DE69332375T2

DE69332375T2 - Hundecoronavirus s gen und verwendung davon

Info

Publication number: DE69332375T2
Application number: DE69332375T
Authority: DE
Inventors: V Jones; Sharon Klepfer; J Miller; Paul Reed
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1992-05-08
Filing date: 1993-05-07
Publication date: 2003-02-13
Anticipated expiration: 2013-05-08
Also published as: ATE225805T1; PT640098E; CA2135200C; AU670092B2; JP3245169B2; JPH07508421A; WO1993023423A1; DK0640098T3; EP0640098A4; EP0640098A1; CA2135200A1; AU4251593A; EP0640098B1; DE69332375D1; ES2182827T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Hundecorona- Virusinfektionen und genauer Proteine, die zur Prophylaxe, Therapie und Diagnose dieser Infektionen bei Hunden geeignet sind.

Hintergrund der Erfindung

Die Coronaviren sind eine große Familie von Säugetier- und Vogelpathogenen, die zuerst 1968 beschrieben wurden. Sie sind das verursachende Prinzip mehrerer Krankheiten einschließlich Enzephalitis, Hepatitis, Peritonitis und Gastroenteritis. Enterische Coronaviren wurden im Fäzes von Menschen, Schweinen, Kälbern, Katzen, Mäusen, Hühnern und Hunden nachgewiesen.
Hundecoronavirus-(CCV)-enteritis wurde zuerst isoliert bei Hunden, die unter Einer akuten Gastroenteritis litten, wie von Binn et al. in Proc. 78th Ann. Mtg. U.S. Animal Health Assoc., Roanoke VA, Seiten 359-366 (1974) berichtet. Die Krankheit wurde während der 70er Jahre vorherrschend. CCV- Gastroenteritis scheint hauptsächlich durch Fäkalkontamination von infizierten Hunden über den oralen Weg übertragen zu werden, was schließlich zur Replikation des Virus in den Epithelzellen des Dünndarms führt. Das Virus kann aus dem Fäzes eines infizierten Hundes 3 bis 14 Tage nach der Infektion gewonnen werden.
CCV-Gastroenteritis ist charakterisiert durch eine milde Depression, Anorexie und weichen Stuhl, wovon sich die Hunde gewöhnlich erholen. Das Einsetzen der Krankheit ist oft plötzlich und wird begleitet von Symptomen wie Diarrhö, Erbrechen, im Stuhl ausgeschiedenem Blut und Dehydratisierung. Manchmal trat der Tod nur 24 bis 36 Stunden nach Einsetzen der klinischen Zeichen ein. Die meisten Hunde schienen ohne Fieber zu sein, aber eine erhöhte Körpertemperatur wurde in einigen Fällen beobachtet. Oft tritt CCV mit einer Hundeparvovirusinfektion auf und diese Coinfektion kann fatal sein.
Serologisch ist die Krankheit eng verwandt mit dem übertragbaren Gastroenteritisvirus Von Schweinen (TGEV). Obwohl Hundecoronavirus Schweine nicht infiziert, erzeugt das übertragbare Gastroenteritisvirus eine subklinische Infektion bei Hunden. Anders als bei dem infektiösen Peritonitis-Coronavirus (FIPV) von Katzen prädisponiert ein vorheriger Kontakt mit CCV Hunde nicht für einen verbesserten Krankheitsverlauf und Antigen-Antikörperkomplexe sind, falls gebildet, nicht mit der Krankheitspathologie verbunden.
Ein Hunde-CCV-Impfstoff mit CCV-Präplomerprotein wird in US 4 904 468 offenbart.
Es besteht weiterhin ein Bedürfnis im Stand der Technik nach Zusammensetzungen, die zur Diagnose, Behandlung und Verhütung von Infektionen mit Hundecoronaviren geeignet sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einem Aspekt liefert die Erfindung die vollständige Nucleotidsequenz des CCV-S-Gens, Stamm 1-71, SEQ ID Nr. 1. Das S-Gen kann für diagnostische Zusammensetzungen für CCV- Infektion nützlich sein.
Gemäß einem anderen Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein CCV-S-(oder Spike)-Protein, das durch die Aminosäuresequenz eines CCV-S-Proteins, Stamm 1-71, SEQ ID Nr. 2, gekennzeichnet ist. Diese Proteine können gegebenenfalls mit anderen Fusionsproteinen oder Molekülen fusioniert oder verbunden sein.
Somit liefert gemäß einem weiteren Aspekt die vorliegende Erfindung eine Impfstoffzusammensetzung, die eine wirksame immunogene Menge mindestens eines CCV-S-Proteins, Stamm 1-71, enthält.
Gemäß einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Impfung eines Tiers gegen eine Infektion mit einem Coronavirus, indem eine wirksame Menge einer Impfstoffzusammensetzung der Erfindung verabreicht wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer CCV-Infektion, die eine therapeutisch wirksame Menge eines CCV-S-Proteins der Erfindung und einen pharmazeutisch wirksamen Träger umfasst.
Gemäß einem anderen Aspekt umfasst ein diagnostisches Reagenz der vorliegenden Erfindung ein CCV-S-Protein, Stamm 1-71. Gemäß einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein diagnostisches Reagenz, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein CCV-S-Protein, Stamm 1-71, codiert, und/oder eine Nucleotidsequenz, die die codierende Region flankiert. Diese Protein- und Nucleotidsequenzen sind gegebenenfalls mit nachweisbaren Markierungen verbunden. Solche diagnostischen Reagenzien können verwendet werden, um die Gegenwart von CCV bei Hunden nachzuweisen unter Verwendung von Standardtestformaten und können Komponenten eines Diagnosekits bilden.
Gemäß einem weiteren. Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Verwendung eines diagnostischen Reagenzes der Erfindung, um Hunde zu identifizieren, die nicht infiziert sind oder die vorher CCV ausgesetzt waren. Das diagnostische Verfahren kann Kontakt mit CCV von einem Kontakt mit anderen verwandten Coronaviren unterscheiden, was die Identifizierung von Hunden zulässt, die gegen diese Krankheiten geimpft wurden und zwischen verschiedenen Stämmen von CCV unterscheiden lässt oder es zulässt, Hunde aufzufinden mit fortgeschrittenen Stadien einer CCV-Infektion.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten CCV-S-Proteins, Stamm 1-71, das umfasst, dass eine ausgewählte Wirtszelle, z. B. eine Säugetierzelle oder ein Virenvektor, der/die mit einer DNA-Sequenz, die ein ausgewähltes CCV-S-Protein, Stamm 1-71, codiert, in operativer Verbindung mit regulatorischen Sequenzen, die die Expression des Proteins steuern können, transformiert ist, gezüchtet wird.
Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in der folgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen näher erläutert.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert neue isolierte Hundecoronavirus-(CCV)-S-Proteine, Stamm 1-71, ebenso wie isolierte Nucleotidsequenzen, die die Proteine codieren. Diese Proteine sind nützlich für diagnostische, Impf- und therapeutische Zusammensetzungen ebenso wie für Methoden zur Verwendung dieser Zusammensetzungen in der Diagnose, Prophylaxe und Behandlung von CCV-verwandten und anderen mit Coronavirus in Beziehung stehenden Zuständen.

I. Definitionen

Ein Aminosäurefragment, wie es hier definiert ist, ist irgendeine Aminosäuresequenz aus mindestens etwa 8 Aminosäuren bis etwa zur vollen Länge des CCV-S-Genproteins. Ein Nucleotidfragment definiert eine Nucleotidsequenz, die mindestens etwa 8 Aminosäure bis zu etwa der vollen Länge des CCV-S- Genproteins codiert.
Der Ausdruck "Region" bezieht sich auf das gesamte Gen oder Protein oder einen Teil davon, das/der ein oder mehrere Fragmente, wie oben definiert, enthalten kann.
Der Ausdruck "immunogen" bezieht sich auf irgendein S- Genprotein oder Fragment davon, irgendein Molekül, Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Virus, Region oder Teil davon, die eine schützende Immunantwort bei einem Wirt, z. B. einem Tier, dem sie zugeführt wurden, hervorrufen können.
Der Ausdruck "antigen" bezieht sich nur auf die Fähigkeit eines Moleküls, Proteins, Peptids, Kohlenhydrats, Virus, einer Region oder eines Teils davon, die Antikörperbildung in einem Wirt (nicht notwendigerweise schützend) hervorzurufen.
Der Ausdruck "Epitop", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Region eines Proteins, die an der Immunogenizität beteiligt ist und kann Regionen einschließen, die B-Zell- und/oder T-Zellantworten induzieren.
Der Ausdruck "B-Zellort oder T-Zellort", wie er hier verwendet wird, definiert eine Region des Proteins, die eine Stelle für die B-Zell- oder T-Zellbindung ist. Bevorzugt bezieht sich dieser Ausdruck auf Stellen bzw. Orte, die an der Immunogenizität des Proteins beteiligt sind.

