JPH11514864A - ヘルペスウイルスのｒｆｈｖ／ｋｓｈｖ亜科の糖タンパク質ｂ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ガンマヘルペスウイルスのRFHV/KSHV亜科（そのうちの３つのメンバーが詳細に特性づけられる）からの糖タンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチドに関する。腹膜後繊維腫症（ＲＦ）に罹患したサル Macaque nemestrinaおよびMacaque mulatta、ならびにカポジ肉腫（ＫＳ）に罹患したヒトエイズ患者からＤＮＡ抽出物を得た。この抽出物を、ガンマヘルペスウイルスの既知のタンパク質およびＤＮＡ配列から設計された共通の縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いて増幅した。319塩基対の断片のヌクレオチド配列は、RFHV1とKSHV間で約76％の同一性を有し、RFHV/KSHV亜科以外の最も密接に関連したガンマヘルペスウイルスとは約60〜63％の同一性を有する。これらの断片内にコードされるタンパク質配列は、RFHV1とKSHV間で約91％の同一性を有し、その他のガンマヘルペスウイルスの配列とは＜約65％の同一性を有する。全長KSHV糖タンパク質Ｂ配列は、Ｎ末端の近傍に膜貫通ドメインを、そして細胞外ドメインに複数の潜在的抗原部位を含む。RFHV1、RFHV2およびKSHVを含むがこれらに限らないRFHV/KSHV亜科のメンバーの糖タンパク質Ｂコード領域を特性づけるための材料および方法を提供する。本発明のペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体は感染症を診断するために、また、糖タンパク質Ｂに対する免疫応答を引き出すために使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘルペスウイルスのＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科の糖タンパク質Ｂ 技術分野 本発明は、一般に、ウイルス学の分野、特にヘルペス科ウイルスに関する。特 に、本発明は、ヒトを含む霊長類における繊維増殖性および新生物形成性状態に 関連するヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂ分子の同定および特性づけに関する。背景技術 カポジ肉腫は、外観を損ない致命的となりうる出血性肉腫の一形態であり、皮 膚上に暗色の斑点または小結節として現れる多発性血管系腫瘍を特徴とする。組 織学的レベルでは、それは、束および血管細隙を形成する比較的均一な紡錘状細 胞の増殖を特徴とする。炎症性浸潤では、形質細胞、Ｔ細胞および単球の存在が 認められることが多い。最終的に、胃腸病変からの又は関連リンパ腫からの出血 により死に至ることがある(概論は、Ｍartinら、Ｆinesmithらを参照されたし) 。 この疾患は、かつてはそれほど注目されなかったが、エイズとの関連性から、 にわかに一般に注目されるようになった。あるエイズ罹患集団の20％もが、その 疾患の経過の間にカポジ肉腫になる。カポジ肉腫は、免疫不全に関連した他の状 態（例えば、腎臓透析、および治療上での免疫抑制）においても生じる。しかし ながら、この疾患の疫学は、免疫不全が唯一の原因因子ではないことを示唆して いる。特に、カポジ肉腫が、ある性慣習と高い関連性を有することから、ヒト免 疫不全ウイルス以外の病原体の関与が示唆されている(Ｂerelら)。 エイズ患者から得られたカポジ病変部位からの組織サンプルにおいて、ヘルペ スウイルス様ＤＮＡ配列が同定されている(Ｃhangら、Ａmbroziukらにより確認 されている)。この配列は、罹患している組織と罹患していない組織からのＤＮ Ａを、無関係なプライミングオリゴヌクレオチドを用いて増幅し、次いで互いに ハイブリダイズさせてそれらの細胞の間の相違を引き出すレプレゼンテイショナ ル・ディファレンス分析（representational difference analysis）(Ｌisitsyn ら) により得られた。この配列の一部は、エプスタインバーウイルスおよびリスザル ヘルペスウイルスの公知配列と同一であった。それは、カプシドおよび外被タン パク質というウイルス内部に引っ込んだ２つの構成成分をコードしていた。種々 の起源からの組織を調べると、患者のＨＩＶの状態にかかわらず、カポジ肉腫病 変の95％でその配列が見出された(Ｍooreら1995a)。同じ患者の無関係な組織の2 1％が陽性であり、一方、対照集団からのサンプルの５％が陽性であった。サン プル間で約0.5％の配列変異があった。 また、体腔リンパ腫(body cavity lymphoma)（エイズ患者に特有に生じるＢ細 胞を特徴とするリンパ腫滲出）において、この配列が検出された(Ｃesarmanら) 。体腔リンパ種におけるコピー数はカポジ肉腫に比べて高かった。他のエイズ関 連リンパ腫は陰性であった。この配列はＣastleman病に罹患している患者の末梢 血単核細胞においても発見されている(Ｄupinら)。これは脈管濾胞性増殖症の形 態学的な特徴とそれに関連した熱、腺症、脾腫を伴う状態である。この配列が由 来すると想定されるウイルスはカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）と して知られている。 ＰＣＲ in situ ハイブリダーゼーションを使用して、Ｂoshoffらはカポジ肉 腫における腫瘍細胞を提示すると考えられる細胞型においてＫＳＨＶポリヌクレ オチド配列を検出した。カポジ肉腫の病因においてＫＳＨＶが重要な役割を担っ ているという血清学的な証拠がある(Ｏ'Ｌeary)。Ｋedesらは、潜在的にＫＳＨ Ｖに感染したＢ細胞において、潜伏性に関連する核抗原に対する抗体を検出する 免疫蛍光血清学的アッセイを開発し、カポジ肉腫患者ではＫＳＨＶの血清反応陽 性が高いことを見出した。Ｇaoらは、免疫ブロットアッセイにより40人のカポジ 肉腫患者のうち32人がＫＳＨＶ抗原に対する抗体について陽性を示したが、これ に対しエイズ発症直後でカポジ肉腫の無い同性愛男性40人中ではわずか７人であ ることを発見した。ＭillerらはＫＳＨＶとエプスタインバーウイルスの両方の ゲノムを含有する体腔リンパ腫細胞系からのＫＳＨＶ抗原を調製した。ある抗原 に対する抗体(p40と称される)はカポジ肉腫を有する48人のＨＩＶ−１感染患者 のうち32人で同定されたが、これに対しカポジ肉腫のないＨＩＶ−１感染患者54 人ではそのうちで同定されたのはわずか７人だった。 Ｚhongらは罹患組織におけるＫＳＨＶ配列の発現をメッセンジャーＲＮＡレベ ルで分析した。２つの小さな転写産物がＫＳＨＶゲノムから転写されたウイルス 特異的ＲＮＡの大部分を占めることがわかった。一方の転写産物は小さな膜タン パク質をコードしていると予想され、他方の転写産物は核中に蓄積する独特なポ リＡＲＮＡであり、タンパク質コード配列を有していないと考えられる。メッセ ンジャーＲＮＡを、ゲノムＤＮＡのラムダライブラリー由来の約120kb ＫＳＨＶ ゲノムに架橋する複数の重複ＫＳＨＶゲノム断片をクローニングして解析した。 このクローンをノーザン分析のプローブとして使用したが、これらの配列は得ら れず、したがって開示されなかった。 Ｍooreらは体腔リンパ種由来のＫＳＨＶゲノム断片を部分的に特性づけた。該 ゲノムの20.7kb領域は配列決定されたと報告されているが、その配列は開示され ていなかった。17の部分的なまたは完全なオープンリーディングフレームがこの 断片中に存在していたが、１つ以外の全てが他の既知のガンマヘルペスウイルス 遺伝子(キャプシド成熟遺伝子およびチミジンキナーゼ遺伝子を含む)に配列相同 性または位置相同性を有していた。系統発生分析により、ＫＳＨＶはエプスタイ ンバーウイルスよりもウマ・ヘルペスウイルス２型およびリスザルウイルスと密 接に関連していることが示された。この20.7kb領域は糖タンパク質ＢとＤＮＡポ リメラーゼのどちらもコードしていなかった。 ヘルペスウイルス科は、全体として、約100nmのサイズで脊椎動物に感染しう る多数の多エンベロープウイルスを含む(一般的な概説としては、例えばＥmery ら、Ｆieldsらを参照されたし)。二本鎖ＤＮＡゲノムは異常に大きく、約88〜約 229キロベース長である。それは、該ウイルスの生活環の種々の段階で50以上の 異なる転写産物を産生する。多くの糖タンパク質がウイルスの表面で発現され、 ウイルスが抗体による標識細胞の認識および該ウイルスの細胞内への侵入におけ る役割を担う。これらの表面タンパク質は内部ウイルス成分と比較して種間での 違いが多い(Ｋarlinら)。ウイルスを取り込んでいる細胞で産生される不完全な ウイルス粒子上にも同様の表面タンパク質が存在する。こうした非伝染性形態の 一つはＬ粒子であり、これは外被およびエンベロープを含むが、ヌクレオカプシ ドは含まない。 ヘルペスウイルス科は、いくつかの亜科に分類されている。それらの各カテゴ リーへの分類は、もともとは生物学的特徴に基づくものであったが、ゲノム配列 データの出現につれて改良されつつある。アルファ亜科は、広い宿主域、短い複 製サイクルおよび知覚神経節に対する親和性を有するウイルスを含む。それらは 、ヒト単純ヘルペスウイルスおよび水痘・帯状疱疹ウイルスを含む。ベータ亜科 は、限局された宿主域を有するウイルスを含み、サイトメガロウイルスおよびヒ トヘルペスウイルス６型を含む。ガンマ亜科は、一般にリンパ栄養性のウイルス を含む。そのＤＮＡは、高いＧＣ含量の複数の縦列反復配列に隣接した低いＧＣ 含量を有する約110キロベースのセグメントを特徴とする。ガンマ亜科は、エプ スタインバーウイルス(ＥＢＶ)、リスザルヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイ ルス２型および５型およびウシヘルペスウイルス４型を含む。 ヘルペスウイルスは、複雑な臨床経過を有する状態に関連している。多くのヘ ルペスウイルスの特徴は、宿主内で長期間潜伏状態に入る能力を有することであ る。アルファ亜科ウイルスは、知覚および自律神経節中で潜伏形態を維持し、一 方、ガンマ亜科ウイルスは、例えばリンパ球系統細胞中で潜伏形態を維持する。 潜伏は、あるウイルス遺伝子の転写と関連しており、そのウイルスが活性な複製 を再開するのに最適な状態になるまで、潜伏が何十年も続くことがある。そのよ うな状態は、免疫不全を含むことがある。さらに、いくつかのガンマ亜科のヘル ペスウイルスは、それらが感染する細胞を遺伝的に形質転換させる能力を有する 。例えば、ＥＢＶは、Ｂ細胞リンパ腫、口内毛髪状白斑、リンパ様間隙肺炎およ び鼻咽頭癌に関連している。 繊維増殖および前新生物形成細胞の生成に関与する他の多数の状態が、ヒトお よび他の脊椎動物で見出される。ヒトで見出される具体例としては、腹膜後繊維 症、結節繊維腫症、偽肉腫繊維腫症および硬化性腸間膜炎が挙げられる。地方病 性腹膜後繊維腫症（ＲＦ）として公知のもう１つの状態が、Ｕniversity of Ｗa shington Ｒegional Ｐrimate Ｒeserch Ｃenterのマカクザルのコロニーで認め られている(Ｇiddensら)。その疾患の後期は、横隔膜を経由して鼡径管内におよ び腹壁内に伸長している腸間膜および腹膜腔の背面部の周囲の増殖性繊維組織を 特徴とする。臨床的に明らかとなれば、該疾患は１〜２ヵ月以内に常に死をもた らす。 その状態は、Ｄ型サルレトロウイルスＳＲＶ-２によるサル免疫不全（ＳＡＩＤ Ｓ）に関連している(Ｔsaiら)。しかしながら、他のコロニーは、ＳＡＩＤＳに 罹患したサルの間で同じ頻度のＲＦを示さず、ＷashingtonでのＲＦの頻度は近 年減少してきている。 ヒト以外の霊長類におけるそのような状態の研究は、ヒトの状態のモデルとし て重要であるだけでなく、１つの霊長類種が、別の種に罹患するウイルスの保有 体として機能しうることからも重要である。例えば、リスザルヘルペスウイルス は、その天然の宿主であるリスザル（サイミリ・シウレウス(Ｓaimiri sciureus )）においては疾患を引き起こすことがないようであるが、他の霊長類、特にヨ ザルにおいては、ポリクローナルＴ細胞リンパ腫および急性白血病を引き起こす 。 ヘルペスウイルス感染の検出および治療に用いる試薬および方法を開発するこ とが必要とされている。ＫＳＨＶとカポジ肉腫における病因の関連が血清学的な 証拠により確認され、この需要の重要性を示唆している。 例えば、カポジ肉腫および同様の症状の診断および評価に使用できる試薬およ び方法を開発することが必要とされている。新たな患者で病原体を検出できれば 、鑑別診断において助けとなるかもしれない。進行中の症状において該病原体の レベルを評価できれば臨床的管理において助けとなるかもしれない。望ましいマ ーカーには、活性型および潜伏型の双方のウイルス感染の存在に対する非常に感 受性の高い指標となるもの、すなわちＢ型肝炎のＨＢsＡg類似体が含まれる。望 ましいマーカーにはまた免疫原性を有し、抗体応答において現れるウイルス体に 対する免疫学的暴露を評価するために使用し得るものが含まれる。ウイルスのエ ンベロープ由来の糖タンパク質抗原はとりわけこれらの特性を有するマーカーと して適当である。これらの抗原はウイルスの複製体としてだけでなく、ウイルス に感染した細胞により産生されるＬ粒子の表面上付近にも高存在量で発現され得 る。 第２に、予防のためのウイルス感染治療および後続してウイルスチャレンジを 行なうウイルス感染治療の双方に使用できる試薬および方法が必要とされている 。そうした試薬にはウイルスに対する免疫レベルを与えるワクチンが含まれる。 抗ウイルス抗体を含むような受動型ワクチンは、ウイルスに暴露したばかりの個 体における即時防御を提供するかまたはウイルスの細胞侵入および複製を阻止す るために使用できる。免疫原性ウイルス成分を含むような能動ワクチンは個体に おける活性で進行中の免疫応答を引き出すために使用できる。能動ワクチンによ り誘導された抗体は、その後の生存ウイルスによるチャレンジから個体を防御す るのに役立つことがある。能動ワクチンによって誘導された細胞障害性Ｔ細胞は 、ウイルスの複製が起こっている宿主細胞を排除することによって同時感染を根 絶するのを助けることができる。防御的な免疫応答、とりわけ抗体に対する好適 な標的は、ウイルス粒子表面に露出したタンパク質抗原および標的細胞とウイル スとの融合に関与するタンパク質抗原である。 第３に、カポジ肉腫および同様の状態に対する新規医薬品の開発に使用できる 試薬および方法を開発することが必要とされている。カポジ肉腫の現在の治療法 は、従来の化学療法（例えばビンクリスチン）と組み合わせた放射線療法である (Ｎorthfelt,Ｍitsuyasu)。病変はこれらの治療法に応答するものの、その応答 は一時的なものであり、一般には、再び臨床経過が悪化し始める。サイトカイン による治療などの実験的な療法でさえ、疾患の原因でなく症状に向けられたもの である。病原体をベースとした薬物スクリーニングおよび合理的な薬剤設計を、 長い間必要とされてきた、長期的効力を有する臨床治療計画に向けさせることが できる。こうした薬剤に適した標的は、宿主細胞の認識および侵入に関連するウ イルス成分である。これらにはウイルスのエンベロープの糖タンパク質成分が含 まれる。 第４に、他の繊維増殖性状態と関連したウイルス因子を同定するのに使用でき る試薬および方法を開発することが必要とされている。Ｃhangらによるレプレゼ ンテイショナル・ディファレンス分析技術は複雑で困難であり、おそらく、一般 的なスクリーニング試験には適さないであろう。より望ましいのは、関連病原体 を含有している疑いのある種々の組織サンプルを調べるためのより一般的なアッ セイにおいて試薬として使用されるオリゴヌクレオチドプローブ、ペプチドおよ び抗体のセットである。その試薬は、目的としないウイルスまたは宿主の内因性 成分の同定を回避するのに十分な程度に特異的でなければならず、関連するが従 来では記載されていなかったウイルス病原体を同定するのに十分な程度に交差反 応性であってもよい。発明の開示 本発明の目的は、ヘルペスウイルスのRFHV／KSHV亜科の糖タンパク質Ｂをコー ドする新規な遺伝子産物由来のまたはこれに反応性の単離されたポリヌクレオチ ド、ポリペプチド、及び抗体を提供することにある。科の２つのメンバーは、後 腹膜繊維腫症関連ヘルペスウイルス(RFHV)とカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(K SHV)である。これらの材料及び関連する方法は、ヒトを含む霊長類におけるヘル ペスウイルス感染の診断及び治療に使用することができる。それらをコードする 単離された糖タンパク質Ｂ断片もしくは組み換え糖タンパク質Ｂ断片又はポリヌ クレオチドは、能動ヘルペスワクチンの成分として使用してもよいが、糖タンパ ク質Ｂに特異的な抗体を受動ワクチンの成分として使用してもよい。 したがって、本発明のある実施態様は、RFHV／KSHV亜科のヘルペスウイルスの 糖タンパク質Ｂをコードする領域を有する単離されたポリヌクレオチドであり、 このポリヌクレオチドは配列番号１または配列番号３のヌクレオチド36〜354に 対して少なくとも65％同一な319ヌクレオチドの配列を含み、各々RFHV及びKSHV からの糖タンパク質Ｂをコードする319ヌクレオチド断片である。実施態様はま た、糖タンパク質Ｂをコードする領域を有する単離されたポリヌクレオチドであ る。このポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドSHMDA（配列番号41）に少な くとも74％同一な35ヌクレオチドの配列、オリゴヌクレオチドCFSSB（配列番号4 3）に少なくとも73％同一な30ヌクレオチドの配列、オリゴヌクレオチドENTFA（ 配列番号45）に少なくとも72％同一な29ヌクレオチドの配列、及びオリゴヌクレ オチドDNIQB（配列番号46）に少なくとも80％同一な35ヌクレオチドの配列から なる群から選ばれる配列を含むものである。 本発明の他の実施態様は、前述の実施態様のポリヌクレオチド糖のタンパク質 コード領域の少なくとも21ヌクレオチド、好ましくは35ヌクレオチド、より好ま しくは50ヌクレオチド、さらに好ましくは75ヌクレオチド、そして一層好ましく は100個の連続したヌクレオチドの断片を含む単離ポリヌクレオチドである。ポ リヌクレオチドは、好ましくは、霊長類に感染できるウイルスに由来するもので ある。RFHV及びKSHV由来の糖タンパク質Ｂコードポリヌクレオチド断片が含まれ る。本発明の別の実施態様は、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号 92のヌクレオチド36〜354、又は配列番号96のどこかには含まれるが、配列番号9 8には含まれない糖タンパク質Ｂコード配列に同一な少なくとも約21ヌクレオチ ドの直鎖状配列を含む単離ポリヌクレオチドである。 本発明のさらに別の実施態様は、前述の実施態様にいずれかによってコードさ れる単離ポリペプチドである。この実施態様はまた、配列番号２、配列番号４、 もしくは配列番号97、又は配列番号94のどこかには示されているが(KSHV)、配列 番号99には示されていない糖タンパク質Ｂのタンパク質の配列と本質的に同一な 少なくとも17個の直鎖状アミノ酸を含む、単離ポリヌクレオチドである。これは 、融合ポリペプチド、免疫原ポリペプチド、及びグリコシル化又は非グリコシル 化型で存在するペプチドを含む。いくつかの好適な抗原を、配列番号67〜76に列 挙する。この実施態様はまた、上述のポリペプチドのいずれかをコードする単離 ポリペプチド及び天然には存在しないポリペプチドであり、それに加えてクロー ニングベクター、発現ベクターおよびそれらに由来するトランスフェクト宿主細 胞である。さらに別の実施態様は、適当な宿主細胞中で本発明のベクターを複製 する工程とポリヌクレオチドを発現する工程とを含む、本発明のポリヌクレオチ ド又はポリペプチドの産生方法である。 本発明のさらに別の実施態様は、本発明において実施態様とされた糖タンパク 質Ｂポリペプチド、又はポリヌクレオチドのコード領域中でコードされた糖タン パク質Ｂに特異的なモノクローナル抗体又は単離ポリクローナル抗体である。こ の抗体は、RFHV／KSHV亜科のメンバーに特異的であり、より関連がうすい糖タン パク質Ｂの配列、特に配列番号30〜41とは交差反応しない。他の糖タンパク質Ｂ 抗体は、請求項９のポリペプチドに対する特異的モノクローナル抗体又は単離ポ リクローナル抗体であるが、配列番号30〜41のいずれかのアミノ酸配列を有する ポリペプチドではない。 本発明のさらにまた別の実施態様では、製剤学的に適合性の賦形剤中に本発明 のポリペプチドを含むワクチンであり、また任意にアジュバントを含んでもよい 。本発明の別の実施態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むワクチンであり、 生ウイルス又はウイルス発現ベクターの形であってもよい。本発明の別の実施態 様は、製剤学的に適合性の賦形剤中に本発明の抗体を含むワクチンである。その 他 の実施態様は、前述の実施態様を投与する工程を含む、予防的又は感染が進行中 のヘルペスウイルス感染の治療方法である。 本発明のさらなる実施態様は、ガンマヘルペスウイルスの亜科の糖タンパク質 Ｂコード配列に特異的なオリゴヌクレオチドである。この亜科は、RFHV／KSHV亜 科であり、RFHV、及びKSHV、特に配列番号24〜63に列挙したこれらのものである 。また、実施態様は、糖タンパク質Ｂをコードしているポリヌクレオチドの増幅 コピーを得るための方法であり、１以上の上述のオリゴヌクレオチドとポリヌク レオチドとを接触させる工程を含む。増幅すべきポリヌクレオチドは、繊維芽細 胞の増殖とコラーゲンの沈着とを特徴とする疾患に罹患している個人から得ても よい。このような疾患には後腹膜繊維腫症もしくはカポジ肉腫、又はリンパ系系 統の悪性腫瘍などが含まれるがこれらに限定されるものではない。 本発明のさらにまた別の実施態様は、サンプル中のウイルスDNA又はRNAの検出 方法である。１つの方法は、サンプル中のDNA又はRNAと本発明のポリヌクレオチ ド又はオリゴヌクレオチドを含むプローブとを、このプローブが配列番号１又は ３で表される配列を有するポリヌクレオチドと安定な二重鎖を形成できるが、RF HV／KSHV亜科以外のヘルペスウイルス（特に、配列番号５〜13）の配列を有する ポリヌクレオチドとはこうしたらせんを形成しない条件下で接触させる工程と； それによって形成されたすべての二重鎖の存在を検出する工程とを含む。ここで 述べる条件は、インキュベーション時間、温度、溶質濃度等の１セットの反応パ ラメーター、及び洗浄工程である。これらのパラメーターは、配列番号５〜13の いずれかのポリヌクレオチドではなく、配列番号１又は配列番号３のポリヌクレ オチドと接触したときに安定な二重鎖を形成することを可能にする。別の方法は 、サンプル中のDNA又はRNAを本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用 いて増幅反応で増幅する工程と、増幅されたコピーを検出する工程とを含む。あ る実施態様では、天然に存在するウイルスのゲノム中または患部組織中に存在す るときに、上述の方法によってポリヌクレオチドを単離する。 本発明のさらに別の実施態様は、感染が疑われる個人から得られた生物学的サ ンプル中でヘルペスウイルス感染に関連する成分を検出するための検査用キット である。このキットは、適当な包装中に、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌ クレオチド、ポリペプチドまたは抗体を含む。実施態様はまた、個人から得られ た生体サンプルに、試薬、方法、又は本発明のキットを適用する工程を含む、個 人の感染の検出方法である。 本発明のさらに別の実施態様は、ガンマヘルペスウイルスによる感染について の治療で使用するための治療用化合物及び組成物である。ここには、遺伝子治療 の目的のための本発明のポリヌクレオチド及びベクターを含む治療剤が含まれる 。また、本発明で実現されたポリペプチドを化合物と接触させ、ポリペプチドの 生化学的な機能が変化するかどうかを定量することによって同定される、医薬化 合物も含まれる。また、糖タンパク質Ｂ分子の構造と生化学的特徴とに基づく、 合理的なドラッグデザインから得られる医薬化合物も含まれる。図面の簡単な説明 図１は、RFHV及びKSHVの糖タンパク質Ｂコード領域から増幅されたポリヌクレ オチド配列を列挙したものである。36番塩基〜354番塩基までの319塩基のポリヌ クレオチドセグメントに下線を付し、これを増幅するために使用したプライマー の間の各ウイルス遺伝子セグメントを表す。ポリヌクレオチド配列でアラインし たオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブ又はPCR用プライマ ーとして使用することができる。１型オリゴヌクレオチドはガンマヘルペスウイ ルスのコンセンサス配列を含み、これを使用してガンマヘルペスウイルスの糖タ ンパク質Ｂ遺伝子セグメントを増幅することができる。例示したものは、NIVPA 及びTVNCBである。２型オリゴヌクレオチドはRFHV/KSHV亜科由来のコンセンサス 配列を含み、これを使用して該亜科に属するウイルスの糖タンパク質Ｂ遺伝子セ グメントを増幅することができる。例示したものは、SHMDA、CFSSB、ENTFA及びD NIQBである。示した他のオリゴヌクレオチドは３型オリゴヌクレオチドである。 これらは、RFHV又はKSHVの配列から直接に得られ、かつ各々のウイルスからの配 列に特異的な配列を含む。コード配列の方向で増幅を開始するオリゴヌクレオチ ド（「A」で終わるとされているもの）は、5'→3'方向に記載されている。コード 配列とは逆の方向で増幅を開始するオリゴヌクレオチド（「B」で終わるとされて いるもの）は、３'→５'方向に記載されている。また、RFHVポリヌクレ オチド配列とKSHVポリヌクレオチド配列でコードされたポリペプチドも示されて いる。いずれの配列においても238〜240番のヌクレオチドでコードされるアスパ ラギンは、他のヘルペスウイルスで保存されている潜在的なＮ-結合グリコシレ ーション部位である。 図２は、KSHVゲノム、及びRFHV／KSHV亜科の他のメンバーに含まれると思われ る糖タンパク質ＢコードDNA配列の地図である。本明細書中に記載されたKSHV糖 タンパク質配列のおおよその位置を示す。また、ガンマヘルペスウイルスからの 糖タンパク質Ｂ配列を釣り上げる工程と増幅する工程とにおいて有用な１型コン センサス／縮重オリゴヌクレオチドにとってのハイブリダイゼーション部位を表 す推定保存セグメントを示す。 図３には、完全なKSHV糖タンパク質Ｂタンパク質配列とRFHV1の断片及びRFHV2 の断片でアライメントをとった、すでに公知のヘルペスウイルスの糖タンパク質 Ｂのタンパク質配列を記載した。四角で囲んだ領域は、推定のプレプロセシング シグナル配列及び膜貫通ドメインを示した。システイン残基に下線を付した。ヘ ルペスウイルスの糖タンパク質Ｂ配列の間で非常によく保存されている残基は、 下側に星印(＊)をつけた。KSHV糖タンパク質Ｂ中で独特に現れているシステイン には、黒丸(・)を下側につけた。 図４には、ガンマヘルペスウイルスのすでに公知の糖タンパク質Ｂのポリヌク レオチド配列を、それらから設計された１型オリゴヌクレオチドFRFDAとともに 、保存領域を示しつつ列挙した。 図５には、ガンマヘルペスウイルスのすでに公知の糖タンパク質Ｂのポリヌク レオチド配列を、それらから設計された１型オリゴヌクレオチドNIVPA及びNIVPA SQとともに、保存領域を示しつつ列挙した。 図６には、ガンマヘルペスウイルスのすでに公知の糖タンパク質Ｂのポリヌク レオチド配列を、それらから設計された１型オリゴヌクレオチドTVNCA、TVNCB及 びTVNCBSQとともに、保存領域を示しつつ列挙した。 図７には、ガンマヘルペスウイルスのすでに公知の糖タンパク質Ｂのポリヌク レオチド配列を、それらから設計された１型オリゴヌクレオチドFAYDAとともに 、保存領域を示しつつ列挙した。 図８には、ガンマヘルペスウイルスのすでに公知の糖タンパク質Ｂのポリヌク レオチド配列を、それらから設計された１型オリゴヌクレオチドIYGKA及びIYGKA SQとともに、保存領域を示しつつ列挙した。 図９には、ガンマヘルペスウイルスのすでに公知の糖タンパク質Ｂのポリヌク レオチド配列を、それらから設計された１型オリゴヌクレオチドCYSRA及びCYARA SQとともに、保存領域を示しつつ列挙した。 図10には、ガンマヘルペスウイルスのすでに公知の糖タンパク質Ｂのポリヌク レオチド配列を、それらから設計された１型オリゴヌクレオチドNIDFB及びNIDFB SQとともに、保存領域を示しつつ列挙した。 図11には、ガンマヘルペスウイルスのすでに公知の糖タンパク質Ｂのポリヌク レオチド配列を、それらから設計された１型オリゴヌクレオチドFREYA、FREYB及 びNVFDAとともに、保存領域を示しつつ列挙した。 図12には、ガンマヘルペスウイルスのすでに公知の糖タンパク質Ｂのポリヌク レオチド配列を、それらから設計された１型オリゴヌクレオチドGGMAとともに、 保存領域を示しつつ列挙した。 図13には、RFHV及びKSHVの糖タンパク質Ｂポリヌクレオチド配列の部分を、ガ ンマヘルペスウイルスのすでに公知の糖タンパク質Ｂのポリヌクレオチド配列と のアライメントをとって示した。各々の共有残基は点で表した。 図14は、ポリヌクレオチド配列中でNIVPAとTVNCBのハイブリダイズ部位の間で コードされる、種々のガンマヘルペスウイルスからの糖タンパク質Ｂのポリペプ チド配列の比較を示す。下線で示したクラスII配列断片は、RFHV／KSHV交差反応 抗原ペプチドであると思われる。小文字で示すクラスIII配列は、RFHV又はKSHV ウイルス特異的ペプチドであると思われる。 図15には、ガンマ、β及びα亜科中のより広範なスペクトラムにわたる糖タン パク質Ｂのポリペプチド配列のアライメントを示す。 図16には、図15に示すポリペプチド配列に基づく、糖タンパク質Ｂの相関図を 示す。 図17には、それらが由来するヌクレオチド配列とアライメントをとった典型的 な２型（亜科特異的）オリゴヌクレオチドの配列を示す。 図18には、KSHVゲノム中に現れている糖タンパク質Ｂコード領域とDNAポリメ ラーゼコード領域の地図であり、オリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイ ゼーション位置を示している。 図19には、図１に示す配列の上流及び下流の断片を増幅することによって得ら れるKSHVのDNA配列を列挙したものである。オープンリーディングフレームは完 全なKSHVの糖タンパク質Ｂの場合の配列を示し、カプシド成熟遺伝子及びDNAポ リメラーゼのためのオープンリーディングフレームと隣接している。 図20は、NIVPAとTVNCBとの間でコードされるRFHVの106ヌクレオチドの糖タン パク質Ｂポリペプチド断片のHopp-Woods抗原性プロットである。配列中の疎水性 残基と抗原性残基のスパンを下部に示す。 図21は、NIVPAとTVNCBとの間でコードされるKSHVの106ヌクレオチドの糖タン パク質Ｂポリペプチド断片のHopp-Woods抗原性プロットである。 図22は、KSHVからの完全な糖タンパク質ＢのHopp-Woods抗原性プロットである 。 図23は、RFHV2と呼ばれる、RFHV／KSHV亜科の第三の糖タンパク質Ｂ断片につ いてのDNA及びタンパク質配列である。残基36から354の間の319塩基のポリヌク レオチドセグメントには下線を付し、この下線を付した部分は、それを増幅させ るために使用するプライマーの間の糖タンパク質Ｂコードセグメントを表す。 発明を実施するための最良の形態 本発明者らは、ヘルペスウイルスのRFHV/KSHV亜科由来の糖タンパク質Ｂをコ ードするポリヌクレオチドを発見し、特性決定した。本発明に例示されるポリヌ クレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体は、ヘルペスウイル ス感染症および関連症状の診断、臨床的モニタリングおよび治療において有用で ある。 RFHV糖タンパク質Ｂのためのポリヌクレオチドの供給源は、腹膜後繊維腫症（「 ＲＦ」）を有するマカク・ネメストリナ（Macaque nemestrina）サルから採取し た罹患組織サンプルであった。KSHV糖タンパク質Ｂのためのポリヌクレオチドは 、カポジ肉腫（「ＫＳ」）を有するヒトからの罹患組織サンプルから得た。本 発明に用いる組織は、RFHV由来またはKSHV由来の遺伝物質を含有することがわか った。何故ならば、それら組織は、従来では、対応するＤＮＡポリメラーゼ・コ ード化断片をクローニングするのにうまく用いられてきたからである。ＤＮＡポ リメラーゼ領域の増幅は、同一出願人による米国特許出願第60/001,148号に記載 されている。 これらのサンプルからの糖タンパク質Ｂ配列を増幅するために、他のヘルペス ウイルスのものからのオリゴヌクレオチドを設計した。糖タンパク質Ｂは、ヘル ペスウイルス間でそれ程よく保存されてはいないと予想される。何故ならば、糖 タンパク質Ｂは、ウイルスのエンベロープ上で外部に曝されており、そのために 、それらが感染する宿主の免疫系からの選択的圧力下に置かれるからである。し たがって、上記のオリゴヌクレオチドは、RFHVおよびKSHVと最も密接に関連する と考えられているヘルペスウイルスの配列から設計した。これら２つのウイルス は、ＤＮＡポリメラーゼ配列から、密接に関連しているガンマ型ヘルペスである ことがわかっている。 オリゴヌクレオチドは、主に、４つのガンマヘルペスウイルス（sHV1、eHV2、 bHV4、mHV68およびhEBV）について従来わかっている糖タンパク質Ｂの配列から 設計した。これら４つの糖タンパク質Ｂ分子のアミノ酸配列を比較したところ、 比較的保存された９つの領域があることが判明した。この配列データに基づいて 、以下のセクションで記載するようにして、縮重セグメントとコンセンサスセグ メントとを含有するオリゴヌクレオチドを構築した。これらのオリゴヌクレオチ ドのうちの３つは、ＲＦおよびＫＳの組織から、RFHV糖タンパク質ＢおよびKSHV 糖タンパク質Ｂをコードするセグメントの断片を得るための増幅反応におけるプ ライマーとして用いられている。 最後の増幅工程後に得られるRFHVおよびKSHVポリヌクレオチド配列の断片を図 １に示す(それぞれ、配列番号１および配列番号３)。増幅に用いられるNIVPAプ ライマーおよびTVNCBプライマーのハイブリダイズ領域に対応するセグメントが 各末端に含まれる。プライマー結合セグメント間の断片の長さは319塩基対(残基 36〜354)であり、RFHVゲノムおよびKSHVゲノムのそれぞれの糖タンパク質Ｂコー ド領域の正確な反映であると考えられる。 RFHV由来の319塩基対の糖タンパク質Ｂコード化ポリヌクレオチドセグメント は、sHV1およびbHV4由来の配列（RFHV／KSHV亜科以外のものに由来する最も密接 に関連する配列）とたった60％同一であるにすぎない。KSHV由来の319塩基対の ポリヌクレオチドセグメントはsHV1およびbHV4とたった63％同一であるにすぎな い。これらのセグメントは、RFHVとKSHVとの間では76％同一である。 対応する推定アミノ酸配列（配列番号２および配列番号４）も示す。これらの ポリペプチド配列は新規であり、他のヘルペスウイルスからの糖タンパク質Ｂ配 列とは部分的に相同である。示される断片は、全糖タンパク質Ｂ配列の約１／８ であると予想される。それら断片は、前処理タンパク質の推定Ｎ末端メチオニン から約80アミノ酸だけ下流から始まる。配列Asn-Xaa-(Thr/Ser)によれば、アミ ノ酸配列の80位には潜在的なＮ結合型グリコシル化部位が存在する。