すると共に、強毒株と弱毒株とを鑑別するための遺伝子診断剤として使用できる。
また、該遺伝子がコードする変異抗原(全長タンパク又はその断片ペプチド)を調製すると共に、そのエピトープを化学合成する。これ等は、流行麻疹の最適な診断用抗原として提供される。
次に、本発明の変異麻疹ウイルス抗原及び変異麻疹ウイルス遺伝子の調製、調製された抗原と遺伝子のワクチンや診断剤としての利用について説明する。
[I]変異麻疹ウイルス抗原及び変異麻疹ウイルス遺伝子の調製
(1)種々の麻疹ウイルス抗原の抗原解析:抗原解析には中和試験、HI(hemagglutination inhibition)試験、PA(passive agglutination)法、モノクローナル抗体を用いる酵素免疫測定法や蛍光抗体法等が採用できる。これ等のうち、特に中和反応による抗体価の測定結果に基づく解析は必須であり、マイクロプレートを用いるUedaの変法(Biken Journal,14,155-160,1971)に従って行うことができる。
抗原解析に用いる抗体としては、血清、例えば、麻疹患者血清、以下に示す麻疹ウイルスに対するマウス免疫血清等を用いる。
抗原(攻撃ウイルス)を選択する際に特に留意すべき点は、過去から現在にいたる様々な麻疹ウイルス株を使用することである。例えば、1950〜1960代の流行株(過去の強毒株)の代表として田辺、Edmonston等、かかる株を弱毒化することにより確立された前述の生ワクチン株(従来の弱毒株)としては、CAM−70、Edmonston B等、更に、最近の流行株(強毒株)としては、1990年代に入り世界各地で分離されている麻疹ウイルス株を用いることができる。例えば、本発明者らが多様な材料から分離したF−t[再感染者の咽喉拭い液(throat swab)から1991年に分離]、F−b[再感染者の血液(blood)から1991年に分離]、U−t(ワクチン未接種患者のthroat swabから1991年に分離)、U−b(ワクチン未接種患者のbloodから1991年に分離)、Momo(患者から1995年に分離)、NA(患者から1996年に分離)等が挙げられる。
尚、上記のウイルス株について以下、屡々、( )内のように略記する:田辺(Tana)、Edmonston(Edmo)、CAM−70(CAM)、及びMomo(MO)。
(2)遺伝子の塩基配列に基づく変異領域の検出と遺伝子がコードするアミノ酸配列の解読:上述(1)の各麻疹ウイルス株のゲノムを用いて行う。先ず、ウイルスゲノムRNAを抽出の後、プライマーを用いてcDNAを作成し、その塩基配列をPCRを用いる直接シークエンス法により決定する。シークエンスと共にホモロジー検索を行い、変異領域を特定する。
次に、上記の変異領域から、Univeral Codeに基づきアミノ酸配列を判読し、そのアミノ酸配列について演繹的解析を行う。疎水性パターンの解析、及びタンパクの二次構造の決定(Chou-Fasman 解析)には、解析ソフトDNASIS-Mac(version 3.6)[日本国、日立ソフトウェアエンジニアリング(株)社製]を用いることができる。また、エピトープの決定には、解析ソフトEpitope Advisor[日本国、(株)富士通九州システムエンジニアリング(FQS)社製]を用いることができる。
(3)変異麻疹ウイルス抗原及びそれをコードする遺伝子:本発明者等は、上記(1)の抗原解析や(2)の塩基及びアミノ酸配列の分析に基づき、近年の麻疹ウイルス流行株において、過去の強毒株や従来の弱毒麻疹生ワクチン株との比較から、アミノ酸置換が存在する領域をHタンパク及びFタンパクに見出し、更に、麻疹ウイルス流行株のワクチンや診断に有用な抗原を特定した。本発明の変異麻疹ウイルス抗原は、弱毒麻疹ウイルス株であるCAM−70又は流行麻疹ウイルス株であるNA株のHタンパク及びFタンパクの全長又は断片である。いずれのアミノ酸配列も本願発明者らによって初めて開示されたものである。具体的には、本発明の麻疹ウイルス抗原は、次に示す(I)変異麻疹ウイルスHタンパク抗原及び(II)変異麻疹ウイルスFタンパク抗原よりなる群から選ばれる少なくとも一種のタンパク抗原を含有する抗原である。
(I)下記のアミノ酸配列(a)〜(f):
(a)配列番号2又は配列番号10に記載のアミノ酸配列;
(b)配列番号3又は配列番号11に記載のアミノ酸配列;
(c)配列番号4又は配列番号12に記載のアミノ酸配列;
(d)配列番号5、配列番号6、配列番号7又は配列番号8に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号13、配列番号14、配列番号15又は配列番号16に記載のアミノ酸配列;
(e)配列番号2又は配列番号10に記載のアミノ酸配列の第174番、第176番、第243番、第279番、又は第302番のアミノ酸を含み、且つ該アミノ酸に隣接する少なくとも6個のアミノ酸の配列からなる断片;及び
