DE3856586T2

DE3856586T2 - Respiratory Syncytial-Virus, Impfstoffe und diagnostische Assays

Info

Publication number: DE3856586T2
Application number: DE3856586T
Authority: DE
Inventors: Peter Paradiso; Stephen W. Hildreth; Branda T. Hu; Antonia Martin-Gallardo; Rasappa Arumugham
Original assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Priority date: 1987-09-29
Filing date: 1988-09-29
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2008-09-30
Also published as: AU636838B2; DE3856141D1; DK79190A; EP0390799B1; DE3856586D1; EP0390799A1; DK175500B1; WO1989002935A1; KR960013578B1; BR1101088A; EP0814089B1; DE3856141T2; EP0814089A3; EP0814089A2; DK79190D0; US5223254A; KR890701770A; ATE307827T1; JP3288692B2; JPH03502687A

Description

1. GEBIET DER ERFINDUNG
Respiratory Syncytial(RS)-Virus ist eine Hauptursache einer unteren Atenmwegs-Erkrankung im Säuglings- und frühen Kindheitsalter. Es ist von großem medizinischen und wissenschaftlichem Interesse, sichere und wirksame Impfstoffe gegen dieses Virus herzustellen.
RS-Virus ist ein behülltes RNA-Virus. Die hauptsächlichen äußeren Hüllenproteine, das F-Protein (auch als Fusionsprotein oder Fusionsglykoprotein bekannt) und das G-Protein spielen eine Schlüsselrolle bei einer RS-viralen Infektion, weil gegen diese Proteine gerichtete Antikörper das Virus neutralisieren können.
In dieser Anmeldung ist ein neutralisierendes Epitop an einem viralen Protein ein Epitop, das für die Virusinfektivität wesentlich ist, wie dies durch die Tatsache gezeigt wird, dass ein an das Epitop bindender Antikörper das Virus neutralisiert. Ein Fusionsepitop an einem viralen Protein ist eine Epitop, das für eine Virus-Zellfusion oder eine interzelluläre Verbreitung der Infektion durch Fusion zwischen einer infizierten Zelle und einer nicht infizierten Zelle wesentlich ist, wie dies durch die Tatsache gezeigt wird, dass ein an das Epitop bindender Antikörper die Fusion beseitigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft im wesentlichen reine Polypeptide, wie in den Ansprüchen definiert. Außerdem beschreibt das Patent Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung von mit dem Fusionsprotein von RS-Virus verwandten Polypeptiden. Diese Polypeptide stehen in Relation mit einem neutralisierenden Epitop oder einem Fusionsepitop oder beiden des Fusionsproteins und können als Immunogene in Impfstoff-Formulierungen, die mehrwertige Impfstoffe für eine aktive Immunisierung und zur Ausbildung von Antikörpern zur Verwendung in einer passiven Immunisierung sowie als Reagenzien für die diagnostische Tests verwendet werden.
Die in Relation zu einem neutralisierenden Epitop, einem Fusionsepitop oder beiden stehenden neuen Polypeptide können durch Anwenden von rekombinanten DNA- oder chemischen Synthesemethoden erhalten werden. Zusätzlich werden auch DNA-Sequenzen und Vektoren, die zur Expression von mit RS-Virus in Relation stehenden Polypeptiden und Zellen, die die neuen DNA-Sequenzen und Vektoren beherbergen, beschrieben.
Es ist festzustellen, dass ein Epitop eine dreidimensionale Struktur ist, die durch eine molekulare Anordnung eines zugrundeliegenden molekularen Gebildes ausgebildet wurde. In der vorliegenden Erfindung sind die zugrundeliegenden molekularen Gebilde Polypeptide. Es ist allgemein bekannt, dass die strukturellen Eigenschaften von Polypeptiden, von denen die dreidimensionale Konfiguration eine ist, durch die Einführung einer geringen Zahl von Modifikationen, wie z.B. Substitutionen, Insertionen und Deletionen, einer oder mehrerer Aminosäuren nur geringfügig verändert werden können. Im allgemeinen liegen solche Substitutionen in der Aminosäure-Sequenz eines Polypeptids in einer Menge von weniger als 20%, noch üblicher von weniger als 10%, vor. Im allgemeinen ist es wenig wahrscheinlich, dass konservative Substitutionen signifikantere strukturelle Veränderungen als nicht konservative Substitutionen hervorrufen, die ihrerseits wieder signifikante strukturelle Veränderungen weniger wahrscheinlich bewirken als Insertionen oder Deletionen. Beispiele für konservative Substitutionen sind Glycin für Alanin; Valin für Isoleuchin; Asparaginsäure für Glutaminsäure; Asparagin für Glutamin; Serin für Threonin; Lysin für Arginin; Phenylalanin für Threonin; und umgekehrt. Es ist deshalb zu verstehen, dass die vorliegende Erfindung modifizierte Polypeptide umfasst, solange das Epitop unverändert ist.
Es ist ebenfalls allgemein bekannt, dass virale Epitope Stamm-zu-Stamm-Veränderungen zeigen können. Eine Einstellung durch die vorstehend angegebenen Modifikationen kann tatsächlich vorteilhaft verwendet werden.
Schließlich können die in Relation zum Fusionsprotein stehenden erfindungsgemäßen Polypeptide, wie die Bonafide-Viral-Proteine, markiert oder unmarkiert, an eine Oberfläche gebunden, mit einem Träger konjugiert und dergleichen, abhängig von der Verwendung, zu der sie verwendet werden, sein.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die WO-A-8704185 beschreibt DNA-Sequenzen, die für RSV-Proteine, wie z.B. F- und G-Glykoproteine, kodieren.
2.1. RESPIRATORY SYNCYTIAL-VIRUS BEI ERKRANKUNG
RS-Virus ist eine Hauptursache für eine untere Atemwegs-Erkrankung im Säuglings- und frühen Kindheitsalter (McIntosh und Chanock, 1985, in Virology, Fields, B. (Hg.), Raven, NY, S. 1285–1304). In allen geographischen Zonen ist es die Hauptursache von Bronchiolitis und Lungenentzündung bei Säuglingen und Kleinkindern. Das Agens reinfiziert häufig während der Kindheit, aber eine durch eine Reinfektion hervorgerufene Erkrankung ist im allgemeinen milder als eine mit der anfänglichen Infektion verbundene und verursacht selten große Probleme.
RS-Virus ist ein behülltes RNA-Virus der Familie Paramyxoviridae und des Genus Pneumovirus. Die zwei Haupt-Hüllenproteine sind das G-Protein, das für die Anlagerung des Virus an die Wirtszellenmembran verantwortlich ist, und das Fusionsprotein, das verantwortlich ist für die Verschmelzung des Virus und der Zellmembranen. Virus-Zell-Fusion ist eine notwendige Stufe für die Infektion. Fusionsprotein ist auch für eine Zellen-Zell-Fusion erforderlich, die ein weiterer Weg zur Ausbreitung der Infektion von einer infizierten Zelle zu einer nicht infizierten Zelle ist.
Gegen das Fusionsprotein oder gegen das G-Protein gerichtete Antikörper können das Virus neutralisieren. Es können jedoch nur Antikörper für das Fusionsprotein die Verbreitung des Virus zwischen Zellen blockieren, d.h., eine Anti-Fusions-Aktivität aufweisen. Antikörper für das Fusionsprotein schützen deshalb gegen ein zirkulierendes Virus und inhibieren die Ausbreitung zwischen Zellen einer vorhandenen Infektion. Es wurde gefunden, dass Antikörper gegen das Fusionsprotein (polyklonale Antiseren gegen gereinigtes Fusionsprotein und monoklonale Antikörper, die neutralisierende und Anti-Fusions-Aktivität aufweisen) in Tiermodellen gegen Infektion schützen (Walsh et al., 1984, Infect. Immun. 43: 756–758).
2.2. IMMUNOLOGISCHER SCHRITT ZUR VERHÜTUNG EINER RS-VIRUS-INFEKTION
Eine praktische Maßnahme zum Schutz von Säuglingen und Kleinkindern gegen obere und untere Atemswegserkrankungen würde eine Schutzimpfung gegen RS-Virus sein. Die Impfung werdender Mütter (aktive Immunisierung) würde Kleinkinder durch passiven Transfer von Immunität, entweder transplacental oder über die Muttermilch, schützen. Es sind verschiedene Schritte zu einem RS-Virus-Impfstoff möglich, aber einige von ihnen haben sich in der Vergangenheit als erfolglos erwiesen.
Eine Impfung mit getötetem RS-Virus-Impfstoff wurde versucht und als nicht wirksam befunden (Kim et al., 1969, Am. J. Epid. 89: 422). Es wurden nicht nur Kinder nicht geschützt, sondern in einigen Fällen, ergaben nachfolgende Infektionen mit RS-Virus eine atypische und ernstere Erkrankung bei den nicht immunisierten Kontrollen. Dieses Phänomen tritt nicht nur bei RS-Virus auf und wurde auch bei getöteten Paramyxovirus-Impfstoffen, wie z.B. Masern, gefunden. Es wurde angenommen, dass der Grund für das Fehlschlagen des inaktivierten RS-Virus-Impfstoffs in der Vergangenheit auf der Inaktivierung der biologisch funktionellen Epitope an einem oder beiden der viralen Hüllen-Glykoproteine beruhte. Das heißt, die neutralisierenden und Fusionsepitope auf dem abgetöteten Virus-Impfstoff waren "denaturiert". Als Ergebnis empfing das geimpfte Subjekt nicht die biologisch funktionellen neutralisierenden und Fusionsepitope. Wenn das geimpfte Subjekt deshalb einem lebenden Virus ausgesetzt war, ergab die resultierende Antikörper-Antwort keine schützende Immunität. Stattdessen trat eine Antikörper-vermittelte inflammatorische Reaktion auf, die häufig zu einer noch ernsthafteren Erkrankung führte (Choppin und Scheid, 1980, Rev. Inf. Dis., 2: 40–61).
Der zweite Versuch zu einem RS-Virus-Impfstoff war es, den lebenden Virus zu attenuieren. Temperaturempfindliche Mutanten (Wright et al., 1982, Infect. Immun. 37: 397–400) und Passage-attenuiertes Virus (Belshe et al., 1982, J. Inf. Dis. 145: 311–319) haben sich als schwach-infektiös und zur Verhütung einer Erkrankung nicht wirksam erwiesen, wenn sie als Immunogene in RS-Virus-Impfstoffen verwendet wurden. In diesen Fällen trat jedoch keine atypische Erkrankung als Ergebnis der Impfung auf.
Auf der Basis der gegenwärtigen Kenntnis der Struktur von RS-Virus und der Immunantwort gegenüber einer Infektion ist es klar, dass ein brauchbarer Impfstoff gegen dieses Virus wirksam sein muss zur Induzierung der Bildung von Antikörpern gegen das Fusionsprotein und/oder das G-Protein. Von besonderer Bedeutung für eine schützende Immunität ist die Bildung von Antikörpern, die die Fusion inhibieren und deshalb die Ausbreitung von Virus zwischen Zellen in den Atemwegen stoppen können. Zusätzlich kann es hilfreich sein, eine zellvermittelte Immunantwort zu induzieren, einschließlich der Stimulierung von zytotoxischen T-Zellen (CTL), die gegen RS-Virus-infizierte Zellen brauchbar sind. Die verschiedenen Impfstoff-Formulierungen der vorliegenden Erfindung sind darauf gerichtet, dass sie diese beiden Aufgabenstellungen erfüllen.