II. Quellen für CCV-Sequenzen

Die Beispiele unten beziehen sich insbesondere auf neu identifizierte Spike-Gen-Sequenzen aus Hundecoronavirus (CCV), Stamm 1-71. Dieser Stamm wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, unter der Hinterlegungsnummer VR-809 hinterlegt. Insbesondere werden die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 bzw. 2 des CCV-S-Gens offenbart.
Um das Verständnis der Nacharbeitbarkeit der Erfindung zu erleichtern, enthält die Beschreibung Bezugnahmen auf Nucleotidfragmente und Peptidfragmente des CCV-S-Proteins und seiner Nucleotidsequenz. Die Nucleotid- und Peptidfragmente sind nicht Teil der beanspruchten Erfindung.

III. CCV-Nucleotid- und Aminosäuresequenzen der Erfindung

Die Erfinder haben Nucleotid- und Proteinsequenzen von CCV Stamm 1-71 identifiziert und ausgewählt, von denen bestimmt wurde, dass sie von Interesse sind zur Verwendung als Impf-, Therapie- und/oder Diagnosezusammensetzungen. Z. B. sind ausgewählte Peptid- und. Nucleotidsequenzen, die hauptsächlich in der variablen N-terminalen Region des CCV-S-Proteins und -gens vorhanden sind, dadurch gekennzeichnet, dass sie Bereiche der Homologie zwischen FIPV, TGEV, Katzenenterocoronavirus (FECV) und anderen Coronavirenstämmen darstellen.
Peptidfragmente, die aus diesem heterogenen N-Ende des S- Proteins erhalten werden, sind nützliche Fragmente für diagnostische Zusammensetzungen und Kits zur Unterscheidung zwischen Infektionen mit CCV Stamm 1-71 von anderen CCV- Infektionen und zur Unterscheidung zwischen einer Infektion mit CCV und anderen Coronaviren, die oben identifiziert wurden, bei einem geimpften oder infizierten Hund, ebenso wie zur Verwendung für Impfmittel und therapeutische Mittel.
Zusätzlich schließen die Amino-terminalen Sequenzen von CCV- S-Protein Peptidsequenzen ein, die B-Zellorte sind und daher nützlich sind für Impfzusammensetzungen oder therapeutische Zusammensetzungen oder zur Erzeugung von Antikörpern gegen CCV, in Tests für den Nachweis von CCV-Antikörpern bei Hunden.
Außerdem wird angenommen, dass bestimmte Fragmente des CCV-S- Proteins T-Zellorte darstellen und daher nützlich sind für Impfzusammensetzungen oder therapeutische Zusammensetzungen.
Andere geeignete CCV-Aminosäureregionen für pharmazeutische oder diagnostische Verwendung sind in anderen Regionen des CCV-S-Proteins SEQ ID Nr. 2 angeordnet. Diese Aminosäure- und Nucleotidfragmente des CCV-S-Proteins und seiner Nucleotidsequenz, die oben diskutiert wurden, werden spezifisch unten in den Tabellen I und II angegeben. Tabelle II berichtet auch über die jeweiligen Homologien von bestimmten dieser gewünschten Fragmente mit Wildtyp FIPV, d. h. FIPV WSU 1146. Die CCV-S-Nucleotidfragmente in den Tabellen I und II können nützlich sein für diagnostische Sonden, PCR-Primer oder zur Verwendung für die rekombinante Erzeugung relevanter S- Proteinfragmente zur Verwendung in therapeutischen oder Impfstoffzusammensetzungen. Andere geeignete Fragmente können auch für diese Verwendung aufgefunden werden. Tabelle I CCV-Aminosäuren Tabelle II Aminosäuresequenzen

IV. Modifizierte Sequenzen der Erfindung

Zusätzlich zu den Aminosäuresequenzen und den entsprechenden Nucleotidsequenzen der spezifisch angegebenen Ausführungsformen der CCV-S-Proteine der Erfindung sind allelische Variationen (natürlich vorkommende Basenveränderungen in der Population einer Art, die zu einer Aminosäureänderung führen können oder nicht) von DNA-Sequenzen, die das S-Protein codieren, auch in der vorliegenden Erfindung enthalten. In ähnlicher Weise sind DNA-Sequenzen, die Proteinsequenzen der Erfindung codieren, sich aber in der Kodonsequenz unterscheiden aufgrund des degenerativen genetischen Codes oder von Variationen in der DNA-Sequenz, die diese Proteine codieren, die durch Punktmutationen verursacht werden oder durch induzierte Modifikationen, um die Aktivität, Halbwertzeit oder Produktion des codierten Peptids zu verbessern, auch von der Erfindung umfasst.
Variationen in den Aminosäuresequenzen der Erfindung können typischerweise Analoga enthalten, die sich nur um etwa 1 bis etwa 4 Kodonänderungen unterscheiden. Andere Beispiele für Analoga schließen Proteine ein mit kleineren Aminosäurevariationen gegenüber der natürlichen Aminosäuresequenz des S-Gen- Proteins und/oder des Fusionspartners; insbesondere konservative Aminosäureaustausche. Konservative Austausche sind solche, die innerhalb einer Familie von Aminosäuren stattfinden, die verwandte Seitenketten haben. Genetisch codierte Aminosäuren werden allgemein in vier Familien aufgeteilt: (1) sauer = Aspartat, Glutamat; (2) basisch = Lysin, Arginin, Histidin; (3) unpolar = Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan und (4) ungeladen polar = Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystein, Serin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden manchmal zusammen als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Es ist z. B. vernünftig davon auszugehen, dass ein isolierter Ersatz eines Leucins durch ein Isoleucin oder Valin, eines Aspartats durch ein Glutamat, eines Threonins durch ein Serin oder ein ähnlich konservativer Austausch einer Aminosäure durch eine strukturell verwandte Aminosäure keine signifikante Wirkung auf ihre Aktivität haben wird, insbesondere wenn der Austausch nicht eine Aminosäure am Epitop der Polypeptide der Erfindung betrifft.

V. Fusionsproteine

Falls erwünscht, können die CCV-S-Proteine und Peptidfragmente, z. B. solche, die in den Tabellen I und II angegeben sind, in Form von Fusionsproteinen, wie unten definiert, erzeugt werden. Fusionsproteine, die Peptidfragmente enthalten, sind nicht Teil der beanspruchten Erfindung. Ein solches Fusionsprotein kann entweder CCV-S-Protein in voller Länge oder ein immunogenes Fragment davon enthalten. Geeignete Fragmente schließen solche ein, die in SEQ ID Nr. 2 enthalten sind und Aminosäurefragmente der Tabellen I und II. Andere geeignete Fragmente können von einem Fachmann auf diesem Gebiet durch Analogie der hier angegebenen Sequenzen bestimmt werden.
Proteine oder Peptide können so ausgewählt werden, dass die Fusionsproteine mit der ausgewählten S-Protein- oder Peptidsequenz bilden aufgrund einer Anzahl von Überlegungen. Der Fusionspartner kann eine bevorzugte Signalsequenz sein, eine Sequenz, die durch eine verbesserte Sekretion in einem ausgewählten Wirtszellsystem gekennzeichnet ist, oder eine Sequenz, die die Stabilität oder Präsentation des von S- abgeleiteten Peptids verbessert. Solche beispielhaften Fusionspartner schließen, ohne Beschränkung, Ubiquitin und α- Mating-Factor für die Hefeexpressionssysteme und β-Galactosidase und Influenza-NS-1-Protein für bakterielle Systeme ein. Der Fachmann auf diesem Gebiet kann leicht einen geeigneten Fusionspartner für ein ausgewähltes Expressionssystem auswählen. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung irgendeines speziellen Fusionspartners beschränkt.
Das CCV-S-Protein oder Fragmente davon können gegebenenfalls miteinander oder dem Fusionspartner über eine konventionelle Linkersequenz fusioniert werden, d. h. eine Sequenz, die etwa 2 bis 50 Aminosäuren und bevorzugter etwa 2 bis etwa 20 Aminosäuren enthält. Dieser fakultative Linker kann einen Raum zwischen den beiden verbundenen Sequenzen schaffen. Alternativ kann diese Linkersequenz, falls erwünscht, ein Polypeptid codieren, das selektiv durch konventionelle chemische oder enzymatische Methoden abspaltbar oder verdaubar ist. Z. B. kann die ausgewählte Spaltstelle eine enzymatische Spaltstelle sein, was Stellen zur Spaltung durch ein proteolytisches Enzym, wie Enterokinase, Faktor Xa, Trypsin, Kollagenase und Thrombin einschließt. Alternativ kann die Spaltstelle in dem Linker eine Stelle sein, die durch Kontakt mit einer ausgewählten Chemikalie, z. B. Bromcyan oder Hydroxylamin, gespalten wird. Die Spaltstelle, falls sie in einen Linker eingesetzt wird, der geeignet ist für fusionierte Sequenzen der Erfindung, beschränkt die Erfindung nicht. Jede gewünschte Spaltstelle, von denen viele im Stand der Technik bekannt sind, kann für diesen Zweck verwendet werden.