(f)配列番号2又は配列番号10に記載のアミノ酸配列の第93番、第157番、第169番、第175番、第211番、第252番、第276番、第284番、第285番、第296番、第316番、第338番、第387番、第416番、第455番、第481番、第484番、第505番、第546番、第592番、第600番、第603番、又は第616番のアミノ酸を含み、且つ該アミノ酸に隣接する少なくとも6個のアミノ酸の配列からなる断片よりなる群から選ばれる少なくとも1種の変異麻疹ウイルスHタンパク抗原。
(II)下記のアミノ酸配列(g)と(h):
(g)配列番号18又は配列番号20に記載のアミノ酸配列;及び
(h)配列番号18又は配列番号20に記載のアミノ酸配列の第11番、第52番、第107番、第165番、第398番、第417番、又は第523番のアミノ酸を含み、且つ該アミノ酸に隣接する少なくとも6個のアミノ酸の配列からなる断片よりなる群ら選ばれる少なくとも1種の変異麻疹ウイルスFタンパク抗原。
本発明の変異麻疹ウイルス抗原に含有されるタンパク抗原のうち、(a)及び(g)はそれぞれHタンパク及びFタンパクであり、(b)〜(f)及び(h)はペプチド(断片)である。更に、(d)に記載した4種の断片、即ち、配列番号2又は10に記載の全長617個のアミノ酸の配列のアミノ酸番号で特定される第172〜178番、第238〜244番、第277〜282番、及び第301〜307番は、本発明者らによって開示されたHタンパクのエピトープである。(a)〜(d)及び(g)については、具体的な配列を配列表に示した。いずれの抗原も、配列表のアミノ酸配列を基に化学合成することができる(実施例5を参照)。
本発明の変異麻疹ウイルス抗原は、上記の全長タンパク及びその断片ペプチドから選ばれるタンパク抗原を少なくとも1種含有するものであり、タンパク抗原は使用目的に応じて適宜選択することができる。又、複数の抗原を組み合わせて使用することもできる。
更に、本発明の他の1つの態様によれば、上記の変異麻疹ウイルス抗原をコードする遺伝子が提供される。具体的には、次に示す(I)変異麻疹ウイルスHタンパク抗原をコードする遺伝子及び(II)変異麻疹ウイルスFタンパク抗原をコードする遺伝子よりなる群から選ばれる少なくとも一種の遺伝子を含有する変異麻疹ウイルス遺伝子が提供される。
(I)下記の塩基配列(a)〜(f):
(a)配列番号2又は配列番号10に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列;
(b)配列番号3又は配列番号11に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列;
(c)配列番号4又は配列番号12に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列;
(d)配列番号5、配列番号6、配列番号7又は配列番号8に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、あるいは配列番号13、配列番号14、配列番号15又は配列番号16に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列;
(e)配列番号2又は配列番号10に記載のアミノ酸配列の第174番、第176番、第243番、第279番、又は第302番アミノ酸を含み、且つ該アミノ酸に隣接する少なくとも6個のアミノ酸の配列からなる断片をコードする塩基配列;及び
(f)配列番号2又は配列番号10に記載のアミノ酸配列の第93番、第157番、第169番、第175番、第211番、第252番、第276番、第284番、第285番、第296番、第316番、第338番、第387番、第416番、第455番、第481番、第484番、第505番、第546番、第592番、第600番、第603番、又は第616番のアミノ酸を含み、且つ該アミノ酸に隣接する少なくとも6個のアミノ酸の配列からなる断片をコードする塩基配列よりなる群から選ばれる少なくとも1種の変異麻疹ウイルスHタンパク抗原をコードする遺伝子。
(II)下記の塩基配列(g)と(h):
(g)配列番号18又は配列番号20に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列;及び
(h)配列番号18又は配列番号20に記載のアミノ酸配列の第11番、第52番、第107番、第165番、第398番、第417番、又は第523番のアミノ酸を含み、且つ該アミノ酸に隣接する少なくとも6個のアミノ酸の配列からなる断片をコードする塩基配列よりなる群ら選ばれる少なくとも1種の変異麻疹ウイルスFタンパク抗原をコードする遺伝子。
本発明の変異麻疹ウイルス抗原をコードする遺伝子は、変異麻疹ウイルス抗原である全長タンパク又はその断片ペプチドをコードする遺伝子であれば特に限定されず、CAM−70又はNA株のゲノムRNAの塩基配列に限定されるものではない。変異麻疹ウイルス遺伝子としては、配列番号1、9、17及び19に記載のcDNAを使用することもできるし、又、変異麻疹ウイルス抗原のアミノ酸配列を基に塩基配列を合成することもできる。
