JP2903129B2 - ネコ伝染性腹膜炎ウイルスの診断手段 - Google Patents
ネコ伝染性腹膜炎ウイルスの診断手段Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，組換えDNA技術およびウイルス疾患の免疫
予防法の分野におけるものである。さらに詳しくは，本
発明は，ネコ伝染性腹膜炎（FIP），組換え技術で製造
されたFIPウイルスのタンパク，および診断法と予防法
とにおけるこれらタンパクの使用に関する。
予防法の分野におけるものである。さらに詳しくは，本
発明は，ネコ伝染性腹膜炎（FIP），組換え技術で製造
されたFIPウイルスのタンパク，および診断法と予防法
とにおけるこれらタンパクの使用に関する。
（従来の技術） ネコ伝染性腹膜炎は，腎臓，肝臓，およびCNS（非滲
出性もしくは「乾燥」形）を含む種々の器官の化膿肉芽
腫性病巣の形成，あるいはフィブリン腹膜炎および／ま
たはフィブリン胸膜炎（滲出性もしくは「湿潤」形）の
発生，あるいは両方の特性の組合わせを特徴とするネコ
の疾患である〔1984年８月，Vet Clin North Am：Anim
Pract，14（５）:975−984;BarloughおよびStoddart（1
986）,Contemporary Issues in Small Animal Practice
Vol.3 Infectious Diseases（F.W.Scott編）Churchill
Livingstone,New York p.93−108〕。その病原はまだ
充分には判明していないが、この疾患は、免疫に関連が
ある疾患であり，その一次病変は，血管内にアルチェス
様（Arthuslike）免疫複合体が沈積することが原因で起
こる脈管炎および脈管周囲炎である。
出性もしくは「乾燥」形）を含む種々の器官の化膿肉芽
腫性病巣の形成，あるいはフィブリン腹膜炎および／ま
たはフィブリン胸膜炎（滲出性もしくは「湿潤」形）の
発生，あるいは両方の特性の組合わせを特徴とするネコ
の疾患である〔1984年８月，Vet Clin North Am：Anim
Pract，14（５）:975−984;BarloughおよびStoddart（1
986）,Contemporary Issues in Small Animal Practice
Vol.3 Infectious Diseases（F.W.Scott編）Churchill
Livingstone,New York p.93−108〕。その病原はまだ
充分には判明していないが、この疾患は、免疫に関連が
ある疾患であり，その一次病変は，血管内にアルチェス
様（Arthuslike）免疫複合体が沈積することが原因で起
こる脈管炎および脈管周囲炎である。
ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（FIPV）は,FIPの病因学的
因子である。FIPVウイルス抗原,IgG,および補体第３成
分（C3）は，免疫蛍光法によってFIP病巣内に存在する
ことが示されており，持続性のFIPV感染は，感染したネ
コのマクロファージと神経根内皮系の細胞とに確認され
ている。血清反応陰性の小ネコが攻撃される場合に比べ
て,FIPV抗体を有する小ネコが病原性のFIPVで攻撃され
る場合の方が，より劇症のFIPが起こる。
因子である。FIPVウイルス抗原,IgG,および補体第３成
分（C3）は，免疫蛍光法によってFIP病巣内に存在する
ことが示されており，持続性のFIPV感染は，感染したネ
コのマクロファージと神経根内皮系の細胞とに確認され
ている。血清反応陰性の小ネコが攻撃される場合に比べ
て,FIPV抗体を有する小ネコが病原性のFIPVで攻撃され
る場合の方が，より劇症のFIPが起こる。
FIPVは，ゲノムの極性が陽性の一本鎖RNAウイルス
（コロナウイルス科）である。そのRNAゲノムから,7〜
９個のmRNAからなる入れ子集合（nestedset）が産生さ
れるが，これらはすべてゲノムの３′末端で終止する。
このウイルスがコードする主な構造タンパクには,45kD
の非グリコシル化ヌクレオキャプシド（Ｎ）,26kDの外
皮糖タンパク（E1），および表面ペプロマー（E2）を構
成する210kDの糖タンパクが含まれる。さらに，他のコ
ロナウイルス類と同様に,FIPVに感染した細胞中で発現
するが,FIPVのビリオンには取り込まれない非構造タン
パク（NS1およびNS2）をコードするオープンリーディン
グフレームが存在する。
（コロナウイルス科）である。そのRNAゲノムから,7〜
９個のmRNAからなる入れ子集合（nestedset）が産生さ
れるが，これらはすべてゲノムの３′末端で終止する。
このウイルスがコードする主な構造タンパクには,45kD
の非グリコシル化ヌクレオキャプシド（Ｎ）,26kDの外
皮糖タンパク（E1），および表面ペプロマー（E2）を構
成する210kDの糖タンパクが含まれる。さらに，他のコ
ロナウイルス類と同様に,FIPVに感染した細胞中で発現
するが,FIPVのビリオンには取り込まれない非構造タン
パク（NS1およびNS2）をコードするオープンリーディン
グフレームが存在する。
３種の原型ワクチンが開発されている。第１のワクチ
ンでは，抗原的に関連する（しかし，ネコに対しては無
発病性の）コロナウイルスを生ワクチンとして用い，中
和抗体の力価が刺激される。これらのワクチンには，ブ
タの伝播性胃腸炎ウイルス（TGEV）および犬のイヌコロ
ナウイルス（CCV）が含まれている。これらの研究の結
果，ほとんど感作が生じないかまたは全く感作が起こら
ず，したがって全く防御作用を示さないことが分かった
（Barloughら，（1984）Lab Anim Sci，34（６）:592−
597;WoodsおよびPedersen,（1979）Vet Microbiol，4:1
1−16）。
ンでは，抗原的に関連する（しかし，ネコに対しては無
発病性の）コロナウイルスを生ワクチンとして用い，中
和抗体の力価が刺激される。これらのワクチンには，ブ
タの伝播性胃腸炎ウイルス（TGEV）および犬のイヌコロ
ナウイルス（CCV）が含まれている。これらの研究の結
果，ほとんど感作が生じないかまたは全く感作が起こら
ず，したがって全く防御作用を示さないことが分かった
（Barloughら，（1984）Lab Anim Sci，34（６）:592−
597;WoodsおよびPedersen,（1979）Vet Microbiol，4:1
1−16）。
第２の原型ワクチンでは，生きた相同FIPウイルスが
用いられる（PedersenおよびBlack,（1983）Am J Vet R
es，44（２）:229−234;PedersenおよびFloyd,（1985）
Compendium on Continuing Education for the Practic
ing Veterinarian，7:1001−1011）。試験の結果，防御
作用が全くないことが分かり，ほとんどの場合，ネコは
感作されるが，次いで病原性のウイルスに攻撃されると
FIPが悪化する。
用いられる（PedersenおよびBlack,（1983）Am J Vet R
es，44（２）:229−234;PedersenおよびFloyd,（1985）
Compendium on Continuing Education for the Practic
ing Veterinarian，7:1001−1011）。試験の結果，防御
作用が全くないことが分かり，ほとんどの場合，ネコは
感作されるが，次いで病原性のウイルスに攻撃されると
FIPが悪化する。
第３の原型ワクチンは,PCT出願公開WO 87/04624に開
示されているが，特異的な株の弱毒FIPウイルス（79−1
146）が用いられる。この株は，生ワクチンとして用い
た場合に，防御を行うが，感作を起こさないと述べられ
ている。
示されているが，特異的な株の弱毒FIPウイルス（79−1
146）が用いられる。この株は，生ワクチンとして用い
た場合に，防御を行うが，感作を起こさないと述べられ
ている。
別の方法も試みられているが,FIPに対して有効なワク
チンの開発は確認されていない。現在まで，充分に特性
が決定された唯一のFIPV構造タンパクはE2もしくはペプ
ロマーの糖タンパクである。E2をコードするcDNA配列は
クローン化され,DeGrootら，（1987）J Gen Virol，68:
2639−2646に発表されているが，欧州特許第264,979号
にも,E2cDNA配列のクローン化が開示され,FIPに対する
ワクチンとして利用することが述べられている。
チンの開発は確認されていない。現在まで，充分に特性
が決定された唯一のFIPV構造タンパクはE2もしくはペプ
ロマーの糖タンパクである。E2をコードするcDNA配列は
クローン化され,DeGrootら，（1987）J Gen Virol，68:
2639−2646に発表されているが，欧州特許第264,979号
にも,E2cDNA配列のクローン化が開示され,FIPに対する
ワクチンとして利用することが述べられている。
（発明の要旨） 本発明は，ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（FIPV）の構造
タンパクおよび非構造タンパクの合成および操作に用い
られる手段を提供するものである。これらのタンパク
は，動物のFIPVに対する曝露もしくはFIPVに対する感染
性を診断するのに有用であり，サブユニットのワクチン
としても有用である。
タンパクおよび非構造タンパクの合成および操作に用い
られる手段を提供するものである。これらのタンパク
は，動物のFIPVに対する曝露もしくはFIPVに対する感染
性を診断するのに有用であり，サブユニットのワクチン
としても有用である。
ある局面では，本発明は,FIPVの構造タンパクおよび
非構造タンパクをコードする組換え体核酸配列に関す
る。特に，これらの配列には,N,E1,MS1,およびNS2,なら
びにその生物学的誘導体の配列が含まれる。すなわち,E
1,N,NS1,およびNS2からなる群から選択されるFIPVの構
造タンパクまたは非構造タンパクをコードする，単離さ
れた，クローン化組換え体の，もしくは合成の核酸配列
が含まれる他の局面では，本発明は，細胞を形質転換さ
せるのに使用できる上記の核酸配列を有する組換え体ベ
クター，およびこれらの形質転換細胞によって産生され
る組換え体タンパクに関する。さらに他の局面では，本
発明は，組換え技術を用いてこれらのFIPVタンパクを製
造する方法に関する。該製造方法は，上記の形質転換細
胞を，タンパクの発現に適した条件下で培養すること
と，および発現されたタンパクを回収することを包含す
る。さらに他の局面では，本発明は,FIPVに対するネコ
被検体の曝露を診断する方法に関する。該診断方法は，
（ａ）被検体の血清試料を，標識されたFIPVポリペプチ
ドと共にインキュベートすること；および（ｂ）標識さ
れたFIPVポリペプチドと抗血清との間で免疫複合体が形
成されているかどうかを決定すること；を包含する。FI
PVに対するネコ被検体の曝露を診断する本発明の他の方
法は，（ａ）被検体の細胞溶解物試料を,FIPV抗体と共
にインキュベートすること；および（ｂ）細胞溶解物と
FIPV抗血清との間で免疫複合体が形成されているかどう
かを決定すること；を包含する。
非構造タンパクをコードする組換え体核酸配列に関す
る。特に，これらの配列には,N,E1,MS1,およびNS2,なら
びにその生物学的誘導体の配列が含まれる。すなわち,E
1,N,NS1,およびNS2からなる群から選択されるFIPVの構
造タンパクまたは非構造タンパクをコードする，単離さ
れた，クローン化組換え体の，もしくは合成の核酸配列
が含まれる他の局面では，本発明は，細胞を形質転換さ
せるのに使用できる上記の核酸配列を有する組換え体ベ
クター，およびこれらの形質転換細胞によって産生され
る組換え体タンパクに関する。さらに他の局面では，本
発明は，組換え技術を用いてこれらのFIPVタンパクを製
造する方法に関する。該製造方法は，上記の形質転換細
胞を，タンパクの発現に適した条件下で培養すること
と，および発現されたタンパクを回収することを包含す
る。さらに他の局面では，本発明は,FIPVに対するネコ
被検体の曝露を診断する方法に関する。該診断方法は，
（ａ）被検体の血清試料を，標識されたFIPVポリペプチ
ドと共にインキュベートすること；および（ｂ）標識さ
れたFIPVポリペプチドと抗血清との間で免疫複合体が形
成されているかどうかを決定すること；を包含する。FI
PVに対するネコ被検体の曝露を診断する本発明の他の方
法は，（ａ）被検体の細胞溶解物試料を,FIPV抗体と共
にインキュベートすること；および（ｂ）細胞溶解物と
FIPV抗血清との間で免疫複合体が形成されているかどう
かを決定すること；を包含する。
（発明の構成） A.定義 本願で用いる場合，「FIPVタンパク」もしくは「FIPV
ポリペプチド」という用語は,45Kのヌクレオキャプシド
タンパク（Ｎ）,25K〜35Kのトランスメンブラン糖タン
パク（E1）および210Kのペプロマー糖タンパク（E2）を
包含するFIPVビリオンの構造タンパク；他のコロナウイ
ルス類でコードされるタンパクと類似し,FIPVゲノム内
のオープンリーディングフレームで予示される非構造タ
ンパクであって，第１図に示すDNA配列でコードされ，
ここではNS1およびNS2と命名されるタンパクを包含する
非構造タンパク；および上記のウイルスタンパクの組換
え体と合成物との免疫原性フラグメント，を意味する。
「FIPV遺伝子」という用語は,FIPVタンパクをコードす
る核酸配列として定義される。これらの用語は，いずれ
のサブグループもしくは株にも限定されない。
ポリペプチド」という用語は,45Kのヌクレオキャプシド
タンパク（Ｎ）,25K〜35Kのトランスメンブラン糖タン
パク（E1）および210Kのペプロマー糖タンパク（E2）を
包含するFIPVビリオンの構造タンパク；他のコロナウイ
ルス類でコードされるタンパクと類似し,FIPVゲノム内
のオープンリーディングフレームで予示される非構造タ
ンパクであって，第１図に示すDNA配列でコードされ，
ここではNS1およびNS2と命名されるタンパクを包含する
非構造タンパク；および上記のウイルスタンパクの組換
え体と合成物との免疫原性フラグメント，を意味する。
「FIPV遺伝子」という用語は,FIPVタンパクをコードす
る核酸配列として定義される。これらの用語は，いずれ
のサブグループもしくは株にも限定されない。
「生物学的誘導体」には,FIPVの構造タンパクもしく
は非構造タンパクに対して少なくとも95％の相同性を有
するFIPVの構造タンパクおよび非構造タンパクの突然変
異体，およびFIPV抗血清との反応性で証明されるFIPVの
免疫原性領域を包含する組換え体もしくは合成物のペプ
チド類が含まれる。
は非構造タンパクに対して少なくとも95％の相同性を有
するFIPVの構造タンパクおよび非構造タンパクの突然変
異体，およびFIPV抗血清との反応性で証明されるFIPVの
免疫原性領域を包含する組換え体もしくは合成物のペプ
チド類が含まれる。
「作動可能に連結された」という用語は，その成分が
通常の機能を実施するような形態に並置されていること
を意味する。したがって，コード配列に作動可能に連結
された制御配列もしくはプロモーターは，コード配列の
発現を行うことができる。
通常の機能を実施するような形態に並置されていること
を意味する。したがって，コード配列に作動可能に連結
された制御配列もしくはプロモーターは，コード配列の
発現を行うことができる。
「制御配列」は，所望のコード配列に適切に連結され
た場合に，このような配列との適合性を有する宿主内で
発現を行い得る単一もしくは複数のDNA配列を意味す
る。このような制御配列は，真核宿主内および原核宿主
内の両方に少なくともプロモーターを有し，また必要に
応じて転写終結シグナルを有する。発現を行うのに必要
もしくは有益な他の因子も固定することができる。本願
で用いる場合，「制御配列」という用語は，単に，使用
される特定の宿主内で発現を行うのに必要などんなDNA
配列をも意味する。
た場合に，このような配列との適合性を有する宿主内で
発現を行い得る単一もしくは複数のDNA配列を意味す
る。このような制御配列は，真核宿主内および原核宿主
内の両方に少なくともプロモーターを有し，また必要に
応じて転写終結シグナルを有する。発現を行うのに必要
もしくは有益な他の因子も固定することができる。本願
で用いる場合，「制御配列」という用語は，単に，使用
される特定の宿主内で発現を行うのに必要などんなDNA
配列をも意味する。
本願で用いる「挿入ベクター」という用語には，ウイ
ルスのゲノムに対して相同的な組換えを媒介することが
できるプラスミド，コスミド，もしくはファージが含ま
れ，組換えにより得られた組換え体ウイルスによって，
非相同的な核酸配列が安定に保持される。本発明のある
実施態様では，ワクシニアウイルスDNAから構築された
プラスミドが用いられる。
ルスのゲノムに対して相同的な組換えを媒介することが
できるプラスミド，コスミド，もしくはファージが含ま
れ，組換えにより得られた組換え体ウイルスによって，
非相同的な核酸配列が安定に保持される。本発明のある
実施態様では，ワクシニアウイルスDNAから構築された
プラスミドが用いられる。
「発現ベクター」という用語には，上記ベクターによ
って保持される各組換え体遺伝子によってコードされる
タンパクを合成することができるプラスミド，コスミ
ド，もしくはファージが含まれる。このようなベクター
は，独立して，適切な宿主細胞の染色体内で複製される
か，または該染色体に組込むことができ，所望のタンパ
クを発現する。
って保持される各組換え体遺伝子によってコードされる
タンパクを合成することができるプラスミド，コスミ
ド，もしくはファージが含まれる。このようなベクター
は，独立して，適切な宿主細胞の染色体内で複製される