VI. Herstellung von Sequenzen der Erfindung

Das CCV-S-Genprotein der Erfindung und Aminosäureregionen, Fragmente davon und deren entsprechende Nucleotidsequenzen ebenso wie andere hier beschriebene Proteine, z. B. Fusionspartner, können mit konventionellen Methoden erzeugt werden. Diese Proteine oder Fragmente und die Nucleotidsequenzen können mit chemischen Synthesetechniken [Merrifield, J.A.C.S., 85: 2149-2154 (1963)] hergestellt werden. Bevorzugt werden sie jedoch mit bekannten rekombinanten DNA-Techniken durch Klonierung und Expression in einem Wirtsorganismus oder einer Zelle eines DNA-Fragments, das eine codierende Sequenz für das ausgewählte Protein trägt, hergestellt werden. Siehe z. B. Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989). Solche Techniken werden unten in den Beispielen diskutiert.
Mit den Klonierungstechniken kann ein ausgewähltes Genfragment in einen ausgewählten Expressionsvektor kloniert werden. Vektoren zur Verwendung für die Methode zur Erzeugung von S- Proteinen umfasst eine neue S-Gen-DNA-Sequenz der Erfindung und ausgewählte regulatorische Sequenzen in operativer Verbindung mit der codierenden DNA-Sequenz und ist geeignet, die Replikation und Expression des Peptids in einer ausgewählten Wirtszelle zu steuern.
Vektoren, z. B. Polynucleotidmoleküle, können für die Expression von CCV-S-Proteinen und/oder Fusionsproteinen in Bakterien-, Säugetier-, Pilz- oder Insektenzellen oder in ausgewählten Viren entwickelt werden. Geeignete Vektoren sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt unter Bezugnahme auf bekannte Veröffentlichungen oder Lieferanten.
Die entsprechenden DNA-Moleküle oder Vektoren, die Nucleotidsequenzen, die Hundecoronavirus-S-Peptide oder Fragmente davon codieren und/oder Fusionsproteine codieren, enthalten, werden dann in die Wirtszellen eingeführt und die Expression des heterologen Proteins induziert.
Zusätzlich können Expressionssysteme die bekannten Virenexpressionssysteme, z. B. Vaccinia, Windpocken, Schweinepacken enthalten. Es versteht sich außerdem, dass der Aufbau des Expressionsvektors von der Auswahl der Wirtszelle abhängt. Eine Vielzahl geeigneter Expressionssysteme für jeden der unten bezeichneten Wirtszellen sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt und können leicht ohne übermäßige Anstrengung ausgewählt werden.
Geeignete Zellen oder Zelllinien zur Verwendung zur Expression des S-Proteins oder von Peptiden der Erfindung können eukaryotisch oder prokaryotisch sein. Ein bevorzugtes Expressionsystem schließt Säugetierzellen, wie Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-1-Zellen ein. Die Auswahl anderer geeigneter Säugetierwirtszellen und Methoden zur Transformation, Kultur, Amplifikation, zum Screenen und zur Produktherstellung und Reinigung sind im Stand der Technik bekannt. Siehe z. B. Gething and Sambrook, Nature, 293: 620-625 (1981) oder alternativ Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 5(7): 1750-1759 (1985) oder Howley et al., U.S.-Patent Nr. 4 419 446. Wünschenswert sind auch Insektenzellsysteme, wie Baculovirus- oder Drosophilasysteme. Die Auswahl von anderen geeigneten Wirtszellen und Methoden der Transformation, Kultur, Amplifikation, des Screenens, der Produktherstellung und Reinigung können von einem Fachmann auf diesem Gebiet unter Bezugnahme auf bekannte Techniken durchgeführt werden. Siehe z. B. Gething and Sambrook, Nature, 293: 620-625 (1981)
Nachdem die transformierten Wirtszellen in üblicher Weise über geeignete Zeiträume und unter geeigneten Kulturbedingungen, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, gezüchtet wurden, können die Zellen lysiert werden. Es kann möglich sein, abhängig von dem angewendeten Konstrukt, dass die rekombinanten Proteine extrazellulär ausgeschieden werden und aus dem Kulturmedium erhalten werden. Zelllysate oder Kulturmedium werden dann auf die Gegenwart von CCV-S-Protein oder Peptid gescreent, die durch Antikörper, bevorzugt monoklonale Antikörper (MAbs), für eine peptidische antigene Stelle von CCV erkannt werden.
In ähnlicher Weise können Fusionsproteine durch chemische Synthesetechniken oder bevorzugt rekombinante Methoden, wie oben beschrieben, erzeugt werden. Die ausgewählten Primersets, die für die in den Beispielen unten beschriebene PCR- Reaktion verwendet werden, können so aufgebaut oder entwickelt werden, dass sie PCR amplifizierte Fragmente erzeugen, die Restriktionsendonucleasespaltsequenzen zur Einführung eines Coronavirus-S-Genfragments in einer spezifischen Orientierung in einen ausgewählten Expressionsvektor erzeugen, um Fusionsproteine der Erfindung zu erzeugen. Der Vektor kann ein gewünschtes Protein oder Fragment davon enthalten, mit dem das S-Genfragment im Leserahmen fusioniert ist, um ein Fusionsprotein zu erzeugen.
Die rohen Zelllysate, die CCV-S-Protein oder Peptide oder Fusionsproteine enthalten, können direkt als Impfkomponenten, therapeutische Zusammensetzungen oder diagnostische Reagenzien verwendet werden. Alternativ können die CCV-S-Peptide aus dem rohen Lysat oder Medium mit üblichen Mitteln gereinigt werden.