本発明の変異麻疹ウイルス遺伝子は、上記の変異麻疹ウイルス抗原をコードする遺伝子から選ばれる遺伝子を少なくとも1種含有するものであり、含有される遺伝子は、使用目的に応じて適宜選択することができる。本発明の変異麻疹ウイルス抗原と同様に、本発明の変異麻疹ウイルス遺伝子は、弱毒株の遺伝子及び流行株の遺伝子を包含する。本発明の開示を基に、例えば、流行株に有効な生ワクチンの作成が可能になる{後述の[II](1)及び実施例2と3を参照}。又、複数の遺伝子を組み合わせて用いる場合には、遺伝子を連係して用いることもできる{後述の[II](2)及び実施例4を参照}。
上記の配列からなる本発明の抗原及びそれをコードする遺伝子は、強毒・弱毒の鑑別マーカーとして有用であり、更に従来のワクチンの改良及び診断剤の開発に極めて重要、且つ有用である。
[II]本発明の変異麻疹ウイルス抗原及び変異麻疹ウイルス遺伝子のワクチンや診断剤としての用途
(1)流行株に対して有効な生ワクチンの作成:生ワクチン株ウイルスと流行株ウイルスとの間で遺伝子を置換した組換え体ウイルスを作成する。生ワクチン株としては、従来技術に記載した種々の株を用いることができるが、少なくとも10年以上の長期にわたり、生ワクチンの有効成分として世界各地で使用され、その安全性と有効性が公認されている株、例えばCAM−70の使用が好ましい。
流行株としては、その遺伝子変異に基づく抗原変異が生ワクチン株ウイルスの抗原性と比較した際に顕著で広い流行株ウイルスから適宜選択して用いる。詳しくは、分離頻度が高く、且つ、流行している地域範囲が広く、抗原変異が特殊ではなく普遍的な最近の流行株、例えば本発明者らが1995〜1996年に分離したMO株又はNA株の採用が好ましい。
置換する遺伝子としては、上記[I](3)に列記した抗原をコードする遺伝子から適宜選択し、単独又はこれ等を組合せて用いることができる。しかし、組換えによる弱毒から強毒への復帰の防止、組換え工程の簡易化等を考慮すると、(c)に記載の第176〜316番のHタンパク断片(即ち、配列番号4のペプチドと配列番号12のペプチド)をコードする遺伝子の採用が好ましい。この領域におけるアミノ酸置換は流行株に固有のものであり、弱毒株には存在しない。従って、この領域を用いることにより、弱毒株に固有の配列(即ち、弱毒化の要因となりうる配列)を変化させることなく、弱毒ウイルスに流行株のエピトープを導入することが可能である。
組換えウイルスの作成には、単鎖(−)センスのRNAウイルス(モノネガウイルス)ゲノムの遺伝子組換えに係るRadeckeらの方法(EMBO Journal,Vol.14,No.23,pp.5773-5784,1995)、又は本発明者らによるその変法に従って行うことができる。
Radeckeらの方法(reverse genetics)を次に示す。初めに、株化細胞293(American Type Culture Collection寄託番号ATCC CRL-1573)にT7 RNAポリメラーゼ及び麻疹ウイルスのNとP両タンパクの各遺伝子をベクターを用いて移入し、これ等の各遺伝子を発現する形質転換体(即ち、helper cell)を作出する。次に、T7プロモーターの支配下で麻疹ウイルスのLタンパク(polymerase)を発現する発現ベクター(以下、“V1”と呼ぶ)を構築する。更に、CAM−70ウイルスの全長ゲノムの(+)センスRNAのcDNAを調製し、該cDNAから前述したアミノ酸置換をコードする領域を制限酵素により切除し、その切断部位に流行株MO又はNAのウイルスゲノムから調製した対応領域(DNA)を挿入連係の後、得られる組換えcDNAをプスミドpBluescript SK 及び KS(英国、Stratagene Ltd.社製)に挿入連係すると共に、該組換えcDNAがT7フアージRNAポリメラーゼにより転写されるよう調製したベクター(以下、“Vo”と呼ぶ)を構築する。VoとV1とを前記のhelper cellに同時感染導入(co-transfection)させた後、該細胞を培養すれば、組換え体ウイルスを得ることができる。感染細胞内での組換え体ウイルスの増殖は、シンシチゥムを生じるCPE(cytopathic effect)の判定や、置換領域がコードするタンパクのエピトープに対するモノクーナル抗体を用いた蛍光抗体法による検鏡にて確認することができる。
上述の方法を用いることにより、CAM−70のHタンパクのアミノ酸番号第176〜316番(配列番号4)をコードする遺伝子が、MO又はNA株のHタンパクのアミノ酸番号第176〜316番(配列番号12)をコードする遺伝子と置換された、CAM−70株の組換え体弱毒麻疹ウイルスが得られる。