か，または該染色体に組込むことができ，所望のタンパ
クを発現する。
B.FIPV遺伝子のクローン化 FIPVの構造遺伝子および非構造遺伝子は，合成もしく
は天然またはその組合わせであってもよい。天然のFIPV
遺伝子（または，そのタンパク）は,FIPV cDNAもしくは
ゲノムライブラリーを調製し，次いでウイルス遺伝子の
存在についてスクリーニングすることによって得ること
ができる。メッセンジャーRNA群からcDNAライブラリー
を調製することは周知であり,Huynhら（1984）が,DNA C
loning,Vol 1 : A Practical Approach（D.Glover編）,
pp.49−78,IRL Press,Oxfordに詳細に記載している。一
般に，ライブラリーが，ヌクレオチドプローブを用いた
ハイブリダイゼーションによってスクリーニングされな
ければならない場合には，いずれの挿入ベクターも適切
であるが，λgt10は，非組換え体ファージに対して直接
選択ができるので好ましい。ライブラリーが抗体プロー
ブを用いてスクリーニングされなければならない場合に
は，最も普通に用いられる発現ベクターは，λgt11であ
る。この発現ベクターでは，クローン化されたコード配
列がβ−ガラクトシダーゼのコード配列に融合されてい
る。
は天然またはその組合わせであってもよい。天然のFIPV
遺伝子（または，そのタンパク）は,FIPV cDNAもしくは
ゲノムライブラリーを調製し，次いでウイルス遺伝子の
存在についてスクリーニングすることによって得ること
ができる。メッセンジャーRNA群からcDNAライブラリー
を調製することは周知であり,Huynhら（1984）が,DNA C
loning,Vol 1 : A Practical Approach（D.Glover編）,
pp.49−78,IRL Press,Oxfordに詳細に記載している。一
般に，ライブラリーが，ヌクレオチドプローブを用いた
ハイブリダイゼーションによってスクリーニングされな
ければならない場合には，いずれの挿入ベクターも適切
であるが，λgt10は，非組換え体ファージに対して直接
選択ができるので好ましい。ライブラリーが抗体プロー
ブを用いてスクリーニングされなければならない場合に
は，最も普通に用いられる発現ベクターは，λgt11であ
る。この発現ベクターでは，クローン化されたコード配
列がβ−ガラクトシダーゼのコード配列に融合されてい
る。
スクリーニングは，ポリペプチドに対して特異的な標
識されたDNAプローブ，または遺伝子産物に対する抗体
を用いて行われる。両方の方法は，いずれも普通の方法
であり，文献には詳細に記載されている。適切な抗体
は，精製したFIPVから調製することができる。適切なDN
Aプローブは,FIPV E2構造タンパクのアミノ酸配列，ま
たは第１図や下記の実験の項で例示されるE1,N,NS1,お
よびNS2のポリペプチドに対するヌクレオチド配列に基
づいて得ることができる。
識されたDNAプローブ，または遺伝子産物に対する抗体
を用いて行われる。両方の方法は，いずれも普通の方法
であり，文献には詳細に記載されている。適切な抗体
は，精製したFIPVから調製することができる。適切なDN
Aプローブは,FIPV E2構造タンパクのアミノ酸配列，ま
たは第１図や下記の実験の項で例示されるE1,N,NS1,お
よびNS2のポリペプチドに対するヌクレオチド配列に基
づいて得ることができる。
合成のヌクレオチド配列を調製する場合には，天然の
ヌクレオチド配列を修飾することが望ましい。例えば，
所望の宿主によって優先的に認識されるコドンを使用す
ることが好ましいことが多い。場合によっては，さら
に，そのヌクレオチド配列を変更して制限部位を創製す
るかもしくは除去して，例えば便利な発現ベクターへの
遺伝子配列の挿入を促進させるか，または得られたポリ
ペプチド中の１つまたはそれ以上のアミノ酸を置換する
ことによって安定性を増大させることが望ましい。
ヌクレオチド配列を修飾することが望ましい。例えば，
所望の宿主によって優先的に認識されるコドンを使用す
ることが好ましいことが多い。場合によっては，さら
に，そのヌクレオチド配列を変更して制限部位を創製す
るかもしくは除去して，例えば便利な発現ベクターへの
遺伝子配列の挿入を促進させるか，または得られたポリ
ペプチド中の１つまたはそれ以上のアミノ酸を置換する
ことによって安定性を増大させることが望ましい。
合成のオリゴヌクレオチドは,Edgeら，Nature（前
出）およびDuckworthら，（1981）Nucleic Acids Res,
9:1691に記載のホスホトリエステル法；またはBeaucage
およびCaruthers,（1981）Tet Letts，22:1859およびMa
tteucciおよびCaruthers,（1981）J Am Chem Soc，103:
3185に記載のホスホアミダイト法によって調製される。
また，市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて調
製することもできる。
出）およびDuckworthら，（1981）Nucleic Acids Res,
9:1691に記載のホスホトリエステル法；またはBeaucage
およびCaruthers,（1981）Tet Letts，22:1859およびMa
tteucciおよびCaruthers,（1981）J Am Chem Soc，103:
3185に記載のホスホアミダイト法によって調製される。
また，市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて調
製することもできる。
C.組換え体ウイルスワクチン Mossらは,1983年発行のMethods in Gene Amplificati
on,3巻,Elservier−North Holland,202〜213,および198
4年発行のJ Virol 49:857〜864に，非相同遺伝子をワク
シニアウイルスのゲノムに挿入することを記載してい
る。これらの遺伝子は，次いで宿主内でウイルスの複製
中に発現されて，これらの遺伝子産物やワクシニアに免
疫応答する。この方法を用いて，インフルエンザ（Smit
hら，Proc Natl Acad Sci,USA，80:7155−7159（198
3）;Benninkら，Nature，311,578（1984）），単純ヘル
ペス（Cremarら，Science，228,737〜740（1985））;B
型肝炎（Mossら，Nature，311,67−69（1984）），およ
びプラスモジウム・クノウレシー（Plasmodium knowles
i）（Smichら，Science，224,397〜399（1984））を含
む各種病原体からの攻撃に対する，重要な免疫学的応答
および／または防御が例示されている。
on,3巻,Elservier−North Holland,202〜213,および198
4年発行のJ Virol 49:857〜864に，非相同遺伝子をワク
シニアウイルスのゲノムに挿入することを記載してい
る。これらの遺伝子は，次いで宿主内でウイルスの複製
中に発現されて，これらの遺伝子産物やワクシニアに免
疫応答する。この方法を用いて，インフルエンザ（Smit
hら，Proc Natl Acad Sci,USA，80:7155−7159（198
3）;Benninkら，Nature，311,578（1984）），単純ヘル
ペス（Cremarら，Science，228,737〜740（1985））;B
型肝炎（Mossら，Nature，311,67−69（1984）），およ
びプラスモジウム・クノウレシー（Plasmodium knowles
i）（Smichら，Science，224,397〜399（1984））を含
む各種病原体からの攻撃に対する，重要な免疫学的応答
および／または防御が例示されている。
この技術には，ワクシニアウイルスのプロモーターの
下流に非相同のFIPV遺伝子を有するプラスミド挿入ベク
ターの構築法が含まれ，前記のワクシニアウイルスのプ
ロモーターはすべて，該挿入ベクター内のワクシニアチ
ミジンキナーゼ（tk）遺伝子に挿入される。ワクシニア
ウイルスに感染した細胞に対する。ワクシニアDNAと挿
入ベクターとのコトランスフェクション（cotransfecti
on）によって，ウイルスDNA内のTK配列とプラスミド間
の相同組み換えが可能になり，その結果，非相同のFIPV
遺伝子がワクシニアゲノムに挿入され，ウイルスtk遺伝
子が中断される。組換え体ウイルスは，そのtk-表現型
によって容易に選択することができる。
下流に非相同のFIPV遺伝子を有するプラスミド挿入ベク
ターの構築法が含まれ，前記のワクシニアウイルスのプ
ロモーターはすべて，該挿入ベクター内のワクシニアチ
ミジンキナーゼ（tk）遺伝子に挿入される。ワクシニア
ウイルスに感染した細胞に対する。ワクシニアDNAと挿
入ベクターとのコトランスフェクション（cotransfecti
on）によって，ウイルスDNA内のTK配列とプラスミド間
の相同組み換えが可能になり，その結果，非相同のFIPV
遺伝子がワクシニアゲノムに挿入され，ウイルスtk遺伝
子が中断される。組換え体ウイルスは，そのtk-表現型
によって容易に選択することができる。
D.ワクシニアウイルスのベクター FIPVタンパクのコード配列は，組換え体ワクシニアウ
イルスを生成させるために，ワクシニアウイルスプラス
ミド挿入ベクターに挿入することができる。その結果,F
IPVワクシニア組換え体は，（１）それぞれのFIPVタン
パクの発現と分析，（２）FIPV抗体の産生，（３）組織
培養物中での死菌免疫原もしくは不活性化免疫原として
ネコに用いるFIPVタンパクの産生，または（４）生きて
いるウイルス免疫原としてネコに用いるのに利用するこ
とができる。
イルスを生成させるために，ワクシニアウイルスプラス
ミド挿入ベクターに挿入することができる。その結果,F
IPVワクシニア組換え体は，（１）それぞれのFIPVタン
パクの発現と分析，（２）FIPV抗体の産生，（３）組織
培養物中での死菌免疫原もしくは不活性化免疫原として
ネコに用いるFIPVタンパクの産生，または（４）生きて
いるウイルス免疫原としてネコに用いるのに利用するこ
とができる。
本発明では，プラスミドのpSC11とpUV1を,FIPVタンパ
クの発現と,FIPVワクシニア組換え体の生成に用いた。N
S1,NS2,E1およびＮのコード配列を含有するプラスミド
で形質転換されたE.Coliの試料は，ブタペスト条約に基
づいて，米国，メリーランド州，ロックビル，パークロ
ーンドライブ12301にあるアメリカンタイプカルチャー
コレクション（ATCC）に1988年８月30日に寄託した。３
種のプラスミドの名称は,p64−FIPV6,pBR329−FIPV9,お
よびpBR329−E2＃２であり，それぞれ67784,67783およ
び67782という受託番号が与えられた。第１図に示す，
これらのプラスミドは以下のヌクレオチド配列を含む：
すなわち,pBR329−E2＃２（１−2784）;pBR329−FIPV9
（2049−3896）；およびFIPV6（3673−5130）である。
クの発現と,FIPVワクシニア組換え体の生成に用いた。N
S1,NS2,E1およびＮのコード配列を含有するプラスミド
で形質転換されたE.Coliの試料は，ブタペスト条約に基
づいて，米国，メリーランド州，ロックビル，パークロ
ーンドライブ12301にあるアメリカンタイプカルチャー
コレクション（ATCC）に1988年８月30日に寄託した。３
種のプラスミドの名称は,p64−FIPV6,pBR329−FIPV9,お
よびpBR329−E2＃２であり，それぞれ67784,67783およ
び67782という受託番号が与えられた。第１図に示す，
これらのプラスミドは以下のヌクレオチド配列を含む：
すなわち,pBR329−E2＃２（１−2784）;pBR329−FIPV9
（2049−3896）；およびFIPV6（3673−5130）である。
FIPV組換え体を産生するために,2種のワクシニアウイ
ルス挿入ベクターpSC11（Chakrabartiら，Mol Cell Bio
l（1985）5,3403〜3409）とpUV1（Falkner,F.G.ら，Nuc
leic Acids Research（1987）15,7192）を用いた。両ベ
クターはともに，第２図Ａに示す共挿入（co−insertio
n）種に属する。これらのベクターは,2つのワクシニア
ウイルスプロモーターを有する。その一方のプロモータ
ー（P1）は選択可能なマーカー遺伝子の発現を駆動する
のに用いられる（この場合β−ガラクトシダーゼ）。他
方のプロモーター（P2）は非相同性のFIPV cDNA挿入体
の発現を駆動するのに用いられる。両者には，野生型ワ
クシニアウイルスゲノムへの相同組換えを促進し，選択
機構（tk−ウイルスの生成）を提供するワクシニアウイ
ルスDNA（中断されたチミジンキナーゼ（tk）遺伝子）
が隣接している。pSC11ベクター（第２図Ｂ）は，ワク
シニア初期−後期プロモーター（P7.5）を利用して非相
同遺伝子の発現を駆動し，単一のSmaＩクローン部位を
有する。pUV1ベクター（第２図Ｃ）は，ワクシニア後期
プロモーター（P11）を利用して非相同遺伝子の発現を
駆動し,P11後期遺伝子のATGの後の融合タンパクを発現
させるよう設計されている。すべての場合,FIPV−pUV1
の構築物は，天然のFIPVタンパク配列に追加のアミノ末
端アミノ酸が導入されることを回避するために，最も
５′末端側（ATGの後）のクローン部位（EcoRI）を利用
して行った。
ルス挿入ベクターpSC11（Chakrabartiら，Mol Cell Bio
l（1985）5,3403〜3409）とpUV1（Falkner,F.G.ら，Nuc
leic Acids Research（1987）15,7192）を用いた。両ベ
クターはともに，第２図Ａに示す共挿入（co−insertio
n）種に属する。これらのベクターは,2つのワクシニア
ウイルスプロモーターを有する。その一方のプロモータ
ー（P1）は選択可能なマーカー遺伝子の発現を駆動する
のに用いられる（この場合β−ガラクトシダーゼ）。他
方のプロモーター（P2）は非相同性のFIPV cDNA挿入体
の発現を駆動するのに用いられる。両者には，野生型ワ
クシニアウイルスゲノムへの相同組換えを促進し，選択
機構（tk−ウイルスの生成）を提供するワクシニアウイ
ルスDNA（中断されたチミジンキナーゼ（tk）遺伝子）
が隣接している。pSC11ベクター（第２図Ｂ）は，ワク
シニア初期−後期プロモーター（P7.5）を利用して非相
同遺伝子の発現を駆動し，単一のSmaＩクローン部位を
有する。pUV1ベクター（第２図Ｃ）は，ワクシニア後期
プロモーター（P11）を利用して非相同遺伝子の発現を
駆動し,P11後期遺伝子のATGの後の融合タンパクを発現
させるよう設計されている。すべての場合,FIPV−pUV1
の構築物は，天然のFIPVタンパク配列に追加のアミノ末
端アミノ酸が導入されることを回避するために，最も
５′末端側（ATGの後）のクローン部位（EcoRI）を利用
して行った。
E.組換え体発現ベクターと宿主 当業者に理解されるように，本願に記載されているFI
PV遺伝子を発現するのに，真核系と原核系の両者を用い
ることができる。原核生物としては，E.coliの各種菌株
が提示される場合が最も多いが，他の微生物の菌株も使
用できる。宿主と適合しうる種由来の複製部位，選択可
能なマーカーおよび制御配列を有するプラスミドベクタ
ーが使用される。例えば，E.coliは，一般に,pBR322（B
olivarら，Gene，2,95（1977）による，E.coliの種由来
のプラスミド）の誘導体を用いて形質転換される。pBR3
22は，アンピシリンとテトラサイクリンに耐性の遺伝子
を有し，その結果，所望のベクターを構築する際に，残
しておくか，または破壊することができる多重の選択可
能なマーカーを提供する。通常用いられる原核制御配列
は，本願では，リポソーム結合部位配列とともに，任意
にオペレーターと，転写を開始するプラスミドとを含有
すると定義されている。この原核制御配列には，β−ラ
クタマーゼ（ペニシリナーゼ）とラクトース（lac）の
プロモーター系（Changら，Nature，198,1056（197
7）），トリプトファン（trp）プロモーター系（Goedde
lら，Nucleic Acids Res，8,4057（1980）），ラムダ由
来のPLプロモーター（Shimatakeら，Nature，292,128
（1981））,N遺伝子リポソーム結合部位およびtrp−lac
（trc）プロモーター系（AmannとBrosius,Gene，40183,
（1985））のような通常用いられるプロモーターを包含
する。
PV遺伝子を発現するのに，真核系と原核系の両者を用い
ることができる。原核生物としては，E.coliの各種菌株
が提示される場合が最も多いが，他の微生物の菌株も使
用できる。宿主と適合しうる種由来の複製部位，選択可
能なマーカーおよび制御配列を有するプラスミドベクタ
ーが使用される。例えば，E.coliは，一般に,pBR322（B
olivarら，Gene，2,95（1977）による，E.coliの種由来
のプラスミド）の誘導体を用いて形質転換される。pBR3
22は，アンピシリンとテトラサイクリンに耐性の遺伝子
を有し，その結果，所望のベクターを構築する際に，残
しておくか，または破壊することができる多重の選択可
能なマーカーを提供する。通常用いられる原核制御配列
は，本願では，リポソーム結合部位配列とともに，任意
にオペレーターと，転写を開始するプラスミドとを含有
すると定義されている。この原核制御配列には，β−ラ
クタマーゼ（ペニシリナーゼ）とラクトース（lac）の
プロモーター系（Changら，Nature，198,1056（197
7）），トリプトファン（trp）プロモーター系（Goedde