VII. Impfstoffzusammensetzungen

Die CCV-S-Proteine der Erfindung können in eine Impfstoffzusammensetzung eingearbeitet werden. Eine solche Impfstoffzusammensetzung kann eine immunogene Menge eines oder mehrerer ausgewählter CCV-S-Peptide oder Proteine enthalten, z. B. solche, die durch vollständige S-Gensequenz von CCV oder von Teilsequenzen davon codiert werden, und gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, zusammen mit einem für die Verabreichung als Impfstoffzusammensetzung für die prophylaktische Behandlung von CCV-Infektionen geeigneten Träger. Impfstoffzusammensetzungen, die Fragmente oder Teilsequenzen des vollständigen S-Gens von CCV oder Fragmente des CCV-S-Proteins enthalten, liegen nicht im Schutzbereich der beanspruchten Erfindung. Das Protein kann in Form eines Fusionsproteins, wie oben beschrieben, sein. Alternativ kann das CCV-S-Gen oder ein Fragment in einen lebenden Vektor eingebaut werden, z. B. Adenovirus, Vacciniavirus und dgl. Die Expression von Impfstoffproteinen in solchen lebenden Vektoren ist dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt [siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4 920 209]. Es ist bevorzugt, dass das in der Impfstoffzusammensetzung angewendete Protein die schützende Immunantwort gegenüber mehr als einem Stamm von CCV induziert.
Eine Impfstoffzusammensetzung gemäß der Erfindung kann gegebenenfalls andere immunogene Komponenten enthalten. Besonders wünschenswert sind Impfstoffzusammensetzungen, die andere Hundeantigene enthalten, z. B. Hunde-Staupe, Borrelia burgdorferi, Hunde-Bordetella, Tollwut, Hunde-Parvovirus, Leptosporidia sp., Hunde-Rotavirus, Hunde-Parainfluenzavirus und Hunde-Adenovirus.
In einer anderen Ausführungsform können die CCV-S-Proteine in einem Kombinationsimpfstoff verwendet werden, der auf verwandte Coronaviren gerichtet ist. Andere geeignete Coronaviren, die in einem solchen Kombinationsimpfstoff verwendet werden können, schließen Katzencoronavirus, wie FIPV oder FECV ein. Z. B. kann ein CCV-S-Peptid oder Protein der vorliegenden Erfindung als zusätzliches Antigen in dem temperaturempfindlichen FIPV-Impfstoff verwendet werden, der im Detail in der Patentanmeldung Serial No. 07/428 796 (US 5 667 785), eingereicht am 30. Oktober 1989, beschrieben wird. Alternativ könnte das CCV-S-Protein oder Peptid oder ein Fragment davon in einer Impfstoffzusammensetzung verwendet werden, die andere Coronavirus-S-Proteine oder Fragmente davon enthält, insbesondere solche, die in der gleichzeitig schwebenden US- Patentanmeldung Serial No. 07/698 927 der gleichen Anmelderin beschrieben werden (und der entsprechenden veröffentlichten PCT-Anmeldung Nr. WO 92/08487).
Die Herstellung einer pharmazeutisch annehmbaren Impfstoff Zusammensetzung mit geeignetem pH, Isotonizität, Stabilität und anderen üblichen Eigenschaften liegt im Fachwissen auf diesem Gebiet. So können solche Impfstoffe optimalerweise andere übliche Komponenten enthalten, wie Adjuvantien und/oder Träger, z. B. wässrige Suspensionen von Aluminium- und Magnesiumhydroxiden, Liposomen und. dgl.
Die Impfstoffzusammensetzung kann angewendet werden, um Tiere gegen die klinischen. Symptome, die mit CCV verbunden sind, zu impfen. Die Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung können auf einem geeigneten Weg verabreicht werden, z. B. auf dem oralen, intranasalen, subcutanen, intraperitonealen oder intramuskulären Weg. Die derzeit bevorzugten Verabreichungsmethoden sind subcutan und intranasal.
Die Menge des CCV-S-Peptids oder Proteins der Erfindung, die in jeder Impfstoffdosis vorhanden ist, wird ausgewählt im Hinblick auf Alter, Gewicht, Geschlecht, allgemeinen physischen Zustand des Tieres und dgl. Die zur Induktion einer immunoprotektiven Antwort in dem Tier erforderliche Menge, ohne signifikante nachteilige Nebenwirkungen, kann variieren abhängig von dem als immunogen angewendeten rekombinanten Protein und der fakultativen Gegenwart eines Adjuvans.
Allgemein wird erwartet, dass jede Dosis etwa 0,05 bis 5000 ug Protein/ml und bevorzugt 0,05 bis 100 ug/ml einer sterilen Lösung einer immunogenen Menge eines Proteins oder Peptids der Erfindung umfasst. An anfängliche Dosen können sich gegebenenfalls wiederholte Verstärkungsdosen, falls wünschenswert, anschließen.
Ein anderes Impfmittel der vorliegenden Erfindung ist eine Antisense-RNA-Sequenz, die für das S-Gen des CCV-Stamms 1-71 [SEQ ID Nr. 1] erzeugt wurde [S. T. Crooke et al., Biotech., 10: 882-886 (Aug. 1992)]. Diese Sequenz kann leicht von einem Fachmann auf diesem Gebiet erzeugt werden entweder synthetisch oder rekombinant. Unter geeigneter Abgabe sollte eine solche Antisense-RNA-Sequenz, wenn sie einem infizierten Tier verabreicht wird, an die RNA des Virus binden können, wodurch eine Virenreplikation in der Zelle verhindert wird.

VIII. Pharmazeutische Zusammensetzungen

Die Erfindung liefert auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein oder mehrere CCV-S-Peptide oder Proteine, die erfindungsgemäß hergestellt wurden, und einen pharmazeutisch wirksamen Träger umfasst. Geeignete pharmazeutisch wirksame Träger zur inneren Verabreichung sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Ein ausgewählter Träger ist sterile Kochsalzlösung. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann an die Verabreichung auf jedem geeigneten Weg angepasst werden, ist aber bevorzugt zur Verabreichung durch Injektion oder intranasale Verabreichung vorgesehen.

IX.

Die Erfinder offenbaren auch die Entwicklung eines Antikörpers gegen ein oder mehrere Epitope in den oben angegebenen Aminosäuresequenzen, die von dem CCV-S-Protein abstammen, wobei das Epitop sich von dem anderer CCV-Stämme oder anderer Coronaviren, z. B. FIPV, TGEV oder FECV, unterscheidet. Der Antikörper kann entwickelt werden, indem als antigene Substanz ein Peptid der Tabelle I oder II angewendet wird. Ein solcher Antikörper ist nicht Teil der beanspruchten Erfindung.
Alternativ können andere Regionen des CCV-Stamms 1-71 S- Proteins SEQ ID Nr. 2 zur Entwicklung eines Antikörpers mit üblichen Techniken angewendet werden.
Der Antikörper kann eine antigene CCV-Stelle, die von SEQ ID Nr. 1 oder einem Fragment davon codiert wird, identifizieren oder an diese binden. Ein solcher Antikörper kann für einen diagnostischen Screeningtest verwendet werden, z. B. als Hybridisierungssonde, oder als therapeutisches Mittel.
Antikörper, die die CCV-Peptide aus den oben angegebenen Regionen binden oder an andere Regionen binden, die zwischen CCV, TGEV, FIPV, FECV und anderen Coronaviren unterscheiden können, zur Verwendung in den Assays können polyklonal sein. Es ist jedoch aus Gründen einer erhöhten Targetspezifizität wünschenswert, MAbs zu verwenden, sowohl in den Assays als auch als potenzielle therapeutische und prophylaktische Mittel. Außerdem können synthetisch entwickelte MAbs mit bekannten gentechnischen Verfahren hergestellt [W. D. Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989)] und in den hier beschriebenen Methoden angewendet werden. Der Einfachheit halber wird der Ausdruck MAb(s) in dieser Beschreibung verwendet; es versteht sich jedoch, dass bestimmte polyklonale Antikörper, insbesondere polyklonale Antikörper mit hohem Titer und rekombinante Antikörper auch angewendet werden können.
Ein MAb kann mit den wohl bekannten Köhler & Milstein- Techniken und Modifikationen davon erzeugt werden und gegen eine oder mehrere der oben angegebenen Aminosäureregionen gerichtet werden oder gegen andere CCV-S-Peptide oder Epitope, die Unterschiede zwischen CCV Stamm 1-71 und anderen Coronaviren enthalten. Z. B. kann ein Fragment von SEQ ID Nr. 2, das eine antigene Stelle darstellt, die sich von der von FIPV unterscheidet, als Antigen bei üblichen Techniken zur Entwicklung von MAbs präsentiert werden. Der Fachmann auf diesem Gebiet kann eine Anzahl von MAbs erzeugen unter Verwendung von Fragmenten der oben angegebenen Aminosäureregionen als Immunogen und unter Anwendung dieser Lehren.
Für diagnostische Zwecke können die Antikörper (ebenso wie die diagnostischen Sonden) mit einzelnen Markierungen verbunden werden. Wenn mehr als ein Antikörper bei einer diagnostischen Methode angewendet wird, sind die Markierungen wünschenswerterweise interaktiv und erzeugen ein nachweisbares Signal. Am wünschenswertesten ist die Markierung visuell nachweisbar, z. B. kolorimetrisch. Nachweisbare Markierungen zur Bindung an Antikörper, die für die diagnostischen Tests nützlich sind, können auch leicht von einem Fachmann auf dem Gebiet der diagnostischen Assays unter denen ausgewählt werden, die ohne Beschränkung Meerrettichperoxidase (HRP) oder alkalische Phosphatase (AP), Hexokinase zusammen mit Glucose- 6-phosphatdehydrogenase, und NAD-Oxidoreductase mit Luciferase und den Substraten NADH und FMN oder Peroxidase mit Luminol und dem Substratperoxid einschließen. Diese und andere geeignete Markierungssysteme und Methoden zu ihrer Kupplung an Antikörper oder Peptide sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt.
Antikörper können auch therapeutisch als zu einem Ziel führende Mittel verwendet werden, um virustoxische oder für infizierte Zellen toxische Mittel zu infizierten Zellen zu führen. Statt mit Markierungen für diagnostische Zwecke verbunden zu sein, wird bei einem therapeutischen Mittel der Antikörper mit einem Mittel oder Liganden, der den Replikationsmechanismus des Virus außer Kraft setzen kann oder die mit Virus infizierte Zelle zerstören kann, verbunden. Die Identität des toxischen Liganden beschränkt nicht die vorliegende Erfindung. Es wird erwartet, dass bevorzugte Antikörper gegen Peptide, die von den hier angegebenen S-Genen codiert werden, auf ihre Fähigkeit, in die infizierte Zelle aufgenommen zu werden und den Liganden in die Zelle zu liefern, gescreent werden können.

X. Diagnostische Reagenzien und Tests

Die Nucleotidsequenzen, Aminosäurefragmente und Antikörper, die hier beschrieben werden, können als diagnostische Reagenzien zur Verwendung in einer Vielzahl diagnostischer Methoden angewendet werden.