更に、Radeckeらの方法の変法について述べる。この変法は、helper cellを要しないよう工夫されているので、培養宿主として任意の感受性細胞を使用することができる。使用する細胞としては、未確認因子や癌原性等の迷入を避けるため、生ワクチン株ウイルスの培養宿主として安全性が確認且つ公認されている細胞、例えば、MRC−5、WI−38の採用が好ましい。先ず、CAM−70のN、P、及びLタンパク各遺伝子の発現ベクターを、プラスミドpcDNA3.1(+)及びpcDNA3.1(-)(カナダ国、Invitrogen社製)を用いて予め作成しておく。例えば、pcDNA3.1(-)にCAM−70のN、P、及びLタンパク各遺伝子をそれぞれ個別にpcDNA3.1(-)の制限酵素サイトに挿入連係し各発現ベクターを構築する。T7 RNA polymeraseを発現させるにはrecombinant MVA(以下“recMVA”と略記する;FEBS Letter,vol.371,no.1,pp.9-12,1995)を用いることができる。そして、この3種の発現ベクターと前述の発現ベクターVoとを、予めrecMVAを感染させたMRC−5又はWI−38細胞にco-transfectionさせた後、約35〜38℃で培養すれば、目的とする組換え弱毒麻疹ウイルスが得られる。かかるウイルスの増殖は、前述と同様にCPE判定やmonoclonal蛍光抗体法等を用いる検鏡により確認することができる。また、得られたウイルスの抗原性あるいは免疫原性の適格性は、前述(1)の抗原解析により確認することができる。
(2)遺伝子免疫用の有効成分の作出:非増殖型アデノウイルスのゲノムに、流行株ウイルスの遺伝子を挿入連係することにより、非増殖型組換えアデノウイルスを作成することができる。このような組換えウイルスは、遺伝子免疫の有効成分として有用である。組換えウイルスの作成には、斉藤らが開発したCOS-TPC法[細胞工学(Cell Technology),vol.13,no.8,pp.757-763,1994]を用いることができる。
この方法では、ヒトアデノウイルス5型ゲノムDNA-TPC(viral DNA-Terminal Protein Complex)と、その非増殖型アデノウイルスゲノムのほぼ全長を有するコスミドカセット(pAdex1;米国特許第5,700,470号)とを使用する。この非増殖型ウイルスは、ヒトアデノウイルス5型に由来し、その増殖に必須の遺伝子E1AとE1Bとを欠損しているため、これ等の遺伝子を恒常的に産生する293細胞以外では増殖できない。更にこのウイルスは、CTL(Cytotoxic T Lymphocyte)によるウイルス抗原の認識を拮抗抑制するE3タンパクをコードする遺伝子をも欠損されていて、CTLによる細胞性免疫の成立が期待できるように工夫されている。
用いる麻疹ウイルス遺伝子としては、上記[I](3)に列記した抗原をコードする遺伝子から適宜選択し、単独又はこれ等を組合せて用いることができる。しかし、感染(ウイルスの細胞への吸着と侵入)防御に係る免疫原性を高める上では、(a)に記載の全長Hタンパク(配列番号2又は10)と(g)に記載の全長Fタンパク(配列番号18又は20)をそれぞれコードする遺伝子を組合わせて使用することが好ましい。
具体的には、上記Hタンパク遺伝子とFタンパク遺伝子cDNA(例えば、配列番号9と配列番号19の塩基配列)を調製し(5'から3'方向に連係する際の組合せはHF又はFH)、これをコスミドカセットpAdex1のE1A・E1B欠損サイトに挿入連係し、pAdex1/HF又はpAdex1/FHとする。一方、アデノ親株ウイルスからDNA-TPCを抽出した後、これを制限酵素Eco T22I(日本国、Takara Shuzo Co.,Ltd.,社製)で消化して切断産物DNA-TPC/EcoT22Iを得る。次に、
pAdex1/HF又はpAdex1/FHと、DNA-TPC/EcoT22Iとをリン酸カルシウム法によリ293細胞にco-transfectionさせると、相同組換えが生じ、麻疹ウイルスHタンパク遺伝子及びFタンパク遺伝子を有する非増殖型組換えアデノウイルスが得られる。このウイルスが麻疹ウイルスのH及びF両タンパク遺伝子を保有することは、例えば、このウイルスを感染させたHela細胞について、かかるタンパクに対するmonoclonal抗体を用いる蛍光抗体法により確認することができる。
(3)麻疹ワクチンの製造:前述[II](1)の組換え弱毒麻疹ウイルスをシードウイルスとして用い、弱毒生麻疹ワクチンを製造することができる。例えば、該組換えウィルスを、感受性細胞、例えばニワトリ胚細胞で培養してウイルス浮遊液を得た後、これを低速遠心にかけ、更に、濾過することにより細胞を除去し、ワクチン原液を調製する。かかるワクチン原液を、適当な培地、例えば、BME培地(Eagle's Basal Medium)で希釈し、ワクチン中のウイルス含量が抗体産生に必要な量、例えば、5,000TCID50/0.5ml(Median Tissue Culture Infective Dose)以上になるように調整する。その際、ウイルス安定化剤を添加混合することもできる。次に、適当な容積、例えば、約1〜20ml容のバイアルに調製したワクチン溶液を分注し、密栓・密封の後、ワクチンとして使用に供する。かかるワクチンは、液状のみならず、分注後に凍結乾燥を行い、乾燥製剤として使用に供することができる。尚、製造したワクチン製剤は、その品質を保証するために、使用前に安全性と有効性に関する種々の検定を行う必要がある。かかる検定は、薬事法(昭和35年法律第145号)及び平成5年・厚生省告示第217号「生物学的製剤基準」に定める「乾燥弱毒生麻疹ワクチン」の規程に準拠して行う。ワクチンは、例えば、1ドーズ約0.25〜0.5m1を皮下接種して用いる。
