DE60017211T2

DE60017211T2 - Fusionsproteine mit Trägern welche eine doppelte Immunantwort induzieren

Info

Publication number: DE60017211T2
Application number: DE60017211T
Authority: DE
Inventors: Manuel Stonington Campos; Serge Rene Mystic Martinod; Becky Ann Ledyard Durtschi; Terecita Dolores Norwich Yule
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 1999-02-17
Filing date: 2000-02-14
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2020-02-15
Also published as: US6911206B1; US20050095258A1; DE60017211D1; DK1035133T3; ATE286511T1; JP2000236887A; BR0000489A; EP1035133A3; CA2297441A1; PT1035133E; EP1035133A2; ES2233284T3; EP1035133B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Gesundheit von Menschen und Tieren und ist auf Fusionsproteine gerichtet, die in Impfstoffzusammensetzungen anwendbar sind.
Hintergrund der Erfindung
Das Vertebraten-Immunsystem umfasst ein kompliziertes System von Zellen, sekretierten Faktoren und Reaktionen zum Schützen eines Organismus vor pathogener Infektion durch Mikroben, Viren, Toxine und andere Pathogene und Reizstoffe. Bestimmte Moleküle umfassen jedoch Epitope, die keine wirksame Immunreaktion in einem Vertebraten induzieren, aufgrund ihrer geringen Größe und/oder weil sie endogen innerhalb des Vertebraten synthetisiert werden und deshalb durch das Immunsystem des Vertebraten nicht als „fremd" wahrgenommen werden. Verfahren zum Erzeugen von Antikörpern gegen bestimmte Peptide, die normalerweise nicht-immunogen sind, wie Hormone, sind erwünscht, weil dadurch Immunoregulation der Aktivität von solchen Peptiden innerhalb des Organismus erreicht werden kann.
Hormonpeptide wurden mit verschiedenen Trägerpeptiden in Fusionsproteinen zum Hervorrufen einer wirksamen Immunreaktion gegen das Hormon kombiniert, wenn ein Organismus mit dem Fusionsprotein beimpft ist. Das Trägerprotein veranlasst das Immunsystem des Organismus, zu erkennen und erzeugt Antikörper gegen das Hormonpeptid, welche es anderweitig nicht erzeugen würde.
US-Patent 5 403 586, Russell-Jones et al., betrifft beispielsweise Fusionsproteine, die ein Analoges von Gona dotropin-freisetzendem Hormon (GnRH) umfassen, auch bekannt als luteinisierendes Hormon-freisetzendes Hormon (LHRH), und ein TraTp-Analoges, worin das Vorliegen des TraTp-Analogen in dem Fusionsprotein hilft, die Erzeugung von Anti-GnRH-Antikörpern auszulösen. TraTp ist ein äußeres Membran-Lipoprotein, das durch bestimmte Stämme von E.coli erzeugt wird, wie in US-Patent 5 403 586, vorstehend, beschrieben.
US-Patent 5 422 110, Potter et al., betrifft Trägersysteme, die Chimäre Proteine einschließen, welche ein Leukotoxinpolypeptid, das an ein ausgewähltes Antigen fusioniert ist, umfassen. Das Leukotoxin wirkt zum Erhöhen der Immunogenizität des Antigens. Ausgewählte. Antigene, die hierin offenbart sind, schließen GnRH, Somatostatin (SRIF) und Rotavirusvirales Protein 4 (VP4) ein.
WO 90/02187 betrifft Fusionsproteine, die einen antigenen, hydrophilen Anteil, wie Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg), und ein Peptid, wie GnRH, umfassen, welches einzeln nicht wesentlich antigen ist.
WO 98/32866 betrifft Fusionsproteine zum intrazellulären Transport, die eine Aminosäuresequenz einschließen, mit der Transportfunktion von herpesviralem VP22-Protein und eine weitere Proteinsequenz, ausgewählt aus (a) Proteinen zur Zellzyklussteuerung; (b) Suizidproteinen; (c) antigenen Sequenzen oder antigenen Proteinen von mikrobiellen und viralen Antigenen und Tumorantigenen; (d) immunomodulierenden Proteinen und (e) therapeutischen Proteinen. Die Fusionsproteine können zur intrazellulären Freisetzung von Proteinsequenzen angewendet werden, um die entsprechende Effektorfunktion in der Zielzelle hervorzurufen.
GnRH ist ein Decapeptid, das endogen erzeugt wurde, hauptsächlich im Hypothalamus. Es wird unter der Vertebratenspezies stark zurückgehalten. Bei Säugern codiert das GnRH-Gen, das Decapeptid Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly mit anschließender post-translationaler Modifizierung der N- und C-Termini zu Pyroglutaminsäure bzw. Glycinamid, unter Erzeugen von (Pyro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly- NH₂. Von GnRH wurde gezeigt, dass es eine maßgebliche Rolle bei der Regulierung von reproduktiven Funktionen in allen Hauptvertebraten durch Regulieren der Produktion und Freisetzung des Follikel-stimulierenden Hormons (FSH) und luteinisierenden Hormons (LH) aus der Schleimdrüse spielt. Weil FSH und LH eine Rolle bei der Spermatogenese und Ovulation sowie Steroidogenese spielen, führen Impfstoffe, die die Erzeugung von Antikörpern gegen GnRH ergeben, zum Rückgang der reproduktiven Funktion (Fertilität) von sowohl Männchen als auch Weibchen, und sollten auch sekundär Sexualeigenschaften, wie geschlechtsspezifisches Verhalten, steuern. Bei Männchen reguliert LH die Steroidogenese von Leydig-Zellen. Somit führt aktive Immunisierung von Männchen gegen GnRH zu testikulärer Atrophie und einer Senkung bei der Testosteronproduktion und testikulären Funktion (Ladd A. et al., 1994, Biol. Reprod. 51:1076–1083; Ladd A., 1993, Am. J. Reprod. Immunol. 29:189-194). Ein GnRH-Impfstoff wurde durch die United States Food and Drug Administration als ein zu untersuchender neuer Arzneistoff für die Behandlung von Prostatakrebs anerkannt (Ladd A., 1993, vorstehend). Die Entwicklung eines GnRH-Immuno-Kontrazeptivums ist eine brauchbare Alternative zur chirurgischen Sterilisierung bei Lebewesen und hat den zusätzlichen Vorteil, reversibel zu sein, da Spermatogenese und Fertilität zur Normalität zurückkehren können, indem man einfach die Anti-GnRH-Titer sinken lässt, (Ladd A. et al., 1989, J. Reprod. Immunol. 15:85–101). Da jedoch GnRH selbst ein kleines Peptid ist und eine kurze Lebensdauer aufweist (WO 90/02187, 8. März 1990), ist es nur schwach immunogen, auch wenn mit einem starken Adjuvans eingespritzt. Beispielsweise ist ein signifikanter Anteil von Tieren nicht in der Lage, eine wirksame Antikörperantwort gegen GnRH zu zeigen, wenn in Freund'schem komplettem Adjuvans verabreicht. Um eine signifikante Antikörperantwort zu erzeugen, muss GnRH deshalb chemisch oder rekombinant an ein Trägerprotein konjugiert werden.
Keine der vorstehend angeführten Literaturstellen lehrt jedoch oder regt das Anwenden eines Trägers an, der eine immuninhibierende Antwort gegen sich selbst auslöst.
Kurzdarstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Fusionsprotein zum Erzeugen einer dualen Immunreaktion in einem Vertebraten bereit, wobei das Fusionsprotein umfasst: (a) einen ersten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem endogen innerhalb des Vertebraten synthetisierten GnRH-Peptid, wobei die Aktivität des Peptids innerhalb des Vertebraten inhibiert werden soll, und wobei der proteinartige Anteil selbst nicht in der Lage ist, eine wirksame immunoinhibitorische Reaktion in dem Vertebraten hervorzurufen; verbunden mit (b) einem zweiten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem BHV-1-Antigen, wobei BHV-1 in der Lage ist, den Vertebraten pathogen zu infizieren;
wobei Anteil (b) das Immunsystem des Vertebraten veranlasst, den Anteil (a) zu erkennen und eine Reaktion zu erzeugen, die: (i) die Aktivität des innerhalb des Vertebraten endogen synthetisierten GnRH-Peptids inhibiert; und (ii) den Vertebraten vor Infektion durch das Pathogen schützt, wenn der Vertebrat mit einer wirksamen Menge des Fusionsproteins beimpft ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin in einem zweiten Aspekt ein Fusionsprotein zum Erzeugen einer dualen Immunreaktion bei einem Vertebraten bereit, wobei das Fusionsprotein umfasst: (a) einen ersten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem GnRH-Peptid, wobei die Aktivität davon innerhalb des Vertebraten inhibiert werden soll, und wobei der proteinartige Anteil selbst nicht in der Lage ist, eine wirksame immunoinhibitorische Reaktion in dem Vertebraten hervorzurufen; verbunden mit (b) einem zweiten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem Rinder Herpes Virus Typ-1 (BHV-1)-Antigen; wobei der zweite proteinartige Anteil (b) das Immunsystem des Vertebraten veranlasst, den ersten proteinartigen Anteil (a) zu erkennen und eine Immunreaktion zu erzeugen, die die Aktivität des Peptids innerhalb des Vertebraten infibieren kann, wenn der Vertebrat mit einer wirksamen Menge des Fusionsproteins beimpft ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Fusionsproteine, wie in den vorangehenden zwei Absätzen angeführt, bereit, die rekombinante Fusionsproteine darstellen.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Polynucleotidmolekül bereit, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung codiert.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen Vektor bereit, der ein Polynucleotidmolekül umfasst, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung codiert.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine transformierte Zelle bereit, die ein Polynucleotidmolekül umfasst, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung codiert.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen Dualfunktionsimpfstoff bereit, der eine Menge eines Fusionsproteins, wie vorstehend angegeben, umfasst, umfassend: (a) einen ersten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem endogen innerhalb des Vertebraten synthetisierten GnRH-Peptid, wobei die Aktivität des Peptids davon innerhalb des Vertebraten inhibiert werden soll, und wobei der proteinartige Anteil selbst nicht in der Lage ist, eine wirksame immunoinhibitorische Reaktion in dem Vertebraten hervorzurufen; verbunden mit (b) einem zweiten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem BHV-1-Antigen, wobei BHV-1 in der Lage ist, den Vertebraten pathogen zu infizieren; wobei Anteil (b) das Immunsystem des Vertebraten veranlasst, den Anteil (a) zu erkennen und eine Reaktion zu erzeugen, die: (i) die Aktivität des innerhalb des Vertebraten endogen synthetisierten GnRH-Peptids in hibiert; und (ii) den Vertebraten vor Infektion durch das Pathogen schützt, wobei das Fusionsprotein in dem Dualfunktionsimpfstoff in einer wirksamen Menge zum Inhibieren der Aktivität des Peptids vorliegt, von dem Anteil (a) abgeleitet ist und zum Schutz des Vertebraten gegen Infektion durch das Pathogen, von dem Anteil (b) des Fusionsproteins abgeleitet ist, wobei der Dualfunktionswirkstoff außerdem einen zur pharmazeutischen oder veterinären Verwendung verträglichen Träger umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin die Verwendung eines Fusionsproteins bereit, das eine duale Immunreaktion in einem Vertebraten erzeugt, wobei das Fusionsprotein umfasst: (a) einen ersten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem endogen innerhalb des Vertebraten synthetisierten GnRH-Peptid, wobei die Aktivität des Peptids innerhalb des Vertebraten inhibiert werden soll, und wobei der proteinartige Anteil selbst nicht in der Lage ist, eine wirksame immunoinhibitorische Reaktion in dem Vertebraten hervorzurufen; verbunden mit (b) einem zweiten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem BHV-1-Antigen, wobei BHV-1 in der Lage ist, den Vertebraten pathogen zu infizieren; wobei Anteil (b) das Immunsystem des Vertebraten veranlasst, den Anteil (a) zu erkennen und eine Reaktion zu erzeugen, die: (i) die Aktivität des innerhalb des Vertebraten endogen synthetisierten GnRH-Peptids inhibiert; und (ii) den Vertebraten vor Infektion durch das Pathogen schützt, wenn der Vertebrat mit einer wirksamen Menge des Fusionsproteins beimpft ist, oder einen Vektor oder eine transformierte Zelllinie, die ein Polynucleotidmolekül umfasst, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein solches Fusionsprotein codiert, für die Herstellung eines Impfstoffs zum Inhibieren in einem Vertebraten der Aktivität des endogen synthetisierten GnRH-Peptids und zum Schützen des Vertebraten gegen BHV-1-Infektion.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen Impfstoff zum Inhibieren der Aktivität eines GnRH-Peptids in einem Vertebraten bereit, der ein wie vorstehend angeführtes Fusionsprotein umfasst, das umfasst: (a) einen ersten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem endogen innerhalb des Vertebraten synthetisierten GnRH-Peptid, wobei die Aktivität des Peptids innerhalb des Vertebraten inhibiert werden soll, und wobei der proteinartige Anteil selbst nicht in der Lage ist, eine wirksame immunoinhibitorische Reaktion in dem Vertebraten hervorzurufen; verbunden mit (b) einem zweiten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem BHV-1-Antigen, wobei Anteil (b) das Immunsystem des Vertebraten veranlasst, den ersten proteinartigen Anteil (a) zu erkennen und eine Reaktion zu erzeugen, die die Aktivität des innerhalb des Vertebraten endogen synthetisierten GnRH-Peptids inhibiert, wobei das Fusionsprotein in dem Impfstoff in einer Menge vorliegt, die wirksam ist, um die Aktivität des Peptids in dem Vertebraten zu inhibieren, und der Impfstoff weiterhin einen zur pharmazeutischen oder veterinären Verwendung verträglichen Träger umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin die Verwendung eines Fusionsproteins bereit, das eine duale Immunreaktion in einem Vertebraten erzeugt, wobei das Fusionsprotein umfasst: (a) einen ersten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem GnRH-Peptid, wobei die Aktivität davon innerhalb des Vertebraten inhibiert werden soll, und wobei der proteinartige Anteil selbst nicht in der Lage ist, eine wirksame immunoinhibitorische Reaktion in dem Vertebraten hervorzurufen; verbunden mit (b) einem zweiten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem BHV-1-Antigen, wobei der zweite proteinartige Anteil (b) das Immunsystem des Vertebraten veranlasst, den Anteil (a) des ersten proteinartigen Anteils zu erkennen und eine Immunreaktion erzeugt, die die Aktivität des Peptids innerhalb des Vertebraten inhibieren kann, wenn der Vertebrat mit einer wirksamen Menge des Fusionsproteins beimpft ist, oder einen Vektor oder eine transformierte Zelle, die ein Po lynucleotidmolekül umfasst, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein Fusionsprotein codiert, für die Herstellung eines Impfstoffs zum Inhibieren in einem Vertebrat der Aktivität des endogen synthetisierten GnRH-Peptids.
Kurzbeschreibung der Figuren
1: Konstrukt von gD/GnRH-Fusionen: Fusionsproteine, aufgebaut gemäß der vorliegenden Erfindung, werden angegeben. gD in diesen Konstrukten ist reif (die Signalsequenz wurde entfernt) und trunkiert (die Transmembran bleibt und verbleibende 3' Sequenz wurde entfernt). GnRH ist in tetramerer Form.
2: Ein GnRH-Tetramerklon, konstruiert durch Fusionieren der C-Termini von anellierten GnRH-Oligonucleotiden (angeführt in SEQ ID NRN: 7 und 8) zu der GnRH-Sequenz (anellierte Oligonucleotide, angeführt in SEQ ID NRN: 9 und 10) in Dimerklon 98BS/GnR. Flankierende Sequenzen von Plasmid pBS KS+ (Stratagene) und klonierende Stellen hierin sind ebenfalls angeführt. Diese Nucleotidsequenz wird in SEQ ID NR: 14 angeführt. Die codierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 15) wird ebenfalls gezeigt.
3 (3A–3C): Nucleotidsequenz (SEQ ID NR: 16), die BHV-1-gD innerhalb Klon FlgD/Pots207nco(#79) codiert, sowie die codierte Polyaminosäure-gD-Sequenz (SEQ ID NR: 17). Nucleotide 3–56 codieren die Signalsequenz; Nucleotide 1092–1169 codieren die Transmembrandomäne. Nucleotide 57–1259 codieren reifes gD und Nucleotide 57–1076 codieren trunkiertes reifes gD. „Gly" gibt Bereiche von Glycosylierung wieder. Vektorsequenzen, die die gD-codierende Sequenz flankieren, werden gezeigt.