この部位は 、RFHVとKSHVとの間で保存されており、他の既知のガンマヘルペスウイルス間で も保存されている。58位には、ガンマ、ベータおよびアルファ亜科のヘルペスウ イルス間で保存されているシステイン残基も存在し、このシステイン残基は、タ ンパク質の３次元構造を維持する上で役割を果たすであろう。 上記増幅プライマー間の319塩基対によってコードされる糖タンパク質Ｂの106 個アミノ酸のセグメントは、RFHVとKSHVとの間では91％同一であるが、KSHVとbH V4の配列（RFHV／KSHV亜科以外の最も近い配列）との間ではたった65％同一であ るにすぎない。 RFHV／KSHVヘルペスウイルス亜科によって発現される糖タンパク質Ｂ分子は、 他のヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｂについて記載されている特性の多くを有 することが期待される。糖タンパク質Ｂ分子のサイズは一般に約110kDaであり、 これは約800〜900個アミノ酸または約2400〜2700塩基対に相当する。疎水性のプ ロットは、Ｎ末端からＣ末端まで以下の順番で存在する領域を示す：膜指向性(m embrane-directing)リーダー配列に対応する疎水性領域；細胞外ドメインに対応 する混合極性領域；膜貫通ドメインに対応する疎水性領域；および、細胞質ドメ インに対応する別の混合極性領域。 KSHV糖タンパク質Ｂの完全配列（図19に示す）は、これらの予想を確証する。 この遺伝子は、シグナルペプチドとＣ末端近傍の膜貫通領域とを含む約845 個のアミノ酸をコードする。システイン残基は、他の糖タンパク質Ｂ配列と同様 に保存されており、可能性のあるさらにもう１つの潜在的なジスルフィドは、３ 次元構造を安定化するのに役立つ可能性がある。 糖タンパク質Ｂは、一般に、感染性および欠損しているウイルス粒子のエンベ ロープ上、および感染細胞の表面上で発現される。糖タンパク質Ｂは、概してグ リコシル化され、５〜20またはそれ以上のグリコシル化部位を含有できる。糖タ ンパク質Ｂは、一般にタンパク質の二量体としても発現され、この二量体は、ウ イルスが発芽する前に、宿主細胞表面へ移動する間に組立てられる。二量体化に 関与する部位は、およそアミノ酸475と膜架橋(membrane-spanning)領域との間に 位置すると思われる(Navarroら)。 従来の研究では、糖タンパク質Ｂ分子の各種領域に対する感染性に関係する幾 つかの生化学的機能をマップした。糖タンパク質Ｂおよび糖タンパク質Ｃの双方 は、HSV1およびウシ・ヘルペスウイルス１型の標的細胞への最初の結合に関与す る(Heroldら、Bymeら)。糖タンパク質Ｂにより認識される細胞上の部分は、ヘパ ラン硫酸であると思われる。この結合は、流動相（fluid-phase）ヘパリンによ って阻害することができる。糖タンパク質Ｃを欠く突然変異体は依然として標的 細胞に結合するが、糖タンパク質Ｂおよび糖タンパク質Ｃの双方を欠く突然変異 体では、それらの細胞に接近する能力が著しく損なわれる。 明らかに重要なもう１つの機能は、糖タンパク質Ｂの、膜融合およびウイルス の細胞への侵入を促進する能力である。ヒトCMVでは、融合誘導の役割は、糖タ ンパク質Ｂの第１の疎水性ドメインにマップされると考えられ、この領域内にあ る保存されたグリシン残基に関連する可能性がある(Reschkeら)。HSV1突然変異 体では、シンシチウム形成を促進する糖タンパク質Ｂの能力は、Ｃ末端近傍にあ るタンパク質の細胞質ドメイン内の複数の部位で認められる(Kostalら)。 これらのより複雑な機能の幾つかを作動させるために、糖タンパク質Ｂは、第 ２の糖タンパク質Ｂ分子とだけではなく、ウイルスによってコードされる他の成 分とも結合するのではないかと考えられる。例えば、UL45遺伝子産物は、糖タン パク質Ｂによって誘発される融合にとって必要であると思われる(Haanesら)。糖 タンパク質Ｂは、他の表面タンパク質と共働して、標的細胞の表面に疎 水性の融合孔(fusion pore)を形成する、という仮説が立てられている(Pereira ら)。糖タンパク質Ｂは、無傷のウイルス（intact virus）を中和できる強力な 抗体応答を顕在化させることがわかっている。中和活性を有するモノクローナル 抗体は、糖タンパク質Ｂ分子上にある多くの異なる部位を対象にすることが可能 である。 したがって、糖タンパク質Ｂ分子は、標的細胞と相互作用し、融合の促進に役 立ち、かつ他のウイルス・タンパク質と結合する部位を有することが予想される 。RFHV／KSHV亜科ウイルスの糖タンパク質Ｂ分子は、ヘルペスウイルスの他の種 における糖タンパク質Ｂが有する機能の多くを発揮し、かつ、同様の特性の幾つ かを有する活性領域を保有するであろうことが予想される。薬剤または抗体を用 いて、あるいは突然変異によってこれらの活性領域のいずれかを干渉することに より、ウイルスの感染性または病原性は損なわれるであろう。 RFHVおよびKSHVの糖タンパク質Ｂの発見に引き続いて、マカカ・ムラック(Mac aca mulatta)サルから得た罹患組織のサンプルにおいて、RFHV／KSHV亜科の第３ のメンバーを同定した(実施例12)。この糖タンパク質Ｂは、RFHVと密接に関連し ているが同一ではなく、RFHV2と命名する。ヒトに対して病原性である幾つかを 含むその他のRFHV／KSHV亜科のメンバーが出現するであろうと予想される。本開 示は、亜科の新規なメンバーがどのようにして検出でき、特性決定できるかを教 示するものである。 RFHV／KSHV亜科内で糖タンパク質Ｂ配列間に相同性があるということは、本発 明で具体的に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチドが、該亜科の 各種株間での信頼性のあるマーカーであることを意味する。本発明で具体的に記 載されているポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体は、RFHV、KSHVまたは 同じ亜科の他のヘルペスウイルスによる個体のウイルス感染の検出および治療の ような用途に有用である。糖タンパク質Ｂに関連するポリヌクレオチド、オリゴ ヌクレオチド・プローブ、ポリペプチド、抗体およびワクチン組成物、並びにこ れらの化合物の調製および使用は、以下のセクションでさらに詳細に説明する。 略語 本明細書では、ヘルペスウイルスの種、並びにそれらから誘導されるポリヌク レオチドおよびポリペプチドを表すのに以下の略語を使用する。 一般的定義 「糖タンパク質Ｂ」は、ウイルス・ゲノムにおいてコードされ、かつ無傷のウ イルスの表面で発現されると考えられるヘルペスウイルスの特定のタンパク質成 分である。ヘルペスウイルスの特定の種（特に、HSV1、hCMVおよびウシ・ヘルペ スウイルス１型）を用いた機能研究から、糖タンパク質Ｂが、ウイルスの感染性 に関連する幾つかの生化学的機能に関わっていることがわかった。これらの 機能としては、標的細胞表面上の成分（例えば、ヘパラン硫酸）への結合、ウイ ルス膜と標的細胞の膜との融合、該細胞へのウイルス・キャプシドの侵入、多核 化シンシチウム細胞の形成が含まれる。糖タンパク質Ｂはホモ二量体として観察 されており、その生化学的機能の幾つかを発揮するために他のウイルス表面タン パク質と相互作用する可能性がある。各種の生化学的機能（特に、ヘパラン硫酸 の結合および膜融合）は、糖タンパク質Ｂ分子のそれぞれ異なる部分にマップす ると思われる。RFHV／KSHV亜科のメンバーを含む他のヘルペスウイルスの糖タン パク質Ｂ分子は、これらの機能のうちのいずれか、または全てを発揮する。本明 細書で用いる糖タンパク質Ｂという用語は、グリコシル化されていない形態、部 分的にグリコシル化されている形態および完全にグリコシル化されている形態、 並びにモノマーおよびポリマーの双方を含む。 本明細書で用いる糖タンパク質Ｂ断片、領域またはセグメントは、糖タンパク 質Ｂ分子の断片、または糖タンパク質Ｂコード化ポリヌクレオチドのサブ領域の 転写産物である。無傷の(intact)糖タンパク質Ｂ分子または全長転写産物は、ウ イルス活性に関連する生化学的機能（例えば、上記したような機能）を示すであ ろう。これらの機能の幾つかまたは全部は、該断片上に保存されていてもよく、 あるいは該断片は、これらの機能をそれ自身のみでは発揮できない無傷の分子の 一部からのものであってもよい。 「糖タンパク質Ｂ活性」とは、糖タンパク質Ｂの任意の生化学的機能、または 糖タンパク質Ｂに特徴があるとされるヘルペスウイルスの任意の生物学的活性を 意味する。これらの活性としては、細胞、細胞受容体（例えば、ヘパラン硫酸） および受容体類似体への該タンパク質の結合；細胞へのウイルスの結合または侵 入、または細胞融合が挙げられるが、それらに限定されない。 「糖タンパク質Ｂ遺伝子」となる用語は、上記で定義した糖タンパク質Ｂ分子 をコードする配列を含有する遺伝子を意味する。糖タンパク質Ｂ遺伝子は、加工 および改変された翻訳産物をもたらす可能性があると理解され、このような翻訳 産物としては、シグナル配列またはリーダー配列を有する、あるいは有さない糖 タンパク質Ｂの形態、末端切断された、または内部欠失している形態、多量体の 形態、および様々な程度にグリコシル化された形態が挙げられるが、これらの 限定されない。 本明細書で用いる「ＤＮＡポリメラーゼ」は、適切な条件下で、鋳型として用 いるポリヌクレオチドに相補的な配列を有するＤＮＡポリヌクレオチドの組み立 てを触媒することが可能なタンパク質またはタンパク質類似体である。ＤＮＡポ リメラーゼは、さらに他の触媒活性（例えば、３′−５′エキソヌクレアーゼ活 性など）を有していてもよく、これらの活性のうちのいずれかが優勢であっても よい。ＤＮＡポリメラーゼは、その触媒機能を発揮するために、追加のタンパク 質または補助因子との結合を必要としてもよい。 「RFHV」は、腹膜後繊維腫症(ＲＦ)に冒されたマカク・ネメストリナ(Macaque nemestrina)サルの組織サンプルにおいて検出されるヘルペス科のウイルスであ る。RFHVは、「RFHV1」、「RFHVMn」および「RFMn」という用語と同義である。「KSHV」 は、カポジ肉腫（ＫＳ）に冒されたヒトの組織サンプルにおいて検出されるヘル ペスウイルス科のウイルスである。RFHV／KSHV亜科の第３のメンバーは、M.ムラ ッタ（M．mulatta）サルにおいて同定されるウイルスである。本明細書では、こ のウイルスを「RFHV2」と呼ぶ。「RFHV2」は、「RFHVMm」および「RFMm」なる用 語と同義である。 「RFHV／KSHV亜科」は、本明細書において、脊椎動物種を感染させる能力を有 するヘルペスウイルスのコレクションを意味するのに用いられる用語である。こ の亜科は、他のヘルペスウイルス（sHV1、eHV2．bHV4、mHV68およびhEBV等）よ りもRFHVまたはKSHVの対応する配列に密接に関連する糖タンパク質Ｂ配列を有す るメンバーから構成される。好ましくは、糖タンパク質Ｂをコードするポリヌク レオチドは、残基36と354との間で、RFHVのもの（配列番号１）またはKSHVのも の（配列番号３）に少なくとも65％同一であるセグメント、オリゴヌクレオチド SHMDAに少なくとも約74％同一であるセグメント、オリゴヌクレオチドCFSSBに少 なくとも約73％同一であるセグメント、ヌクレオチドENTFAに少なくとも約72％ 同一であるセグメント、またはヌクレオチドDNIQBに少なくとも約80％同一であ るセグメントを含有する。RFHVおよびKSHVは、RFHV／KSHV亜科の典型的なメンバ ーである。RFHV／KSHV亜科は、ヘルペスウイルスのガンマ亜科のサブセットを表 す。 「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」なる用語は、互換的に使 用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかまたはそ れらの類似体の任意のヌクレオチド長の重合形態を意味する。ポリヌクレオチド は、任意の三次元構造を有していてもよく、既知または未知の任意の機能を発揮 してもよい。ポリヌクレオチドの非限定的な具体例として、以下のものが挙げら れる：遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ (ｍＲＮＡ)、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポ リヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意配列の 単離されたＤＮＡ、任意配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライ マー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体な どの修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよい。ヌクレオチドの構造に対する 修飾が存在する場合、それは、該ポリマーの組立て(assembly)の前または後に付 与されうる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により分断されていて もよい。重合後に、標識成分との結合などにより、ポリヌクレオチドをさらに修 飾してもよい。 本発明で用いるポリヌクレオチドなる用語は、一本鎖分子および二本鎖分子の 双方を意味する。特に明示または要求されない限り、ポリヌクレオチドである本 明細書に記載の本発明の任意の実施態様は、二本鎖形態、および該二本鎖形態を 形成することがわかっている、または予想される２つの相補的な一本鎖形態のそ れぞれを包含する。 ポリヌクレオチドの場合、「線状配列」または「配列」は、ポリヌクレオチド のヌクレオチドの5'から3'への方向の並びであり、この場合、配列内で互いに隣 接する残基は、そのポリヌクレオチドの一次構造において隣接している。「部分 配列」は、一方または両方の方向で追加的な残基を含むことがわかっているポリ ヌクレオチドの一部の線状配列である。 「ハイブリダイゼーション」は、１以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌク レオチド残基の塩基間の水素結合により安定化された複合体を形成する反応を意 味する。水素結合は、ワトソン・クリック型塩基対合、フーグスティーン型結合 、または他の任意の配列特異的態様により生じうる。その複合体は、二 重らせん構造を形成する２本の鎖、多鎖複合体を形成する３本以上の鎖、自己ハ イブリダイズする一本鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい 。ハイブリダイゼーション反応は、PCRの開始、またはリボザイムによるポリヌ クレオチドの酵素的切断などとして、より大規模な方法の一工程を構成してもよ い。 ハイブリダイゼーション反応は、種々の「ストリンジェンシー」の条件下で行 なうことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加さ せる条件は、当該分野において広く知られており、公表されている。例えば、Sa mbrook FritschおよびManiatisを参照されたし。適切な条件（ストリンジェンシ ーを増加させるためのもの）には、例えば、25℃、37℃、50℃および68℃のイン キュベーション温度；10×SSC、６×SSC、１×SSC、0.1×SSC（SSCは、0.15M Na Clおよび15mMクエン酸の緩衝液である）の緩衝液濃度および他の緩衝系を用いる それらの等価物；０％、25％、50％および75％のホルムアミド濃度；５分〜24時 間のインキュベーション時間；１回、２回またはそれ以上の洗浄工程；１、５ま たは15分間の洗浄インキュベーション時間；および6×SSC、１×SSC、0.1×SSC または脱イオン水の洗浄溶液が含まれる。 「Tm」は、ワトソン・クリック型塩基対合により逆平行方向に水素結合した相 補鎖よりなるポリヌクレオチド二重らせんの50％が実験条件下で一本鎖に解離す る摂氏の温度である。Tmは、標準的な式、例えば、 Tm＝81.5＋16.6 log[Na⁺]+0.41(%G/C)−0.61(％F)−600/L ［式中、[Na⁺]はmol/L単位のカチオン（通常はナトリウムイオン）濃度であり、 (%G/C)は二重らせん中の全残基の割合(％)としてのＧおよびＣ残基の数であり、 (％F)は溶液中のホルムアミドの割合(％)(wt/vol)であり、Ｌは二重らせんの各 鎖内のヌクレオチド数である］ により予想することができる。 ポリヌクレオチドの「安定な二重らせん」または生化学的反応において任意の ２以上の成分の間で形成される「安定な複合体」は、該二重らせんまたは複合体 の形成とそれに続く検出との間で十分に持続する程度に長く維持される二重らせ んまたは複合体を意味する。この二重らせんまたは複合体は、形成の時 点と検出の時点との間に存在または導入されいかなる条件（これらの条件は、行 うべきアッセイまたは反応と相関する）にも耐えうるものでなければならない。 場合によっては存在してもよく二重らせんまたは複合体を取り出しうる介在条件 には、洗浄、加熱、反応混合物への追加的な溶質（例えば変性剤）または溶媒の 添加、および追加的な反応種との競合が含まれる。安定な二重らせんまたは複合 体は、不可逆的であっても可逆的であってもよいが、この定義の他の要件を満足 しなければならない。したがって、反応混合物中には一時的な複合体が生じても よいが、それが自発的に、または新たに課された条件または検出前に導入される 操作の結果として解離する場合には、それは安定な複合体を構成しない。 ２つの一本鎖ポリヌクレオチドの間で、逆平行の立体配置の安定な二重らせん が形成されている場合(特に、高ストリンジェントな条件下)、そのような鎖は、 実質的に「相補的」である。二本鎖ポリヌクレオチドが、もう１つのポリヌクレ オチドと「相補的」となりうるのは、第１ポリヌクレオチドの鎖の１つと第２の ものとの間で安定な二重らせんが形成されうる場合である。一本鎖のポリヌクレ オチドの配列から予想される相補的配列は、一般的に受け入れられている塩基対 合則に従って該一本鎖ポリヌクレオチドと水素結合を形成すると予想される標準 的なヌクレオチドの最適配列である。 「センス」鎖および「アンチセンス」鎖は、それらが同じ文脈で用いられる場 合には、互いに相補的である一本鎖ポリヌクレオチドを意味する。それらは、二 本鎖ポリヌクレオチドの対向している鎖であってもよく、あるいは一般的に受け 入れられている塩基対合則に従って一方の鎖を他方の鎖から予想してもよい。特 に指示しない限り、一方または他方の鎖の、「センス」または「アンチセンス」 としての割り当ては、任意のものである。ポリヌクレオチドのポリペプチド・コ ード化セグメントについては、「センス」鎖は一般に該コード化セグメントを含 有する鎖である。 同一性の程度についての比較をポリヌクレオチド間で行なう場合、相補鎖が容 易に生じ、比較しているポリヌクレオチド間の同一性を最大にするセンスまたは アンチセンス鎖が選択または予想されることが暗黙のうちに理解される。 例えば、比較するポリヌクレオチドの一方または両方が二本鎖である場合、第１ ポリヌクレオチドの一方の鎖が第２ポリヌクレオチドの一方の鎖と同一であれば 、それらの配列は同一である。同様に、ポリヌクレオチドプローブがその標的と 同一であると記載されている場合、該プローブと該標的との間のハイブリダイゼ ーション反応に関与するのは標的の相補鎖であると理解される。 ヌクレオチドの線状配列がもう１つの線状配列と「実質的に同一」となるのは 、両方の配列が、同じ相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重らせん を形成しうる場合である。より大きなストリンジェンシーの条件下でハイブリダ イズする配列がより好ましい。ハイブリダイゼーション反応は、ヌクレオチド配 列内の挿入、欠失および置換を受け入れうると理解される。したがって、ヌクレ オチドの線状配列は、たとえヌクレオチド残基のいくつかが正確に対応または一 致していない場合であっても、それらは実質的に同一となりうる。本明細書に開 示される本発明により密接に対応または一致する配列が、比較的により好ましい 。一般に、約25残基のポリヌクレオチド領域が、もう１つの領域と実質的に同一 となるのは、それらの配列が、少なくとも約85％、さらに好ましくは少なくとも 約90％、さらに好ましくは少なくとも約95％、より一層好ましくは100％同一で ある場合である。40残基以上のポリヌクレオチド領域が、もう１つの領域と実質 的に同一となるのは、相同部分のアライメントをとった後、それらの配列が少な くとも約75％、さらに好ましくは少なくとも約80％、さらに好ましくは少なくと も85％、さらに好ましくは少なくとも約90％、より一層好ましくは100％同一で ある場合であろう。 ポリヌクレオチド配列が実質的に同一であるか否かを判定する場合、比較対象 のポリヌクレオチドの機能を保持する配列が特に好ましい。機能は、種々のパラ メーターにより判定することができる。例えば、もう１つのポリヌクレオチドと のハイブリダイゼーションを含む反応でポリヌクレオチドを使用する場合、好ま しい配列は、同じ標的と同様の条件下でハイブリダイズしうる配列である。一般 に、ＤＮＡの二重らせんのTmは、ミスマッチ残基の位置に応じて、配列同一性が １％減少する毎に、200残基以上の二重らせんの場合には約１℃、40残基未満の 二重らせんの場合には約５℃低下する(例えば、Meinkothらを参 照されたし)。約100残基の実質的に同一な配列は、一般に、互いの各相補配列と 、Tmより約20℃低い温度、好ましくは約15℃低い温度、より好ましくは約10℃低 い温度、さらに好ましくは約５℃低い温度、より一層好ましくはおよそTmで安定 な二重らせんを形成するであろう。もう１つの具体例において、ポリヌクレオチ ドでコードされるポリペプチドが、その機能の重要な部分である場合は、好まし い配列は、同一または実質的に同一なポリペプチドをコードする配列である。し たがって、同類アミノ酸置換を引き起こすヌクレオチドの相違が、非同類置換を 引き起こすものより好ましく、アミノ酸配列を改変しないヌクレオチドの相違が より好ましく、同一のヌクレオチドがより一層好ましい。ポリペプチド内の挿入 または欠失を生ずるポリヌクレオチド内の挿入または欠失は、下流のコード領域 をずらしてしまうものよりも好ましく、挿入または欠失を含まないポリヌクレオ チド配列がより一層好ましい。ハイブリダイゼーション特性の相対的な重要性お よびポリヌクレオチドのコード化ポリペプチド配列は、本発明の用途に左右され る。 あるポリヌクレオチドが、もう１つのポリヌクレオチドと同じ「特徴」を有す るのは、その両方が、ストリンジェンシーが最大となる同様の条件下で特定の第 ３のポリヌクレオチドと安定な二重らせんを形成しうる場合である。好ましくは 、同様のハイブリダイゼーション特性に加え、該ポリヌクレオチドは実質的に同 一なポリペプチドをもコードする。 ポリヌクレオチド配列の「保存」されている残基は、比較する２以上の関連し ている配列の同じ位置で、改変されずに存在する残基である。比較的保存されて いる残基は、それらの配列内の他の位置に出現する残基よりも、関連のある配列 の間で保存されている、あるいはより大きな度合の同一性を有する残基である。 「関連」しているポリヌクレオチドは、同一な残基の有意な割合を共有してい るポリヌクレオチドである。 本発明で用いる「縮重」オリゴヌクレオチド配列は、以下のとおり、少なくと も２つの関連している起源ポリヌクレオチド配列に由来する設計された配列であ る。すなわち、起源配列内で保存されている残基は、縮重配列内で保持さ れており、一方、起源配列内で保存されていない残基は、縮重配列内でいくつか の代替物として与えられうる。例えば、縮重配列AYASAは、起源配列ATACAおよび ACAGA（式中、ＹはＣまたはＴ、およびＳはＣまたはＧである）から設計するこ とができる。ＹおよびＳは、「１つの塩基に拘束されない(アンビギュアスな)」 残基の例である。縮重セグメントは、縮重配列を含有するポリヌクレオチドのセ グメントである。 縮重配列を含む合成オリゴヌクレオチドは、実際には、アンビギュアスな位置 以外で同一の配列を共有する密接に関連しているオリゴヌクレオチドの混合物で あると理解される。そのようなオリゴヌクレオチドは、通常、アンビギュアスな 位置でのヌクレオチドのあらゆる可能な組み合わせの混合物として合成される。 該混合物中の各オリゴヌクレオチドは、「代替形態」と称される。該混合物中の 形態の数は、 （式中、k_iは、各位置で許容される別のヌクレオチドの数である） に等しい。 本発明で用いる「コンセンサス」オリゴヌクレオチド配列は、以下のとおり、 少なくとも２つの関連している起源ポリヌクレオチド配列に由来する設計された 配列である。すなわち、すべての起源配列内で保存されている残基は、コンセン サス配列内で保持されるが、残基が保存されていない位置では、該起源配列から もう１つの残基が選ばれる。一般に、選ばれるヌクレオチドは、起源配列内で最 大頻度で出現するヌクレオチドである。例えば、コンセンサス配列AAAAAは、起 源配列CAAAA、AAGAAおよびAAAATから設計することができる。コンセンサスセグ メントは、コンセンサス配列を含有するポリヌクレオチドである。 本発明で用いるポリヌクレオチドの「断片」または「挿入断片」は、一般に完 全長形態のサブ領域を表すが、完全長ポリヌクレオチドの全体を含むこともある 。 ポリヌクレオチドが互いに「対応」するのは、それらが互いに由来し合うか、 あるいは共通の起源(ancestor)に由来している場合である。例えば、異なるウイ ルスの遺伝子のコード領域が対応するのは、それらが有意な程度の同一性を共有 しているか、ゲノムの同じ位置にマップしているか、あるいは同様の生化学的機 能を発揮するタンパク質をコードする場合である。メッセンジャーＲＮＡは、そ れが転写される遺伝子に対応する。ｃＤＮＡは、それが産生される基礎になった ＲＮＡ、または該ＲＮＡをコードする遺伝子に対応する。タンパク質は、それを コードするポリヌクレオチド、および該タンパク質を特異的に結合することが可 能な抗体に対応する。 ポリヌクレオチド操作に関して用いる「プローブ」は、関心のあるサンプル中 に潜在的に存在する標的とハイブリダイズさせることにより該標的を検出するた めの試薬として提供されるオリゴヌクレオチドを意味する。通常、プローブは標 識を含むか、あるいは、そのハイブリダイゼーション反応の前または後のいずれ かにおいて標識を結合しうる手段を含むであろう。適当な標識には、放射性同位 体、蛍光色素、化学発光化合物、染料およびタンパク質（例えば酵素）が含まれ るが、これらに限定されるものではない。 「プライマー」は、一般的には遊離3'−OH基を有するオリゴヌクレオチドであ って、関心のあるサンプル中に潜在的に存在する標的とハイブリダイズすること により該標的に結合し、ついで該標的と相補的なポリヌクレオチドの重合を促進 するオリゴヌクレオチドである。 同じポリヌクレチドの複製コピーを産生させる方法（例えば、PCRまたは遺伝 子クローニング）を、本明細書では、「増幅」または「複製」と総称する。例え ば、同じ配列を有するもう１つのＤＮＡを形成させるために、一本鎖または二本 鎖ＤＮＡを複製することができる。ＲＮＡは、例えば、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリ メラーゼにより、あるいはＤＮＡを逆転写し、ついでＰＣＲを行なうことにより 複製することができる。後者の場合、増幅されたＲＮＡのコピーは、同じ配列を 有するＤＮＡである。 「ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)」は、１以上のプライマーおよび重合触媒（例 えば、逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼ、および特に耐熱性ポリメラーゼ酵 素）を用いて、複製コピーを標的ポリヌクレオチドから作製する反応である。 一般には、PCRは、以下の３工程の繰り返しを含む：増幅すべきポリヌクレオチ ドとオリゴヌクレオチドプライマーとが二重らせんを形成しうるよう温度を調節 する「アニーリング」、二重らせんを形成したポリヌクレオチドを鋳型として用い て、二重らせんを形成したオリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼで伸長する よう温度を調節する「伸長」、およびそのポリヌクレオチドおよび伸長したオリゴ ヌクレオチドが解離するよう温度を調節する「融解」。ついで、所望量の増幅ポリ ヌクレオチドが得られるまで、そのサイクルを繰り返す。PCRの方法は、米国特 許第4,683,195号（Mullis）および同第4,683,202号（Mullisら）に教示されてい る。 「制御要素」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、 スプライシング、翻訳または分解などのポリヌクレオチドの機能的調節に寄与す る分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。その調節は、その過程の 頻度、速度または特異性に影響を及ぼすことがあり、本質的に促進的であっても 抑制的であってもよい。制御要素は、当該分野で公知である。例えば、「プロモ ーター」は、制御要素の一例である。プロモーターは、ある条件下でＲＮＡポリ メラーゼに結合し、該プロモーターの下流（3'方向）に位置するコード領域の転 写を開始しうるＤＮＡ領域である。「作動可能的に結合している」とは、遺伝的 要素の配置であって、該要素が予想どおりに作動しうる関係にある配置を意味す る。例えば、プロモーターがコード配列の転写開始を助ける場合、プロモーター はコード領域に作動可能的に結合している。この機能的関係が維持される限り、 プロモーターとコード領域との間に介在残基が存在していてもよい。 「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」なる用語は、本明細書で は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを表すために互換的に使用する。ポリマー は、直鎖状であっても分枝状であってもよく、修飾されたアミノ酸を含んでいて もよく、非アミノ酸で分断されていてもよい。また、これらの用語は、自然に修 飾されているアミノ酸ポリマー、または例えば、ジスルフィド結合形成、グリコ シル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他の任意の操作（例えば、標識 成分との結合）の介入により修飾されているアミノ酸ポリマーをも 包含する。 ポリペプチドの場合、「線状配列」または「配列」は、Ｎ末端からＣ末端への 方向のポリペプチド内のアミノ酸の並びであり、この場合、配列内で互いに隣接 する残基は、そのポリペプチドの一次構造において隣接している。「部分配列」 は、一方向または両方向に追加的残基を含むことがわかっているポリペプチドの 一部の線状配列である。 アミノ酸の線状配列がもう１つの線状配列と「実質的に同一」であるのは、そ の２つの配列が実質程度の配列同一性を有する場合である。タンパク質のフォー ルディングおよび生化学的機能は、アミノ酸配列内の挿入、欠失および置換を受 け入れうると理解される。したがって、アミノ酸の線状配列は、たとえ残基のい くつかが正確に対応または一致していない場合であっても、実質的に同一である 。本明細書に開示される発明により密接に対応または一致する配列が、より好ま しい。また、いくつかのアミノ酸の置換は、より容易に許容されると理解される 。例えば、疎水性側鎖、芳香族側鎖、極性側鎖、正または負の電荷を有する側鎖 、または２以下の炭素原子を含む側鎖を有するアミノ酸が、同様の特性の側鎖を 有する別のアミノ酸により置換されていても、その２つの配列の実質的な同一性 を妨げるものではない。相同領域を決定し、相同性を算出する方法は、当該分野 でよく知られている。例えば、AltschulらおよびHenikoffらを参照されたし。十 分に許容される配列の相違は、「同類置換」と称される。したがって、同類置換 を有する配列は、同じ位置で他の置換を有する配列より好ましく、同じ位置に同 一の残基を有する配列が、より一層好ましい。一般に、ポリペプチド領域がもう １つの領域と本質的に同一となるのは、相同部分のアライメントをとった後、そ れらの配列が少なくとも約92％、さらに好ましくは少なくとも約95％同一な場合 ；さらに好ましくは、それらの配列が少なくとも約95％同一であり、同一である か同類置換のいずれかである別の少なくとも２％を含む場合；さらに好ましくは 、それらの配列が少なくとも約97％同一である場合；さらに好ましくは、それら の配列が少なくとも約97％同一であり、同一であるか同類置換のいずれかである 別の少なくとも２％を含む場合；さらに好ましくは、それらの配列が少なくとも 約99％同一である場合；さらに 一層好ましくは、それらの配列が100％同一である場合である。 ポリペプチド配列が実質的に同一であるか否かを判定する場合、比較対象のポ リペプチドの機能を維持している配列が特に好ましい。機能は、種々のパラメー ター、例えば、酵素活性、基質−酵素または受容体−リガンド相互作用における 結合速度または親和性、抗体との結合親和性、およびＸ線結晶構造により判定す ることができる。 あるポリペプチドが、もう１つのポリペプチドと同じ「特徴」を有するのは、 それが、同じ生化学的機能（例えば、酵素活性、リガンド結合または抗体反応性 ）を示す場合である。糖タンパク質Ｂまたは糖タンパク質Ｂ断片と関連したポリ ペプチドの好ましい特徴は、他のヘルペス種の糖タンパク質Ｂが結合する細胞表 面受容体の類似体への結合能、標的細胞との膜融合の促進能、宿主細胞のウイル ス侵入の促進能である。また、比較対象のポリペプチドと同じ生化学的機能を示 し、コンピューターでのモデリングにより予想したりＸ線結晶学により決定した 場合に同様の三次元コンフォメーションを有すると考えられるポリペプチドも好 ましい。 ポリペプチドの「生化学的機能」、「生物学的機能」または「生物活性」には、 適当な実験調査により検出可能なポリペプチドの任意の特徴が含まれる。「改変 」された生化学的機能は、例えば、分子量の測定、円二色性、抗体結合、示差分 光法または核磁気共鳴により検出可能なポリペプチドの一次、二次、三次または 四次構造の変化を意味することがある。それはまた、ある反応を触媒する能力ま たは補因子、基質、阻害剤、薬物、ハプテンまたは他のポリペプチドに結合する 能力などの反応性の変化を意味することもある。物質がこれらの任意の方法によ りポリペプチドの生化学的機能を変化させる場合、該物質はポリペプチドの生化 学的機能を「阻害(interfere)」すると言うことがある。 「融合ポリペプチド」は、ある領域を配列内に、天然で見出されるものとは異 なる位置に含むポリペプチドである。その領域は、通常は、別々のタンパク質内 に存在しうるが、融合ポリペプチドにおいては一緒になっている。あるいは、通 常は同じタンパク質内に存在しうるが、融合ポリペプチド内では新しい編成で位 置する。融合ポリペプチドは、例えば、化学合成により、あるいはペ プチド領域が所望の関係でコードされているポリヌクレオチオドを作製し翻訳さ せることにより作製することができる。 「抗体」(単数形および複数形で互換的に用いる)は、ポリペプチドなどの標的 に特異的に結合しうる免疫グロブリン分子であり、その結合は、該免疫グロブリ ン分子の可変領域内に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して生じる。 