前記[II](2)の非増殖型組換えウイルスは、293細胞で量産することができる。293細胞の培養液から、上記のワクチン製剤と同様にして、最終ウイルス含量が293細胞において106〜108PFU/ml(Plaque-Forming Unit)になるよう調整した液状あるいは乾燥製剤を調製し、遺伝子ワクチンの有効成分として提供することができる。該製剤は、1ドーズ約0.25〜0.5mlを皮下、筋肉内又は経鼻接種して用いることができるが、接種の簡易化を考慮すると、特に経鼻接種が好ましい。
(4)診断剤の調製:診断用抗原としては、上述[I](3)に列記した抗原(全長タンパク又はその断片ペプチド)を、単独又は組合せて用いることができる。組合せとしては、抗原スペクトルを広げる意味で、異なるエピトープを包含する抗原を組合せる方が好ましい。本発明の診断用抗原は、例えば、沈降反応、凝集反応、中和反応、蛍光抗体法、酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ等の抗原として提供できる。また、これ等を動物、例えば、ウサギ、モルモット、マウス等の腹腔内、皮下や筋肉内に接種することにより、免疫血清や抗体等を作成することもできる。この抗体は、例えば、各種診断法において、抗原検出用抗体として提供することができる。
尚、この発明に係る診断用の抗原や抗体は、診断剤中の含量が、抗原抗体反応を生じるに必要な量となるよう希釈調整して使用する。
更に、上述[I](3)に列記した抗原をコードする遺伝子を単独又は組合せて、例えば、遺伝子診断におけるプローブ試薬や同定試薬として使用することもできる。本願に開示した弱毒株や流行株ウイルスのHタンパクやFタンパクの配列(例えば、配列番号2、10、18及び20)、又はそれらをコードする遺伝子の配列(例えば、配列番号1、9、17及び19)を基にPCRプライマーを設計することができる。得られたPCRプライマーはPCRを用いた診断用の試薬として提供することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
実施例1
抗原解析と遺伝子解析を次の通り行い、過去の流行株(強毒株)、従来の生ワクチン株(弱毒株)及び最近の流行株(強毒株)の三者間における塩基配列とアミノ酸配列の相違をそれぞれ判定する。また、変異抗原のアミノ酸配列を特定すると共に、そのエピトープを決定する。
(1)抗原解析
中和抗体価の測定(1):マイクロプレートを用いるUedaの変法により測定する。攻撃ウイルスにはワクチン株CAM−70と流行株Momoを、また、ウイルスの培養にはB95a細胞を用いる。検体には1994〜1996年の間に麻疹CAM−70ワクチンの接種を受けた小児から得たワクチン接種前及び接種1〜2か月後の血清のうち、豊島株(1959年分離)のHI抗原で測定したHI抗体価が8倍の血清11検体(A群)と64倍の血清14検体(B群)とを用い、1検体につき2列のウェルを用いる。
ウェル内に培地を分注し、その培地を用いて血清を20μlずつ2倍に段階希釈する。これに20μlの攻撃ウイルス(ウイルス感染価を10 TCID50/20μlに調整済)を添加混合し、37℃で1時間反応させる。次に、各ウェルにB95a細胞を100μlずつ分注の後、1週間培養する。中和抗体価の測定は、CPEの有無を判定することにより行う。その結果を以下に記載する:
A群:合計11検体のうち、9例(9/11;81.8%)の相対抗体価(流行株/ワクチン株)は1/2以下であり、特に、これ等9例のうち6例(6/11;54.5%)では、ワクチン株に対する抗体価が2.6〜3.6(数値はlog2)であるにも拘らず、流行株に対する抗体価は0(数値はlog2)未満であり検出されない。尚、残り2例の相対抗体価は1である。
B群:合計14検体中、10例(10/14;71.4%)の相対抗体価(流行株/ワクチン株)は1/2〜1/8と低く、残り4例のそれは約1である。以上の結果、相対抗体価(流行株/ワクチン株)が1/2以下の例が高頻度に検出されるため、最近の流行株麻疹ウイルスの中和ないしは感染に関与する抗原(HとFの両タンパク)に変異があると判定する。