lら，Nucleic Acids Res，8,4057（1980）），ラムダ由
来のPLプロモーター（Shimatakeら，Nature，292,128
（1981））,N遺伝子リポソーム結合部位およびtrp−lac
（trc）プロモーター系（AmannとBrosius,Gene，40183,
（1985））のような通常用いられるプロモーターを包含
する。
細菌に加えて，酵母のような真核微生物も宿主として
使用できる。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomy
ces cerevisiae）の実験室菌株である製パン用酵母が最
もよく使用されるが，他の多数の菌株もしくは種も通常
利用できる。例えば,Broach,Meth Enz，101,307（198
3）の,2ミクロンの複製起源，または他の酵母に適合し
うる複製起源（例えば,Stinchcombら，Nature，282,39
（1979）;Tschumperら，Gene，10,157（1980）；および
Clarkeら，Meth Enz 101,300（1983）参照）を使用する
ベクターを用いることができる。酵母ベクターの制御配
列は，解糖酵素合成のプロモーター（Hessら，J Adv En
zyme Reg 7,149（1968）;Hollandら，Biochemistry 17,
4900（1978））を有する。当該技術分野で知られている
別のプロモーターには,3−ホスホグリセリン酸キナーゼ
のプロモーター（Hitzemanら，J Biol Chem，255,2073
（1980））が包含されている。増殖条件および／または
遺伝背景によって制御される転写の別の利点を有する他
のプロモーターは，アルコールデヒドロゲナーゼ2,イソ
シトクロムC,酸性ホソファターゼ，窒素代謝と関連のあ
る分解酵素類，およびマルトースとガラクトースの利用
に関与するα因子系と酵素のプロモーター領域である。
ターミネーター配列は，コード配列の３′末端の位置に
あることが望ましいと考えられる。このようなターミネ
ーターは，酵母由来の遺伝子のコード配列に続く３′側
の非翻訳領域に見出される。
使用できる。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomy
ces cerevisiae）の実験室菌株である製パン用酵母が最
もよく使用されるが，他の多数の菌株もしくは種も通常
利用できる。例えば,Broach,Meth Enz，101,307（198
3）の,2ミクロンの複製起源，または他の酵母に適合し
うる複製起源（例えば,Stinchcombら，Nature，282,39
（1979）;Tschumperら，Gene，10,157（1980）；および
Clarkeら，Meth Enz 101,300（1983）参照）を使用する
ベクターを用いることができる。酵母ベクターの制御配
列は，解糖酵素合成のプロモーター（Hessら，J Adv En
zyme Reg 7,149（1968）;Hollandら，Biochemistry 17,
4900（1978））を有する。当該技術分野で知られている
別のプロモーターには,3−ホスホグリセリン酸キナーゼ
のプロモーター（Hitzemanら，J Biol Chem，255,2073
（1980））が包含されている。増殖条件および／または
遺伝背景によって制御される転写の別の利点を有する他
のプロモーターは，アルコールデヒドロゲナーゼ2,イソ
シトクロムC,酸性ホソファターゼ，窒素代謝と関連のあ
る分解酵素類，およびマルトースとガラクトースの利用
に関与するα因子系と酵素のプロモーター領域である。
ターミネーター配列は，コード配列の３′末端の位置に
あることが望ましいと考えられる。このようなターミネ
ーターは，酵母由来の遺伝子のコード配列に続く３′側
の非翻訳領域に見出される。
もちろん，多細胞生物由来の真核宿主細胞培養物中
で，ポリペプチドをコードする遺伝子を発現させること
も可能である（例えばAxelらの米国特許第4,399,261号
参照）。これらの系は，追加の利点として，イントロン
をスプライスする能力を有するので，ゲノムフラグメン
トを直接発現するのに用いることができる。有用な宿主
細胞系には,VERO,HeLa,ベビーハムスターの腎臓（BH
K）,CV−1,COS,MDCK,NIH 3T3,L,およびチャイニーズハ
ムスターの卵巣（CHO）細胞が包含される。有用なネコ
宿主細胞としては，クランドール（Crandoll）ネコ腎臓
細胞（CRFK）とネコ全胎児（FCWF）が挙げられる。この
ような細胞の発現ベクターには，サルウイルス40（SV4
0）（Firesら，Nature，273,113（1978））由来の通常
用いられる初期と後期のプロモーター，またはポリオー
マ，ヘルペスウイルス，アデノウイルス2,ネコ白血病ウ
イルス由来のネコレトロウイルスLTR,ウシ乳頭腫ウイル
スもしくはトリ肉腫ウイルス由来の他のウイルスプロモ
ーターなどの哺乳類細胞と適合しうる，プロモーター類
と制御配列が一般に含まれている。制御可能なプロモー
ターであるhMT II（Karinら，Nature，299,797〜802（1
987））も使用できる。哺乳類の細胞宿主系の形質転換
の一般的な態様なAxelの前記文献に記載されている。
で，ポリペプチドをコードする遺伝子を発現させること
も可能である（例えばAxelらの米国特許第4,399,261号
参照）。これらの系は，追加の利点として，イントロン
をスプライスする能力を有するので，ゲノムフラグメン
トを直接発現するのに用いることができる。有用な宿主
細胞系には,VERO,HeLa,ベビーハムスターの腎臓（BH
K）,CV−1,COS,MDCK,NIH 3T3,L,およびチャイニーズハ
ムスターの卵巣（CHO）細胞が包含される。有用なネコ
宿主細胞としては，クランドール（Crandoll）ネコ腎臓
細胞（CRFK）とネコ全胎児（FCWF）が挙げられる。この
ような細胞の発現ベクターには，サルウイルス40（SV4
0）（Firesら，Nature，273,113（1978））由来の通常
用いられる初期と後期のプロモーター，またはポリオー
マ，ヘルペスウイルス，アデノウイルス2,ネコ白血病ウ
イルス由来のネコレトロウイルスLTR,ウシ乳頭腫ウイル
スもしくはトリ肉腫ウイルス由来の他のウイルスプロモ
ーターなどの哺乳類細胞と適合しうる，プロモーター類
と制御配列が一般に含まれている。制御可能なプロモー
ターであるhMT II（Karinら，Nature，299,797〜802（1
987））も使用できる。哺乳類の細胞宿主系の形質転換
の一般的な態様なAxelの前記文献に記載されている。
昆虫の発現系もFIPV遺伝子を発現するのに利用するこ
とができる。例えば、バキュロウイルス多角体遺伝子
が，非相同タンパクの高レベルの発現に利用されている
（Smithら，Mol Cell Biol，3（12）,2156〜2165（198
3）;Summersら，“Genetic Engi−neering of the Geno
me of the Autographa Cali−fornica Nuclear Polyhed
rosis Viru"Banbury Report:Genetically Altered Viru
ses in the Environment,22,319−339,（1985）,Cold S
pring Harbor Laboratory）。
とができる。例えば、バキュロウイルス多角体遺伝子
が，非相同タンパクの高レベルの発現に利用されている
（Smithら，Mol Cell Biol，3（12）,2156〜2165（198
3）;Summersら，“Genetic Engi−neering of the Geno
me of the Autographa Cali−fornica Nuclear Polyhed
rosis Viru"Banbury Report:Genetically Altered Viru
ses in the Environment,22,319−339,（1985）,Cold S
pring Harbor Laboratory）。
F.安定して転写された細胞系の生成 ワクシニア中で発現されたFIPVcDNAクローンも,FIPV
サブユニットタンパクを発現する，安定にトランスフェ
クトされた細胞系を生成させるのに使用できる。一般
に，これらの細胞系は,2つの発現プラスミドの一つを最
初に構築することによって生成される。両発現プラスミ
ドには，選択可能なマーカーが,SV40初期プロモータ
ー，それ自身のプロモーターを含む細菌カナマイシン耐
性遺伝子,SV40の介在配列，および初期領域由来のSV40
ポリアデニル化部位で構成されたG418ネオマイシン発現
カセット（neo）によって与えられる。第１の発現プラ
スミドでは,FIPVcDNAクローン化部位には,5′末端には,
SV40エンハンサーで修飾された，ヒトメタロチオネイン
遺伝子プロモーターであるpMt IIaが隣接し,3′末端に
は初期領域由来のSV40ポリアデニル化部位が隣接してい
る。第２の発現構造では,FIPV cDNAクローン化部位に
は,5′末端に，特にネコの細胞中で機能するプロモータ
ー機能を与えるネコ白血病ウイルス（FeLV）の長い末端
繰返し配列（LTR）が隣接し,3′末端には,SV40初期領域
もしくはβ−アクチン遺伝子の配列のような，有用なポ
リアデニル化部位をコードする配列が隣接している。
サブユニットタンパクを発現する，安定にトランスフェ
クトされた細胞系を生成させるのに使用できる。一般
に，これらの細胞系は,2つの発現プラスミドの一つを最
初に構築することによって生成される。両発現プラスミ
ドには，選択可能なマーカーが,SV40初期プロモータ
ー，それ自身のプロモーターを含む細菌カナマイシン耐
性遺伝子,SV40の介在配列，および初期領域由来のSV40
ポリアデニル化部位で構成されたG418ネオマイシン発現
カセット（neo）によって与えられる。第１の発現プラ
スミドでは,FIPVcDNAクローン化部位には,5′末端には,
SV40エンハンサーで修飾された，ヒトメタロチオネイン
遺伝子プロモーターであるpMt IIaが隣接し,3′末端に
は初期領域由来のSV40ポリアデニル化部位が隣接してい
る。第２の発現構造では,FIPV cDNAクローン化部位に
は,5′末端に，特にネコの細胞中で機能するプロモータ
ー機能を与えるネコ白血病ウイルス（FeLV）の長い末端
繰返し配列（LTR）が隣接し,3′末端には,SV40初期領域
もしくはβ−アクチン遺伝子の配列のような，有用なポ
リアデニル化部位をコードする配列が隣接している。
上記の各ベクターは，特に限定はないが，下記実施例
に記載したような哺乳類の細胞系に，リン酸カルシウム
−DNA共沈降法もしくはエレクトロポレーション法（ele
ctroporation）によって形質転換することができる。１
日後に，細胞を1mg/mlのG418で処理しG418耐性コロニー
のプールを得る。成功裏に得られた形質転換体は，発現
構築物中に含まれているFIPV cDNAを安定に継承し，次
に低密度にプレートしてクローン単離物を精製する。ク
ローン単離物を，所望のFIPVタンパクの最大産生量につ
いて分析し，高生産性のクローンをワクチン種として役
立つように増殖させる。
に記載したような哺乳類の細胞系に，リン酸カルシウム
−DNA共沈降法もしくはエレクトロポレーション法（ele
ctroporation）によって形質転換することができる。１
日後に，細胞を1mg/mlのG418で処理しG418耐性コロニー
のプールを得る。成功裏に得られた形質転換体は，発現
構築物中に含まれているFIPV cDNAを安定に継承し，次
に低密度にプレートしてクローン単離物を精製する。ク
ローン単離物を，所望のFIPVタンパクの最大産生量につ
いて分析し，高生産性のクローンをワクチン種として役
立つように増殖させる。
G.診断用途 FIPVタンパク，またはこのタンパク由来の免疫原性ペ
プチドセグメントは，ネコが以前にFIPVに暴露されたか
否かを決定する診断試薬として用いることができ，また
ネコのその疾病に対する感染性を決定する手段を提供す
る。このことは，多数のネコの生体試料を検定すること
によって行うことができる。第１に，ネコの血清は,FIP
V抗体の存在を検定することができる。第２に，ネコか
ら得た細胞溶解物もしくは全固定細胞は,FIPVタンパク
が発現されているか否かを決定する検定を行うことがで
きる。第１の場合,FIPVタンパクが診断手段である。第
２の場合,FIPVタンパクに対する抗体が診断手段であ
る。
プチドセグメントは，ネコが以前にFIPVに暴露されたか
否かを決定する診断試薬として用いることができ，また
ネコのその疾病に対する感染性を決定する手段を提供す
る。このことは，多数のネコの生体試料を検定すること
によって行うことができる。第１に，ネコの血清は,FIP
V抗体の存在を検定することができる。第２に，ネコか
ら得た細胞溶解物もしくは全固定細胞は,FIPVタンパク
が発現されているか否かを決定する検定を行うことがで
きる。第１の場合,FIPVタンパクが診断手段である。第
２の場合,FIPVタンパクに対する抗体が診断手段であ
る。
本発明のFIPVタンパクに対する抗体を調製するのに，
標準のプロトコルを用いることができる。ポリクローナ
ル抗体とモノクローナル抗体の両者の製造法は，当該技
術分野では公知である。簡単に述べれば，ポリクローナ
ル抗体は，ウサギもしくはマウスのような動物に,FIPV
タンパクをアジュバントと共に注射することによって調
製される。FIPVタンパクは，カルボジイミド，グルタル
アルデヒドまたは他の架橋剤を用いる化学的方法を利用
してウシ血清アルブミンもしくはキイホール・リンペッ
ト・ヘマシアニン（keyhole limpet hemacyanin）のよ
うな担体タンパクに接合する必要がある。あるいはこの
タンパクは担体タンパクに接合せずに投与してもよい。
FIPVタンパクを発現しているワクシニア組換え体も，抗
体を調製するのに利用できる。動物は，最初に免疫化し
てから数週間後に追加免疫を行う。10日〜２週間後，動
物から採血し，抗血清を集めて，力価を分析する。
標準のプロトコルを用いることができる。ポリクローナ
ル抗体とモノクローナル抗体の両者の製造法は，当該技
術分野では公知である。簡単に述べれば，ポリクローナ
ル抗体は，ウサギもしくはマウスのような動物に,FIPV
タンパクをアジュバントと共に注射することによって調
製される。FIPVタンパクは，カルボジイミド，グルタル
アルデヒドまたは他の架橋剤を用いる化学的方法を利用
してウシ血清アルブミンもしくはキイホール・リンペッ
ト・ヘマシアニン（keyhole limpet hemacyanin）のよ
うな担体タンパクに接合する必要がある。あるいはこの
タンパクは担体タンパクに接合せずに投与してもよい。
FIPVタンパクを発現しているワクシニア組換え体も，抗
体を調製するのに利用できる。動物は，最初に免疫化し
てから数週間後に追加免疫を行う。10日〜２週間後，動
物から採血し，抗血清を集めて，力価を分析する。
モノクローナル抗体は，ポリクローナル抗体を形成し
ている動物のＢ−リンパ球と，不死化された骨髄腫細胞
系とを，適切な条件下で融合させることによって，一般
に調製される。Ｂ−リンパ球は，脾臓細胞もしくは末梢
血液のリンパ球であってもよい。融合法は，当該技術分
野で公知であり，一般に，細胞をポリエチレングリコー
ルのような融合剤と混合することを包含する。成功裏に
ハイブリドーマが生成したことを検定し，例えばHAT培
地のような標準法で選択される。成功裏に得られたハイ
ブリドーマから，所望の抗体を分泌するものの存在につ
いて培養媒体を検定することによって，所望の抗体を分
泌するものをクリーニングする。
ている動物のＢ−リンパ球と，不死化された骨髄腫細胞
系とを，適切な条件下で融合させることによって，一般
に調製される。Ｂ−リンパ球は，脾臓細胞もしくは末梢
血液のリンパ球であってもよい。融合法は，当該技術分
野で公知であり，一般に，細胞をポリエチレングリコー
ルのような融合剤と混合することを包含する。成功裏に
ハイブリドーマが生成したことを検定し，例えばHAT培
地のような標準法で選択される。成功裏に得られたハイ
ブリドーマから，所望の抗体を分泌するものの存在につ
いて培養媒体を検定することによって，所望の抗体を分
泌するものをクリーニングする。
ELISA法（enzyme−linked immunoassay）,RIA法（Rad
ioimmunoassay）,IFA法（immunofluorescenceassay）お
よびウエスタン・ブロット分析法のような標準の免疫学
的方法は，当該技術分野では公知であり,FIPVの診断ス
クリーニングに利用できる。基本的な検定原理の各種改
変については，莫大な文献か現在存在しているが，その
検定原理は，単に，標的被分析物が抗体と特異的に結合
しなければならず，その結合が定性的におよび／または
定量的に検出できるということだけである。螢光，酵素
もしくは放射性の標識が一般に用いられる。一般的な装
置は，標識をつけた抗原（例えばFIPVタンパク）と被分
析物との，抗体に対する競合を利用し，次いで結合画分
と未結合画分を物理的に分離する。被分析物は，標識を
付けた抗原の結合に対して競合し，その結果，多量の被
分析物が存在すれば，多量の標識が未結合画分に残る。
競合結合型検定法では，試料は，公知の力価の標識を付
けたFIPVタンパクとFIPVタンパク抗体とともに培養され
る。次いで抗体−タンパク複合体を，公知の方法を用い
て，複合体になっていない試薬から分離し，複合体化し
た物質中の標識の量を、例えばラジオイムノアッセイの
場合はガンマ線を計数し，または酵素イムノアッセイの
場合は光度を測定することによって測定する。試料中の
FIPVタンパクの量は，いずれにしろ，標識の測定量と標
準曲線との比較によって決定される。この基本原理の他
の態様には，標識をつけた抗体そのものの使用；被分析