2.3. REKOMBINANTE DNA-TECHNOLOGIE UND GEN-EXPRESSION
Rekombinante DNA-Technologie umfasst die Insertion von spezifischen DNA-Sequenzen in einen DNA-Träger (Vektor), um ein rekombinantes DNA-Molekül auszubilden, das dazu fähig ist, in einer Wirtszelle repliziert zu werden. Im allgemeinen, aber nicht notwendigerweise, ist die insertierte DNA-Sequenz zum Rezeptor-DNA-Träger fremd, d.h., die insertierte DNA-Sequenz und der DNA-Vektor sind von Organismen abgeleitet, die keine genetische Information austauschen, die in der Natur oder in der insertierten DNA-Sequenz Information umfasst, die ganz oder teilweise künstlich sein kann. Es sind verschiedene allgemeine Methoden entwickelt worden, die die Konstruktion von rekombinanten DNA-Molekülen ermöglichen. US-Patent Nr. 4 237 224 (Cohen und Boyer) beschreibt z.B. die Herstellung solcher rekombinanter Plasmide unter Verwendung von Verfahren zur Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen und Verbinden der DNA-Stücke mittels bekannter Ligationsverfahren.
Diese rekombinanten Plasmide werden dann mittels Transformation eingeführt und in einzelligen Kulturen, die prokaryotische Organismen und in der Gewebskultur gewachsene eukaryotische Zellen umfassen, repliziert. Eine andere Methode zur Einführung von rekombinanten DNA-Molekülen in einzellige Organismen wird von Collins und Hohn im US-Patent Nr. 4 304 863 beschrieben. Diese Methode wendet ein Verpackungs-, Transduktions-System mit Bakteriophagen-Vektoren (Cosmiden) an.
DNA-Sequenzen können auch in Viren, z.B. Vaccinia-Virus, insertiert werden. Solche rekombinanten Viren können z.B. durch Transfektion von Plasmiden in mit Virus infizierten Zellen gebildet werden (Chakrabarti et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 3403–3409).
Unabhängig von der für die Konstruktion verwendeten Methode ist das rekombinante DNA-Molekül vorzugsweise mit der Wirtszelle kompatibel, d.h., dazu fähig, in der Wirtszelle entweder als Teil der Wirtschromosomen oder als extrachromosomales Element repliziert zu werden. Das rekombinante DNA-Molekül oder rekombinante Virus weist vorzugsweise eine Marker-Funktion auf, die die Selektion des (der) gewünschten rekombinanten DNA-Moleküls (Moleküle) oder Virus (Viren) ermöglicht. Wenn alle geeigneten Replikations-, Transkriptions- und Translationssignale am rekombinanten DNA-Molekül korrekt angeordnet sind, wird das fremde Gen zusätzlich in den transformierten oder transfizierten Wirtszellen geeignet exprimiert.
Verschiedene genetische Signale und Prozessergebnisse kontrollieren die Gen-Expression an verschiedenen Stufen. Die DNA-Transkription ist z.B. eine Stufe, und eine Messenger-RNA(mRNA)-Translation eine andere. Die Transkription von DNA ist vom Vorhandensein eines Promotors abhängig, der eine DNA-Sequenz ist, die die Bindung von RNA-Polymerase lenkt und dadurch die RNA-Synthese fördert. Die DNA-Sequenzen von eukaryotischen Promotoren unterscheiden sich von denen von prokaryotischen Promotoren. Außerdem könnten eukaryotische Promotoren und begleitende genetische Signale in einem prokaryotischen System nicht erkannt werden oder nicht funktionieren.
Auf ähnliche Weise hängt die Translation von mRNA in Prokaryoten von der Gegenwart geeigneter prokaryotischer Signale ab, die sich von denen von Eukaryoten unterscheiden. Eine effiziente Translation von mRNA in Prokaryoten erfordert eine Ribosomen-Bindungsstelle, bezeichnet als Shine-Dalgarno(SD)-Sequenz, auf der mRNA. Für ein Review zur Gen-Expressionsmaximierung, siehe Roberst und Lauer, 1979, Methods in Enzymology 68: 473.
Selbst nach Insertion und geeigneter Positionierung von geeigneten Signalen komplizieren viele andere Faktoren die Expression fremder Gene in Prokaryoten. Ein solcher Faktor ist die Gegenwart eines aktiven proteolytischen Systems in E. coli und anderen Baktieren. Dieses Protein-abbauende System scheint fremde Proteine selektiv zu zerstören. Deshalb würde durch die Entwicklung eines Mittels zum Schutz von in Bakterien exprimierten eukaryotischen Proteinen vor einem proteolytischen Abbau ein gewaltiger Nutzen geschaffen. Eine Strategie ist es, Hybrid-Gene zu konstruieren, in denen die Fremdsequenz in Phase (d.h., in einem korrekten Leseraster) mit einem prokaryotischen Struktur-Gen ligiert ist. Die Expression dieses Hybrid-Gens ergibt ein rekombinantes Protein-Produkt (ein Protein, das ein Hybrid von prokaryotischen und fremden Aminosäure-Sequenzen ist).
Ähnliche Überlegungen der Gen-Expression in eukaryotischen Systemen wurden diskutiert in Enhancers & Eukaryotic Gene Expression, Gluzman & Shenk (Hg.), Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, 1983, und Eukaryotic Viral Vectors, Gluzman (Hg.), Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, 1982.
Eine erfolgreiche Expression eines klonierten Gens erfordert eine effiziente Transkription von DNA, Translation der mRNA und in einigen Fällen eine post-translationale Modifikation des Proteins. Zur Steigerung der Protein-Produktion aus dem klonierten Gen wurden Expressionsvektoren entwickelt. In Expressionsvektoren wird das klonierte Gen oft in die Nähe eines starken Promotors platziert, der kontrollierbar ist, wodurch eine Transkription, wenn erforderlich, initiiert werden kann. Zellen können auf eine hohe Dichte wachsen gelassen werden, und der Promotor kann dann induziert werden, um die Zahl der Transkripte zu erhöhen. Dies führt bei einer effizienten Translation zu hohen Protein-Ausbeuten. Dies ist ein besonders wertvolles System, wenn das Fremdprotein für die Wirtszelle schädlich ist.
Nur zum Zweck der Illustration werden nachstehend verschiedene rekombinante DNA-Expressionssysteme beschrieben, und diese Beispiele sollen den Rahmen der vorliegenden Erfindung keinesfalls beschränken.
2.3.1. E. COLI ALS EXPRESSIONSVEKTOR
Es sind viele E. coli-Plasmide bekannt und wurden zur Expression von Fremd-Genen verwendet. Aus wirtschaftlichen Gründen wäre es höchst wünschenswert, ein hohes Expressionsniveau zu erhalten. Ein Weg, um große Mengen eines bestimmten Genproduktes zu erhalten, ist es, ein Gen an einem Plasmid zu klonen, das innerhalb der Bakterienzelle eine sehr hohe Zahl von Kopien aufweist. Durch Erhöhen der Zahl von Kopien eines bestimmten Gens steigen normalerweise auch die mRNA-Ausbeuten, was wieder zu einer erhöhten Produktion des gewünschten Proteins führt.
2.3.2. VACCINIA-VIRUS ALS EXPRESSIONSVEKTOR
Vaccinia-Virus kann als Klonier- und Expressionsvektor verwendet werden. Das Virus enthält ein lineares doppelsträngiges DNA-Genom von ca. 187 kb-Paaren und repliziert innerhalb des Zytoplasmas infizierter Zellen. Diese Viren enthalten ein vollständiges Transkriptionsenzym-System (einschließlich von Capping-, Methylierungs- und Polyadenylierungsenzymen) innerhalb des Viruskerns. Dieses System ist für eine Virus-Infektivität notwendig, weil Vaccinia-Virus-Transkriptionsregulations-Sequenzen (Promotoren) eine Initiierung der Transkription durch Vaccinia-RNA-Polymerase ermöglichen, aber nicht durch zelluläre RNA-Polymerase.
Die Expression von Fremd-DNA in rekombinanten Viren erfordert die Fusion von Vaccinia-Promotoren zu Protein-kodierenden Sequenzen des Fremd-Gens. Plasmid-Vektoren, auch Insertionsvektoren genannt, wurden konstruiert, um das chimäre Gen in Vaccinia-Virus zu insertieren. Ein Typ des Insertionsvektors umfasst: (1) einen Vaccinia-Virus-Promotor, einschließlich der Transkriptions-Initiierungsstelle; (2) mehrere unikale Restriktionsendonuclease-Klonierungsstellen stromabwärts von der Transkriptions-Startstelle zur Insertion von Fremd-DNA-Fragmenten; (3) nicht-essentielle Vaccinia-Virus-DNA (wie z.B. das Thymidin-Kinase-Gen), das den Promotor flankiert und Klonungsstellen mit direkter Insertion des chimären Gens in die homologe nicht-essentielle Region des Virus-Genoms; und (4) einen bakteriellen Replikationsursprung und antibiotischen Resistenzmarker zur Replikation und Selektion in E. coli. Beispiele solcher Vektoren werden von MacKett (1984, J. Virol. 49: 857–864) beschrieben.
Rekombinante Viren werden durch Transfektion von rekombinanten bakteriellen Insertionsvektoren, die das Fremd-Gen enthalten, in mit Vaccinia-Virus infizierte Zellen gebildet. Innerhalb der infizierten Zellen findet homologe Rekombination statt und führt zur Insertion von Fremd-Gen in das virale Genom. Immunologische Techniken, DNA-Plaque-Hybridisierung oder genetische Selektion können verwendet werden, um das gewünschte rekombinante Virus zu identifizieren und zu isolieren. Diese Vakzina-Rekombinanten behalten die für eine Infektivität essentiellen Funktionen und können so konstruiert werden, dass sie bis zu ca. 35 kb der Fremd-DNA aufnehmen.
Die Expression eines Fremd-Gens kann mittels enzymatischer oder immunologischer Assays (z.B. Immuopräzipitation, Enzym-Linked Immunosorbent-Assay (ELISA), Radioimmunoassay oder Immunoblotting) bestimmt werden. Zusätzlich werden natürlich auftretende, von rekombinanten Vaccinia-infizierten Zellen erzeugte Membran-Glykoproteine glykolysiert und können zur Zelloberfläche transportiert werden. Hohe Expressionsausbeuten können erhalten werden unter Verwendung starker Promotoren oder Klonieren von mehreren Kopien eines Einzel-Gens.