その用語は、本明細書で用いる場合には、もとの抗体だけでなく、その断片、そ の突然変異体、融合タンパク質、ヒト化抗体、および要求される特異性の抗原認 識部位を含む免疫グロブリン分子の他の任意の修飾立体配置も包含する。 「免疫学的認識」または「免疫学的反応性」は、免疫グロブリンまたは関連分 子（例えば、Ｂ細胞受容体またはＴ細胞受容体）内の少なくとも１つの抗原認識 部位を介する、標的の特異的結合を意味する。 「抗原」なる用語は、抗体が、その抗原認識部位を介して特異的に結合する標 的分子を意味する。抗原は、抗体の産生を刺激した免疫原と化学的に関連してい てもよいが、必ずしもその必要はない。抗原は多価であってもよいし、あるいは 一価のハプテンであってもよい。抗体に認識されうる抗原の種類としては、例え ば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、他の抗体分子、オリゴ糖、複合脂質、薬 物、化学物質などが挙げられる。 「免疫原」は、適当な宿主（通常は哺乳動物）に注入された場合に抗体産生を 刺激しうる化合物である。この特性を有する化合物は、「免疫原性である」と記 載される。化合物を免疫原性にするのは、当該分野で公知の多数の技術、例えば 、結合価を増加させるための担体との架橋または結合、免疫応答を増加させるた めのマイトジェンとの混合、提示を増強するためのアジュバントとの合体により 行なうことができる。 「ワクチン」は、特定の標的または標的群に対するある程度特異的な免疫学的 反応性を受容者に付与するために投与するヒトまたは動物用の医薬製剤である。 免疫学的反応性は、標的に対して免疫学的に反応性である抗体または細胞(特に Ｂ細胞、形質細胞、Ｔヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球、およびそれら の前駆体)、あるいはそれらの任意の組み合わせであってもよい。可能 性のある標的としては、外来性または病因性化合物、例えば、外因性タンパク質 、病原ウイルス、癌細胞により発現される抗原などが挙げられる。免疫学的反応 性は、実験目的、特定の状態の治療、特定の物質の除去または特定の状態または 物質の予防の場合に要求されるかもしれない。特に指示しないかぎり、本明細書 で言及するワクチンは、受動ワクチンまたは能動ワクチンのいずれかであり、そ れらの双方の特性を有していてもよい。 「受動ワクチン」は、受容者の免疫応答の関与を要することなくその効果を発 揮するワクチンである。通常、それは、標的に対して反応性の抗体分子を含む。 この抗体は、供与対象から得て、受容者に投与するのに十分な程度に精製しても よく、あるいは、抗体は、例えば、ハイブリドーマ細胞の培養から、または抗体 分子をコードするポリヌクレオチドを遺伝子操作することによりインビトロで製 造してもよい。 「能動ワクチン」は、受容者内で特異的な免疫応答を惹起するために投与され 、標的に対する所望の免疫学的反応性を有するワクチンである。能動ワクチンは 、適当な免疫原を含む。望まれる免疫応答は、液性または細胞性、全身性または 分泌性、あるいはこれらの任意の組み合わせであってもよい。 「試薬」ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体は、反応のために提供さ れる、反応のためのいくつかの望ましい公知パラメーターを有する物質である。 また、反応混合物は、該試薬が反応しうるポリヌクレオチド、抗体、ポリペプ チドなどの「標的」を含有していてもよい。例えば、いくつかの型の診断試験で は、サンプル中の標的の量は、試薬を加え、試薬と標的とを反応させ、反応生成 物の量を測定することにより測定することができる。臨床処置の場合、「標的」 は、細胞、細胞の集まり、または投与物質（例えば、医薬化合物）の対象器官で あってもよい。ウイルス感染の標的である細胞は、複製または形質転換して潜伏 形態にする目的のためにウイルスが優位に局在する細胞である。 「単離」されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体または他 の物質は、該物質または同様の物質が天然に存在しているか又は最初に得られた 場合に存在する他の成分の少なくともいくつかを欠く物質の調製物を意味 する。したがって、例えば、単離された物質は、起源混合物からそれを富化させ る精製技術を用いることにより調製することができる。富化度(enrichment)は、 溶液の容量当たりの重量などの絶対的な基準に基づき測定することができるし、 あるいは、それは、起源混合物中に存在する第２の潜在的な阻害物質に関して測 定することができる。本発明の実施態様の富化度を増加させることが、より一層 好ましい。したがって、例えば、２倍の富化が好ましく、10倍の富化がより好ま しく、100倍の富化がさらに好ましく、1000倍の富化がより一層好ましい。物質 は、化学合成または組換え発現などの人工的な集合方法により、単離された状態 で得ることができる。 反応で使用するポリヌクレオチド（例えば、ハイブリダイゼーション反応で使 用するプローブ、PCRで使用するプライマー、または医薬製剤中に存在するポリ ヌクレオチド）は、それが、意図される標的に対して、別の物質に対する場合よ り頻繁に、より迅速に、あるいはより長い持続時間でハイブリダイズまたは反応 する場合には、「特異的」または「選択的」であると称される。同様に、ポリペ プチドは、それが、意図される標的（例えば、リガンド、ハプテン、基質、抗体 または他のポリペプチド）に対して、別の物質に対する場合より頻繁に、より迅 速に、またはより長い持続時間で結合する場合には、「特異的」または「選択的 」であると称される。抗体は、それが、少なくとも１つの抗原認識部位を介して 、意図される標的に対して、別の物質に対する場合より頻繁に、より迅速に、あ るいはより長い持続時間で結合する場合には、「特異的」または「選択的」であ ると称される。ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体は、それが、特定の 基質の間の反応を、別の基質の間の反応の場合より著しい程度で、またはより長 い持続時間で抑制または阻害する場合、反応を「選択的に抑制」または「選択的 に阻害」すると称される。 「候補薬剤」または「候補薬物」は、治療可能性を有すると考えられる、効力 に関して試験される化合物である。候補薬物の「スクリーニング」は、該候補の 効力および／または特異性を評価しうるアッセイを行なうことを意味する。この 場合、「効力」は、該候補を有益な方法で投与する細胞または器官に対して該候 補が影響を及ぼす能力（例えば、侵襲性ウイルスによる病状の抑制）を意 味する。 医薬製剤の「エフェクター成分」は、標的細胞を保持する対象に投与された場 合に所望の方法で機能を改変することにより標的細胞を修飾する成分である。い くつかの改善された医薬製剤はまた、該エフェクター成分を標的部位へより有効 に送達するのを助ける抗体などの「標的化成分」を有する。所望の作用に応じて 、該エフェクター成分は、多数の作用様式の任意の１つを有していてもよい。例 えば、それは、細胞の正常な機能を維持または増強しうるし、細胞の異常な機能 を除去または抑制しうるし、あるいは細胞の表現型を改変しうる。あるいは、そ れは、ウイルス感染細胞などの病理学的特徴を有する細胞を殺したり、休止させ うる。エフェクター成分の具体例は、後の節で記載する。 「細胞系」または「細胞培養」は、in vitroで増殖または維持される高等な真 核細胞を示す。細胞の子孫は、親細胞と完全に同一（形態、遺伝子型または表現 型のいずれかについて）でなくてもよいと理解される。 「宿主細胞」は、外因性ポリヌクレオチドの投与により形質転換された又は形 質転換されうる細胞である。「宿主細胞」には、もとの形質転換体の子孫が含ま れる。 「遺伝的改変」は、自然の細胞分裂以外により、遺伝的要素が細胞内に導入さ れるプロセスを意味する。その要素は、該細胞に対して異種であってもよく、そ れは、該細胞内に既に存在する要素の追加的コピーまたは改善型であってもよい 。遺伝的改変は、例えば、公知の任意の方法、例えばエレクトロポレーション、 リン酸カルシウム沈殿法、ポリヌクレオチド−リポソーム複合体との接触、また はＤＮＡまたはＲＮＡウイルスまたはウイルスベクターでの形質導入または感染 により、組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェク ションすることにより行なうことができる。該改変は、該改変細胞の子孫に遺伝 しうることが好ましいが、必ずしもその必要があるわけではない。 「個体」は、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを意味し、家畜、愛玩動物 および霊長類（ヒトを含む）を含むが、これらに限定されるものではない。 本明細書で用いる「霊長類」なる用語は、哺乳動物種の最も高等な目の任意 のメンバーを意味する。これは、キツネザル、スローロリスなどの原猿類；メガ ネザルなどのメガネザル属動物；リスザル(サイミリ・シウレウス(Saimiri sciu reus))、タマリンなどの新世界ザル；マカクなどの旧世界ザル(マカカカ・ネメ ストリナ(Macaca nemestrina)、マカカ・ファシクラリス(Macaca fascicularis) およびマカカ・フスカタ(Macaca fuscata))；ギボン、フクロテナガザルなどの テナガザル属動物；オランウータン、ゴリラ、チンパンジーなどの類人猿；およ びヒトなどのヒト科動物を含むが、これらに限定されるものではない。 ヘルペスウイルス感染により引き起こされる「病理」は、宿主の健康状態また は正常な生理を損なうあらゆるものである。これは、未だ感染していない細胞内 へのウイルスの破壊的侵襲、該細胞の正常な代謝を犠牲にするウイルスの複製、 ウイルスによる毒素または他の非天然分子の産生、細胞または細胞内構造物の不 規則な増殖(繊維症など)、感染細胞の正常でないまたは抑制された生化学的活性 、悪性形質転換、隣接細胞の正常な機能の阻害、炎症応答または免疫応答の悪化 または抑制、および他の病原生物または状態に対する感受性の増大を含むことが あるが、これらに限定されるものではない。 個体または細胞の「治療」は、個体または細胞の自然の経過を改変させるため の任意の型の介入である。例えば、個体の治療は、該個体に感染するヘルペスウ イルスにより引き起こされる病理を減少または抑制するよう行なってもよい。治 療は、医薬組成物などの組成物の投与を含み(これらに限定されるものではない) 、予防的または治療的に病理事象の開始または病原体との接触の後に行なうこと ができる。 臨床または生物学的「サンプル」は、対象から得られin vitro法（例えば、診 断試験）で有用な種々のサンプル型を包含すると理解される。その定義は、外科 的切除物、病理標本または生検標本、組織培養またはそれに由来する細胞および その子孫、およびこれらの任意の供給源から調製される切片またはスミアとして 得られる固形組織サンプルを包含する。非限定的な具体例は、感染部位、繊維症 部位、未罹患部位および腫瘍から得られるサンプルである。その定義はまた、血 液、脊髄液、および生物由来の他の液体サンプルをも包含し、それらや液体培地 およびその溶質に懸濁された細胞または細胞断片のいずれかを 意味することがある。その定義はまた、ある特定の成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮ Ａ、タンパク質または抗体）に関して可溶化または富化されたサンプルをも含む 。 本明細書に記載するオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、次のよ うに命名されている。すなわち、名称の最初の部分は、基礎となるポリペプチド の保存領域の一部（通常は４残基長）に対する単一のアミノ酸コードである。こ れに続くＡまたはＢの文字は、それぞれ、該オリゴヌクレオチドがコード領域の センス鎖またはアンチセンス鎖と相補的であることを示す。配列決定および標識 化反応に用いる第２のコンセンサスオリゴヌクレオチドには、その名称の最後に SQの文字が付されている。 一般的技術 本発明の実施においては、特に記載しない限り、当業界の技術の範囲内に含ま れる分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の通常の技術を用いる。 このような技術は文献中に十分に記載されている。例えば、“Molecular Clonin g:A Laboratory Manual”，第二版(Sambrook，Fritsch & Maniatis，1989)，“O ligonucleotide Synthesis”(M.J．Gait編,1984),“Animal Cell Culture”(R.I .Freshney編，1987);“Methods in Enzymology”シリーズ(Academic Press，Inc .);“Handbook of Experimental Immunology”(D.M．Weir & C.C．Blackwell編) ,“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(J.M．Miller & M.P．Calos 編，1987),“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M．Ausubelら編，1 987);及び“Current Protocols in Immunology”(J.E．Coliganら編，1991)を参 照されたい。 本明細書中に記載の特許、特許出願、論文及び刊行物は全て(前掲及び後掲の いずれも)、引用により本明細書中に含まれるものとする。ヘルペスウイルスRFHV/KSHV亜科の糖タンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチ ド 本発明は、糖タンパク質Ｂポリペプチドの断片をコードするヘルペスウイルス 中に存在する糖タンパク質Ｂ遺伝子に由来する単離されたポリヌクレオチドセグ メントを具体化する。該ポリヌクレオチドは、ヘルペスウイルスのRFHV/KSHV亜 科に関連する。典型的なポリヌクレオチドは、RFHVまたはKSHVのいずれか由来の 糖タンパク質Ｂ断片をコードする。好適な断片には、図１に示す断片及びそのサ ブ断片が含まれ、後述の実施例に記載のようにして得られる。配列番号１、配列 番号３もしくは配列番号96の残基36〜354の配列を含むポリヌクレオチド、また は配列番号92に含まれるポリヌクレオチドが特に好適である。 RFHV及びKSHVの残基36〜354のポリヌクレオチドセグメントは76％同一である 。共有されている残基を図１中「^*」で示す。このセグメント内においてRFHVとK SHVとの間で等しく共有される最も長いサブ領域は、15、17及び20ヌクレオチド 長である。 増幅プライマー結合部位間にあるRFHV及びKSHVの319塩基対断片の相互の同一 性は、既に配列決定されているいずれのヘルペスウイルスの塩基対断片に対する これらのうちの一方の同一性よりも高い。２番目に密接な関連性を有する配列は sHV1及びbHV4である。これらの配列は、対応するKSHVの配列に対して63％同一で あり、対応するRFHVの配列に対して60％同一である。糖タンパク質Ｂ断片と既に 配列決定されている任意のウイルスとの間で共有される連続塩基の最大数は14で ある。16塩基対以上のRFHVまたはKSHV配列のサブ断片は、いずれもRFHV/KSHV亜 科またはその亜科に含まれる特別のヘルペスウイルス種及び変異体に特有のもの であると考えられる。 本発明は、RFHV/KSHV亜科の糖タンパク質Ｂ遺伝子に含まれるサブ断片、好ま しくは配列番号１、配列番号３もしくは配列番号96の残基36〜354の319塩基対断 片に対応する領域、または配列番号92のどこかに含まれるサブ断片を具体化する 。好ましくは、サブ断片は、少なくとも約16ヌクレオチド長であり、より好まし くは少なくとも18ヌクレオチド長であり、よりこのましくは少なくとも21ヌクレ オチド長であり、より好ましくは少なくとも約25ヌクレオチド長であり、より好 ましくは少なくとも約35ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは少なくとも約 50ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは少なくとも約75ヌクレオチド長であ り、さらに好ましくは100ヌクレオチド長以上である。また、各ヘルペスウイル ス糖タンパク質Ｂのオープンリーディングフレームの全長を含むポリヌ クレオチドも本発明で具体化する。 RFHV/KSHV亜科は、RFHVまたはKSHVと表１に列挙した他の任意のウイルスとの 同一性よりも、RFHVまたはKSHVの対応配列に対する同一性が高い配列を有するメ ンバーからなる。その科の好適なメンバーは、図１の配列に対応する領域内の糖 タンパク質Ｂ遺伝子の配列に基づいて同定することが可能である。表２にはこの 領域における配列の同一性を示す。 配列の同一性（％）は、まずコード化アミノ酸配列を並べ、コードするポリヌ クレオチドの対応するアライメントを決定し、次いで各整列位置で配列を比較し 、共有されている残基数を計数することにより計算する。挿入または欠失があっ てもペナルティーとしないが、挿入または欠失は、整列させる配列の１つにおい て明らかにアミノ酸残基の数を増加させる必要がある場合にのみ許容する。単に 配列アライメントを向上させるために挿入を帳消にすることは、ポリペプチドま たはポリヌクレオチドのいずれのレベルにおいても許されない。従って、ポリヌ クレオチド配列内の挿入はいずれも３の倍数の長さを有することになる。比較ま たは参照配列中の残基と同一である試験配列中の残基について％を求める。 本発明の好適な糖タンパク質Ｂコードポリヌクレオチド配列は、RFHV/KSHVヘ ルペスウイルス亜科由来のものである。該配列は、RFHVまたはKSHV配列の塩基36 〜354と少なくとも65％同一であり、より好ましくは少なくとも67％同一であり 、より好ましくは少なくとも約70％同一であり、より好ましくは少なくとも約75 ％同一であり、より好ましくは少なくとも約80％同一であり、より好ましくは 少なくとも約85％同一であり、より好ましくは少なくとも約90％同一であり、さ らに好ましくは95％よりも高い同一性である。前記の同一性基準を満たす領域の 上流または下流に位置する糖タンパク質Ｂコード領域も含まれる。 他の好適な糖タンパク質Ｂコードポリヌクレオチド配列は、後記の節でより詳 細に記載するRFHV/KSHV亜科に特異的なオリゴヌクレオチド（２型オリゴヌクレ オチド）との同一性（％）で同定することが可能である。RFHV及びKSHV糖タンパ ク質Ｂと典型的な２型オリゴヌクレオチドとの同一性（％）を表３に示す。 この長さのオリゴヌクレオチドの場合には、アライメントをとるため、オリゴ ヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれにおいてもギャップが生じないように して同一性（％）を計算する。本開示中、比較すべき２つの配列の少なくとも一 方がアンビギュアス残基を含む縮重オリゴヌクレオチドである場合、縮重オリゴ ヌクレオチドの別型の少なくとも１つが比較すべき配列と同一であれば、２つの 配列は同一であるとする。例えば、AYAAAはATAAAとACAAAとの混合物であるため 、AYAAAはATAAAと100％同一である。 好適な糖タンパク質Ｂコード配列は、対応する領域にわたってSHMDAに対して 少なくとも72％同一なものであり、より好ましくは少なくとも74％同一、より好 ましくは少なくとも約77％同一、より好ましくは少なくとも約80％同一、より好 ましくは少なくとも約85％同一、より好ましくは少なくとも約91％同一なもので ある。他の好適な糖タンパク質Ｂコード配列は、対応する領域にわたってCFSSB に対して少なくとも71％同一なものであり、より好ましくは少なくとも73％同一 、より好ましくは少なくとも約77％同一、より好ましくは少なくとも約80％同一 、より好ましくは少なくとも約85％同一なものである。他の好適な糖タンパク質 Ｂコード配列は、対応する領域にわたってENTFAに対して少なくとも70％同一な ものであり、より好ましくは少なくとも72％同一、より好ましくは少なくとも約 75％同一、より好ましくは少なくとも約80％同一、より好ましくは少なくとも約 85％同一、より好ましくは少なくとも約89％同一なものである。他の好適な糖タ ンパク質Ｂコード配列は、対応する領域にわたってDNIQBに対して少なくとも約7 8％同一なものであり、より好ましくは少なくとも80％同一、より好ましくは少 なくとも約85％同一、より好ましくは少なくとも約91％同一なものである。前記 の同一性基準を満たす領域の上流または下流に位置する糖タンパク質Ｂコード領 域も含まれる。 RFHVもしくはKSHVのいずれかの配列またはRFHV/KSHV亜科特異的オリゴヌクレ オチドを用いる上述のいずれかの配列比較により同定されるRFHV/KSHV亜科のメ ンバーに由来する糖タンパク質Ｂコード配列が、等しく好適である。典型的な配 列は、RFHV及びKSHVの糖タンパク質Ｂコード配列である。本発明では、該亜科の 糖タンパク質Ｂコード配列の任意の断片、及びこのようなポリヌクレオチド断片 を含む長鎖ポリペプチドも具体化する。 本節に記載のポリヌクレオチド配列は、後続の節で概説する合成オリゴヌクレ オチド、タンパク質及び抗体を得るための基礎となる。これらの化合物は、以下 に記載するとおり、当業者に公知の標準的な技術によって調製することができ、 多くの研究、診断及び治療の目的に使用することができる。ポリヌクレオチドの調製 本発明のポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、当業界で公知の任意の 適切な方法によっても調製することが可能である。例えば、後述する実施例３及 び実施例11で記載するとおり、ヘルペスウイルス感染組織から得たＤＮＡのPCR 増幅においてオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。あるいは 、後記実施例８で記載するとおり、適切な細菌クローンのＤＮＡライブラリーの 同定にオリゴヌクレオチドを用いることができる。 ポリヌクレオチドは、本発明で提供する配列から化学合成によって直接調製す ることも可能である。トリエステル法や亜リン酸法などいくつかの合成法が当業 界で公知である。好適な方法では、モノヌクレオシドホスホルアミダイトカップ リング単位を用いる固相合成により、ポリヌクレオチドを調製する。例えば、Ho riseら，Beaucageら，Kumarら及び米国特許第4,415,732号を参照されたい。 典型的な固相合成は、脱保護、カップリング、キャッピング及び酸化の４つの 段階を繰り返すものである。これにより、3'から5'方向へオリゴヌクレオチドが 段階的に合成される。 第一段階では、(-O-)基を介して3'末端にて固体支持体に結合した成長中のオ リゴヌクレオチドの5'末端を脱保護する。例えば、ピリジン中で4,4'-ジメトキ シトリチルクロライド(DMT-Cl)と反応させることにより形成した-ODMT基で5'末 端を保護することが可能である。この基は、塩基性条件下では安定であるが、酸 性条件下、例えばジクロロ酢酸(DCA)またはトリクロロ酢酸(TCA)の存在下では容 易に除去される。脱保護により、5'-OH反応性基が生成する。 第二段階では、オリゴヌクレオチドを所望のヌクレオチドモノマーと反応させ る。該ヌクレオチドモノマーは、まず5'-保護された3'-ホスホルアミダイトへ変 換しておく。該モノマーの5'-OHは、例えば-ODMT基の形で保護することができ、 3'-OH基は-OP(OR')NR₂［式中、Rはイソプロピル基-CH(CH₃)₂であり、R'は例えば -H(ホスホルアミダイトジエステルを生成する)、または-CH₃、-CH₂CH₃、または β-シアノエチル基-CH₂CH₂CN（ホスホルアミダイトトリエステルを生成する）で ある］等のホスホルアミダイトに変換することができる。該モノマーの3'-ホス ホルアミダイト基は成長中のオリゴヌクレオチドの5'-OH基と反応して、亜リン 酸結合5'-OP(OR')O-3'を生成する。 第三段階では、合成をさらに進める前に該モノマーとカップリングしていない オリゴヌクレオチドを回収し、不完全なポリマーが形成するのを防ぐ。これは、 残存している5'-OH基を、例えば、無水酢酸(CH₃C(O)-O-C(O)CH₃)と反応させるこ とによってアセテート(-OC(O)CH₃)の形でキャッピングすることにより達成され る。 第四段階では、新たに形成した亜リン酸基（即ち、5'-OP(OR')O-3'）を、例え ば、水性ヨウ素及びピリジンと反応させることによって酸化し、リン酸基（即ち 、5'-OP(=O)(OR')O-3'）とする。 工程の終了時に得られるオリゴヌクレオチドは5'-保護されており、第一段階 へ使用できる状態にあるため、該４段階工程を繰り返してもよい。所望の完全長 オリゴヌクレオチドが得られたら、例えば、アルカリ及び熱で処理して固体支持 体より切り離すことが可能である。この段階では、リン酸トリエステル（即ち、 R'が-Hでない場合）をリン酸ジエステル(-OP(=O)₂O-)へ変換し、ヌクレオチド塩 基の塩基不安定な保護アミノ基を脱保護することも可能である。 これらの任意の方法で調製したポリヌクレオチドを、PCR増幅または遺伝子ク ローニング等の標準的な任意の技術によって複製し、大量に供給することができ る。糖タンパク質Ｂコードポリヌクレオチドを含むクローニング及び発現ベクター 本発明では、ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂまたはその変異体またはその断 片をコードする配列を含むクローニングベクター及び発現ベクターを提供する。 適切なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築するか、あるいは当 業界で入手可能な多くのクローニングベクターから選択してもよい。使用する宿 主細胞に応じて、選択するクローニングベクターが変わることがあるが、有用な クローニングベクターは、一般に、自己複製能力を有し、特定の制限エンドヌク レアーゼに対して単一の標的を有し、トランスフェクトされたクローンの選択に 使用できるマーカー用遺伝子を保持するものである。適切な例としては、プラス ミド及び細菌ウイルス、例えば、pUC18、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pC R1、RP4、ファージＤＮＡ、並びにpSA3及びpAT28等のシャトルベクターが挙げら れる。 発現ベクターは、通常、適切な転写制御エレメント及び翻訳制御エレメントに 機能的に結合したポリペプチドをコードする複製可能なポリヌクレオチド構築物 である。転写制御エレメントの例としては、プロモーター、エンハンサー、転写 開始部位、及び転写終結部位が挙げられる。翻訳制御エレメントの例としては、 リボソーム結合部位、翻訳開始部位、及び停止コドンが挙げられる。また、タン パク質プロセシングエレメント、例えば、ポリペプチドが膜を通って移動したり 細胞から分泌されたりするのに必要なリーダーペプチドまたはシグナルペプチド 及びプロテアーゼ切断部位をコードする領域が含まれることもある。使用するエ レメントは、発現に用いる宿主細胞内で機能し得るはずである。制御エレメント は、ベクターで用いるのと同一の糖タンパク質Ｂ遺伝子に由来するものであって もよいし、また、異種（即ち、他の遺伝子及び／または他の生物由来）のもので あってもよい。 ポリヌクレオチドは、当業界で公知の任意の手段により宿主細胞中へ挿入する ことができる。適切な宿主細胞としては、細菌細胞、例えば大腸菌(E.coli)、マ イコバクテリア、その他の原核微生物及び真核細胞（真菌細胞、昆虫細胞、植物 細胞及び動物細胞を含む）が挙げられる。直接的な取り込み、エンドサイトーシ ス、トランスフェクション、f-接合(f-mating)、またはエレクトロポレーション によって外因性ポリヌクレオチドを挿入することにより、該細胞を形質転換させ る。次いで、外因性ポリヌクレオチドを、プラスミド等の非組み込みベクターと して細胞内で維持してもよいし、あるいは宿主細胞ゲノム中へ組み込んでもよい 。 クローニングベクターは、ベクター中に含まれるポリヌクレオチドの複製コピ ーを得るのに用いることができ、また、後で回収を行えるよう受託機関において ポリヌクレオチドを保存する手段として用いることができる。発現ベクター及び 宿主細胞は、ベクター中に含まれるポリヌクレオチドによって転写されたポリペ プチドを得るのに用いることができる。これらはまた、無傷の細胞に該ポリペプ チドの合成能を付与するのが望ましいアッセイ（薬剤スクリーニングアッセイ等 ）にも用いることができる。ガンマヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｂのための合成１型オリゴヌクレオチド 本発明で具体化するヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂの配列より設計したオリ ゴヌクレオチドは、関連配列を同定するためのプローブとして、またはPCR等の 増幅反応におけるプライマーとして用いることができる。 特性の異なる各種オリゴヌクレオチドを以下の節で記載する。１型と呼ばれる オリゴヌクレオチドは、既知のガンマヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂポリヌク レオチド配列より設計する。該オリゴヌクレオチドは、任意のガンマヘルペスウ イルス糖タンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするよう に設計されており、既知のガンマヘルペスウイルス種を検出するのに用いること ができる。該オリゴヌクレオチドを使用して、新規なガンマヘルペスウイルス種 を検出及び特性決定することもできる。２型と呼ばれるオリゴヌクレオチドは、 RFHV及びKSHV糖タンパク質Ｂポリヌクレオチド配列の両方から設計する。該オリ ゴヌクレオチドは、RFHV/KSHV亜科（RFHV及びKSHVを含むがこれらに限られない ）の糖タンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするように 設計されている。３型と呼ばれるオリゴヌクレオチドは、個々のウイルスに対し て比較的特異的なRFHVまたはKSHV糖タンパク質配列から設計する。該オリゴヌク レオチドは、RFHVまたはKSHV及び密接な関連性を有するウイルス種のみに由来す る糖タンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする ように設計されている。 １型オリゴヌクレオチドの好適な例を、いくつか表４に挙げる。これらのオリ ゴヌクレオチドは、広範囲のヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｂコードポリヌク レオチドに対して特異性を有する。 表４に示した向きは、ポリヌクレオチドのコード領域に対するものである。「 センス」方向を有するオリゴマーは、コード鎖に対してアンチセンスな鎖とハイ ブリダイズし、コード配列の方向で増幅を開始するものである。「アンチセンス 」方向を有するオリゴマーは、コード鎖とハイブリダイズし、コード配列の逆方 向で増幅を開始するものである。 これらのオリゴヌクレオチドは、以下の複数の特性に留意して設計されている ：即ち、１）標的ＤＮＡに対する感度(起源物質中に非常に少ないコピー数で存 在する場合であっても)、２）目的としない配列（例えば、限定された類似性を 有する宿主配列）とのハイブリダイズを回避するのに十分な特異性、３）未知の 標的とその設計に使用する配列との相違により、オリゴヌクレオチドが該標的と 安定な二重らせんを形成するのを妨げない程度に十分な交差反応性。 いくつかの適用では、特に有効な設計は、3'末端に縮重セグメントを有するオ リゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチド標的に対 してある程度保存されていると考えられる少なくとも２つの公知のポリヌクレオ チドの領域から設計される。アンビギュアス残基の種々の順列によって、オリゴ ヌクレオチドの他の形態の少なくとも１つが標的と確実にハイブリダイズできる ようになる。オリゴヌクレオチドの5'末端で縮重セグメントに隣接するのは、形 成し得る二重らせんを強化し、より高温で行なうハイブリダイゼーションまたは 増幅反応を許容するコンセンサスセグメントである。縮重セグメントは分子の3' 末端に位置しており、ポリメラーゼ連鎖反応中に伸長が開始する部位においてオ リゴヌクレオチドと標的とが厳密に対合する可能性を高める。 該配列の縮重部分に含まれるアンビギュアス残基を以下の記号により示す。 表４に示す１型オリゴヌクレオチドは、通常、糖タンパク質Ｂコードポリヌク レオチドセグメントとハイブリダイズさせるのに有用である。これにより、該ポ リヌクレオチドの有無を検出したり、増幅反応を引き起こしてポリヌクレオチド の特性をさらに決定することが可能である。適切な標的には、RFHV/KSHV亜科の メンバーを含む広い範囲のガンマヘルペスウイルスに由来する糖タンパク質Ｂの 領域をコードするポリヌクレオチドが含まれる。ヒト及びヒト以外の霊長類を含 む任意の脊椎動物に感染するガンマヘルペスウイルスが適しており、該糖タンパ ク質Ｂまたは該ウイルスが公知であるかまたは記載されているか否かには係わら ない。限定するものではないが、例として、表１に記載の任意のガンマヘルペス ウイルスに由来する糖タンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチドが挙げられる 。 オリゴヌクレオチドは、とりわけ、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする 部位から3'方向へ標的ポリヌクレオチドの領域を増幅する反応を引き起こすため に用いることができる。FRFDA、HIVPA、TVNCB、FAYDA、IYGKA、CYSRA、NIDFB、F REYA、FREYB、NVFDB、GGMA及びTVNCAは、縮重セグメントに隣接するコンセンサ スセグメントを有するオリゴヌクレオチドであり、この目的に有用なものである 。 図２に、上述のオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズすると予想さ れる位置を、RFHV/KSHV亜科の糖タンパク質Ｂポリヌクレオチド配列と共に示す 。地図は一定の倍率で描かれているわけではないが、予測されるハイブリダイゼ ー ション部位の順番を糖タンパク質Ｂコード鎖に沿って5'から3'へ向かって正確に 示している。また、増幅反応において各種組み合わせのプライマーを用いて生成 し得る増幅産物のおおよその長さも示す。図に示した長さには、各末端における プライマー結合部位及びプライマーとプライマーの間に挟まれたポリヌクレオチ ドが含まれる。 表４に記載のオリゴヌクレオチドの標的として使用するＤＮＡの好適な起源は 、ヘルペスウイルスが潜伏していることが判っているかまたはその可能性がある 任意の生物学的サンプル（固体組織及び組織培養物を含む）であり、特に脊椎動 物由来のものである。有機溶剤による抽出または高い塩濃度での沈澱等の当業界 で公知の任意の方法により、前記起源からＤＮＡを抽出する。 好適な増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応である(概説としては米国特許第4,6 83,195号(Mullis)及び米国特許第4,683,202号(Mullisら)を参照、ウイルス性ポ リヌクレオチドへの適用については米国特許第5,176,995号(Sninskyら)を参照さ れたい)。