物，抗−被分析物抗体および抗−抗体間の３系複合体を
用い，これら成分の一つが標識をもっているサンドイッ
チアッセイ；および免疫吸着剤を用いて結合画分と非結
合画分とを分離する分離法が含まれる。目視可能な沈澱
が生じる凝集検定法も利用できる。（Limetら，J Clin
Chem Clin Biochem 20,142〜147（1982）。
ioimmunoassay）,IFA法（immunofluorescenceassay）お
よびウエスタン・ブロット分析法のような標準の免疫学
的方法は，当該技術分野では公知であり,FIPVの診断ス
クリーニングに利用できる。基本的な検定原理の各種改
変については，莫大な文献か現在存在しているが，その
検定原理は，単に，標的被分析物が抗体と特異的に結合
しなければならず，その結合が定性的におよび／または
定量的に検出できるということだけである。螢光，酵素
もしくは放射性の標識が一般に用いられる。一般的な装
置は，標識をつけた抗原（例えばFIPVタンパク）と被分
析物との，抗体に対する競合を利用し，次いで結合画分
と未結合画分を物理的に分離する。被分析物は，標識を
付けた抗原の結合に対して競合し，その結果，多量の被
分析物が存在すれば，多量の標識が未結合画分に残る。
競合結合型検定法では，試料は，公知の力価の標識を付
けたFIPVタンパクとFIPVタンパク抗体とともに培養され
る。次いで抗体−タンパク複合体を，公知の方法を用い
て，複合体になっていない試薬から分離し，複合体化し
た物質中の標識の量を、例えばラジオイムノアッセイの
場合はガンマ線を計数し，または酵素イムノアッセイの
場合は光度を測定することによって測定する。試料中の
FIPVタンパクの量は，いずれにしろ，標識の測定量と標
準曲線との比較によって決定される。この基本原理の他
の態様には，標識をつけた抗体そのものの使用；被分析
物，抗−被分析物抗体および抗−抗体間の３系複合体を
用い，これら成分の一つが標識をもっているサンドイッ
チアッセイ；および免疫吸着剤を用いて結合画分と非結
合画分とを分離する分離法が含まれる。目視可能な沈澱
が生じる凝集検定法も利用できる。（Limetら，J Clin
Chem Clin Biochem 20,142〜147（1982）。
さらに，抗血清を，ウイルスの伝染性を中和する能力
について試験する。FIPV読取り枠の産物もしくは機能が
未知の遺伝子に対して生成する抗血清は，免疫応答を中
和する潜在的な標的を同定するのに利用できる。この中
和応答は，このような抗血清を動物検体に注射し，次い
でFIPVで攻撃して応答を観察することによって検定でき
る。
について試験する。FIPV読取り枠の産物もしくは機能が
未知の遺伝子に対して生成する抗血清は，免疫応答を中
和する潜在的な標的を同定するのに利用できる。この中
和応答は，このような抗血清を動物検体に注射し，次い
でFIPVで攻撃して応答を観察することによって検定でき
る。
このタンパクもしくはヌクレオチドのプローブは，自
然に感染したFIPV疾患野ネコを、サブユニットワクチン
で免疫化され，それ故全FIPVタンパクに対する抗血清を
産生しないネコから識別する診断手段を提供する。
然に感染したFIPV疾患野ネコを、サブユニットワクチン
で免疫化され，それ故全FIPVタンパクに対する抗血清を
産生しないネコから識別する診断手段を提供する。
H.投与法と製剤法 本発明の方法によって創製された伝染性組換え体のウ
イルスもしくは細胞系はFIPVワクチンとして有用であ
る。特に、本発明者らは,FIPVのＮタンパクに対する機
能性DNA挿入部を有するワクシニアウイルスからなる生
菌ウイルスをネコに接種すると，その後のFIPVによる攻
撃に対して免疫効果があることを例証した。非構造タン
パクのNS1とNS2の一つもしくは両方を発現する組換え体
のウイルスもしくは細胞系をワクチンとして利用して，
ネコをFIPVに対して免疫化することは本発明の範囲内に
考慮される。N,E1,E2,NS1およびNS2のタンパクの組合わ
せを発現するか，その組合わせからなる組換え体のウイ
ルスもしくは細胞系が,FIPVワクチンとして使用される
ことも考慮されている。本発明のFIPVワクチンには，上
記のタンパクもしくはタンパクの組合わせ，または上記
定義のその生物學的誘導体の免疫原性ペプチドのセグメ
ントを含有するものが，さらに考慮されている。
イルスもしくは細胞系はFIPVワクチンとして有用であ
る。特に、本発明者らは,FIPVのＮタンパクに対する機
能性DNA挿入部を有するワクシニアウイルスからなる生
菌ウイルスをネコに接種すると，その後のFIPVによる攻
撃に対して免疫効果があることを例証した。非構造タン
パクのNS1とNS2の一つもしくは両方を発現する組換え体
のウイルスもしくは細胞系をワクチンとして利用して，
ネコをFIPVに対して免疫化することは本発明の範囲内に
考慮される。N,E1,E2,NS1およびNS2のタンパクの組合わ
せを発現するか，その組合わせからなる組換え体のウイ
ルスもしくは細胞系が,FIPVワクチンとして使用される
ことも考慮されている。本発明のFIPVワクチンには，上
記のタンパクもしくはタンパクの組合わせ，または上記
定義のその生物學的誘導体の免疫原性ペプチドのセグメ
ントを含有するものが，さらに考慮されている。
ワクチンは種々の経路で投与され得る。例えば，非経
口（皮下，皮膚内，腹腔内，筋肉内，胸骨内など），鼻
腔内エアゾール，または経口による方法がある。予防接
種に用いられる投与量と投与の方法は，動物の年齢と体
重，投与モードおよび処方物中のアジュバントの存在に
よって変えられ得る。個々の投与量は，通常100ng〜1mg
の範囲内の免疫原である。さらに,1つ以上のFIPVタンパ
クは，投与用の単一処方物に組合わせ得る。先に示した
ように，ワクチン処方物は，免疫応答を開始させるのに
用いるのが好ましく，次に死んだウイルスもしくは亜感
染量の生禁ウイルスを注射する。予防接種は，一般に，
一年目およびそれ以上にわたって周期的に追加免疫の接
種を行う。本願で用いる場合，「免疫原量」という用語
は上記のような投与量を含むものとする。
口（皮下，皮膚内，腹腔内，筋肉内，胸骨内など），鼻
腔内エアゾール，または経口による方法がある。予防接
種に用いられる投与量と投与の方法は，動物の年齢と体
重，投与モードおよび処方物中のアジュバントの存在に
よって変えられ得る。個々の投与量は，通常100ng〜1mg
の範囲内の免疫原である。さらに,1つ以上のFIPVタンパ
クは，投与用の単一処方物に組合わせ得る。先に示した
ように，ワクチン処方物は，免疫応答を開始させるのに
用いるのが好ましく，次に死んだウイルスもしくは亜感
染量の生禁ウイルスを注射する。予防接種は，一般に，
一年目およびそれ以上にわたって周期的に追加免疫の接
種を行う。本願で用いる場合，「免疫原量」という用語
は上記のような投与量を含むものとする。
以下の実施例は，本発明をさらに例示するものであ
り，本発明を限定するものではない。
り，本発明を限定するものではない。
（実施例） 細胞を形質転換し，ベクトルを構築し，メッセンジャ
ーRNAを抽出し,cDNAライブラリーを作製し，免疫検定を
行うなどに用いる技術のほとんどは，当該技術分野で広
く実施されており，ほとんどの当業者は，特定の条件や
方法が記載されている標準法の資料に精通している。実
施例は，このような知見に基づいて記載され，当該技術
分野で一般的であると考えられる方法が援用される。
ーRNAを抽出し,cDNAライブラリーを作製し，免疫検定を
行うなどに用いる技術のほとんどは，当該技術分野で広
く実施されており，ほとんどの当業者は，特定の条件や
方法が記載されている標準法の資料に精通している。実
施例は，このような知見に基づいて記載され，当該技術
分野で一般的であると考えられる方法が援用される。
実施例１ FIPV cDNAのクローン化 A.cDNAライブラリーの合成 ２つのcDNAライブラリーを，異なるウイルス源から構
築した。第１ライブラリーは，フォート・ドッジII型FI
PV（Fort Dodge Type II FIPV,Black,Vet Med/SmallAni
mal Clin,pp.811〜814,1980年５月）に感染させた細胞
由来のポリ（Ａ）＋RNAを用い，一方第２ライブラリー
は，そのポリ（Ａ）＋RNA源としてFIPVの79〜1146単離
物に感染させた細胞を用いた。二本鎖cDNAは,RNAse H法
の改変法（Ｄ′Alessioら，Focus 9(1):1〜４（198
7））によって合成された。一般に，この改変法によっ
て，単一チューブ反応による第１鎖と第２鎖のcDNAの合
成が行われる。
築した。第１ライブラリーは，フォート・ドッジII型FI
PV（Fort Dodge Type II FIPV,Black,Vet Med/SmallAni
mal Clin,pp.811〜814,1980年５月）に感染させた細胞
由来のポリ（Ａ）＋RNAを用い，一方第２ライブラリー
は，そのポリ（Ａ）＋RNA源としてFIPVの79〜1146単離
物に感染させた細胞を用いた。二本鎖cDNAは,RNAse H法
の改変法（Ｄ′Alessioら，Focus 9(1):1〜４（198
7））によって合成された。一般に，この改変法によっ
て，単一チューブ反応による第１鎖と第２鎖のcDNAの合
成が行われる。
第１鎖の合成は,10μｌの5X反応緩衝液（250mMトリス
−塩酸緩衝剤pH 8.3;375mM KCl;50mM DTT;および15mM M
gCl2）,2.5μｌの10mM dNTP,5μｌの1mg/mlオリゴ−dT,
29μｌのRNA＋水,2.5μｌの400U/μｌモロニーウイルス
逆転写酵素（BRL），および１μｌの1U/μｌのRNAsin
（BRL）を用いて行った。第１のcDNAライブラリーにつ
いては,8.4μｇのポリ（Ａ）＋RNAを鋳型として用い，
そして6.5μｇのポリ（Ａ）＋RNAは第２ライブラリーを
生成させるのに用いられた。そのRNAは68℃で３分間熱
処理された後，反応混合物に添加された。反応混合物を
37℃で１時間インキュベートした。
−塩酸緩衝剤pH 8.3;375mM KCl;50mM DTT;および15mM M
gCl2）,2.5μｌの10mM dNTP,5μｌの1mg/mlオリゴ−dT,
29μｌのRNA＋水,2.5μｌの400U/μｌモロニーウイルス
逆転写酵素（BRL），および１μｌの1U/μｌのRNAsin
（BRL）を用いて行った。第１のcDNAライブラリーにつ
いては,8.4μｇのポリ（Ａ）＋RNAを鋳型として用い，
そして6.5μｇのポリ（Ａ）＋RNAは第２ライブラリーを
生成させるのに用いられた。そのRNAは68℃で３分間熱
処理された後，反応混合物に添加された。反応混合物を
37℃で１時間インキュベートした。
第２鎖の合成には,45μｌの上記mRNA:cDNAハイブリッ
ド反応混合物を,64μｌの5X第２鎖緩衝液（95mMトリス
−塩酸緩衝剤pH8.3;455mK KC1;25mM MgCL2；および20mM
DTT）,6.4μｌの10mM dNTP,10μｌの32Ｐ−dCTP,168μ
ｌの水,16μｌの1mg/ml BSA,8μｌの10U/μl DNAポリメ
ラーゼＩ（NEB）および2U/μl RNAse H （BRL）に直接
添加した。この反応生成物を,16℃で２時間インキュベ
ートし，次いでEDTAを5mM添加することによって反応を
停止させた。cDNAをフェノール／CHCl3で１回抽出し，
次いでCHCl3で抽出し，そしてエタノールで沈澱させ
た。
ド反応混合物を,64μｌの5X第２鎖緩衝液（95mMトリス
−塩酸緩衝剤pH8.3;455mK KC1;25mM MgCL2；および20mM
DTT）,6.4μｌの10mM dNTP,10μｌの32Ｐ−dCTP,168μ
ｌの水,16μｌの1mg/ml BSA,8μｌの10U/μl DNAポリメ
ラーゼＩ（NEB）および2U/μl RNAse H （BRL）に直接
添加した。この反応生成物を,16℃で２時間インキュベ
ートし，次いでEDTAを5mM添加することによって反応を
停止させた。cDNAをフェノール／CHCl3で１回抽出し，
次いでCHCl3で抽出し，そしてエタノールで沈澱させ
た。
次にcDNAがメチル化され，平滑末端処理されて，そし
てこれにManiatisら〔Molecular Cloning:A Laboratory
Manual（1982）Cold Spring Harbor Press〕の方法に
よってEcoR Iリンカーが添加された。EcoR I制御酵素で
消化した後,cDNAを,EcoR Iで浄化してホスホターゼで処
理したλgt10の両アームに連結した（Huynhら，（198
4），DNA Cloning,Vol.1:A Practical Approach （D.Gl
over編）,pp.49〜78,IRL Press,オックスフォード）。
連結混合物を伝染性ファージ粒子（Stratagene）内に充
填し，次いで充填されたファージを，E.coli（C600 hfl
A）上で増殖させた。
てこれにManiatisら〔Molecular Cloning:A Laboratory
Manual（1982）Cold Spring Harbor Press〕の方法に
よってEcoR Iリンカーが添加された。EcoR I制御酵素で
消化した後,cDNAを,EcoR Iで浄化してホスホターゼで処
理したλgt10の両アームに連結した（Huynhら，（198
4），DNA Cloning,Vol.1:A Practical Approach （D.Gl
over編）,pp.49〜78,IRL Press,オックスフォード）。
連結混合物を伝染性ファージ粒子（Stratagene）内に充
填し，次いで充填されたファージを，E.coli（C600 hfl
A）上で増殖させた。
B.NS1,NおよびE1遺伝子の単離 1.プローブの合成 第1cDNAライブラリーを，「サブトラクテッドプロー
グ（subtracted probe）」でスクリーニングした。この
プローブは，第１鎖cDNAをFIPVに感染させた細胞由来の
RNAから合成し，鋳型のRNAをNaOH処理で除き，そして得
られたcDNAを未感染の細胞から調製した過剰のRNAと雑
種形成させることによって生成させた。この雑種形成に
続いて,cDNAを，プローブを煮沸することなしにフィル
ターに添加した。ウイルスに特異的でそのため過剰のRN
Aに結合しないcDNAだけが，フィルターのプラークとの
結合に利用され得る。
グ（subtracted probe）」でスクリーニングした。この
プローブは，第１鎖cDNAをFIPVに感染させた細胞由来の
RNAから合成し，鋳型のRNAをNaOH処理で除き，そして得
られたcDNAを未感染の細胞から調製した過剰のRNAと雑
種形成させることによって生成させた。この雑種形成に
続いて,cDNAを，プローブを煮沸することなしにフィル
ターに添加した。ウイルスに特異的でそのため過剰のRN
Aに結合しないcDNAだけが，フィルターのプラークとの
結合に利用され得る。
プローブのcDNAは,10μｌの5X反応緩衝液,2.5μｌの1
0mM dATP,TTP,dGTP,10mM MgCl2,5μｌの32P−dCTP,5μ
ｌのRNAsinおよび2.5μｌのモロニーウイルス逆転写酵
素（400単位／μl,BRLから入手）を混合することによっ
て合成された。上記混合物に，水中のRNA（0.5μｇ）を
24μｌと,65℃で15分間加熱した５μｌのランダムプラ
イマー（水中で50mg/ml,Pharmaciaから入手）とを添加
した。反応混合物を37℃で１時間反応させ，次いでEDTA
を10mM添加して反応を停止させた。NaOHを0.2M添加し，
反応混合物を65℃で１時間インキュベートしてRNAの鋳
型を加水分解した。反応液に，トリス−塩酸pH8を0.2M
添加して中和し，次いで1M HC1を添加してpHを７に調整
した。
0mM dATP,TTP,dGTP,10mM MgCl2,5μｌの32P−dCTP,5μ
ｌのRNAsinおよび2.5μｌのモロニーウイルス逆転写酵
素（400単位／μl,BRLから入手）を混合することによっ
て合成された。上記混合物に，水中のRNA（0.5μｇ）を
24μｌと,65℃で15分間加熱した５μｌのランダムプラ
イマー（水中で50mg/ml,Pharmaciaから入手）とを添加
した。反応混合物を37℃で１時間反応させ，次いでEDTA
を10mM添加して反応を停止させた。NaOHを0.2M添加し，
反応混合物を65℃で１時間インキュベートしてRNAの鋳
型を加水分解した。反応液に，トリス−塩酸pH8を0.2M
添加して中和し，次いで1M HC1を添加してpHを７に調整
した。
次に,10μｇの酵母tRNA添加し，次いでNH4OAcを用い
てcDNAを沈澱させた。得られたcDNAを「サブトラクショ
ンRNA（subtraction RNA）」とバナジルリボヌクレオシ
ド複合体（BRLから入手したVRC）を10mMの最終濃度まで
添加した水中で可溶化させた。この溶液を,65℃で５分
間加熱し，次に，雑種形成溶液（75μｌの20XSSC,30μ
ｌの0.5M HEPES pH6.9,120μｌのホルムアミド,15μｌ
の200mM VRC,および60μｌのサブトラクションRNA,cDNA
および水）に添加した。後者の溶液を一夜42℃でインキ
ュベートし，次いでcDNAをフィルターに添加した。
てcDNAを沈澱させた。得られたcDNAを「サブトラクショ
ンRNA（subtraction RNA）」とバナジルリボヌクレオシ
ド複合体（BRLから入手したVRC）を10mMの最終濃度まで
添加した水中で可溶化させた。この溶液を,65℃で５分
間加熱し，次に，雑種形成溶液（75μｌの20XSSC,30μ
ｌの0.5M HEPES pH6.9,120μｌのホルムアミド,15μｌ
の200mM VRC,および60μｌのサブトラクションRNA,cDNA
および水）に添加した。後者の溶液を一夜42℃でインキ
ュベートし，次いでcDNAをフィルターに添加した。