2.3.3. BACULOVIRUS ALS EXPRESSIONSVEKTOR
Ein Baculovirus, wie z.B. Autographica californica nuclear polyhedris Virus (AcNPV) wurde ebenfalls als Klonier- oder Expressionsvektor verwendet. Die infektiöse Form von AcNPV wird normalerweise in einer viralen Okklusion gefunden. Diese Struktur setzt sich überwiegend aus Polyhedrinpolypeptid, in dem Virusteilchen eingebettet sind, zusammen. Polyhedrin-Genexpression tritt im Infektionszyklus sehr spät auf, nachdem reife Virusteilchen gebildet sind. Polyhedrin-Genexpression ist deshalb eine entbehrliche Funktion, d.h., in Abwesenheit von Polyhedrin-Genexpression gebildete nicht-okkuldierte Virusteilchen sind voll aktiv und dazu fähig, Zellen in Kultur zu infizieren. Gemäß der europäischen Patentanmeldung Serial No. 84105841.5 (Smith et al.) kann ein rekombinanter Baculovirus-Expressionsvektor in zwei Stufen hergestellt werden. Zuerst wird Baculovirus-DNA gespalten, um ein Fragment zu bilden, das ein Polyhedrin-Gen oder einen Teil davon enthält, und dieses Fragment wird in einen Klonierungsträger insertiert. Das zu exprimierende Gen wird ebenfalls in den Klonierungsträger insertiert; und es wird so insertiert, dass es unter Kontrolle des Polyhedrin-Genpromotors ist. Dieses rekombinante Molekül wird rekombinanter Transfervektor genannt. Normalerweise wird der rekombinante Transfervektor in geeigneten Wirtszellen amplifiziert. Zweitens wird der auf diese Weise gebildete rekombinante Transfervektor mit Baculovirus-Helfer-DNA gemischt und verwendet, um Insektenzellen in Kultur zu transfizieren, um eine Rekombination und den Einbau des klonierten Gens am Ort des Polyhedrin-Gens des Baculovirus- Genoms zu bewirken. Das resultierende rekombinante Baculovirus wird verwendet, um empfängliche Insekten oder kultuvierte Insektenzellen zu infizieren.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die in den Ansprüchen definierten Polypeptide.
Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide, die mit einem neutralisierenden Epitop, einem Fusionsepitop oder beiden, des Fusionsproteins des respiratorischen RS-Virus in Relation stehen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können als Subunit-Impfstoff-Formulierungen für RS-Virus oder als Reagentien in diagnostischen Immunoassays auf RS-Virus verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken hergestellt oder durch chemische Methoden synthetisiert werden.
Das vorliegende Patent beschreibt auch Verfahren zum molekularen Klonen von und die Expression von Genen oder Gen-Fragmenten, die ein neutralisierendes oder Fusionsepitop oder beide von RS-Virus-Fusionsprotein kodieren.
Rekombinante Viren oder Zellextrakte, die die erfindungsgemäßen Polypeptide aufweisen, können auch als Immunogene in viralen Impfstoff-Formulierungen verwendet werden. Da ein Fusions- oder neutralisierendes Epitop eines Virus im Wirtstier als "fremd" erkannt wird, werden humorale und zellvermittelte Immunantworten gegen das (die) Epitop(e) induziert. In einer geeignet hergestellt Impfstoff-Formulierung sollte dies den Wirt gegen eine nachfolgende RS-Virus-Infektion schützen.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch als Reagentien in Immunassays, wie z.B. ELISA-Tests und Radioimmunoassays, zur Bestimmung von RS-Virus-, Infektionen in Blutproben, Körperflüssigkeiten, Geweben usw. verwendet werden.
Die hier beschriebenen Polynucleotid-Sequenzen können auch als Reagentien in Nucleinsäure-Hybridisierungs-Assays verwendet werden, um RS-Virus in Blutproben, Körperflüssigkeiten, Geweben usw. zu bestimmen.
4. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die komplette Nucleotid- und Aminosäure-Sequenz des RS-Virus-Fusionsproteins, wiedergegeben von Collins et al., 1985, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 81: 7683–7687.
2 zeigt das elektrophoretische Verhalten in SDS-Polyacrylamid-Gel von 1 μg des gereinigten RS-Virus-Fusionsproteins unter verschiedenen Bedingungen. In Spur 2 wurde das Protein mit 5% β-Mercaptoethanol reduziert und vor der Elektrophorese auf 100°C erhitzt; in Spur 3 wurde das Protein vor der Elektrophorese auf 100°C erhitzt; in Spur 4 wurde das Protein vor der Elektrophorese nicht erhitzt oder reduziert. Spur 1 weist Standard-Markerproteine auf, dessen Molekulargewichte auf dem linken Rand angezeigt sind. Der rechte Rand zeigt das Molekulargewicht verschiedener Fusionsprotein-Komponenten. Das Gel wurde zur Sichtbarmachung mit Silber angefärbt.
3 zeigt die Positionen der synthetischen Polypeptide 1, 2, 3, 4 und 5 (sp1 bis sp5) an einer linearen Karte der F₁-Untereinheit. Die F₁-Untereinheit umfasst Aminosäuren 137–574. Die 3 zeigt auch die exakte Aminosäure-Sequenz der synthetischen Polypeptide.
4 zeigt die Positionen der proteolytischen Fragmente des Fusionsproteins an einer linearen Karte der F₁-Untereinheit.
5 ist ein Diagramm eines E. coli-rekombinanten Vektors, der die vollständige Nucleotid-Sequenz des RS-Virus-Fusionsprotein-Gens aufweist.
6 zeigt die Amino- und Carboxy-terminalen Sequenzen verschiedener in E. coli exprimierter rekombinanter Proteine.
7 zeigt die Positionen der rekombinanten Proteine auf einer linearen Karte der F₁-Untereinheit. Die in schraffierten Balken dargestellten Fragmente waren mit dem L4-monoklonalen Antikörper reaktiv, und die in gefüllten Balken dargestellten waren mit dem L4-monoklonalen Antikörper nicht reaktiv.
8 veranschaulicht ein Dot-Blot-Autoradiogramm der vier (4) der durch die am linken Rand angegebenen Aminosäure-Ketten definierten synthetischen Polypeptide. Die Spuren 1 bis 4 enthalten 20 μg, 15 μg, 10 μg bzw. 5 μg des Peptids. Die Spur 5 enthält eine positive Fusionsprotein-Kontrolle. Der Blot wurde mit dem L4-monoklonalen Antikörper und dann mit ¹²⁵Iod-Protein A reagieren gelassen.
5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Nach der vorliegenden Erfindung wurde eine Region des RS-Virus-Fusionsproteins, das ein neutralisierendes und Fusionsepitop[e] definiert, identifiziert. Es werden eine Methode zur Herstellung neuer Proteine, Polypeptide und Peptide, die ein Epitop[e] aufweisen, und die Polynucleotid-Sequenzen, die solche neuen Proteine und Polypeptide kodieren, beschrieben.
Das Fusionsprotein des RS-Virus hat ein Molekulargewicht von 70.000 Dalton, gemessen mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Das aus 574 Aminosäure-Resten bestehende primäre (cistronische) Translationsprodukt wird synthetisiert und dann durch enzymatische Spaltung an einer Trypsin-empfindlichen Stelle verarbeitet, und ergibt zwei mit F₁ (Aminosäuren 137– 574) und F₂ (Aminosäuren 1–136) bezeichnete Untereinheiten.
Die vollständige Nucleotid-Sequenz des Fusionsprotein-Gens aus dem A2-Stamm von RS-Virus (Collins et al., 1984, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 81: 7683–7687), das das Fusionsprotein mit 574 Aminosäuren kodiert, wird in 1 veranschaulicht. Das in 1 angegebene Bezifferungssystem wird in der gesamten Anmeldung verwendet. Die F₁ (scheinbares Molekulargewicht: 48.000 Dalton) und F₂ (scheinbares Molekulargewicht: 23.000 Dalton)-Untereinheiten werden über eine Disulfidbindung verbunden und bilden ein Protein, das mit F_1,2 (scheinbares Molekulargewicht ca. 70.000 Dalton) bezeichnet wird. Wenn es aus dem RS-Virus oder infizierten Zellen gereinigt wird, existiert das native Fusionsprotein überwiegend als Dimer (scheinbares Molekulargewicht: 140.000 Dalton). Die dimere Form ist die am meisten immunogene Form des RS-Virus-Fusionsproteins.
2 zeigt die elektrophoretische Beweglichkeit verschiedener Fusionsprotein-Komponenten unter Verwendung von SDS-PAGE. In Spur 2 wurde das Protein vor der Elektrophorese mit 5% β-Mercaptoethanol reduziert und auf 100°C erhitzt; in Spur 3 wurde das Protein vor der Elektrophorese auf 100°C erhitzt; in Spur 4 wurde das Protein vor der Elektrophorese nicht erhitzt oder reduziert. Spur 1 enthält Standard-Markerproteine, dessen Molekulargewichte auf dem linken Rand angegeben sind. Der rechte Rand zeigt das Molekulargewicht der verschiedenen Fusionsprotein-Komponenten. Das Gel wurde zur Sichtbarmachung mit Silber angefärbt (Morrissey, 1981, Anal. Biochem. 117: 307–310).
Ein monoklonaler Antikörper gegen das Fusionsprotein, als L4 bezeichnet (Walsh und Hruska, 1983, J. Virol. 47: 171–177), ist dazu fähig, RS-Virus zu neutralisieren und eine Fusion zu inhibieren. Es scheint deshalb, dass dieser Antikörper mit einem Epitop am Fusionsprotein reagiert, das für die Infektivität und die Fusionsfunktion des Fusionsproteins essentiell ist, d.h., dieser Antikörper reagiert mit einem Fusionsepitop und einem neutralisierenden Epitop. Darüber hinaus schützt ein passiver Transfer des L4-monoklonalen Antikörpers Baumwollratten (cotton rats) vor einer Virusinfektion in ihren Lungen (Walsh et al., 1984, Infect. Immun., 43: 756–758).
Zusätzlich zum L4-Typ-Antifusions-neutralisierenden Epitop gibt es ein weiteres Antifusions-neutralisierendes Epitop des Fusionsproteins, das konformationell abhängig sein dürfte. Dieses Epitop wird durch den monoklonalen Antikörper A5 (Walsh et al., 1986, J. Gen. Virol., 67: 505–513) erkannt. Die Reaktivität dieses Antikörpers scheint von der nativen Konformation des Fusionsproteins abhängig zu sein. Wenn die Konformation des Fusionsproteins entweder durch Hitzebehandlung oder durch Hitzebehandlung und Reduktion der Disulfidbindungen verändert wird, wird das A5-Typ-Epitop zerstört. In den vorliegenden Studien wurde die Rolle der L4-Typ- und A5-Typ-Epitope des RS-Virus-Fusionsproteins für die Formulierung des Proteins als wirksamer Impfstoff untersucht. Die Ergebnisse eines kompetitiven ELISA zeigen, dass ein Drittel des Fusionsprotein-spezifischen Antikörpers in erwachsenen Menschen, die sich von einer natürlichen RS-Infektion erholen, gegen entweder durch L4 oder A5 erkannte Epitope gerichtet ist. Die Impfung mit gereinigtem F-Protein ruft eine Reaktion hervor, die zu 80% mit einer Kombination von L4 und A5 blockiert werden kann. Eine kompetitive Bindung an das F-Protein zeigt, dass diese Epitope um 40% überlappen. Auf der Basis dieser Untersuchungen scheint es, dass die funktionellen Antifusions-neutralisierenden Epitope in zwei Kategorien klassifiziert werden können, in L4-Typ und A5-Typ.