4 (4A–4C): Aufstellungsbericht (DNA-Aufstellung), unter Vergleichen von BHV-1-gD von Klon FlgD/Pots207nco(#79) (gD/Pots, Spitzensequenz) und BHV-1-gD mit GenBank Zugangs-Nr. M59846 (Bodensequenz) (Tikoo et al., 1990, vorstehend) (GenBank DNA-Sequenz Datengrundlage des U.S. National Center for Biotechnology Information (NCBI, Be thesda, Maryland)). Das Clustalverfahren mit gewogener Restgewichttabelle wurde für diesen Bericht verwendet. „TM" steht für Transmembrandomäne. Reste in Kästchen in dem FlgD/Pots207nco(#79)-Klon sind jene, die sich von Resten in M59846 unterscheiden. M59846 DNA ist SEQ ID NR: 18.
5: Aminosäureaufstellung zwischen gD/Pots (Bodensequenz) und M59846 (Spitzensequenz). Clustalverfahren mit PAM250-Restgewichttabelle wurde verwendet. Reste in gD/Pots, die sich von Resten in M59846 unterscheiden, sind in Kästchen. M59846 ist SEQ ID NR: 19.
6: (6A–6C): pQE-tmgD. Nucleotid-codierende Sequenz für tmgD, flankiert durch Plasmid pQE-31-Sequenzen, einschließlich eine Sequenz, die ein 6XHIS-tag codiert, welches exprimiert wird, verbunden mit dem tmgD (SEQ ID NR: 20). Die Aminosäuresequenz aus dem tmgD mit dem verbundenen 6XHIS tag wird auch gezeigt (SEQ ID NR: 21).
7: (7A–7C): Nucleotid-codierende Sequenz und flankierende Sequenzen für Plasmid pQE-GnRH:gD (SEQ ID NR: 22). Aminosäuresequenz für das 4GnRH-tmgD-Fusionsprotein, einschließlich ein 6XHIS tag, wird ebenfalls gezeigt (SEQ ID NR: 23).
8: (8A–8C): pQE-gD:GnRH. Nucleotidcodierende Sequenz und Plasmid-flankierende Sequenzen werden gezeigt (SEQ ID NR: 24). Die Aminosäuresequenz von dem tmgD-4GnRH mit einem 6XHIS tag wird ebenfalls gezeigt (SEQ ID NR: 25) .
9: (9A–9C): pQE-GnRH:gD:GnRH. Nucleotidcodierende Sequenz und Plasmid-flankierende Sequenzen werden gezeigt (SEQ ID NR: 26). Die Aminosäuresequenz von dem 4GnRH-tmgD-4GnRH mit einem 6XHIS tag wird ebenfalls gezeigt (SEQ ID NR: 27).
10: Vergleich von Expressionsprodukten von bakteriellem Vektor pQE-Konstrukt. „A" ist pQE-tmgD, „B" ist pQE-gD:GnRH, „C" ist pQE-GnRH:gD und „D" ist pQE-GnRH:gD:GnRH. Die Aminosäuren, die die gD-Portionen verbin den, die GnRH-Tetramere und die 6XHIS tags werden in dieser Figur angeführt.
11 (11A–11B): Nucleotidsequenz (SEQ ID NR: 28) von Plasmid pCMV-tgD, unter Codieren eines trunkierten gD, und deduzierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 29) von dem trunkierten gD-Expressionsprodukt, einschließlich der Signalsequenz.
12 (12A–12B): Nucleotidsequenz (SEQ ID NR: 30) von Plasmid pCMV-gD:GnRH (ATCC Zugangs-Nr. 203370), unter Codieren eines tgD-4GnRH-Fusionsproteins, mit deduzierter Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 31) von dem Fusionsproteinprodukt, einschließlich Signalsequenz.
Beschreibung der Erfindung im Einzelnen
Fusionsproteine
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Fusionsproteine bereit, die in einem Vertebraten eine Dualimmunreaktion indizieren, die sowohl die Aktivität des GnRH-Peptids, endogen synthetisiert durch den Vertebraten, inhibiert, als auch eine pathogene BHV-1-Infektion in dem Vertebraten inhibiert. Inhibierung des endogen-synthetisierten GnRH-Peptids wird durch Verbinden eines ersten proteinartigen Teils erhalten, der analog zu der Gesamtheit oder einen Teil des endogen-synthetisierten GnRH-Peptids zu einem Träger ist, wobei der Träger ein proteinartiger Anteil ist, der analog zu der Gesamtheit oder eines Teils eines BHV-1-Antigens ist, wobei das BHV-1 in der Lage ist, pathogen den Vertebraten zu infizieren. Zusätzlich zu der Funktion als ein Träger (d.h. Erhöhen der Immunreaktion gegen das Analoge von dem endogen-synthetisierten Peptid oder einem Teil davon), induziert der analog zu dem immunogenen oder immunogenen Teil des Pathogens analoge Teil auch eine Reaktion gegen sich selbst in dem Vertebraten und schützt somit den Vertebraten vor Infektion durch das Pathogen.
Da zwei Hauptursachen von wirtschaftlichem Verlust im Rindermastviehbestand in den Vereinigten Staaten und bei Wei devieh weltweit Rinderatemwegserkrankung (BRD), die durch BHV-1-Infektion und sexuelles und aggressives Verhalten verursacht wird, sind, würde ein Produkt, das gleichzeitig BRD behandeln und auch sekundäre Sexualeigenschaften, beispielsweise Aggression, inhibiert, die Fleischqualität und -produktivität durch Beseitigen oder Vermindern dieser infektiösen und endocrinen Ursachen von Produktionsverlusten bei Rindern verbessern. Somit wurde als eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Glycoprotein D (gD), das ein Immunogen von BHV-1 ist, als ein Träger ausgewählt, um mit einem GnRH-Peptid in einem Fusionsprotein zu kombinieren, um GnRH-Aktivität beim Rind zu regulieren, unter gleichzeitigem Bereitstellen von Schutz gegen BRD.
Bestimmte proteinartige Teile, die analog zu dem Immunogen aus einem Pathogen oder einem Teil eines Immunogens von einem Pathogen sind, wie die BHV-1-Glycoprotein-Analogen, die hierin beschrieben wurden, wurden vorher nicht offenbart oder als Träger vorgeschlagen. Somit stellt in einem zweiten Aspekt die vorliegende Erfindung ein Fusionsprotein zum Erzeugen einer Immunreaktion in einem Vertebraten bereit, wobei das Fusionsprotein als einen Träger einen proteinartigen Anteil, analog zu der Gesamtheit oder einem Teil eines BHV-1-Antigens, umfasst. In diesem zweiten Aspekt muss der Vertebrat kein Vertebrat sein, der pathogen durch BHV-1 infiziert werden kann; das BHV-1-Antigen wirkt analog einfach als ein Träger, der eine Immunreaktion induziert, die die Aktivität des proteinartigen Anteils (a) inhibiert.
Wenn somit ein Fusionsprotein dieser Erfindung beispielsweise ein Anteil (a), analog zu der Gesamtheit oder einem Teil eines GnRH-Peptids, und einen Anteil (b), analog zu der Gesamtheit oder einem Teil eines BHV-1-Antigens, umfasst, wird ein solches Fusionsprotein eine duale Immunreaktion beim Rind erzeugen, wird jedoch auch in anderen Vertebratenspezies zum Inhibieren von GnRH-Aktivität, ohne Schützen gegen BHV-1-Infektion, verwendbar sein, wobei als solche andere Spezies nicht pathogen durch BHV-1 infiziert sind.
Für die erfindungsgemäßen Zwecke bedeutet „Fusionsprotein" ein Molekül, das eine Vielzahl von proteinartigen Anteilen, die miteinander verbunden sind, umfasst. Somit schließen Fusionsproteine dieser Erfindung chemische Konjugate (chemisch verbundenen Anteil (a) und (b)) und rekombinante Fusionsproteine ein. Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein umfasst einen proteinartigen Anteil (a) und einen proteinartigen Anteil (b), wobei gemeint ist, dass das Molekül mindestens einen Anteil (a) und mindestens einen Anteil (b) umfassen kann, jedoch mehr als einen Anteil (a) und/oder mehr als einen Anteil (b) umfassen kann. Die Anteile (a) und (b) können linear verbunden sein. Wenn mehrfache Anteile von (a) und/oder (b) vorliegen, dann können die Anteile linear verbunden sein oder sie können in einer verzweigten Weise verbunden sein, beispielsweise mit einem von den Anteilen (a) oder (b), die zentral in dem Molekül angeordnet sind, oder mit anderen Anteilen (a) oder (b), die mit dem zentralen Anteil mehrfach verbunden sind. Andere Verbindungsmuster, die durch den Durchschnittsfachmann festgestellt werden können, sind innerhalb der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, solange mindestens ein Teil (a) und ein Teil (b) in den Fusionsproteinen vorliegt.
Die Anteile (a) und (b) können zueinander so positioniert sein, dass eine wirksame Immunreaktion gegen den Anteil (a) sowie den Anteil (b), falls erwünscht, optimiert wird. Solches Positionieren kann durch dem Durchschnittsfachmann bekannte Verfahren ermittelt werden. Beispielsweise kann ein hierin beschriebenes Fusionsprotein durch Westernblot mit Antikörpern gegen (a) und/oder (b) getestet werden, um zu bestimmen, wenn Anteile (a) und/oder (b) positioniert sind, um das Binden von Antikörpern, die dafür spezifisch sind, zu optimieren.
Die Anteile der vorliegenden Fusionsproteine können durch Mittel verbunden werden, einschließlich chemische Verbindungen und rekombinante Verbindungen. Eine „chemische Verbindung" beinhaltet Erzeugen eines chemischen Zwischenpro dukts aus einem proteinartigen Anteil und Umsetzen des Zwischenprodukts mit einem weiteren proteinartigen Anteil. Beispielsweise kann eine „chemische Verbindung" das Bilden einer direkten kovalenten Bindung zwischen einer organischen Gruppe von einem proteinartigen Anteil, wie Anteil (a), und einer organischen Gruppe von dem anderen proteinartigen Anteil, beispielsweise Anteil (b), beinhalten, vorausgesetzt, dass die Anteile organische Gruppen aufweisen, die in der Lage sind, unter geeigneten Reaktionsbedingungen zur Bildung einer solchen kovalenten Bindung zu reagieren. Als weiteres Beispiel kann einer von den proteinartigen Anteilen, wie Anteil (a), derivatisiert werden, unter Bildung eines Zwischenprodukts, das Substituenten enthält, die mit Anteilen (b) reagieren werden. Eine „rekombinante Verbindung" beinhaltet Ligieren einer Nucleinsäure, unter Codieren eines proteinartigen Anteils zu einer Nucleinsäure, unter Codieren von anderem proteinartigen Anteil, und Exprimieren eines Proteins daraus in einem geeigneten Expressionssystem. Chemische Verknüpfungen und rekombinante Verknüpfung sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden nachstehend weiter genauer hierin beschrieben.
Der hierin verwendete Begriff „Träger" (ausgenommen, wenn in der Wortgruppe „pharmazeutisch verträglicher Träger", „Träger, verträglich zur pharmazeutischen oder veterinären Verwendung", und ähnliche Wortgruppen, oder wie anders ausgewiesen) bedeutet ein Molekül, das eine Immunreaktion gegen ein zweites Molekül, wenn damit verbunden, hervorruft oder verstärkt.
Der hierin verwendete Begriff „analog zu" zum Beschreiben von Anteilen eines Fusionsproteins bedeutet, sofern nicht anders ausgewiesen, „mit der gleichen oder im Wesentlichen der gleichen Struktur wie", beispielsweise mit der gleichen oder im Wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz. Beispielsweise hat ein proteinartiger Anteil, der analog zu einem Peptid ist, das endogen durch einen Vertebraten synthetisiert wird, die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie das endogen-synthetisierte Peptid. „Im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz" bedeutet eine Polyaminosäuresequenz, die anders die Aminosäuresequenz des endogen synthetisierten Peptids aufweist, jedoch worin eine oder mehrere Aminosäurereste gelöscht wurden, hinzugefügt wurden oder mit einem anderen Aminosäurerest substituiert wurden, wo das sich ergebende Polyaminosäuremolekül beim Ausführen der vorliegenden Erfindung verwendbar ist. Ein Polyaminosäuremolekül ist beim Ausführen der vorliegenden Erfindung verwendbar, wenn es eine spezifische Immunreaktion ergeben kann, wenn in dem Fusionsproteinprodukt vorhanden. Aminosäuresubstitution wird vorzugsweise konservative Substitutionen sein, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Regeln zur Herstellung solcher Substitutionen schließen jene von Dayhof, M.D., 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., Band 5, Sup. 3, unter anderen, beschriebenen ein.
Wenn ein Anteil (a) oder Anteil (b) eines erfindungsgemäßen Fusionproteins hierin als „abgeleitet von" einem Peptid oder Pathogen bezeichnet wird, bedeutet dies, dass der Anteil analog zu der Gesamtheit oder Teil des Peptids bzw. der Gesamtheit oder Teil eines Immunogens (oder Antigens) von dem Pathogen ist.
„Teil von" einem Peptid, Antigen oder Immunogen für erfindungsgemäße Zwecke ist, sofern nicht anders ausgewiesen, jeder Anteil, sodass das sich ergebende Polyaminosäuremolekül beim Ausführen der vorliegenden Erfindung verwendbar ist. Dies bedeutet, dass der Teil ausreichend sein muss, um eine Immunreaktion gegen das Pathogen, von dem (b) abgeleitet ist, und/oder das Peptid, von dem (a) abgeleitet ist, hervorzurufen. Bestimmen solcher Anteile ist innerhalb des Fachgebiets des Durchschnittsfachmanns. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Anteil des Peptids, Antigens oder Immunogens mindestens 60%, bevorzugter 70%, und auch bevorzugter mindestens 90%, der Aminosäuresequenz des einzelnen Peptids, Antigens oder Immunogens. Der tatsächliche Prozentsatz des Peptids, Antigens oder Immunogens ist weniger wichtig als ein schließlich in dem Anteil jener Aminosäurereste, die eine Immunreaktion gegen (b) und/oder (a) hervorrufen werden.
Die hierin verwendeten Begriffe „Immunogen" und „Antigen" bedeuten ein Molekül, das eine wirksame Immunreaktion in einem einzelnen Vertebraten oder einer Vertebratenspezies auslösen kann. Für die vorliegende Erfindung verwendbare Immunogene sind proteinartige Moleküle; d.h. Moleküle, umfasst von einer Sequenz von Aminosäuren, die jedoch auch Nicht-Protein-Gruppen einschließen kann, beispielsweise Kohlenhydrateinheiten.
Der Begriff „Immunreaktion" für erfindungsgemäße Zwecke bedeutet die Herstellung von Antikörpern und/oder Zellen (wie T-Lymphozyten), die direkt speziell oder indirekt dagegen gerichtet sind, oder bei der Zersetzung oder Inhibierung von einem einzelnen Epitop oder einzelnen Epitopen unterstützen. Eine „wirksame Immunreaktion" ist eine Immunreaktion, die bezüglich Anteil (a) gegen ein oder mehrere Epitope gerichtet ist, um die Aktivität eines endogen in dem beimpften Vertebraten synthetisierten Peptids zu inhibieren; und bezüglich Anteil (b) gegen ein oder mehrere Epitope eines Pathogens gerichtet ist, um gegen das Pathogen in dem beimpften Vertebraten zu schützen. „Auslösen einer Immunreaktion" und dergleichen Begriffe, wenn hierin verwendet, bedeuten Induzieren und/oder Verstärken einer Immunreaktion in einem Vertebraten in Reaktion auf Beimpfung. Wortgruppen, wie „Inhibierung von Infektion" und „Schutz vor Infektion" beziehen sich nicht nur auf die absolute Verhinderung der Infektion, sondern auch auf beliebige nachweisbare Verminderung des Grads oder der Geschwindigkeit der Infektion durch ein solches Pathogen, oder beliebige nachweisbare Verminderung bei der Schwere der Erkrankung, oder beliebiges Symptom oder beliebiger Zustand, der sich aus Infektion durch das Pathogen in dem beimpften Tier, verglichen mit einem nichtbeimpften Tier, ergibt. Eine Reaktion, die Infektion inhibiert, kann in Tieren induziert werden, die vorher nicht mit dem Pathogen infiziert wurden und/oder nicht mit dem Pathogen gleichzeitig mit der Beimpfung infiziert wurden. Solche Wortgruppen sind vorgesehen, um auch das Inhibieren einer Geschwindigkeit und/oder eines Grads der Infektion in einem Tier, das bereits mit dem Pathogen zum Zeitpunkt der Impfung infiziert war, einzuschließen.
Der hierin verwendete Begriff „Dualimmunreaktion" bedeutet eine wirksame Immunreaktion, wie vorstehend definiert, die die Aktivität von mehr als einem Peptid inhibiert, und vorzugsweise zwei verschiedene Peptide, beispielsweise ein endogen-synthetisiertes Hormonpeptid und ein virales Peptid.
Ein hierin verwendeter „Dual-Funktion-Impfstoff" bedeutet einen Impfstoff, der eine Immunreaktion in einem damit beimpften Vertebraten erzeugen kann, die gerichtet ist gegen mehr als ein Peptid und vorzugsweise zwei verschiedene Peptide, innerhalb des Vertebraten, beispielsweise ein Hormon, das endogen durch den Vertebraten und ein virales Peptid eines Virus, der pathogen den Vertebraten infiziert, synthetisiert wird.
Die hierin verwendete, sofern nicht anders ausgewiesene Wortgruppe „endogen-synthetisiertes Peptid" bedeutet ein Peptid, das durch einen Vertebraten als Teil der Vertebratenmetabolischen Funktion synthetisiert wird. Beispiele für endogen-synthetisierte Peptide schließen Hormone und Enzyme ein, sind jedoch nicht darauf begrenzt.