フィルターを,5 X SSPE,40％ホルムアミド,0.5％脱脂
乾燥牛乳,0.1％SDSおよび10μg/mlのtRNAの中で,37℃で
一夜雑種形成させ,0.2X SSC内で50℃にて洗浄した後，
フィルムに暴露させた。
乾燥牛乳,0.1％SDSおよび10μg/mlのtRNAの中で,37℃で
一夜雑種形成させ,0.2X SSC内で50℃にて洗浄した後，
フィルムに暴露させた。
2.cDNAの分析 サブトラクテッドプローブで同定された８個のクロー
ンを，標準の方法に従ってプラークで精製した。ファー
ジDNAを調製し,EcoRIによる消化を行った。最大の挿入
部を有する２つのクローンを次の試験をするのに選ん
だ。FIPV ＃6c DNAは長さが約1.6kbで,FIPV ＃9 cDNAは
約3.1kbの長さである。
ンを，標準の方法に従ってプラークで精製した。ファー
ジDNAを調製し,EcoRIによる消化を行った。最大の挿入
部を有する２つのクローンを次の試験をするのに選ん
だ。FIPV ＃6c DNAは長さが約1.6kbで,FIPV ＃9 cDNAは
約3.1kbの長さである。
クローン＃６からの最初の配列は,TGEV配列に対して
相同性を示した。クローン＃９はTGEV配列に重なり，か
つ延出しており,FIPVのNS1とＮの遺伝子の全配列を誘導
するために利用された。これらの遺伝子の配列を第１図
に示す。クローン＃９は,E1遺伝子の５′末端まで完全
には延出しなかったので，第1cDNAライブラリーを，ク
ローン＃９のアミノ末端配列由来のオリゴヌクレオチド
（５′−TCGTAAGCGCTAGAACAA−３′）でスクリーニング
した。そのオリゴヌクレオチドを，標準法にしたがって
32Ｐ−ATPを用いてキナーゼ処理を行い，次に6 X SSPE,
1mg/mlヘパリン,0.5％脱脂乾燥牛乳および0.1％SDS中で
雑種成形を行った。フィルターを37℃で一夜雑種形成さ
せ，次いで,50℃にて6 X SSC内で洗浄してからフィルム
に暴露させた。
相同性を示した。クローン＃９はTGEV配列に重なり，か
つ延出しており,FIPVのNS1とＮの遺伝子の全配列を誘導
するために利用された。これらの遺伝子の配列を第１図
に示す。クローン＃９は,E1遺伝子の５′末端まで完全
には延出しなかったので，第1cDNAライブラリーを，ク
ローン＃９のアミノ末端配列由来のオリゴヌクレオチド
（５′−TCGTAAGCGCTAGAACAA−３′）でスクリーニング
した。そのオリゴヌクレオチドを，標準法にしたがって
32Ｐ−ATPを用いてキナーゼ処理を行い，次に6 X SSPE,
1mg/mlヘパリン,0.5％脱脂乾燥牛乳および0.1％SDS中で
雑種成形を行った。フィルターを37℃で一夜雑種形成さ
せ，次いで,50℃にて6 X SSC内で洗浄してからフィルム
に暴露させた。
E1配列の５′末端からさらに200bp延出したクローン
を単離した（＃3a−２）。このようにして完成したE1配
列を得た。FIPVクローン＃９と＃3a−２が,E1遺伝子と
Ｎ遺伝子の全配列をコードするフラグメントを生成させ
るために用いられた。クローン＃3a−２を標準条件下で
EcoRIとSspIの制限酵素で消化して，約200bpのEcoRI−S
spIフラグメントを単離した。クローン＃９を類似の条
件下で,EcoRI,SspIおよびSphI制限酵素を用いて消化し
た。約1.7kbのSspI−SphIフラグメントを，上記の消化
生成物から単離し，そしてクローン＃3a−２から単離し
た約200bpのEcoRI−SspIフラグメントに連結した。E1遺
伝子とＮ遺伝子の全コード配列を含む上記の連結された
EcoRI−SphIフラグメントを,EcoRIとSphIで消化させたp
UC18にサブクローン化し，得られたクローンをpUC18:E1
−Ｎと命名した。フラグメントの単離，連結およびプラ
スミドへのサブクローニングの標準方法が本実験例を通
じて適用された。正しくE1−Ｎの構築が行われているか
は，ミニプレップドDNA（mini−prepped DNA）を増殖さ
せ，次に得られたプラスミドDNAを制限酵素で消化する
ことによって確認した。
を単離した（＃3a−２）。このようにして完成したE1配
列を得た。FIPVクローン＃９と＃3a−２が,E1遺伝子と
Ｎ遺伝子の全配列をコードするフラグメントを生成させ
るために用いられた。クローン＃3a−２を標準条件下で
EcoRIとSspIの制限酵素で消化して，約200bpのEcoRI−S
spIフラグメントを単離した。クローン＃９を類似の条
件下で,EcoRI,SspIおよびSphI制限酵素を用いて消化し
た。約1.7kbのSspI−SphIフラグメントを，上記の消化
生成物から単離し，そしてクローン＃3a−２から単離し
た約200bpのEcoRI−SspIフラグメントに連結した。E1遺
伝子とＮ遺伝子の全コード配列を含む上記の連結された
EcoRI−SphIフラグメントを,EcoRIとSphIで消化させたp
UC18にサブクローン化し，得られたクローンをpUC18:E1
−Ｎと命名した。フラグメントの単離，連結およびプラ
スミドへのサブクローニングの標準方法が本実験例を通
じて適用された。正しくE1−Ｎの構築が行われているか
は，ミニプレップドDNA（mini−prepped DNA）を増殖さ
せ，次に得られたプラスミドDNAを制限酵素で消化する
ことによって確認した。
実施例２ E2とNS2のcDNAの単離 E2をコードするcDNA配列を単離するために第２ライブ
ラリーを用いた。下記表１に示すオリゴヌクレオチドプ
ローブは,E2についてすでに刊行されている配列（deGro
otら，前出）から設計した。
ラリーを用いた。下記表１に示すオリゴヌクレオチドプ
ローブは,E2についてすでに刊行されている配列（deGro
otら，前出）から設計した。
雑種形成の条件は，オリゴヌクレオチドのスクリーニ
ングについて記載したのと同様である。各々，長さ6kb
のcDNA挿入部を有する２つのcDNAクローンを単離し,pBR
329にサブクローン化し，これらをp329（88）;E2＃１お
よびp329（88）:E2＃２と命名した。後者プラスミドはp
BR329−E2＃２と命名した。ヌクレチオドの配列とサザ
ンブロット法の実験結果からみて，これらのクローン
は，刊行されたE2配列の463ヌクレオチドから始まり,E2
の末端まで延出し，次いでNS2とE1に続いている。
ングについて記載したのと同様である。各々，長さ6kb
のcDNA挿入部を有する２つのcDNAクローンを単離し,pBR
329にサブクローン化し，これらをp329（88）;E2＃１お
よびp329（88）:E2＃２と命名した。後者プラスミドはp
BR329−E2＃２と命名した。ヌクレチオドの配列とサザ
ンブロット法の実験結果からみて，これらのクローン
は，刊行されたE2配列の463ヌクレオチドから始まり,E2
の末端まで延出し，次いでNS2とE1に続いている。
実施例３ ワクシニアウイルス挿入ベクターの構築 ５つの各FIPVタンパクをコードするFIPV cDNAをもっ
ている組換え体ワクシニアウイルスをMackettおよびSmi
thの（J Gen Virol，67:2067−2082,（1986）で総説さ
れている）標準法で生成させた。この文献を参考とし
て，ここに引用する。第２図に示す２つの共挿入ベクタ
ーのうちの１つ（もしくは両者を）各cDNAに用いた。pS
Cl1ベクターは,cDNA挿入部で与えられたATGを有する単
一の平滑末端クローン化部位（SmaＩ）を有する。pUV1
ベクターは，多数のクローン化部位を備え，これらはす
べてワクシニアP11プロモーターのATGの後に生成してい
る。それ故に，すべてのpUV1−FIPVの構築物には,FIPV
のコード配列が,p11のATGとのフレーム内に位置してい
る必要がある。各構築物の詳細は次のとおりである。
ている組換え体ワクシニアウイルスをMackettおよびSmi
thの（J Gen Virol，67:2067−2082,（1986）で総説さ
れている）標準法で生成させた。この文献を参考とし
て，ここに引用する。第２図に示す２つの共挿入ベクタ
ーのうちの１つ（もしくは両者を）各cDNAに用いた。pS
Cl1ベクターは,cDNA挿入部で与えられたATGを有する単
一の平滑末端クローン化部位（SmaＩ）を有する。pUV1
ベクターは，多数のクローン化部位を備え，これらはす
べてワクシニアP11プロモーターのATGの後に生成してい
る。それ故に，すべてのpUV1−FIPVの構築物には,FIPV
のコード配列が,p11のATGとのフレーム内に位置してい
る必要がある。各構築物の詳細は次のとおりである。
pSC11−NS2: NS2をコードする配列（n.t.641−853）を,pSC11のSma
Ｉ部位にサブクローン化された，平滑末端XmnＩ（n.t.5
99）−PvuII（n.t.2124）フラグメントとして,pBR329−
E2＃２から単離した。n.t.641に位置するNS2のATGは，
クローニング部位の３′側に出合う最初の開始コドンで
ある。
Ｉ部位にサブクローン化された，平滑末端XmnＩ（n.t.5
99）−PvuII（n.t.2124）フラグメントとして,pBR329−
E2＃２から単離した。n.t.641に位置するNS2のATGは，
クローニング部位の３′側に出合う最初の開始コドンで
ある。
pUV1−NS2: NS2をコードする配列を，Tth111I（n.t.648）−PvuII
（n.t.2124）フラグメントとして,pBR329−E2＃２から
単離した。Tth111I部位に突き出ている単一の塩基対は
クレノウ試薬で充填された。pUV1ベクターは，EcoRIに
よる消化とクレノウ試薬による充填によって調製した。
次に，平滑末端とされたNS2フラグメントを,p11のATGの
後にpUV1の平滑末端とされたEcoRI部位にサブクローン
化した。その結果,FIPV−NS2のアミノ末端が，「met−a
sp−ile−val−lys・・・」から「met−asn−phe−val
−lys・・・」に変化する。この変形残基にはアンダー
ラインをつけている。
（n.t.2124）フラグメントとして,pBR329−E2＃２から
単離した。Tth111I部位に突き出ている単一の塩基対は
クレノウ試薬で充填された。pUV1ベクターは，EcoRIに
よる消化とクレノウ試薬による充填によって調製した。
次に，平滑末端とされたNS2フラグメントを,p11のATGの
後にpUV1の平滑末端とされたEcoRI部位にサブクローン
化した。その結果,FIPV−NS2のアミノ末端が，「met−a
sp−ile−val−lys・・・」から「met−asn−phe−val
−lys・・・」に変化する。この変形残基にはアンダー
ラインをつけている。
pSC11−E1: E1をコードする配列（n.t.1954−2739）を，クレノウ
試薬によってEcoRI部位を平滑末端化したEcoRI（n.t.19
21）−Ba1Ｉ（n.t.2759）フラグメントとして,pUC18:E1
−Ｎ（実施例１参照）から単離した。このEcoRI部位が
第１図の配列に存在しないのは，それがもとのラムダク
ローンの１つ（＃3a−2;実施例１参照）に存在するリン
カー部位であったからである。この部位の位置は，第１
図に「〔EcoRI〕」で示してある。平滑末端EcoRI−BalI
E1フラグメントをpSC11のSmaＩ部位にサブクローン化
した。n.t.1954に位置するE1のATGは，クローニング部
位の３′側に出会う最初の開始コドンである。pS11-N ： Ｎをコードする配列（n.t.2755−3885）を,pUC18:E1
−ＮからM1uＩ（n.t.2773）−SphＩ（n.t.3896）フラグ
メントとして単離した。SmaＩ−M1uＩリンカーを,5′末
端に付加して，SmaＩクローン化部位を与え,NのATGと，
M1uＩ部位の５′側に生じるコード配列とを元の位置に
もどした。SphＩ−SmaＩリンカーを３′末端に付加し
た。得られたSmaINフラグメントを,pSC11のSmaＩ部位に
サブクローン化した。pUV1-N ： Ｎをコードする配列を，Ba1Ｉ（n.t.2759）−HindIII
フラグメントとしてpUC18:E1−Ｎから単離した。HindII
I部位は,pUC18ポリリンカー領域によって供給された。
このHindIII部位はクレノウ試薬によって充填された。
得られた平滑末端とされたＮフラグメントを,p11のATG
の後のpUV1の平滑末端とされたEcoRI部位にサブクロー
ン化した。このサブクローン化法によって，アミノ酸末
端のＮ配列が，「met−ala−thr−glu・・・」から「me
t−asn−ser−thr−glu・・・」に変化する。その変形
もしくは付加残基にはアンダーラインを付けてある。pSC11-NS1 ： NS1をコードする配列（n.t.3893−4195）を，SphＩ
（n.t.3896）−EcoRI（n.t.5126）フラグメントとしてp
64−FIPV6から単離した。リンカーをそのSphＩ部位に付
加して,NS1のATGを戻し,5′EcoRIクローン化部位を与え
た。５′と３′側のEcoRI部位にクレノウ試薬を充填
し，平滑末端のＮフラグメントをpSC11のSmaＩ部位にサ
ブクローン化した。pUV1-NSI ： 上記の（リンカーを付加した後）EcoRI NS1フラグメ
ントを,pUV1のEcoRＩ部位に直接サブクローン化した。
その結果，アミノ末端のNS1残基が，“met−leu−val−
phe・・・”から“met−ans−ser−met−leu−val−phe
・・・”に変化する。付加した残基はアンダーラインを
してある。pUV1-E2 5′： FIPV cDNAクローンp329（88）:E2＃２（実施例２参
照）は,E2タンパクのカルボキシ末端までの約90％をコ
ードするE2配列の3893個のヌクレオチドを有している。
この配列は,deGrootらの配列（前記文献）のn.t.463の
位置に位置するEcoRI部位から始まる（E2タンパクの終
止コドンは，第１図のn.t.572に生じる）。pUV1挿入プ
ラスミドの構築は，上記のE2配列を含む3921n.t.EcoRI
−XmnＩ（第１図のn.t.599）フラグメントを精製し，得
られたフラグメントを,pUVlポリリンカーのEcoRI−Sma
Ｉ部位にサブクローン化する（第2C図参照）ことによっ
て行った。その結果,E2タンパク配列がp11のATGとのフ
レームに位置し，第１残基が“met−asn−ser・・・”
になっている。deGrootらの正しいE2配列は“asn−ser
・・・”残基で始まる。pSC11-E2 ： ５′E2 cDNA配列は，ポリメラーゼ連鎖反応（Sakiら,
1988年，science，239巻,487−491頁，およびStoflet
ら,1988年，Science，239巻,491−494頁）を利用して,F
IPV1146 RNA（Pedersenら，Am J Vet Res，45（1
2）,2580−2585頁,1984年）から生成させた。平滑クロ
ーニング部位を，変性していないE2のATGの５′側に構
築して，全E2フラグメントが,5′側平滑部位と,pUV1−E
2 5′の構築実施例で述べた３′側XmnＩ部位とを用い
て,pSC11のSmaＩ部位にブラントすることができるよう
にした。pUV1-E2 ： 部位試行突然変異誘発法を用いて，EcoRI部位を変性
していないE2のATGの後に挿入して,n.t.463までの５′E
2配列を，EcoRIフラグメントとして単離することが可能
になり，次いでこのフラグメントをpUV1−E2 5′構築物
のEcoRI部位に挿入する。得られた構築物は,p11開始コ
ドンの後に完全なE2配列を有する。そのアミノ末端のE2
配列“met−ile−val−leu−val・・・”は“met−asn
−ser−leu−val・・・”になる。変異残基にはアンダ
ーラインをしてある。
試薬によってEcoRI部位を平滑末端化したEcoRI（n.t.19
21）−Ba1Ｉ（n.t.2759）フラグメントとして,pUC18:E1
−Ｎ（実施例１参照）から単離した。このEcoRI部位が
第１図の配列に存在しないのは，それがもとのラムダク
ローンの１つ（＃3a−2;実施例１参照）に存在するリン
カー部位であったからである。この部位の位置は，第１
図に「〔EcoRI〕」で示してある。平滑末端EcoRI−BalI
E1フラグメントをpSC11のSmaＩ部位にサブクローン化
した。n.t.1954に位置するE1のATGは，クローニング部
位の３′側に出会う最初の開始コドンである。pS11-N ： Ｎをコードする配列（n.t.2755−3885）を,pUC18:E1
−ＮからM1uＩ（n.t.2773）−SphＩ（n.t.3896）フラグ
メントとして単離した。SmaＩ−M1uＩリンカーを,5′末
端に付加して，SmaＩクローン化部位を与え,NのATGと，
M1uＩ部位の５′側に生じるコード配列とを元の位置に
もどした。SphＩ−SmaＩリンカーを３′末端に付加し
た。得られたSmaINフラグメントを,pSC11のSmaＩ部位に
サブクローン化した。pUV1-N ： Ｎをコードする配列を，Ba1Ｉ（n.t.2759）−HindIII
フラグメントとしてpUC18:E1−Ｎから単離した。HindII
I部位は,pUC18ポリリンカー領域によって供給された。
このHindIII部位はクレノウ試薬によって充填された。
得られた平滑末端とされたＮフラグメントを,p11のATG
の後のpUV1の平滑末端とされたEcoRI部位にサブクロー
ン化した。このサブクローン化法によって，アミノ酸末
端のＮ配列が，「met−ala−thr−glu・・・」から「me
t−asn−ser−thr−glu・・・」に変化する。その変形
もしくは付加残基にはアンダーラインを付けてある。pSC11-NS1 ： NS1をコードする配列（n.t.3893−4195）を，SphＩ
（n.t.3896）−EcoRI（n.t.5126）フラグメントとしてp
64−FIPV6から単離した。リンカーをそのSphＩ部位に付