5.1. IDENTIFIZIERUNG VON NEUTRALISIERIENDEM[N] UND/ODER FUSIONSEPITOP[EN] VON RS-VIRUS-FUSIONSPROTEIN
Nach der vorliegenden Erfindung wurde die Region des RS-Virus-Fusionsproteins, die ein Epitop ist, das für die Bildung von neutralisierenden und Antifusions-Antikörpern verantwortlich ist, nun bestimmt. Diese Region wurde mittels drei Methoden definiert. Die erste Methode verwendet eine definierte proteolytische Spaltung des nativen Proteins. Die zweite Methode betrifft das Klonieren und Exprimieren von Fragmenten des Fusionsprotein-Gens, z.B. in E. coli. Die dritte betrifft die Synthese synthetischer Polypeptide, die an neutralisierende und Antifusions-Antikörper binden. In allen drei Methoden wurde die Reaktivität mit dem L4-monoklonalen Antikörper verwendet, um gewünschte Fragmente zu identifizie ren. Irgendein anderer monoklonaler Antikörper, der dazu fähig ist, zu neutralisieren und die Fusion von RS-Virus zu verhindern, kann verwendet werden.
5.1.1. MAPPING (KARTIERUNG) DURCH DEFINIERTE PROTEOLYTISCHE SPALTUNG
Der L4-monoklonale Antikörper wurde auf seine Fähigkeit, an die Fusionsprotein-Untereinheit (F₁ und F₂) zu binden, mittels Protein-Immunoblotting(Western-Blot)-Analyse untersucht. Unter Verwendung von Western-Blot, wie in Abschnitt 8.1., unten, beschrieben, war der L4-monoklonale Antikörper fähig, nur an die F₁-Untereinheit zu binden. Zusätzlich wurde gezeigt, dass der L4-monoklonale Antikörper an Serotyp-B-Virus (Anderson et al., 1985, J. Inf. Dis., 151: 623–33), definiert durch den Prototyp-Virus bezeichneten Stamm 18537, bindet.
Um die F₁-Untereinheit zu kartieren, werden synthetische Polypeptide hergestellt, die verschiedenen Regionen entlang der F₁-Untereinheit entsprechen. Diese synthetischen Polypeptide werden an ein Trägerprotein gekuppelt, wie z.B. ein Keyhole-Lympet-Hemocyanin (KLH), und dann getrennt verwendet, um Kaninchen zu immunisieren (siehe den Abschnitt 6, unten). In dem in Abschnitt 6 gezeigten besonderen Beispiel wurden fünf Antiseren (anti-sp1 bis anti-sp5) erhalten. Jedes in dem Kaninchen produzierte Antiserum reagierte mit dem dem Immunogen, das das Antiserum induzierte, entsprechenden synthetischen Polypeptid, d.h., anti-sp1 reagierte mit sp1; anti-sp2 reagierte mit sp2 usw. Alle fünf Antiseren reagierten mit der F₁-Untereinheit des Fusionsproteins.
Das gereinigte Fusionsprotein wird dann einer proteolytischen Spaltung unter einer Vielzahl von Bedingungen (siehe Abschnitt 6, unten) unterworfen. In dem in Abschnitt 6, unten, angegebenen Beispiel waren die verwendeten Proteasen (1) Trypsin, das spezifisch nach Lysin- und Arginin-Resten spaltet, (2) Endoproteinase Arg-C, das spezifisch nach Arginin-Resten spaltet, und (3) Endoproteinase Lys-C, das spezifisch nach Lysin-Resten spaltet. Die Spaltung nach einem Rest bedeutet die Spaltung einer Peptidbindung am Carboxylende des Restes. Es ist verständlich, dass andere Kombinationen von Proteasen verwendet werden können. Die gezeigte Kombination ist deshalb keine Beschränkung der vorliegenden Erfindung.
Die Spaltungen werden auch in Gegenwart und Abwesenheit des L4-monoklonalen Antikörpers durchgeführt. Die gespaltenen Protein-Fragmente werden mittels SDS-PAGE getrennt, und die Spaltungsprodukte mittels Western-Blot auf die Fähigkeit analysiert, an den L4-monoklonalen Antikörper sowie die antisynthetisches Polypeptid-Antikörper zu binden (siehe eine beispielhafte Veranschaulichung, Abschnitt 6.2., unten). Die Positionen der proteolytischen Fragmente innerhalb der Fusionsprotein-Sequenz werden von den Reaktivitäten dieser Spaltungsfragmente mit jedem der anti-synthetisches Polypeptid-Antiseren abgeleitet. Wie z.B. in Abschnitt 6.2. veranschaulicht, wird erwartet, dass ein durch Trypsin-Digestion gebildetes Spaltungsfragment, das mit anti-sp1 reagierte, Aminosäuren 155–169 aufweist. Das Fragment muss außerdem Arginin oder Lysin an seinem Carboxylende aufweisen und einen N-terminalen Rest, der einem Lysin oder Arginin in der Sequenz der 1 folgt. Schließlich kann das Molekulargewicht eines Fragments durch seine Mobilität in SDS-PAGE bestimmt werden. Diese Information sagt voraus, dass das durch Trypsin-Digestion gebildete 28.000 Dalton-Fragment, das mit anti-sp1 reaktiv ist, die Amino säuren 137–394 des F₁-Polypeptids überspannt. Die Positionen der anderen Spaltungsfragmente werden auf ähnliche Weise abgeleitet.
Die Relation zwischen den Positionen der Spaltungsfragmente und den Reaktivitäten dieser Fragmente gegenüber dem L4-monoklonalen Antikörper werden analysiert. Aus dem in Abschnitt 6.2. angegebenen Beispiel ist leicht ersichtlich, dass die Aminosäuren 283–327 die Region definieren, die allen der L4-positiven Fragmente gemeinsam ist und allen L4-negativen Fragmenten fehlt. Diese Region umfasst deshalb ein Virus-neutralisierendes und/oder Antifusionsepitop des durch den L4-monoklonalen Antikörper definierten RS-Virus.
5.1.2. KLONIEREN UND EXPRIMIEREN VON FRAGMENTEN DES FUSIONSPROTEINS
Die in 1 veranschaulichte cDNA, die die vollständige Nucleotid-Sequenz des Fusionsprotein-Gens aufweist, wird in einen Kloniervektor, wie z.B. E. coli-Plasmidvektor pBR322, kloniert. Aufgrund der Degeneration der Nucleotid-kodierenden Sequenzen können auch andere Sequenzen, die im wesentlichen die gleiche Aminosäure-Sequenz, wie in 1 gezeigt, kodieren, verwendet werden. Diese umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, Nucleotid-Sequenzen, die alle oder Teile der in 1 dargestellten Fusionsprotein-Nucleotid-Sequenzen aufweisen, die durch die Substitution verschiedener Codons, die den gleichen oder einen funktionell äquivalenten Aminosäure-Rest innerhalb der Sequenz (z.B. eine Aminosäure der gleichen Polarität) kodieren, und so eine Silent-Mutation bilden.
Regionen des Fusionsprotein-Gens werden aus dem Kloniervektor durch Restriktionsendonuclease-Digestion ausgeschnitten und in einen kompatiblen Expressionsvektor ligiert (siehe unten). In dem in Abschnitt 6.2., unten, beschriebenen experimentellen Beispiel wurde der E. coli-Expressionsvektor pUC19 (Yanish-Perron et al., 1985, Gene 33: 103–19) verwendet. Die exprimierten rekombinanten Proteine werden auf ihre Reaktivität zuerst mit polyklonalem Kaninchen-Antiserum gegen natives Fusionsprotein gescreent, um rekombinante Fragmente zu identifizieren, und dann mit L4-monoklonalem Antikörper, um solche Fragmente zu identifizieren, die das neutralisierende und AntiFusionsepitop aufweisen. Wie in Abschnitt 6.3. veranschaulicht, wird die allen der rekombinanten Proteine, die mit dem L4-monoklonalen Antikörper reaktiv sind, gemeinsame RS-Virus-Fusionsprotein-Sequenz durch die Aminosäure-Reste 253–298 definiert.
5.1.3. SYNTHESE VON ANTIGENEN PEPTIDEN
Um die Identität des wie vorstehend beschrieben identifizierten neutralisierenden und AntiFusionsepitops zu bestätigen, können synthetische Polypeptide, die im wesentlichen den Aminosäure-Resten 299–315; 294–315; 289–315 und 283–315 des RS-Virus-Fusionsproteins entsprechen, hergestellt werden. Diese Peptide werden auf die Reakivität mit L4-monoklonalem Antikörper analysiert. Wie in Abschnitt 6.4., unten, veranschaulicht, reagieren Polypeptide, die die Reste 294–315; 289–315 und 283–315 aufweisen, mit L4 positiv, während Peptide 299–315 dies nicht tun. Dies zeigt an, dass ein neutralisierendes und Fusionsepitop zwischen den Resten 283–298 liegt und so klein sein kann wie die Reste 294–299.
5.2. HERSTELLUNG VON PROTEINEN, POLYPEPTIDEN UND PEPTIDEN, DIE MIT RS-VIRUS-FUSIONSPROTEIN IN RELATION STEHEN
Die Polypeptide und Peptide der vorliegenden Erfindung können auf eine große Vielzahl von Wegen hergestellt werden. Die Polypeptide können aufgrund ihrer relativ kurzen Größe in Lösung oder auf einem festen Träger nach konventionellen Verfahren synthetisiert werden. Verschiedene automatische Synthesizer sind handelsüblich erhältlich und können gemäß bekannten Protokollen verwendet werden. Siehe z.B. Stewart und Young, 1984, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Aufl., Pierce Chemical Co. Die strukturellen Eigenschaften der Polypeptide, von denen die dreidimensionale Konfiguration eine ist, dürften durch die Einführung einer kleinen Zahl von Modifikationen, wie z.B. Substitutionen, Insertionen und Deletionen einer oder mehrerer Aminosäuren, nur geringfügig verändert werden. Im allgemeinen liegen solche Substitutionen in der Aminosäure-Sequenz eines Polypeptids in einer Menge von weniger als 20%, noch üblicher von weniger als 10%, vor. Im allgemeinen ist es weniger wahrscheinlich, dass konservative Substitutionen signifikante strukturelle Veränderungen als nicht-konservative Substitutionen machen, die ihrerseits weniger wahrscheinlich signifikante strukturelle Veränderungen als Insertionen oder Deletionen hervorrufen. Beispiele für konservative Substitutionen sind Glycin für Alanin; Valin für Isoleucin; Asparaginsäure für Glutaminsäure; Asparagin für Glutamin; Serin für Threonin; Lysin für Arginin; Phenylalanin für Threonin; und umgekehrt. Es ist deshalb verständlich, dass die vorliegende Erfindung modifizierte Polypeptide umfasst, solange das Epitop des RS-Virus-Fusionsproteins unverändert bleibt.