„Inhibieren der Aktivität eines Peptids" und dergleichen, hierin verwendete Wortgruppen bedeuten In-Wechselwirkung-Treten mit der Fähigkeit des Peptids, seine normale Funktion auszuführen, beispielsweise seine Fähigkeit, eine biochemische Reaktion zu katalysieren (falls das Peptid ein Enzym darstellt), eine biophysikalische Reaktion auszulösen (wenn das Peptid ein Hormon darstellt), oder an viraler Infektivität oder Replikation (falls das Peptid ein virales Peptid darstellt), teilzuhaben. Die Wortgruppen „Menge, wirksam zum Inhibieren der Aktivität des Peptids, von welchem Anteil (a) abgeleitet ist", „wirksame Menge zum Inhibieren der GnRH-Aktivität" und dergleichen, beziehen sich auf jene Menge von Fusionsprotein, die eine ausreichende Immunreaktion induzieren kann, um die Fähigkeit des Peptids, seine Funktion auszuführen, zu stören, wie dem Hindern von GnRH am Stimulieren oder Vermindern der Fähigkeit von GnRH am Stimulieren der Freisetzung von LH oder FSH, oder Stören mit einem Oberflächenprotein eines Virus, sodass er nicht in der Lage ist, Zellen zu infizieren, wodurch die Replikation und Infektion durch den Virus gehemmt wird. Eine wirksame Menge kann als entweder eine Einzeldosis eines Impfstoffs oder Mehrfachdosen eines Impfstoffs verabreicht werden.
Wenn hierin verwendet, beziehen sich die Wortgruppen „Menge, wirksam zum Inhibieren der Infektion durch das Pathogen, von dem (b) abgeleitet ist", „Menge, wirksam zum Inhibieren von BHV-1-Infektion", „Menge, wirksam zum Schutz gegen Infektion" und dergleichen, auf jene Menge von Fusionsprotein oder Impfstoff, das/der in der Lage ist, einen Vertebraten vor wie vorstehend definierter Infektion zu schützen. Eine wirksame Menge kann als entweder eine Einzeldosis eines Impfstoffs oder Mehrfachdosen eines Impfstoffs verabreicht werden.
Ein hierin verwendeter „Vertebrat" bezieht sich auf beliebige Spezies mit einem Gerüst oder Wirbelsäule, nämlich Fisch, Amphibien, Reptilien, Vögel und Säuger. Beispiele für Vertebraten, die von dem Impfstoff der vorliegenden Erfindung Vorteil haben können, schließen Menschen, Hühner, Schweine, Hunde, Katzen, Kühe, Ziegen, Schafe und Pferde, unter anderen ein, sind jedoch nicht darauf begrenzt. Vorzugsweise ist der Vertebrat ein Säuger.
Der hierin verwendete Begriff „pathogen infizierend" bezieht sich auf die Fähigkeit eines Pathogens, einen Vertebraten in einer Weise zu infizieren oder einen Grad, der einen nachweisbaren Erkrankungszustand in dem Vertebraten ergibt. BHV-1 beispielsweise infiziert pathogen Rinder, jedoch nicht Menschen.
Ein Herpesvirus-Glycoprotein (Gompels, U.A. et al., 1992, DNA Seq. 3(1):25–39; Misra, V. et al., 1988, Virology 166:542–9; Whitbeck, J.C., et al., 1988, J. Virol. 62:3319-27; Fitzpatrick, D.R. et al., 1989, Virology 173 :46–57); ein proteinartiges Anteilsanaloges zu der Gesamtheit oder einem Teil eines Herpesvirus-Glycoproteins kann als ein Träger in einem Fusionsprotein dieser Erfindung dienen und kann auch in dem Fusionsprotein wirken, um Immunschutz vor Herpes bei Menschen und Rind bereitzustellen.
GnRH ist ein reproduktives Systemhormon, das vom Rind synthetisiert wird. Inhibieren von GnRH-Aktivität beim Rind wird eine vorteilhafte Verminderung der Expression von Sexualeigenschaften, wie aggressivem Verhalten, bereitstellen. Da BHV-1-Pathogen Rinder infiziert, kann ein Immunogen von BHV-1 als ein Träger mit GnRH angewendet werden. Somit werden in einer Ausführungsform ein Anteil (a) analog zu der Gesamtheit oder einem Teil eines GnRH-Peptids und einem Anteil (b) analog zu der Gesamtheit oder einem Teil eines Immunogens von BHV-1 verbunden, unter Bereitstellung eines Fusionsproteins, das eine duale Immunreaktion beim Rind induziert, die sowohl GnRH-Aktivität inhibiert, als auch gegen BHV-1-Infektion schützt.
Die proteinartigen Anteile (a) und (b) für die erfindungsgemäßen Fusionsproteine können gemäß auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren erhalten werden. Beispielsweise kann entweder einer oder beide von Anteil (a) oder Anteil (b) durch Reinigung aus natürlichen Quellen erhalten werden. Alternativ kann einer oder beide von Anteil (a) oder Anteil (b) durch synthetisches Verbinden von Aminosäuren miteinander erhalten werden. Alternativ können einer oder beide von Anteil (a) oder Anteil (b) rekombinant unter Anwendung von gut bekannten rekombinanten Techniken für ein Polynucleotidmolekül synthetisiert werden, umfassend eine Nucleotidsequenz, die den Anteil (a) oder den Anteil (b) codiert. Vorzugsweise wird ein Polynucleotidmolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, die Anteil (a) codiert, an ein Polynucleotidmolekül ligiert, umfassend eine Nucleotidsequenz, die Anteil (b) codiert, sodass das gesamte Fusionsprotein rekombinant synthetisiert ist.
Rekombinante Techniken innerhalb des Fachgebiets des Durchschnittsfachmanns können angewendet werden, um Polynucleotidmoleküle herzustellen, die Anteile (a) und (b) der vorliegenden Fusionsproteine codieren. Solche Techniken werden unter anderem in Maniatis, et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis et al., (Hrsg.), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego; und Erlich (Hrsg.), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, New York, beschrieben, wobei alle davon hierin durch Hinweis einbezogen sind.
Die Aminosäuresequenzen von vielen Hormonpeptiden sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Die Aminosäuresequenz von GnRH ist auf dem Fachgebiet bekannt (siehe beispielsweise Ladd, A., 1993, vorstehend). Die Aminosäuresequenz von GnRH wird hierin auch bereitgestellt (SEQ ID NR: 13).
Beispiele für BHV-1-Antigene, aus denen der proteinartige Anteil (b) abgeleitet sein kann, schließen BHV-1 gB, BHV-1 gC und BHV-1 gD (auch bekannt auf dem Fachgebiet als BHV-1gI, -gIII bzw. -gIV) ein, sind jedoch nicht darauf begrenzt. Verfahren zum Gewinnen von proteinartigen Anteilen, die zu der Gesamtheit oder einem Teil solcher Antigene analog sind, werden vorstehend beschrieben. Beispielsweise offenbart US-Patent 5 151 267, Babiuk et al., die Nucleotidsequenzen und deduzierten Aminosäuresequenzen von BHV-1gI, -gIII und -gIV. Siehe auch US-Patent 5 585 264, Babiuk et al. Zusätzlich offenbart US-Patent 5 545 523, Batt et al., BHV-1-spezifische Oligonucleotide, die bei der Verstärkung von BHV-1gI und -gIV-Gensequenzen verwendbar sind. Weiterhin wurden Verfahren zum Reinigen von BHV-1-Glycoproteinen aus Virusinfizierten Zellkulturen beschrieben (Babiuk, L.A. et al., 1987 Virology 159:57–66). Die Aminosäuresequenz von voller Länge BHV-1gD, wie in Tikoo et al., 1990, vorstehend, veröffentlicht, wird hierin bereitgestellt (siehe 5 und SEQ ID NR: 19). Expression von Volllängen-reifem BHV-1gD wurde in Baculovirus-, Adenovirus-, Vacciniavirus- und E.coli-Systemen (van Drunen Littel-van den Hurk, S. et al., 1993, Vaccine 11:25–35) ausgeführt. Die Offenbarungen und Lehren der vorstehenden Patente und Veröffentlichungen werden hierin durch Hinweis einbezogen. Ein weiteres Beispiel eines BHV-1gD-Antigens, das im Ganzen oder zum Teil für ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, ist die BHV-1gD-Polyaminosäure, die durch Klon, FlgD/Pots207nco(#79) (siehe 3 und SEQ ID NR: 17) codiert.
Obwohl jeder Teil von einem BHV-1-Antigen, der eine Immunreaktion stimulieren kann, die das Peptid, aus dem Anteil (a) abgeleitet ist, inhibiert, und, wie in dem ersten Aspekt der Erfindung, eine Immunreaktion, die eine Kuh vor BHV-1-Infektion schützt, kann in den erfindungsgemäßen Fusionsproteinen angewendet werden, wobei Beispiele von bevorzugten Teilen von BHV-1gD, die in dieser Erfindung verwendet werden können, trunkiertes gD (tgD), reifes gD (mgD) und trunkiertes reifes gD (tmgD) sind. Trunkiertes gD (tgD) bezieht sich auf ein gD-Protein, worin die Transmembrandomäne, gegebenenfalls mit Stromabwärts- und/oder Stromaufwärts-Nucleotiden, vollständig oder teilweise entfernt wurde. Die Transmembrandomäne für gD ist auf dem Fachgebiet als ein teilweiser Polyaminosäurebereich von gD von im Allgemeinen stark hydrophoben Aminosäuren bekannt. Die Transmembrandomäne von gD/Pots, BHV-1gD, codiert durch Klon FlgD/Pots207nco(#79), ist in 3 angegeben. Die Transmembrandomäne für gD/Pots beginnt bei Aminosäure 364 (Valin) und endet bei Aminosäure 389 (Tyrosin). Reifes gD bezieht sich auf ein gD-Protein, das keine Signalsequenz an dem Amino-endständigen Ende aufweist. Die Signalsequenz von voller Länge gD/Pots ist in 3 angegeben. In einer weiteren Ausführungsform kann der proteinartige Anteil (b) von dem Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung eine heterologe Sig nalsequenz, die an das Amino-endständige Ende des Proteins gebunden ist, umfassen. Alternativ kann Anteil (b) keine Signalsequenzen umfassen. In einer Ausführungsform der Erfindung ist Anteil (b) analog zu einem BHV-1gD, das sowohl trunkiert als auch reif ist (tmgD). Ein Beispiel eines trunkierten, reifen gD-Antigens wird in SEQ ID NR: 35 bereitgestellt. Ein Beispiel von trunkiertem gD-Antigen, das nicht reif ist, wird in SEQ ID NR: 29 bereitgestellt.
Wenn hierin verwendet, bezieht sich „tgD" auf ein BHV-1gD-Protein, das wie vorstehend beschrieben trunkiert ist, „mgD" bezieht sich auf ein BHV-1gD-Protein, das wie vorstehend beschrieben reif ist, und „tmgD" bezieht sich auf ein BHV-1gD-Protein, das sowohl trunkiert als auch reif ist.
Der Begriff „GnRH-Peptid" bedeutet, sofern nicht anders ausgewiesen, ein Molekül mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 13. In einer Ausführungsform umfassen die vorliegenden Fusionsproteine Mehrfachanteile (a), analog zu einem GnRH-Peptid. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die erfindungsgemäßen Fusionsproteine einen oder mehrere Anteile, die analog zu vier GnRH-Peptiden, die aufeinander folgend verbunden sind; d.h. einen oder mehrere Anteile analog zu einem GnRH-Tetramer. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung einen 4GnRH-Anteil. Wenn hierin verwendet, bezieht sich „4GnRH" auf ein GnRH-Tetramer mit vier GnRH-Peptiden, aufeinander folgend in der gleichen Amino-endständigen/Carboxy-endständigen Orientierung verbunden. Vorzugsweise umfassen die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung ein oder mehrere GnRH-Tetramere, wobei jedes Tetramer eine in SEQ ID NR: 15 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
Hierin bereitgestellte mit Bindestrich geschriebene Ausdrücke und die die Begriffe „4GnRH", „tmgD", „tgD" und „mgD" (wie vorstehend definiert) enthalten, zeigen Fusionsproteine an, die Polyaminosäureanteile umfassen, die den von links nach rechts in der ausgewiesenen Reihenfolge gebundenen Begriffen entsprechen; das linke Ende, das dem Amino beendeten Ende des Fusionsproteins entspricht, und das rechte Ende, das dem Carboxy-beendeten Ende des Fusionsproteins entspricht. Die Polyaminosäureanteile können direkt aneinander gebunden sein, oder sie können indirekt gebunden werden; d.h. die Anteile können getrennt durch eine oder mehrere (beispielsweise 1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 3) Aminosäuren sein. Somit bezieht sich „tmgD-4GnRH" auf ein Fusionsprotein mit einem trunkierten, reifen gD-Anteil, verbunden direkt oder indirekt, mit einem 4GnRH-Anteil, wobei das Carboxy-beendete Ende des trunkierten, reifen gD-Anteils an das Amino-beendete Ende von dem 4GnRH gebunden ist (direkt oder indirekt). Als weiteres Beispiel bezieht sich „tgD-4GnRH" auf ein Fusionsprotein mit dem Amino-endständigen Ende von 4GnRH-Anteil, verbunden mit dem Carboxy-endständigen Ende eines trunkierten gD-Antigens, das nicht reif ist. Als weiteres Beispiel bezieht sich „4GnRH-tmgD-4GnRH" auf einen 4GnRH-Anteil mit einem Carboxylende, das an das Aminosäureende eines tmgD-Anteils gebunden ist, wobei der tmgD-Anteil wiederum durch sein Carboxylende an das Aminoende eines zweiten 4GnRH-Anteils gebunden ist. Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung schließen die Beispiele von in diesem Absatz beschriebenen Fusionsproteine ein, sind jedoch nicht darauf begrenzt. Ein weiteres Beispiel eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins ist tmgD-4GnRH. In beliebigen der vorstehend erwähnten Beispiele können die Anteile direkt oder indirekt gebunden sein.
Wie vorstehend erörtert, können proteinartige Anteile (a) und (b) mit Hilfe von chemischen Linkern und Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, chemisch verbunden werden. Als ein Beispiel können bestimmte Aminosäuren an einem Anteil (a) oder (b), beispielsweise an einem gD-analogen (b)-Anteil, chemisch mit einem Reagenz, wie Jodacetamid, aktiviert werden. Verbleibende Anteile (a) oder (b), beispielsweise GnRH-Monomere und/oder -Multimere, können hinzugefügt werden. In diesem Beispiel reagieren endständig eingearbeitete Cysteinreste an GnRH mit aktivierten Lysinresten an dem gD-Analogen. Diese Reaktion ergibt Fusionsproteine gemäß der vorliegenden Erfindung, die einen zentralen gD-analogen Anteil mit Mehrfach-GnRH-Analogen, verbunden dort über etwa verschiedene Lysinreste, umfasst. In einem weiteren Beispiel können Anteile (b) analog zu einem BHV-1-Antigen, zusammen mit Anteilen (a) analog zu GnRH-Monomeren oder -Multimeren, in Gegenwart von Ethyldimethylaminopropylcarbodiimid (EDAC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) kombiniert werden (siehe Bernatowics, M. und Matsueda, G., 1986, Analytical Biochemistry 155:95–102). Diese Reaktion ergibt auch einen zentralen Anteil (b), analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem BHV-1-Antigen, mit Mehrfachanteilen (a), analog zu GnRH-Monomeren oder -Multimeren, die chemisch daran gebunden sind. Die chemisch synthetisierten Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung können auch gegebenenfalls chemisch modifiziert werden, um Substituenten, die von Aminosäuren verschieden sind, zu umfassen, beispielsweise Kohlenhydratsubstituenten, unter Anwendung bekannter Techniken. Andere chemische Techniken zum Kombinieren von proteinartigen Anteilen, entweder mit Mehrfachbindungen an ein proteinartiges Zentrum, oder lineare Bindungen von proteinartigen Anteilen, können zum chemischen Synthetisieren von erfindungsgemäßen Fusionsproteinen unter Verwendung bekannter Techniken angewendet werden. Techniken zum Herstellen von chemisch-synthetisierten Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung werden unter anderem in Dunn und Pennington, 1994, Methods in Molecular Biology, Band 26, Kapitel 10 (Humana Press Inc.), welches hierin durch Hinweis einbezogen ist, beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt auch wie vorstehend beschriebene, rekombinante Fusionsproteine bereit. Beispiele für erfindungsgemäße rekombinante Fusionsproteine schließen das rekombinante Fusionsprotein, das durch das Plasmid pCMV-gD:GnRH, das Plasmid pQE-gD:GnRH, codiert wurde, das rekombinante Fusionsprotein, das durch das Plasmid pQE-GnRH:gD:GnRH codiert wurde, und das rekombinante Fusionsprotein, das durch das Plasmid pQE-GnRH:gD codiert wurde, ein. Zellen, die diese Plasmide enthalten, wurden bei der American Type Culture Col lection (ATCC Manassas, Virginia, USA) hinterlegt; sie wurden unter den Zugangsnummern 203370, 98953, 98955 bzw. 98954 hinterlegt. Ein weiteres Beispiel eines rekombinanten Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung ist das rekombinante Fusionsprotein, exprimiert durch den Baculoviruskonstrukt BacgD:GnRH. Bac-gD:GnRH wurde ebenfalls bei dem ATCC hinterlegt und wurde mit der ATCC Zugangsnummer VR-2633 gekennzeichnet. Die vorstehend erwähnten pQE-Plasmide und Baculoviruskonstrukt werden besonders für die In-vitro-Expression von Fusionsproteinen angewendet. Das Plasmid pCMV-gD:GnRH ist bei der In-vivo-Expression besonders verwendbar.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Fusionsproteine können gegebenenfalls Anteile umfassen, die beim Reinigen der Fusionsproteine von dem Reaktionsmedium gemäß In-vitro-Transkription und -Translation unterstützen. Ein Beispiel einer Polyaminosäuresequenz, die bei der Reinigung eines rekombinanten Proteins von dem Medium unterstützen kann, ist 6XHIS tag. Die Wortgruppe „6XHIS tag" wird in dieser Anmeldung austauschbar mit „6XHIS Leader" verwendet. Die Sequenz des 6XHIS tag, codiert durch den Vektor pQE-31, wird in SEQ ID NR: 37 bereitgestellt. Proteine, umfassend ein 6XHIS tag, können von den Medien mittels Durchleiten der Medien durch eine Nickelsäule, wie Ni-NTA-Säule von Quiagen (Chatsworth, CA), gereinigt werden. Ein weiteres Beispiel eines Anteils, der beim Reinigen von rekombinanten Fusionsproteinen dieser Erfindung gemäß In-vitro-Expression unterstützen kann, ist das FLAG^TM Epitop tag (International Biotechnologies Inc., New Haven, CT), welches ein hydrophiles Markerpeptid darstellt. Das das FLAGT" Epitop tag codierende Gen kann durch Standardtechniken in ein Polynucleotidmolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein Fusionsprotein dieser Erfindung bei einem Punkt codiert, entsprechend beispielsweise dem Amino- oder Carboxylterminus des Fusionsproteins, inseriert werden. Ein daraus exprimiertes Fusionsprotein kann dann nachgewiesen werden und unter Anwendung von kommerziell erhältlichen anti-FLAG^TM-Antikörpern Aqffinitäts-gereinigt werden.