中和抗体価の測定(2):NA株Hタンパクのマウス免疫血清に対する中和抗体価を、次の記載以外は、上記(1)と同様にして測定する。攻撃ウイルスには、CAM−70、田辺、及びNAの3株を用いる。マウス免疫血清は次のように作成する。4週齢BALB/Cマウス10匹の各々に、NA株Hタンパク発現ベクターpcDNA3.1(-)/H(naked DNA)を100μlずつ筋肉内接種し、その2週間後に同じ接種を再び行い追加免疫する。比較対照としての5匹のマウスには生理的食塩水を接種する。追加免疫から4週間後に、各マウスから個別に採血し、これ等を免疫マウス血清とする。尚、上記naked DNAは、後述の実施例3に付随し、NA株Hタンパク発現ベクターとして構築したプスミドpcDNA3.1(-)/Hを大腸菌で増幅し、その培養液から精製して調製する。
測定の結果、各攻撃ウイルスによる平均中和抗体価(log2)は、NA株では4.0、CAM−70株では3.8、及び田辺株では4.0である。この結果と前記(1)の結果に基づき、流行株NAの抗原スペクトルは、ワクチン株及び過去の流行株のこれ等に比べて広く、且つ、これ等を包含すると判定する。
(2)遺伝子解析
Hタンパク及びFタンパクの両遺伝子の塩基配列の決定:Isegawaらの方法(Mol.Cell.Prob.,6,467-475,1992)に従って行う。表2及び表3に記載の各麻疹ウイルスを感染させたB95a細胞からChirgwinらのGTC/CsCl法(Biochemistry,18,5294-5299,1979)によりRNAを抽出の後、6merのランダムプライマーを用いてcDNAを作成する。次いで、Edmonston株の遺伝子cDNAの塩基配列(Virology,vol,173,no.2,pp.415-425,1989)を参考にして合成した特異的プライマー(表1)を使用し、PCRを用いる直接シークエンス法により塩基配列を決定すると共に、Universal Codeに基づきアミノ酸配列を判読し、遺伝子変異によるアミノ酸の置換を特定する。その結果を表2、表3、配列番号1,2,9,10,17〜20にそれぞれ示す。
Hタンパク二次構造の決定:上記で得たアミノ酸配列をコンピータ解析することにより、Hタンパクの二次構造を決定した。解析ソフトにはDNASIS-Mac(version 3.6)[日本国、日立ソフトウェアエンジニアリング(株)社製]を用い、疎水性パターンの解析及びChor-Fasman解析を行う。その結果、配列番号2に記載のHタンパク全長アミノ酸配列のアミノ酸番号第1番〜第617番のうち、第176番〜第316番及び第317番〜第616番の領域の二次構造においては、ワクチン株と流行株との間で、エピトープの位置の逆転(flip-flop)している[即ち、ワクチン株(例えばCAM−70)と流行株(例えばMOやNA)の解析像を左右に並べると、両像は互いに鏡像(線対称)の関係になる様に大きく変化している]。一方、Fタンパクには、上記した鏡像(線対称)の関係にある様な変化は見られない。
Hタンパクの変異エピトープの解析:更に、エピトープ解析ソフトEpitope Advisor[日本国、(株)富士通九州システムエンジニアリング(FQS)社製]を用い、上記ワクチン株と流行株の変異(アミノ酸置換)が集中している領域に着目し、そのエピトープ解析を行う。その結果から、配列番号2及び10に記載のアミノ酸番号、第172〜178番、第238〜244番、第277〜282番、及び第301〜307番の4領域が変異したエピトープであると確認される。
実施例2
弱毒生ワクチン株ウイルスゲノムの改造:前述Radeckeらの方法(reverse genetics)により、ワクチン株CAM−70のHタンパクの一部を流行株Momoのそれと置換した組換え体ウイルスCAM−70を作成する。置換領域は、配列番号1に記載の塩基配列の第526番から第948番の塩基(アミノ酸番号第176番〜第316番)からなる領域(423塩基)を含む各ウイルス株ゲノムcDNAの制限酵素HinfI断片とする。得られた組換えウイルスの抗原性の確認は、CAM−70及びMomo両株のモノクローナル抗体を用いる蛍光抗体法と酵素免疫測定法により行う。
実施例3
弱毒生ワクチン株ウィルスゲノムの改造:Radeckeらの方法の変法を用いる以外は実施例2の方法と同様にして、ワクチン株CAM−70のHタンパクの一部を流行株NAの対応する配列と置換した組換え体ウイルスを作成する。
先ず、CAM−70株ウイルスゲノムRNAを抽出の後、RT−PCR(reverse transcript-PCR)によりcDNAを調製し、そのcDNAから、プライマーを用いることにより、CAM−70株ウイルスのN、P及びL各タンパクをコードする遺伝子をクローニングする。(以下、これ等のクローンをそれぞれ、pcDNA3.1(-)/N、pcDNA3.1(-)/P、及びpcDNA3.1(-)/Lと呼ぶ)。これ等は大腸菌で増幅の後、保存し、次の工程に供する。
また、プラスミドpBluescript SK 及び KSを用い、上記と同様の方法によって、CAM−70株ウイルス全長ゲノムRNAのcDNAの中で、Hタンパク遺伝子の一部に対応するNA株の配列と置換した遺伝子cDNAをクローニングする。得られたクローンは、以下、pBluescript/MVと呼び、培養・保存し、次の工程に供する。尚、置換する配列は、配列番号1に記載のCAM−70株Hタンパク遺伝子の塩基配列第526番から第948番(423塩基;アミノ酸番号第176番〜第316番)からなる領域と、配列番号9に記載のNA株の対応領域(526番から第948番の塩基)との間で行う。