Es ist außerdem allgemein bekannt, dass virale Epitope Stamm-zu-Stamm-Variationen zeigen können. Die Einstellung der vorstehend angegebenen Modifikationen kann tatsächlich vorteilhafterweise angewendet werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können als markierte oder unmarkierte Verbindungen, abhängig von ihrer Verwendung, eingesetzt werden. Unter Markierung wird eine Einheit verstanden, die direkt oder indirekt ein bestimmbares Signal bereitstellt. Verschiedene Marker können verwendet werden, wie z.B. Radionuclide, Enzyme, Fluoreszenzmittel, Chemilumineszenzmittel, Enzymsubstrate, Co-Faktoren oder Inhibitoren, Teilchen (z.B. magnetische Teilchen), Liganden (z.B. Biotin) und Rezeptoren (z.B. Avidin) oder dergleichen. Zusätzlich können die Polypeptide in einer Vielzahl von Wegen zum Binden an eine Oberfläche, z.B. eine Mikrotiterplatte, an Glasperlen, eine chromatographische Oberfläche, z.B. Papier, Cellulose und dergleichen, modifiziert werden. Die besondere Weise, in der die Polypeptide an eine andere Verbindung oder Oberfläche gebunden werden, ist konventionell und wird in der Literatur ausführlich beschrieben. Siehe z.B. US-Patente Nr. 4 371 515, 4 487 715, und die darin zitierten Patente.
Alternativ kann eine rekombinante DNA-Technologie zur biosynthetischen Herstellung der Peptide verwendet werden.
5.3. INSERTION VON RS-VIRUS-FUSIONSPROTEIN-KODIERENDEN SEQUENZEN IN EXPRESSIONSVEKTOREN
Die für das RS-Virus-Fusionsprotein oder einen Teil davon kodierende Nucleotid-Sequenz wird in einen geeigneten Vektor insertiert, d.h., einen Vektor, der die notwendigen Elemente zur Transkription und Translation der insertierten Protein-kodierenden Sequenz enthält. Nach einer im Patent beschriebenen bevorzugten Methode werden Nucleotid-Sequenzen, die für ein neutralisierendes und/oder Fusionsepitop des Fusionsproteins kodieren, in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert. Die kodierende Sequenz kann am 5'- und 3'-Ende oder beiden Enden erweitert werden, um das Polypeptid biosynthetisch zu erweitern, während das Epitop zurückbehalten wird. Die Extension kann einen Arm zum Verbinden, z.B. an einen Marker (siehe unten), an einen Träger oder eine Oberfläche, bereitstellen. Die Erweiterung kann Immunogenizität bereitstellen, die andernfalls in einigen kürzeren Antigen-Polypeptiden der Erfindung fehlen könnten.
Eine Vielzahl von Wirts-Vektorsystemen kann verwendet werden, um die Protein-kodierende Sequenz zu exprimieren. Diese umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, Säugetier-Zellkulturen, wie z.B. Chinese Hamster Ovary-Zell-Wirtkulturen usw.; mit Virus (z.B. Vaccinia-Virus, Adenovirus usw.) infizierte Säugetier-Zellsysteme; mit Virus (z.B. Baculovirus) infizierte Insekten-Zellsysteme; Mikroorganismen, wie z.B. Hefe-Vektoren enthaltende Hefe oder mit Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformierte Baktieren. In einer Ausführungsform kann der Expressionsvektor ein attenuiertes enteroinvasives Bakterium sein, einschließlich aber nicht begrenzt auf Salmonella spp., enteroinvasiven E. coli (EIEC) und Shigella spp. Solche Baktieren können Darmepitelgewebe invasieren, sich über das retikuloendotheliale System verbreiten und Zugang zum mesenterischen Lymphgewebe erhalten, wo sie sich vervielfachen und humorale und zellvermittelte Immunität induzieren. Die Expressionselemente dieser Vektoren variieren in ihrer Stärke und den Spezifizitäten. Abhängig vom verwendeten Wirt-Vektorsystem kann irgendeines einer Anzahl geeigneter Transkriptions- und Translationselemente verwendet werden. Beim Klonieren in Säugetier-Zellsystemen können z.B. Promotoren, die vom Genom von Säugetierzellen (z.B. Maus-Metallothionen-Promotor) oder von Viren, die in diesen Zellen wachsen (z.B. Vaccinia-Virus 7,5 K-Promotor), isoliert sind, verwendet werden. Für eine Transkription der insertierten Sequenzen können auch durch rekombinante DNA oder synthetische Verfahren gebildete Promotoren verwendet werden.
Für eine effiziente Translation von insertierten Protein-kodierenden Sequenzen sind auch spezifische Initiatorsignale erforderlich. Diese Signale weisen ein ATG-Initiationscodon und benachbarte Sequenzen auf. In Fällen, in denen das RS-Virus-Fusionsprotein-Gen, einschließlich seines eigenen Initiationscodons und benachbarter Sequenzen, in die geeigneten Expressionsvektoren insertiert wird, sind keine zusätzlichen Translationskontrollsignale erforderlich. In Fällen, in denen nur ein Teil der RS-Virus-Fusionsprotein-kodierenden Sequenz insertiert wird, müssen jedoch exogene Translationskontrollsignale, einschließlich des ATG-Initiationscodons, bereitgestellt werden. Das Initiationscodon muss außerdem in Phase mit dem Leseraster der Protein-kodierenden Sequenzen sein, um eine Translation des gesamten Inserts sicherzustellen. Diese exogenen Translationskontrollsignale und Initiationscodons können eine vielfältige natürliche und synthetische Abstammung haben.
Irgendeine der früher für die Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor beschriebenen Methoden kann verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die ein chimäres Gen aufweisen, das aus geeigneten Transkriptions/Translations-Kontrollsignalen und den Protein-kodierenden Sequenzen besteht. Diese Methoden können umfassen in vitro-rekombinante DNA- und synthetische Verfahren und in vivo-Rekombinationen (genetische Rekombinationen).
Die hier beschriebenen Methoden sind nicht auf die Verwendung von E. coli oder prokaryotischen Expressionsvektoren beschränkt. Expressionsvektoren, die verwendet werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die folgenden Vektoren oder ihre Derivate: menschliche oder tierische Viren, wie z.B. Vaccinia-Viren oder Adenoviren; Insektenviren, wie z.B. Baculoviren; Hefevektoren; Bakteriophagen-Vektoren und Plasmid- und Cosmid-DNA-Vektoren, um nur einige zu nennen.
In den Fällen, in denen ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, wird das RS-Virus-Fusionsprotein-Gen oder Fragment davon an einen Adenovirus-Transkriptions/Translations-Kontrollkomplex, z.B. den späten Promotor und dreiteilige Leader-Sequenzen, ligiert. Dieses chimäre Gen wird dann mittels in vitro- oder in vivo-Rekombination in das Adenovirus-Genom insertiert. Die Insertion in eine nicht-essentielle Region des viralen Genoms (z.B. Region E1 oder E3) ergibt ein rekombinantes Virus, das lebensfähig ist und zur Expression des in Relation mit dem RS-Virus-Fusionsprotein stehenden Proteins in infizierten Wirten fähig ist. Gegenwärtig existieren zwei Stämme von Adenovirus (Typen 4 und 7), die für Militärpersonen als Impfstoffe genehmigt und verwendet werden. Sie sind erstklassige Kandidaten zur Verwendung als Vektoren zur Expression des RS-Virus-Fusionsproteins.
Zusätzlich kann ein Wirtszellenstamm verwendet werden, der die Expression der insertierten Sequenzen moduliert oder das chimäre Gen-Produkt in die spezifische gewünschte Fassung modifiziert und verarbeitet. Eine Expression von bestimmten Promotoren kann in Gegenwart bestimmter Induktoren (z.B. Zink- oder Cadmiumionen für Metallothionen-Promotoren) verstärkt werden. Die Expression des gentechnisch gebildeten RS-Virus-Fusionsproteins oder eines Fragmentes davon kann deshalb kontrolliert werden. Dies ist von Bedeutung, wenn das Protein-Produkt des klonierten Fremd-Gens gegenüber Wirtzellen letal ist. Außerdem sind Modifikationen (z.B. Glykosylierung) und Verarbeitung (z.B. Spaltung) von Protein-Produkten für die Funktion des Proteins von Bedeutung. Verschiedene Wirtszellen weisen charakteristische und spezifische Mechanismen für die post-translationale Verarbeitung und Modifikation von Proteinen auf. Geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme können ausgewählt werden, um die korrekte Modifikation und Verarbeitung des exprimierten Fremd-Proteins sicherzustellen.
5.4. IDENTIFIZIERUNG VON REKOMBINANTEN EXPRESSIONSVEKTOREN, DIE ZUR REPLIKATION UND EXPRESSION DES INSERTIERTEN GENS FÄHIG SIND
Expressionsvektoren, die Fremd-Gen-Insertionen aufweisen, können mittels dreier allgemeiner Verfahren identifiziert werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung, (b) Vorhandensein oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen und (c) Expression insertierter Sequenzen. In dem ersten Verfahren kann die Gegenwart eines in einen Expressionsvektor insertierten Fremd-Gens bestimmt werden mittels DNA-DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden, die Sequenzen aufweisen, die homolog zum fremden insertierten Gen sind. Im zweiten Verfahren, kann das rekombinante Vektor/Wirt-System auf der Basis der Gegenwart oder Abwesenheit von bestimmten "Marker"-Genfunktionen (z.B. Thymidinkinase-Aktivität, Resistenz gegenüber Antibiotika, Transformations-Pheno-Typ, Okklusionskörperbildung in Bakulovirus usw.), verursacht durch die Insertion von Fremd-Genen im Vektor, identifiziert und selektiert werden. Wenn das RS-Virus-Fusionsprotein-Gen oder Fragment davon z.B. innerhalb der Marker-Gen-Sequenz des Vektors insertiert wird, können Rekombinanten, die das RS-Virus-Fusionsprotein insertiert aufweisen, aufgrund der Abwesenheit der Marker-Gen-Funktion identifiziert werden. Im dritten Verfahren können die rekombinanten Expressionvektoren durch Prüfen des durch den Rekombinanten exprimierten Fremd-Gen-Produktes identifiziert werden. Solche Assays können auf den physikalischen, immunologischen oder funktionellen Eigenschaften des Gen-Produktes basieren.
Wenn das bestimmte rekombinante DNA-Molekül identifiziert und isoliert ist, können, abhängig davon, ob eine solche Rekombinante eine selbst-replizierende Einheit (ein Replikon) bildet, verschiedene Methoden verwendet werden, um es zu vermehren. Eine selbst-replizierende Einheit, z.B. Plasmide, Viren, Zellen usw., können sich selbst in einer geeigneten Zellumgebung und Wachstumsbedingungen vermehren. Rekombinante, denen eine selbst-replizierende Einheit fehlt, müssen in ein Molekül, das eine solche Einheit aufweist, integriert werden, um vermehrt zu werden. Bestimmte Plasmid-Expressionsvektoren müssen z.B. bei der Einführung in eine Wirtszelle in das zelluläre Chromosom integriert werden, um eine Vermehrung und stabile Expression des rekombinanten Gens sicherzustellen. Sobald ein geeignetes Wirtssystem und Wachstumsbedingungen etabliert sind, können rekombinante Expressionsvektoren vermehrt und in Menge hergestellt werden.
5.5 IDENTIFIZIERUNG UND REINIGUNG DES EXPRIMIERTEN GEN-PRODUKTS
Sobald eine Rekombinante, die das RS-Virus-Fusionsprotein-Gen oder ein Fragment exprimiert, identifiziert ist, kann das Gen-Produkt analysiert werden. Dies kann erreicht werden durch Untersuchungen auf der Basis physikalischer, immunologischer oder funktioneller Eigenschaften des Produkts. Eine immunologische Analyse ist insbesondere dann von Bedeutung, wenn das Endziel die Verwendung der Gen-Produkte oder rekombinanten Viren, die solche Produkte exprimieren, in Impfstoff-Formulierungen und/oder als Antigene in diagnostischen Immunoassays ist.