加して,NS1のATGを戻し,5′EcoRIクローン化部位を与え
た。５′と３′側のEcoRI部位にクレノウ試薬を充填
し，平滑末端のＮフラグメントをpSC11のSmaＩ部位にサ
ブクローン化した。pUV1-NSI ： 上記の（リンカーを付加した後）EcoRI NS1フラグメ
ントを,pUV1のEcoRＩ部位に直接サブクローン化した。
その結果，アミノ末端のNS1残基が，“met−leu−val−
phe・・・”から“met−ans−ser−met−leu−val−phe
・・・”に変化する。付加した残基はアンダーラインを
してある。pUV1-E2 5′： FIPV cDNAクローンp329（88）:E2＃２（実施例２参
照）は,E2タンパクのカルボキシ末端までの約90％をコ
ードするE2配列の3893個のヌクレオチドを有している。
この配列は,deGrootらの配列（前記文献）のn.t.463の
位置に位置するEcoRI部位から始まる（E2タンパクの終
止コドンは，第１図のn.t.572に生じる）。pUV1挿入プ
ラスミドの構築は，上記のE2配列を含む3921n.t.EcoRI
−XmnＩ（第１図のn.t.599）フラグメントを精製し，得
られたフラグメントを,pUVlポリリンカーのEcoRI−Sma
Ｉ部位にサブクローン化する（第2C図参照）ことによっ
て行った。その結果,E2タンパク配列がp11のATGとのフ
レームに位置し，第１残基が“met−asn−ser・・・”
になっている。deGrootらの正しいE2配列は“asn−ser
・・・”残基で始まる。pSC11-E2 ： ５′E2 cDNA配列は，ポリメラーゼ連鎖反応（Sakiら,
1988年，science，239巻,487−491頁，およびStoflet
ら,1988年，Science，239巻,491−494頁）を利用して,F
IPV1146 RNA（Pedersenら，Am J Vet Res，45（1
2）,2580−2585頁,1984年）から生成させた。平滑クロ
ーニング部位を，変性していないE2のATGの５′側に構
築して，全E2フラグメントが,5′側平滑部位と,pUV1−E
2 5′の構築実施例で述べた３′側XmnＩ部位とを用い
て,pSC11のSmaＩ部位にブラントすることができるよう
にした。pUV1-E2 ： 部位試行突然変異誘発法を用いて，EcoRI部位を変性
していないE2のATGの後に挿入して,n.t.463までの５′E
2配列を，EcoRIフラグメントとして単離することが可能
になり，次いでこのフラグメントをpUV1−E2 5′構築物
のEcoRI部位に挿入する。得られた構築物は,p11開始コ
ドンの後に完全なE2配列を有する。そのアミノ末端のE2
配列“met−ile−val−leu−val・・・”は“met−asn
−ser−leu−val・・・”になる。変異残基にはアンダ
ーラインをしてある。
実施例４ ワクシニアウイルス組換え体の生成 実施例３に記載のワクシニア挿入ベクターを用いて，
以下のようにしてFIPV−ワクシニア組換え体ウイルスを
生成した。
以下のようにしてFIPV−ワクシニア組換え体ウイルスを
生成した。
FIPV−ワクシニアウイルス組換え体の調製 60mmの皿内のCV−１細胞の集密的細胞単層に，ワクシ
ニアウイルス〔ウイス株（Wyeth strain）〕を,0.05pfu
/細胞の感染多重度（moi:モイ）で感染させた。感染さ
せてから２時間後，細胞に,10μｇの挿入プラスミドDNA
と0.5μｇの野生型ワクシニアウイルスDNAをリン酸カル
シウム沈降法でトランスフェクションさせた。細胞を完
全培地に入れ,37℃で２日間インキュベートした。単層
を集めて,TK-ワクシニアウイルスを,25μg/mlの５−ブ
ロモデオキシウリジン（BudR）の存在下,TK-143細胞上
で選択した。感染させてから48時間後，単層を,300μg/
mlの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ
−ガラクトピラノシド（Xgal）を含有する１％のアガロ
ースで覆った。４〜６時間後，青色のプラークを採取
し，さらにBudRとXgalの存在下でプラークの精製を２回
追加して行った。FIPV−ワクシニア組換え体ウイルスの
株をTK-143,CV−１もしくはVEROの細胞内に作製した。
組換えウイルスDNAを各株から作製し，サザーンブロッ
ト分析した結果，適切なFIPV cDNA挿入部を有し，野生
型または自然のTK-ワクシニアで汚染されていないこと
が分かった。
ニアウイルス〔ウイス株（Wyeth strain）〕を,0.05pfu
/細胞の感染多重度（moi:モイ）で感染させた。感染さ
せてから２時間後，細胞に,10μｇの挿入プラスミドDNA
と0.5μｇの野生型ワクシニアウイルスDNAをリン酸カル
シウム沈降法でトランスフェクションさせた。細胞を完
全培地に入れ,37℃で２日間インキュベートした。単層
を集めて,TK-ワクシニアウイルスを,25μg/mlの５−ブ
ロモデオキシウリジン（BudR）の存在下,TK-143細胞上
で選択した。感染させてから48時間後，単層を,300μg/
mlの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ
−ガラクトピラノシド（Xgal）を含有する１％のアガロ
ースで覆った。４〜６時間後，青色のプラークを採取
し，さらにBudRとXgalの存在下でプラークの精製を２回
追加して行った。FIPV−ワクシニア組換え体ウイルスの
株をTK-143,CV−１もしくはVEROの細胞内に作製した。
組換えウイルスDNAを各株から作製し，サザーンブロッ
ト分析した結果，適切なFIPV cDNA挿入部を有し，野生
型または自然のTK-ワクシニアで汚染されていないこと
が分かった。
組織培養物中でワクシニアウイルス組換え体によって
産生されたFIPV−特異性ポリペプチドの同定 FIPV I型とFIPV II型を感染させたFCWFもしくはCRFK
の組織培養細胞由来のFIPV構造タンパク（N,E1およびE
2）を特異的に免疫沈降させたネコの腹水の試薬はすで
に同定された。CV−１細胞に，ワクシニア−FIPVのE1,N
もしくはE2の組換え体を,5〜10のモイで感染させて〔35
Ｓ〕メチオニンで放射能標識をつけると，感染細胞溶解
物を調製することができ，予想される分子量のFIPV特異
的ポリペプチドをネコの腹水の試薬で免疫沈降させるこ
とができる（PAGE分析法による）。NS1とNS2との組換え
体の場合には，これらのまだ同定されていないFIPVでコ
ードされたタンパクを認識する免疫学的試薬は入手でき
なかった。しかし、NS1とNS2との組換え体に対してラビ
ットに生じた抗血清は,FIPVウイルスを感染させた細胞
から新規なポリペプチドを特異的に免疫沈降させて，模
擬感染させた細胞からは沈降させないようにするのに用
いることができる。このようにして非構造組換え体は,F
IPVがコードするタンパクを作っていることを証明でき
る。
産生されたFIPV−特異性ポリペプチドの同定 FIPV I型とFIPV II型を感染させたFCWFもしくはCRFK
の組織培養細胞由来のFIPV構造タンパク（N,E1およびE
2）を特異的に免疫沈降させたネコの腹水の試薬はすで
に同定された。CV−１細胞に，ワクシニア−FIPVのE1,N
もしくはE2の組換え体を,5〜10のモイで感染させて〔35
Ｓ〕メチオニンで放射能標識をつけると，感染細胞溶解
物を調製することができ，予想される分子量のFIPV特異
的ポリペプチドをネコの腹水の試薬で免疫沈降させるこ
とができる（PAGE分析法による）。NS1とNS2との組換え
体の場合には，これらのまだ同定されていないFIPVでコ
ードされたタンパクを認識する免疫学的試薬は入手でき
なかった。しかし、NS1とNS2との組換え体に対してラビ
ットに生じた抗血清は,FIPVウイルスを感染させた細胞
から新規なポリペプチドを特異的に免疫沈降させて，模
擬感染させた細胞からは沈降させないようにするのに用
いることができる。このようにして非構造組換え体は,F
IPVがコードするタンパクを作っていることを証明でき
る。
上記の組換え体ウイルス株は，生きた免疫原として用
いられるか，またはFIPVサブユニットタンパクが次に発
現される，感染可能な細胞の単層に感染させるのに用い
られる。次にワクシニアで発現された組換え体FIPVタン
パクを含有する単層を採集し，死菌免疫原として用いる
ために不活性化する。
いられるか，またはFIPVサブユニットタンパクが次に発
現される，感染可能な細胞の単層に感染させるのに用い
られる。次にワクシニアで発現された組換え体FIPVタン
パクを含有する単層を採集し，死菌免疫原として用いる
ために不活性化する。
実施例５ タンパクの調製 ワクシニアウイルスの増殖法 特に限定はないが，クランドール（Crandall）ネコ腎
臓細胞（CRFK），ウッド（Wood）のネコ細胞系（FC），
ネコ胎児の全胎児（FCWF），犬の腎臓細胞系（DK），マ
ジン・ダービー・キャニン（Madin Darby Canine）の腎
臓細胞（MDCK），ベビーハムスターの腎臓細胞（BH
K），アフリカ緑ザルの腎臓細胞（VERO）のような哺乳
類の細胞培養物の100％の集密的細胞単層に，組織培養
感染量（TCID50）もしくはプラーク形成単位（pfu）で
測定して，ウイルス対細胞の比率を1:10,000〜1:10,好
ましくは1:5000〜1:100,さらに好ましくは1:1500〜1:50
0にして,FIPV−ワクシニア組換え体ウイルスを接種し
た。最適に接種するには，細胞は，増殖容器内に，接種
後約12〜48時間以内，好ましくは24時間以内に，少なく
とも100,000〜1,000,000細胞数／cm2，好ましくは150,0
00〜500,000細胞数／cm2細胞単層を形成するのに充分な
量が存在していなければならない。ウイルスを，細胞
に,28〜38℃にて，少なくとも60分間しかし300分間末
端，好ましくは90〜240分間で吸着させ，次に容器に維
持培養液を再供給する。
臓細胞（CRFK），ウッド（Wood）のネコ細胞系（FC），
ネコ胎児の全胎児（FCWF），犬の腎臓細胞系（DK），マ
ジン・ダービー・キャニン（Madin Darby Canine）の腎
臓細胞（MDCK），ベビーハムスターの腎臓細胞（BH
K），アフリカ緑ザルの腎臓細胞（VERO）のような哺乳
類の細胞培養物の100％の集密的細胞単層に，組織培養
感染量（TCID50）もしくはプラーク形成単位（pfu）で
測定して，ウイルス対細胞の比率を1:10,000〜1:10,好
ましくは1:5000〜1:100,さらに好ましくは1:1500〜1:50
0にして,FIPV−ワクシニア組換え体ウイルスを接種し
た。最適に接種するには，細胞は，増殖容器内に，接種
後約12〜48時間以内，好ましくは24時間以内に，少なく
とも100,000〜1,000,000細胞数／cm2，好ましくは150,0
00〜500,000細胞数／cm2細胞単層を形成するのに充分な
量が存在していなければならない。ウイルスを，細胞
に,28〜38℃にて，少なくとも60分間しかし300分間末
端，好ましくは90〜240分間で吸着させ，次に容器に維
持培養液を再供給する。
TCID50で測定して少なくとも1000粒子であるが通常50
0,000,000未満で，一般に5,000,000粒子であり，また細
胞培養物において80％を上まわる細胞変性効果（CPE）
を示す採集可能なウイルス力価を，接種してから24〜96
時間後に得ることができる。細胞単層を多重凍結融解法
で取出し，超音波処理し次いで不活性化あるいは凍結保
存する。
0,000,000未満で，一般に5,000,000粒子であり，また細
胞培養物において80％を上まわる細胞変性効果（CPE）
を示す採集可能なウイルス力価を，接種してから24〜96
時間後に得ることができる。細胞単層を多重凍結融解法
で取出し，超音波処理し次いで不活性化あるいは凍結保
存する。
特殊な例では,10個の850cm2のローラービンすなわちV
ERO細胞を洗い流し，各ローラービンに,5.211ogTCID50/
mlの力価を有するFIPV−ワクシニアの種を添加した。各
ローラービンには150,000,000の集密VERO細胞が入って
おり，ウイルス対細胞の比率のモイ値は1:100であっ
た。ウイルスを,50mlのMEMに３時間吸着させ，次いで維
持用のMEMを再度供給した。ウイルス液を接種してから7
2時間後に採集したが，ウイルスの力価は,6.25logTCID
50/mlであった。40×PEGで濃縮後（以下参照），ウイル
スの力価は8logTCID50/mlであった。生きた免疫原とし
て使用されるウイルス製剤も，106〜108pfu/投与の接触
濃度を達成するよう濃縮される。このような粗製ウイル
ス株は，動物を直接免疫化するのに用いてもよく，また
は凍結乾燥し次いで適当な希釈剤で再構成してもよい。
ERO細胞を洗い流し，各ローラービンに,5.211ogTCID50/
mlの力価を有するFIPV−ワクシニアの種を添加した。各
ローラービンには150,000,000の集密VERO細胞が入って
おり，ウイルス対細胞の比率のモイ値は1:100であっ
た。ウイルスを,50mlのMEMに３時間吸着させ，次いで維
持用のMEMを再度供給した。ウイルス液を接種してから7
2時間後に採集したが，ウイルスの力価は,6.25logTCID
50/mlであった。40×PEGで濃縮後（以下参照），ウイル
スの力価は8logTCID50/mlであった。生きた免疫原とし
て使用されるウイルス製剤も，106〜108pfu/投与の接触
濃度を達成するよう濃縮される。このような粗製ウイル
ス株は，動物を直接免疫化するのに用いてもよく，また
は凍結乾燥し次いで適当な希釈剤で再構成してもよい。
死んだ免疫原として使用されるウイルス製剤は，不活
性化され，濃縮され，ついで標準のプロトコルでアジュ
バントが加えられる。
性化され，濃縮され，ついで標準のプロトコルでアジュ
バントが加えられる。
安定してトランスフェクションされた細胞系の増殖方法 構造上FIPVタンパクを発現する安定な細胞系を,850cm
2のローラービンに100％の集密度で増殖させる。細胞が
最大密度に達した後，細胞を，凍結融解を３回行って採
集し，ウイルス液について記載したのと同様にして濃縮
する。細胞系の液を不活性化し，濃縮し，次いで標準の
プロトコルを用いてアジュバントを加える。
2のローラービンに100％の集密度で増殖させる。細胞が
最大密度に達した後，細胞を，凍結融解を３回行って採
集し，ウイルス液について記載したのと同様にして濃縮
する。細胞系の液を不活性化し，濃縮し，次いで標準の
プロトコルを用いてアジュバントを加える。
ウイルス液もしくは細胞系液のバイナリー（binary）エ
チレンイミン（BEI）による不活性化 ブロモエチルアミン臭化水素酸塩の0.2モル溶液と水
酸化ナトリウムの0.4モル溶液とを同体積混合し，約37
℃で60分間培養する。得られた環化不活性化剤は，バイ
ナリーエチレンイミン（BEI）であり，ウイルス液もし
くは細胞系液に0.5〜４％（V/V）で添加される。不活性
化中のウイルス液もしくは細胞系液は，周期的に撹拌し
ながら,4〜37℃で24〜72時間保持される。
チレンイミン（BEI）による不活性化 ブロモエチルアミン臭化水素酸塩の0.2モル溶液と水
酸化ナトリウムの0.4モル溶液とを同体積混合し，約37
℃で60分間培養する。得られた環化不活性化剤は，バイ
ナリーエチレンイミン（BEI）であり，ウイルス液もし
くは細胞系液に0.5〜４％（V/V）で添加される。不活性
化中のウイルス液もしくは細胞系液は，周期的に撹拌し
ながら,4〜37℃で24〜72時間保持される。
不活性化されたウイルス液もしくは細胞系液は，細胞
培養を３回行い，特異的ウイルスの増殖量を検査して完
全な不活性化について試験する。
培養を３回行い，特異的ウイルスの増殖量を検査して完
全な不活性化について試験する。
ウイルス液もしくは細胞系液の濃縮 ウイルス液もしくは細胞系液は，アミコン（Amico
n），ペリコン（Pellicon）（Millipore社）の濃縮装置
のような有効な技術；塩化アンモニウムもしくポリエチ
レングリコールなどによる沈降法；カーボワックス液も
しくはワックスを用いて透析管による濃縮法，またはリ
ン酸アルミニウムのようなアジュバント濃縮法のいくつ
かを用いて,2〜50倍濃縮される。PEGによる濃縮法では,
80mlの50％PEGを１のウイルス液もしくは細胞系液に
加え，次いで一昼夜４℃で混合する。翌日PEG−ウイル
ス液を2500RPMを上まわる回転数で遠心分離し，上澄液
を廃棄し，得られたPEG−ウイルスのペレットを，正し
い体積培地に再度懸濁させて所望の濃度とする。
n），ペリコン（Pellicon）（Millipore社）の濃縮装置
のような有効な技術；塩化アンモニウムもしくポリエチ
レングリコールなどによる沈降法；カーボワックス液も
しくはワックスを用いて透析管による濃縮法，またはリ
ン酸アルミニウムのようなアジュバント濃縮法のいくつ
かを用いて,2〜50倍濃縮される。PEGによる濃縮法では,
80mlの50％PEGを１のウイルス液もしくは細胞系液に
加え，次いで一昼夜４℃で混合する。翌日PEG−ウイル
ス液を2500RPMを上まわる回転数で遠心分離し，上澄液
を廃棄し，得られたPEG−ウイルスのペレットを，正し
い体積培地に再度懸濁させて所望の濃度とする。
ウイルス液もしくは細胞系液へのアジュバント添加 以下のアジュバントを，動物の皮膚硬化反応とアジュ
バントの混合適合性によって，単独もしくは２種以上組
み合わせて用いてもよい。
バントの混合適合性によって，単独もしくは２種以上組
み合わせて用いてもよい。
水中に１％（W/V）の濃度で調製した，エチレンマレ
イン酸無水物（EMA）を，不活性化したウイルス液もし
くは細胞系液に,0.01〜６％（V/V）添加した（単独もし
くは他のアジュバントと組み合わせて濃縮）。得られた
液のpHを,1Nの水酸化ナトリウム溶液を添加して7.1〜7.