増幅反応は、増幅すべき標的ポリヌクレオチドを、標的とハイブリダ イズして重合反応のプライマーとして作用し得る短いオリゴヌクレオチドと組み 合わせることにより行なうことができる。基質モノヌクレオチドや耐熱性ＤＮＡ 依存性糖タンパク質Ｂ（Taq等）を加えてもよい。増幅反応に用いる条件は、通 常当業界で公知であり、RFHV、KSHV、hEBVまたはHSV1等の公知のウイルスの起源 を用いて実験的に最適化することができる。例えば、増幅サイクル(特にハイブ リダイゼーション段階)の時間と温度を変えたり、オリゴヌクレオチドプライマ ーのモル濃度を変えたり、緩衝液の組成を変えたり、増幅サイクルの回数を変え ることにより、条件を変えることができる。増幅条件の微調整は、当業者にとっ ては通常の作業である。 １つの方法では、任意に第二プライマー（ランダムプライマー等）を用いる増 幅反応において本発明の単一プライマーを用い、第一プライマーから下流方向へ 及び逆方向へ複製を開始させる。好適な方法では、同じ反応に本発明のプライマ ーの少なくとも２つを用いて、複製を逆方向に開始させる。少なくとも２つの特 異的なプライマーを用いることにより、増幅反応の特異性が高められ、サンプル どうしを比較するための断片のサイズが限定される。例えば、プライマーNIVPA とTVNCBを用いて増幅を行なうことができる。より好ましくは、ネステッド様式( nested fashion)においていくつかのプライマーのセットを組み合わせて増幅を 増強する。ネスティングは、追加プライマーに対して１個以上の内部結合部位を 含む中間産物を生成するプライマーを用いて第一次増幅を行なうことにより達成 される。次いで、新しいプライマーを上述のプライマーの１つと組み合わせて用 いるか、あるいは２つの新しいプライマーを用いて第二次増幅を行なう。従って 、第二次増幅産物は第一次増幅産物のサブ断片である。所望であれば、追加プラ イマーを用いてさらに数次の増幅を行なうことができる。 従って、センス方向を有する少なくとも１つのプライマーとアンチセンス方向 を有する１つのプライマーを含む３つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを任 意に組み合わせて、ネスティング増幅反応を行なうことができる。好ましくは、 中間増幅産物が約2000塩基対以下、より好ましくは約1500塩基対以下、さらに好 ましくは約750塩基対以下となるようにプライマーを選択する。好ましくは、最 も内側のプライマーから、約1200塩基対以下、より好ましくは約750塩基対以下 、さらに好ましくは約500塩基対以下の最終増幅産物を得る。従って、好適な組 み合わせは、FAYDA、IYGKA、CYSRA、NIDFB、NVFDB及びFREYBから選択される少な くとも３つのプライマーである。別の好適な組み合わせは、FRFDA、NIVPA、TVNC A、NIDFB、NVFDB及びFREYBから選択される少なくとも３つのプライマーである。 特に好適なのは、プライマーFRFDA及びTVNCBを用いる第一次増幅、これに続く プライマーNIVPA及びTVNCBを用いる第二次増幅である。KSHVの糖タンパク質Ｂ遺 伝子に由来するポリヌクレオチド上で行なう場合、プライマー結合領域を含む最 終断片のサイズは約386塩基である。 増幅させたポリヌクレオチドは、例えば、サイズを決定することにより、増幅 反応中のいずれの段階でも特性を決定することができる。好ましくは、サイズの 決定は、約１〜２％のアガロースゲル上でポリヌクレオチドを泳動させて行なう 。ゲル中のポリヌクレオチドは、十分な量が含まれていれば、臭化エチジウムで 染色し、紫外線下で検出することができる。あるいは、約６％のポリアクリルア ミドゲル上にロードする前に、ポリヌクレオチドを³²Ｐまたは³⁵Ｓ等の放射性同 位体で標識し、次いで該ゲルを用いてオートラジオグラム得ることができる。増 幅させたポリヌクレオチドを標識する好適な方法は、ポリヌクレオチドキナーゼ とγ-[³²P]-ATPを用いてNIVPA等のオリゴヌクレオチドプライマーを³²Ｐで末端 標識し、増幅を約５〜１５サイクル繰り返すものである。 所望ならば、増幅ポリヌクレオチドを調製する１つの段階としてサイズ分離を 用いることも可能である。サイズ分離は、増幅混合物にサイズの異なる人工ポリ ヌクレオチド（目的としない標的との交差反応性により生じ得る）が含まれてい る場合に特に有用である。先の段落に記載したような分離用ゲルは、ペーパーバ ッキング上で乾燥させ、オートラジオグラムの作製に使用する。オートラジオグ ラム上の所望のバンドに対応するゲルの箇所を切り出し、標準的な技術によって 抽出する。次いで抽出したポリヌクレオチドを直接特性決定し、クローニングし 、またはさらに増幅させることができる。 オリゴヌクレオチドNIVPASQ、TVNCBSQ、IYGKASQ、CYSRASQ及びNIDFBSQは、各 々コンセンサス縮重１型オリゴヌクレオチドに由来する。これらのオリゴヌクレ オチドは、コンセンサスセグメントを保持するが縮重セグメントを欠いている。 該オリゴヌクレオチドは、コンセンサス縮重オリゴヌクレオチドを用いて増幅に 成功した糖タンパク質Ｂポリヌクレオチド断片の配列決定に特に有用である。 また、増幅反応で得られた混合物中に含まれる目的としないポリヌクレオチド は、この種のプライマーに代えることによって比例的に減少させることもできる 。例えば、増幅の最初の３〜５サイクルは、プライマーNIVPA及びTVNCBの使用量 を通常の1/5〜1/25にして行なうことができる。次いでモル過剰(例えば50pmol) のNIVPASQ及び／またはTVNCBSQを添加し、増幅をさらに30〜35サイクル続ける。 これにより、増幅混合物中に含まれるオリゴヌクレオチドの複雑度が減少し、反 応温度を上昇させて目的としないポリヌクレオチドの増幅を減少させることが可 能となる。RFHV/KSHV 亜科の糖タンパク質Ｂのための２型オリゴヌクレオチドプライマー ２型オリゴヌクレオチドは、RFHV/KSHV亜科の任意のウイルスの糖タンパク質 Ｂの検出または増幅反応を意図するものである。該オリゴヌクレオチドは、RFHV とKSHV（既に配列決定されている他のガンマヘルペスウイルスではない）の間で 比較的良く保存されている糖タンパク質Ｂコード領域のセグメントより設計する 。好適な例を表６に挙げる。 ２型オリゴヌクレオチドは、RFHV/KSHV亜科特異性に対する特異性が要求され る多くの目的に使用することができる。例としては、RFHV/KSHV亜科の公知のウ イルスからの糖タンパク質Ｂの検出または増幅、あるいは該科の新規なメンバー からの糖タンパク質Ｂの特性決定等が挙げられる。 SHMDA、CFSSB、ENTFA、及びDNIQBは、PCR増幅の初期プライマーとして有用な 縮重3'末端を有するコンセンサス縮重オリゴヌクレオチドであり、RFHVまたはKS HVのいずれとも同一でないRFHV/KSHV亜科のポリヌクレオチドが含まれる。SHMDA SQ、CFSSBSQ、及びDNIQBSQは、コンセンサスセグメントのみを含み、例えば、コ ンセンサス縮重オリゴヌクレオチドを用いて既に増幅させたポリヌクレオチドの 標識や配列決定に有用である。 １つの適用では、これらの２型オリゴヌクレオチドを、個々にまたは組み合わ せて増幅プライマーとして使用する。この適用の一例では、該オリゴヌクレオチ ドを、組織サンプルから得たＤＮＡ上で直接使用し、RFHV/KSHV亜科（hEBV、hCM VまたはHSV1等の同一組織内に存在し得る関連性がさらに低いウイルスではない ）に由来する糖タンパク質Ｂを得る。従って、SHMDA及びDNIQBをPCRにおい てプライマーとして用いることができ、任意に、NIVPA及びTVNCB等の１型オリゴ ヌクレオチドを用いて予備増幅を行なってもよい。他の組み合わせも適切である 。別の例では、表６の２型オリゴヌクレオチドの１つを、先に挙げた適切な１型 オリゴヌクレオチドと組み合わせて使用する。従って、NIVPAはDNIQBと組み合わ せて、SHMDAはTVNCBと組み合わせて、PCRにおいてプライマーとして使用するこ とができる。ＤＮＡ起源は、NIVPA及びTVNCBを用いて任意に予備増幅させること ができる。また、他の組み合わせも適切である。 別の適用では、２型オリゴヌクレオチド、またはこれらの配列またはその断片 を含むオリゴヌクレオチドを、検出アッセイにおいてプローブとして使用する。 例えば、該オリゴヌクレオチドを³²Ｐ等の適切な標識で標識し、次いでFRFDA及 び／またはNIVPAとTVNCBとを用いて増幅させたＤＮＡ等の適切な標的とのハイブ リダイゼーションアッセイで使用することができる。RFHV またはKSHVの糖タンパク質Ｂに特異的な３型オリゴヌクレオチドプライマー ３型オリゴヌクレオチドは、特定のウイルスに特異的な検出または増幅反応を 意図したものである。それらは、RFHVまたはKSHVの糖タンパク質Ｂコード領域の 非縮重セグメントであり、これらのセグメントは、該領域の他のセグメントと比 べて、これらの２つのウイルス間で、及び他のヘルペスウイルスに対して比較的 可変性である。好ましい具体例を表７及び実施例に示す。 GMTEB、AAITB、GMTEA、KYEIA、TDRDB、VEGLB、VEGLA及びPVLYAは、RFHV糖タン パク質Ｂに特異的な非縮重オリゴヌクレオチドであり、RFHV由来の糖タンパク質 Ｂコードポリヌクレオチドの増幅及び検出に使用することができる。増幅は、好 ましくは、ネステッド様式で該オリゴヌクレオチドを用いて行なう。例えば、G MTEA及びVEGLBをプライマーとして用いて第１増幅を行ない、ついでKYEIA及びTD RDBをプライマーとして用いて第２増幅を行なう。これにより、RFHV糖タンパク 質Ｂに特異的な非常に高感度な増幅アッセイが提供される。GMTEB及びAAITBは、 該断片の5'末端付近でハイブリダイズするものであり、配列を5'方向で増幅また は検出するために上流でハイブリダイズする１型オリゴヌクレオチドと組合せて 使用することができる。VEGLA及びPVLYAは、該断片の3'末端付近でハイブリダイ ズするものであり、配列を3'方向で増幅または検出するために下流でハイブリダ イズする１型オリゴヌクレオチドと組合せて使用することができる。 同様に、GLTEB、TNKYB、GLTEA、YELPA、VNVNB、ENTFB、SQPVA及びTVFLAは、KS HV糖タンパク質Ｂに特異的な非縮重オリゴヌクレオチドであり、増幅反応用プラ イマーなどとして同様の様式で使用することができる。好ましくは、該増幅は、 ネステッド様式にて該オリゴヌクレオチドを用いて行なう。例えば、GLTEA及びE NTFBをプライマーとして用いて第１増幅を行ない、ついでYELPA及びVNVNBをプラ イマーとして用いて第２増幅を行なう。これにより、KSHV糖タンパク質Ｂに特異 的な非常に高感度な増幅アッセイが提供される。GLTEB及びTNKYBは、該断片の5' 末端付近でハイブリダイズするものであり、配列を5'方向で増幅または検出する ために上流でハイブリダイズする１型オリゴヌクレオチドと組合せて使用するこ とができる。SQPVA及びTVFLAは、該断片の3'末端付近でハイブリダイズするもの であり、配列を3'方向で増幅または検出するために下流でハイブリダイズする１ 型オリゴヌクレオチドと組合せて使用することができる。 当業者であれば、糖タンパク質Ｂコードポリヌクレオチドの異なる部分を増幅 するために、１型、２型及び３型のオリゴヌクレオチド（特に、表４、６及び７ に示しているもの）を、PCRにおいて互いに組合せて使用しうることを即座に認 めることができるであろう。増幅反応の特異性は、一般に、最小量の交差反応性 を有するプライマーにより決定される。増幅された断片のサイズ及び位置は、最 終次の増幅で用いるプライマーにより決定される。例えば、NIVPAはSQPVBと併用 すると、KSHVと密接に関連しているウイルスに由来する糖タンパク質Ｂをコード するポリヌクレオチドの約310塩基を増幅するであろう。適当な組合せのオリゴ ヌクレオチドを、ネステッド様式で増幅プライマーとして用いてもよい。ポリヌクレオチド標的を特徴づけるための合成オリゴヌクレオチドの使用 前記の節で説明したとおり、本発明で具体化されるオリゴヌクレオチドは、ヘ ルペスウイルス糖タンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチドの増幅のためのプ ライマーとして、特にポリメラーゼ連鎖反応において使用することができる。 PCRを行なうための条件は、使用するオリゴヌクレオチドの性質に左右される 。特に、縮重セグメント、または標的の対応セグメントと一部のみが同じコンセ ンサスセグメントを含むオリゴヌクレオチドを使用する場合や、標的ポリヌクレ オチドが未知の配列を含む場合には、条件の選択が増幅の成功に重要となるであ ろう。新たなプライマーまたは新たなポリヌクレオチド標的のための条件を最適 化することは、当業者にとっては日常的なものである。以下は、その目的達成の 助けとなる１つの指標である。 第１に、PCRのアニーリング工程の温度を最適化して、増幅される標的ポリヌ クレオチドの量を、増幅される無関係なポリヌクレオチドの量より増加させる。 理想的には、その温度は、プライマーと標的配列とのハイブリダイズは許容する が、他の配列とのハイブリダイズは許容しない。コンセンサスセグメントを含む プライマー（１型）の場合、PCRの繰返しサイクルにおけるアニーリング工程の 温度は、一般には、少なくとも約45℃、好ましくは少なくとも約50℃である。ま た、PCRの最初の数サイクルを、より一層高い温度（例えば、55℃、あるいはさ らには60℃）で行なうのが好ましい。温度が高くなるほど、アニーリングは、サ イクル中で、より配列特異的となり、無関係な配列のバックグラウンド増幅が減 少するであろう。増幅速度を改善するために、後続のサイクルのアニーリング工 程は、少し低いストリンジェンシー条件下で行なってもよい。特に好ましい方法 においては、第１PCR増幅サイクルは、60℃で行なう約１分のアニーリング工程 を含む。後続のサイクルのアニーリング工程は、温度が50℃に達するまで、サイ クルごとに２℃低い温度で行なう。ついで、所望の増幅度が達成されるまで、50 ℃のアニーリング工程で後続のサイクルを行なう。 ウイルスに特異的でコンセンサスセグメントを含有しないプライマー（３型） が、より選択的であり、より広範囲の温度にわたって有効である。PCR増幅サイ ク ルのアニーリング工程に好ましい温度は、50℃〜65℃である。 第２に、緩衝条件を最適化する。本発明者らは、Taqポリメラーゼの市販の調 製物に供給する緩衝液は、マグネシウムイオン濃度に決定的に依存することなど から、使用が困難な場合があることを見出した。本発明のオリゴヌクレオチドを 用いて行なうPCRは、一般に、緩衝液（例えば、M．Wigler(Lisitsynら)により示 唆されているもの）を用いて、より容易に行われる。好ましくは、最終PCR反応 混合物は、主イオン源としてKClでなく(NH4)2SO4を含有する。好ましくは、最終 反応混合物中の(NH4)2SO4の濃度は、約５〜50mM、より好ましくは約10〜30mM、 より一層好ましくは16mMである。緩衝成分は、好ましくは最終濃度が約67mMでpH が約8.8の好ましくはトリスである。これらの条件下、MgCl2濃度は、それほど重 要ではない。好ましくは、最終濃度は約１〜10mM、より好ましくは約３〜６mM、 最適には約４mMである。該反応混合物はまた、約10mMのβ−メルカプトエタノー ル及び0.05〜１mg/mLのウシ血清アルブミンを含有する。特に好ましい緩衝液は 、WB4緩衝液（67mMトリス緩衝液(pH8.8)、４mM MgCl2、16mM(NH4)2SO4、10mMβ −メルカプトエタノール及び0.1mg/mLアルブミン）である。該反応を行なうため の好ましい条件は、以下の実施例３に記載する。 PCR反応を行なうために、オリゴヌクレオチドプライマー、４つのデオキシヌ クレオチド、適当な緩衝液、増幅すべきＤＮＡ、及び耐熱性ＤＮＡ依存性ＤＮＡ ポリメラーゼを含む混合物を調製する。ついで、所望の増幅度が達成されるまで 、アニーリング、伸長及び融解工程の温度サイクルにより該混合物を処理する。 得られたＤＮＡの量は、例えば、所望により増幅断片をアガロースゲル上で分離 した後、臭化エチジウムで染色することにより測定することができる。 該増幅反応で生じうる厄介な問題は、オリゴヌクレオチドプライマー自体の二 量化及び増幅である。これは、アガロースゲル上で低分子量（＜100塩基対）断 片として容易に検出することができる。増幅されたプライマーは、アガロースま たはポリアクリルアミドゲル分離により除去することができる。増幅された二量 体の量は、反応条件（特に、アニーリング工程の温度）を少し調整することによ り減少させることができる。また、プライマー、デオキシヌクレオチド及び緩衝 液を予め混合し、該混合物を80℃まで加熱してから、増幅すべきＤＮＡを加える の も好ましい。 本発明のいずれかのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる増幅反応か らは、糖タンパク質Ｂの一部をコードするポリヌクレオチド断片が得られる。こ れらの断片は、当業者に公知の多くの技術により特徴づけることができる。限定 するわけではないが、断片を特徴づける方法は、以下のとおりである。 １つの方法では、Maxam及びGilbert法、Sanger及びNicholson法などの当該技 術分野で公知の任意の配列決定法により、断片を配列決定することができる。あ るいは、ポリヌクレオチドの配列決定サービスを提供している任意の商業的機関 に断片を提出してもよい。配列決定の前に、所望により、断片をクローニング及 び／または増幅してもよい。ヌクレオチド配列は、該断片によりコードされるア ミノ酸配列を予想するために使用することができる。配列データは、ポリヌクレ オチドまたはアミノ酸のいずれかのレベルで、配列決定された他の糖タンパク質 Ｂと比較するために使用して、もとの起源物質中に存在するヘルペスウイルスの 種を同定することができる。配列データはまた、抗原領域または三次元構造を予 想するためのアルゴリズムのモデル化に使用することもできる。 特徴づけの第２の方法では、断片のサイズは、ポリアクリルアミドまたはアガ ロースゲル上を移動させたり、あるいは適当な密度勾配で遠心するなどの適当な 任意の方法により決定することができる。例えば、RFHV及びKSHVの場合、NIVPA とTVNCBとの間の断片は、約319塩基である。従って、プライマー結合領域を含む 完全な増幅断片の長さは、約386塩基である。sHV1の対応断片は、さらに６塩基 対を含有する。従って、例えば、分離ゲルの隣接レーンのそれぞれから増幅され たポリヌクレオチド断片を移動させることにより、あるいは適当な分子量標準と 並べてsHV1断片を移動させることにより、sHV1断片を、RFHVまたはKSHVの断片か ら識別することができる。RFHV及びKSHVの断片と同一サイズのポリヌクレオチド 断片は、同じかまたは密接に関連しているウイルス種に由来している可能性があ る。サイズが実質的に異なる断片は、異なるヘルペスウイルスに由来する可能性 がさらに高い。 特徴づけの第３の方法では、断片とオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリ ダイズを試みることにより、該断片を試験することができる。好ましい具体例で は、RFHVまたはKSHVの糖タンパク質Ｂコード領域に対する関連性に関して、断片 を試験する。その試験は、糖タンパク質Ｂコード領域の配列またはその遺伝的相 補体を含むプローブを用いて行なう。適当なプローブは、RFHVまたはKSHVからの 配列を含むポリヌクレオチド、例えば、表７に挙げた３型オリゴヌクレオチドな どである。 プローブの長さ及び性質ならびにハイブリダイゼーション条件は、試験の目的 に応じて選択される。その目的が、少数の株変異体を含むRFHVまたはKSHV由来の ポリヌクレオチドのみの検出であれば、高いストリンジェンシーの条件下でハイ ブリダイゼーションを行なう。それぞれの糖タンパク質Ｂからの配列を使用する 。長さがより長い配列は、その試験の特異性を向上させ、高いストリンジェンシ ーの条件下で使用することができる。好ましくは、そのプローブは、少なくとも 約30ヌクレオチドの糖タンパク質Ｂ配列を含み、より好ましくは、その配列は、 少なくとも約50ヌクレオチド長、より一層好ましくは少なくとも約75ヌクレオチ ド長である。 その目的が、RFHVまたはKSHVと密接に関連しているが同一でないポリヌクレオ チドの検出（例えば、スクリーニング試験またはこれまでに未記載のRFHV/KSHV 亜科ウイルスをリクルートする試験の場合）であれば、異なる条件を選択する。 RFHVまたはKSHV由来の配列を使用してもよいが、その２つの混合物または縮重プ ローブが一般に好ましい。配列の長さ及びハイブリダイゼーション反応の条件は 、目的としない配列を除外するのに十分な特異性が得られるよう、あるいは可能 な標的の中で最大の交差反応性が得られるよう選択する。適当な条件は、既に与 えられている式を用いて、Tmを計算し、ついで許容されるミスマッチの程度が最 大となる対応温度を計算することにより予想することができる。条件の適合性は 、ヘルペス糖タンパク質Ｂをコードする公知の標的ポリヌクレオチドを含有する サンプルとプローブとの交差反応性を試験することにより、実験的に試験するこ とができる。 アッセイ条件下で安定な二重らせんを形成するのに必要な相補性の最小の値に よって、プローブとハイブリダイズする糖タンパク質Ｂ配列が決まると考えられ る。例えば、ヒトまたはヒト以外の霊長類から得、配列番号３の塩基36〜354に 対応する断片を産生するよう増幅し、ついでKSHVポリヌクレオチドの対応断片と プローブさせた標的を検討してみよう。表２のデータによれば、安定な二重らせ んを形成するのにわずか約50％の同一性しか要求されない条件下でハイブリダイ ゼーション反応を行なえば、プローブは、配列決定された任意のガンマヘルペス 糖タンパク質Ｂ遺伝子（hEBV及びsHV1を含む）由来の標的とハイブリダイズする 可能性がある。安定な二重らせんを形成するのにプローブと標的との間で少なく とも約65％、好ましくは少なくとも約67％、より好ましくは少なくとも約70％、 より一層好ましくは約75％の同一性が要求される条件下で反応を行なえば、アッ セイにより、RFHV/KSHV亜科、すなわち、RFHV、KSHV、または配列未決定の糖タ ンパク質Ｂポリヌクレオチドを有する密接に関連したヘルペスウイルスからの標 的ポリヌクレオチドが検出されるであろう。安定な二重らせんを形成するのに約 50〜55％の同一性しか要求されないハイブリダイゼーション条件下であっても、 陽性反応は、bHV4、eHV2またはmHV68の存在を示さないであろう。なぜなら、こ れらのウイルスは、霊長類に対する感染能を有さないと考えられているからであ る。 サイズによる特徴づけとハイブリダイゼーションによる特徴づけとを組合せる ことが可能である。例えば、増幅したポリヌクレオチドを、アクリルアミドまた はアガロースのゲル上で分離し、適当な物質（例えば、ニトロセルロース）の膜 にブロッティングし、ついで適当な標識（例えば、³²Ｐ）を有するプローブとハ イブリダイズさせることができる。洗浄後の標識の存在は、サンプル中にハイブ リダイズしうる物質が存在することを表し、一方、適当な分子量標準と比較した 移動距離は、その物質のサイズを表す。高いストリンジェンシーの条件下で前記 プローブの１つとハイブリダイズするが予想外のサイズを有する断片の配列は、 プローブと高い同一性を有するがRFHVまたはKSHVとは異なる糖タンパク質Ｂの配 列を示すものであろう。ヘルペスウイルスの感染を検出するためのポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオ チドの使用 本発明で具体化される、ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｂをコードするポリ ヌクレオチド及びこれらに基づく合成オリゴヌクレオチドは、ヘルペスウイルス の感染に関連する臨床症状の診断に有用である。例えば、臨床サンプル中の検出 可能なヘルペス糖タンパク質Ｂの存在は、対応するヘルペスウイルスが症状の発 現において病原体として関与したことを示唆している可能性がある。ウイルスの 糖タンパク質Ｂが、特定の組織には存在するが周囲の組織には存在しない場合、 そのような糖タンパク質Ｂの存在は、感染病変の位置づけに有効であろう。臨床 サンプルにおいてガンマヘルペスウイルスとその他のヘルペスウイルスとを識別 することは、感染の臨床経過を予想したり、あるいは治療に適した薬剤を選択す るのに有用であろう。糖タンパク質Ｂは、複製ウイルス、Ｌ粒子及び感染細胞に より発現されるため、これらの任意の形態のタンパク質の発現を伴う疾患の活動 期及び静止期に関する有用なマーカーとして役立つと予想される。 診断試験を行なうための方法は、当該技術分野で広く知られており、当業者に とって日常的なものである。一般に、本発明の診断方法を実施するために、臨床 サンプル中の標的と反応し、それを検出する試薬として、本発明の組成物の１つ を準備する。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的（例えば、ヘルペスウイルスに感 染した細胞中に存在しうるもの）を検出するための試薬として、本発明のポリヌ クレオチドを使用することができる。抗体分子または（ポリペプチドが受容体の 場合には）対応するリガンドなどの標的と特異的複合体を形成する能力を有し該 標的を検出する試薬として、本発明のポリペプチドを使用することができる。ウ イルス感染細胞により発現されたポリペプチドなどの標的を特異的に認識し該標 的を検出する試薬として、本発明の抗体を使用することができる。 標的は、診断パラメーターが測定される個体から適当な組織サンプルを得るこ とにより供給される。適切な試験サンプルは、ヘルペスウイルスを有する疑いが ある個体から入手されるサンプルである。多くの種類のサンプルがこの目的に適 しており、これらには、感染または病理が疑われる部位の近辺でバイオプシーま たは外科的剥離により得られたサンプル、それらに由来する細胞のin vitro培養 物、可溶化抽出物、血液及び血液成分が含まれる。必要に応じて、アッセイを行 なう前に、標的をサンプルから部分的に精製するかまたは増幅してもよい。試薬 と標的との間で複合体が形成する条件下で試薬とサンプルとを接触させることに より、反応を行なう。反応は溶液中で、または例えば組織切片を使用して固体組 織サンプル上で行なうことができる。複合体の形成は、当該技術分野で公知の多 数の技術により検出される。例えば、試薬に標識を付し、未反応の試薬を複合体 から除去することができ、この場合、残存する標識の量が、形成された複合体の 量の指標となる。複合体の検出に関するさらなる詳細及び別法を以下に記載する 。 形成された複合体の量が、ヘルペス感染した細胞または未感染の細胞のいずれ を表すのかを判定するため、好ましくは、アッセイの結果を、対照サンプルで行 なう同様のアッセイと比較する。未感染起源に由来すること以外は被検臨床サン プルと同様の組成を有する対照サンプルを使用するのが、一般に好ましい。しか しながら、対照中の標的の相対量が既知であるか又は比較のために使用できるの であれば、任意の対照サンプルが適合しうる。試験サンプル及び対照サンプルに 対するアッセイを同時に行なうのが好ましい場合が多い。しかしながら、形成さ れる複合体の量が定量可能であり、十分に一貫している場合は、試験サンプル及 び対照サンプルを別の日にまたは別の試験室でアッセイすることも可能である。 このように、生物学的サンプル中に存在しうるガンマヘルペスウイルスポリヌ クレオチドを検出するために、RFHV/KSHV亜科の糖タンパク質Ｂをコードするポ リヌクレオチド、及び本発明で具体化される合成オリゴヌクレオチドを使用する ことができる。特異的診断アッセイにおいてポリヌクレオチドを使用する一般的 な方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、日本国特許出願第530900 0号（latron）を参照されたし。 ポリヌクレオチド試薬を使用するアッセイは、例えば、１）特異的プローブと のハイブリダイゼーション反応を行なう、２）特異的プライマーによる増幅を行 なう、または３）それらの２つを組合せることにより、特異的なものにすること ができる。 特異的プローブとのハイブリダイゼーションにより特異的となったアッセイを 行なうためには、意図される標的に要求される相補性を有するポリヌクレオチド を選択する。好ましいプローブには、RFHV、KSHV、またはRFHV/KSHV亜科の別の メンバーの糖タンパク質Ｂの一部をコードする少なくとも約16ヌクレオチド長の ポリヌクレオチドが含まれる。プローブは、それに含まれる糖タンパク質Ｂコー ド領域が少なくとも約18、21、25、30、50または100ヌクレオチドとなるにした がい、より好ましいものとなる。また、用いる条件下でRFHV/KSHV亜科のポリヌ クレオチドとは安定な二重らせんを形成しうるが他のヘルペスウイルスのポリヌ クレオチドとは形成しない縮重プローブも好ましい。 一般には、プローブに標識を付する。このタイプのアッセイでよく使用される 標識には、32Ｐ及び33Ｐなどの放射性同位体、化学発光体、またはフルオレセイ ンなどの蛍光試薬、ならびに着色溶質または沈殿物を生成しうるアルカリホスフ ァターゼなどの酵素が含まれる。標識は試薬に固有のものであってもよいし、化 学的に直接連結することにより結合されているもの、またはビオチン−アビジン 複合体などの一連の中間反応性分子もしくは一連の中間反応性ポリヌクレオチド を介して接続されたものであってもよい。標識は、標的ポリヌクレオチドとハイ ブリダイズさせる前または後に、試薬に加えることができる。アッセイ感度を向 上させるために、ハイブリダイゼーションから生じたシグナルを増強するのが望 ましいことが多い。これは、連続的にハイブリダイズするポリヌクレオチドまた は分枝ポリヌクレオチドの組合せを使用して複数の標識成分が各複合体中に取込 まれるようにすることにより達成することができる。米国特許第5,124,246号（U rdeaら）を参照されたし。 必要に応じて、標的ポリヌクレオチドをサンプルから抽出し、部分精製しても よい。ウイルス粒子を測定するには、好ましくは、調製物のＤＮＡを富化させる 。糖タンパク質Ｂの活性な転写を測定するには、好ましくは、調製物のＲＮＡを 富化させる。一般に、臨床サンプル中のヘルペスウイルスのポリヌクレオチドレ ベルは低いと予想される。糖タンパク質ＢをコードするＤＮＡは、ウイルスが潜 伏期の場合には１細胞当たりわずか数コピー、ウイルスが複製期の場合には１細 胞当たり数百コピーまでであろう。該タンパク質が活発に発現されている細胞で は、該遺伝子が不活性な細胞よりも、ｍＲＮＡレベルは高くなるであろう。従っ て、ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅することによりサンプル中の標的レベルを増強す るのが望ましい。好適な増幅方法はPCRであり、これは、好ましくは、本発明で 具体化するオリゴヌクレオチドプライマーを１つ以上使用して行なう。逆転写酵 素を使用してｃＤＮＡコピーを作製し、ついで前記プライマーを使用してPCRを 行なうことにより、ＲＮＡを増幅することができる。 所望により、標的ポリヌクレオチドを、制限エンドヌクレアーゼによる消化、 サイズ分離（例えば、アガロースまたはポリアクリルアミド中での電気泳動によ るもの）、反応マトリックス（例えば、ブロッティング材）への固定を含む追加 的な処理の任意の組合せに付すことができる。 標的ポリヌクレオチドを含有する疑いのあるサンプルと試薬ポリヌクレオチド とを適当な反応条件下で混合することにより、ハイブリダイゼーションを行なう 。その後、未反応の試薬を除去するために洗浄または分離を行なってもよい。一 般に、相補的配列を効率的にハイブリダイズさせるためには、標的ポリヌクレオ チド及び試薬の両方を少なくともある程度平衡化して一本鎖形態にしなければな らない。従って、当該技術分野で公知の標準的な変性方法によりサンプルを調製 するのが有用な場合もある（特に、ＤＮＡに関する試験の場合）。 ハイブリダイゼーション条件のために選択するストリンジェンシーレベルは試 験の目的如何による。試験をRFHVまたはKSHVに特異的なものにしたい場合は、対 応する糖タンパク質Ｂのセグメントを含むプローブを使用して、高ストリンジェ ンシー条件下で反応を行なう。例えば、50ヌクレオチド以上の好ましいプローブ を使用する好ましい一連の条件は、50％ホルムアミド中、37℃で6×SSC、ついで 低いイオン強度で洗浄するというものである。この場合、一般には、安定な二重 らせんが形成されるためには、標的がポリヌクレオチドプローブに対して少なく とも約90％の同一性を有することが要求される。使用するプローブの長さを増加 させることにより、問題とされる特定のウイルスに対する反応特異性も増加する 。従って、本発明のこの適用に関しては、より長いプローブほど特に好ましい。 あるいは、KSHVに関連する他のヘルペスウイルスを検出しうる試験にしたい場合 は、より低いストリンジェンシーを用いる。適当なプローブには、KSHV糖タンパ ク質Ｂポリヌクレオチドからの断片、それらの混合物、または例えば表７に記載 のオリゴヌクレオチドが含まれる。 プローブをこのプローブに対して所望の同一性度を有する糖タンパク質Ｂ配列 のみとハイブリダイズさせるために、適当なハイブリダイゼーション条件を決定 する。要求されるストリンジェンシーは、ポリヌクレオチドプローブの長さ、及 びプローブと所望の標的配列との間の同一性度に左右される。例えば、NIVPA及 び TVNCBの各ハイブリダイゼーション部位間のKSHVポリヌクレオチド断片からなる プローブを考えてみる。60％の最小同一度が要求される条件では、KSHV及び他の ガンマヘルペスウイルス（例えば、sHV1）の対応するポリヌクレオチドとの安定 な二重らせんが形成されるであろう。90％の最小同一度が要求される条件では、 KSHV及び密接に関連する変異体からのポリヌクレオチドのみとの安定な二重らせ んが形成されるであろう。65〜70％の最小同一度が要求される中等度のストリン ジェンシー条件では、KSHV及びRFHV/KSHV亜科のいくつかの他のメンバーの糖タ ンパク質Ｂポリヌクレオチドでは安定な二重らせんが形成されるが、他の公知ヘ ルペスウイルス（ガンマヘルペスウイルスeHV2、sHV1、mHV68、bHV4、EBVを含む ）及び他のヒト病原体（例えば、hCMV、hHV6、hVZV及びHSV1）の対応するポリヌ クレオチドでは形成されないであろう。 既に与えられている数式を使用して、条件を予め推定することができる。好ま しくは、アッセイにおいて検出を意図するポリヌクレオチド及び検出を意図しな いポリヌクレオチドを含むことが判明している別々のサンプルと共にプローブを 試験することにより厳密な条件を確認する。そのようなサンプルは、公知配列か らポリヌクレオチドを合成するか、または相当するヘルペスウイルスに感染して いると考えられる組織からＤＮＡを抽出し増幅することにより得ることができる 。ハイブリダイゼーション条件の決定は、当業者にとっては日常的な調整作業で あり、過度の実験を必要とするものではない。eHV2、sHV1、mHV68、bHV4及びEBV は、アルファ及びベータヘルペスウイルスよりRFHV/KSHV亜科に対して高い同一 性を有するため、ガンマヘルペスウイルスをRFHV/KSHV亜科から除外する条件は 、一般に、表１に示すその他のヘルペスウイルスも除外することになる。さらに 、あるウイルスが最終判定において被検サンプル中に存在しないと考えられるな らば（例えば、ヒト組織サンプル中のeHV2、mHV68またはbHV4）、アッセイ条件 を決める際に、対応する標的配列を所望により省略してもよい。