上記のpcDNA3.1(-)/N,pcDNA3.1(-)/P,pcDNA3.1(-)/L,及びpBluescript/MVを、前述recMVAを予め感染させたMRC−5にco-transfectionさせ、37℃での培養により、組換え体ウイルスを得る。これより得られた組みえ体ウイルスの抗原性の確認は、CAM−70及びNA両株のモノクローナル抗体を用いる蛍光抗体法と酵素免疫測定法により行う。このウイルスは、抗原性が流行株のそれと同等であり、しかも、弱毒株であるので、弱毒生麻疹ワクチンの有効成分として提供することができる。
実施例4
遺伝子免疫ワクチン用の有効成分の作出:前述の斉藤らの方法により、非増殖型組換えアデノウイルスを作出する。該ウイルスゲノムに挿入連係する遺伝子は、配列番号9と配列番号19にそれぞれ記載のNA株のH及びF各タンパクをコードする遺伝子cDNAを組合わせて連係し用いる。連係は、FとHが融合タンパクとして発現されるよう、5’から3’方向にF−Hの順に行い、このcDNAを制限酵素SwaIで開裂したコスミドカセットpAdex1のE1A・E1B欠損サイトに挿入連係し、pAdex1/FHを得る。
尚、HとF各遺伝子のcDNAは、NA株ゲノムRNAから、各遺伝子に対応するプライマーを用いるRT−PCRにより各々調製する。また、pAdex1/FHは、λファージでパッケージングし、大腸菌で増幅・保存し、次の工程に供する。
次に、親株アデノウイルスDNA−TPCを、その感染細胞からCsCl超遠心法により抽出精製の後、制限酵素Eco T22Iで消化し、切断産物DNA-TPC/Eco T22Iを得る。次に、リン酸カルシウム法により、上記のpAdex1/FHとDNA-TPC/Eco T22Iとを培養した293細胞にco-transfectionさせ、37℃で18時間培養し、相同組換えを起こさせる。これにより、NA株のH及びF両タンパク遺伝子を保有する非増殖型組換えアデノウイルスを作出する。該ウィルスとその増殖は、その感受性宿主である293細胞において、NA株のH及びF各タンパクに対するmonoclonal抗体を用いる蛍光抗体法により選別且つ確認する。
実施例5
診断剤の調製:次のアミノ酸配列、「Leu Glu Ala Arg Ala Thr Asn」、「Asn Leu Ser Ser Lys Gly Ser」、「Glu Gln Ser Val Ser Asn」、及び「His Arg Glu Asp Ser Ile Thr」をそれぞれ、ペプチドシンセサイザー(米国、モデルABI 432A,Perkin-Elmer社製)を用いて合成し、麻疹ウイルス流行株の感染を鑑別し、且つ同定するための抗原として使用する。
産業上の利用可能性
本発明の変異麻疹ウイルス抗原又はこれをコードする変異麻疹ウイルス遺伝子を用いると、流行株麻疹ウイルスに適合した弱毒生麻疹ワクチン又は遺伝子ワクチン、さらに流行株麻疹ウイルスによる感染を的確に検出できる診断剤を、効率的且つ経済的に提供することが可能である。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:1854
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA to genomic RNA encoding H Protein
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:弱毒麻疹ウイルスCAM−70株
配列
配列番号:2
配列の長さ:617
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド(Hタンパク質)
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:弱毒麻疹ウイルスCAM−70株
配列
配列番号:3
配列の長さ:524
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:弱毒麻疹ウイルスCAM−70株
配列
配列番号:4
配列の長さ:141
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:弱毒麻疹ウイルスCAM−70株
配列
配列番号:5
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:弱毒麻疹ウイルスCAM−70株
配列
配列番号:6
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:弱毒麻疹ウイルスCAM−70株
配列
配列番号:7
配列の長さ:6
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:弱毒麻疹ウイルスCAM−70株