7に調節する。
イン酸無水物（EMA）を，不活性化したウイルス液もし
くは細胞系液に,0.01〜６％（V/V）添加した（単独もし
くは他のアジュバントと組み合わせて濃縮）。得られた
液のpHを,1Nの水酸化ナトリウム溶液を添加して7.1〜7.
7に調節する。
ネオクリールA640（Neocryl A640）とは，（スチレン
と，アクリル酸とメタクリル酸との混合物との）コポリ
マーのラテックスエマルジョンの商品名である。ネオク
リールA640は，スチレンを含有する，非融合性の水性ア
クリルコポリマーであり,pHは7.5,粘度が100cps（Brook
field 25℃）であり,1ガロン当りの重量は,40重量％固
形分および38容量％固形分で供給された場合,8.6ポンド
である。A640という数字はそのグレードを示す。他の有
用なネオクリールのグレードは520,625および966であ
る。以下に用いられる「CSMA」という用語はスチレン
と，アクリル酸とメタクリル酸との混合物とのコポリマ
ーを意味する。50％（V/V）の水中懸濁液として調製さ
れたCSMAを，不活性化したウイルス液もくしは細胞系液
に,0.2〜10容量％で，単独もしくは他のアジュバントと
組み合わせて添加する。CSMAは中性pHであるから一般に
pHを調節する必要はない。
と，アクリル酸とメタクリル酸との混合物との）コポリ
マーのラテックスエマルジョンの商品名である。ネオク
リールA640は，スチレンを含有する，非融合性の水性ア
クリルコポリマーであり,pHは7.5,粘度が100cps（Brook
field 25℃）であり,1ガロン当りの重量は,40重量％固
形分および38容量％固形分で供給された場合,8.6ポンド
である。A640という数字はそのグレードを示す。他の有
用なネオクリールのグレードは520,625および966であ
る。以下に用いられる「CSMA」という用語はスチレン
と，アクリル酸とメタクリル酸との混合物とのコポリマ
ーを意味する。50％（V/V）の水中懸濁液として調製さ
れたCSMAを，不活性化したウイルス液もくしは細胞系液
に,0.2〜10容量％で，単独もしくは他のアジュバントと
組み合わせて添加する。CSMAは中性pHであるから一般に
pHを調節する必要はない。
最近の家畜用製品で（Omaka,NE），小動物用のエマル
シゲン（Emulsigen）アジュバントは，水中油滴型エマ
ルジョンで，ウイルス液もしくは細胞系液に１〜20％
（V/V）で単独もしくは他のアジュバントと組み合わせ
て用いられる。
シゲン（Emulsigen）アジュバントは，水中油滴型エマ
ルジョンで，ウイルス液もしくは細胞系液に１〜20％
（V/V）で単独もしくは他のアジュバントと組み合わせ
て用いられる。
アブリジン（Avridine）が,5〜30mg/投与で単独もし
くは他のアジュバントと組み合わせて用いられる。2.4m
gのアブリジンを18mlの無水エチルアルコールに溶解
し，次に1.8mlのTween−80を添加し，得られた混合物を
0.2ミクロンフィルターで濾過する。次に20.2mlの脂質
内大豆油を上記のアブリジンに無菌で添加する。次い
で，このアジュバントを，ウイルス液もしくは細胞系液
に７〜50％（V/V）で添加する。
くは他のアジュバントと組み合わせて用いられる。2.4m
gのアブリジンを18mlの無水エチルアルコールに溶解
し，次に1.8mlのTween−80を添加し，得られた混合物を
0.2ミクロンフィルターで濾過する。次に20.2mlの脂質
内大豆油を上記のアブリジンに無菌で添加する。次い
で，このアジュバントを，ウイルス液もしくは細胞系液
に７〜50％（V/V）で添加する。
サポニンが,0.01mg〜5mg/投与の量で単独もしくは他
のアジュバントと組み合わせて使用される。サポニン
は,200mg/mlの濃度で調製され，フィルター滅菌され，
次にウイルス液もしくは細胞系液に,0.01〜50％（V/V）
で添加される。
のアジュバントと組み合わせて使用される。サポニン
は,200mg/mlの濃度で調製され，フィルター滅菌され，
次にウイルス液もしくは細胞系液に,0.01〜50％（V/V）
で添加される。
0.01〜5mg/投与のリン酸アルミニウムまたは0.5〜20m
g/投与の水酸化アルミニウムも，単独もしくは他のアジ
ュバントと組み合わせて用いられる。
g/投与の水酸化アルミニウムも，単独もしくは他のアジ
ュバントと組み合わせて用いられる。
細胞とウイルスの増殖培地 ワクチン製造時に，細胞を，ビタミン類，非必須アミ
ノ酸，ピルビン酸ナトリウム，重炭酸ナトリウムおよび
Ｌ−グルタミンを補充した最小必須培地（MEM）中で増
殖させた。30μg/mlのゲンタマイシンを，上記培地に，
防腐剤として添加し，ウシ血清を，細胞増殖のために10
％まで，維持培地として１％まで添加した。
ノ酸，ピルビン酸ナトリウム，重炭酸ナトリウムおよび
Ｌ−グルタミンを補充した最小必須培地（MEM）中で増
殖させた。30μg/mlのゲンタマイシンを，上記培地に，
防腐剤として添加し，ウシ血清を，細胞増殖のために10
％まで，維持培地として１％まで添加した。
実施例６ ネコによる試験：ワクチンの効力 予防接種されたネコに対する病毒性FIPVの攻撃の効果
を観察することによって，効力もしくは免疫防御性を評
価しうる。免疫化させたネコの免疫状態評価する際に，
血清中のサブユニット特異的抗体もしくは中和抗体の力
価を決定することはほとんど価値がない。従来，特異的
抗体の力価と，防御性との間には相関がなかった。実際
に，（中和性もしくは非中和性の）高力価のFIPV特異的
抗体をもったネコは，一般にウイルスの攻撃により病気
にかかりやすくなったり，疾病に敏感になり病状が悪化
しやすい。しかし、免疫化したネコの血清学的プロフィ
ルを得ることは，特にFIPV I型FIPV II型間の交差防御
性を評価する際に有用である。ネコにワクチンの試験を
実施する方法は次のとおりである。
を観察することによって，効力もしくは免疫防御性を評
価しうる。免疫化させたネコの免疫状態評価する際に，
血清中のサブユニット特異的抗体もしくは中和抗体の力
価を決定することはほとんど価値がない。従来，特異的
抗体の力価と，防御性との間には相関がなかった。実際
に，（中和性もしくは非中和性の）高力価のFIPV特異的
抗体をもったネコは，一般にウイルスの攻撃により病気
にかかりやすくなったり，疾病に敏感になり病状が悪化
しやすい。しかし、免疫化したネコの血清学的プロフィ
ルを得ることは，特にFIPV I型FIPV II型間の交差防御
性を評価する際に有用である。ネコにワクチンの試験を
実施する方法は次のとおりである。
ネコは,3週間の間隔をあけて０日目と21日前に候補の
ワクチンを1ml投与量ずつ２回予防接種される。不活性
化ワクチンの場合，アジュバントが，各投与量の10〜50
％を占める。不活性化ワクチンは筋肉内に投与される。
生ワクチンは，乱切法，筋肉内法などで投与される。予
防接種されたネコと対照のネコは,35日目に，経口／鼻
腔内ルートで,1:10,000に希釈されたFTPV79−1146の5ml
で攻撃され，熱と腹水について監視される。35日目の攻
撃された日から，研究が終わるまで，ネコは，ネコどう
しが接触しないように別々のかごにいれてある。ネコ
は,0,7,14,21,28,35,42,49,50,70,77,84,91,105および1
12日目に,I型とII型に対するIFA,I型とII型に対するSN,
ならびに抗FIPVサブユニット（タンパク，またはワクチ
ンの組合せによる）の抗体の測定用に採血した。生き残
った被検体に対する，第２の攻撃は，第１の攻撃をして
から５〜６週間後に行った。
ワクチンを1ml投与量ずつ２回予防接種される。不活性
化ワクチンの場合，アジュバントが，各投与量の10〜50
％を占める。不活性化ワクチンは筋肉内に投与される。
生ワクチンは，乱切法，筋肉内法などで投与される。予
防接種されたネコと対照のネコは,35日目に，経口／鼻
腔内ルートで,1:10,000に希釈されたFTPV79−1146の5ml
で攻撃され，熱と腹水について監視される。35日目の攻
撃された日から，研究が終わるまで，ネコは，ネコどう
しが接触しないように別々のかごにいれてある。ネコ
は,0,7,14,21,28,35,42,49,50,70,77,84,91,105および1
12日目に,I型とII型に対するIFA,I型とII型に対するSN,
ならびに抗FIPVサブユニット（タンパク，またはワクチ
ンの組合せによる）の抗体の測定用に採血した。生き残
った被検体に対する，第２の攻撃は，第１の攻撃をして
から５〜６週間後に行った。
“FIPVタンパク”という用語は，一般に,N,E1,NS1お
よびNS2から選択された各タンパクを含めて包括的な意
味で用いられる。実施例７と８の診断検定法に上記タン
パクのいずれも用いることができる。
よびNS2から選択された各タンパクを含めて包括的な意
味で用いられる。実施例７と８の診断検定法に上記タン
パクのいずれも用いることができる。
実施例７ 放射線免疫検定法による診断試験 7A.ポリクローナル抗体の調製 実施例５のFIPVタンパクを，標準のタンパク精製法を
用いて精製する。5mgの精製FIPVタンパクを,2段階の工
程でカルボジイミドを用いて，キーホール・リンペット
・ヘモシアニン（KLH）に接合させる。タンパクと5mgの
カルボジイミドとを,1mlの1mM HCl中で,4℃にて15分間
インキュベートする。9mlの1mM NaOH（25℃）を上記混
合物に添加し，次いで5mgのKLHを添加する。反応混合物
を一夜21℃で振盪し，次いで10mM NaH2PO4,150mM NaCl
（pH7.4）に対して２日間透析する。得られたFIPVタン
パク/KLH接合体を,4:6の比率で，完全フロイントアジュ
バントを用いて乳化させ,250μｇのタンパクを,5kgの雄
のダッチベルテッドラビットの，皮下の多数の部位また
は直接鼠蹊部のリンパ節に注射する。これらラビットの
後足に,3週間後，同じ製剤I.M.を注射して追加免疫を行
う。10日後，動物から採血し，抗血清を収集して分析す
る。標準のエンザイム−リンクドイムノソルベントアッ
セイ（ELISA法）（E.Engvall,J.Immunol，109:129（197
2））を用いて，抗タンパクと対照の抗血清とが種々の
抗原に結合する性質を試験する。
用いて精製する。5mgの精製FIPVタンパクを,2段階の工
程でカルボジイミドを用いて，キーホール・リンペット
・ヘモシアニン（KLH）に接合させる。タンパクと5mgの
カルボジイミドとを,1mlの1mM HCl中で,4℃にて15分間
インキュベートする。9mlの1mM NaOH（25℃）を上記混
合物に添加し，次いで5mgのKLHを添加する。反応混合物
を一夜21℃で振盪し，次いで10mM NaH2PO4,150mM NaCl
（pH7.4）に対して２日間透析する。得られたFIPVタン
パク/KLH接合体を,4:6の比率で，完全フロイントアジュ
バントを用いて乳化させ,250μｇのタンパクを,5kgの雄
のダッチベルテッドラビットの，皮下の多数の部位また
は直接鼠蹊部のリンパ節に注射する。これらラビットの
後足に,3週間後，同じ製剤I.M.を注射して追加免疫を行
う。10日後，動物から採血し，抗血清を収集して分析す
る。標準のエンザイム−リンクドイムノソルベントアッ
セイ（ELISA法）（E.Engvall,J.Immunol，109:129（197
2））を用いて，抗タンパクと対照の抗血清とが種々の
抗原に結合する性質を試験する。
7B.放射線免疫検定法 実施例５のFIPVタンパクを，標準の方法を用いて精製
し，標準のプロトコルを用いて下記のようにしてヨウ素
化する。Iodogen（Pierce Chemical Co.＃28666）をク
ロロホルムに溶解して10μg/mlの濃度とし，その160μ
ｌを,12×75のガラス管に入れ，乾燥窒素流下で蒸発さ
せる。60μｌの0.2Mリン酸ナトリウム（pH7.2）を前記
ガラス管に添加する。精製FIPVタンパク（一般に３μ
ｇ）をガラス管に添加して混合する。Na125Ｉの２倍モ
ル過剰量を添加して反応を開始させる。15分間，室温で
インキュベートした後,60μｌの0.1％のメタ重亜硫酸ナ
トリウムと30μｌの0.1mMのヨウ化カリウムを添加して
反応を停止させる。得られた反応混合物を,G−50セファ
デックスカラム（0.1mlの吸着床容積，リン酸緩衝塩水
で平衡化する）に移し入れて，通過数を収集する。TCA
沈澱液カウント数（TCA−precipitable counts）を測定
し，その放射リガンドを−70℃で貯蔵する。
し，標準のプロトコルを用いて下記のようにしてヨウ素
化する。Iodogen（Pierce Chemical Co.＃28666）をク
ロロホルムに溶解して10μg/mlの濃度とし，その160μ
ｌを,12×75のガラス管に入れ，乾燥窒素流下で蒸発さ
せる。60μｌの0.2Mリン酸ナトリウム（pH7.2）を前記
ガラス管に添加する。精製FIPVタンパク（一般に３μ
ｇ）をガラス管に添加して混合する。Na125Ｉの２倍モ
ル過剰量を添加して反応を開始させる。15分間，室温で
インキュベートした後,60μｌの0.1％のメタ重亜硫酸ナ
トリウムと30μｌの0.1mMのヨウ化カリウムを添加して
反応を停止させる。得られた反応混合物を,G−50セファ
デックスカラム（0.1mlの吸着床容積，リン酸緩衝塩水
で平衡化する）に移し入れて，通過数を収集する。TCA
沈澱液カウント数（TCA−precipitable counts）を測定
し，その放射リガンドを−70℃で貯蔵する。
放射線免疫検定法については,FIPVの，精製タンパク
標準品またはネコ由来の白血球溶解物の試料100μｌを
レプリケートガラス管に小分けする。各管に,150cpm/μ
ｌを含むように希釈されたヨウ素化FIPVタンパク（前記
のようにして調製したもの）の300μｌと，前記7A項で
調製し1/3000に希釈されたポリクローナルFIPV抗体100
μｌを添加する。全試薬は,RIA緩衝液（50nMリン酸ナト
リウムpH7.4,5mM塩化ナトリウムおよび2mMアジ化ナトリ
ウム）で希釈される。得られた反応混合物を，一夜室温
でインキュベートする。翌日,RIA緩衝液で1/10に希釈さ
れたヤギ抗ラビットIgG 200μｌを，反応混合物に加
え，一夜室温でインキュベートする。次の日，各管を40
00rpmで30分間遠心分離し，上澄み液を吸引し，得られ
たペレットをガンマーカウンターでカウントした。カウ
ント数の多い試料は，その中心にごく少量のFIPVのタン
パクしか含有していないが，一方，カウント数の少ない
試料はかなりの量のFIPVタンパクを含有している。所望
により，標準曲線を描いて，それを試料中のFIPVの量を
決定するのに用いることができる。
標準品またはネコ由来の白血球溶解物の試料100μｌを
レプリケートガラス管に小分けする。各管に,150cpm/μ
ｌを含むように希釈されたヨウ素化FIPVタンパク（前記
のようにして調製したもの）の300μｌと，前記7A項で
調製し1/3000に希釈されたポリクローナルFIPV抗体100
μｌを添加する。全試薬は,RIA緩衝液（50nMリン酸ナト
リウムpH7.4,5mM塩化ナトリウムおよび2mMアジ化ナトリ
ウム）で希釈される。得られた反応混合物を，一夜室温
でインキュベートする。翌日,RIA緩衝液で1/10に希釈さ
れたヤギ抗ラビットIgG 200μｌを，反応混合物に加
え，一夜室温でインキュベートする。次の日，各管を40
00rpmで30分間遠心分離し，上澄み液を吸引し，得られ
たペレットをガンマーカウンターでカウントした。カウ
ント数の多い試料は，その中心にごく少量のFIPVのタン
パクしか含有していないが，一方，カウント数の少ない
試料はかなりの量のFIPVタンパクを含有している。所望
により，標準曲線を描いて，それを試料中のFIPVの量を
決定するのに用いることができる。
実施例８ ELISA法による診断試験 8A.モノクローナル抗体の調製 実施例５のFIPVタンパクを，標準のタンパク精製法を
用いて精製する。８週齢のBalb/cマウスを，必要に応じ
て接合させ，アジュバントで乳化させた精製FIPVタンパ
クの100μｇを皮下注射および腹腔内注射して免疫化す
る。マウスは，充分な抗血清の力価が達成されるまで,2
〜３週間の間隔で,50μｇのFIPVタンパクとアジュバン
トで追加免疫化を行う。最後の追加免疫を行ってから３
日後，マウスを殺し，脾臓を取出す。その脾臓を,Schne
idermanら，Somatic Cell Genet，5:263〜269（1979）
に記載された，Ca2+と血清を含有しない培地（CSF）中
ですすぎ，単一細胞懸濁液を調製する。得られた懸濁液
を1000×ｇで10分間遠心分離し（Beckman TJ−６），得