Andere Mittel zum Reinigen von rekombinanten Proteinen, exprimiert in vitro, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und können zum Reinigen der rekombinanten Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Verfahren werden unter anderem in Marshak, D. R., et al., 1996, Strategies for Protein Purification and Characterization: a Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben.
Wurde ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein einmal erhalten, kann es, falls erwünscht, durch Standardverfahren charakterisiert werden, einschließlich durch SDS-PAGE, Größenausschlusschromatographie, Aminosäuresequenzanalyse, usw.. Das Fusionsprotein kann weiter charakterisiert werden, unter Anwendung von Hydrophilizitätsanalyse (siehe beispielsweise Hopp und Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824), oder analogen Softwarealgorithmen, zum Identifizieren von hydrophoben und hydrophilen Bereichen. Strukturanalyse kann zum Identifizieren der Bereiche des Fusionsproteins ausgeführt werden, die spezifische sekundäre Strukturen annehmen. Biophysikalische Verfahren, wie Röntgen-Kristallographie (Engstrom, 1974, Biochem. Exp. Biol. 11: 7–13), Computermodellieren (Fletterick und Zoller (Hrsg.), 1986, in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), und kernmagnetische Resonanz (NMR) können verwendet werden, um potenzielle Wechselwirkungsstellen zwischen dem Polypeptid und anderen mutmaßlich in Wechselwirkung tretenden Proteinen/Rezeptoren/Molekülen, wie Antikörpern, zu kartographieren und zu untersuchen.
Polynucleotid-Moleküle und Vektoren, die Fusionsproteine codieren
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Polynucleotidmolekül bereit, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung codiert. Beispiele für solche Polynucleotidmoleküle schließen ein Polynucleotidmolekül, das eine in SEQ ID NR: 34 angeführte Nuc leotidsequenz umfasst, welche ein 4GnRH-tmgD-4GnRH-Fusionsprotein codiert; ein Polynucleotidmolekül, das die in SEQ ID NR: 40 angeführte Nucleotidsequenz umfasst, welche ein 4GnRHtmgD-4GnRH-Fusionsprotein codiert; und ein die in SEQ ID NR: 41 angeführte Nucleotidsequenz umfassendes Polynucleotidmolekül, das ein tmgD-4GnRH-Fusionsprotein codiert ein, sind jedoch nicht darauf begrenzt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Klonierungs- und Expressionsvektoren bereit, die ein Polynucleotidmolekül umfassen, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein Fusionsprotein der Erfindung codiert. Der hierin verwendete Begriff „Vektor" bedeutet eine Einheit, die genetische Information (in Form von Polynucleotidsequenzen) umfasst, wobei die Information in der Lage ist, Polyaminosäuren und/oder Programm der Replikation der Einheit, wenn geeignete Bedingungen und Ressourcen (beispielsweise Aminosäure, Nucleotide und Transkriptionsfaktoren) vorliegen, zu exprimieren. Beispiele für solche Einheiten schließen Viren, Plasmide und Cosmide ein.
Wenn hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „Nucleotidsequenz", „codierende Sequenz", „Polynucleotid", „Polynucleotidsequenz" und dergleichen auf sowohl DNA- als auch RNA-Sequenzen, die entweder einsträngig oder doppelsträngig sein können, und ein oder mehrere prokaryotische Sequenzen, eukaryotische Sequenzen, cDNA-Sequenzen, genomische DNA-Sequenzen, einschließlich Exons und Introns, und chemisch synthetisierte DNA- und RNA-Sequenzen einschließen können.
Die Erzeugung und Manipulation eines Polynucleotidmoleküls der vorliegenden Erfindung, das Nucleotidsequenzen, die Anteile (a) und (b) der vorliegenden Fusionsproteine umfassen, codiert, sind innerhalb des Fachgebiets des Durchschnittsfachmanns und können gemäß auch an anderen Stellen in Maniatis, et al., vorstehend; Ausubel, et al., vorstehend; Sambrook, et al., vorstehend; Innis et al., vorstehend; und Erlich, vorstehend, beschriebenen rekombinanten Techniken ausgeführt werden. Nucleotidsequenzen, die viele Hormonpeptide und virale Antigenpeptide codieren, sind auf dem Fachgebiet bekannt, und solche Information kann verwendet werden, um codierende Bereiche für die proteinartigen Anteile (a) und (b) herzustellen. Solche Sequenzen werden an anderen Stellen, in den vorstehend angeführten Literaturstellen, die Immunogene und Peptide, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, beschreiben, bereitgestellt. Alternativ können die Nucleotidsequenzen von Peptiden und viralen Antigenen unter Verwendung von in der Molekularbiologie bekannten Verfahren deduziert werden.
Nucleotidsequenzen, die Anteil (a) und/oder Anteil (b) codieren, können synthetisch hergestellt werden. Die gewünschte Sequenz kann aus überlappenden Oligonucleotiden hergestellt werden. Siehe beispielsweise Edge, 1981, Nature 292:756; Nambair et al., 1984 Science 223:1299; Jay et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:6311; und US-Patent 5 422 110 vorstehend.
In einem weiteren Beispiel kann die Aminosäuresequenz eines Peptids oder Antigens zum Aufbau von Sonden zum Identifizieren des Gens, das das Peptid oder Antigen in einer genomischen Library codiert, verwendet werden. In diesem Verfahren werden Oligonucleotidsonden, die einen Teil der Aminosäuresequenz des Peptids oder Antigens codieren, hergestellt. Die Oligonucleotidsonden werden verwendet, um eine geeignete DNA-Library auf Gene, die das Peptid oder das Antigen codieren, abzusuchen. Im Allgemeinen ist die DNA-Library, die abgesucht wird, eine Library, die aus genomischer DNA oder genomischer RNA (cDNA) aus einer geeigneten Quelle, wie einer Zelle oder ein Gewebe, das das Peptid exprimiert, oder aus einem das Antigen codierenden Virus, hergestellt wird. Techniken zum Isolieren von Genen auf diese Weise sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Nucleotidsequenzen, die homolog zu in hierin vorstehend beschriebenen Sequenzen zum Codieren von Immunogenen oder Peptiden erhalten werden, können in der vorliegenden Er findung ebenfalls verwendet werden. Für Zwecke der vorliegenden Erfindung ist eine zweite Nucleotidsequenz zu einer ersten Nucleotidsequenz „homolog", wenn sie das gleiche Protein, Peptid oder andere Polyaminosäure, wie die erste Nucleotidsequenz, codiert, oder wenn sie eine Polyaminosäure codiert, die ausreichend ähnlich zu der Polyaminosäure ist, die durch die erste Nucleotidsequenz codiert wurde, um beim Ausführen der vorliegenden Erfindung verwendbar zu sein. Da der genetische Code degenerativ ist, kann eine homologe Nucleotidsequenz eine beliebige Anzahl von „ruhigen" Basenaustauschen einschließen; d.h. Nucleotidsubstitutionen, die dennoch die gleiche Polyaminosäure codieren. Eine homologe Nucleotidsequenz kann weiterhin nicht-stille Mutationen enthalten; d.h. Basensubstitutionen, Deletionen und Additionen, die sich aus Aminosäureunterschieden in der codierten Polyaminosäure ergeben, solange die Sequenz der Polyaminosäure zum Ausführen der vorliegenden Erfindung verwendbar bleibt. Eine zweite Nucleotidsequenz, die homolog zu einer ersten Nucleotidsequenz ist, ist vorzugsweise jene, die zu der Ergänzung der ersten Nucleotidsequenz unter moderat strengen Bedingungen; d.h. Hybridisierung zu filtergebundener DNA in 0,5 M NaHPO₄, 7%igem Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und Waschen in 0,2×SSC/0,1% SDS bei 42°C (siehe Ausubel et al., vorstehend), hybridisiert. Bevorzugter werden homologe Nucleotidsequenzen aneinander unter sehr strengen Bedingungen hybridisiert; d.h. Hybridisierung an filtergebundener DNA in 0,5 M NaHPO₄, 7% SDS, 1 mM EDTA bei 65°C, und Waschen in 0,1×SSC/0,1% SDS bei 68°C (siehe Ausubel et al., vorstehend).
Nach Erhalten von Polynucleotidmolekülen, umfassend Nucleotidsequenzen, die Anteile (a) und (b) codieren, können diese Nucleotidmoleküle aneinander, unter Anwendung geeigneter Enzyme und bekannter Techniken, zur Bildung eines Polynucleotidmoleküls, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein Fusionsprotein dieser Erfindung codiert, ligiert werden.
Beispiele für codierende Sequenzen, die beim Konstruieren von Polynucleotidmolekülen verwendbar sind, die Se quenzen, die die erfindungsgemäßen Fusionsproteine codieren, umfassen, und Vektoren, die solche Polynucleotidmoleküle umfassen, schließen die in SEQ ID NR: 16 wiedergegebene Sequenz, die das BHV-1 gD-Antigen FlgD/Pots codiert, exprimiert durch Klon FlgD/Pots207nco(#79), angeführt in SEQ ID NR: 17; die Sequenz, wiedergegeben in SEQ ID NR: 18, die M59846 BHV-1 gD codiert, angeführt in SEQ ID NR: 19; die Sequenz, wiedergegeben in SEQ ID NR: 28, die ein trunkiertes gD-Antigen, das nicht reif ist, codiert, angeführt in SEQ ID NR: 29; und die in SEQ ID NR: 36 wiedergegebene Sequenz, die ein trunkiertes reifes gD codiert, angeführt in SEQ ID NR: 35 ein, sind jedoch nicht darauf begrenzt. Ein Beispiel einer Nucleotidsequenz, die ein GnRH-Monomer codiert, wird in SEQ ID NR: 33 angeführt. Ein Beispiel einer Sequenz, die ein GnRH-Tetramer codiert, nämlich ein GnRH-Tetramer mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR: 15 angeführt wird, wird in SEQ ID NR: 32 angegeben.
In einer Ausführungsform ist ein Vektor der vorliegenden Erfindung zur In-vitro-Expression eines Fusionsproteins, wie einem Plasmid, geeignet, welches in der Lage ist, eine Wirtszelle, wie eine Bakterienzelle, zu transfizieren und das Fusionsprotein in der Bakterienzelle zu exprimieren. Beispiele für Plasmidvektoren schließen Plasmide, wie rekombinante pQE-Plasmide, ein, die in der Lage sind, Bakterien zu transfizieren und die erfindungsgemäßen Fusionsproteine zu exprimieren. Beispiele für einige prokaryotische Expressionsvektorplasmide, in die ein Polynucleotidmolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein codiert, inseriert werden können, schließen pQE-50 und pQE-31 (Qiagen, Chatsworth, CA), pUC8, pUC9, pBR322 und pBR239 (Biorad Laboratories, Richmond, CA), pPL und pKK223 (Pharmacia, Piscataway, NJ) ein. Andere, auf dem Fachgebiet bekannte Plasmide können auch zum Herstellen von Vektoren verwendet werden, die ein Polynucleotidmolekül umfassen, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein codiert, und solche Plasmide können durch den Durchschnittsfachmann ermittelt werden. Bevorzugte Plasmide, die Fusionsproteine der Erfindung in vitro exprimieren können, schließen pQE-gD:GnRH (ATCC Zugangs-Nr. 98953), pQE-GnRH:gD:GnRH (ATCC Zugangs-Nr. 98955) und pQE-GnRH:gD (ATCC Zugangs-Nr. 98954) ein. Diese Plasmide können die erfindungsgemäßen Fusionsproteine in E.co1i-Bakterien exprimieren.
In einer weiteren Ausführungsform ist ein Vektor der vorliegenden Erfindung ein Plasmid, das zur In-vivo-Expression eines Fusionsproteins geeignet ist. Plasmide, die eukaryotische Zellen transfizieren können und die zum Aufbauen von Vektoren der vorliegenden Erfindung angewendet werden können, können durch den Durchschnittsfachmann ermittelt werden. Solche Plasmide können Sequenzen umfassen und codieren Elemente, die bei der In-vivo-Expression und dem Verarbeiten der Fusionsproteine in einem beimpften Vertebraten unterstützen. Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßes Plasmid eine eukaryotische Promotorsequenz umfassen. Als weiteres Beispiel kann ein erfindungsgemäßes Plasmid eine Sequenz, die ein an das exprimierte Fusionsprotein gebundenes Signal codiert, umfassen, wobei das Signal den Transport des exprimierten Fusionsproteins zu der Zellmembran und Exkretion des Fusionsproteins aus der Zelle in das Kreislaufsystem des beimpften Vertebraten ergibt. Ein Beispiel eines Plasmids, das zum Aufbau von Vektoren in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, die Fusionsproteine in vivo exprimieren, ist pCMV (Clontech, Inc., Palo Alto, CA). Andere typische eukaryotische Expressionsplasmide, die aufgebaut werden können, um ein Polynucleotidmolekül zu umfassen, das eine Nucleotidsequenz, die ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung codiert, umfasst, schließen ein induzierbares Säugerexpressionssystem und die auf Cytomegalovirus Promotor-Verstärker-basierenden Systeme (Promega, Madison, WE; Stratagene, La Jolla, CA; Invitrogen) ein. Andere, zum Herstellen von Vektoren, die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung in vivo exprimieren, verwendbare Plasmide können durch den Durchschnittsfachmann ermittelt werden. Ein bevorzugtes Beispiel eines erfindungs gemäßen Plasmids, das in vivo Expression eines Fusionsproteins ausführen kann, ist pCMV-gD:GnRH, welches bei der ATCC (ATCC Zugangs-Nr. 203370) hinterlegt wurde.
Vektoren der vorliegenden Erfindung können auch rekombinante Viren einschließen, die ein Polynucleotidmolekül umfassen, welches eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung codiert. Solche Viren können gemäß auf dem Fachgebiet bekannten Techniken hergestellt werden. Sie können beispielsweise aus Bakteriophagen hergestellt werden, wobei der sich ergebende rekombinante Bakteriophage zum Exprimieren und Erzeugen der vorliegenden Fusionsproteine in vitro in Bakterien verwendbar ist. Beispiele für Bakteriophagen, die zum Herstellen der erfindungsgemäßen Vektoren verwendet werden können, schließen T4, T7, ΦX174, G4, M13 und folgende ein. Anderer, für die vorliegende Erfindung verwendbarer Bakteriophage kann durch den Durchschnittsfachmann ermittelt werden.
Rekombinante Viren, die Insektenzellen oder Hefezellen transfizieren können, können auch für die In-vitro-Expression und Erzeugung von Fusionsproteinen dieser Erfindung in Insektenzellen bzw. Hefezellen aufgebaut werden. In dieser Hinsicht ist ein weiteres Beispiel eines Vektors, der zur In-vitro-Erzeugung der erfindungsgemäßen Fusionsproteine verwendet werden kann, ein rekombinantes Virus, das auf einem Baculovirus basiert. In bevorzugten Ausführungsformen stellt die vorliegende. Erfindung Baculovirusvektoren bereit, die tmgD-4GnRH, 4GnRH-tmgD-4GnRH oder 4GnRH-tmgD exprimieren. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist der Vektor der Baculovirusvektor Bac-gD:GnRH, der ein tmgD-4GnRH-Fusionsprotein exprimiert. Bac-gD:GnRH wurde bei der ATCC (ATCC Zugangs-Nr. VR-2633) hinterlegt.