Eine Vielzahl von Antiseren sind zur Analyse der Immunreaktivität des Produktes erhältlich, einschießlich, aber ohne darauf beschränkt zu sein, von L4-monoklonalem Antikörper, A5-monoklonalem Antikörper, polyklonalen Antiseren gegen gereinigtes Fusionsprotein, wie in Abschnitt 6, unten, beschrieben. Das Protein sollte, egal ob es von der Expression der ganzen Gen-Sequenz, einem Teil der Gen-Sequenz oder von zwei oder mehreren Gen-Sequenzen, die ligiert sind, um die Produktion von chimären Proteinen zu lenken, resultiert, immunoreaktiv sein. Diese Reaktivität kann durch immunologische Standardverfahren, wie z.B. Radioimmunoausfällung, Radioimmunokonkurrenz oder Immunoblots, demonstriert werden.
Sobald das RS-Virus-Fusionsprotein identifiziert ist, kann es mittels Standardmethoden, einschließlich von Chromatographie (z.B. Ionenaustausch-, Affinitäts- und Größenbestimmungs-Säulenchromatographie), Zentrifugation, Differentiallöslichkeit oder irgendeine andere Standardmethode zur Reinigung von Proteinen isoliert und gereinigt werden.
5.6. BESTIMMUNG DER IMMUNOPOTENZ DES REKOMBINANTEN PRODUKTES
Die Immunopotenz des RS-Virus-Fusionsproteins kann bestimmt werden, indem man die Immunantwort von Testtieren nach der Immunisierung mit dem gereinigten synthetischen Peptid verfolgt. In Fällen, in denen das RS-Virus-Fusionsprotein durch ein infektiöses rekombinantes Virus exprimiert wird, kann das rekombinante Virus selbst verwendet werden, um Testtiere zu immunosieren. Testtiere können, ohne darauf beschränkt zu sein, umfassen Mäuse, Ratten, Kaninchen, Primaten und gegebenenfalls Menschen. Methoden zur Einführung des Immunogens können umfassen orale, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, intranasale oder andere Standardwege der Immunisierung. Die Immunantwort des Testsubjekts kann durch drei Verfahren analysiert werden: (a) der Reaktivität des resultierenden Immunserums gegenüber authentischen RS-viralen Antigenen, wie z.B. durch bekannte Techniken, z.B. Enzym-Linked Immunosorbant Assay (ELISA), Immunoblotting, Radioimmunoausfällungen usw., untersucht, (b) der Fähigkeit des Immunserums, die Infektivität von RS-Virus in vitro zu neutralisieren, (c) die Fähigkeit des Immunserums, die Virusfusion in vitro zu inhibieren, und (d) Schutz vor RS-Virus-Infektion.
5.7. FORMULIERUNG EINES IMPFSTOFFES
Zur Verabreichung der hier beschriebenen Impfstoff-Formulierungen an ein Tier oder einen Menschen können viele Methoden verwendet werden. Diese umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein: orale, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane und intranasale Verabreichungswege. Die durch das Schleimhaut-assoziierte Lymphgewebe gebildeten sekretorischen IgA-Antikörper können beim Schutz gegen RS-Virusinfektion eine wichtige Rolle spielen, indem sie die anfängliche Wechselwirkung der Pathogene mit der Schleimhautoberfläche verhindern, oder indem sie die bedeutsamen Epitope der Pathogene, die in die Infektion/oder das Verbreiten der Krankheit verwickelt sind, neutralisieren. Eine Stimulierung der Schleimhaut-Immunantworten, einschließlich der Produktion von sekretorischen IgA-Antikörpern, kann von großer Bedeutung sein, um Schutz gegen eine Infektion der oberen und unteren Atemwege zu verleihen. Wenn eine lebendes rekombinantes Virus-Impfstoff-Formulierung verwendet wird, kann sie über den natürlichen Weg der Infektion des Wild-Typ-Muttervirus, das zur Bildung des rekombinanten Virus in der Impfstoff-Formulierung verwendet wurde, verabreicht werden.
5.7.1. UNTEREINHEIT-IMPFSTOFF-FORMULIERUNGEN
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind als Immunogene in einem Untereinheit-Impfstoff zum Schutz gegen Erkrankungssysteme der oberen und unteren Atemwege gegenüber RS-Virus-Infektion geeignet. Untereinheit-Impfstoffe umfassen nur das zur Immunisierung eines Wirts erforderliche relevante immunogene Material. Impfstoffe aus genetisch gebildeten Immunogenen, chemisch synthetisierten Immunogenen und/oder Immunogenen, die authentisches, im wesentlichen reines RS-Virus-Fusionsprotein oder Fragmente davon aufweisen, die zur Bildung einer schutzfähigen Immunantwort fähig sind, sind besonders von Vorteil, weil kein Risiko einer Infektion des Empfängers existiert.
Das RS-Virus-Fusionsprotein und/oder -Polypeptide können aus Rekombinanten gereinigt werden, die die neutralisierenden und/oder Fusionsepitope exprimieren. Solche Rekombinanten umfassen irgendeinen der vorstehend beschriebenen mit den rekombinanten Viren oder kultivierten Säugetierzellen, wie z.B. Chinese Hamster Ovary-Zellen, die die RS-Virus-Fusionsprotein-Epitope exprimieren (siehe Abschnitt 5.3., oben) infizierten bakteriellen Transformanten, Hefe-Transformanten, Kulturzellen. Zusätzlich umfassen die Rekombinanten rekombinante attenuierte enterovasive Bakterien, die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein neutralisierendes und/oder Fusionsepitop von Respiratory Syncytial-Virus-Fusionsprotein kodieren. Diese rekombinanten attenuierten enteroinvasiven Bakterien sind insbesondere für orale Impfstoff-Formulierungen geeignet. Das rekombinante Protein oder die Polypeptide können viele Kopien des Epitops von Interesse umfassen.
Alternativ kann das RS-Virus-Fusionsprotein und/oder Polypeptid chemisch synthetisiert werden (siehe Abschnitt 5.2., oben). In einer weiteren alternativen Ausführungsform kann das in Relation mit dem RS-Virus-Fusionsprotein stehende Protein oder Polypeptid in im wesentlichen reiner Form aus RS-Virus oder Kulturen von mit RS-Virus infizierten Zellen isoliert werden (siehe z.B. Abschnitt 6.1. oder Abschnitt 10., unten).
Unabhängig von der Herstellungsmethode wird das RS-Virus-Fusionsprotein oder -Polypeptid auf eine geeignete Konzentration eingestellt und kann mit irgendeinem geeigneten Impfstoff-Adjuvans formuliert werden. Die Polypeptide können im allgemeinen bei Konzentrationen im Bereich von 0,1 μg bis 100 μg pro kg/Wirt formuliert werden. Physiologisch annehmbare Medien können als Träger verwendet werden. Diese umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein: steriles Wasser, Salzlösung, Phosphat-gepufferte Salzlösung und dergleichen. Geeignete Adjuvantien umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein: oberflächenaktive Substanzen, z.B. Hexadecylamin, Octadecylamin, Octadecylaminsäureester, Lysolecithin, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N,N-Dioctadecyl-N'-N-bis(2-hydroxyethylpropandiamin), Methoxyhexadecylglycerin und pluronische Polyole; Polyamine, z.B. Pyran, Dextransulfat, Poly-IC, Polyacrylsäure, Carbopol; Peptide, wie z.B. Muramyldipeptid, Dimethylglycin, Tuftsin; Ölemulsionen; und Mineralgele, wie z.B. Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat usw. Das Immunogen kann auch in Liposome eingebaut oder mit Polysacchariden und/oder anderen Polymeren zur Verwendung in einer Impfstoff-Formulierung konjugiert sein.
In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung ist das mit dem RS-Virus-Fusionsprotein in Relation stehende Protein oder Polypeptid ein Hapten, d.h., ein Molekül, das antigen ist, indem es spezifisch oder selektiv mit verwandten Antikörpern reagiert, aber in dem Sinne nicht immunogen ist, dass es keine Immunantwort hervorrufen kann. In einem solchen Fall kann das Hapten kovalent an einen Träger oder ein immunogenes Molekül gebunden sein; z.B. wird ein großes Protein, wie z.B. Proteinserumalbumin, die Immunogenizität auf das mit ihm gekuppelte Hapten übertragen. Die Hapten-Trägersubstanz kann zur Verwendung als Untereinheit-Impfstoff formuliert werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können an einen löslichen makromolekularen Träger gebunden, verwendet werden. Vorzugsweise liegen die Träger und die erfindungsgemäßen Polypeptide nach dem Verbinden mit über fünftauschend Dalton vor. Insbesondere liegt der Träger in mehr als fünf Kilodalton vor. Vorzugsweise ist der Träger eine natürliche oder synthetische Polyaminosäure, die in Tieren, ein schließlich Menschen, immunogen ist. Die Art der Verbindung ist eine konventionelle. Viele Verbindungstechniken werden in US-Patent Nr. 4 629 783 beschrieben. Viele Vernetzungsmittel werden in 1986-87 Handbook and General Catalog, Pierce Chemical Company (Rockford, Illinois), Seiten 311 bis 340, beschrieben.