られたペレットを,30mlのCSF中で３回洗浄する。
用いて精製する。８週齢のBalb/cマウスを，必要に応じ
て接合させ，アジュバントで乳化させた精製FIPVタンパ
クの100μｇを皮下注射および腹腔内注射して免疫化す
る。マウスは，充分な抗血清の力価が達成されるまで,2
〜３週間の間隔で,50μｇのFIPVタンパクとアジュバン
トで追加免疫化を行う。最後の追加免疫を行ってから３
日後，マウスを殺し，脾臓を取出す。その脾臓を,Schne
idermanら，Somatic Cell Genet，5:263〜269（1979）
に記載された，Ca2+と血清を含有しない培地（CSF）中
ですすぎ，単一細胞懸濁液を調製する。得られた懸濁液
を1000×ｇで10分間遠心分離し（Beckman TJ−６），得
られたペレットを,30mlのCSF中で３回洗浄する。
並行して,2×105細胞数/mlの密度まで増殖させたSP2/
0骨髄腫細胞100mlを,1000×ｇで10分間遠心分離にかけ
て採集する。２×107の全細胞ペレットを30ml CSFで３
回洗浄し，再度ペレット化する。最後に，上記のように
して得た脾臓細胞と,SP2/0骨髄腫細胞を合わせて遠心分
離によってペレット化する。CSF中37％（V/V）の濃度の
ポリエチレングリコール（PEG,MW＝1500,Koch−Light L
aboratories,ハーバーヒル，英国）1mlを，上記の混合
したペレットに,90秒間かけて，融合を促進するため連
続的に攪拌しながら添加する。次に10mlのCSFを徐々に
添加することにより上記のPEGを希釈し，細胞を再ペレ
ット化し,CSF中で洗浄する。得られた細胞のペレットを
HAT選択培地中で再懸濁させる。この培地は,RPMI 1640,
20％ウシ胎児血清，ヒポキサンチン，アミノプテリンお
よびチミジンを含有する（Littlefield,Science，145:7
09（1964）。得られた細胞を,10×96ウエルのマイクロ
タイタープレートにプレートし,7％CO2雰囲気中37℃で
インキュベートした。骨髄腫細胞は,HPRT酵素を欠いて
いるので，脾臓細胞（この酵素を有している）とうまく
融合したSP2/0細胞だけが，前記の選択培地中に生存す
る。細胞には，次の10日間に２回，選択培地が再供給さ
れる。
0骨髄腫細胞100mlを,1000×ｇで10分間遠心分離にかけ
て採集する。２×107の全細胞ペレットを30ml CSFで３
回洗浄し，再度ペレット化する。最後に，上記のように
して得た脾臓細胞と,SP2/0骨髄腫細胞を合わせて遠心分
離によってペレット化する。CSF中37％（V/V）の濃度の
ポリエチレングリコール（PEG,MW＝1500,Koch−Light L
aboratories,ハーバーヒル，英国）1mlを，上記の混合
したペレットに,90秒間かけて，融合を促進するため連
続的に攪拌しながら添加する。次に10mlのCSFを徐々に
添加することにより上記のPEGを希釈し，細胞を再ペレ
ット化し,CSF中で洗浄する。得られた細胞のペレットを
HAT選択培地中で再懸濁させる。この培地は,RPMI 1640,
20％ウシ胎児血清，ヒポキサンチン，アミノプテリンお
よびチミジンを含有する（Littlefield,Science，145:7
09（1964）。得られた細胞を,10×96ウエルのマイクロ
タイタープレートにプレートし,7％CO2雰囲気中37℃で
インキュベートした。骨髄腫細胞は,HPRT酵素を欠いて
いるので，脾臓細胞（この酵素を有している）とうまく
融合したSP2/0細胞だけが，前記の選択培地中に生存す
る。細胞には，次の10日間に２回，選択培地が再供給さ
れる。
培養物が，マイクロタイターウエル表面の75〜100％
を覆う細胞密度に到達した後に，そのハイブリドーマか
らの培地を，固定プレート結合検定法（immobilized pl
ate−binding assay）（R.H.Kennettら編集，Monoclona
l Antibodies（1980）,Plenum Press,ニューヨーク）を
用いて，抗FIPV抗体の存在に対してスクリーニングす
る。50mMの重炭酸ナトリウム（pH8.3）で希釈した精製F
IPVタンパクの１μｇを，フレキシブルマイクロタイタ
ープレートのウエルでインキュベートする。37℃で３時
間インキュベートした後，ウエルを洗浄し，γグロブロ
リンを含有しない20％のウマ血清を添加して，非特異的
タンパク結合部位をふさぐ。ハイブリドーマを含有する
ウエルからの培地を加え，そのウエルを37℃で２時間イ
ンキュベートし，特異的な抗FIPV抗体と結合させる。そ
のウエルを再度洗浄した後，そのウエル中で125Ｉヒツ
ジ抗マウスIgGを37℃で２時間インキュベートすること
によって，特異的に結合したモノクローナル抗体を検出
する。洗浄したウエルをプレートから切取り，結合した
放射能をカウントする。対照の結合量の３倍もしくはそ
れを越える比率を陽性とみなす。ハイブリドーマが分泌
するFIPV特異的抗体をサブクローン化し，プロテインＡ
セファロースによって，分泌されたモノクローナル抗体
の生産と精製のために増殖させる。
を覆う細胞密度に到達した後に，そのハイブリドーマか
らの培地を，固定プレート結合検定法（immobilized pl
ate−binding assay）（R.H.Kennettら編集，Monoclona
l Antibodies（1980）,Plenum Press,ニューヨーク）を
用いて，抗FIPV抗体の存在に対してスクリーニングす
る。50mMの重炭酸ナトリウム（pH8.3）で希釈した精製F
IPVタンパクの１μｇを，フレキシブルマイクロタイタ
ープレートのウエルでインキュベートする。37℃で３時
間インキュベートした後，ウエルを洗浄し，γグロブロ
リンを含有しない20％のウマ血清を添加して，非特異的
タンパク結合部位をふさぐ。ハイブリドーマを含有する
ウエルからの培地を加え，そのウエルを37℃で２時間イ
ンキュベートし，特異的な抗FIPV抗体と結合させる。そ
のウエルを再度洗浄した後，そのウエル中で125Ｉヒツ
ジ抗マウスIgGを37℃で２時間インキュベートすること
によって，特異的に結合したモノクローナル抗体を検出
する。洗浄したウエルをプレートから切取り，結合した
放射能をカウントする。対照の結合量の３倍もしくはそ
れを越える比率を陽性とみなす。ハイブリドーマが分泌
するFIPV特異的抗体をサブクローン化し，プロテインＡ
セファロースによって，分泌されたモノクローナル抗体
の生産と精製のために増殖させる。
8B.ELISA法による検定 上記8A項で調製したモノクローナル抗体を10μg/ml含
有する50mM重炭酸ナトリウム溶液（pH8.3）の100μｌづ
つで,96ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルを
被覆する。37℃で90分間，または４℃で18時間インキュ
ベートを行い，ウエルを緩衝液Ａ（この緩衝液Ａは,1％
卵アルブミンと0.1％トウィーン20を含有するリン酸緩
衝塩水である）で４回洗浄する。ネコの白血球の溶解物
（1:10に希釈）もしくは精製FIPVタンパクの標準品を90
〜95μｌの緩衝液Ａに添加し，前記ウエルを，この混合
物とともに室温で90分間インキュベートする。ウエルを
緩衝液Ａで再度４回洗浄し，上記実施例7Aで調製したラ
ビット抗FIPVの緩衝液Ａで1/5000に希釈した希釈液100
μｌで処理する。室温で90分間保持した後，各ウエルを
緩衝液Ａで再度４回洗浄する。この洗浄後，ヤギ抗ラビ
ットIgGペルオキシダーゼ接合体（Coppel Laboratorie
s）の緩衝液Ａによる1/3000希釈液100μｌを各ウエルに
添加し，そのプレートを上記のようにしてインキュベー
トして洗浄する。200μｌの基質（ｏ−フェニレンジア
ミン＋H2O2含有のクエン酸リン酸緩衝液,pH5）を各ウエ
ルに加えて，結合した抗体を検出する。30分後,50μｌ
の4N硫酸を添加して呈色反応を停止させる。490nm波長
光の吸光度をELISA読取り装置で読取る。溶解物中のFIP
Vタンパクの濃度は，標準曲線と比較して決定する。
有する50mM重炭酸ナトリウム溶液（pH8.3）の100μｌづ
つで,96ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルを
被覆する。37℃で90分間，または４℃で18時間インキュ
ベートを行い，ウエルを緩衝液Ａ（この緩衝液Ａは,1％
卵アルブミンと0.1％トウィーン20を含有するリン酸緩
衝塩水である）で４回洗浄する。ネコの白血球の溶解物
（1:10に希釈）もしくは精製FIPVタンパクの標準品を90
〜95μｌの緩衝液Ａに添加し，前記ウエルを，この混合
物とともに室温で90分間インキュベートする。ウエルを
緩衝液Ａで再度４回洗浄し，上記実施例7Aで調製したラ
ビット抗FIPVの緩衝液Ａで1/5000に希釈した希釈液100
μｌで処理する。室温で90分間保持した後，各ウエルを
緩衝液Ａで再度４回洗浄する。この洗浄後，ヤギ抗ラビ
ットIgGペルオキシダーゼ接合体（Coppel Laboratorie
s）の緩衝液Ａによる1/3000希釈液100μｌを各ウエルに
添加し，そのプレートを上記のようにしてインキュベー
トして洗浄する。200μｌの基質（ｏ−フェニレンジア
ミン＋H2O2含有のクエン酸リン酸緩衝液,pH5）を各ウエ
ルに加えて，結合した抗体を検出する。30分後,50μｌ
の4N硫酸を添加して呈色反応を停止させる。490nm波長
光の吸光度をELISA読取り装置で読取る。溶解物中のFIP
Vタンパクの濃度は，標準曲線と比較して決定する。
本発明の実施する上記態様を変更したもので，免疫
学，組換えDNA技術および／または獣医学の分野の当業
者にとって自明なものは，上記の特許請求の範囲に含ま
れるものとする。
学，組換えDNA技術および／または獣医学の分野の当業
者にとって自明なものは，上記の特許請求の範囲に含ま
れるものとする。
（発明の要約） 本発明は，ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（FIPV）に対す
る動物の曝露あるいはFIPVに対する感受性を診断するた
めに有用な手段を提供する。この診断手段は，構造FIPV
タンパク及び非構造FIPVタンパクをコードする核酸配列
と,FIPVタンパクに対して生成される抗体とを包含す
る。FIPVタンパクはサブユニットワクチンとしても有用
である。
る動物の曝露あるいはFIPVに対する感受性を診断するた
めに有用な手段を提供する。この診断手段は，構造FIPV
タンパク及び非構造FIPVタンパクをコードする核酸配列
と,FIPVタンパクに対して生成される抗体とを包含す
る。FIPVタンパクはサブユニットワクチンとしても有用
である。
第１図は,NS2,E1,NおよびNS1の各ペプチドのヌクレオチ
ドの配列と推定アミノ酸の配列を示す図である。各種の
タンパクをコードする遺伝子の特異的DNA配列は次のと
おりである。NS2＝641〜853ヌクレオチド;E1＝1954〜27
39ヌクレオチド;N＝2755〜3885ヌクレオチド；およびNS
1＝3893〜4195ヌクレオチドである。 第２図は，共挿入ベクターであるpSC11とpUV1を表わす
図である。
ドの配列と推定アミノ酸の配列を示す図である。各種の
タンパクをコードする遺伝子の特異的DNA配列は次のと
おりである。NS2＝641〜853ヌクレオチド;E1＝1954〜27
39ヌクレオチド;N＝2755〜3885ヌクレオチド；およびNS
1＝3893〜4195ヌクレオチドである。 第２図は，共挿入ベクターであるpSC11とpUV1を表わす
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 ビバリー デイル アメリカ合衆国 カリフォルニア 94087 サニーベイル，ケネウィック ドライブ 1507 (72)発明者 マイルス ヤマナカ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94086 サニーベイル，ナンバー 417 イースト フレモント アベニュー 880 (72)発明者 ウィリアム エヌ．アクリー アメリカ合衆国 アイオワ 50501 ノ ース フォート ダッジ，フィフス ア ベニュー 1218 (72)発明者 ロイド ジー．シャベ ジュニア アメリカ合衆国 アイオワ 50501 ノ ース フォート ダッジ，テンス アベ ニュー 1302 (56)参考文献 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，1988，Ｖｏｌ. 167，Ｎｏ．２，ｐ370−376 Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．1987，Ｖｏ ｌ．68，Ｎｏ．４，ｐ995−1002 Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，1987，Ｖｏｌ. 69，Ｎｏ．６／７，ｐ591−600 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 7/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ
Claims (14)
- 【請求項１】ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（FIPV）感染に
よって引き起こされる疾患に対するネコの防御のための
ワクチンであって、該ワクチンは、有効量の免疫原およ
び非毒性の担体または希釈剤を含み、該免疫原は、 （ａ）組換え産生されたFIPVのE1タンパク質もしくはＮ
タンパク質、または該E1およびＮタンパク質の組合せ、
あるいは （ｂ）FIPVのE1もしくはＮタンパク質、または両方をコ
ードするヌクレオチド配列であって、その発現のための
制御配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含
むウイルス粒子、 である、ワクチン。 - 【請求項２】前記免疫原が、組換え産生されたFIPVのE1
タンパク質もしくはＮタンパク質、または該E1およびＮ
タンパク質の組合せである、請求項１に記載のワクチ
ン。 - 【請求項３】前記免疫原が、FIPVのE1もしくはＮタンパ
ク質、または両方をコードするヌクレオチド配列を含む
ウイルス粒子であって、ここで該ヌクレオチド配列は、
その発現のための制御配列に作動可能に連結されてい
る、請求項１に記載のワクチン。 - 【請求項４】前記組換え産生されたタンパク質が、昆虫
細胞中でバキュロウイルス発現ベクターから調製され
る、請求項２に記載のワクチン。 - 【請求項５】前記制御配列が、異種ウイルスプロモータ
ーを含む、請求項３に記載のワクチン。 - 【請求項６】アジュバントをさらに含む、請求項１〜５
のいずれかに記載のワクチン。 - 【請求項７】請求項１に記載のワクチンの産生のために
有用な組成物であって、該組成物は、FIPVのE1タンパク
質もしくはＮタンパク質、または両方をコードするヌク
レオチド配列であって、その発現のための制御配列に作
動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現系を含
有する核酸分子を含む、組成物。 - 【請求項８】前記E1タンパク質が、図１に示されるアミ
ノ酸配列を有するか、または前記Ｎタンパク質が、図１
に示されるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の組
成物。 - 【請求項９】前記E1タンパク質が、図１に示されるアミ
ノ酸配列を有し、かつ前記Ｎタンパク質が、図１に示さ
れるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の組成物。 - 【請求項１０】前記制御配列が、ヒトMT−IIプロモータ
ー、ヒトβアクチンプロモーター、ワクシニア由来プロ
モーター、およバキュロウイルスプロモーターからなる
群より選択されるプロモーターを含む、請求項７〜９の
いずれかに記載の組成物。 - 【請求項１１】請求項７〜10のいずれかに記載の発現系
を含むように改変された、組換え宿主細胞。 - 【請求項１２】請求項７〜10のいずれかに記載の発現系
を含む、組換え体ウイルス粒子。 - 【請求項１３】請求項７〜10のいずれかに記載の発現系
を含む、組換えベクター。 - 【請求項１４】FIPVのE1もしくはＮタンパク質、または
両方を産生する方法であって、該方法は、該タンパク質
の産生のために適切な条件下で、請求項11に記載の細胞
を培養する工程を包含する、方法。
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