このようにして 、２型オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、表６に記載されているもの）が、 配列番号１または配列番号３を含むポリペプチドとは共に安定な二重らせんを形 成するが、配列番号５〜13よりなる群から選択される配列とはそれを形成しない ような条件を決定することができる。配列番号１または３の少なくとも21個以上 の連 続した塩基を含む適当な断片が、配列番号１及び配列番号３を含むポリヌクレオ チドとは共に安定な二重らせんを形成するが、配列番号５〜13のいずれか１つを 含むポリヌクレオチドとはそれを形成しないような条件を決定することもできる 。 あるいは、特異的プライマーを使用する増幅により特異的となるアッセイを行 なうためには、前記のとおり、生物学的サンプルからＤＮＡまたはＲＮＡを調製 する。所望により、表４に示すような、種特異的でないプライマー（例えば、表 ４または６に記載されているもの）を使用するPCRにおいて、標的ポリヌクレオ チドを予備増幅する。ついで、特異的プライマー（例えば、表７に記載されてい るもの）を使用して、あるいは表４、６及び７からのプライマーを併用して標的 を増幅する。好ましい実施態様においては、オリゴヌクレオチドプライマーをネ ステッド様式で使用して、第二次増幅を行なう。すなわち、第一次増幅ではウイ ルス特異的または非特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを、そして第二次増 幅ではウイルス特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。これにより 、高感度かつ特異的なアッセイが提供される。 必要な特異性を得るには、増幅中に特異的な３型プライマーを使用すれば十分 である。陽性試験は、一連の増幅の終了時に十分な反応生成物が存在することが 指標となりうる。増幅されたポリヌクレオチドは、例えば、反応混合物をニトロ セルロースなどの媒体上にブロッティングし、臭化エチジウムで染色することに より検出することができる。あるいは、最終増幅サイクル中に放射性標識基質を 混合物に加えてもよい。取り込まれた標識を、取り込まれなかった標識から分離 し（例えば、ブロッティングまたはサイズ分離により）、標識を検出することが できる（例えば、計数またはオートラジオグラフィーにより）。アガロースまた はポリアクリルアミドのゲル上で移動させる場合は、生成物のサイズが、増幅さ れた断片の同一性を確認する助けとなりうる。また、特異的増幅の後に、既に大 まかに説明されているハイブリダイゼーション反応の標的源として、前操作で得 られた増幅混合物を使用することにより、特異的なハイブリダイゼーションを行 なうことができる。遺伝子治療のためのポリヌクレオチドの使用 本発明では、有効成分としてウイルス特異的ポリヌクレオチド、ポリペプチド または抗体を含む医薬が具体化される。そのような組成物は、ウイルスもしくは 感染細胞の病理そのものを減少させるか、または非特異的医薬化合物による治療 に対してウイルスもしくは感染細胞をより感受性にしうる。 例えば、感染した個体に遺伝子治療の目的で投与するために、ヘルペスウイル ス糖タンパク質Ｂの一部をコードする本発明のポリヌクレオチドを使用すること ができる（一般的には、米国特許第5,399,346号: Andersonらを参照されたし） 。一般的な原理は、ポリヌクレオチドがそれにコードされるポリペプチドの発現 を促進または減弱させるよう、該ポリヌクレオチドを投与するものである。 遺伝子治療の好ましい形態は、ポリヌクレオチドが細胞内部で複製されて、そ の効果を増強し持続するよう、該ポリヌクレオチドを与えるものである。従って 、ポリヌクレオチドを、適当なプロモーター（例えば、対応する遺伝子の天然プ ロモーター、標的組織型の細胞中で本来的に活性な異種プロモーター、または適 当な薬剤により誘導されうる異種プロモーター）に作動可能的に連結させる。ポ リヌクレオチドの細胞内への進入は、当該技術分野で公知の適当な技術（例えば 、ポリヌクレオチドを、ウイルス発現ベクターなどの適当なベクターの形態で与 えたり、あるいはポリヌクレオチドをリポソーム内に封入する）により促進され る。ポリヌクレオチドは、全身的に注入するか、または抗原特異的ホーミング機 構もしくは直接注射により感染部位に与えることができる。 １つの変法においては、ポリヌクレオチドは、ヘルペスウイルス感染の過程で 転写される鎖と同じ方向でポリヌクレオチド鎖に結合したプロモーターを含む。 好ましくは、コードされる糖タンパク質Ｂは、外部成分、膜貫通成分、及び表面 への輸送のためのシグナル配列を含む。この種のポリヌクレオチドをトランスフ ェクトされたウイルス感染細胞では、その表面に発現される糖タンパク質Ｂの発 現レベルが増強されると予想される。糖タンパク質Ｂ発現をこのようにして増強 させると、抗体（及びADCCなどの抗体依存性エフェクター）及びウイルス特異的 細胞傷害性Ｔ細胞を含む免疫系の要素によるこれらの細胞の認識が増強されうる 。 もう１つの変法では、ポリヌクレオチドが、ヘルペスウイルス感染の過程で転 写される鎖と逆方向でポリヌクレオチド鎖に結合したプロモーターを含む。この 種のポリヌクレオチドをトランスフェクトされたウイルス感染細胞では、糖タン パク質Ｂの発現レベルが減少すると予想される。その転写産物は、ウイルス遺伝 子により転写される相補鎖とハイブリダイズし、翻訳を妨げると予想される。こ のアプローチは、アンチセンス療法として公知である。糖タンパク質Ｂ活性を有するRFHV/KSHV亜科ポリペプチド及びそれらの断片 図１に示すRFHV及びKSHVポリヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレ ームを有する。それらにコードされるポリペプチドを、それぞれ、配列番号２及 び配列番号４に示す。該ポリヌクレオチド配列を得るのに使用されるプライマー NIVPA及びTVNCBのハイブリダイズ領域の間には、RFHVとKSHVとの間で91％の同一 性を有する糖タンパク質Ｂ分子の106アミノ酸の断片がコードされている。KSHV 糖タンパク質Ｂの完全なタンパク質の配列を、配列番号94に示す。RFHV/KSHV亜 科の第３のメンバーであるRFHV2の糖タンパク質Ｂ断片を、配列番号97に示す。 配列決定された他のヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｂ分子と相同な多数の残 基が存在する。配列番号２または配列番号４に含有されるが他のヘルペスウイル スの公知配列には含有されない最長の配列は、２つの例外（配列番号64及び65） を除き、９アミノ酸長である。糖タンパク質Ｂのアミノ酸配列中の他の位置には 、より長い相同(matching)部分が見出される。最も長いのは、配列番号99に示す bHV4の21アミノ酸の配列であり、残りはすべて、16アミノ酸長以下である。配列 番号99の例外を除き、RFHV及びKSHVの糖タンパク質Ｂタンパク質配列の17アミノ 酸長以上の任意の断片が、それぞれRFHVまたはKSHV、または密接に関連した株に 特異的と考えられる。bHV4、及び相同セグメントを有する残りのウイルスは、霊 長類に感染する能力を有さないと考えられるため、霊長類で見出され配列番号４ に含有されていた約10アミノ酸以上の任意の断片は、KSHVと密接に関連した感染 性因子の存在を示すものであろう。 本発明は、RFHV/KSHV亜科のヘルペスウイルス由来の完全な糖タンパク質Ｂ、 及びこの亜科に特異的なその任意の断片の両方を具体化する。本発明の好ましい 糖タンパク質Ｂ断片は、少なくとも10アミノ酸長であり、より好ましくは、少な く とも13アミノ酸長であり、より好ましくは、少なくとも約17アミノ酸長であり、 より好ましくは、少なくとも約20アミノ酸長であり、さらに好ましくは、少なく とも約25アミノ酸長であり、より一層好ましいくは、少なくとも約30アミノ酸長 である。 配列番号２、４、94及び96に示すRFHV及びKSHV糖タンパク質Ｂ断片のアミノ酸 配列を使用して、ウイルス特異的及び交差反応性抗原領域を同定することができ る。 原則として、特異的抗体は、該抗体が由来する種によっても共有されていない いずれかのアミノ酸配列の配列間相違を認識しうるであろう。抗体結合部位は、 一般には、抗原の５〜９アミノ酸残基を含むのに十分な程度に大きく、単一アミ ノ酸の相違を十分認識する能力を有する。特異的抗体は、糖タンパク質Ｂを発現 するウイルスが感染した動物内で自然に生じるポリクローナル応答の一部であっ てもよい。また、特異的抗体は、完全な糖タンパク質Ｂまたは糖タンパク質Ｂ断 片のいずれかを実験動物に注射することにより誘導することもできる。 このように、KSHVに特有の５アミノ酸以上の任意のペプチドが、潜在的なウイ ルス特異的抗原であり、KSHV特異的抗体により認識されうるであろう。同様に、 RFHV/KSHV亜科内で共有されるが他のヘルペスウイルスとは共有されない十分な 長さの任意のペプチドが、潜在的な亜科特異的抗原である。 好ましいペプチドのいくつかの例を、表８に示す。当業者であれば、記載され ているペプチドの長さを若干変更することにより、及び／または、ペプチドのフ レームをいずれかの方向へ数残基移動させることにより、同様の特異性を有する 他のペプチドを設計しうることを即座に認識するであろう。 表８に示すクラスＩペプチドは、KSHVの糖タンパク質Ｂとガンマヘルペスウイ ルス亜科のいずれかの他のメンバーの糖タンパク質Ｂとの間で保存されている。 従って、この領域内のそのような１つの糖タンパク質Ｂに対する抗体は、残りの いくつかと交差反応しうる。クラスIIペプチドは、RFHVとKSHVとの糖タンパク質 Ｂ間では保存されているが、他のガンマヘルペスウイルスに対しては保存されて いない。この領域に対する抗体は、RFHV、KSHV及びRFHV/KSHV亜科の他のウイル ス間では交差反応するが、この亜科以外のヘルペスウイルスとは交差反応しな いと予想される。クラスIIIペプチドは、RFHV、KSHV及び他の公知ガンマヘルペ スウイルスの糖タンパク質Ｂの間で異なっている。この領域（特に、それに含有 される同一でない残基）に結合する抗体は、RFHV及びKSHVの糖タンパク質Ｂを、 それら相互から、そして関連性がより低いヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｂか ら識別すると予想される。 クラスIIIからの特に好ましいペプチドは、実施例に記載するとおり、抗原エ ピトープに適合した極性特性を有する糖タンパク質Ｂの領域を含むペプチドであ る。KSHV及びRFHV/KSHV亜科の他のメンバーからの糖タンパク質Ｂの完全な配列 がわかれば、ウイルス特異的ペプチドまたは亜科特異的ペプチドを、その分子の 他の領域に関して、同様の分析により予想することができる。ポリペプチドの製造 本発明のポリペプチドは、いずれも当業者に公知の種々のいくつかの方法によ り製造することができる。 例えば、約５〜50アミノ酸長の短いポリペプチドは、配列データから、化学合 成により簡便に製造される。好ましい方法は、固相Merrifield法である。別法と して、所望のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡを、既に記載され ている方法の１つに従い単離または合成し、ウサギ網状赤血球系などのin vitro 翻訳系を用いて翻訳してもよい。例えば、Dorskyらを参照されたし。 より長いポリペプチド（完全な糖タンパク質Ｂ及びそれに至るまでのもの）は 、適当な発現ベクター系を用いて簡便に製造される。例えば、完全長ｃＤＮＡの コード鎖を、適当なプロモーターに作動可能的に結合し、発現ベクター中に挿入 し、適当な宿主細胞中にトランスフェクトすることができる。ついで、転写及び 翻訳が生じる条件下で、宿主細胞を培養し、ついで該ポリペプチドを回収する。 他のヘルペスウイルス種に由来する糖タンパク質Ｂの発現及び回収の具体例に関 しては、例えば、米国特許第4,642,333号（Person）、第5,244,792号（Burkeら ）、Manservigiらを参照されたし。 細胞表面への輸送のためのシグナルをコードする領域を含むが該タンパク質の 膜貫通ドメインをコードする領域を欠く組換え糖タンパク質Ｂポリヌクレオチド が、多数の目的に特に簡便に使用される。該ポリヌクレオチドは、膜貫通コード 領域の5'側がトランケート化されていてもよいし、あるいは、細胞外及び細胞質 コード領域を含むが膜貫通領域を欠くものであってもよい。この性質の構築物は 、可溶性形態で細胞から分泌されると予想される。単量体である糖タンパク質Ｂ 断片を有することが望ましい場合には、該タンパク質の最初の約475アミノ酸に 翻訳を限定するよう、組換え体を設計してもよい。 例えば、これらの任意の形態の糖タンパク質Ｂを酵母中で発現させるために、 グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）プロモーター領域及 びターミネーター領域を使用して、カセットを調製してもよい。GAPDH遺伝子断 片を、酵母ライブラリーで同定し、単離し、適当な立体配置で連結する。このカ セットを、pBR322中にクローニングし、単離し、ＤＮＡ配列決定により確認する 。 糖タンパク質ＢインサートとGAPDHプロモーター及びターミネーター領域とを含 有するpCI/Iプラスミドを構築する。該プラスミドを使用して、酵母株S．cerevi siaeを形質転換する。培養後、該酵母細胞を遠心することによりペレット化し、 プロテアーゼ阻害物質（例えば、１mMフェニルメチルスルホニルフルオリド及び 0.1μg/mlペプスタチン）を含有する緩衝液に再懸濁する。洗浄された細胞を、 ガラスビーズと共にボルテックスすることにより破壊し、再遠心する。上清中の 妥当なサイズの糖タンパク質Ｂの存在は、例えば、以下の節に記載のとおりに調 製された糖タンパク質Ｂに対する抗体を使用するウエスタンブロット法により確 認することができる。糖タンパク質Ｂは、イオン交換クロマトグラフィー、抗体 または基質を使用するアフィニティークロマトグラフィー、高圧液体クロマトグ ラフィーなどの標準的なタンパク質化学技術を組合せることにより、上清から精 製することができる。 哺乳動物細胞中で糖タンパク質Ｂを発現させるために、例えば、pSV1/dhfrな どの哺乳動物発現ベクターを使用してもよい。これは、アンピシリン耐性ベータ ラクタマーゼ遺伝子と、SV40初期プロモーターに結合したジヒドロ葉酸レダクタ ーゼ（これは哺乳動物細胞選択マーカーである）とを有する。糖タンパク質Ｂポ リヌクレオチド平滑末端断片を、pSV1/dhfrベクターに連結し、エンドヌクレア ーゼで消化して、SV40プロモーター、糖タンパク質コード領域ならびにSV40スプ ライス及びポリアデニル化部位を含むカセットを得る。該プラスミドを使用して 、例えば、dhfrが欠損したCHO細胞を形質転換し、トランスフェクト体を選択す る。糖タンパク質Ｂを発現する細胞は、例えば、一次抗体として抗糖タンパク質 Ｂを使用する免疫蛍光法により同定することができる。 もう１つの例では、糖タンパク質Ｂを発現させるための組換えプラスミドを、 エピソーム複製ベクターであるpRP-RSV中、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復 配列の制御下でクローニングする。このプラスミドは、ヒトパポーバウイルスBK の複製起点及び初期領域、ならびにdhfr耐性マーカーを含有する。ついで、この ベクターを使用して、例えば、ヒト293細胞を形質転換することができる。膜貫 通伸長ドメインを欠く糖タンパク質Ｂコード領域を使用することにより、糖タン パク質Ｂポリペプチドを0.15〜0.25pg／細胞／日で培地中に構成的に分泌させる 。 0.6〜６μMメトトレキセートの存在下では、エピソーム組換え体の増幅のため、 産生が10〜100倍増加しうる。このようにして製造した糖タンパク質Ｂは、とり わけ、新たな及び再発性のヘルペスウイルス感染症の診断における使用や、それ らのヘルペスウイルス感染症を防御するワクチンの製造に適している（Manservi giら）。ヘルペスウイルス感染を評価するためのポリペプチドの使用 本発明で具体化されるポリペプチドは、いくつかの異なる用途において個体の ヘルペスウイルス感染の状態を検出または評価するために使用することができる 。 一つの用途では、ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂの一部をコードするポリペ プチドが、それを特異的に認識しうる抗体の存在を検出するためのアッセイ用試 薬として供給される。そのような抗体は、例えば、現在または過去にヘルペスウ イルスにさらされた個体の循環系に存在しうる。 循環系における糖タンパク質Ｂに対する抗体の存在は、ウイルス感染を高感度 で早期に示しうる。糖タンパク質Ｂは、ウイルスエンベロープの機能的成分であ るため、ウイルス粒子中に捕捉される他の転写産物より大量に産生される。その 分布は、そのウイルスの生活環において一時的に出現するにすぎない転写産物よ り広範である。さらに、それは、完全なウイルスだけでなく、ウイルス感染細胞 の非感染産物（例えば、L−粒子）によっても発現されうる。種々のヘルペスウ イルス種由来の糖タンパク質Ｂが、強度に免疫原性であることが公知である。従 って、個体における糖タンパク質Ｂに対する抗体の検出は、進行中の活性なヘル ペスウイルス感染、潜伏感染、以前の曝露、または糖タンパク質Ｂワクチンでの 処理の指標となりうる。 抗体レベルの測定に適した臨床サンプルとしては、ガンマヘルペスウイルスに 感染している疑いのある個体からの血清または血漿などが挙げられる。抗体の存 在は、例えばイムノアッセイにより測定する。 ウイルスペプチドを使用して抗体を定量するための多数のイムノアッセイ法が 、当該技術分野で確立されている（例えば、米国特許第5,350,671号: Houghton らを参照されたし）。例えば、潜在的に特異的抗体を含有する試験サンプルを、 予 め測定した非限定量の試薬ポリペプチドと混合することができる。この試薬は、 酵素または放射性同位体などの、直接結合した標識を含有していてもよい。液相 アッセイの場合には、未反応の試薬を、濾過またはクロマトグラフィーなどの分 離技術によって除去する。あるいは、サンプル中の抗体を、まず、固相上で試薬 により捕捉してもよい。これは、例えば、特異的ポリペプチド、抗免疫グロブリ ンまたはプロテインＡであってもよい。ついで、捕捉された抗体を、結合標識を 有する特異的ポリペプチド、抗免疫グロブリンまたはプロテインＡなどの第２の 試薬により検出する。捕捉試薬または検出試薬の少なくとも一方は、特異的ポリ ペプチドでなければならない。第３の変法では、該ポリペプチドを含有する細胞 または組織片に、該抗体を含有する試験サンプル、ついで、検出試薬（例えば、 標識された抗免疫グロブリン）を重層する。これらのすべての例において、該複 合体中に捕捉された標識の量は、試験サンプル中に存在する特異抗体の量に対し て正の関連性を有する。試験サンプル中の抗体を、標識抗体と、限定量の特異的 ペプチドへの結合について競合させる同様のアッセイを設計することができる。 該複合体中の標識の量は、この場合、試験サンプル中の特異的抗体の量と負に相 関する。これらの任意のアッセイを使用して得られた結果を、試験サンプルと、 未感染源由来の対照サンプルとの間で比較する。 試薬ポリペプチドを適切に選択することにより、所望の特異性を有する抗体が 検出されうる。例えば、完全な糖タンパク質Ｂを使用する場合、または、ヘルペ スウイルス間で保存されている領域を含む断片を使用する場合には、試験サンプ ルにおいて検出される抗体は、ウイルス特異的、交差反応性、またはその両方で あり得る。複数エピトープの試薬が、ヘルペスウイルス感染に関連した抗体に関 する一般的なスクリーニングアッセイに好ましい。アッセイをRFHVまたはKSHVの いずれかに対する抗体に特異的にするためには、例えば、表８のクラスIIIに挙 げられている適当な糖タンパク質Ｂ分子の非保存領域を含む抗原ペプチドを選択 する。好ましくは、そのようなペプチドの混合物を使用する。RFHV、KSHV及びガ ンマヘルペス科の密接に関連したウイルス（sHV1及びEBVを除く）に対する抗体 を同時に検出するためには、表８のクラスIIに挙げた性質を有する抗原ペプチド を選択する。好ましくは、そのようなペプチドの混合物を使用する。 ヘルペスウイルス感染中に刺激された抗体は、感染がいったん消散すると、退 去するか、宿主の免疫記憶の一部として維持されうる。後者の場合、現在の感染 による抗体は、抗体のクラスを調べることにより、免疫記憶による抗体と区別で きる。例えば、試験サンプル中の抗体を特異的ポリペプチドで捕捉し、ついで、 標識された抗IgＭまたは抗IgＧで展開するアッセイを行うことができる。試験サ ンプル中のIgＭクラスの特異的抗体の存在は、進行中の感染を示し、一方、IgＧ 抗体のみの存在は、その活性が、以前の感染またはワクチン接種の免疫記憶によ るものであることを示す。抗−ウイルス薬を設計またはスクリーニングするためのポリペプチドの使用 糖タンパク質Ｂ遺伝子または遺伝子産物の妨害により、感染過程またはこの疾 患の進行が改変される。本発明の目的は、ガンマヘルペスウイルス感染の治療に おいて有用な医薬組成物および該化合物の使用方法を開発し、試験することがで きる方法を提供することである。特に好ましいのは、ＲＦＨＶ、ＫＳＨＶおよび ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科の他のメンバーによる感染の治療に有用な医薬化合物で ある。適する薬物は、糖タンパク質Ｂ遺伝子の転写または翻訳を妨害するもの、 およびその遺伝子によってコードされるポリペプチドの生物学的機能を妨害する ものである。妨害のメカニズムが分かっている必要はなく、ただ、その妨害が感 染過程に関連する反応に対して優先することのみが必要である。 好ましい薬物としては、硫酸ヘパリンおよびその類似体などの、糖タンパク質 Ｂが標的細胞上のその基質に結合するのを競合的に妨害するものが挙げられる。 また、糖タンパク質Ｂが、ウイルスが標的細胞の浸透などのその生物学的機能の 一つを示すために必要であると考えられる、他のウイルスエンベロープ成分と相 互作用するのを競合的に妨害する薬物も好ましい。さらに、糖タンパク質Ｂを架 橋し、またはそれ以外の方法で固定化し、それによってその基質の結合またはウ イルス感染能において役割を果たす生物学的機能の遂行を妨害し得る分子も好ま しい。 本発明は、どれが臨床用途に適するかを調べるための薬剤候補のスクリーニン グ法を提供する。その方法は、現在公知の抗ウイルス化合物および将来設計され る可能性のある抗ウイルス化合物に対して使用できる。 その方法は、活性糖タンパク質Ｂと薬剤候補とを結合させ、生化学的機能が薬 剤候補によって変えられるかどうかを測定することを含む。糖タンパク質Ｂは、 糖タンパク質Ｂ活性を有するＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科の糖タンパク質Ｂ遺伝子に よってコードされる断片であってもよい。適する断片は、その分子の活性部位を コードする遺伝子操作されたポリペプチドの発現により、または糖タンパク質Ｂ をプロテアーゼによる切断して、活性断片を精製することにより得られる。好ま しい態様では、糖タンパク質Ｂ全体が提供される。反応混合物はまた、タンパク 質の生物学的活性の測定に必要な他の成分を含む。例えば、基質結合を測定する ためのアッセイでは、硫酸ヘパリンまたはその類似体が提供され、恐らくは、そ れらは結合反応の測定を容易にするための固体支持体に結合している。 スクリーニング法の一つの態様では、それは薬剤候補の単離された糖タンパク 質Ｂまたはその断片への直接の結合を測定するものである。分子の活性部位に結 合する化合物は、糖タンパク質Ｂ活性を妨害すると予想される。すなわち、糖タ ンパク質Ｂ全体または活性部位を含む断片を、薬剤候補と混合させる。候補の結 合は、例えば、候補を放射線標識した、または安定な同位体で標識した形態で提 供することにより、直接測定することができる。糖タンパク質Ｂに結合した標識 の存在は、例えば、糖タンパク質Ｂを適切な抗体によって沈殿させることにより 、または固相に結合した分子を提供し、反応後に固相を洗浄することにより測定 できる。候補の糖タンパク質Ｂへの結合は、立体配置の変化として確認すること もでき、例えば、差分光法、核磁気共鳴法または円偏光二色性によって検出でき る。あるいは、結合は、競合アッセイで測定してもよい。例えば、糖タンパク質 Ｂを候補と混合し、次いで、標識したヌクレオチドまたは調節サブユニットの断 片を加える。候補の生化学的に関連する部位への結合により、標識した化合物の その後の結合が阻害されるはずである。 スクリーニング法の第二の態様は、糖タンパク質Ｂの基質または基質類似体へ の結合を阻害する薬剤候補の能力を測定するものである。好ましい類似体は、Se pharose^TMビーズなどの固体支持体に結合したヘパリンである。阻害は、例えば 、糖タンパク質Ｂに放射線標識を付与し、それを薬剤候補とともにインキュベー トし、アフィニティー樹脂を加えた後、樹脂を洗浄して計数し、その候補が放射 能 の結合量を減少させたかどうかを調べることにより測定できる。薬剤候補はまた 、糖タンパク質Ｂと他のヘルペスウイルスタンパク質との間の相互作用を競合的 に妨害する能力について試験してもよい。 スクリーニング法の第三の態様は、ウイルス粒子などの活性粒子の、糖タンパ ク質Ｂによって媒介される活性を阻害する薬剤候補の能力を測定するものである 。粒子を、同じ機能を媒介し得る他の成分ではなく、糖タンパク質Ｂを発現する ように操作する。次いで、その粒子が基質結合または膜融合などの生物学的機能 を阻害する能力を、薬剤候補の存在下または不在下で、適切な標的を提供するこ とにより測定する。 本発明はまた、薬物の推論的設計によるヘルペス感染を治療するための薬剤の 開発についてのものでもある（一般的には、HodgsonおよびEricksonらを参照） 。この態様では、糖タンパク質Ｂの三次構造を、アミノ酸配列に基づく予測モデ ルにより、または好ましくは、実験的測定により決定する。実験方法としては、 抗体マッピング、突然変異分析、および抗−イディオタイプの生成が挙げられる 。特に好ましくは、Ｘ線結晶学的手法である。糖タンパク質の三次構造、特に基 質結合部位付近の重要なアミノ酸の方向を知ることにより、化合物がde novoで 設計され、または、既存化合物が適切に改変される。設計した化合物は、糖タン パク質Ｂの活性部位付近に結合させ、その部位の正常な生化学的機能を立体的に 妨害するのに適切な電荷バランス、疎水性および／または形状を有する。好まし くは、この方法によって設計された化合物を、次いで、上記で概説したような薬 物スクリーニングアッセイで試験する。糖タンパク質Ｂに対する抗体およびその調製 本明細書に含まれる糖タンパク質Ｂのアミノ酸配列は、感染する宿主に対して 異質物である。ヘルペスウイルスの他の種に由来する糖タンパク質Ｂは、哺乳類 における免疫原性が強いことが知られている。抗−糖タンパク質Ｂは、例えば、 ｈＣＭＶによる感染の通常の結果として、ヒトの中に形成される。同様に、ＲＦ ＨＶ、ＫＳＨＶおよびＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科の他のメンバーの糖タンパク質Ｂ は、ヒトを含めた哺乳類において免疫原性であることが予想される。これらの予 想は、下記の実施例の項に記載する観察結果によって支持される。 ポリペプチドに対する抗体は、一般に、当技術分野で公知の方法によって調製 される。実験的に動物での抗体産生を刺激するためには、しばしば、グルタルア ルデヒドによる重合、またはフロイントアジュバントなどのアジュバントとの結 合などの技術によりポリペプチドの免疫原性を高めることが好ましい。免疫原を 適する実験動物に注入する。モノクローナル抗体の調製の場合は齧歯動物が好ま しく、ポリクローナル抗体の調製の場合はウサギまたはヒツジなどのより大きい 動物が好ましい。約４週間後に２回目またはブースター注入を行い、約１週間以 降に抗体源の採取を開始するのが好ましい。 免疫感作した動物から採取した血清は、ポリクローナル抗体源となる。源とな る材料から特異的抗体活性を精製する方法の詳細は、当技術分野で公知である。 所望ならば、特異的抗体活性を、タンパク質Ａクロマトグラフィー、硫安沈殿、 イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーおよび固体支持体 に結合した免疫感作ポリペプチドのカラム上でのイムノアフィニティークロマト グラフィーなどの技術によりさらに精製することができる。 糖タンパク質Ｂ完全体または保存配列を含む断片で免疫感作することにより生 成したポリクローナル抗体は、ヘルペスウイルス間で交差反応性であると考えら れる。ウイルスまたは亜科に特異的な抗体は、上記表８に挙げたような適切な特 異抗原による免疫感作によって生成させてもよい。あるいは、より大きい断片に 対して生成させたポリクローナル抗体は、他のウイルス糖タンパク質Ｂに対する 不要な活性を、例えば抗体を糖タンパク質Ｂから作った吸着体に通し、未結合画 分を集めることによって除去することにより、特異的にすることができる。 あるいは、脾臓細胞などの免疫細胞を免疫感作した動物から回収し、モノクロ ーナル抗体産生細胞系の作製に使用することができる。例えば、Harrow & Lane (1988)，米国特許第4,472,500号（Milsteinら）および米国特許第4,444,887号（ Hoffmanら）を参照されたい。 簡単に述べると、抗体産生細胞系は、特に細胞融合によって、または抗体産生 細胞をエプスタインバルウイルス（Epstein Barr Virus）で形質転換することに よって、または癌遺伝子ＤＮＡで形質転換することによって、作製することがで きる。処理した細胞はクローン化して培養し、所望の特異性をもつ抗体を産生す るクローンを選択する。特異性の試験は、多数の方法、例えば免疫感作ポリペプ チドを標準的イムノアッセイにおける検出試薬として使用したり、免疫組織化学 においてポリペプチドを発現する細胞を使用して、培養上清に対して行うことが できる。選択したクローンから供給されるモノクローナル抗体は、大容量の組織 培養上清から、またはクローンを注入して適切に調製した宿主動物の腹水から精 製することができる。 この方法の有効な変形としては、ポリペプチドによる免疫感作を単離した細胞 上で行う方法が挙げられる。抗体断片および他の誘導体は、タンパク質分解酵素 によって抗体を切断するなどの標準的タンパク質化学の方法によって作製できる 。抗体の遺伝子操作による変異体は、抗体をコードするポリヌクレオチドを入手 し、そして突然変異を導入して変異体を翻訳するための分子生物学の一般的方法 を適用することにより作製することができる。 糖タンパク質Ｂ完全体または保存配列を含む断片の注入により生成したモノク ローナル抗体は、ヘルペスウイルス間で交差反応性であると考えられる。ウイル スまたは亜科に特異的な抗体は、表８から選択することのできる適切な特異抗原 による免疫感作により生成させることができる。あるいは、ウイルス特異的クロ ーンは、スクリーニング法において表８のクラスIIIから選択されるような適切 な抗原を使用することにより、クローン化したハイブリドーマから選択できる。 ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂに対して特異的な抗体は、開発、診断および 治療研究において多数の用途がある。例えば、抗体は、薬物のスクリーニングに 使用できる（米国特許第5,120,639号参照）。これはまた、下記に記載するよう に、受動ワクチンの成分として、または生物学的サンプルにおけるヘルペスウイ ルスの検出および薬物の標的化のために使用できる。 糖タンパク質Ｂに関連する抗−イディオタイプも調製できる。これは、まず糖 タンパク質Ｂ抗体、通常はモノクローナル抗体、を前記した方法に従って作製す ることにより行う。該抗体は次いで、ボランティアまたは実験動物の免疫原とし て使用して、抗−イディオタイプを生成させる。抗−イディオタイプは、モノク ローナルまたはポリクローナルのいずれでもよく、その発生は、一般的に、第一 の抗体に対して使用した方法にしたがって行う。抗−イディオタイプまたは抗− イディオタイプを発現するハイブリドーマクローンの選択は、免疫原抗体を正の セレクターとして使用し、特異性が無関係である抗体を負のセレクターとして使 用することにより行う。通常、負のセレクター抗体は、ポリクローナル免疫グロ ブリン調製物または免疫原抗体と同じ免疫グロブリンクラスおよびサブクラスな らびに同じ種のモノクローナル免疫グロブリンを含むプールである。抗−イディ オタイプは、糖タンパク質Ｂに対する能動ワクチンの代わりの成分として使用で きる。生物学的サンプル中の糖タンパク質Ｂを検出するための抗体の使用 糖タンパク質Ｂに対して特異的な抗体は、糖タンパク質Ｂポリペプチドならび に、例えば固体組織サンプルおよび培養細胞に存在し得るウイルス起源の断片の 検出に使用できる。そのような測定を行うための免疫組織化学的手法は、当業者 には明らかである。一般に、組織は、凍結、種々の溶媒への交換、パラホルムア ルデヒドなどの試薬による固定、アルコールなどの試薬による乾燥またはパラフ ィンもしくはＯＣＴなどの市販の媒体への包埋などの技術の組み合わせにより保 存する。サンプルの一片を適切に調製し、タンパク質に特異的な一次抗体をその 上に置く。 一次抗体には、適切な標識を直接付与することができる。より頻繁に行われる 方法では、一次抗体を、製造が容易な、または市販されている多数の展開試薬の 一つを使用して検出する。典型的には、これらの展開試薬は、抗−免疫グロブリ ンまたはタンパク質Ａであり、典型的には標識を有し、該標識としては、これら に限定されないが、フルオレセインなどの蛍光マーカー、適する化学化合物を沈 殿し得るペルオキシダーゼなどの酵素、コロイドの金などの電子密度の高いマー カー、または¹²⁵Ｉなどの放射性同位体を含む。次いで、そのサンプル片を適切 な顕微鏡技術を使用して可視化し、標識レベルを、ウイルス感染の疑いがある細 胞と対照細胞（感染領域の周りの細胞または遠隔部位から取った細胞など）との 間で比較する。 糖タンパク質Ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質は、標準的定量イムノ アッセイで検出することもできる。タンパク質が感染細胞から確認できる量で分 泌され、または発する場合は、血漿または血清サンプル中に検出できる。あるい は、標的タンパク質は、固体組織サンプルから可溶化し、または抽出することが できる。定量の前に、タンパク質は任意に、ブロット法または捕獲抗体の使用な どによって固相に固定することができる。 定量を行うための多数のイムノアッセイ法が当技術分野で確立されている。例 えば、タンパク質は、限定されない所定量の、そのタンパク質に特異的な試薬抗 体と混合させることができる。試薬抗体は、酵素または放射性同位体などの直接 結合した標識を含んでもよいし、あるいは、抗−免疫グロブリンまたはタンパク 質Ａなどの第二の標識試薬を添加してもよい。固相アッセイの場合、未反応試薬 は洗浄により除去する。液相アッセイの場合は、未反応試薬を濾過またはクロマ トグラフィーなどの他の何らかの分離法により除去する。複合体に捕獲される標 識の量は、試験サンプル中に存在する標的タンパク質の量に正比例する。この方 法の変形は、標的タンパク質が標識された類似体と、特異的抗体上の結合部位に 対して競合する競合アッセイである。この場合、捕獲される標識の量は、試験サ ンプル中に存在する標的タンパク質の量に反比例する。そのようなアッセイを使 用して得られる結果を、試験サンプルと未感染源由来の対照サンプルとの間で比 較する。薬物標的化のための抗体の使用 ヘルペスウイルス感染の治療のための抗体の使用例は、エフェクター成分の特 異的標的化にある。