5.7.2. VIRALE IMPFSTOFF-FORMULIERUNGEN
Ebenso beschrieben werden ein lebender rekombinanter viraler Impfstoff oder ein inaktivierter rekombinanter viraler Impfstoff, die verwendet werden, um gegen Infektionen der unteren Atemwege und andere Krankheitssymptome von RS-Virus zu schützen. Dazu werden rekombinante Viren hergestellt, die mit RS-Virus-Fusionsprotein in Relation stehende Epitope exprimieren (siehe Abschnitt 52., oben). Wenn das rekombinante Virus gegenüber dem zu immunisierenden Wirt infektiös ist, aber keine Erkrankung hervorruft, wird ein lebender Impfstoff bevorzugt, weil die Vermehrung im Wirt zu einem verlängerten Stimulus führt, und deshalb eine wesentlich länger andauernde Immunität hervorruft. Das infektiöse rekombinante Virus kann, wenn es in einen Wirt eingeführt wird, das mit dem RS-Virus-Fusionsprotein in Relation stehende Protein oder Polypeptid-Fragment aus seinem chimären Gen exprimieren und deshalb eine Immunantwort gegen RS-Virus-Antigen hervorrufen. In Fällen, in denen eine solche Immunantwort einen Schutz gegen eine nachfolgende RS-Virus-Infektion darstellt, kann das lebende rekombinante Virus selbst als vorbeugender Impfstoff gegen RS-Virus-Infektion verwendet werden. Die Produktion eines solchen rekombinanten Virus kann in vitro-(z.B. Gewebekulturzellen) und in vivo-(z.B. ein natürliches Wirtstier)Systeme umfassen. Konventionelle Methoden zur Herstellung und Formulierung von Pockenimpfstoff können z.B. zur Formulierung von lebendes rekombinantes Virus-Impfstoff, das ein mit einem RS-Virus-Fusionsprotein in Relation stehendes Protein oder Polypeptid exprimiert, angepasst werden. Mehrwertige lebende Virus-Impfstoffe können aus einzelnen oder einigen infektiösen rekombinanten Viren, die Epitope von Organismen exprimieren, die zusätzlich zu den Epitopen des RS-Virus-Fusionsproteins eine Erkrankung verursachen, hergestellt. Ein Vaccinia-Virus kann z.B. ausgebildet werden, um es zusätzlich zu solchen des RS-Virus-Fusionsproteins Sequenzen zu enthalten, die für andere Epitope kodieren. Ein solches rekombinantes Virus selbst kann als Immunogen in einem mehrwertigen Impfstoff verwendet werden. Alternativ kann eine Mischung von Vaccinia- oder anderen Viren, die alle ein verschiedenes Gen, das ein Epitop von RS-Virus-Fusionsprotein und ein Epitop einer anderen Erkrankung, die Organismen hervorruft, exprimiert, in einem mehrwertigen Impfstoff formuliert werden. Egal, ob das rekombinante Virus gegenüber dem zu immunisierenden Wirt infektiös ist oder nicht, kann eine inaktivierte Virus-Impfstoff-Formulierung hergstellt werden. Inaktivierte Impfstoffe sind in dem Sinne, dass ihre Infektivität zerstört wurde, üblicherweise mittels chemischer Behandlung (z.B. Formaldehyd), "tot". Idealerweise wird die Infektivität des Virus ohne Beeinträchtigung der Proteine, die mit der Immunogenizität des Virus in Relation stehen, zerstört. Um inaktivierte Impfstoffe herzustellen, müssen große Mengen des rekombinanten Virus, das das mit dem RS-Virus-Fusionsprotein in Relation stehende Protein oder Polypeptid exprimiert, in Kultur gezüchtet werden, um die notwendige Menge an relevanten Genen bereitzustellen. Eine Mischung aus inaktivierten Viren, die verschiedene Epitope exprimieren, kann zur Formulierung von "mehrwertigen" (multivalenten) Impfstoffen verwendet werden. In bestimm ten Fällen können diese "mehrwertigen" inaktivierten Impfstoffe gegenüber lebenden Impfstoff-Formulierungen aufgrund potentieller Schwierigkeiten mit einer gegenseitigen Beeinflussung von miteinander verabreichten lebenden Viren bevorzugt sein. In jedem Falle sollte das inaktivierte rekombinante Virus oder Mischungen dieser Viren in einem geeigneten Adjuvans formuliert werden, um die immunologische Antwort gegenüber den Antigenen zu verstärken. Geeignete Adjuvantien umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein: oberflächenaktive Substanzen, z.B. Hexadecylamin, Octadecylaminosäureester, Octadecylamin, Lysolecithin, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N,N-Dioctadecyl-N'-N-bis(2-hydroxyethylpropandiamin), Methoxyhexadecylglycerin und pluronische Polyole; Polyamine, z.B. Pyran, Dextransulfat, Poly-IC, Polyacrylsäure, Carbopol; Peptide, wie z.B. Muramyldipeptid, Dimethylglycin, Tuftsin; Ölemulsionen; und Mineralgele, wie z.B. Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat usw.
5.7.3. PASSIVE IMMUNITÄT UND ANTI-IDIOTYPISCHE ANTIKÖRPER
Anstelle einer aktiven Immunisierung mit viralen oder Untereinheit-Impfstoffen ist es möglich, einem Wirt durch Verabreichung eines vorgeformten Antikörpers gegen ein Epitop eines RS-Virus-Fusionsproteins einen kurzzeitigen Schutz zu verleihen. Die Impfstoff-Formulierungen können verwendet werden, um Antikörper zur Verwendung in einer passiven Immunotherapie herzustellen. Menschliches Immunoglobulin ist in der Humanmedizin bevorzugt, weil ein heterologes Immunoglobulin eine Immunantwort gegen seine fremden immunogenen Komponenten hervorrufen kann. Eine solche passive Immunisierung kann auf Notfall-Basis zum sofortigen Schutz von nicht-immunisierten Individuen, die speziellen Risiken ausgesetzt sind, verwendet werden, z.B. für Kleinkinder, die den Kontakt mit RS-Virus-Patienten ausgesetzt sind. Alternativ können diese Antikörper zur Herstellung eines antiidiotypischen Antikörpers verwendet werden, der selbst wieder als Antigen verwendet werden kann, um eine Immunantwort gegen RS-Virus-Fusionsprotein-Epitope zu stimulieren.
5.8. DIAGNOSTISCHE ASSAYS
Ebenfalls beschrieben werden Reagentien zur Verwendung in diagnostischen Assays für die Bestimmung von Antigenen des RS-Virus-Fusionsproteins oder G-Proteins (und damit RS-Virus) oder zur Bestimmung von Antikörpern gegenüber dem RS-Virus-Fusionsprotein oder G-Protein in verschiedenen Körperflüssigkeiten von Individuen, bei denen der Verdacht auf eine RS-Virus-Infektion besteht.
5.8.1. IMMUNOASSAYS
In einer beschriebenen Methode können das RS-Virus-Fusionsprotein oder die Polypeptide und Peptide der vorliegenden Erfindung als Antigene in Immunoassays zur Bestimmung von RS-Virus in verschiedenen Patientengeweben und Körperflüssigkeiten, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, von: Blut, Rückenmarksfluid, Speichel, Nasensekreten, Sekreten der Atemwege usw., verwendet werden.
Die Polypeptide und Peptide der vorliegenden Erfindung können in irgendeinem auf diesem Gebiet bekannten Immunoassay-System verwendet werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt von: Radioimmunoassays, ELISA-Assays, "Sandwich"-Assays, Präzipitinreaktionen, Geldiffusions- Immunodiffusionsassays, Agglutinationsassays, Fluoreszenzimmunoassays, Protein A-Immunoassays und immunoelektrophoretischen Assays, um nur einige zu nennen. Das US-Patent 4 629 783 und die darin zitierten Patente beschreiben auch geeignete Assays.
5.8.2. NUCLEINSÄURE-HYBRIDISIERUNGSASSAY
In einer anderen beschriebenen Methode kann die neue Nucleotid-Sequenz des Gens oder Gen-Fragments, das die RS-Virus-Fusionsprotein-Polypeptide und -Peptide der vorliegenden Erfindung kodiert, als Sonde in Nucleinsäure-Hybridisierungsassays zur Bestimmung von RS-Virus in verschiedenen Körperfluiden von Patienten verwendet werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, von: Blut, Speichel, Nasensekretionen, Sekretionen der Atemwege usw.
Die erfindungsgemäßen Nucleotid-Sequenzen können in irgendeinem auf diesem Gebiet bekannten Nucleinsäure-Hybridisierungsassay-System verwendet werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, von: Southern-Blotting (Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98: 508), Northern-Blotting (Thomas et al., 1980, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77: 5201–05); Kolonie-Blotting (Grunstein et al., 1975, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 72: 3961–65).
Die folgenden Beispiele werden zum Zwecke der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung angegeben, sollen aber keinesfalls den Rahmen der vorliegenden Erfindung beschränken.
6. IDENTIFIZIERUNG VON NEUTRALISIERENDEM(N) UND/ODER FUSIONSEPITOP(EN) VON RS-VIRUS-FUSIONSPROTEIN
6.1. ALLGEMEINE VERFAHREN
Die folgenden Arbeitsprotokolle werden zur Definition eines Epitops von RS-Virus-Fusionsprotein, das neutralisierende und Antifusions-Antikörper hervorruft, verwendet.
6.1.1. PROTEIN-IMMUNOBLOT (WESTERN-BLOT)-ANALYSE
Fusionsprotein-Untereinheiten F₁ und F₂ wurden einer SDS-PAGE unterworfen (Laemmli, 1970, Nature, 227: 680–685). Die aufgetrennten Protein-Untereinheiten im Gel wurden elektrophoretisch auf eine Nitrocellulose-Folie unter Verwendung einer Transferlösung, die 12,1 g Tris-HCl, 56,3 g Glycin, pro 5 Liter enthielt, übertragen. Die Nitrocellulose-Folie wurde an der Luft getrocknet. Die luftgetrocknete Nitrocellulose wurde bei 37°C hinter einander inkubiert mit (i) BLOTTO während 15 min, (ii) BLOTTO, das den L4-monoklonalen Antikörper enthielt, während 15 min, (iii) BLOTTO während 15 min, (iv) BLOTTO, das sekundäres Antiserum enthielt, während 60 min, und (v) BLOTTO während 15 min.
Das an den L4-monoklonalen Antikörper gebundene sekundäre Antiserum wurde entweder mit Meerrettich-Peroxidase markiert oder nicht markiert. Wenn mit Peroxidase markiert, wurde die Antikörperbindung mittels durch enzymatische Reaktion mit 0,05% 4-Chlornaphthol, 0,09% H₂O₂ in Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 6,8, hervorgerufener Farbentwicklung bestimmt. Wenn nicht markiert, wurde die Antikörperbindung mittels Radiographie nach ¹²⁵Iod-Protein-A-Bindung an die Antikörper bestimmt.
6.1.2. KUPPLUNG VON PEPTIDEN AN KEYHOLE-LYMPET-HEMOCYANIN (KLH) UND BILDUNG VON KANINCHEN-ANTISERUM
1 mg/ml KLH-Lösung wurde wie folgt hergestellt: 4 mg eines resuspendierten Ammoniumsulfat-Niederschlags von KLH (der 37 mg Protein/ml enthielt) wurden 5 Minuten lang bei 4°C in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 3 ml 0,1 M NaHCO₃ gelöst. Die Lösung wurde gegen 0,1 M NaHCO₃ mit 2 Wechseln dialysiert. Das Volumen der dialysierten KLH-Lösung wurde zur Herstellung einer 1 mg/ml-KLH-Lösung auf 4 ml eingestellt.
4 μl einer 1 mg/ml-Lösung eines synthetischen Polypeptids wurden zur KLH-Lösung zugegeben und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang gemischt. 4 ml von 25%igem wässerigen Glutaraldehyd wurden zur Mischung zugegeben und weitere 24 Stunden bei Raumtemperatur gemischt. 20 μl von 25%igem wässerigen Glutaraldehyd wurden wieder zur Mischung zugegeben und weitere 72 Stunden bei Raumtemperatur gemischt. Mit Glutaraldehyd vernetztes synthetisches Polypeptid-KLH wurde über Nacht gegen PBS mit verschiedenen Wechseln des Dialysepuffers dialysiert.
Kaninchen wurden mit 250 μg Protein in komplettem Freund'schen Adjuvans immunisiert und in 2-wöchigen Intervallen 2 bis 3 Mal mit 250 μg Protein in unvollständigem Freund'schen Adjuvans verstärkt.
6.1.3. PROTEOLYTISCHE SPALTUNG DES FUSIONSPROTEINS
Trypsin-Digestion ohne L4-Schutz:
Gereinigtes Fusionsprotein in 50 mM Tris, pH 7,1, 0,05% SDS und 0,1% β-Mercaptoethanol wurden 5 Minuten bei 100°C erhitzt. Trypsin wurde zur gekühlten denaturierten Fusionsprotein-Probe zugegeben und bei 37°C während 2 Stunden inkubiert, wobei Enzym/Substrat-Verhältnisse von 1:1000, 1:2500 und 1:5000 verwendet wurden. Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Proteinasen aus einer 1 mg/ml-Vorratslösung zugegeben.