A. PCR-Diagnoseassays

Diese Sequenzen können z. B. in einer diagnostischen Methode angewendet werden unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um die Gegenwart eines CCV- oder CCV-artigen Virus festzustellen und zur Therapie infizierter Tiere.
Zusätzlich zu den oben angegebenen Sequenzen können die Oligonucleotidsequenzen, die so entworfen wurden, dass sie die cDNA-Synthese an spezifischen Stellen innerhalb des CCV-S- Gens primen, wie im Detail unten in Beispiel 3 beschrieben [SEQ ID Nr. 46 bis 50] auch als diagnostische Reagenzien angewendet werden. Diese Sequenzen ebenso wie die unten beschriebenen optimierten Bedingungen für die PCR-Amplifikation von CCV-Fragmenten können auch in einer diagnostischen Methode angewendet werden.
Die PCR-Technik ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Gentechnik bekannt und wird im Detail in Beispiel 4 beschrieben [siehe z. B. R. K. Saiki et al., Science, 230: 1350-1354 (1985)], das hier durch Bezugnahme miteingeschlossen wird Kurz beschrieben, wendet PCR zwei Oligonucleotidprimer an, die komplementär zu den entgegengesetzten Strängen einer interessierenden doppelsträngigen Nucleinsäure sind, deren Stränge so orientiert sind, dass dann, wenn sie durch DNA- Polymerase verlängert werden, eine Synthese über den Bereich erfolgt, der die Oligonucleotide trennt. Durch wiederholte Zyklen von Hitzedenaturierung, Annealing der Primer mit ihren komplementären Sequenzen und Verlängerung der reassoziierten Primer mit einer temperaturstabilen DNA-Polymerase werden Millionen von Kopien der Zielgensequenz erzeugt. Die Matrize für die Reaktion ist insgesamt RNA, die aus mit CCV infizierten Zellen isoliert wurde. DNA-Fragmente, die durch PCR erzeugt wurden, wurden aus cDNA amplifiziert, die aus dieser RNA synthetisiert worden war. Andere Stämme von CCV oder von CCV-verwandten Sequenzen können auch PCR-Matrizen in ähnlicher Weise liefern.
Bei einer diagnostischen Methode sind z. B. heterogene CCV- Gensequenzen der Erfindung nützlich als Reagenzien in diagnostischen Tests, um die Gegenwart von spezifischen Viren nachzuweisen und diese voneinander zu unterscheiden, z. B. um einen Hundecoronavirusstamm von einem anderen oder eine Art Coronavirus von einer anderen mit Hilfe üblicher Testformate zu unterscheiden. Unter Verwendung von Protokollen ähnlich denen, die für forensische Zwecke verwendet werden, würden z. B. Gewebe oder Blutproben von einem Hund, von dem angenommen wird, dass er mit CCV infiziert ist, einer PCR-Amplifikation mit einem ausgewählten CCV-spezifischen Primersatz unterzogen, z. B. solchen DNA-Sequenzen, wie sie hier offenbart werden. Die Amplification von DNA aus einem Probegewebe oder einer biologischen Flüssigkeit des Tiers, bei dem eine Infektion vermutet wird, unter Verwendung von Nucleotidsequenzen als Primer, die für Regionen der CCV-Virengensequenzen spezifisch sind, könnten mit der Gegenwart von CCV korrelieren. Die Abwesenheit von CCV in der Probe würde zu keiner Amplifikation führen. In ähnlicher Weise würde die Auswahl spezifischer Sätze von S-Gen-Primern auch die Identifikation eines speziellen Stamms von CCV zulassen. So kann eine geeignete Behandlung für das infizierte Tier ausgewählt werden.
Beispiel 3 liefert Oligonucleotidprimer, die die Synthese von Regionen des CCV-S-Gens zulassen. Die Nucleotidsequenz des S- Gens von CCV liefert wünschenswerte Sequenzen für Hybridisierungssonden und PCR-Primer, z. B. die Sequenz zwischen den Nucleotidbasenpaaren 900 und etwa 1600 [SEQ ID Nr. 55] und etwa 2500 bis etwa 3900 [SEQ ID Nr. 56] von SEQ ID Nr. 1. Kleinere oder größere DNA-Fragmente in diesen Regionen können auch als PCR-Primer oder Hybridisierungssonden angewendet werden.
Es ist wünschenswert, PCR-Primersequenzen mit 15 bis 30 Basenpaaren Länge zu haben mit einer zwischenliegenden Sequenz von mindestens 100 Basen und bis zu 5000 Basen gemäß der üblichen PCR-Technologie. Es ist jedoch möglich, dass größere oder kleinere Sequenzlängen nützlich sein können auf Basis von Modifikationen der PCR-Technologie. Um eine befriedigende Unterscheidung zu erreichen, besteht im Allgemeinen eine Hybridisierungs- oder Oligonucleotidsonde aus einer oder mehreren dieser Sequenzen mit einer Länge von 15 bis 50 Basenpaaren basierend auf der derzeitigen Technologie.

B. Übliche Testformate

Die CCV-S-Proteine oder Peptidfragmente können auch in diagnostischen Standardassays angewendet werden, die auf 5-Protein-Immunogenen als Targets für Serenerkennung basieren. Die diagnostischen Assays können irgendwelche üblicherweise angewendeten Assays sein, z. B. Sandwich-ELISA-Assays, Western Blot, Southern Blot und dgl. Da eine große Vielzahl von diagnostischen Methoden existiert und üblicherweise bekannt ist, die an die Verwendung der hier beschriebenen Nucleotid- und Aminosäuresequenzen angepasst werden können, versteht sich, dass die Art des diagnostischen Assays die Verwendung der in dieser Anmeldung offenbarten Sequenzen nicht beschränkt.
Die von den CCV-S-Gensequenzen codierten Aminosäuresequenzen, wie z. B. die in den Tabellen I und II oben erscheinenden, die mit PCR amplifiziert werden, liefern beispielsweise Peptide, die für solche diagnostischen Assays, wie ELISA oder Western Assay nützlich sind, oder als Antigene zum Screenen von Seren oder zur Entwicklung von Antikörpern.
Z. B. wird davon ausgegangen, dass Sequenzen zwischen etwa Aminosäure 1 und etwa 250 [SEQ ID Nr. 57], etwa 450 bis etwa 650 [SEQ ID Nr. 58] und etwa 900 bis etwa 1150 [SEQ ID Nr. 59] des obigen CCV-Stamms 1-71-S-Genproteins SEQ ID Nr. 2 als Antigene nützlich sind. Solche Peptide können gegebenenfalls bei der Entwicklung eines synthetischen Peptids, das an einen Träger gekuppelt ist für diagnostische Verwendungen, z. B. zum Antikörpernachweis in Seren, angewandt werden. Geeignete Träger schließen Ovalbumin, Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Rinderserumalbumin, Sepharoseperlen und Polydextranperlen ein.
Solche Peptidantigene und Antikörper gegen diese Peptide würden mit Gewebe- oder Serumproben von Hunden, die mit CCV infiziert sind, positiv reagieren, aber mit nicht mit CCV- infizierten Hunden negativ reagieren. Diese Antikörper werden im Detail unten diskutiert.
Z. B. liefert die Erfindung ein Verfahren zur Verwendung des CCV-S-Proteins in voller Länge als diagnostische Mittel zur Identifikation der Gegenwart oder Abwesenheit von Antikörpern bei vorher exponierten, unbehandelten bzw. geimpften Hunden aufzufinden ebenso wie zur Differenzierung des Kontakts mit CCV von anderen verwandten Coronaviren. Andere S-Peptide oder Fusionsproteine, die eine andere Reaktivität gegenüber CCV und anderen Coronavirusseren zeigen können, können auch nützlich als CCV-spezifische Reagenzien in auf ELISA basierenden Screeningassays sein, um einen CCV-Kontakt bei Hunden nachzuweisen. In ähnlicher Weise könnte ein S-Protein oder Peptid, das Epitope enthält, die nur von Seren von CCV-infizierten Hunden oder von Seren von CCV-positiven Hunden erkannt werden können, angewendet werden, um zwischen verschiedenen Coronavirusinfektionen zu unterscheiden oder zu differenzieren.
Ein Testformat kann sein, die Reaktivität von mit Affinität gereinigten CCV-S-Proteinen oder Peptidfragmenten bei biologischen Flüssigkeiten oder Zellen von Hunden mit Western Blot zu untersuchen. Der Test wird bevorzugt an Seren durchgeführt, kann aber auch so angepasst werden, dass er an anderen geeigneten Flüssigkeiten oder Zellen durchgeführt werden kann, z. B. Makrophagen oder weißen Blutkörperchen. Bei der Western-Blot-Technik wird das gereinigte Protein, das mit präparativem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt wurde, auf Nitrocellulose überführt und in zahlreiche Streifen geschnitten. Die Streifen werden dann mit Hundeseren aus uninfizierten oder infizierten Hunden untersucht. Die Bindung der Hundeseren an das Protein wird nachgewiesen durch Inkubation mit Ziege-anti-Hund-IgG, das mit alkalischer Phosphatase markiert ist, und anschließend durch Inkubation mit Enzymsubstrat BCIP/NBT. Die Farbentwicklung wird gestoppt, indem der Streifen mit Wasser gewaschen wird.
CCV-S-Protein oder Fragmente davon können auch bei einem auf ELISA basierenden Test zum Nachweis der CCV-Krankheit verwendet werden. Ein typisches ELISA-Protokoll beinhaltet das Anhaften von Antigen (z. B. einem S-Protein) in einem Napf einer 96-Napf-Titerplatte. Das zu testende Serum wird dann zugegeben. Wenn das Serum Antikörper gegen das Antigen enthält, wird es binden. Die Spezifizität der Reaktion wird bestimmt durch das Antigen, das an der Platte absorbiert wird. Mit dem S-Protein würden nur Seren von solchen Hunden, die mit CCV infiziert sind, an die Platte binden; Seren von nicht befallenen oder uninfizierten Hunden würden nicht binden.
In gleicher Weise könnte ein CCV-S-Protein oder Peptid, das Epitope enthielte, die nur von Seren aus mit CCV infizierten Hunden oder Seren aus CCV-positiven Hunden erkannt würden, angewendet werden, um Coronavirusinfektionen zu unterscheiden. Nachdem der primäre Antikörper gebunden ist, wird ein enzymmarkierter Antikörper, der gegen das Globulin des Tiers, dessen Serum getestet wird, gerichtet ist, zugegeben. Substrat wird dann zugegeben. Das mit dem Antikörper verbundene Enzym, das an den Napf gebunden ist, würde das Substrat in eine sichtbare Form umwandeln. Die Menge an Farbe, die gemessen wird, ist proportional der Menge an Antikörper in dem Testmaterial. Auf diese Weise können Hunde, die mit CCV infiziert sind, identifiziert und behandelt werden oder Hunde, die von dem Virus unbetroffen sind, durch Impfung geschützt werden.
Die Primer, Sonden, Peptidantigene, Nucleotidsequenzen, die ein CCV-S-Protein codieren oder flankieren, gemäß der vorliegenden Erfindung und Antikörper, die in dieser Anmeldung offenbart werden, können gegebenenfalls, wenn sie als diagnostische Reagenzien verwendet werden, mit nachweisbaren Markierungen oder Markierungssystemen, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, verbunden werden. Solche markierten diagnostischen Reagenzien können verwendet werden, um auf die Gegenwart von CCV in Hunden in Hybridisierungsassays oder mit der oben beschriebenen PCR-Technik zu testen.