ウイルス感染細胞は一般に、ウイルスのペプチド、特にウイ ルスエンベロープの外側で発現されるタンパク質を表示する。従って、そのペプ チドは、特異的抗体が結合し得る感染細胞のマーカーとなる。従って、抗体に結 合したエフェクター成分は、感染した細胞付近に濃縮されるようになり、それら の細胞に対する効果が改善され、未感染細胞に対する効果は減少する。さらに、 抗体がエンドサイトーシスを誘発し得る場合、これは、エフェクターが細胞内部 へ入るのを高める。 標的化の目的のためには、ウイルスのポリペプチド（この場合、糖タンパク質 Ｂの領域）に対して特異的な抗体は、好ましくは共有結合または高アフィニティ ー結合によって、適するエフェクター成分とコンジュゲートされる。このような 組成物の適切なエフェクター成分としては、¹³¹Ｉなどの放射性核種、毒性化学 物質およびジフテリア毒などの毒性ペプチドが挙げられる。もう一つの適するエ フェクター成分は、任意にリポソームにカプセル封入された、アンチセンスポリ ヌクレオチドである。診断用キット 本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチドまたは抗体を使用 する診断法は、診断試験室で、実験室で、開業医によって、または個人的に行う ことができる。本発明は、これらの環境で使用できる診断用キットを提供する。 個体中のヘルペスウイルスの存在は、その個体から得られる臨床サンプルでは、 該サンプルに含まれるＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または抗体の変化として明ら かに表れる。ヘルペスウイルスの存在から生じるこれらの成分の一つにおける変 化は、健康な個体のサンプルと比較した場合の、その成分のレベルの増加もしく は減少、またはその成分の形態の変換という形をとる。臨床サンプルは、任意に 、検査したい標的の濃度を上げるための前処理を行う。そうして、使用者は、診 断成分におけるレベル変化または変換を検出するために、キットに含まれる試薬 を適用する。 各キットは必ず、方法を特定化するための試薬を含む。すなわち、分析したい サンプルに存在し得る標的ＤＮＡまたはＲＮＡの検出に使用されるポリヌクレオ チド試薬；標的タンパク質の検出に使用される抗体試薬；または標的抗体の検出 に使用されるポリペプチド試薬である。試薬は、在庫保管に適し、後に検査を行 うときの反応媒体への交換または添加に適する固体形または液体緩衝物溶液とし て供給される。適切な包装が与えられる。キットは任意に、その方法に有用な別 の成分を提供してもよい。これらの任意の成分としては、緩衝剤、捕獲試薬、展 開試薬、標識、反応表面、検出手段、対照サンプル、取扱説明書および判定情報 が挙げられる。ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科の他のメンバー ＲＦＨＶおよびＫＳＨＶは、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科の典型的なメンバーであ る。本発明は、本明細書で定義するように、その亜科の他のメンバーの糖タンパ ク質Ｂをコードするポリヌクレオチド配列を包含する。本明細書に記載するコン センサス−縮重ガンマヘルペスウイルスオリゴヌクレオチド１型および２型プラ イマーならびに方法は、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科の他のメンバーの対応するポリ ヌクレオチド断片の特徴に適するように設計される。そのようなメンバーの一つ は、サルに感染する別のウイルスであり、ＲＦＨＶ２と称する。このウイルスの 糖タンパク質をコードする配列のセグメントが、実施例１２に記載するように、 Macaca mulattaサルから得られたＲＦ組織からクローン化された。 科の他のメンバーを同定し、特性付けするために、本発明の試薬および方法を 、そのようなウイルスに感染していると推測される組織サンプルから抽出したＤ ＮＡに適用する。 この目的に適するＤＮＡ源としては、ヒトおよび他の脊椎動物で生じる幅広い 病態から得られる生物学的サンプルが挙げられる。好ましくは、その物質が、ガ ンマヘルペスウイルス亜科の他のメンバーに類似したリンパ栄養（lymphotrophi c）であると推測される病態であり、例えば、非ＥＢＶ起源の感染性単核細胞症 である。より好ましくは、その臨床または組織学的特徴の少なくとも一つが、Ｒ ＦＨＶまたはＫＳＨＶが関連する病態と似ている病態である。これらには、ａ） 繊維増殖がその疾患の病理学的現象の一部であり、特にコラーゲン付着に関連し 、特に繊維組織が崩壊している病態；ｂ）血管の形成異常を含む病態；ｃ）悪性 形質転換、特に、それに限定されないが、リンパ球由来細胞を含む病態；ｄ）根 元的な免疫不全が疾患の頻度または重篤度に寄与する病態；ｅ）器官または体全 体の多重部位で特発的に起こる病態；ｆ）疫学データの示唆が、感染性または環 境の物質と関連する病態が含まれる。これらの基準の一つより多くを満たす病態 がより好ましい。特に好ましい病態のいくつかの例しては、腹膜後繊維症、結節 性繊維腫症、偽肉腫性繊維腫症、繊維肉腫、硬化腸間膜炎、急性呼吸疾患症候群 、特発性肺繊維症、種々の型のびらん性増殖性糸球体腎炎、グリオーマ、グリオ ブ ラストーマ、グリオーシスならびにあらゆる型の白血病およびリンパ腫が挙げら れる。 使用する組織サンプルの型は、病態の臨床的発現に依存する。その病態に関連 するウイルスを含んでいる可能性のより大きいサンプルは、その疾患の病理学的 現象に関与する部位、またはウイルス親和性の他の何らかの証拠がある部位から 採取できる。感染した個体の末梢血単核細胞も、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科ウイル スの担体として作用し得る。ＫＳＨＶは、カポージ肉腫(Mooreら、1995b)および キャッスルマン病（Dupinら）の両方のＰＢＭＣで検出されている。他の適切な 供給源は、そのような供給源から生成させた細胞培養物およびそのような供給源 から得たウイルスを高濃度にした、または単離した調製物である。負の対照サン プルとしては、組織を、同一個体の明らかに未感染の部位から、またはその病態 に明らかに罹患していない適合した個体から得ることができる。 ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科のメンバーを同定する方法は、好ましくは、本発明で 提供される方法および試薬の単独または組み合わせによる使用を含む。 一つの方法は、サンプルから抽出したＤＮＡからのヘルペスウイルス糖タンパ ク質Ｂをコードするポリヌクレオチドの増幅を含む。これは、例えば、ＰＣＲな どの反応においてポリヌクレオチドを増幅することにより行うことができる。一 つの変形法では、増幅反応を、表４に示すような広い特異性を持つコンセンサス −縮重タイプ１オリゴヌクレオチドを使用して開始する。こうして、ヘルペスウ イルス、主にγ型が増幅される。ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科は、ガンマヘルペスウ イルスのサブセットであるので、この変形法によって検出される糖タンパク質Ｂ 配列は、それらがＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科に属するかどうかを調べるためにさら に特性付けする必要がある。第二の変形では、表７に挙げたようなＲＦＨＶもし くはＫＳＨＶ特異的タイプ３オリゴヌクレオチド、またはこれらのウイルスから 採取される他の糖タンパク質Ｂポリヌクレオチドセグメントによって増幅を開始 する。増幅は、中程度〜低いストリンジェント条件下で行い、オリゴヌクレオチ ドがウイルスの関連する種と交差ハイブリダイズするようにする。より好ましい 変形法では、増幅反応を、表６に挙げたようなＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科特異的タ イプ２オリゴヌクレオチドを使用して開始する。適切なハイブリダイゼーション 条件下では、これらのプライマーは、その亜科のヘルペスウイルスから糖タンパ ク質Ｂを優先的に増幅する。 糖タンパク質Ｂポリヌクレオチドプローブを使用して検出される亜科の好まし いメンバーは、配列番号１または配列番号３の残基36〜354のＲＦＨＶまたはＫ ＳＨＶ糖タンパク質Ｂヌクレオチド配列と少なくとも65%の同一性を有するもの である。より好ましくは、少なくとも約67%の同一性を有するもの、さらに好ま しくは、少なくとも約70%の同一性を有するもの、さらに好ましくは、少なくと も約80%の同一性を有するもの、さらに好ましくは、少なくとも約90%以上の同一 性を有するものである。 亜科のメンバーは、適するプローブを使用して、サンプルのポリヌクレオチド に対してハイブリダイゼーションアッセイを行うことにより同定することもでき る。試験されるポリヌクレオチドは、任意に、タイプ１またはタイプ２オリゴヌ クレオチドをプライマーとして使用するなどして、ハイブリダイゼーションアッ セイを行う前に増幅することができる。次いで、標的を、適切に標識したプロー ブとのハイブリダイゼーション反応において試験する。プローブは、好ましくは 、配列番号１および３のＲＦＨＶまたはＫＳＨＶ糖タンパク質Ｂ配列に含まれる 少なくとも21個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約25個のヌクレオチド、 より好ましくは少なくとも約50個のヌクレオチドを含む。さらに好ましくは、プ ローブが、配列番号１または３のヌクレオチド36〜354を含む。他の好ましいプ ローブとしては、表６に示すようなタイプ２オリゴヌクレオチドが挙げられる。 ハイブリダイゼーション条件は、プローブが、先に配列決定されたヘルペスウイ ルスではないＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科、特にｓＨＶ１、ｂＨＶ４、ｅＨＶ２、ｍ ＨＶ６８、ｈＥＢＶ、ｈＣＭＶ、ｈＨＶ６、ｈＶＺＶおよびＨＳＶ１に由来する 糖タンパク質Ｂポリヌクレオチド配列とハイブリダイズできるように選択する。 これらの条件下で試験ポリヌクレオチドと安定な二本鎖が形成されると、これは 、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科のメンバーから誘導されたサンプルにポリヌクレオチ ドが存在することを示唆する。 亜科のメンバーは、その調製について先に概説したクラスII抗体を使用して同 定することもできる。クラスII抗体は、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科のメンバーによ って産生される抗原間で交差反応し、その亜科のメンバーでないヘルペスウイル スによって産生されるものなどの他の抗原とは交差反応しない。亜科の新規メン バーについての試験は、例えば、それらの抗体を、上記で挙げた病態を持つ個体 から調製した組織片の免疫組織化学研究で使用することにより行う。組織片の抗 体による染色が陽性の場合は、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科のメンバー由来のサンプ ルに糖タンパク質Ｂが存在することを示唆する。多分、その組織がウイルス感染 しているからである。さらに、組織片がＲＦＨＶおよびＫＳＨＶ特異的クラスII I抗体と反応しない場合、組織中の糖タンパク質Ｂは、亜科の別のメンバーに由 来する可能性がある。同様に、クラスII抗体がある個体の循環器系中に存在する 場合、その個体はＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科のメンバーによる感染を現在または過 去に受けている可能性がある。 推定上の新規ウイルスが上記方法のいずれかによっていったん同定されると、 それがＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科のメンバーであることは、そのウイルスの糖タン パク質Ｂ遺伝子の領域を得て配列決定し、それを、亜科の定義に従ってＲＦＨＶ またはＫＳＨＶと比較することにより、確認できる。ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科の 新規メンバーについては、本発明の他の態様を、検出、診断および薬剤開発のた めに活用することができる。新規亜科メンバーに対して本発明の態様の改変を必 要とする場合、その改変は本質的に小さいと予想され、その新規配列データに基 づいて明らかとなり、または、通常行われるように調整できる。ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科由来の糖タンパク質Ｂの変形 本発明はまた、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科の糖タンパク質Ｂの変形を包含する。 ＨＳＶ１およびｈＣＭＶの糖タンパク質Ｂの天然に存在する突然変異および誘 発される突然変異の両方についての多くの研究は、分子のいくつかの領域のその 種々の生化学的機能に対する役割に向けられている。例えば、融合におけるカル ボキシ末端アミノ酸の役割については、Reschkeら、およびBaghianら；抗体を中 和するためのエピトープについては、Shiuら、およびPellettら；シンシチウム 形成に関与する分子の領域についてはGageら；ウイルスの浸透および細胞から細 胞への広がりに関与する領域についてはNavarroら（1992）；生合成中の糖 タンパク質Ｂの細胞内輸送に関与する領域についてはQuadriら、およびNovarro ら（1991）を参照されたい。 記載した残基のいくつかは、以前に調べられたウイルスの糖タンパク質Ｂ分子 と本明細書に記載する糖タンパク質Ｂ分子との間で保存されている可能性がある 。同様に、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科の糖タンパク質Ｂの同じ残基の突然変異は、 他のウイルスについて記載したのと同様の効果を有すると予想される。あるいは 、異なる糖タンパク質Ｂ分子の機能領域を結合して、機能の変化した糖タンパク 質Ｂ組換え体を産生することができる。例えば、病原性ウイルスの糖タンパク質 Ｂ遺伝子を非病原性ウイルスのもので置き換えると、組換え体の病原性を減少さ せることができる（Kostalら）。ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶヘルペスウイルス亜科の糖 タンパク質Ｂの突然変異および組換えのいずれかは、株の弱毒化をもたらし、感 染性、複製活性または病原性のいずれかを減少させることができる。これらの効 果を有する糖タンパク質Ｂ配列の変化は、本発明に含まれるものである。 ヘルペスウイルスの弱毒化株は、例えば、多価ワクチンの開発において有用で ある。特に開発途上国では、いくつかの潜在的病原体に対する免疫系を同時に刺 激し得る予防ワクチンの提供が望まれている。いくつかの異なる病原体の免疫原 性ペプチドを発現するように操作されたウイルスがこの目的を達成できる。ヘル ペスウイルスは、特に適するベクターであると考えられる。なぜならば、大きい ゲノムは、それらのペプチドをコードする数kbの特別のＤＮＡを容易に収容でき るからである。理想的には、ウイルスベクターは、いくつかの生物学的活性を示 し、宿主の免疫系を引きつけるのに十分な完全体であり、それと同時に、異常を あまり引き起こさないよう十分弱毒化されている。すなわち、ＲＦＨＶ／ＫＳＨ Ｖ亜科の弱毒化ウイルスは、毒性を持つ形態に対するワクチンとして有用であり 、別のペプチドを発現して免疫保護の範囲を広げるように改変できる。 ヘルペスウイルスの弱毒化形態のもう一つの用途は、遺伝子治療用の送達ビヒ クルとしての用途である(Latchmanら、Gloriosoら)。有効であるためには、遺伝 子治療におけるポリヌクレオチドが標的組織部位に送達されなければならない。 繊維症疾患、悪性疾患および関連病態の治療では、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科の弱 毒化ウイルスベクターが、他のヘルペスウイルスなどの他の標的化メカニズムよ りも好ましいと考えられる。なぜならば、それらは、影響を受けた組織を標的と する手段を有するからである。この態様では、ウイルスをまず弱毒化し、次いで 、先に概説したものなどの遺伝子治療に望ましいポリヌクレオチドを含むように 改変する。ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科ワクチンにおける糖タンパク質Ｂ 糖タンパク質Ｂは、感染性ウイルスのエンベロープおよび感染した細胞上での 隆起のために、免疫エフェクターに対する有用な標的であると予想される。ヘル ペスウイルス糖タンパク質Ｂは、一般に、免疫原性であり、ウイルスを中和し、 ウイルスが複製期に入るのを防ぐことができる抗体を生じる。さらに、糖タンパ ク質Ｂは、Ｔ−細胞応答を引き出すことができ、宿主細胞でのウイルス複製部位 を攻撃することにより、進行しているウイルス感染の撲滅を助け得る。 本発明は、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科由来のウイルスによる感染の予防および管 理におけるワクチン組成物およびそれらの使用方法を含む。 一連の態様は、能動ワクチンに関する。これらの組成物は、糖タンパク質Ｂに 対して治療している個体の免疫応答を刺激するように設計される。それらは一般 に、糖タンパク質Ｂ分子、その免疫原性断片もしくは変異体、または糖タンパク 質Ｂ分子を発現することのできる細胞もしくは粒子のいずれかを含む。あるいは 、それらは、免疫原性糖タンパク質Ｂ断片をコードするポリヌクレオチド（Horn ら）を、好ましくは発現ベクターの形態で含むことができる。ポリヌクレオチド ワクチンは、任意に、リポソームまたはウイルスベクター粒子などの送達ビヒク ルを含み、またはＤＮＡそのものとして投与することができる。 本発明のワクチン組成物は、免疫原性断片が適切な免疫細胞型の増殖および／ または生物学的機能を刺激するために与えられるように設計される。抗体応答を 引き出すための組成物は、Ｂ細胞エピトープを含み、またはコードし、そして、 抗原提示細胞による取り込みおよび表示を増強する、もしくはＴ細胞の助けを補 充する他の要素も含み、またはコードする。ヘルパーＴ細胞、特にＣＤ４+細胞 を引き出すための組成物は、一般に、クラスII組織適合性分子の関係において提 示され得るＴ細胞エピトープを含む。細胞傷害性Ｔ細胞およびその前駆体、特に Ｃ Ｄ８+細胞を刺激するための組成物は、一般に、クラスＩ組織適合性分子の関係 において提示され得るＴ細胞エピトープを含む。 個体が今後ヘルペスウイルスに暴露されるのを防ぐにあたっては、抗体応答で 十分であると考えられる。予防組成物は、好ましくは、Ｂ細胞応答を引き出す成 分を含む。進行しているヘルペスウイルス感染の良好な撲滅には、細胞傷害性Ｔ 細胞、Ｔヘルパー−インデューサー細胞、またはその両方が関与してもよい。進 行している感染を治療するための組成物は、好ましくは、Ｔヘルパー細胞および 細胞傷害性Ｔ細胞の両方を引き出すことができる成分を含む。タイプ２ヘルパー （Ｔ_H2）細胞よりもタイプ１ヘルパー（Ｔ_H1）を優先的に刺激する組成物がさら に好ましい。活性ワクチンに適切な組成物の調製および試験は、下記に概説する 。 別の一連の態様は、受動ワクチンおよび養子輸送用の他の物質に関する。これ らの組成物は、一般に、ウイルスの中和または撲滅に直ちに容易に関与する、糖 タンパク質Ｂに対して特異的な免疫成分を含む。これらの組成物を使用する治療 法は、ウイルス暴露直後の病的結果の防止において好ましい。それらはまた、能 動ワクチンに対して十分な免疫応答を準備することができない免疫無防備状態の 個体においても好ましい。そのような個体としては、先天的免疫不全、後天的免 疫不全（ＨＩＶ感染者または腎臓透析者など）および免疫抑制治療を、例えばコ ルチコステロイドによって受けている者が挙げられる。 養子輸送に適する物質としては、下記に記載するように、糖タンパク質Ｂに対 して特異的な抗体が挙げられる。また、免疫細胞の養子輸送も挙げられる。例え ば、糖タンパク質Ｂに対して反応性のＴ細胞は、ドナーから採取し、任意にin v itroでクローン化し、または培養した後、組織適合性の受容者に移すことができ る。より好ましくは、移される細胞が受容者由来のものであり、これをin vitro で刺激する。すなわちＴ細胞は、治療を受ける人から精製し、糖タンパク質Ｂの 免疫原性成分およびウイルス特異的細胞を引き出すのに適する刺激因子の存在下 で培養した後、再投与する。 本明細書に含まれるいくつか組成物は、能動および受動の両ワクチンの特性を 有することができる。例えば、養子輸送によって与えられる糖タンパク質Ｂ抗体 は、ヘルペスウイルスに対する即時保護を付与することができ、また、抗−イデ ィオタイプネットワークを介して、またはウイルス抗原の免疫提示を高めること によって、進行している応答を刺激するともできる。糖タンパク質Ｂポリペプチドを含むワクチン 糖タンパク質Ｂに対する免疫応答を刺激するためのワクチンの特異的な成分と しては、完全体糖タンパク質Ｂ分子および宿主において免疫原性である糖タンパ ク質Ｂの断片が挙げられる。 完全体糖タンパク質Ｂおよびそのより長い断片は、先に記載した方法のいずれ か、特に、糖タンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチドを含む適切な発現ベク ターからの精製によって作製できる。他のウイルス株から単離した糖タンパク質 Ｂは、保護免疫応答を刺激する（米国特許第5,171,568号（Burkeら）参照）。好 ましい断片は、完全なウイルスエンベロープの外側に暴露され、成熟タンパク質 のＮ−末端の約650アミノ酸内に位置するその分子の領域を含む。 糖タンパク質Ｂのグリコシル化は、免疫原性には必要でない（O'Donnellら） 。そのため、分子のグリコシル化された形もグリコシル化されていない形も等し く好ましい。グリコシル化は標準的方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル 電気泳動でのタンパク質の移動度を、市販のエンドグリコシダーゼタイプＦまた はＨで処理する前と後とで比較することにより調べることができる。 糖タンパク質Ｂの特定のエピトープを含む5〜50アミノ酸のより小さい断片も 適切なワクチン成分である。これらは、先に記載した方法のいずれによっても作 製することができ、最も便利なのは化学合成である。好ましい断片は、免疫原性 であり、ウイルスエンベロープの外側で発現されるものである。さらに好ましい のは、細胞表面受容体への結合またはウイルスの標的細胞への浸透などの糖タン パク質Ｂの生物学的機能に関与する断片である。 種々のエピトープの免疫原性は、当技術分野で公知のアリゴリズムによって予 想できる。Ｂ細胞受容体に対して抗原性の領域は、例えば、可変極性領域を同定 することにより決定できる（Hoppら、実施例９参照）。Ｔ細胞受容体に対して抗 原性の領域は、例えば、組織適合性分子の提示溝に両親媒性ヘリックスを形成す ることができる領域を同定することにより決定できる。抗原性領域は、他のウイ ルス種の糖タンパク質Ｂ分子との類似性によって同定することもできる。例えば 、ＨＳＶ１のＢ細胞エピトープについては、Sanchez-Pescadorら、およびMester らを、ｈＣＭＶのＨＬＡ−制限ヘルパーＴ細胞エピトープについてはLiuらを、 ＨＳＶ１の細胞傷害性Ｔリンパ球エピトープについてはHankeらを参照されたい 。 種々のエピトープの免疫原性は、多数の種々の方法によって実験的に測定する ことができる。一般に、これらは、潜在的抗原性領域を含む、長さ5〜20アミノ 酸のタンパク質断片の作製、およびそれらの特定のバイオアッセイでの試験を含 む。断片は、糖タンパク質Ｂのより大きいセグメントのＣＮＢｒおよび／または タンパク質分解により作製し、例えばゲル電気泳動およびニトロセルロース上へ のブロッティングにより精製することができる（Demotzら）。断片はまた、標準 的なペプチド合成によっても作製できる（Schumacherら、Liuら）。好ましい方 法では、８残基が重複する12アミノ酸の連続したペプチドを、ナイロン膜支持体 上でＦ−Ｍｏｃ化学を使用して、成熟糖タンパク質Ｂ分子の細胞外ドメイン全体 に従って合成する（実施例１１参照）。 次いで、作製した断片に対する反応性は、完全体ウイルスまたは糖タンパク質 Ｂ成分に暴露した個体からのサンプルにおいて測定できる。個体は、慎重に投与 することにより糖タンパク質Ｂ成分に実験的に暴露しておいてもよい。あるいは 、個体が自然に起こるウイルス感染を有していてもよく、好ましくは、糖タンパ ク質ＢまたはＤＮＡポリメラーゼに対してウイルス特異的オリゴヌクレオチドプ ローブを使用した増幅反応が陽性であることにより確認する。血液サンプルは、 個体から採取して、標準的方法による血清、Ｔ細胞および末梢血単核細胞（ＰＢ ＭＣ）の調製に使用する。 血清は、固相酵素免疫検定法において糖タンパク質Ｂ特異的抗体の有無を試験 することができる。例えば、ナイロン膜などの固体支持体に結合したペプチドを 血清とともにインキュベートし、洗浄し、酵素結合抗免疫グロブリンとともにイ ンキュベートし、酵素基質を使用して展開する。特定の糖タンパク質Ｂペプチド に対する抗体の存在は、試験ウェルにおける反応産物のレベルが、無関係のペプ チドを含むウェルよりも高いことによって示される（実施例１１）。 リンパ球調製物は、糖タンパク質Ｂ特異的ヘルパーＴ細胞の存在を増殖アッセ イで試験することができる。約２ｘ10⁴個のヘルパーＴ細胞を抗原提示細胞とし ての照射した自己由来の、または照射した10⁵ＰＢＭＣの存在下、10^-4〜10^-6Mの ペプチドと約３日間インキュベートする。[³H]チミジンを培養の最後の約16時間 添加する。次いで、細胞を採取し、洗浄する。ペプチドの不在下で培養したもの に対して、洗浄した細胞の放射能が約10倍のレベルであることは、そのペプチド に対して特異的なＴ細胞の増殖を意味する（Liuら）。所望ならば、ＣＤ３+ ４+ ８-表現型を有する細胞を、ヘルパーＴ細胞応答をさらに特性付けするために、 クローン化することができる。 リンパ球調製物は、糖タンパク質Ｂ特異的細胞傷害性Ｔ細胞の存在を⁵¹Ｃｒ放 出アッセイで試験することができる。標的は、同種異系細胞を発現可能な糖タン パク質Ｂ遺伝子を含むヘルペスウイルスで感染することにより調製する。あるい は、糖タンパク質Ｂ発現ベクターでトランスフェクトした同種異系細胞を使用す ることができる。標的は、⁵¹Ｃｒとともに37℃で約90分間インキュベートした後 、洗浄する。約５ｘ10⁴個の標的細胞を10^-4〜10^-5Mのペプチドおよび0.1〜２ｘ1 0⁴個の試験Ｔ細胞とともに37℃で約30分間インキュベートする。自然溶解による ものよりも実質的に高いレベルで上清に放出される放射能は、ＣＴＬ活性を示す 。所望ならば、ＣＤ３+ ４- ８+表現型を有する細胞を、ＣＴＬ応答をさらに特 性付けするために、クローン化することができる。 糖タンパク質Ｂペプチドは、任意に、ワクチン中で同じウイルスの他のペプチ ドと結合させることができる。適するペプチドとしては、糖タンパク質Ｃ、Ｄ、 Ｈ、Ｅ、Ｉ、ＪおよびＧなどの、ヘルペスウイルスの他の成分のいずれのペプチ ドをも挙げることができる。糖タンパク質Ｂペプチドはまた、任意に、２種以上 の病原性生物に対する多価ワクチンを提供するために異なるウイルスの免疫原性 ペプチドと結合させることができる。ペプチドは、溶液のペプチド混合物を調製 し、または種々のペプチド成分が結合した融合タンパク質を合成することにより 結合させることができる。 適切なエピトープを含む糖タンパク質Ｂの形態は、特に100個以下のアミノ酸 を含む場合は、その免疫原性を高めるために、任意に化学的に処理することがで きる。そのような処理としては、例えばグルタルアルデヒドによる架橋；キーホ ールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風毒素などのタンパク質担体 への結合が挙げられる。 ペプチドまたはペプチド混合物は、そのままで使用してもよいが、通常は、水 、食塩水、生理学的緩衝食塩水、または糖水溶液などの生理学的かつ薬学的に許 容される賦形剤と組み合わせる。 好ましい態様では、能動ワクチンはまた、免疫原の提示を高め、さもなくば免 疫原に対する免疫応答を強めるアジュバントも含む。適するアジュバントとして は、ミョウバン、水酸化アルミニウム、β−２ミクログロブリン（WO91/16924: Rockら）、ムラミルジペプチド、ムラミルトリペプチド（米国特許第5,171,568 号: Burkeら）およびモノリン酸脂質Ａ（米国特許第4,436,728号: Ribiら; およ びWO 92/16231: Francotteら）が挙げられる。また、インターロイキン２などの 免疫調節剤を存在させてもよい。ペプチドおよび他の成分（存在する場合）は、 任意に、リポソームまたはミクロスフェア中にカプセル化する。種々のアジユバ ンドの実験による試験の概要は、米国特許第5,171,568号（Burkeら）を参照され たい。種々のアジュバントが有効である。アジュバントの選択は、少なくとも部 分的にはアジユバントの存在下でのワクチンの安定性、投与経路、および特にヒ トに使用する場合はアジュバントの調節許容性に依存する。 ポリペプチドワクチンは、一般に、有効範囲が広い。通常の投与経路は筋肉内 であるが、他の方法、例えば静脈内、腹腔内、経口、鼻腔内および吸入投与によ って有効である調製物も開発できる。筋肉内投与するときのワクチンの１回の用 量あたりの糖タンパク質Ｂポリペプチドの総量は、一般に約10μg〜5mgであり、 通常は約50μg〜2mgであり、より普通には約100〜500μgである。ワクチンは、 好ましくは、まず開始用量として投与し、次いで、追加用量として、通常は少な くとも４週間後に再び投与する。さらに追加用量投与を行って、定期的に応答を 高め、または活気づけてもよい。糖タンパク質Ｂを発現するウイルス粒子を含むワクチン 能動ワクチンはまた、糖タンパク質Ｂの免疫原性エピトープを発現する粒子と して調製することもできる。 そのような一つのワクチンは、組換えヘルペスウイルスのＬ−粒子を含む（米 国特許第5,284,122号: Cunninghamら）。組換えウイルスのゲノムは、キャプシ ド成分が不完全であり、さもなくば、完全体ウイルスの形成が妨害される。しか し、Ｌ−粒子形成能は保持している。ゲノムは、組換えウイルスの制御要素に機 能を発揮するように結合した、糖タンパク質Ｂをコードする本発明のポリヌクレ オチドを含むように操作する。次いで、ウイルスは、例えば培養細胞中で増殖さ せ、粒子をＦＩＣＯＬＬ^TMなどの適切な勾配上で遠心分離することにより精製す る。そのような調製物は、感染ウイルスを含まず、多数の異なる所望のエピトー プのペプチド成分を発現することができる。 もう一つのそのようなワクチンは、本発明の糖タンパク質Ｂを異種抗原として 発現する生きたウイルスを含む。そのようなウイルスとしては、ＨＩＶ、ＳＩＶ 、ＦＩＶ、ウマ伝染性貧血、ビスナウイルスおよび他の種のヘルペスウイルスが 挙げられる。ウイルスは、治療すべき種では当然、非病原性であるべきであり、 あるいは、遺伝子的改変を行って例えば複製または毒性を低下させることにより 弱毒化すべきである。ヘルペスウイルスは、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子などの複 製に関与する遺伝子の突然変異によって弱毒化できる。ヘルペスウイルスはまた 、糖タンパク質Ｈなどの必須の後期成分の欠失により弱毒化できる（WO 92/0526 3: Inglisら）。生きたワクチンは、特にこれがタンパク質の発現を高める場合 は、宿主において低レベルの複製が可能であるが、治療している被検者に病原性 の徴候を引き起こす程ではない。 生きたワクチンを調製するのに好ましいウイルス種は、アデノウイルスである 。ヒトの治療の場合は、ヒトアデノウイルス４型および７型が、悪影響を及ぼさ ないことが分かっており、ベクターとしての使用に適する。従って、本発明の糖 タンパク質Ｂポリヌクレオチドは、例えば、ウイルスゲノムのＥ１またはＥ３領 域中に操作することができる。ＨＳＶ１またはＨＳＶ２由来の糖タンパク質Ｂを 発現するアデノウイルスベクターは、高力価のウイルス中和抗体の産生を刺激す ることが知られている（McDermottら）。その応答は、実験動物を、各々の生き たウイルスによる致死チャレンジに対して保護する。 また、生きた組換えワクチン用のウイルスとして好ましいのは、組換えポック スウイルス、特にワクシニアである。さらに好ましくは、必須でない毒性因子を 、例えば、その因子に関係するオープンリーディングフレームの欠失または挿入 により不活性化するように改変したワクシニアウイルスの株である（米国特許第 5,364,773号: Paolettiら）。ワクチンを調製するために、糖タンパク質Ｂをコ ードする本発明のポリヌクレオチドは、ウイルスゲノム中に遺伝子操作し、ワク シニアウイルスプロモーターの制御下で発現させる。このタイプの組換え体は、 １回の用量当たり約10⁷〜10⁸プラーク形成単位のワクチン接種に直接使用できる 。抗体応答を刺激するには、１回の用量で十分である。ＨＳＶ１の糖タンパク質 Ｂを含むワクシニアウイルス組換え体は、マウスを致死ＨＳＶ１感染に対して保 護するのに有効である（Cantinら）。 このカテゴリーのもう一つのワクチンは、自己集合複製欠損ハイブリッドウイ ルスである。例えば、WO 92/05263（Inglisら）を参照されたい。粒子は、例え ば、キャプシドおよびエンベロープ糖タンパク質を含んでいてもよいが、完全な ウイルスゲノムは含まない。本発明で具体化されるように、ウイルスエンベロー プにおける糖タンパク質の一つは、糖タンパク質Ｂである。 好ましい態様では、粒子は、異種の種のキャプシドおよびエンベロープに対す る領域をコードするとともに、複製に十分なその種のゲノムのセグメントを有す る第一の種のウイルスベクターによって産生する（米国特許第5,420,026号: Pay neを参照）。第一の種の遺伝子要素は、真核細胞のベクターによる感染が、自己 集合して複製欠損粒子になるキャプシドおよびエンベロープ糖タンパク質を産生 するように選択する。この態様の変形では、キャプシドおよびエンベロープ糖タ ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、第一のウイルス種から誘導される２ つの別々のベクター中に与えられる。キャプシドをコードする領域は、ＨＩＶ、 ＳＩＶ、ＦＩＶ、ウマ伝染性貧血またはビスナウイルスなどのレンチウイルスか ら誘導できる。エンベロープをコードする領域は、本発明の糖タンパク質Ｂをコ ードするポリヌクレオチドを含む。好ましくは、全てのエンベロープ成分は、特 にＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科のヘルペスウイルスによってコードされる。欠損ウイ ルス粒子は、ＢＳＣ−４０などの感受性の強い真核細胞系にベクターを感染させ 、約18時間後に上清を採取するこにより得られる。ウイルス粒子は、所望ならば 、 ショ糖クッションによる遠心分離によりさらに精製できる。粒子はまた、ワクチ ンとして投与する前に、40℃で24時間、0.8%のホルマリンで処理してもよい。 生きた弱毒化ウイルスまたはウイルス類似体を含むワクチンは、冷凍のために 凍結乾燥することができる。希釈剤としては、任意に、組織培養培地、ソルビト ール、ゼラチン、重炭酸ナトリウム、アルブミン、ゼラチン、食塩水溶液、リン 酸緩衝液および滅菌水が挙げられる。他の活性成分としては、任意に、多価ワク チンを製造するために、麻疹、流行性耳下腺炎および風疹の弱毒化株などを添加 することができる。