Trypsin-Digestion mit L4-Schutz
Äquimolare Mengen von gereinigtem Fusionsprotein und L4-monoklonalem Antikörper wurden gemischt und 1 Stunde lang auf Eis gestellt. Trypsin wurde zur Mischung in Gegenwart von 50 mM Tris, pH 7,1, zugegeben und bei 37°C während 2 Stunden inkubiert. Es wurde ein Enzym/Substrat-Verhältnis von 1:10 verwendet.
Trypsin/Arg-C-Digestionen mit L4-Schutz:
Äquimolare Mengen von gereinigtem Fusionsprotein und L4-monoklonalem Antikörper wurden gemischt und 1 Stunde auf Eis gestellt. Trypsin-Digestion bei einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1:10 wurde wie in Beispiel 2.2 beschrieben durchgeführt. Das Trypsin-digestierte Fusionsprotein wurde 5 Minuten bei 100°C erhitzt, abgekühlt und weiter mit Arg-C bei einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1:2, 1:5, 1:10 bei 37°C während 2 Stunden digestiert.
Arg-C/Arg-C-Digestionen mit L4-Schutz:
Äquimolare Mengen von gereinigtem Fusionsprotein und L4-monoklonalem Antikörper wurden gemischt und 1 Stunde lang auf Eis gestellt. Eine erste Arg-C-Digestion der Mischung bei einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1:3 wurde in Gegenwart von 20 mM NH₄HCO₃ während 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Dann wurde die Reaktionsmischung durch Zugabe von 2-Mercaptoethanol bis zu einer Endkonzentration von 0,1% reduziert und 5 Minuten bei 100°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde eine zweite Arg-C-Digestion bei einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1:6 während 2 Stunden bei 37°C durchgeführt.
Lys-C/Arg-C-Digestionen mit L4-Schutz:
Es wurde nach dem gleichen Verfahrensprotokoll wie im obigen Beispiel 2.4 gearbeitet, mit der Ausnahme, dass Lys-C bei einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1:2 in der ersten Digestion verwendet wurde.
6.1.4. DOT-BLOT-ANALYSE
Eine Dot-Blot-Analyse wurde mit synthetischen Polypeptiden wie folgt durchgeführt:
Polypeptide (bis zu 20 μg) wurden auf Nitrocellulose-Folien aufgetüpfelt. Die Nitrocellulose-Folie wurde luftgetrocknet. Die luftgetrocknete Nitrocellulose wurde bei 37°C nacheinander inkubiert mit (i) BLOTTO (5% Carnation^TM-Pulvermilch in Phosphat-gepufferten Salzlösung, pH 6,8) während 15 min, (ii) BLOTTO, das den L4-monoklonalen Antikörper enthielt, während 0,25 bis 72 Stunden, (iii) BLOTTO während 15 min, (iv) BLOTTO, das sekundäres Antiserum enthielt, während 60 bis 120 min und (v) BLOTTO während 15 min.
Das an den L4-monoklonalen Antikörper gebundene sekundäre Antiserum wurde entweder mit Meerrettich-Perioxidase markiert oder nicht markiert. Wenn mit Peroxidase markiert, wurde die Antikörperbindung mittels einer durch enzymatische Reaktion mit 0,06% 4-Chlornaphthol, 0,3% H₂O₂ in Phosphatgepufferter Salzlösung, pH 6,8, hervorgerufenen Farbentwicklung bestimmt. Wenn unmarkiert, wurde die Antikörperbindung mittels Autoradiographie nach ¹²⁵Iod-Protein-A-Bindung an die Antikörper bestimmt.
6.2. MAPPING (KARTIERUNG) MITTELS DEFINIERTER PROTEOLYTISCHER SPALTUNG
Um die F₁-Untereinheit des RS-Virus-Fusionsproteins zu kartieren, wurden synthetische Polypeptide hergestellt, die verschiedenen Regionen der F₁-Untereinheit, wie in 3 dargestellt, und als synthetische Polypeptide (sp) sp1 bis sp5 bezeichnet, entsprachen. Diese sp wurden an KLH, wie vorstehend beschrieben, gekuppelt und getrennt verwendet, um Kaninchen zu immunisieren. Fünf entsprechende Kaninchen-Antiseren wurden erhalten, die mit Anti-sp1 bis Anti-sp5 bezeichnet wurden. Alle fünf Antiseren waren mit der F₁-Untereinheit sowie mit dem als Immunogen verwendeten bestimmten sp reaktiv. Das gereinigte RS-Virus-Fusionsprotein wurde dann einer definierten proteolytischen Spaltung, wie im Detail in Abschnitt 6.1.3. beschrieben, unterworfen. Die gespaltenen Protein-Fragmente wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt, um das Molekulargewicht zu bestimmen, und mittels Western-Blot-Analyse auf ihre Fähigkeit, an den L4-monoklonalen Antikörper sowie an die gegen die synthetischen Polypeptide entwickelten Antikörper zu binden, analysiert. Die Position eines bestimmten proteolytischen Fragments innerhalb der Fusionsprotein-Sequenz wurde von den Reaktivitäten mit jedem der Antiseren abgeleitet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 (A–E) angegeben und in 4 zusammengefasst.
Tabelle 1 (A–E) zeigt die durch die fünf proteolytischen Spaltungsverfahren abgeleiteten Fragmente zusammen mit der Reaktivität mit den monoklonalen und polyklonalen Antiseren. 4 bestätigt die Daten der Tabelle 1 (A–E) und zeigt die Position aller in der linearen Karte identifizierten Fragmente. Die Fragmente, die mit dem L4-monoklonalen Antikörper reagierten, sind als schraffierte Balken angegeben, und die, die nicht reagierten, in vollen Balken. Die in allen mit L4-monoklonalem Antikörper reaktiven Fragmenten vorhandene kreuzschraffierte Fläche überspannt die Aminosäurereste 283–327.
6.3. MAPPING DURCH EXPRESSION VON PROTEIN-FRAGMENTEN
Die im wesentlichen wie in 1 dargestellte cDNA, die die vollständige Nucleotid-Sequenz des Fusionsprotein-Gens enthält, wurde in E. coli-Plasmidvektor pG103 an der BamHI-Stelle kloniert. 5 zeigt das resultierende rekombinante Plasmid pPX1043.
Die im wesentlichen wie in 1 dargestellte cDNA, die vollständige Nucleotid-Sequenz des Fusionsprotein-Gens enthält, wurde in E. coli-Plasmidvektor pBR322 an der BamHI-Stelle kloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit pBR322-F bezeichnet. Die Regionen des Fusionsprotein-Gens wurden aus pBR322-F mittels Restriktionsendonuclease-Digestion ausgeschnitten und in den E. coli-Expressionsvektor pUC19 (Yanish-Perron et al., 1985, Gene 33: 103–19) ligiert. Tabelle 2 zeigt die verwendeten Restriktionsstellen, die Nucleotid-Sequenzen des Fusionsprotein-Gens innerhalb der Restriktionsfragmente und die durch diese Nucleotid-Sequenzen kodierten Aminosäuren. Jede dieser DNA-Fragmente wurde in den E. coli-Expressionsvektor pUC19 in die Polylinker-Region so kloniert, dass die Sequenzen im Raster mit dem lac Z-Gen-Initiationscodon waren. Die durch die rekombinanten DNA-Moleküle an und nahe den Verbindungen des Vektorplasmids und der geklonten Fusionsprotein-Gen-Fragmente kodierten Aminosäure-Sequenzen sind in 6 veranschaulicht. Da die kodierenden Sequenzen des Fusionsproteins in das lac Z-Gen des pUC 19-Vektors insertiert wurden, sind einige Aminosäuren des lac Z-Proteins sowie einige durch den Polylinker kodierte Aminosäuren in den rekombinanten Proteinen umfasst.
Sechs rekombinante Proteine, bezeichnet als F3, F4, F7, F8, F10 und F11, die den durch die Konstruktion cF3 (auch als Plasmid pPX-1029 bezeichnet), cF4, cF7, cF8, cF10 und cF11 kodierten Proteinen entsprechen, wurden in E. coli exprimiert, wie durch die Reaktivität des gegenüber polyklonalem Kaninchen-Antiserum gegen die nativen Fusionsproteine mittels Western-Blot-Analyse, wie vorstehend beschrieben, gezeigt. Alle rekombinanten Proteine, außer F11, reagierten bei der Western-Blot-Analyse mit dem L4-monoklonalen Antikörper. Die 7 zeigt ein Diagramm der L4-reaktiven und L4-nicht-reaktiven rekombinanten Proteine. Wie in 7 veranschaulicht, wird die RS-Virus-Fusionsprotein-Sequenz, die allen rekombinanten Proteinen, die mit dem L4-monoklonalen Antikörper reaktiv sind, gemeinsam ist, durch die Reste 253 bis 298 definiert.
6.4. MAPPING DURCH SYNTHETISCHE PEPTIDE
Es wurden vier synthetische Polypeptide hergestellt, die den Aminosäure-Resten 299–315, 294–315, 289–315 bzw. 283–315 des RS-Virus-Fusionsproteins entsprachen. Die exakten Sequenzen dieser vier synthetischen Polypeptide sind in Tabelle 3 angegeben.
Die Polypeptide wurden auf Nitrocellulose-Folien aufgetüpfelt und auf ihre Reaktivität mit dem L4-monoklonalen Antikörper mittels Dot-Blot-Analyse (siehe Abschnitt 6.1.4., oben) geprüft.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in 8 veranschaulicht. Wie in 8 gezeigt, reagierte das Peptid 299–315 nicht mit dem L4-monoklonalen Antikörper, während die Polypeptide 294–315, 289–315 und 283–315 reagierten, was anzeigt, dass zwischen den Resten 283–298 ein neutralisierendes und Fusionsepitop vorhanden ist, das so klein wie 294–299 sein kann. Der Grund, warum diese minimale Region bei 294–299 und nicht bei 294–298 angegeben ist, ist der, weil im allgemeinen eine Spanne von mindestens sechs Aminosäuren zur Bildung eines Epitops erforderlich ist.
7. HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
Viele Polcynucleotid-Sequenzen können verwendet werden, um die vorliegende Erfindung durchzuführen. E. coli-Stamm JM83, der das Plasmid pPX1043 trägt, das das gesamte RS-Virus-Fusionsprotein-Gen aufweist, und E. coli-Stamm JM103, das das Plasmid pPX1029 trägt, wurden bei der Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, IL, hinterlegt und den Hinterlegungsnummern (Accession Numbers) NRRL B-18254 bzw. NRRL B-18255 zugeordnet.
Die beschriebenen spezifischen Ausführungsformen sind nur beispielhaft angegeben, und die Erfindung wird nur durch die anliegenden Ansprüche begrenzt.

Claims

Im wesentlichen reines Polypeptid mit der Aminosäure-Sequenz
Im wesentlichen reines Polypeptid mit der Aminosäure-Sequenz
Im wesentlichen reines Polypeptid mit der Aminosäure-Sequenz Glu-Glu-Val-Leu-Ala-Tyr-Val.