C. Diagnostische Kits

Die Assaymethoden, PCR-Primer, CCV-S-Nucleotidsequenzen [SEQ ID Nr. 1], S-Proteine und Peptide und hier beschriebenen Antikörper können wirksam zum Aufbau eines Diagnosekits verwendet werden, der von Tierärzten oder Laboratorien verwendet werden kann. Der Kit ist nützlich zur Unterscheidung zwischen mit CCV infizierten Tieren und geimpften Tieren ebenso wie nicht exponierten Hunden und zwischen mit CCV infizierten Tieren und Tieren, die mit serologisch verwandten Viren infiziert sind, wie anderen CCV oder FIPV, TGEV und FECV. Ein solcher Diagnosekit enthält die Komponenten, die notwendig sind, um die oben beschriebenen Assays durchzuführen. Diagnosekits, die Antikörper enthalten, sind nicht Teil der beanspruchten Erfindung.
Somit kann der Kit eine ausreichende Menge mindestens eines CCV-S-Proteins, Fusionsproteins oder Peptidfragments, mindestens einer CCV-S-Gen-Nucleotidsequenz oder eines PCR- Primerpaars der Erfindung, einen MAb, der gegen ein erstes Epitop des CCV-S-Proteins gerichtet ist (wobei der MAb markiert sein kann), gegebenenfalls weitere Komponenten eines nachweisbaren Markierungssystems, Gläschen zur Aufnahme der Serumproben, Proteinproben und dgl., und einen zweiten MAb, der mit dem zweiten Enzym konjugiert ist, das in der Nähe des ersten Enzyms ein sichtbares Produkt produziert, enthalten. Andere übliche Komponenten gleicher Diagnosekits können auch enthalten sein.
Alternativ kann ein Kit ein ausgewähltes CCV-S-Protein oder Peptid, einen MAb, der gegen ein ausgewähltes CCV-S-Peptidfragment gerichtet ist, der an eine feste Oberfläche gebunden ist und mit einem ersten Enzym verbunden ist, einen anderen MAb, der mit einem zweiten Enzym verbunden ist, und eine ausreichende Menge des Substrats für das erste Enzym, das, wenn es zu dem Serum und den MAbs zugegeben wird, den Reaktanten für das zweite Enzym bildet, was zu einer Farbänderung führt, enthalten.
Andere bekannte Assayformate schließen weitere Komponenten für einen Diagnosekit gemäß der vorliegenden Erfindung ein.
Die folgenden Beispiele erläutern die Ausführungsformen der Erfindung und beschränken den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung nicht.

Beispiel 1 - Isolierung von CCV

Hundecoronavirus Stamm 1-71 wurde 1971 aus Militärhunden isoliert, die unter einer Virengastroenteritis litten, gemäß Binn et al., Proceeding 78th Annual Meeting U.S. Animal Health Association, Oktober 1974, Seiten 359-366. Das erste Isolat aus dem Fäzes des infizierten Hundes wurde in Gewebekultur auf der PrDKTCA72-Hundezelllinie [ATCC Nr. CRL 1542] gezüchtet. Der in dieser Untersuchung verwendete Coronavirusstamm wurde von ATCC erhalten (ATCC #VR-809, CCV-Stamm 1-71, eingefrorene Charge #4, Passage 7/PDK, 17. Mai 1988) und fünf Passagen mit PrDKTCA72 durchgeführt.

Beispiel 2 - RNA-Reinigung

Nach der fünften Passage wurden die infizierten Zellen zur RNA-Isolierung verarbeitet, indem eine Rollflasche mit 1700 cm³ mit einem CCV-Inokulum infiziert wurde. Das Inokulum wurde hergestellt, indem 2,5 ul infizierter Flüssigkeit aus einer zusammenfließenden Monolayer in 13,0 ml Medium verdünnt wurden. 1 ml dieses Materials wurde verwendet, um eine Rollflasche zu infizieren, und die Zellen wurden gezüchtet, bis sie einen deutlichen cytopathischen Effekt nach 48 Stunden zeigten. Die infizierten Monolayers wurden geerntet und die gesamte cytoplasmatische RNA extrahiert unter Verwendung des Guanidiniumthiocyanat-Verfahrens, wie von Chirgwin et al., Biochem., 18: 5294 (1979) beschrieben.

Beispiel 3 - Primer, die zur PCR-Amplifikation von CCV-Spike- Genfragmenten verwendet werden

Die Primer, die unten in Tabelle III erscheinen, wurden in üblicher Weise mit Phosphoramididmethode synthetisiert und vor der Verwendung gelgereinigt. Primer #3045 basierte auf einer FECV-S-Gensequenz und die Primer #4920, 1923, 2443 und 2600 basierten auf WT FIPV WSU 1146-Sequenzen. Tabelle III