懸濁物は、例えば気体注入法により凍結乾燥することができ る。これは、10〜18Paの乾燥滅菌アルゴンで約−45℃に前冷却しておいた凍結乾 燥室にワクチンのバイアルを置き、その温度を約5〜25℃／時で＋30℃に上げ、 完全真空により第二の凍結乾燥サイクルを行い、次いで、アルゴン下、通常の方 法でそのバイアルを密封することにより行う（EP 0290197B1: Mcaleerら参照） 。生きたヘルペスウイルスを含むワクチンの場合、凍結乾燥した最終の調製物は 、好ましくは、2〜8%の水分を含む。 能動ワクチンの代わりとなる多数の組成物が、本明細書で詳細に記載したもの に限定されることなく、特異的Ｂ−およびＴ−細胞免疫の惹起に有効であること が認められる。そのような組成物は全て、ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科糖タンパク質 Ｂポリヌクレオチドまたはポリペプチドを活性成分として含むならば、本発明の 精神を逸脱することなく具現化される。糖タンパク質Ｂ抗体を含むワクチン ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科の糖タンパク質Ｂに対する抗体は、養子輸送によって 投与することにより、治療を受ける被検者に体液性免疫レベルを直ちに与えるこ とができる。受動的に投与される抗−糖タンパク質Ｂは、Ｔ−細胞免疫が弱めら れた被検者においてすら、他のヘルペスウイルスによる致死チャレンジに対して 実験的に保護する。 使用する抗体分子は、保護を所望する糖タンパク質Ｂに対して特異的であるべ きである。他の抗原、特に治療をうける被検者の内因性抗原とは交差反応すべき でない。抗体は、治療の目的に応じて、全ＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科（クラスII抗 体）に対して、または特定のウイルス種（クラスIII抗体）に対して特異的であ ってもよい。好ましくは、抗体の多価抗原に対する総アフィニティーが少なくと も約10⁸M^-1であり、より好ましくは少なくとも約10¹⁰M^-1であり、より好ましく は少なくとも約10¹²M^-1であり、さらに好ましくは10¹³M^-1以上である。完全な抗 体分子、組換え体、融合タンパク質、または抗体断片が使用できるが、天然の抗 体エフェクター機能を発現することができる完全な抗体分子または組換え体が好 ましい。関係するエフェクター機能としては、それらに限定されないが、ウイル ス凝集、抗体依存性細胞性細胞傷害性、補体活性化およびオプソニン作用が挙げ られる。 抗体は、先の説明に従って調製できる。全身保護の場合、抗体は、好ましくは 単一遺伝子性であり、好ましくはＩｇＧクラスである。粘膜保護の場合、抗体は 、多遺伝子性であり、好ましくはＩｇＡクラスである。抗体は、モノクローナル またはポリクローナルのいずれでもよく、典型的には、モノクローナル抗体のカ クテルが好ましい。また、調製物は、元の抗体源以外の生物学的成分が実質的に ないのが好ましい。所望の反応性を持つ他の抗体分子、および担体または安定剤 は、精製後に添加できる。 いくつかの場合、抗体は、治療されるべき種の抗体とできるだけ密接に似てい るのが望ましい。これは、投与された抗体自体が、受容者の免疫応答の標的にな るのを防ぐためである。このタイプの抗体は、被検者が能動免疫系を有する場合 、または抗体を反復用量で投与すべき場合に特に望ましい。 従って、本発明は、ヒトであるか、ヒトに適応させてある抗−糖タンパク質Ｂ 抗体を含む。ポリクローナルヒト抗体は、予め各々のＲＦＨＶ／ＫＳＨＶ亜科ヘ ルペスウイルスを感染させておいたヒト個体の血清から、または能動ワクチンを 投与したボランティアから精製できる。モノクローナルヒト抗体は、そのような 個体の、例えば末梢血から得たリンパ球から作製できる。一般に、ヒトハイブリ ドーマは、先に概説した方法に従って作製できる。通常、安定なヒトハイブリド ーマの産生には、手技操作の組み合わせ、例えばヒトミエローマ細胞系との融合 および例えばＥＢＶによる形質転換の両方が必要となる。 好適な方法において、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するキメラ非霊 長類動物から、ヒト抗体を作成した（WO 91／10741；Jakobovitsら）。この非霊 長類動物種（典型的には、マウス）は、内因性免疫グロブリン重鎖、および最適 には少なくとも１つの内因性免疫グロブリン軽鎖を、発現することができない。 動物を遺伝子操作して、ヒト重鎖および最適にはヒト軽鎖も発現させる。これら の動物を、ヘルペスウイルスのRFHV／KSHV亜科の糖タンパク質Ｂで免疫する。次 にその血清を使用してポリクローナル抗体を調製し、それらのリンパ球を使用し て常法に従ってハイブリドーマを調製ヒト抗体である。することができる。適切 な選別と精製後、得られる抗体は目的の特異性を有するヒト抗体である。 別の好適な方法において、まず別の種（例えば、マウス）で糖タンパク質Ｂに 対して目的の特異性を有するモノクローナル抗体を作成し、次にヒト化する。抗 体をヒト化するために、特異抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、抗原 結合領域を得て、次に関係のない特異性を有するヒト免疫グロブリンの成分をコ ードするポリヌクレオチドで再構成する。あるいは、特異抗体のヌクレオチド配 列を得て、ヒトの特徴を有する関連配列（これは、例えば化学合成により調製で きる）を設計するのに使用する。特異抗体の重鎖定常領域または軽鎖定常領域（ 好ましくは両方）を、目的のクラスのヒト免疫グロブリンの定常領域で置換する 。相補性決定領域（ＣＤＲ）の外側の両方の鎖の可変領域のセグメントを、ヒト の同等物で置換することも好ましい（EP0329400：Winter）。 より好ましくは、可変領域のセグメントを、これらが抗原結合または結合部位 の構造の維持に関与していないなら、そのヒトの同等物で置換する。重要なアミ ノ酸は、例えばPadlanが記載したように同定しうる。ある１つの方法（WO 94／1 1509：Coutoら）では、既知の免疫グロブリンの配列と結晶データを使用して、 位置コンセンサス配列を作成した。糖タンパク質Ｂ特異抗体のアミノ酸配列をモ デル配列と比較し、抗原結合、ＣＤＲとの接触、または反対の(opposing)鎖との 接触に関与するアミノ酸を同定する。必要な場合は、他のアミノ酸を変化させて 、ヒト免疫グロブリン配列のコンセンサスに一致するようにする。次に、ヒト化 配列をコードするポリヌクレオチドを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、 元々得られた抗体クローンと同じ糖タンパク質Ｂ特異性を有するヒト化抗体を産 生するのに使用する。 これらの方法のいずれかを用いて得られる特異抗体は一般的に、滅菌され、製 剤学的に適合性のある賦形剤と混合される。0.3モルのグリシンのような安定化 剤、および１：10,000チメロサールのような保存剤が存在してもよい。懸濁物は 、例えば炭酸ナトリウムにより中性のｐＨ（約7.0）に緩衝化される。力価は、 例えばCohn冷エタノール分画法により得られる正常な血漿の大きなプールから得 られる、正常なヒトIgGの添加により、随時調整される。代わりに、アルブミン 溶液のような他の希釈剤を使用してもよい。濃度は、１回の投与により0.005〜0 .2mg/kg、好ましくは約0.06mg/kgになるように調整される。１回の投与により好 ましくは、ELISA又は他の適切な方法で検出する時、抗糖タンパク質Ｂの循環レ ベルが得られ、これは、能動糖タンパク質Ｂワクチンを投与されたか、または対 応するウイルスへの急性感染から回復した個体、または実験的研究により、ウイ ルスの病原性投与に対して防御的であることがわかっている個体で観察されるレ ベルに匹敵する。 投与は一般的に、筋肉内注射（静脈内ではない）で行われ、針が血管内に入ら ないように注意すべきである。ヒトグロブリンの投与後に全身性アレルギー反応 を起こした経歴のある個体については、特に注意すべきである。予防的応用のた めに、抗体調製物は、前のセクションで記載したように、糖タンパク質Ｂの能動 ワクチンと組合せて随時投与される。暴露後の応用のために、抗体調製物は、暴 露の１週間以内、より好ましくは24時間以内に、または暴露後出来る限り早く投 与することが好ましい。以後の投与は、約３ヶ月の間隔で随時行われる。 本明細書に記載のすべての治療装置のように、組成物の使用量、および投与の 適切な経路やスケジュールは、治療される特定の個体の臨床症状や必要性に依存 する。特定の治療方法の選択は、最終的には処方する医師または獣医師の責任で ある。 前述の説明、特にヘルペスウイルス（特に、RFHV／KSHV亜科のもの）の糖タン パク質Ｂをコードする領域が、どのように同定できてその配列が得られるかの詳 細な説明を提供する。RFHVとKSHVの両方の糖タンパク質Ｂの領域をコードするポ リヌクレオチド配列が提供される。 RFHVとKSHVについて本明細書に記載するポリヌクレオチド配列は、本試験で使 用される組織サンプル中のヘルペスウイルスからのポリヌクレオチドに含有され る配列の正確な写し(rendition)であると考えられる。これらは、複数のクロー ン から得られる配列データの一致を示す。しかし、ＰＣＲのような増幅法により得 られる配列は、増幅の結果としてたまに配列のエラーがあることが、認識されて いる。このエラー率は、１回の測定について約0.44％〜0.75％であると推定され ており、これは、ｎ回の異なる測定の一致を√（ｎ−1）で割る比率とほぼ同じ である。しかし、エラー率は、1％またはそれ以上になることもある。増幅エラ ーの無い配列は、表７に記載のようなオリゴヌクレオチドを使用して、ヘルペス ウイルスポリヌクレオチド配列のライブラリーを作成して関連するクローンを選 別し、選別されたクローン中のＤＮＡを配列決定することにより得られる。関連 する方法は当業者に公知であり、以後の実施例のセクションの記載も参照された い。 ヘルペスの対立遺伝子変異種やエスケープ突然変異体があることが知られてい る。天然に存在するか、または偶然もしくは故意的に誘導された突然変異を取り 込むポリヌクレオチドやポリペプチドが、本発明の精神を逸脱することなく、単 離または誘導される。 以下の実施例は、当業者に対する指針として提供されるものであり、決して本 発明を限定するものではない。実施例 実施例１：ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂのオリゴヌクレオチドプライマー 既知のヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｂ分子のアミノ酸配列は、ＰＩＲタン パク質データベースから得たか、またはGenBankデータベースから得られるＤＮ Ａ配列から得た。該配列を、コンピューターの整列プログラムを使用して手作業 で並べた。 結果を図３に示す。sHV1、bHV4、mHV68、EBVおよびhHV6配列を使用して、特に ガンマヘルペスウイルス内で比較的よく保存されている領域を同定した。増幅プ ライマーの設計のために９つの領域を選択した。次に、これらの領域のＤＮＡ配 列を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。３’末端に8〜14塩 基対の縮重セグメント、および５’末端に18〜30塩基のコンセンサスセグメント が得られるように、プライマーを設計した。これにより、最適の感受性と特異性 を有するプライマーが得られた。 この縮重セグメントは、ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂ配列の高度に保存さ れた領域にわたって伸長し、最小数の代替コドンを包含する。従ってプライマー は、縮重位置で代替ヌクレオチド残基で合成可能で、最小数の組合せを与える。 得られた各プライマーについて、代替型は256以下であった。 コンセンサスセグメントは、糖タンパク質Ｂ配列の対応する領域の両側に存在 する領域から得られた。一般に、コンセンサスセグメントは、解析したすべての 糖タンパク質Ｂ配列の各位置で最も頻繁に現れるヌクレオチドを選択することに より得られた。しかし、安定な２本鎖を生成するプライマーの能力を最大にする ために、選択されるものはＣまたはＧヌクレオチドに偏っていた。 結果を図４〜12に示し、表４に要約する。ＰＣＲでは、「センス」配向を有す るものとして表４に示すオリゴヌクレオチドは、該コード鎖に対するアンチセン ス鎖とハイブリダイズし、糖タンパク質Ｂをコードする配列と同じ方向に重合を 開始することにより、プライマーとして作用するであろう。「アンチセンス」配 向を有するものとして表４に示すオリゴヌクレオチドは、コード鎖とハイブリダ イズし、糖タンパク質Ｂをコードする配列の方向とは反対の方向に重合を開始す るであろう。 設計した配列に従う合成オリゴヌクレオチドは、Oligos Etc，Inc.に注文して 得た。実施例２：ＤＮＡ抽出 生検サンプルは、エイズと診断されたヒト患者のカポシ肉腫病変から得た。サ ンプルをパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、これを処理して 通常の組織学的試験を行った。 パラフィンサンプルの断片を、1.5mlのエッペンドルフ（登録商標）円錐遠心 分離管中で500μlのキシレンで抽出した。サンプルを室温で５分間静かに揺すり 、試験管を、エッペンドルフ（登録商標）卓上遠心分離機を用いて14,000rpmで ５分間遠心分離した。パスツールピペットでキシレンを除去した後、95％エタノ ール500μlを加えて、サンプルを再懸濁し、次に再度遠心分離した。エタノール を除去し、洗浄工程を繰り返した。次にサンプルを１時間空気乾燥した。500μl のプロテイナーゼ−Ｋ緩衝液（0.5％ TWEEN（登録商標）20、界面活性剤；50mM トリス緩衝液（ｐＨ7.5）、50mM NaCl）と、5μlのプロテイナーゼＫ（20mg/ml ）を加えて、サンプルを55℃で３時間インキュベートした。95℃で10分インキュ ベートしてプロテイナーゼ−Ｋを不活性化した。 ＫＳ組織からのＤＮＡのサンプルをプールして、増幅反応用のポリヌクレオチ ドの一貫した供給源を得た。このプールは、本出願人らによる米国特許出願60／ 001,148に記載のように、KSHVＤＮＡポリメラーゼ配列の増幅により検出すると 、KSHVのＤＮＡを含有することがわかった。実施例３：KSHVの糖タンパク質Ｂの増幅セグメントを得る 実施例１で得られたオリゴヌクレオチドを使用して、以下のプロトコールに従 って、実施例２に記載のKSHV組織から抽出したＤＮＡのセグメントを増幅した。 2μlのプールしたＤＮＡ鋳型1μlのオリゴヌクレオチドFRFDA（50pmol/μl） 、1μlのオリゴヌクレオチドTVNCB（50pmol/μl）、10μlの10×緩衝液、2.5mM の各デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）を含有する1μl、65μlの蒸留 水、および65μlの鉱物油を使用して、最初のＰＣＲ反応を行った。パーキン・ エルマー（Perkin-Elmer）（モデル480）ＰＣＲ装置中で、混合物を80℃に加熱 した。次に、0.5μlのTaqポリメラーゼ（BRL、5U/μl）および19.5μlの水を加 えた。以下の順序で35サイクルの増幅を行った：94℃で１分、アニーリング温度 で１分、および７２℃で１分。アニーリング温度は、最初のサイクルで60℃であ り、50℃に達するまでは各サイクルで2℃ずつ下げた。その後のサイクルでは、 アニーリング温度として50℃を使用して行った。 第２回目のＰＣＲ反応は以下のように行った：前の工程からの1μlの反応混合 物に、1μlのオリゴヌクレオチドNIVPA（50pmol/μl）、1μlのオリゴヌクレオ チドTVNCB（50pmol/μl）、10μlの10×緩衝液、1μlのｄＮＴＰ、66μlの水、 および65μlの鉱物油を加えた。混合物を80℃に加熱し、水19.5μl中の0.5μlの Taqポリメラーゼを加えた。前述のように同じ温度のステップダウン法を使用し て、35サイクルの増幅を行った。ＰＣＲ産物を2％アガロースゲルで電気泳動し 、臭化エチジウムで染色して解析した。 14種類の試験緩衝液を用いて、増幅操作を２ラウンド行った。５種類の緩衝液 は、他のヘルペス配列から類推される大体のサイズのＰＣＲ産物を与えた。これ らは、WB4緩衝液（10×WB4緩衝液は、0.67Ｍトリス緩衝液（ｐＨ8.8）、40mM Mg Cl２、0.16Ｍ（NH４）２SO4、0.1Ｍ β−メルカプトエタノール、1mg/mlウシ血 清アルブミンであり、これを反応物中で１：10に希釈した）を含有した。またWB 2緩衝液（10×濃縮物中で20mM MgCl２である以外は、WB4緩衝液と同じである） も試験した。また、最終的に反応容量に希釈した時、10mMトリス（ｐＨ8.3）、3 .5mM MgCl２、および25mM KCl；または、10mMトリス（ｐＨ8.3）、3.5mM MgCl２ 、および75mM KCl；または10mMトリス（ｐＨ8.8）、3.5mM MgCl２、および75mM KClを含有する緩衝液も試験した。WB4緩衝液は、最も強いバンドを示し、いくつ かの別の弱いバンドを示した。これは、WB4サンプル中の標識した増幅したポリ ヌクレオチドの全体の量が多いことが原因かも知れない。 WB2緩衝液による増幅から得られた産物を、さらに試験するために選別した。 第３ラウンドの増幅を行って、放射性標識を導入した。最後に使用したオリゴヌ クレオチド（TVNCB）を、ガンマ３２Ｐ−ＡＴＰで末端標識し、前の増幅工程か らの反応混合物20μlに、1μlの2.5mM ｄＮＴＰとともに加えた。混合物を80℃ に加熱し、0.5μlのTaqポリメラーゼを加えた。94℃、60℃および72℃で５サイ クル行って増幅させた。Circumvent配列決定ゲルキットからの8.8μlの充填緩衝 液を使用して、反応を停止させた。 放射性標識反応生成物の約4μlのアリコートを、6％ポリアクリルアミド配列 決定ゲルで、51℃で1.5時間電気泳動した。ゲルを1.5時間乾燥し、12時間感光し てオートラジオグラフィーを作成した。２つのバンドが同定された。大きいバン ドは、他のガンマヘルペスウイルス配列との類推からの断片について予測される サイズを有した。 大きいバンドに印を付けて、切り出し、40μlのTE緩衝液（10mMトリスと1mMED TA、ｐＨ8.0）でインキュベートしてＤＮＡを溶出させた。抽出したＤＮＡにつ いて、1μlの溶出液、10μlの10×WB2緩衝液、1μlの2.5mM ｄＮＴＰ、1μlの各 第２のセットのオリゴヌクレオチドプライマー（NIVPAとTVNCB）、および65μl の水を使用して、さらに増幅反応を行った。混合物を80℃に加熱し、水19.5μl 中の0.5μlのTaqポリメラーゼを加えた。前述のように同じ温度のステップダウ ン法を使用して、35サイクルの増幅を行った。実施例４：KSHV糖タンパク質Ｂの386塩基断片の配列 KSHVの糖タンパク質Ｂ遺伝子から増幅したポリヌクレオチド断片を精製し、以 下の方法に従いクローン化した。 40μlの増幅産物を2％アガロースゲルにかけ、０．125μg/mlの臭化エチジウ ムを使用して染色した。約400塩基対で１つのバンドを切り出し、キアゲン（Qia gen）（登録商標）ゲル抽出キットを使用して、製造業者の説明書に従って精製 した。 精製したＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ（登録商標）−クローニングベクターに結合 させた。このベクターを使用して、コンピテントな細菌（E.coli JM-109）を形 質転換した。増幅したＤＮＡを含有する細菌クローンを取り上げ、培養した。細 菌を溶解し、フェノール−クロロホルムで抽出し、次にエタノールで沈殿させて ＤＮＡを抽出した。正しいサイズの挿入体を含有するコロニーを使用して、配列 決定のためのＤＮＡを得た。クローン挿入体を、ベクター特異的オリゴヌクレオ チド（前進および逆プライマー）を使用して、シーケナーゼ（SEQUENASE）（登 録商標）７−deaza ｄＧＴＰキットを用いて製造業者の説明書に従って、両端か ら配列決定した。１つのKSHV糖タンパク質Ｂ増幅産物の５つのクローンから得た 配列データを組合せて、新しい断片のコンセンサス配列を得た。 プライマーハイブリダイズ領域の間の断片の長さは、319塩基対であった。こ のヌクレオチド配列を配列番号３としてリストに挙げ、図１に示す。コードされ たポリペプチド配列を、配列番号４としてリストに示す。 図13は、糖タンパク質Ｂ遺伝子断片の配列を、他のガンマヘルペスウイルスの 対応する配列と比較する。点（．）は、他のガンマヘルペスウイルス中のKSHV配 列同一の残基を示す。ダッシュ（−）は、コードされたタンパク質の最適の整列 を提供するために、隙間(gap)を加えた位置を示す。KSHVと他のリストに挙げた 任意の配列との間で同一の連続的なヌクレオチドの最も長い鎖は14である。短い 保存配列は、断片全体に分散している。全体として、KSHVと、２つの最も近いヘ ルペスウイルス配列であるsHV1とbHV4との間で、ポリヌクレオチド断片は63％同 一である。 配列データを使用して、20〜40塩基対の長さの３型オリゴヌクレオチドプライ マーを設計した。このプライマーを、KSHV糖タンパク質Ｂポリヌクレオチドと優 先的にハイブリダイズするが、糖タンパク質Ｂをコードする他の配列決定したポ リヌクレオチドとはハイブリダイズしないように、設計した。この型のプライマ ーの例を前記の表７に挙げる。 図14は、同じ糖タンパク質Ｂ遺伝子断片によりコードされる予測されるアミノ 酸配列を比較する。KSHVと、すでに既知のガンマヘルペスウイルスであるbHV4と の間で、アミノ酸のレベルで、２つの短いセグメントが共有される。第１のセグ メント（配列番号64）は13アミノ酸の長さであり、断片のＮ−末端近くに位置す る。第２のセグメント（配列番号65）は15アミノ酸の長さであり、断片のＣ−末 端近くに位置する。KSHVと他のガンマヘルペスウイルスの間で共有されるすべて の他のセグメントは、９アミノ酸であるかまたはそれより短い。実施例５：RFHV糖タンパク質Ｂの386個の塩基を含む断片の配列 ワシントン大学Regional Primate Research CenterのMacaque nemes trinaサ ルの腫瘍から組織試料を採取した。これらの試料をパラホルムアルデヒド中で固 定し、パラフィン中に包埋した。実施例２に従って、これらの試料からＤＮＡを 抽出した。 ＤＮＡ調製物中にRFHVポリヌクレオチドが存在するかを調べるために、ＤＮＡ ポリメラーゼ遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用い てPCR増幅反応を行った。この手順の詳細については、同一所有者の米国特許出 願第60/001,148号に記載されている。このようにして確認されたRFHVポリヌクレ オチドを含有するＤＮＡ抽出物をプールし、本研究で使用した。 RFHVポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ調製物を、糖タンパク質Ｂコンセンサ ス縮重オリゴヌクレオチドFRFDAおよびTVNCBを用いたPCR増幅反応において鋳型 として機能させ、続いてオリゴヌクレオチドNIVPAおよびTVNCBを用いて２回目の 増幅を行った。条件は、本質的には実施例３と同じであったが、最初の原料中の ＤＮＡの量および使用した条件の下では、WB4緩衝液だけが強度の大きいバンド を生じた点が異なっていた。増幅されたＤＮＡの標識化は、前の場合と同じよう に32P末端標識化NIVPAを用いて行った。この生成物を、6%ポリアクリルアミドゲ ル上で電気泳動させ、オートラジオグラムを得た。約386塩基対および分子量が 約10大きいコンカテマーに対応するバンドの並びが観測された。386塩基対のバ ンド(同時に実験したKSHV断片と同じ移動度を有する)をゲルから切り取って抽出 した。 この抽出物中のＤＮＡが特異的増幅反応から得られたものであるかを 調べるために、NIVPASQ単独、TVNCBSQ単独、または２つのプライマーの併用のそ れぞれの場合についてPCRを行った。緩衝液条件は、最初の増幅反応の場合と同 じであった。混合物を80℃まで加熱し、Taqポリメラーゼを添加し、段階的温度 降下法を用いて増幅を35回繰り返した。理論的には、特異的増幅反応が起こると 、１つのプライマーを使用した場合、生成物の量は直線的に増大し、反対の方向 の２つのプライマーを使用した場合、指数関数的に増大する。従って、両方のプ ライマーを用いた反応の方が生成物の量が多い場合は特異的であるとみなされ、 一方、３つの混合物に対して同量の生成物が得られた場合は非特異的増幅とみな される。これらの試験的反応によって得られた増幅生成物は、アガロースゲル上 でエチジウムブロミドで染色することにより分析した。RF抽出物を分析した結果 、NIVPASQ反応では生成物は存在せず、TVNCBSQ反応では適切な移動度を有する中 程度に染色されたバンドが得られ、両方のプライマーを併用した場合は、強く染 色されたバンドが得られた。並行して行ったKSHV断片のアッセイの結果、NIVPAS Q反応では僅かに染色されたバンドが得られ、TVNCBSQ反応ではバンドは得られず 、両方のプライマーを併用した場合は、強く染色されたバンドが得られた。本発 明者らは、RF抽出物中の386塩基対のバンドは特異的増幅生成物を示すものであ ると判断した。 従って、両方のプライマーを用いて増幅させたRF抽出物40μLを2%アガロース ゲル上で分離させ、約386塩基対のバンドを切り取った。QIAGEN（商標）キット を使用してアガロースを除去し、この生成物をE．coli中でクローニングし、実 施例４に示したように配列を決定した。同じ増幅RFHV生成物から得られた３つの 異なるクローンに対するコンセンサス配列を決定した。 RFHV糖タンパク質Ｂ断片(配列番号1)のポリヌクレオチド配列を、KSHVから得 られた対応する配列と共に、図１中に併記した。また、コードされたRFHVアミノ 酸配列(配列番号2)も示されている。プライマーのハイブリダイゼーション領域 間(ヌクレオチド36〜354)では、ポリヌクレ オチド配列は76%同一であり、アミノ酸配列は91%同一である。内部システイン残 基および潜在的Ｎ結合グリコシル化部位はいずれも、２つのウイルスの間で保存 されている。 こうした配列データを利用して、20個〜40個の塩基対の長さの３型オリゴヌク レオチドプライマーの設計した。RFHV糖タンパク質Ｂポリヌクレオチドと優先的 にハイブリダイズするが、糖タンパク質Ｂをコードする他の配列のポリヌクレオ チドとはハイブリダイズしないように、プライマーを設計した。このタイプのプ ライマーの例を、既に提示した表７中に列挙した。 図15では、糖タンパク質Ｂ遺伝子断片のヌクレオチド36〜354によってコード される推定アミノ酸配列の比較を行う。KSHV配列に関しては、RFHVと既知のガン マヘルペスウイルスbHV4との間で２つの短いセグメントが共有されている。RFHV と他のガンマヘルペスウイルスとの間で共有される他のセグメントはすべて、長 さが９アミノ酸よりも短い。 図16は、データの利用が可能なヘルペスウイルスのスペクトル中の同じ糖タン パク質Ｂ断片に対する配列データの並びである。図17は、図16に示された部分的 糖タンパク質Ｂアミノ酸配列での同一性の程度に基づいて、ヘルペスウイルス間 の系統発生的関係を示している。アミノ酸の相同性から判断すると、図示された ウイルスの中ではRFHVおよびKSHVが、bHV4、eHV2、およびsHV1と最も密接に関連 する。実施例６：RFHV/KSHV亜科に対するオリゴヌクレオチドプライマーおよびプロー ブ RFHVおよびKSHVに対して得られたポリヌクレオチド断片に基づき、RFHV/KSHV 亜科のメンバーを用いてPCRプライマーまたはハイブリッド形成プローブとして 使用可能な７個の２型オリゴヌクレオチドを設計した。 ４個のコンセンサス縮重２型オリゴヌクレオチドSHMDA、CFSSB、ENTFA、およ びDNIQBを、それらが誘導される配列と並べて図17中に示す。これらのオリゴヌ クレオチドは、実施例１のオリゴヌクレオチドと同様に、5 '末端の方向にコンセンサスセグメントを有し、3'末端の方向に縮重セグメント を有する。しかしながら、これらのオリゴヌクレオチドは、RFHV配列およびKSHV 配列だけに基づくものであり、従って、RFHV/KSHV亜科の糖タンパク質Ｂと優先 的に安定な二本鎖を形成するであろう。２型オリゴヌクレオチドの例を、既に提 示した表６中に列挙した。 異なる２型オリゴヌクレオチドは、センス方向またはアンチセンス方向を呈す る。PCR増幅において、反対方向のプライマーを併用してもよい。あるいは、任 意の２型オリゴヌクレオチドを、反対方向の１型オリゴヌクレオチドと組合せて 用いてもよい。実施例７：上流および下流糖タンパク質Ｂ配列 この他の配列データを得るために、更に増幅反応を行う。KSHVＤＮＡの供給源 は、実施例２に従って調製されたカポジ肉腫組織(凍結組織塊もしくはパラフィ ン包埋組織)、または体腔リンパ腫などのKSHVを病因とする癌から発生させた細 胞系統である。この他に好適なものとしては、培養で繁殖させたKSHVが挙げられ る(Weissら)。 コード鎖の5'方向の更なる配列データを得る一般的な方法は、断片より上流の 領域とハイブリダイズするコンセンサス縮重（１型）オリゴヌクレオチドを5'プ ライマーとして使用し、最も密接なウイルス特異的（３型）オリゴヌクレオチド を3'プライマーと組み合わせて使用する増幅反応を行なうことである。この場合 、第１シリーズの増幅サイクルは、例えば、第１のプライマーの組合せとしてFR FDAおよびTNKYBを用いることにより行われる。この後、場合に応じて、第２シリ ーズの増幅サイクルを、例えば、第２のプライマーの組合せとしてFRFDAおよびG LTEBを用いることにより行ってもよい。 使用される条件は、実施例３および４に記載のものと同じである。実施例３に 記載した段階的温度降下法(temperature step-down procedure)を用いてWB4緩衝 液中で反応を行う。増幅を２ラウンド行ってから、最後に使用されるγ-32P-ATP で末端標識化されたウイルス特異的オリゴヌ クレオチド(この場合はGLTEB)を用いて、生成物を標識化する。標識化された生 成物を6%ポリアクリルアミド上で電気泳動し、他のヘルペスウイルスとの類似性 から予測される適切なサイズに対応するバンドを切り取る。再び増幅を行った後 、生成物を精製し、クローニングし、前の場合と同様に配列決定する。この新し い断片に対するコンセンサス配列は、およそ３つの測定の結果を組み合わせるこ とにより得られる。 コード鎖の3'方向の更なる配列データを得るために、断片より下流の領域とハ イブリダイズするコンセンサス縮重（１型）オリゴヌクレオチドを3'プライマー として使用し、それと組み合わせて最も密接なウイルス特異的（３型）オリゴヌ クレオチドを5'プライマーと組み合わせて使用することにより増幅を行う。１つ の実施例において、NVFDBおよびTVFLAを使用して第１シリーズの増幅サイクルを 行い、場合に応じて、NVFDBおよびSQPVAを使用して第２シリーズを行う。前の場 合と同様に、増幅および配列決定を行う。この新しい配列を利用して、センス方 向の更なる３型オリゴヌクレオチドを設計し、これを他の下流ハイブリダイズ・ １型オリゴヌクレオチド(例えば、FREYBおよびNVFDB)と共に用いて更なる配列デ ータを得る。あるいは、反対方向の１型オリゴヌクレオチドを使用して、さらな る3'方向の配列データが得られる。例えば、２つのプライマーを、FRFDA、NIVPA 、TVNCA、NIDFB、NVFDB、およびFREYBから成る群より選択する。追加のプライマ ーをネステッド増幅のために選択してもよい。 最下流オリゴヌクレオチドプライマーから3'配列データを得るために、CYSRA などの１型プライマーまたはTVFLAなどの３型プライマーを、ＤＮＡポリメラー ゼ遺伝子の5'末端方向にハイブリダイズするプライマーと組み合わせて使用して もよい。RFHVおよびKSHV関連ヘルペスウイルスのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子にハ イブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーは、同一出願人の米国特許出願 第60/001,148号に記載されている。ＤＮＡポリメラーゼコード領域は、糖タンパ ク質Ｂコード領域の3'側に位置する。こうしたプライマーの組合せを用いてPCR を行えば、 糖タンパク質Ｂコード領域の3'末端と、介在配列が存在する場合はその介在配列 と、ＤＮＡポリメラーゼコード領域の5'末端とを含むポリヌクレオチドが増幅さ れるものと考えられる。 この方法を以下のように実施した。 糖タンパク質Ｂに対するKSHVコード配列を含有するＤＮＡを、凍結されたカポ ジ肉腫サンプル(RiGrと称す)および体腔リンパ腫から誘導された細胞系(BC-1と 称す)より調製した。 完全長5'配列を得るために、糖タンパク質Ｂの上流に位置すると考えられるコ ード配列〔すなわち、キャプシド成熟遺伝子(CAPMAT)〕に対する１型オリゴヌク レオチドプローブを設計した。他のウイルス由来のCAPMATの既知の配列を利用し て比較的保存された領域を同定し、糖タンパク質Ｂのセンス方向にCAPMATとハイ ブリダイズするコンセンサス縮重プライマー(FENSAと称す)を設計した。糖タン パク質Ｂの下流に位置すると考えられるコード配列〔すなわち、ＤＮＡポリメラ ーゼ〕に対する１型オリゴヌクレオチドプローブを設計した。これらのオリゴヌ クレオチドを、表９に掲載する。 糖タンパク質Ｂコード領域全体をカバーするセンスプライマーおよびアンチセ ンスプライマーの対を使用して、増幅を行った。得られた断片としては、表10に 列挙されたものが挙げられる。 増幅および配列決定に使用したプロトコルは次の通りであった。ＤＮＡ鋳型を プライマー対(例えば、FREYAおよびSCGFB)と共に使用してPCR増幅を行った。94 ℃で45秒間、60℃で45秒間、および72℃で45秒間のサイクルを35回行い、続いて 最終伸長工程を72℃で10分間行った。予測された長さのPCR生成物を、Quiagen社 製のQIAQUICK（商標） PCR精製キットを使用してアガロースゲル上で精製した。 精製されたPCR生成物を、第２ラウンドの増幅処理にかけ、再び増幅した。この 第２ラウンドは、ネステッド方式または非ネステッド方式で交互に行った。所与 の実施例において、第２ラウンドの増幅を、FREYAとSCGFBを用いてまたはFREYA とHVLQBを用いて行った。94℃で45秒間、65℃で45秒間、および72℃で45秒間の 増幅を35サイクル行い、続いて最終伸長工程を72℃で60分間行った。 PCR生成物をNovagen PT7 BLUE（商標）ベクター中に連結し、Novablueコンピ テントE coliに形質転換した。連結および形質転換は、Novagenプロトコルを用 いて行った。M13前進および後退オリゴヌクレオチドを利用したPCRにより、コロ ニーのスクリーニングを行った。Quiaquickプラスミド単離キットを使用して、3 7℃においてLBブロス5mL中で一晩 増殖させたPCR陽性コロニーからプラスミドを単離した。M13前進および後退配列 決定用プライマーを利用した手操作によるプラスミドの配列決定はUSB Sequenas e Kitプロトコル(USB)に従って行った。自動配列決定はABI法により行った。 KSHV配列が現れた場合、更なるKSHV特異的３型オリゴヌクレオチドを設計した 。３型オリゴヌクレオチドを種々の組合せの対で、または１型オリゴヌクレオチ ドと共に使用して、KSHVＤＮＡのセクションのPCR増幅、クローニング、および 配列決定を行った。