配列
配列番号:8
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:弱毒麻疹ウイルスCAM−70株
配列
配列番号:9
配列の長さ:1854
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA to genomic RNA encoding H protein
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:強毒麻疹ウイルスNA株
配列
配列番号:10
配列の長さ:617
配列の型:アミノ酸
トポロジー:一本鎖
配列の種類:ペプチド(Hタンパク質)
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:強毒麻疹ウイルスNA
配列
配列番号:11
配列の長さ:524
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:強毒麻疹ウイルスNA株
配列
配列番号:12
配列の長さ.:141
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:強毒麻疹ウイルスNA株
配列
配列番号:13
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:強毒麻疹ウイルスNA株
配列
配列番号:14
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:強毒麻疹ウイルスNA株
配列
配列番号:15
配列の長さ:6
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:強毒麻疹ウイルスNA株
配列
配列番号:16
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:強毒麻疹ウイルスNA株
配列
配列番号:17
配列の長さ:1653
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA to genomic RNA encoding F Protein
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:弱毒麻疹ウイルスCAM−70株
配列
配列番号:18
配列の長さ:550
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
配列の種類:ペプチド(Fタンパク質)
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:弱毒麻疹ウイルスCAM−70株
配列
配列番号:19
配列の長さ:1653
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA to genomic RNA encoding F Protein
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:強毒麻疹ウイルスNA株
配列
配列番号:20
配列の長さ:550
配列の型:アミノ酸
トポロジー:一本鎖
配列の種類:ペプチド(Fタンパク)
起源
生物名:麻疹ウイルス(measles virus)
株名:強毒麻疹ウイルスNA株
配列
Claims (4)
- 下記のアミノ酸配列(a)〜(c)よりなる群から選ばれる少なくとも1種の変異麻疹ウイルスHタンパク抗原からなる変異麻疹ウイルス抗原。
(a)配列番号10に記載のアミノ酸配列;
(b)配列番号3又は配列番号11に記載のアミノ酸配列;及び
(c)配列番号4又は配列番号12に記載のアミノ酸配列。 - 変異麻疹ウイルスHタンパク抗原をコードする下記の塩基配列(a)〜(c)よりなる群から選ばれる少なくとも1種の塩基配列からなる変異麻疹ウイルス遺伝子。
(a)配列番号10に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列;
(b)配列番号3又は配列番号11に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列;及び
(c)配列番号4又は配列番号12に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列。 - 配列番号2の176番〜316番アミノ酸を配列番号12のアミノ酸配列で置換することによって得られる、組み換え変異麻疹ウイルス抗原。
- 配列番号2の176番〜316番アミノ酸をコードする塩基配列を、配列番号12のアミノ酸配列をコードする塩基配列で置換することによって得られる、組み換え変異麻疹ウイルス遺伝子。
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