Beispiel 4 - PCR-Anplifikation des CCV-S-Gens

Mit PCR amplifizierte Fragmente des CCV-S-Gens wurden erzeugt unter Verwendung des folgenden Verfahrens. Alle PCR- Reagenzien wurden von Perkin Elmer-Cetus, Norwalk, CT, geliefert. In einem letzten Reaktionsvolumen von 20 ul 1X RT- Puffer (5X RT-Puffer: 250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl&sub2;) wurden die folgenden Komponenten in RNAse-freien siliconisierten 500-ul-Zentrifugenröhrchen zusammengefasst: jeweils 1,0 mM dNTP, 20 Einheiten RNAsin [Promega Corp., Madison, WI], 2,5 umol statistische Hexameroligonucleotide [Pharmacia, Milwaukee, WI], 100 umol/ul Lösung in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), 200 Einheiten reverse Transkriptase [Superscript(RTM) RT, Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD] und 1,0 ug der jeweiligen RNA, die wie oben in Beispiel 3 beschrieben isoliert wurde. Um Pipettierfehler und Kontamination zu vermeiden, waren alle Lösungen Aliquots aus Mastermischungen, die mit mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser hergestellt wurden und bestanden aus allen Reaktionskomponenten außer der RNA, die zuletzt zugegeben wurde.
Die Mischung wurde in einer programmierbaren Thermozyklusvorrichtung [Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT] bei 21ºC 10 Minuten lang und anschließend 1 Stunde lang bei 42ºC und dann 5 Minuten lang bei 95ºC inkubiert und schließlich auf 4ºC gehalten bis zur PCR-Amplifikation.
Die Amplifikation der cDNA wurde im Wesentlichen gemäß der Methode von R. K. Saiki et al., Science, 230: 1350-1354 (1985) unter Verwendung von Taq-Polymerase durchgeführt. Kurz gesagt, wurden zu 20 ul cDNA-Reaktionsmischung von oben 10,0 ul 10X PCR-Puffer, jeweils 1,0 ul Stromaufwärts- und Stromabwärtsprimer, die vorher mit Wasser auf 30 umol/ul verdünnt worden waren, und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase [Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT] zugegeben. Das Endvolumen wurde unter Verwendung von mit DEPC behandeltem Wasser auf 100 ul gebracht und mit 100 ul Mineralöl überschichtet. Wie oben wurden Mastermischungen hergestellt, um eine Kontamination zu vermeiden. Die Reaktion wurde in der Perkin-Elmer-Cetus- Thermozyklusvorrichtung einen Zyklus lang durchgeführt, indem 1 Minute bei 95ºC denaturiert wurde, 3 Minuten lang bei 37ºC reassoziiert wurde und anschließend 40 Minuten bei 72ºC verlängert wurde.
Der Anfangszyklus erhöhte die Wahrscheinlichkeit einer DNA- Synthese des ersten Strangs. Ein Standard-PCR-Profil wurde dann über 40 Zyklen durchgeführt: bei 95ºC für 1 Minute Denaturierung, bei 37ºC 3 Minuten Annealing, bei 72ºC 3 Minuten Verlängerung. Ein letzter Verlängerungszyklus erfolgte, indem 1 Minute bei 95ºC denaturiert, 2 Minuten bei 37ºreassoziiert und 15 Minuten bei 72ºC verlängert wurde und auf 4ºC gehalten wurde, bis zur Analyse.
Die PCR-Produkte wurden analysiert durch Elektrophorese von 5,0 ul des Ansatzes auf einem 1,2%-Agarosegel über 16 bis 17 Stunden. Die Banden wurden durch Ethidiumbromidfärbung des Gels sichtbar gemacht und durch Fluoreszenz mit UV-Bestrahlung bei 256 nm. Eine Fotografie unter Verwendung eines Polaroid(RTM) Films Typ 55 lieferte ein Negativ, das bezüglich der Probendistanzwanderung und eines Vergleichs gegen Marker, die auf jedem Gel mitliefen, digitalisiert werden konnte. Die tatsächlichen Größen der Banden wurden dann berechnet unter Verwendung der Beckman-Microgenie-Software, die auf einem IBM AT läuft.

Beispiel 5 - Klonierung der CCV-Spike-Genregionen

Klonierungsverfahren wurden durchgeführt, im Wesentlichen wie von Maniatis et al., wie oben zitiert, beschrieben. Die Details der Klonierungen sind in den folgenden Beispielen angegeben. Alkalische Phosphatase vom Kalb war von Bethesda Research Labs (Gaithersburg, MD). Die Ligierungsprodukte wurden in E. coli Wirtsstamm XL1 Blue [Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA] tranformiert. Ein pBluescript SKIIM13-Phagemidvektor wurde auch von Stratagene Cloning Systems erhalten. Alle Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs (Beverly, MA) oder Bethesda Research Labs (Gaithersburg, MD) erworben und gemäß den Angaben des Herstellers verwendet. T4- DNA-Ligase wurde von Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, IN) erhalten. Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm wurde von Bethesda Research Labs erworben.

Beispiel 6 - CCV-S-Proteinfragment, A. A. 1-128 [SEQ ID Nr. 51][nicht vom Schutzbereich der Ansprüche umfasst]

5 ul (ungefähr 200 ng) von mit PCR amplifizierter DNA, die den Aminosäuren 1 bis 362 [SEQ ID Nr. 53] des CCV-Spike-Gens entsprachen, wurden mit dem pT7Blue-T-Vektor (Novagen, Madison, WI) nach den Anleitungen der Herstellers ligiert. 1 ul der Ligierungsmischung wurde verwendet, um NovaBlue-kompetente Zellen (Novagen) zu transformieren und Transformationsmischungen wurden auf LB-Platten ausplattiert, die mit Ampicillin, Isopropylthio-β-galactosid (IPTG; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (X-gal; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ergänzt waren. Weiße Kolonien wurden herausgepickt und mit Restriktionsanalyse von Miniprep-DNA gescreent. Ein Insert tragende Klone wurden identifiziert und im Hinblick auf den Vektor durch SmaI/PstI-, StuI- und PstI-Verdau orientiert. Klon #2964 enthielt ein Aminosäureinsert voller Länge mit 1 bis 362 Aminosäuren und wurde verwendet, um eine Sequenzanalyse der Aminosäuren 1 bis 128 des CCV-S-Gens zu liefern.

Beispiel 7 - CCV-S-Proteinfragment, A. A. 128-555 [SEQ ID Nr. 43][nicht vom Schutzbereich der Ansprüche umfasst]

10 ul PCR-DNA, die 1 bis 555aa des CCV-Spike-Proteins codiert, wurden mit SmaI/StuI 4 Stunden bei Raumtemperatur verdaut. Die DNA-Banden wurden isoliert und mit bei niedriger Temperatur schmelzenden Agarosegelen gereinigt, wie von Maniatis et al., oben zitiert, beschrieben. Kurz gesagt wurden DNA-Fragment nach Anfärbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht, aus dem Gel mit einem Skalpell herausgeschnitten und in Mikrofugenröhrchen überführt. Gelstreifen wurden 5 Minuten bei 65ºC inkubiert, gevortext und 5 Volumina 20 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA wurden zugegeben. Die Proben wurden weitere 2 Minuten bei 65ºC inkubiert und dann einmal mit Phenol und einmal mit Phenol : Chloroform extrahiert. Die DNA wurde mit 1/10 Volumen 3 M NaOAc, pH 7,0 und 2,5 Volumina kaltem 95% EtOH über Nacht bei -20ºC ausgefällt. Die Insert-DNA wurde in einen SKIIM13-SmaI-verdauten, dephosphorylierten Vektor [Stratagene] 4 Stunden bei Raumtemperatur ligiert. Insert tragende Klone wurden identifiziert durch XhoI/SstI- und BglI-Verdau von Miniprep-DNA. Die Restriktionsenzym- und Sequenzanalyse zeigte, dass das klonierte Insert nur etwa 300 bp lang war aufgrund der Gegenwart einer StuI-Stelle bei Aminosäure #128 des CCV-Spike-Gens. Daher enthielten diese Klone die CCV-S-Proteine überspannenden Aminosäuren von etwa 128 bis 555 [SEQ ID Nr. 43].

Beispiel 8 - CCV-S-Proteinfragment, A. A. 352-1452 [SEQ ID Nr. 52][nicht vom Schutzbereich der Ansprüche umfasst]

Mit PCR amplifizierte DNA-Fragmente, die die Aminosäuren 352 bis 1454 des CCV-Spike-Proteins codieren, wurden unter Verwendung von Prime-Erase-Quik-Säulen [Stratagene] nach den Anleitungen des Herstellers gereinigt. Säulengereinigte DNAs wurden dann mit XmaI/EcoRV über Nacht bei 15ºC verdaut und anschließend isoliert und von bei niedriger Temperatur schmelzenden Agarosegelen eluiert, wie von Maniatis et al., oben zitiert, beschrieben. Die Inserts wurden über Nacht bei 15ºC mit SKIIM13-, XmaI/StuI-verdautem, dephosphoryliertem Vektor [Stratagene] ligiert. Die Klone wurden identifiziert und im Hinblick auf den Vektor durch XhoI/SstI- bzw. PvuII- Verdau von Miniprep-DNAs orientiert.