使用した３型オリゴヌクレオチドを、表11に列挙する。 図18は、オリゴヌクレオチドがKSHV ＤＮＡとハイブリダイズする位置を表す マップである。使用した略号は次の通りである：ｄまたはｈ=ヘルペスウイルス 配列とハイブリダイズするコンセンサス縮重プローブ （１型）、sq=他の利用可能な配列決定用尾部、ｇ=ガンマヘルペスウイルスとハ イブリダイズするプローブ（１型）、ｆ=ヘルペスウイルスのKSHV/RFHV科とハイ ブリダイズするプローブ（２型）、ks=KSHVに特異的なプローブ（３型）。 図19は、特性決定した断片のそれぞれから得られた配列データをコンパイルす ることによって得られたコンセンサス配列のリストである。ポリヌクレオチド配 列(配列番号91)が示されている。ＤＮＡポリメラーゼコード配列の前の領域を組 み込んだヌクレオチド1〜3056(配列番号92)は、本発明の実施態様である。この コンセンサス配列は、各サンプルおよび各遺伝子セグメントに対する複数のクロ ーンの配列決定を行うことによりカポジ肉腫サンプルRiGrおよびリンパ腫細胞系 BC-1の両方から得られたデータの共通部分を表している。各位置において、約3 〜9の測定が行われた。 図19にはまた、３つのオープンリーディングフレーム(配列番号93〜95)のアミ ノ酸翻訳が示されている。コード化CAPMATタンパク質断片(配列番号93)は、異な る読み枠で(in a different phase)糖タンパク質Ｂコード配列(配列番号94)の5' 末端と重複する。更に上流では、CAPMATコード配列はまた、エプスタインバーウ イルスのＲＮＡポリメラーゼ２に対する結合部位との相同性から判断して、糖タ ンパク質Ｂ転写物に対する調節要素を含む可能性がある。この推定プロモーター 領域は、図中で下線が引かれている。糖タンパク質Ｂコード配列の3'末端には、 ポリアデニル化シグナルを含む非翻訳配列がある。更に下流には、ＤＮＡポリメ ラーゼ断片に対するコード配列(配列番号95)がある。 糖タンパク質Ｂコード配列をGenBankの他の配列と比較したところ、他のヘル ペスウイルス由来の糖タンパク質Ｂ配列とだけ相同性が見出された。20個ヌクレ オチド以上の副次的配列は、数種のヘルペスウイルスと共有されている。配列AT GTTCAGGGAGTACAACTACTACAC(配列番号98)は、eHV2と共有されている。この配列以 外で21個以上のヌクレオチドを有するKSHVコード領域のセグメントは、他の既知 の配列と比較して明らか にユニークである。 糖タンパク質Ｂコード配列内で、カポジ肉腫サンプルを用いて得られた配列デ ータと体腔リンパ腫細胞系を用いて得られた配列データとの間にはポリヌクレオ チドレベルで４つの対立変異体が認められた。これらは図中で矢印で示されてい る。１つの変異体以外はすべて、サイレント変異体である。第４番目の変異体は 、遺伝子産物中でプロリンからロイシンへの変異を生じる。 KSHV糖タンパク質Ｂ遺伝子によりコードされたタンパク質産物は、次のような 特徴を有する：すなわち、そのＮ末端には、他のヘルペスウイルスの糖タンパク 質Ｂのシグナルペプチドドメイン(「リーダー」)に対応するドメインが存在する 。完全なKSHV糖タンパク質Ｂアミノ酸配列が他のヘルペスウイルスに対する既知 の配列と共に図３に示され、相同領域が明らかにされている。ヘルペスウイルス 糖タンパク質Ｂ配列間で保存性の高い残基には、アステリスク(*)が付けられて いる。他のヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂ配列間で保存されるシステイン残基 もまた、KSHVの配列中に存在する。この他に、更に２つのシステインが存在し、 これにより、更なる内部ジスルフィドが形成されて三次元構造が安定化されるで あろう(「・」で印を付けた)。KSHV糖タンパク質Ｂ配列にはまた、他のヘルペス ウイルスの糖タンパク質Ｂ上の推定膜架橋ドメインに対応するドメインが含まれ る。 同様の方法で、RFHVの完全長糖タンパク質Ｂ配列が得られる。RFHVＤＮＡの供 給源もまた、ワシントン大学Regional Primate Research Centerの感染サルから 同様に調製された組織である。実施例５の記載に従ってＤＮＡを抽出する。 コード鎖の5'方向の更なる配列データを得るために、断片より上流の領域とハ イブリダイズするコンセンサス縮重（１型）オリゴヌクレオチドを5'プライマー として使用し、それと組み合わせて最も密接なウイルス特異的（３型）オリゴヌ クレオチドを3'プライマーとして使用することにより増幅を行う。この場合、第 １シリーズの増幅サイクルを、例え ば、第１のプライマーの組合せとしてFRFDAおよびAAITBを用いることにより行う 。この後、第２シリーズの増幅サイクルを、同じプライマーを用いるか、または 、ネステッドプライマーの組合せとしてFRFDAおよびGMTEBを用いて行う。増幅の 条件は、KSHBに対して記載したものと同じである。 コード鎖の3'方向の更なる配列データを得るために、断片より下流の領域とハ イブリダイズするコンセンサス縮重（１型）オリゴヌクレオチドを3'プライマー として使用し、それと組み合わせて最も密接なウイルス特異的（３型）オリゴヌ クレオチドを5'プライマーとして使用することにより増幅を行う。この場合、第 １シリーズの増幅サイクルを、NVFDBおよびVEGLAを用いて行い、続いて、第２シ リーズを、NVGDBおよびPVLYAを用いて行う。増幅および配列決定は、先に述べた 手順で行う。この新しい配列を使用して、センス方向の更なる３型オリゴヌクレ オチドを設計し、得られた３型オリゴヌクレオチドを他の下流ハイブリダイズ性 １型オリゴヌクレオチド(すなわち、FREYBおよびNVFDB)と共に用いて更なる配列 データを得る。 ポリヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データを使用して、RFHVおよびKSHVの 糖タンパク質Ｂを互いに比較するか、または他のヘルペスウイルスの糖タンパク 質Ｂと比較する。実施例６の場合のように、RFHVおよびKSHVの配列を使用して、 更なる亜科特異的２型オリゴヌクレオチドを設計してもよい。実施例８：ＤＮＡライブラリー由来の糖タンパク質Ｂ配列 完全糖タンパク質Ｂ配列の作製または確認は、感染組織からＤＮＡライブラリ ーを発生させることによって行うことができる。この研究用のＤＮＡの供給源は 、実施例７に対するものと同じである。 ＤＮＡ溶解産物をプロテイナーゼＫを用いて消化し、フェノール‐クロロホル ムを用いてＤＮＡを抽出する。大量の透析を行った後、Sau3A I制限エンドヌク レアーゼを用いて調製物を部分的に消化する。消化物を ショ糖勾配遠心分離にかけ、約10〜23キロベースの断片を回収する。BamHIを用 いた切断により、ラムダDASH-2TMベクターファージ(Stratagene)を調製する。次 に、大きさに基づいて選択した断片をベクターと混合し、ＤＮＡリガーゼを用い て連結する。 製造業者の指示に従って、Stratagene由来のパッケージング抽出物を用いて連 結済みベクターを調製する。これを用いてXL1-BLUETM MRA細菌に感染させる。約 200,000個のファージ感染細菌を、プレート１枚あたり約20,000個の密度で寒天 上にプレーティングする。培養後、プレートをニトロセルロース上に重ね、次い でニトロセルロースを切断して断片に分割した。断片からファージを溶離させ、 これらのＤＮＡを、適切なウイルス特異的プライマーを用いた増幅反応にかける 。反応生成物をアガロースゲル上で泳動し、エチジウムブロミドを用いて染色す る。期待された大きさの増幅ＤＮＡを与えるプレートの領域からファージを回収 する。回収されたファージを用いて新しいXL1細菌に感染させ、新しい培地中で 再びプレーティングを行う。限界希釈法で単一クローンが得られるまで、この処 理を繰り返す。 次に、この手順により選択された各クローンを、制限ヌクレアーゼを用いてマ ッピングし、含まれる断片のサイズを確認する。ベクター特異的プライマーを用 いて、糖タンパク質Ｂの全配列を含有するのに十分な大きさを有するインサート を両末端において配列決定する。これらの配列を、全EBVゲノムの既知のポリヌ クレオチド配列と比較し、その断片が無傷の糖タンパク質Ｂ配列を含むかを調べ る。適切なクローンからＤＮＡを取り出し、切断し、標準的技法に従ったショッ トガンクローニングにより配列を決定した。実施例９：糖タンパク質Ｂの抗原領域 糖タンパク質Ｂ遺伝子中のNIVPAおよびTVNCBに対するハイブリッド形成部位の 間のポリヌクレオチド断片は、図14に示されるような推定アミノ酸配列を有する 。これらの配列に基づいて、RFHVまたはKSHVに特 異的なペプチドまたは種の間で共有されるペプチドを同定することができる。 図14には、長さが６または７アミノ酸からなるペプチドの例が示されている。 これらのペプチドの一部は、対応するガンマヘルペスウイルスペプチドと比較し た場合、RFHVまたはKSHVのもの(クラスIII)またはRFHV/KSHV亜科のもの(クラスI I)と区別される１つ以上の残基を含んでいる。 糖タンパク質Ｂの106個のアミノ酸領域内に含まれる領域が抗体により認識さ れるかを確認するために、コンピュータ解析を行い、HoppおよびWoods抗原性プ ロットを作製した。HoppおよびWoods解析は、連続したアミノ酸残基の相対的親 水性および疎水性に一部基づくものである(Hoppら)。結果は、図20、21、および 22に示されている。記号は次の意味を有する：〜 =抗原性；＾= 疎水性；# = 潜 在的Ｎ結合グリコシル化部位。図20は、RFHV由来の106個のアミノ酸からなる糖 タンパク質Ｂ断片の解析を示し；図21は、KSHV断片の解析を示し；図22は、全KS HV配列の解析を示している。 RFHVおよびKSHVのいずれにも、抗体標的部位となりうる領域が数ヶ所含まれて いる。特に、KSHV配列には、この断片のＮ末端近傍および潜在的Ｎ結合グリコシ ル化部位近傍に抗原領域が存在する。全長KSHV配列には、シグナルペプチド(残 基〜25)および膜貫通ドメイン(残基〜750)の両方に対応する疎水性最小部分が存 在する。スコア＞1.0または＞1.5を有する推定抗原領域が数多く観測される。特 筆すべき領域は、残基440−460あたりに存在し、スコアが〜2.5に達する領域で ある。実施例10：ウイルス特異的糖タンパク質Ｂ増幅アッセイ ネステッド(nested)ウイルス特異的ネスト増幅反応において３型オリゴヌクレ オチドを使用し、感染の可能性のある被験者から得られた組織サンプルのパネル 中にRFHVまたはKSHVが存在するかを検出する。 KSHVについては、ウイルス感染の恐れのある組織(特に、カポジ肉腫 症および体腔Ｂ細胞リンパ腫を患ったヒト被験者から得られた生検サンプル)か らＤＮＡを抽出する。KS症から得られたサンプル、同一個体から得られた明らか に感染されていない組織サンプル、明らかにKS症でないHIV陽性個体から得られ たサンプル、HIV陰性個体から得られたサンプルなど多数の異なる組織サンプル を使用する。５個のサンプルを、各カテゴリーで使用する。実施例２に記載した 手順により、ＤＮＡを調製する。 オリゴヌクレオチドプライマーGLTEA、YELPA、VNVNB、およびENTFBを、Oligos Etc.，Inc.から取り寄せる。第１段階でプライマーGLTEAおよびENTFBを使用し 、第２段階でプライマーYELPAおよびVNVNBを使用して、２段階でＤＮＡを増幅す る。増幅の条件は、実施例３のものと同じである。反応生成物を2%アガロースゲ ル上で電気泳動し、エチジウムブロミドで染色し、UV光の下で観察する。エチジ ウムブロミド染色で検出した場合、反応生成物中に多量のポリヌクレオチドが存 在すれば結果は陽性と見なされる。このことは、サンプル中にKSHV由来ＤＮＡ( 特に、YELPAからVNVNBまでの糖タンパク質Ｂコード断片)が存在することを意味 する。こうした結果を、患者の病歴およびサンプルの組織病理学的所見と対応さ せ、アッセイの結果が陽性であることとKSに対する罹病性との間に相関があるか を調べる。 RFHVについては、Washington Regional Primate Research Centerの霊長類コ ロニー中で生存するMacaca nemestrinaサルおよびMacaca fascicularisサルから 採取した凍結組織サンプルからＤＮＡを抽出する。繊維腫症の顕在的徴候を示す 組織部位、同じサルの明らかに感染していない部位、病状が見られないサルの対 応する部位から、それぞれ10個のサンプルを採取する。最初にGMTEAおよびVEGLB を使用し、次にKYEIAおよびTDRDBを使用して、ネステッドPCR増幅を行う。増幅 生成物を電気泳動し、前と同じように染色し、サンプル中にRFHVポリヌクレオチ ドが存在するかを調べる。実施例11：糖タンパク質Ｂの免疫原領域 KSHVの自然感染経路において抗体が生成されるかを確認するために、カポジ肉 腫症を患ったAIDS被験者10〜20個体、HIV陽性症状陰性被験者10〜20個体、HIV陰 性被験者10〜20個体から、血清サンプルを採取した。最初の研究では、各個体群 の血清をプールして抗体分析に使用した。 成熟KSHV糖タンパク質Ｂ分子の推定上の全細胞外ドメインに対応する12個の残 基からなるペプチドを合成する。全配列をカバーし、８個の残基が重なり合うペ プチドを順次調製する。Genosys社製SPOTSTMキットを使用し、製造業者の指示に 従って標準的なF-Moc化学によりナイロン膜支持体上で、ペプチドを調製する。 調製した膜を血清でおおい、洗浄し、βガラクトース結合抗ヒトIgGでおおう。 基質X-galの添加により試験を行う。陽性染色の場合は、対応するペプチドに対 して反応性を有するIgG抗体が血清中に存在することを意味する。 同様に、RFHVの自然感染経路において抗体が形成されるかを確認するために、 Macaca nemestrinaサル10匹およびMacaca fascicularisサル10匹から血液サンプ ルを採取する。これらのサルの一部には、繊維腫症の顕在的症状が現れている。 進行中のRFHV感染の有無を、実施例10に記載のRFHV特異的オリゴヌクレオチドを 用いたPCR増幅アッセイを行うことによって、確認する。これらの血清を使用し て、KSHVに対するものと同じ方法で抗体試験を行う。ただし、RFHV糖タンパク質 Ｂ配列に基づいて12-merを合成する。 また、特定のRFHVペプチドおよびKSHVペプチドを用いて動物モデルで試験を行 い、明礬やDETOXTMなどの適当なアジュバントと組合せて投与した場合の免疫原 性を調べる。好適なペプチドとしては、先の実験で、ウイルスの自然感染経路に おいて抗体を誘導することが確認されたペプチドが挙げられる。他の候補ペプチ ドとしては、糖タンパク質Ｂの生物学的機能に関与すると考えられるペプチドお よびウイルス中和抗体を誘導することが知られている他のヘルペスウイスルのペ プチドに対応する ペプチドが挙げられる。こうしたペプチドを、キャリアーとしてのキーホールリ ンペットヘモシアニン(KLH)に結合し、標準的なプロトコルに従ってアジュバン トと混合し、100μgペプチド当量を含む接種物1mL〜2mLをウサギに筋肉内注射す る。４週間後に二回目のブースター投与を行い、更に２週間後に試験的採血を行 う。 ELISA用のマイクロタイタプレートのウェルを用意するにあたって、免疫原ま たは関連のないペプチド-KLH対照でコーティングする。採血試料から得られた血 漿の連続希釈液を入れ、洗浄し、βガラクトース-抗ヒトIgGおよびX-galを用い て発色させる。試験ウェル中で陽性染色を呈し、対照ウェル中で陽性染色が現れ ない場合、この条件下ではこのペプチドが免疫原性を有すると考えられる。実施例12：RFHV/KSHV亜科の他のメンバーから得られた糖タンパク質Ｂの同定お よび特性決定 以前に記載されていないガンマヘルペスウイルスを含むと疑われる組織サンプ ル〔特に、繊維増殖症状、リンパ系悪性疾患、ならびに免疫不全および免疫抑制 と関連した症状(例えば、急性呼吸窮迫症候群:ARDS)を呈するサンプル〕を凍結 保存し、実施例２の場合と同じようにＤＮＡを抽出する。第１ラウンドで１型オ リゴヌクレオチドFRFDAおよびTVNCBを使用し、第２ラウンドで１型または２型ネ ステッドオリゴヌクレオチドを使用して、２ラウンドのPCR増幅を行う。 場合により、RFHV/KSHV亜科の糖タンパク質Ｂポリヌクレオチドの存在を、好 適なプローブを用いて増幅生成物を検索することにより確認する。増幅されたポ リヌクレオチドをアガロース中で電気泳動し、ナイロン膜上にブロットする。糖 タンパク質ＢをコードするKSHVポリヌクレオチド(配列番号３の残基36−354)か ら得られたポリヌクレオチド断片を32Pで標識したプローブとブロットとをハイ ブリダイズさせる。プローブとヘルペスウイルス由来の糖タンパク質Ｂとの間で は安定な複合体を形成するが、プローブとRFHV/KSHV亜科以外の供給源由来のポ リヌクレオ チドをコードする糖タンパク質Ｂとの間では安定な複合体を形成しないような条 件下で、ハイブリダイゼーション反応を行う。安定な複合体が形成するためには 、ハイブリダイゼーション条件として、プローブおよび標的のハイブリッド形成 セグメントの間に約70%の同一性が必要である。こうした条件は、先に提示した 式を用いて計算されるが、ただし、プローブの長さおよび配列ならびに標的の対 応する配列に左右される。条件は次のように推定される：a)6×SSC(0.15M NaCl 、15mMクエン酸ナトリウム緩衝液)中室温でホルムアミドの不存在下にプローブ を標的とハイブリダイズさせること；b)新たに生成した二重鎖を2×SSC中室温で 短時間(5分間〜10分間)洗浄すること。 こうした条件下で標識プローブとハイブリダイズする増幅ポリヌクレオチドを 更なる特性決定のために選択する。あるいはまた、KSHVから推定されたものとほ ぼ同じサイズを有するPCR増幅生成物は、関連配列をもつ可能性がある。ヘルペ スウイルスゲノムの他の領域(例えば、ＤＮＡポリメラーゼ)を含むポリヌクレオ チドを得るために使用されたサンプルの場合もまた、そのサンプルが関連配列を 有する可能性がある。サイズの違いまたは供給源が異なるために、RFHVまたはKS HVと異なる可能性のある断片を含有するサンプルは、実施例４の場合のように、 その断片の配列決定を行う。これらの新規な配列を有する断片を使用し、実施例 ７または８と同様な方法で糖タンパク質Ｂの全遺伝子配列を調べる。 RFHV/KSHVヘルペスウイルス亜科の第３のメンバーから得られた糖タンパク質 Ｂコード配列は、次のようにして得た。 腹膜後繊維腫症に罹ったMacaca mulattaサルから採取した２つの凍結組織サン プルからＤＮＡを抽出した。抽出は実施例１に従って行った。抽出したＤＮＡを 、キャリアーである40μgのグリコーゲンの存在下でエタノールを用いて沈殿さ せ、70%エタノールで洗浄し、10mMのトリス緩衝液(pH8.0)中に懸濁させた。抽出 されたＤＮＡを使用して、ヘルペスウイルスＤＮＡポリメラーゼの151塩基対の 断片を得た。この断片は、KSHV、RFHV、または他の既に特性決定されたＤＮＡポ リメラーゼとは同じ でなかった。このことから、このサンプルには、異なるヘルペスウイルスに由来 するゲノムＤＮＡが含まれ、このＤＮＡを用いて新しい糖タンパク質Ｂ遺伝子の 同定および特性決定が行えるものと推定される。 糖タンパク質Ｂコード配列の386塩基対の断片を、ヘミ-ネステッド(hemi-nest ed)PCRを用いて、このサンプルから増幅させた。この手順は、実施例４および５ で使用したものと同様であり、第１ラウンドの増幅ではFRFDAおよびTVNCBを使用 し、続く第２ラウンドの増幅ではNIVPAおよびTVNCBを使用した。最終PCR産物は 前記のように配列決定した。 図23には、ポリヌクレオチド配列(配列番号96)が、対応するアミノ酸翻訳(配 設番号97)と一緒に示されている。２つのプライマーハイブリダイゼーション部 位の間にある319塩基対の配列に下線が引いてある。これらの配列は、KSHVおよ びFRHVの配列とは異なる。この糖タンパク質Ｂは、ヘルペスウイルスのRFHV/KSH V亜科の新しいメンバー(RFHV2と記す)から得られたものである。 参考文献 Altschul et al.(1986).Bull.Math.Bio.48:603-616. 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/569 33/569 Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｓ 39/42 39/42 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 21/08 21/08 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＧＭ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 ボシュ，マミックス，エル. アメリカ合衆国 98004 ワシントン州, ベルエヴュー，78ティーエイチ アベニュ ー エヌ．イー．2601 (72)発明者 ストランド，カート アメリカ合衆国 98027 ワシントン州, イサカ，エス．イー．32エヌディー スト リート 22101 【要約の続き】 タンパク質Ｂコード領域を特性づけるための材料および 方法を提供する。本発明のペプチド、ポリヌクレオチド および抗体は感染症を診断するために、また、糖タンパ ク質Ｂに対する免疫応答を引き出すために使用すること ができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｂをコードする領域を有する単離されたポ リヌクレオチドであって、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド36〜354 に対して少なくとも65％の同一性を有する配列を含んでなる前記ポリヌクレオチ ド。 ２．請求項１に記載のポリヌクレオチドの糖タンパク質Ｂコード領域の少なくと も50個の連続したヌクレオチドの断片を含んでなる、単離されたポリヌクレオチ ド。 ３．ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｂをコードする領域を有する単離されたポ リヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドSHMDA（配列番号41）に対して少 なくとも74％の同一性を有する35ヌクレオチドの配列、オリゴヌクレオチドCFSS B（配列番号43）に対して少なくとも73％の同一性を有する30ヌクレオチドの配 列、オリゴヌクレオチドENTFA（配列番号45）に対して少なくとも72％の同一性 を有する29ヌクレオチドの配列、およびオリゴヌクレオチドDNIQB（配列番号46 ）に対して少なくとも80％の同一性を有する35ヌクレオチドの配列よりなる群か ら選択される配列を含んでなる、前記ポリヌクレオチド。 ４．請求項３に記載のポリヌクレオチドの糖タンパク質Ｂコード領域の少なくと も50個の連続したヌクレオチドの断片を含んでなる、単離されたポリヌクレオチ ド。 ５．前記ヘルペスウイルスが霊長類に対する感染能を有する、請求項１または２ に記載のポリヌクレオチド。 ６．前記ヘルペスウイルスがRFHV1、RFHV2またはKSHVである、請求項１または２ に記載のポリヌクレオチド。 ７．配列番号１、３または92のヌクレオチド36〜354または配列番号96のどこか に含まれる線状配列と同一であるが、配列番号98には含まれない少なくとも21ヌ クレオチドの線状配列を含んでなる、単離されたポリヌクレ オチド。 ８．配列番号１、配列番号３もしくは配列番号96のヌクレオチド36〜354、また は配列番号92の少なくとも200個の連続したヌクレオチドと実質的に同一な線状 配を含んでなる、請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチド。 ９．請求項２に記載のポリヌクレオチドによりコードされる、単離されたポリペ プチド。 10．配列番号２、４または97のアミノ酸13〜118または配列番号94のどこかに含 まれる配列と実質的に同一であるが、配列番号99には含まれない少なくとも17ア ミノ酸の線状配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。 11．実質的に配列番号２、配列番号４、配列番号94または配列番号97に示した配 列を有するポリペプチドからなる、請求項10に記載の単離されたポリペプチド。 12．請求項10に記載のポリペプチドに含まれる配列と同一である少なくとも17ア ミノ酸の線状配列を含んでなる融合ポリペプチド。 13．ヘルペスウイルスと哺乳動物細胞との結合または融合に関与する、請求項10 に記載の単離されたポリペプチド。 14．グリコシル化されている、請求項10に記載の単離されたポリペプチド。 15．グリコシル化されていない、請求項10に記載の単離されたポリペプチド。 16．免疫原性がある、請求項10に記載の単離されたポリペプチド。 17．配列番号67〜76よりなる群から選択される配列を含んでなる、請求項１０に 記載の単離されたポリペプチド。 18．請求項10に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド 。 19．請求項10に記載のポリペプチドをコードする、天然には存在しないポリヌク レオチド。 20．ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドに直接結合した請求項２ に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、融合ポリペプチドをコードす るポリヌクレオチド。 21．請求項10に記載のポリペプチドに含まれる配列と同一である少なくとも17ア ミノ酸の線状配列をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる組換えクロー ニングベクター。 22．制御ポリヌクレオチド配列に機能的に連結された、請求項10に記載のポリペ プチドに含まれる配列と同一である少なくとも17アミノ酸の線状配列をコードす るポリヌクレオチド配列を含んでなる組換え発現ベクター。 23．請求項７に記載のポリヌクレオチドに含まれる線状配列と同一である少なく とも21ヌクレオチドの線状配列を含んでなる組換えクローニングベクター。 24．請求項18もしくは19に記載のポリヌクレオチドにより、または請求項21、22 もしくは23に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。 25．請求項１に記載のポリヌクレオチドの前記コード領域中にコードされる糖タ ンパク質Ｂポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体または単離されたポリク ローナル抗体。 26．請求項11に記載のポリペプチドに対して特異的であるが、配列番号30〜41の いずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対しては特異的でないモノクロ ーナル抗体または単離されたポリクローナル抗体。 27．モノクローナル抗体である、請求項26に記載の抗体。 28．単離されたポリクローナル抗体である、請求項26に記載の抗体。 29．製剤学的に適合性の賦形剤中に請求項９または10に記載のポリペプチドを含 有するワクチン。 30．アジュバントをさらに含有する、請求項29に記載のワクチン。 31．請求項29に記載のワクチンを投与することを含んでなる、ヘルペスウイルス 感染の治療方法。 32．製剤学的に適合性の賦形剤中に請求項２または７に記載のポリヌクレオチド を含有するワクチン。 33．生きているウイルスまたはウイルス発現ベクターである、請求項32に記載の ワクチン。 34．請求項32に記載のワクチンを投与することを含んでなる、ヘルペスウイルス 感染の治療方法。 35．製剤学的に適合性の賦形剤中に請求項25または26に記載の抗体を含有するワ クチン。 36．請求項35に記載のワクチンを投与することを含んでなる、ヘルペスウイルス 感染の治療方法。 37．配列番号24〜63、配列番号77〜78および配列番号80〜90よりなる群から選択 されるオリゴヌクレオチドと実質的に同一であるオリゴヌクレオチド。 38．糖タンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチドの増幅されたコピーの作製方 法であって、 a）該ポリヌクレオチドを請求項37に記載のオリゴヌクレオチドと接触させ、 そして b）該ポリヌクレオチドと二重らせんを形成したオリゴヌクレオチドを伸長さ せる、 各工程を含んでなる前記方法。 39．前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項38に記載の 方法。 40．前記ＰＣＲがアニーリングおよび伸長のサイクルの繰り返しを含み、該アニ ーリングを少なくとも50℃の温度で行なう、請求項39に記載の方法。 41．増幅するポリヌクレオチドをまず、繊維芽細胞増殖およびコラーゲン沈着を 特徴とする疾患に罹患した個体から採取した生物学的サンプルより得る、請求項 38に記載の方法。 42．サンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法であって、 a）該サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡと、請求項２または７に記載のポリヌ クレオチドを含むプローブとを、該プローブが配列番号１、３、92または94に示 した配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドとは安定な二重らせんを形 成できるが配列番号５〜13に示した配列のいずれかを有するポリヌクレオチドと は安定な二重らせんを形成しない条件下で接触させ、そして b）工程a）で形成された前記安定な二重らせんの有無を検出する、 各工程を含んでなる前記方法。 43．サンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法であって、 a）該サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡと、請求項２または７に記載のポリヌ クレオチドを含むプローブとを、該プローブが配列番号１に示した配列を有する ポリヌクレオチドおよび配列番号34に示した配列を有するポリヌクレオチドとは 安定な二重らせんを形成できるが配列番号５〜13に示した配列のいずれかを有す るポリヌクレオチドとは安定な二重らせんを形成しない条件下で接触させ、そし て b）工程a）で形成された前記安定な二重らせんの有無を検出する、 各工程を含んでなる前記方法。 44．霊長類に由来するサンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法であ って、 a）該サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡと、請求項２または７に記載のポリヌ クレオチドを含むプローブとを、該プローブが配列番号１、３、92または94に示 した配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドとは安定な二重らせんを形 成できるが配列番号５または９〜13に示した配列のいずれかを有するポリヌクレ オチドとは安定な二重らせんを形成しない条件下で接触させ、そして b）工程a）で形成された前記安定な二重らせんの有無を検出する、 各工程を含んでなる前記方法。 45．前記プローブと接触させる前に、前記サンプルのＤＮＡまたはＲＮＡに対し て増幅反応を行なうことをさらに含む、請求項42に記載の方法。 46．サンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法であって、 a）請求項37に記載のオリゴヌクレオチドを増幅反応のプライマーとして用い て、該サンプル中のポリヌクレオチドに対して増幅反応を行ない、そして b）該ポリヌクレオチドの増幅されたコピーの有無を検出する、 各工程を含んでなる前記方法。 47．配列番号１、３、92および94およびそれらのそれぞれの相補的配列よりなる 群から選択される配列を含む第２ポリヌクレオチドと、該第２ポリヌクレオチド が配列番号１、３、92または94に示した配列を有する少なくとも１つのポリヌク レオチドとは安定な二重らせんを形成できるが配列番号５〜13のいずれかの配列 を有するポリヌクレオチドとは安定な二重らせんを形成しない条件下で、安定な 二重らせんを形成できる、単離されたポリヌクレオチド。 48．そのヌクレオチド配列が天然に存在するウイルスのゲノム中に含まれる、請 求項47に記載の単離されたポリヌクレオチド。 49．請求項47に記載のポリヌクレオチド内にコードされる少なくとも25アミノ酸 の線状配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。 50．ヘルペスウイルスによる個体の感染の検出方法であって、該個体から得られ た生物学的サンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを、請求項42、44または46 に記載の方法により検出することを含んでなる前記方法。 51．生物学的サンプル中のヘルペスウイルスポリヌクレオチドを検出するための 診断用キットであって、適当な容器内に、請求項２または７に記載のポリヌクレ オチドを含む試薬を含んでなる前記キット。 52．生物学的サンプル中のヘルペスウイルスポリヌクレオチドを検出するための 診断用キットであって、適当な容器内に、請求項37に記載のオリゴヌクレオチド を含む試薬を含んでなる前記キット。 53．ヘルペスウイルスによる個体の感染の検出方法であって、 a）安定な抗原−抗体複合体の形成を可能とする条件下、該個体から得られた サンプルからの抗体を請求項25または26に記載のポリペプチドと接触させ、そし て b）工程a）で形成された前記安定な複合体の有無を検出する、 各工程を含んでなる前記方法。 54．生物学的サンプル中に存在する抗ヘルペスウイルス抗体を検出するための診 断用キットであって、適当な容器内に、請求項25または26に記載のポリペプチド を含む試薬を含んでなる前記キット。 55．ヘルペスウイルスによる個体の感染の検出方法であって、 a）安定な抗原−抗体複合体の形成を可能とする条件下、該個体から得られた サンプルからのポリペプチドを請求項９または10に記載の抗体と接触させ、そし て b）工程a）で形成された前記安定な複合体の有無を検出する、 各工程を含んでなる前記方法。 56．生物学的サンプル中に存在するヘルペスウイルスポリペプチドを検出するた めの診断用キットであって、適当な容器内に、請求項９または10に記載の抗体を 含む試薬を含んでなる前記キット。 57．候補薬剤がガンマヘルペス感染症の治療に有効であるか否かを決定する方法 であって、 a）請求項９または10に記載のポリペプチドを該候補薬剤と接触させ、そして b）該ポリペプチドの生化学的機能が該候補薬剤により改変されるか否かを判 定する、 各工程を含んでなる前記方法。 58．工程 b）で判定される前記ポリペプチドの生化学的機能が哺乳動物細胞の表 面への該ポリペプチドの結合性である、請求項57に記載の方法。 59．真核細胞において請求項２または７に記載のポリヌクレオチドを発現させる ことを含んでなる、糖タンパク質Ｂポリペプチドの産生方法。 60．請求項21または23に記載の組換えクローニングベクターを複製させることを 含んでなる、ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂをコードする領域を含むポリヌク レオチドの産生方法。