Beispiel 9 - DNA-Sequenzierung

Die DNA-Sequenz für das CCV-S-Gen wurde bestimmt aus den einzelnen Klonen #1775 (AA 352-1452; SEQ ID Nr. 52), #2007 (AA 128-555; SEQ ID Nr. 43) und #2964 (AA 1-362; SEQ ID Nr. 53). Deletionen eines ineinander gesetzten Satzes wurden von jedem Klon erzeugt oder innere Primer synthetisiert, um das Primer- Walking zu erleichtern und die Sequenz beider Stränge bestimmt [Lark Sequencing Technologies, Houston, TX]. Die von Sanger et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977) beschriebene Kettenabbruchmethode wurde verwendet, um die Sequenz aller Klone zu bestimmen. Die Sequenz voller Länge des CCV-S-Gens wurde aus überlappenden Sequenzen jedes der drei einzelnen Fragmente durch Computeranalyse zusammengesetzt.
Die DNA-Sequenzanalyse wurde durchgeführt entweder mit Beckman-Microgenie-Programmen auf einem IBM Modell PS/2-Modell 70 oder der University-of-Wisconsin-GCG-Packung von Programmen, die auf einem DEC-VAX-Cluster implementiert war [Devereau et al. (1984)].
SEQ ID Nr. 1 ist die vollständige Nucleotidsequenz des CCV- Stamm-1-71-S-Gens. Die Aminosäure [SEQ ID Nr. 2] und die Nucleotidsequenzen [SEQ ID Nr. 1] von CCV 1-71 haben insgesamt 1452 Aminosäuren bzw. 4356 Basenpaare. CCV 1-71 hat eine DNA- Homologie von 90,8% zu dem veröffentlichten FIPV-Stamm WT WSU 1146, 93,2% Identität mit FIPV-Stamm DF2 und 94,1% Ähnlichkeit mit FECV. Im Vergleich zu WSU 1146 enthält dieser CCV- Stamm weiterhin zwei Aminosäuredeletionen an den Positionen 11 und 12 und zwei Aminosäureinsertionen an den Positionen 118 und 119. Im Vergleich zu den Aminosäuresequenzen anderer Coronavirus-S-Gene ist die Aminosäuresequenz von CCV zu 82,2% homolog zu TGEV, 89,7% homolog zu DF2-HP, 90,0% homolog zu TS-BP, 92,9% homolog zu T5, 93,2% homolog zu DF2 und 94,1% homolog zu FECV.
Das Hundecoronavirus-S-Gen, das die Aminosäuren #225 bis 1325 codiert [SEQ ID Nr. 54] hat eine Gesamthomologie zu dem veröffentlichten WT FIPV WSU 1146-Stamm mit den Aminosäuren. 352 bis 1454 von 95,9%. Der Homologiegrad wird auf 97,5% erhöht, wenn der Vergleich gemäß den Aminosäuregleichheitsregeln erfolgt, wie von M. O. Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, Bd. 5, Ergänzung 3, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC (1978), vorgeschlagen. Es gibt 42 Aminosäureunterschiede zwischen dem CCV-S-Gen und der veröffentlichten Sequenz des WSU-1146-Stamms innerhalb der CCV-Sequenz von SEQ ID Nr. 2. Andere CCV-Fragmenthomologien mit WT FIPV WSU 1146 sind in Tabelle II oben dargestellt.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
Miller, Timothy J.
Klepfer, Sharon
Reed, Albert Paul
Jones, Elaine V.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG:
Hunde-Coronavirus-S-Gen und dessen Verwendungen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 59
(iv) KORRESPONDENZ-ADRESSE:
(A) ADRESSAT: SmithKline Beecham Corporation - Corporate Patents
(B) STRASSE: 709 Swedeland Road
(C) ORT: King of Prussia
(D) STAAT: PA
(E) LAND: USA
(F) ZIP: 19406-2799
(v) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version # 1.25
(v) DATEN ZUR VORLIEGENDEN ANMELDUNG
(A) ANMELDENUMMER: US
(B) ANMELDEDATUM:
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) DATEN ZUR FRÜHEREN ANMELDUNG
(A) ANMELDENUMMER: US 07/880,194
(B) ANMELDEDATUM: 8. Mai 1992
(vii) DATEN ZUR FRÜHEREN ANMELDUNG
(A) ANMELDENUMMER: US 07/698,927
(B) ANMELDEDATUM: 13. Mai 1991
(vii) DATEN ZUR FRÜHEREN ANMELDUNG
(A) ANMELDENUMMER: US 07/613,066
(B) ANMELDEDATUM: 14. November 1990
(viii) INFORMATIONEN ZUM VERTRETER:
(A) NAME: Schreck, Patricia A.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 33,777
(C) BETREFF/INTERNES ZEICHEN: SBC H85010
(ix) TELEKOMMUNIKATIONS-ANGABEN:
(A) TELEFON: (215) 270-5015
(B) TELEFAX: (215) 270-5090
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 4359 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..4356 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2;
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1452 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 201 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 51 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKULS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 51 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 51 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 81 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKLTLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 126 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 76 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 203 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LÄNGE: 19 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 34 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:: SEQ ID NO: 15:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 34 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 27 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 37 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 78 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure:
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 26 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 372 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..372 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 124 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:: SEQ ID NO: 25:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 180 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..180 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 60 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 141 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..141 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 47 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 51 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..51 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..42 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 51 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..51 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 35:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 36:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..42 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 36:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 37:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 38:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 195 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..195 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 38:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 39:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 65 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 39:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 40
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 765 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA. (genomisch)
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..765 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 40:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 41:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 255 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 41:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 42:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1284 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..1284 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 42:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 43:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 428 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 43:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 44:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 546 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..546 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 44:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 45:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 182 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 45:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 46:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 38 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 46:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 47:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 39 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 47:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 47:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 37 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 48:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 49:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 39 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 49:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 50:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 43 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 50:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 51:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 128 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 51:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 52:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1101 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 52:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 53:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 362 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 53:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 54:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1101 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 54:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 55:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 701 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 55:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 56:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1401 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 56:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 57:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 250 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 57:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 58:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 201 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 58:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 59:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 251 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 59:

Claims

1. Isolierte Proteinsequenz mit den Aminosäureresten 1 bis 1452 des S-Proteins des Coronavirusstamms CCV 1-71 vom Hund (SEQ ID Nr. 2).

2. Proteinsequenz nach Anspruch 1, wobei das Protein mit einem ausgewählten Protein fusioniert ist.

3. DNA-Sequenz, die das S-Protein von Hundecoronavirusstamm CCV 1-71 codiert ausgewählt aus SEQ ID Nr. 1 oder einer Sequenz, die SEQ ID Nr. 2 codiert.

4. DNA-Sequenz nach Anspruch 3, die weiterhin eine DNA- Sequenz umfasst, die ein ausgewähltes Protein codiert, das mit dem S-Protein von Hundecoronavirusstamm CCV 1-71 fusioniert werden kann.

5. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten S-Proteins des Hundecoronavirusstamms CCV 1-71 umfassend, dass ein ausgewählter Wirt gezüchtet wird, der mit einer DNA- Sequenz gemäß Anspruch 3 in operativer Verbindung mit einer oder mehreren regulatorischen Sequenzen, die die Expression dieses Proteins regulieren können, transformiert ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Wirt eine Säugetierzelle ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Wirt ein viraler Vektor ist.

8. Rekombinanter Vektor umfassend die DNA-Sequenz nach Anspruch 3, wobei die Sequenz operativ verbunden ist mit einer oder mehreren regulatorischen Elementen, die dessen Expression regulieren können.

9. Wirtszelle umfassend den rekombinanten Vektor nach Anspruch 8.

10. Impfstoffzusammensetzung umfassend eine wirksame Menge des S-Proteins von Hundecoronavirusstamm CCV 1-71 und einen fakultativen Träger.

11. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das S- Protein ein Fusionsprotein ist.

12. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 10 oder Anspruch 11 weiter umfassend eine immunogene Menge eines oder mehrerer zusätzlicher Antigene.

13. Verwendung eines Hundecoronavirusproteins umfassend die Aminosäurereste 1 bis 1452 des S-Proteins von Hundecoronavirusstamm CCV 1-71, gegebenenfalls fusioniert mit einem ausgewählten Protein zur Herstellung eines Arzneimittels zur Impfung gegen Hundecoronavirusinfektionen oder zu deren Behandlung.

14. Diagnosekit umfassend ein oder mehrere diagnostische Reagenzien ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) einer Sequenz des S-Proteins von Hundecoronavirusstamm CCV 1-71 mit den Aminosäureresten 1 bis 1452 in voller Länge, gegebenenfalls fusioniert mit einem ausgewählten Protein, wobei die Sequenz gegebenenfalls mit einer nachweisbaren Markierung verbunden ist und

b) einer Nucleotidsequenz, die S-Protein von Hundecoronavirusstamm CCV 1-71 codiert, wobei die Nucleotidsequenz gegebenenfalls mit einer nachweisbaren Markierung verbunden ist.

15. Verwendung eines Kits nach Anspruch 14 zur in-vitro- Diagnose von CCV-Infektionen bei Hunden.

16. Verwendung eines Kits nach Anspruch 15, mit dem bei Hunden nachgewiesen wird, ob sie vorher CCV oder einem CCV- Impfstoff ausgesetzt waren.

17. Verwendung eines Kits nach Anspruch 15, wobei die in- vitro-Diagnose zwischen dem Kontakt mit einem Hundecoronavirusstamm CCV 1-71 und einem anderen verwandten Coronavirus differenzieren kann.