Rekombinante Viren, die die vorliegenden Fusionsproteine in eukaryotischen Zellen, wie Vögel- oder Säugerzellen, einschließlich Viren für sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Expression der Fusionsproteine in eukaryotischen Zellen, infizieren und exprimieren können, können ebenfalls gemäß auf dem Fachgebiet gut bekannten Techniken konstruiert werden. Beispiele für Viren, aus denen solche rekombinanten Viren hergestellt werden können, schließen Poxviren, wie Pockenvirus, und Adenovirus ein. Sowohl rekombinantes Pockenvirus als auch rekombinanter Adenovirus können für entweder In-vitro- oder In-vivo-Expression verwendet werden. Andere Viren, die zur Expression in eukaryotischen Zellen geeignet sind, können durch den Durchschnittsfachmann ermittelt werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist ein Vektor der vorliegenden Erfindung ein „Transfervektor", umfassend ein Polynucleotidmolekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung codiert. Ein Transfervektor ist ein Plasmid, das eine Sequenz umfasst, die ein Peptid codiert, wobei das Plasmid eine geeignete Wirtszelle infizieren kann, wie eine geeignete Insekten- oder Säugerzelle, in einem In-vitro-Co-Infektionsverfahren mit einem Virus, unter Verursachen, dass die Wirtszelle ein rekombinantes Virus erzeugt, wobei das rekombinante Virus selbst ein Vektor ist, der das Peptid, das durch das Plasmid in einem geeigneten Expressionssystem codiert wird, exprimieren kann. Die Herstellung von Transfervektoren zur In-vitro-Erzeugung von rekombinantem Virus ist auf dem Fachgebiet gut bekannt, und Plasmide, die zum Herstellen von Transfervektoren gemäß dieser vorliegenden Erfindung verwendbar sind, können durch den Durchschnittsfachmann ermittelt werden. Beispiele für Plasmide, die zum Herstellen von Transfervektoren geeignet sind, schließen pBacPAK8 und pBacPAK9 (Clontech, Inc.) ein, sind jedoch nicht darauf begrenzt. Ein bevorzugter Transfervektor zum Herstellen eines viralen Vektors, der ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung codiert, ist der Transfervektor pBacHISgD:GnRH.
Die Nucleotidsequenz, die ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung codiert, kann ligiert werden an und angeordnet werden unter der Steuerung von verschiedenen Nucleotidelementen, wie Signalsequenzen, induzierbaren und nichtinduzierbaren Promotoren, Ribosombindungsstellen für bakteri elle Expression und Operatoren. Solche Elemente erlauben der Nucleotidsequenz, transkribiert zu werden; entweder in vivo oder in vitro, in eine Wirtszelle transfiziert mit einem Vektor, der das Polynucleotidmolekül umfasst, und folglich in der Wirtszelle geklont oder exprimiert zu werden. Regulatorische Sequenzen und Verstärkersequenzen können auch in das Polynucleotidmolekül der Erfindung eingeschlossen sein. Die codierenden Sequenzen werden in „operativer bzw. wirksamer Verbindung" mit den Elementen, die in den Polynucleotidmolekülen eingeschlossen sind, angeordnet, was bedeutet, dass ihre Anordnung und Orientierung derart ist, dass Transkription der codierenden Sequenzen stattfinden kann. Solche Anordnung ist innerhalb des Fachgebiets des Durchschnittsfachmanns.
Regulatorische Elemente von Polynucleotidmolekülen der vorliegenden Erfindung können in ihrer Stärke und ihren Spezifizitäten variieren. In Abhängigkeit von dem anzuwendenden Wirts-/Vektorsystem können beliebige einer Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden. Wenn beispielsweise in Säugerzellsysteme kloniert wird, können Promotoren, die aus dem Genom von Säugerzellen isoliert werden, beispielsweise Maus-Metallothionein-Promotor, oder aus Viren, die in diesen Zellen wachsen, Pockenvirus 7.5K Promotor oder murines Moloney-Sarcomavirus, lange endständige Wiederholung, verwendet werden. Durch rekombinante DNA- oder synthetische Techniken erhaltene Promotoren können auch verwendet werden, um Transkription der inserierten Sequenz bereitzustellen. Zusätzlich kann Expression von bestimmten Promotoren in Gegenwart von besonderen Inducern, beispielsweise Zink- und Cadmiumionen, für Metallothioneinpromotoren erhöht werden. Nicht-begrenzende Beispiele für transkriptionale regulatorische Bereiche oder Promotoren schließen für Bakterien den β-Gal-Promotor, den T7-Promotor, den T5-Promotor, den TAC-Promotor, λ links und rechts Promotoren, Trp- und Lac-Promotoren, Trp-Lac-Fusionspromotoren, usw.; für Hefe-, glycolytische Enzympromotoren, wie ADH-I- und -II-Promotoren, GPK-Promotor, PGI-Promotor, TRP-Promotor, usw.; und für Säugerzellen frühe und späte SV40-Promotoren, hauptsächliche späte Adenovirus-Promotoren, unter anderen, ein.
Spezielle Startsignale können zur Translation von inserierten Codierungssequenzen verwendet werden. Diese Signale schließen typischerweise ein ATG-Startcodon und benachbarte Sequenzen ein. In Fällen, wo das Polynucleotidmolekül der vorliegenden Erfindung sein eigenes Startcodon einschließt und benachbarte Sequenzen in den geeigneten Expressionsvektor inseriert werden, können keine zusätzlichen Translationskontrollsignale benötigt werden. Jedoch in Fällen, wenn nur ein Anteil einer codierenden Sequenz inseriert wird, können exogene translationale Kontrollsignale, einschließlich des ATG-Startcodons, erforderlich sein. Diese exogenen translationalen Kontrollsignale und Startcodone können aus einer Vielzahl von Quellen, sowohl natürlich als auch synthetisch, erhalten werden. Weiterhin muss das Startcodon in Phase mit dem Leseraster der codierenden Bereiche sein, um In-Raster-Translation des gesamten Inserts zu sichern.
Vektoren dieser Erfindung können Repressorgene und Operatoren einschließen, die die Transkription von mRNA regulieren. Beispiele für Operatoren, die in die vorliegenden Vektoren eingeschlossen sein können, schließen die Lac-Operatorsequenz ein. Andere Operatoren sind auf dem Fachgebiet bekannt und können in die erfindungsgemäßen Vektoren eingeschlossen sein.
Expressionsvektoren können auch ein erfindungsgemäßes Polynucleotidmolekül enthalten, das weiter aufgebaut wird, um Polylinkersequenzen zu enthalten, die spezifische Proteasespaltungsstellen codieren, sodass das exprimierte Fusionsprotein aus den exprimierten Vektorsequenzen durch Behandlung mit einer spezifischen Protease freigesetzt werden kann. Beispielsweise kann der Fusionsproteinvektor eine Nucleotidsequenz einschließen, die eine Thrombin- oder Faktor-Xa-Spaltungsstelle, unter anderen, codiert.
Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung können auch Nucleotidsequenzen umfassen, die eine Polyaminosäure codieren, die bei der Reinigung eines Fusionsproteins aus Medien nach Expression unterstützen kann. Ein Beispiel von einer solchen Nucleotidsequenz ist eine Nucleotidsequenz, die ein 6XHIS tag codiert, wie die in SEQ ID NR: 38 angeführte Nucleotidsequenz.
Transformierte Zellen zum Exprimieren von Fusionsproteinen
Die vorliegende Erfindung stellt auch transformierte Zellen bereit, die ein Polynucleotidmolekül umfassen, welches eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein wie hierin beschriebenes Fusionsprotein codiert. Zur Transformation für diese Erfindung verwendbare Zellen schließen bakterielle Zellen, Hefezellen, Säugerzellen, Insektenzellen und Pflanzenzellen ein. Transformierte Zellen dieser Erfindung können durch Transfizieren einer Zelle mit einem ein Polynucleotidmolekül umfassenden Vektor, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die das wie vorstehend beschriebene Fusionsprotein codiert, hergestellt werden.
Beim Ausführen der vorliegenden Erfindung verwendbare Wirtszellen können eukaryotisch und prokaryotisch sein. Solche transformierten Wirtszellen schließen Mikroorganismen, wie Bakterien, transformiert mit einem rekombinanten Bakteriophagen oder Plasmid; Hefe, transformiert mit einem rekombinanten Vektor; Tierzellen, wie Säugerzellen, infiziert mit einem rekombinanten Virusvektor, beispielsweise Adenovirus oder Vacciniavirus, unter anderen; und Insektenzellen, transformiert mit einem rekombinanten Virusvektor, beispielsweise Baculovirusvektor ein, sind jedoch nicht darauf begrenzt.
Zur Expression und zum Ernten von Fusionsproteinen in vitro können bakterielle Zellen als Wirtszellen verwendet werden. Beispielsweise kann ein Stamm von E. coli verwendet werden, wie zum Beispiel der DH5α-Stamm, erhältlich von ATCC, Rockville, MD, USA (ATCC Zugangs-Nr. 31343) oder von Stratagene (La Jolla, CA) oder den BL21-Stamm, erhältlich von Mi kroorganismushinterlegungen, wie der ATCC. Eukaryotische Wirtszellen., einschließlich Hefezellen und Vertebratezellen, beispielsweise von einer Maus, Hamster, Kuh, Affe oder humane Zelllinie, können unter anderem ebenfalls wirksam angewendet werden. Beispiele für eukaryotische Wirtszellen, die angewendet werden können, um ein Fusionsprotein der Erfindung zu exprimieren, schließen Chinesische Hamster-Ovarienzellen (CHO) (beispielsweise ATCC Zugangs-Nr. CCL-61), NIH Schweizer Maus-Embryozellen NIH/3T3 (beispielsweise ATCC Zugangs-Nr. CRL-1658) und Madin-Darby-Rinderniere-(MDBK)-Zellen (ATCC Zugangs-Nr. CCL-22) ein.
Andere Zellen, die besonders zur In-vitro-Expression und zum Ernten von Fusionsproteinen dieser Erfindung verwendbar sind, sind Zellen, die ein System zur Glycosylierung von Aminosäuren von Proteinen besitzen. Einige Beispiele von Zellen, die ein Glycosylierungssystem aufweisen, sind Insektenzellen, Säugerzellen und Hefezellen. Systeme von verschiedenen Zelltypen können verschiedene Muster der Glycosylierung für ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein bereitstellen.
Der erfindungsgemäße rekombinante Vektor wird vorzugsweise in eine oder mehrere Wirtszellen aus einer im Wesentlichen homogenen Kultur von Zellen transformiert oder transfiziert. Der Vektor kann in Wirtszellen gemäß bekannter Techniken, wie beispielsweise durch Protoplastentransformation, Calciumphosphatpräzipitation, Calciumchloridbehandlung, Mikroinjektion, Elektroporation, Transfektion durch Kontakt mit einem rekombinierten Virus, Liposom-vermittelter Transfektion, DEAE-Dextrantransfektion, Transduktion, Konjugation, oder Mikroprojektil-Bombardement, unter anderen, eingeführt werden. Die Auswahl von Transformanten kann durch Standardverfahren, wie durch Auswählen von Zellen, die einen auswählbaren Marker exprimieren, beispielsweise antibiotischer Widerstand, verbunden mit dem rekombinanten Expressionsvektor, durchgeführt werden.
Ist einmal ein Expressionsvektor in die Wirtszelle eingeführt, kann die Integration und das Halten der Polynuc leotidsequenz, die ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein codiert, entweder in dem Wirtszellengenom oder episomal, durch Standardtechniken, beispielsweise durch Southern Hybridisierungsanalyse, Restriktionsenzymanalyse, PCR-Analyse, einschließlich Umkehrtranskriptase PCR (rt-PCR), oder durch immunologisches Assay zum Nachweisen des erwarteten Fusionsproteinprodukts bestätigt werden. Wirtszellen, die eine Polynucleotid-codierende Sequenz enthalten und/oder ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung exprimieren, können durch einen beliebigen von mindestens vier allgemeinen Ansätzen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, identifiziert werden, einschließlich: (i) DNA-DNA, DNA-RNA oder RNA-Antisense-RNA-Hybridisierung; (ii) Nachweisen des Vorliegens von „Marker"genfunktionen; (iii) Bewerten des Transkriptionsniveaus, wie durch die Expression von spezifischen mRNA-Transkripts in der Wirtszelle gemessen; oder (iv) Nachweisen des Vorliegens von reifem Polypeptidprodukt; beispielsweise durch Immunoassay, wie auf dem Fachgebiet bekannt.
Wurde einmal eine Polynucleotidsequenz, die ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung codiert, stabil in eine geeignete Zelle eingeführt, kann die transformierte Zelle klonal vermehrt werden, und die erhaltenen Zellen können unter Bedingungen wachsen, die für die Maximumherstellung des codierten Fusionsproteins förderlich sind. Solche Bedingungen schließen typischerweise transformierte, bis zu hoher Dichte wachsende Zellen ein. Wenn der Expressionsvektor einen induzierbaren Promotor umfasst, werden geeignete Induktionsbedingungen, wie beispielsweise Temperaturverschiebung, Erschöpfung von Nährmitteln, Zusatz von unbegründeten Inducern (beispielsweise Analogen von Kohlenhydraten, wie Isopropyl-β-D-thiogalac-topyranosid (IPTG)), Akkumulation von überschüssigen metabolischen Nebenprodukten, oder dergleichen, verwendet, wenn sie benötigt werden, um Expression zu induzieren.
Wenn das rekombinant exprimierte Fusionsprotein innerhalb der Wirtszellen verbleibt, werden die Zellen geerntet und lysiert, und das Produkt wird aus dem Lysat unter Extrak tionsbedingungen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, gereinigt, um Proteinabbau zu minimieren, wie beispielsweise bei 4°C, oder in Gegenwart von Proteaseinhibitoren, oder beidem. Wenn das rekombinant exprimierte Fusionsprotein aus Wirtszellen ausgewählt ist, kann das erschöpfte Nährmedium einfach gesammelt werden und das Fusionsprotein daraus isoliert werden.
Das rekombinant exprimierte Fusionsprotein kann aus Zelllysaten oder Kulturmedium, wie erforderlich, unter Anwendung von Standardverfahren, einschließlich, jedoch nicht auf eines oder mehrere der nachstehenden Verfahren begrenzt: Ammoniumsulfatausfällung, Größenfraktionierung, Ionenaustausch-Chromatographie, HPLC, Dichtezentrifugierung und Affinitäts-Chromatographie, gereinigt werden. Das rekombinant exprimierte Fusionsprotein kann, basierend beispielsweise auf der Größe oder Reaktivität mit einem Fusionsprotein-spezifischen Antikörper, oder durch das Vorliegen eines Fusions-tag, beispielsweise einem 6XHIS tag, nachgewiesen werden. Die vorliegende Erfindung umfasst rekombinant exprimiertes Fusionsprotein in einem ungereinigten Zustand, wie in das Kulturfluid sekretiert, oder in einem Zelllysat vorliegend, sowie ein teilweise oder im Wesentlichen gereinigtes rekombinantes Fusionsprotein, wobei alle zum Ausführen der vorliegenden Erfindung geeignet sind.
Impfstoffe, einschließlich Dual-Funktions-Impfstoffe, und Verfahren unter An Wendung derselben
Fusionsprotein, Vektoren und transformierte Zellen der vorliegenden Erfindung können zum Herstellen von Dual-Funktions-Impfstoffen verwendet werden, um eine immunoinhibitorische Reaktion in einem Vertebraten gegen das GnRH-Peptid zu induzieren, wozu Anteil (a) der vorliegenden Fusionsproteine analog ist, unter gleichzeitigem Schützen gegen BHV-1-Infektion. Solche Impfstoffe sind in einem Vertebraten nur durch Inhibieren eines GnRH-Peptids, zu dem Anteil (a) analog ist, auch verwendbar.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen Dual-Funktions-Impfstoff zum Inhibieren von GnRH-Aktivität beim Rind, unter gleichzeitigem Schützen des Rinds vor BHV-1-Infektion, bereit, welcher ein Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, oder einen Vektor oder eine transformierte Zelle, umfassend ein Polynucleotidmolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein solches Fusionsprotein codiert, wobei Anteil (a) des Fusionsproteins analog zu der Gesamtheit oder einem Teil eines GnRH-Peptids ist, und wobei Anteil (b) analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem BHV-1-Antigen ist, wobei das Fusionsprotein in einer Menge vorliegt, die wirksam ist, um GnRH-Aktivität beim Rind zu inhibieren und auch das Rind vor BHV-1-Infektion schützt, zusammen mit einem Träger, der zur veterinären Anwendung verträglich ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines Fusionsproteins bereit, das eine duale Immunreaktion in einem Vertebraten erzeugt, wobei das Fusionsprotein umfasst:

(a) einen ersten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem endogen innerhalb des Vertebraten synthetisierten GnRH-Peptid, wobei die Aktivität des Peptids innerhalb des Vertebraten inhibiert werden soll, und wobei der proteinartige Anteil selbst nicht in der Lage ist, eine wirksame immunoinhibitorische Reaktion in dem Vertebraten hervorzurufen; verbunden mit
(b) einem zweiten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem BHV-1-Antigen, wobei BHV-1 in der Lage ist, den Vertebraten pathogen zu infizieren;

Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines Fusionsproteins bereit, das eine Dual-Immunreaktion in einem Vertebraten erzeugt, wobei das Fusionsprotein umfasst:

In Impfstoffen, die ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung umfassen, worin Anteil (b) analog zu der Gesamtheit oder einem Teil eines BHV-1-Antigens ist, braucht der Vertebrat, der geimpft wird, kein Vertebrat zu sein, bei dem BHV-1 in der Lage ist, pathogen zu infizieren. In solchen Vertebraten wirkt einfach Anteil (b) als ein Träger zum Induzieren einer Immunreaktion, unter Inhibieren des Peptids, an das es gebunden ist.
Somit stellt die vorliegende Erfindung einen Impfstoff zum Inhibieren der Aktivität von GnRH in einem Vertebraten bereit, welcher ein Fusionsprotein umfasst, worin Anteil (a) analog zu der Gesamtheit oder einem Teil eines GnRH-Peptids ist und Anteil (b) analog zu der Gesamtheit oder einem Teil eines BHV-1-Antigens ist, oder Vektor oder transformierte Zelle, umfassend ein Polynucleotidmolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein solches Fusionsprotein codiert, in einer Menge, die wirksam ist, um GnRH-Aktivität zu inhibieren, zusammen mit einem Träger, der zur pharmazeutischen oder veterinären Verwendung geeignet ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines Fusionsproteins bereit, das eine Dual-Immunreaktion in einem Vertebraten erzeugt, wobei das Fusionsprotein umfasst:
(a) einen ersten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem GnRH-Peptid, wobei die Aktivität davon innerhalb des Vertebraten inhibiert werden soll, und wobei der proteinartige Anteil selbst nicht in der Lage ist, eine wirksame immunoinhibitorische Reaktion in dem Vertebraten hervorzurufen; verbunden mit (b) einem zweiten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem BHV-1-Antigen; wobei der zweite proteinartige Anteil (b) das Immunsystem des Vertebraten veranlasst, den ersten proteinartigen Anteil (a) zu erkennen und eine Immunreaktion zu erzeugen, die die Aktivität des Peptids innerhalb des Vertebraten inhibieren kann, wenn der Vertebrat mit einer wirksamen Menge des Fusionsproteins beimpft ist, oder einen Vektor oder eine transformierte Zelle, umfassend ein Polynucleotidmolekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein solches Fusionsprotein codiert, zur Herstellung eines Impfstoffs zum Inhibieren in einem Vertebraten der Aktivität von endogen synthetisiertem GnRH-Peptid.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines Fusionsproteins bereit, das eine duale Immunreaktion in einem Vertebraten erzeugt, wobei das Fusionsprotein umfasst:
(a) einen ersten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem GnRH-Peptid, wobei die Aktivität davon innerhalb des Vertebraten inhibiert werden soll, und wobei der proteinartige Anteil selbst nicht in der Lage ist, eine wirksame immunoinhibitorische Reaktion in dem Vertebraten hervorzurufen; verbunden mit (b) einem zweiten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem BHV-1-Antigen; wobei der zweite proteinartige Anteil (b) das Immunsystem des Vertebraten veranlasst, den ersten proteinartigen Anteil (a) zu erkennen und eine Immunreaktion zu erzeugen, die die Aktivität des Peptids innerhalb des Vertebraten inhibieren kann, wenn der Vertebrat mit einer wirksamen Menge des Fusionsproteins beimpft ist oder einen Vektor oder eine transformierte Zelle, umfassend ein Polynucleotidmolekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein solches Fusionsprotein codiert, zur Herstellung eines Impfstoffs zum Inhibieren der Sexualeigenschaften in einem Vertebraten.
„Sexualeigenschaften" bezieht sich auf jene Eigenschaften in einem Vertebraten, die mit Geschlecht des Vertebraten und/oder der Fähigkeit des Vertebraten zum Reproduzieren verbunden sind, wobei die Eigenschaften entweder insgesamt oder als Teil, entweder direkt oder indirekt, durch GnRH induziert werden. Solche Eigenschaften sind durch den Durchschnittsfachmann bestimmbar. Beim männlichen Rind schließen Beispiele der Inhibierung solcher Sexualeigenschaften Repression von aggressivem Verhalten, Unterdrückung der Testosteronproduktion, verminderte Libido, Regression von den Nebengeschlechtsdrüsen (einschließlich Prostata und seminalen Vesikeln), Absenkung des testikulären Volumens und Verminderung oder Beendigung von Spermatogenese ein. Bei der Kuh schließt Inhibierung solcher Sexualeigenschaften Versagen von Ovulierung und Infertilität, Regression des reproduktiven Trakts und Abortion ein. In einer Ausführungsform wird GnRH in entweder einem männlichen oder weiblichen Vertebraten inhibiert, sodass die Sexualeigenschaften, die inhibiert werden, ein funktionelles reproduktives System einschließen, wobei die vorliegende Erfindung somit eine Form von Kontrazeption bereitstellt.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können gemäß akzeptierter Konvention formuliert werden, um verträgliche Träger für Tiere, einschließlich Menschen, wie Standardpuffer, Stabilisatoren, Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel und/oder Solubilisierungsmittel, einzuschließen, und können auch formuliert werden zur Erleichterung der verzögerten Freisetzung. Verdünnungsmittel schließen Wasser, Salzlösung, Dextrose, Ethanol, Glycerin und dergleichen ein. Additive zur Isotonizität schließen Natriumchlorid, Dextrose, Mannit, Sorbit und Lactose unter anderem ein. Stabilisatoren schließen unter anderem Albumin ein. Andere geeignete Impfstoffvehikel und Additive, einschließlich jener, die besonders beim Formulieren von modifizierten Lebendimpfstoffen verwendbar sind, sind bekannt oder werden dem Fachmann bekannt sein. Siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Science, 18. Ausgabe, 1990, Mack Publishing, das hierin durch Hinweis einbezogen ist.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können weiterhin eine oder mehrere zusätzliche immunomodulatorische Komponenten, wie beispielsweise einen Hilfsstoff oder Cytokin, Choleratoxin (CT) oder wärmelabiles Toxin (LT) unter anderem umfassen. Nichtbegrenzende Beispiele für Hilfsstoffe, die in dem erfindungsgemäßen Impfstoff verwendet werden können, schließen das RIBI-Adjuvanssystem (Ribi Inc., Hamilton, MT), Alaun, Mineralgele, wie Aluminiumhydroxidgel, Öl-in-Wasser-Emulsionen, Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie beispielsweise Freund'sches vollständiges und unvollständiges Adjuvans, Block-Copolymer (CytRx, Atlanta, GA), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), AMPHIGEN^® Adjuvans, Saponin, Quil A oder andere Saponinfraktion, Monophosphoryllipid A und Avridinlipidamin-Adjuvans, ein.
Nichtbegrenzende Beispiele für Öl-in-Wasser-Emulsionen, die in dem erfindungsgemäßen Impfstoff verwendbar sind, schließen modifizierte SEAM62- und SEAM-1/2-Formulierungen ein. Modifiziertes SEAM62 ist eine Öl-in-Wasser-Emulsion, die 5% (Volumen/Volumen) Squalen (Sigma), 1% (Volumen/Volumen) SPAN^® 85 Detergent (ICI Surfactants), 0,7% (Volumen/Volumen) TWEEN^® 80 Detergent (ICI Surfactants), 2,5% (Volumen/Volumen) Ethanol, 200 μg/ml Quil A, 100 μg/ml Cholesterin und 0,5% (Volumen/Volumen) Lezithin enthält. Modifiziertes SEAM 1/2 ist eine Öl-in-Wasser-Emulsion, umfassend 5% (Volumen/Volumen) Squalen, 1% (Volumen/Volumen) SPAN^® 85 Detergent, 0,7% (Volumen/Volumen) Tween 80 Detergent, 2,5% (Volumen/Volumen) Ethanol, 100 μg/ml Quil A und 50 μg/ml Cholesterin. Andere immunomodulatorische Mittel, die in den Impfstoff eingeschlossen sein können, schließen beispielsweise ein oder mehrere Interleukine, Interferone oder andere bekannte Cytokine ein. Wenn der Impfstoff lebend transformierte Zellen umfasst, ist das Adjuvans vorzugsweise ausgewählt bezogen auf die Fähigkeit der sich ergebenden Impfstoffformulierung, mindestens einen Grad an Lebensfähigkeit der lebend transformierten Zellen zu halten.
Ein Impfstoff, umfassend transformierte Zellen der vorliegenden Erfindung, kann durch Standardtechniken hergestellt werden, beispielsweise unter Verwendung eines Aliquoten von Kulturfluid, enthaltend die transformierten Zellen, entweder frei in dem Medium oder verweilend in Säugerwirtszellen, oder beiden, die direkt oder in konzentrierter Form an den Patienten verabreicht werden können. Alternativ können modifizierte, lebend transformierte Zellen mit einem Träger kombiniert werden, der zur pharmazeutischen oder veterinären Verwendung verträglich ist, mit oder ohne ein immunomodulatorisches Mittel, ausgewählt aus jenen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, und geeignet für den ausgewählten Verabreichungsweg, wo mindestens ein Grad an Lebensfähigkeit der Lebendzellen in der Impfstoffzusammensetzung gehalten wird. Solche Verfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Wenn ein erfindungsgemäßer Impfstoff lebend transformierte Zellen umfasst, kann der Impfstoff kalt oder gefroren gelagert werden. Wenn die Impfstoffzusammensetzung ein Fusionsprotein, einen Vektor oder inaktivierte transformierte Zellen der vorliegenden Erfindung umfasst, kann der Impfstoff gefroren gelagert oder in lyophilisierter Form vor der Verabreichung unter Anwendung eines geeigneten Verdünnungsmittels rehydratisiert werden.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können gegebenenfalls zur verzögerten Freisetzung des Fusionsproteins formuliert werden. Beispiele für solche Formulierungen zur verzögerten Freisetzung schließen Fusionsprotein in Kombination mit Verbundwerkstoffen von bioverträglichen Polymeren, wie beispielsweise Poly(milchsäure), Poly(milch-co-glycolsäure), Methylcellulose, Hyaluronsäure, Collagen und dergleichen, ein. Die Struktur, Auswahl und Verwendung von abbaubaren Polymeren in Arzneimittelfreisetzungsvehikeln wurde in verschiedenen Publikationen übersichtsmäßig angegeben, einschließlich A. Domb et al., 1992, Polymers for Advanced Technologies 3:279–292. Weitere Richtlinien beim Auswählen und Anwenden von Polymeren in pharmazeutischen Formulierungen können in dem Text von M. Chasin und R. Langer (Herausg.), 1990, „Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems" in: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Band 45, M. Dekker, NY, gefunden werden. Alternativ oder zusätzlich können das Fusionsprotein, der Vektor oder die transformierten Zellen mikroeingekapselt werden, um die Verabreichung und Wirksamkeit zu verbessern. Verfahren zum Mikroeinkapseln von Antigenen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und schließen Techniken ein, die beispielsweise in US-Patent 3 137 631, US-Patent 3 959 457, US-Patent 4 205 060, US-Patent 4 606 940, US-Patent 4 744 933, US-Patent 5 132 117 und Internationaler Patentveröffentlichung WO 95/28227 beschrieben werden.
Liposomen können auch verwendet werden, um für die verzögerte Freisetzung von Fusionsprotein, Vektor oder transformierter Zelle zur Verfügung zu stehen. Einzelheiten, betreffend die Erzeugung und Anwendung von liposomalen Formulierungen, können in, unter anderen Stellen, US-Patent 4 016 100, US-Patent 4 452 747, US-Patent 4 921 706, US-Patent 4 927 637, US-Patent 4 944 948, US-Patent 5 008 050 und US-Patent 5 009 956 gefunden werden.
Eine wirksame Menge von jedem der vorstehend beschriebenen Impfstoffe kann durch herkömmliche Mittel, ausgehend von einer niedrigen Dosis Fusionsprotein, Vektor oder transformierter Zelle, und dann Erhöhen der Dosierung unter Verfolgen der Wirkungen bestimmt werden. Eine wirksame Menge kann nach einer einzelnen Verabreichung eines Impfstoffs oder nach Mehrfachverabreichungen eines Impfstoffs erhalten werden. Bekannte Faktoren können beim Bestimmen einer optimalen Dosis pro Lebewesen in Betracht gezogen werden. Diese schließen die Spezies, Größe, Alter und Allgemeinzustand des Lebewesens, das Vorliegen anderer Arzneistoffe in dem Lebewesen und dergleichen ein. Die tatsächliche Dosierung wird vorzugsweise nach Betrachtung der Ergebnisse aus anderen Tierstudien ausgewählt.
Ein Verfahren des Bestimmens, ob hinreichende Immunreaktion erreicht wurde, ist, Serokonversion und Antikörpertiter in dem Lebewesen nach Beimpfung zu bestimmen. Der Zeitpunkt der Impfung und die Anzahl von Verstärkern, falls überhaupt, wird vorzugsweise durch den ausgebildeten Wissenschaftler oder Veterinär, bezogen auf die Analyse aller relevanten Faktoren, wobei einige davon vorstehend beschrieben werden, bestimmt.
Die wirksame Dosismenge an Fusionsprotein, Vektor und transformierter Zelle der vorliegenden Erfindung kann unter Anwenden bekannter Techniken bestimmt werden, unter In-Betracht-Ziehen von Faktoren, die durch den Durchschnittsfachmann bestimmt werden können, wie dem Gewicht des zu beimpfenden Tiers. Die Dosismenge an Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung in einem Impfstoff der vorliegenden Erfindung liegt vorzugsweise in Bereichen von etwa 1 μg bis etwa 10 mg, bevorzugter etwa 50 μg bis etwa 1 mg, und besonders bevorzugt etwa 100 μg bis etwa 0,5 mg. Die Dosismenge eines Vektors der vorliegenden Erfindung in einem Impfstoff der vorliegenden Erfindung liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 50 μg bis etwa 1 mg. Die Dosismenge von transformierten Zellen der vorliegenden Erfindung in einem Impfstoff der vorliegenden Erfindung liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 1 × 10³ bis etwa 1 × 10⁸ Zellen/ml und bevorzugter etwa 1 × 10⁵ bis etwa 1 × 10⁷ Zellen/ml. Eine geeignete Dosierungsgröße liegt im Bereich von etwa 0,5 ml bis etwa 10 ml und bevorzugter etwa 1 ml bis etwa 5 ml.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Herstellen eines Impfstoffs bereit, umfassend ein wie vorstehend beschriebenes Fusionsprotein, wobei das Verfahren Kombinieren einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins mit einem zur pharmazeutischen oder veterinären Verwendung verträglichen Träger umfasst.
Die nachstehenden Beispiele werden nur für erläuternde Aspekte der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Sie sind nicht vorgesehen, oder sollten nicht aufgefasst werden, um die Erfindung, die in den Ansprüchen angeführt ist und hierin vollständiger beschrieben wird, zu begrenzen.
Beispiele
Beispiel 1: Plasmide, die gD/GnRH-Fusionsproteine exprimieren
Konstruktion von pQE-tm gD:
Das Plasmid FlgD/Pots207nco(#79) (codierend eine volle Länge gD, anschließend „gD/Pots") wurde mit Ncol/Xbal verdaut und das erhaltene 1,26 kB Fragment wurde in die entsprechenden Stellen von pUC21 kloniert, unter Erzeugen des Plasmids pUC-FLgD. Die vollständige Sequenz des Ncol/Xbal Fragments in dem Plasmid pUC-FLgD wurde an beiden DNA-Strängen, unter Anwendung von Sanger-fluoreszenter-Didesoxy-Kettenbeendigungs-Sequenzierungstechnologie, bestimmt. 3 zeigt die Sequenzergebnisse und -eigenschaften. Die für gD/Pots codierende Nucleotidsequenz ist in SEQ ID NR: 16 eingeschlossen.
DNA-Anordnung zwischen gD/Pots und veröffentlichten BHV-1gD (GenBank Zugangs-Nr. M59846) zeigt 94,7% Homologie mit der Mehrheit von Fehlversuchen, die 3' von der Transmembrandomäne auftreten (4).
Aminosäureanordnung zwischen gD/Pots und M59846 zeigt vier Aminosäureunterschiede, wobei einer davon in der Signalsequenz angeordnet ist und die anderen drei in oder um die Transmembrandomäne angeordnet sind (5).
Die Signalsequenz für das gD-Protein wurde entfernt, um die Expression von dem Protein in E. coli zu erleichtern. Die Signalsequenzentfernung wurde durch Verdau von pUC-FLgD-Plasmid-DNA mit Nco I/Hind III und Füllen mit Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I in die Enden ausgeführt. Das sich ergebende DNA-Fragment wurde Gel-gereinigt und ligiert. Kolonien wurden auf eine Verschiebung in der Mobilität eines Sph I/Sac I-Fragments untersucht, das Deletion des 50 Bp-Fragments anzeigen würde. Zwei positive Klone wurden ausgewählt und über den Nco I/Hind III-Deletionsbereich sequenziert. Von allen Klonen wurde gezeigt, dass sie die korrekte Sequenz aufweisen. Klon #1 wurde pUC-MgD bezeichnet und wurde zur weiteren Manipulation ausgewählt.
Die reife gD-Sequenz wurde in einen E.coli-Expressionsvektor zur Herstellung des Proteins auf einer Großmaßstabsbasis subgeklont. Dazu wurde ein 1,07 kB Sph I/Sac I-Fragment aus pUC-MgD, enthaltend die reife gD-Sequenz (trunkiert an dem 3' Ende, um die Transmembrandomäne auszuschließen), in die entsprechenden Stellen von pQE-31 (Qiagen) subgeklont. (pQE-31 verwendet den Phagen T5-Promotor und zwei Lac Operatorsequenzen zur größeren Repression vor Induktion von Expression mit IPTG. pQE-31 enthält auch N-terminale 6XHIS tag Fusion für Reinigungszwecke.) Die erhaltenen Klone wurden hinsichtlich des 1,07 kB SphI/SacI-Fragments abgesucht. Ein positiver Klon, bezeichnet pQE-tmgD, wurde zur Herstellung von weiteren Plasmiden, nachstehend, ausgewählt. pQE-tmgD codiert ein N-terminales 6XHIS tag, kondensiert an eine trunkierte reife gD-(tmgD)-Sequenz, beendet mit einem Vektor-codierten Stoppcodon nach der SacI-Stelle. Die Verbindungsbereiche der gD-Sequenz und des Plasmidgerüsts wurden zum Verifizieren der Integrität des Inserts sequenziert und wurden als korrekt befunden. Die das tmgD (nicht einschließlich das 6XHIS tag) in pQE-tmgD codierende Sequenz wird in SEQ ID NR: 36 angeführt. Die Aminosäuresequenz von dem tmgD, codiert durch pQE-tmgD (ohne das 6XHIS tag), wird in SEQ ID NR: 35 angeführt.
Konstruktion von GnRH-Tetramerklonen:
Zwölf verschiedene Oligonucleotide (Sinn(Sense)- und komplementäre (Umkehr)Stränge[Antisense])-codierende GnRH (Monomere und Dimere) mit verschiedenen endständigen DNA-Sequenzen wurden hergestellt. Diese zwölf Oligonucleotide werden in SEQ ID NUM-MERN: 1–12 bereitgestellt.
Oligonucleotide 9 und 10 wurden anelliert und in die BamHi/Xhol-Stellen von pBS KS+ (Stratagene) geklont, unter Erzeugen von p98BS/GnRH. Ein ein GnRH-Tetramer codierendes Plasmid wurde aus Plasmid p98BS/GnRH durch Zusetzen von anellierten Oligonucleotiden 7 und 8 an den Sma I/Xho I-Stellen konstruiert. Eine Rekonstruktion der vollständigen Länge des Tetramers war notwendig, weil Sequenzanalyse von 5 getrennten Klonen zeigte, dass alle grundlegende Veränderungen in dem synthetischen Primerbereich aufwiesen. Ein Klon, enthaltend die vollständige Länge des Tetramers mit der korrekten Sequenz, wurde durch Ersetzen eines 106 Bp EagI-Fragments von einem mutanten Klon mit dem entsprechenden Fragment von einem Klon, dessen Basenveränderungen in diesem Bereich fehlten, aufgebaut. Einer der sich ergebenden, wiederaufgebauten Klone wurde sequenziert und wurde als die korrekte DNA-Sequenz aufweisend gefunden, die das GnRH-Tetramer codiert. Dieser Klon enthielt einen Sequenzunterschied von der vorhergesagten Nucleotidsequenz von dem GnRH-Tetramerkonstrukt. Die Veränderung ist ein zusätzliches G, 3' und außerhalb des GnRH-codierenden Bereichs, und beeinflusst deshalb nicht den codierenden Bereich für GnRH. (Das zusätzliche G, das in dem Klon vorliegt, wurde für den Wiederaufbau verwendet und ist wahrscheinlich auf Grund eines Fehlers in der synthetischen Primersequenz.) Dieser Klon wurde p9897-R bezeichnet. Ein Anteil von p9897-R, einschließlich der Sequenz, die das GnRH-Tetramer codiert, wird in 2 gezeigt. Die Sequenz, die das GnRH-Tetramer codiert, wird in SEQ ID NR: 32 angeführt. Die Aminosäuresequenz des GnRH-Tetramers, codiert durch p9897-R, wird in SEQ ID NR: 33 angeführt.
Ein PCR wurde angewendet, unter Verwendung von Primern P14-S1 (SEQ ID NR: 42) und P14-A138 (SEQ ID NR: 43), mit Templat DNA von Plasmid p9897-R, um ein 138 Bp-Fragment zu erzeugen, das das GnRH-Tetramer PCR-Fragment mit einem 3' Stoppcodon und synthetischem 5' SacI- und 3' HindIII-Enden enthält. Das PCR-Fragment wurde in den pGEM-T EASY Vektor (Promega, Madison, Wisconsin), unter Erzeugen von p9897 S/d3, geklont. Der Klon wurde sequenziert, und es wurde gefunden, dass er die korrekte Sequenz aufweist. Der Klon, p9897 S/d3, stellte eine Quelle für eine GnRH-Tetramer-codierende Sequenz mit SacI- und HindIII-Enden für weiteres Klonen in pQE-Vektoren bereit.
Konstruktion von pQE-gD:GnRH:
Ein 126 Bp SacI/HindIII-Fragment von p9897 S/d3, enthaltend das GnRH-Tetramer, wurde in die entsprechenden Stellen von Plasmid pQE-tmgD geklont. Die Kolonien wurden auf das Vorliegen von dem 126 Bp SacI/HindIII-Fragment und einem 1165 Bp Bam-HI/HindIII-Fragment, was die geeignete Orientierung des Inserts ausweist, abgesucht. Die Verbindungsbereiche, die benachbart zu den Klonierungsstellen sind, wurden durch DNA-Sequenzieren analysiert und als korrekt befunden. Die Nucleotidsequenz, die tmgD-4GnRH codiert, einschließlich das 6XHIS tag, und Plasmid-flankierende Sequenzen, werden in SEQ ID NR: 24 angeführt. Die Aminosäuresequenz von dem tmgD-4GnRH, codiert durch pQE-gD:GnRH, wird in SEQ ID NR: 25 angeführt. Wie vorstehend beschrieben, ist tmgD-4GnRH ein Fusionskonstrukt, worin ein GnRH-Tetramer an den Carboxyterminus von trunkiertem, reifem gD fusioniert wird.
Konstruktion von pQE-GnRH:gD:
Die GnRH-Tetramer-codierende Sequenz in p9897-R wurde mit BamHI/NcoI gespalten, wobei die Enden durch Füllen mit Klenow abgeglättet wurden und das 132 Bp-Fragment gelgereinigt wurde. Ein reifes gD-Vektorfragment (d.h. ohne die Signalsequenz) wurde durch Spaltung von pUC-FLgD mit NcoI/HindIII hergestellt, unter Abglätten der Enden durch Einfüllen mit Klenow und Gelreinigen des 4,4 kB-Fragments. Nach Ligierung mit dem 132 Bp-Fragment von p9897-R und Transformation wurden die Klone für die Regeneration der 5' BamH I- und Nco I-Stellen abgesucht, was sich aus der Ligierung in der korrekten Orientierung ergab. Weiteres Screening für die Erzeugung eines ≈ 400 Bp Nde I-Fragments bestätigte die korrekte Struktur. Der Konstrukt wurde über die GnRH/gD-Verbindungen sequenziert, um die korrekte Sequenz zu bestätigen. Dieser Konstrukt, bezeichnet mit pUC-GnRH:gD, enthält eine GnRH-Tetramersequenz, kondensiert an den Aminoterminus von einer reifen Volllängen-gD-Sequenz in einem pUC-Vektor.
Eine 1161 Bp GnRH-Tetramer-/trunkierte reife gD-Fusionssequenz wurde durch Verdau von pUC-GnRH:gD mit Sph I- und Sac 1-Restriktionsenzymen erhalten. Dieses 1161 Bp-Fragment wurde in die entsprechenden Stellen von pQE-31 geklont, unter Erzeugen von pQE-GnRH:gD. Die Klone wurden auf das 1161 Bp Sph I/Sac I-Fragment und auf das korrekte Muster der Nde I-Fragmente (380 Bp, 2,0, 2,2 kB) abgesucht.
Die Nucleotidsequenz, die 4GnRH-tmgD codiert, einschließlich das 6XHIS tag, und Plasmid-flankierende Sequenzen werden in SEQ ID NR: 22 angeführt. Die Aminosäuresequenz von dem 4GnRH-tmgD, codiert durch pQE-GnRH:gD, wird in SEQ ID NR: 23 angeführt.
Konstruktion von pQE-GnRH:gD:GnRH:
Das 126 Bp Sac I/Hind III-Fragment von dem p9897 S/d3 wurde in die entsprechenden Stellen von Plasmid pQE-GnRH:gD, unter Erzeugen von pQE-GnRH:gD:GnRH, subgeklont. Die Klone wurden auf das 126 Bp Sac I/Hind III-Fragment sowie auf das korrekte Muster von Nde I-Fragmenten abgesucht.
pQE-GnRH:gD:GnRH codiert ein 4GnRH-tmgD-4GnRH-Fusionsprotein. Wie vorstehend beschrieben, umfasst 4GnRH-tmgD-4GnRH ein trunkiertes, reifes gD mit einem GnRH-Tetramer, fusioniert an sowohl den Amino- als auch Carboxytermini. Die Nucleotid-codierende Sequenz und flankierende Sequenzen von pQE-GnRH:gD:GnRH werden in SEQ ID NR: 26 bereitgestellt. Die Aminosäuresequenz von 4GnRH-tmgD-4GnRH, codiert durch pQE-GnRH:gD:GnRH, einschließlich der 6XHIS tag, wird in SEQ ID NR: 27 angeführt.
Vergleich von Expressionsprodukten von bakteriellem Expressionsvektor pQE-Konstrukte:

Alle vier Konstrukte enthielten ein tmgD, abgeleitet von Klon FklgD/Pots207nco(#79), der Rminosäuren 19 bis 358 von F1gD/Pots207nco(#79) einschloss.
Alle vier Konstrukte enthielten Amino-endständige pQE-HIS-Führungssequenz [Leader-Sequenz] (ein 6XHIS tag), bezeichnet durch Aminosäurekennzeichnung: MRGSHHHHHHTDPHA (SEQ ID NR: 37). Die codierende Sequenz für das 6XHIS tag wird in SEQ ID NR: 38 angeführt.
Alle vier Konstrukte hatten einen 2- oder 3-Aminosäurelinker nach der 6XHIS-Führungssequenz.
Alle GnRH-Produkte waren von GnRH-Tetramerklon p9897-R abgeleitet.

Die pQE-GnRH:gD- und pQE-GnRH:gD:GnRH-Klone enthielten drei Aminosäurelinker (SMS) zwischen dem Amino-endständigen GnRH-Tetramer und der tmgD-Sequenz.
Die pQE-gD- und pQE-GnRH:gD-Klone enthielten extra zehn Aminosäuren am Carboxy-terminalen Ende von tmgD für die Vektorsequenz als ein Artefakt vom Klonen.
Die pQE-gD:GnRH- und pQE-GnRH:gD:GnRH-Klone enthielten einen Aminosäure-(Prolin)-Linker zwischen tmgD und GnRH-Carboxy-Fusion.
Siehe 10 für eine Erläuterung von jedem von den pQE-Konstrukten.
Beispiel 2: Expression von GnRH/gD-Fusionsproteinen durch transformierte bakterielle Zellen
Alle von den pQE-Konstrukts, die vorstehend in Beispiel 1 beschrieben wurden, wurden in E.coli DHSa-F'IQ-Zellen zur Expression transformiert. Zur Einführung von Expression wurden Zellen in einem OD600 von 0,7–0,9 in einem 2-Liter-Ablenkungs-Kulturkolben in 2xYT-Brühe, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin und 25 μg/ml Kanamycin, wachsen lassen, dann mit 1–2 mM IPTG induziert und für 4 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubiert. Mittlere OD₆₀₀-Lesungen bei Erntezeit waren 1,3. Expression von allen vier Konstrukts wurde durch Westernblot-Analyse bestätigt.
Beispiel 3: Formulierung von Fusionsprotein-Impfstoffen und Immunisierung von Mäusen
Impfstoffanordnung:
Fusionsproteine von pQE-tmgD (als eine Kontrolle), pQE-GnRH:gD, pQE-GnRH:gD:GnRH und pQEgD:GnRH wurden zum Einschluss von Körperzubereitungen durch präparative Elektrophorese an 9% Polyacrylamidgelen aufkonzentriert. Banden, geschnitten von SDS PAGE Gelen, wurden in 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM Glycin und 0,1% SDS (Gewicht/Volumen) gelöst. Das Äquivalent von 10 μg gD/Maus Dosis wurde mit SEAM1- (Squalen Emulsion Adjuvans metabolisierbarer) Emulsion (10 μg QuilA/100 μl Dosis) unterstützt. Impfstoffformulierungen wurden bei 4°C gelagert. SEAM1 ist 5% Squalen, 0,1% Vitamin-E-acetat, 1% Span 85, 0,70 Tween 80, 2 mg/ml QuilA und 400 μl/ml Cholesterin.
Mäuse:
Männliche BALB/c wurden in der Studie verwendet, nachdem sie 8 Wochen alt waren (10/Gruppe). Mäuse wurden anfänglich in Gruppen von 10 gehalten, jedoch wurden Kontrollen anschließend in einzelne Käfige umgesetzt, um das Kämpfen zu verhindern.
Immunisierung:
Mäuse wurden subkutan mit 10 μg Fusionsprotein in 100 μl Adjuvans, vorstehend beschrieben, immunisiert. Drei Immunisierungen wurden an Studientagen 0, 20 und 41 gegeben.
Anti-GnRH-Antikörper durch ELISA:
Serumproben wurden bei Studientagen 0, 20, 31, 41, 55, 62, 69 und 146 gesammelt und wurden auf Anti-GnRH-Antikörpertiter in einem Peptid-ELISA (enzyme linked immunoadsorbant assay) bewertet. Ein biotinyliertes GnRH-Peptid (Biotin-GnRH) (0,1 μg/ml in 25 mM Tris, 0,15 M NaCl bei pH 7,6), bestehend aus der natürlichen Sequenz plus einem 4-Aminosäurelinker (CAGAEHWSYGLRPG), gereinigt durch HPLC an einer Umkehrphasensäule, wurde an Avidin-beschichteten Platten adsorbiert und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Überschüssiges Peptid wurde durch Waschen der Platten viermal mit einem Waschpuffer (25 mM Tris, 0,15 M NaCl, 0,05 Tween-20 und 0,05% BSA-(Rinder-Serum-Albumin)-Fraktion V) entfernt. Dann wurden fünffache serielle Verdünnungen von positiver Kontrolle, negativen und unbekannten Mausseren in Verdünnungsmittel (25 mM Tris, 0,15 M NaCl, 0,05 BSA) (100 μl/Vertiefung) zu den Peptid-beschichteten Vertiefungen gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden viermal in Waschpuffer gewaschen und dann wurde Kaninchen-anti-Maus-IgG (IgG-spezifische)-Meerrettich-Peroxidase (Zymed, Kalifornien) zu jeder Vertiefung (1:4 000, 100 μl/Vertiefung) gegeben. Nach Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde der gebundene Antikörper mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidinsubstrat (Kierkegaard & Perry, Katalog-Nr. 50–76–04) (100 μl/Vertiefung, 15 Minuten im Dunkeln) nachgewiesen und die Reaktion wurde mit der Zugabe von 50 μl/Vertiefung von 0,18 M H₂SO₄ gehalten. Die Absorption bei 450 nm wurde mit einem Molekular-Vorrichtungs-Mikroplattenleser gemessen. Um Antikörpertiter zu berechnen, wird eine positive Kontrollkurve erzeugt und die Titer von unbekannten Proben werden extrapoliert aus der Kurve, unter Anwendung von Computersoftware.
BHV-1 gD ELISA:
Serumproben wurden an Studientagen 0, 20, 31, 41, 55, 62, 69 und 146 gesammelt und wurden auf AntigD-BHV-1-Antikörpertiter durch ELISA bewertet. Gereinigtes rekombinantes gD BHV-1, exprimiert von MDBK- (Madin Darby Bovine Kidney) Zellen (1 μg/ml in Dulbecco's PBS + 0,01 Thime rosol, 100 μl/Vertiefung), wurde auf Mikrotiterplatten für 18–24 Stunden bei 4°C adsorbiert. Überschüssiges Protein wurde von den Vertiefungen gewaschen, dann wurden ungebundene Stellen in Vertiefungen durch Inkubieren für 2 Stunden bei 37°C mit 300 μl von 1%igem PVA (Polyvinylacetat) in DPBS (Dulbecco's Phosphat-gepufferte Salzlösung) mit 0,01% Thimerosol blockiert. Serumproben (positive und negative Kontrolle und unbekanntes Serum) wurden 1:50 verdünnt, dann seriell durch 4-fache Verdünnungen in 1% PVA in DPBS, mit 0,01% Thimerosal und 100 μl zu jeder Vertiefung gegeben. Das Assay wurde 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden viermal mit destilliertem Wasser, dann HRP (Meerrettich-Peroxidase) Ziege-anti-Maus (1:10 000 in 1% PVA in DPBS mit 0,01 Thimerosol, 100 μl/Vertiefung, KP+L) zugegeben und die Platten wurden 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden viermal mit destilliertem Wasser gewaschen, dann wurde das Assay mit ABTS (2,2'-Azino-di[3-ethyl-benzthiazolin]sulfonat)(6)substrat (100 μl/Vertiefung, RT, 15 min) entwickelt. Die Reaktion wurde bei 405/490 nm an einem ELISA-Reader gelesen. Die Titer wurden unter Verwendung des Forecast-Verfahrens in EXCEL^TM (Microsoft, Redmond, Washington), unter Anwendung von 0,5 OD als ein Cutoff, und unter Verwendung von 2 Verdünnungen vorstehend 0,5 und 1 Verdünnung nachstehend der 0,5 OD, zum Extrapolieren der Titer berechnet.
Testosteron-Konzentrationen:
Serumproben von Studientagen 0, 41 und 69 wurden auf Testosteron-Konzentrationen bewertet. Das Assay war ein Human-Testosteron-Radioimmunoassay, unter Verwendung von Antikörper, der mit murinem Testosteron kreuz-reagiert. Human-Testosteron-Standards wurden in dem Assay verwendet. Die murinen Proben laufen in der Regel am unteren Ende der Human-Testosteron-Standardkurve, was zu einer breiteren Variabilität in Normalwerten führt. Die Empfindlichkeit des Assays ist 0,02 ng/ml.
Nekropsie und Histopathologie:
Tiere wurden am Studientag 146 geopfert. Testes, Epididymide und Prostata mit seminalem Vesikel wurden entfernt und vor der Fixierung von Geweben in Bouin's Fixativum [75 ml Picrinsäure (gesättigte Lösung); 25 ml Formalin (37%); 5 ml Essigsäure (4,76%)] gewogen. Die Gewebe wurden 48 Stunden fixiert, dann in 50% Ethanol:H₂O gespült. Die Gewebe wurden in frischem 50%igem Ethanol vor der Analyse gelagert. Gewebe wurden verarbeitet und in Paraffin eingebettet und 5 um Abschnitte geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Jedes Organ wurde auf Entzündung, Atrophie und spermatogoniale Degeneration bewertet. Die Bewertungen wurden, basierend auf dem Anteil von Aspermatogenese, Atrophie oder anderen Läsionen, bezeichnet. Gewichte wurden als ein Prozentsatz des mittleren Gewichts in der normalen Kontrollgruppe eingestuft. Eine kumulative Bewertung wurde für jedes Tier zugeordnet.
Ergebnisse:

Anti-gD-Antikörper-Reaktionen: Alle Mäuse, die mit gD oder einem gD-enthaltenden Fusionsprotein immunisiert waren, erzeugten Anti-gD-ELISA-Antikörper, ungeachtet, ob gD in prokaryotischen (d.h. E. coli-exprimiertes Carboxyl-, Aminooder Carboxyl-Amino-Fusionsprotein) oder eukaryotischen Expressionssystemen (d.h. MDBK-exprimiertes Protein) exprimiert wurde.
Anti-GnRH-Antikörper-Reaktionen: Eine Hierarchie von Anti-GnRH-Titern wurde durch die verschiedenen Fusionsproteine eingeführt: tmgD-4GnRH (d.h. mit einem GnRH-Tetramer an dem Carboxyende des Proteins) erzeugte die höchsten Titer, gefolgt von 4GnRH-tmgD-4GnRH, während die niedrigsten Titer in dem 4GnRH-tmgD immunisiert eingeführt wurden. In allen Gruppen zeigten Anti-GnRH-Titer Peaks nach der zweiten Immunisierung und verblieben bei einem Plateau für mehr als 2 Monate.

Alle (9 von 9) Mäuse, immunisiert mit den tmgD-4GnRHhergestellten Antikörper, reagierten auf GnRH, wurden durch Peptid ELISA gemessen, obwohl 2/9 Mäuse niedrige Responder waren. Es gab 3/10 Nichtresponder in der 4GnRH-tmgD-Gruppe und 1/9 Nichtresponder bei dem 4GnRH-tmgD-4GnRH. Alle von den GnRH-Nichtrespondern waren gD-Responder.
Wirkung von Anti-GnRH-Antikörpern auf das männliche reproduktive System:
Um zu bestimmen, ob Induktion von Anti-GnRH-Antikörpern die GnRH-Funktion aufheben würde, bewerteten wir Testosteronspiegel vor und nach GnRH-Immunisierung. Bei Nekropsie wurden reproduktive Traktgewebe gewogen, dann der Gross- und histologischen Überprüfung übergeben. Die normalen Bereiche von Testosteron-Konzentrationen in der Maus variierten breit, wie unter Verwendung des Human-Testosteron-Radioimmunoassays gemessen. Jedoch Mäuse, immunisiert mit tmgD-4GnRH, hatten signifikant niedrigere mittlere Testosteron-Konzentrationen, wenn mit normalen Kontrollen oder anderen Behandlungsgruppen verglichen. Die Prostata, Hoden und Epididymiden von tmgD-4GnRH-immunisierten Mäusen waren signifikant atrophiert, wenn Grossgewebsgewicht und histologische Prüfung der Spermienentwicklung bewertet wurden. Mäuse, immunisiert mit 4GnRH-tmgD-4GnRH, waren weniger befallen, wenn mit normalen Kontrollen verglichen.
Beispiel 4: Baculovirus-Konstrukts, die die gD/GnRH-Fusionsproteine codieren
Konstruktion von pBacHISgD:LH und Bac-gD:GnRH:
pQE-gD:GnRH (siehe Beispiel 1) wurde mit Hind III verdaut und die Stelle glatt beendet mit Klenow-Behandlung und anschließend mit EcoRI verdaut. Ein ungefähr 1,2 kB-Fragment, das die tmgD-4GnRH-codierende Sequenz enthielt, wurde Gel-gereinigt und in STUI/EcoRI-verdautes Transfervektor pBacPAK9-Plasmid (Clontech, Inc.), unter Bildung von pBacHISgD:LH, kloniert. (Der Transfervektor enthält Sequenzen, die den Replikationsmangel in einem Replikationsmangel-Baculovirus kompensieren.) Sf21-Insektenzellen wurden mit pBacHISgD:LH und Replikationsmangel-Baculovirus-viraler DNA co-transfiziert. Diese transfizierten Sf21-Zellen erzeugen einen rekombinanten Baculovirus (bezeichnet Bac-gD:GnRH) (ATCC Zugangs-Nr. VR-2633), welcher ein tmgD-4GnRH-Fusionsprotein codiert. Rekombination (Austausch von DNA) zwischen dem Transfervektor pBacHISgD:LH und Replikationsmangel-Baculovirus-viraler DNA wird durch homologe, flankierende virale Sequenzen, die in pBac-PAK9 vorliegen, vermittelt, was effiziente Übertragung der gesamten Expressionskassette (Sequenz-codierendes tmgD-4GnRH) von pBacHISgD:LH in virale DNA, zusammen mit dem Gen oder den Genen, die für Replikationsmangel ergänzend sind, erlaubt.
Rekombinantes Virus kann durch Plaqueassay von infizierten Sf21-Zellen gereinigt werden. Wiederholte Zyklen von Sf21-Zellinfektion und Plaqueassayreinigung können unter Gewinnung einer größeren Konzentration von rekombinantem Virus, unter Exprimieren von Fusionsprotein, zur Herstellung in größerem Maßstab von dem Fusionsprotein ausgeführt werden. Expression der rekombinanten Konstrukts wurde durch Westernblot bestätigt. Infizierte Sf21-Zellen können durch Zentrifugierung gesammelt und auf –80°C, bis für den rekombinanten Baculovirus verarbeitet, überführt werden.
Die Nucleotidsequenz, die den ORF von dem 6XHIS tag, trunkiertem reifem gD und GnRH-Tetramer in Bac-gD:GnRH codiert, wird in SEQ ID NR: 39 angeführt. Nucleotide Nr. 1–45 codieren ein 6XHIS tag, Nucleotide Nr. 46–1074 codieren ein trunkiertes, reifes BHV-1 gD, Nucleotide Nr. 1075–1194 codieren ein GnRH-Tetramer und Nucleotide Nr. 1195–1197 sind ein Stoppcodon. Die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins, codiert durch Bac-gD:GnRH, ist die gleiche wie die Sequenz, die in SEQ ID NR: 25 angeführt wird.
Konstruktion von pBacHISMgD:
Ein rekombinanter Baculoviruskonstrukt, enthaltend gD, wurde als eine Kontrolle erzeugt. Plasmid pCMV-MgD (siehe Beispiel 5, nachstehend) wurde mit PacI und ApaI verdaut, unter Erlauben der Isolierung eines 950 Bp-Fragments, das die Mehrheit des gD-Gens minus das 5'-Ende enthält. Plasmid pBacHISgD:LH unterlag Verdau mit PacI und ApaI, unter Erlauben der Isolierung eines 5,6 kB-Fragments, das das Plasmidgerüst und den 5'-Anteil von gD enthält. Ligierung des 5,6 kB-Fragments mit dem 950 Bp-Fragment erzeugte Plasmid pBacHISMgD, das trunkiertes, reifes gD in Transfervektor, pBacPAC9, enthält.
Sf21-Zellen wurden mit pBacHISMgD und Replikationsmangelvirus co-transfiziert. Diese transformierten Sf21-Zellen erzeugen rekombinanten Baculovirus (bezeichnet Bac-MgD), welcher tmgD codiert. Rekombinanter Virus wurde gereinigt und wie vorstehend beschrieben gelagert.
Expression:
Rekombinanter Baculovirus kann aus den Lysaten von infizierten Sf21-Zellen erhalten werden. Das Lysat enthält auch das Fusionsprotein, exprimiert durch den rekombinanten Virus, und das Fusionsprotein kann aus dem Lysat gereinigt werden. Beispielsweise wurde nach Detergenzlysis des Zellpellets das Lysatpellet in dem vorstehend erwähnten Beispiel in 8 M Harnstoff, 50 mM Tris, pH 7,5, solubilisiert, und auf eine Ni NTA Säule beladen; das tmgD-4GnRH wurde in einem pH-Schritt-Gradienten eluiert. Das Lysat, enthaltend sowohl den rekombinanten Baculovirus als auch Fusionsprotein, kann beispielsweise bei –80°C gelagert werden.
Beispiel 5: Plasmid, geeignet zur In-vivo-Expression von gD/GnRH-Fusionsproteinen
Das β-Gal-Gen von pCMVβ-Vektor (Clontech, Inc) wurde durch EcoRV/NotI-Restriktionsverdau entfernt und das erhaltene NotI-Vektorfragment wurde durch Gel-Elektrophorese isoliert. Ein synthetischer Linker, enthaltend mehrfache Klonierungsstellen (MC) mit NotI-Enden, wurde in dieses NotI-Vektorfragment kloniert, unter Erzeugen von pCMV-MC.
Ein trunkierte-s gD-Gen, einschließlich der Signalsequenz, wurde PCR-vergrößert von F1gD/Pots207nco(#79), unter Verwendung von Primern, die eine EcoRV-Stelle am 5'-Ende einführten, einem zweiten Codon, repariert zum Codieren von Gln, anstatt als Glu, einem Stoppcodon, zugesetzt nach Pro 337 von der codierenden Sequenz, und einer KpnI-Stelle, am 3'-Ende zugesetzt. Dieses 1083 Bp-PCR-Fragment wurde in EcoRV/KpnI-verdautem pGEM-T EASY Vektor (Promega, Madison, Wisconsin) unter Erzeugen von pGEM-T-EASY/gD kloniert und anschließend durch Fluoreszenz-Di-desoxy-Terminierungschemie in beiden Richtungen zum Sichern der Integrität von PCR-Produkt sequen ziert. Das trunkierte gD-Fragment wurde aus dem pGEM-T-EASY/gD-Klon durch EcoRV/KpnI-Verdauung isoliert und in pCMV-MC unterkloniert. Der erhaltene Klon, bezeichnet pCMV-gD, wurde durch Restriktionsenzymanalyse verifiziert.
Zum Aufbau von pCMV-gD:GnRH (ATCC Zugangs-Nr. 203370) wurde pQE-gD:GnRH mit HindIII gespalten, mit Klenow am Ende abgeglättet und dann mit ApaI verdaut. Das erhaltene, am Ende abgeglättete/ApaI 1,05 kB-Fragment, enthaltend tmgD und GnRH-Tetramer, wurde isoliert. Klon pCMV-gD wurde mit SmaI, gefolgt von ApaI, gespalten, unter Entfernen des trunkierten gD-codierenden Bereichs. Das verbleibende 3,7 kB pCMV-Vektorfragment, enthaltend die Signalsequenz für gD, wurde isoliert und in einer Ligierungsreaktion mit dem 1,05 kB-Fragment, enthaltend tmgD und GnRH-Tetramer, verwendet. Der erhaltene Klon wurde pCMV-gD:GnRH bezeichnet. Das ORF, das das tgD-4GnRH, einschließlich der Signalsequenz, von pCMVgD:GnRH codiert, wird in SEQ ID NR: 28 angeführt. Die Aminosäuresequenz von tgD-4GnRH, einschließlich der Signalsequenz, die durch pCMV-gD:GnRH codiert wird, wird in SEQ ID NR: 29 angeführt.
HINTERLEGUNG VON BIOLOGISCHEN MATERIALIEN

Das nachstehende biologische Material wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) bei 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110–2209, USA, am 22. Oktober 1998 hinterlegt und wurde mit den nachstehenden Zugangsnummern bezeichnet:

Plasmid	Zugangs-Nr.
Plasmid pQE-gD:GnRH	98953
Plasmid pCMV-gD:GnRH	203370
Plasmid pQE-GnRH:gD	98954
Plasmid pQE-GnRH:gD:GnRH	98955
Vektor	Zugangs-Nr.
Baculovirus Bac-gD:GnRH	VR-2633

SEQUENZLISTING

Claims

Fusionsprotein zum Erzeugen einer dualen Immunreaktion bei einem Vertebraten, wobei das Fusionsprotein umfasst: (a) einen ersten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem endogen innerhalb des Vertebraten synthetisierten GnRH-Peptid, wobei der Teil jene Aminosäurereste einschließt, die eine Immunreaktion hervorrufen, wobei die Aktivität des Peptids innerhalb des Vertebraten inhibiert werden soll, und wobei der proteinartige Anteil selbst nicht in der Lage ist, eine wirksame immunoinhibitorische Reaktion in dem Vertebraten hervorzurufen; verbunden mit (b) einem zweiten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem BHV-1-Antigen, wobei der Teil jene Aminosäurereste einschließt, die eine Immunreaktion hervorrufen, wobei BHV-1 in der Lage ist, den Vertebraten pathogen zu infizieren; wobei Anteil (b) das Immunsystem des Vertebraten veranlasst, den Anteil (a) zu erkennen und eine Reaktion zu erzeugen, die: (i) die Aktivität des innerhalb des Vertebraten endogen synthetisierten GnRH-Peptids inhibiert; und (ii) den Vertebraten vor Infektion durch das Pathogen schützt, wenn der Vertebrat mit einer wirksamen Menge des Fusionsproteins beimpft ist.
Fusionsprotein zum Erzeugen einer dualen Immunreaktion bei einem Vertebraten, wobei das Fusionsprotein umfasst: (a) einen ersten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem GnRH-Peptid, wobei der Teil jene Rminosäurereste einschließt, die eine Immunreaktion hervorrufen, wobei die Aktivität davon innerhalb des Vertebraten inhibiert werden soll, und wobei der proteinartige Anteil selbst nicht in der Lage ist, eine wirksame immunoinhibitorische Reaktion in dem Vertebraten hervorzurufen; verbunden mit (b) einem zweiten proteinartigen Anteil analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von einem BHV-1-Antigen, wobei der Teil jene Aminosäurereste einschließt, die eine Immunreaktion hervorrufen; wobei der zweite proteinartige Anteil (b) das Immunsystem des Vertebraten veranlasst, den ersten proteinartigen Anteil (a) zu erkennen und eine Immunreaktion zu erzeugen, die die Aktivität des Peptids innerhalb des Vertebraten inhibieren kann, wenn der Vertebrat mit einer wirksamen Menge des Fusionsproteins beimpft ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2, wobei Teil (b) analog zu der Gesamtheit oder einem Teil von BHV-1 gD ist.
Polynucleotidmolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2 codiert.
Vektor, umfassend ein Polynucleotidmolekül nach Anspruch 4.
Vektor nach Anspruch 5, geeignet zur in-vitro-Expression des Fusionsproteins.
Vektor nach Anspruch 5, geeignet zur in-vivo-Expression des Fusionsproteins.
Transformierte Zelle, umfassend ein Polynucleotidmolekül, umfassend eine Polynucleotidmolekülsequenz, die für ein Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2 codiert.
Dualfunktionsimpfstoff, der ein Fusionsprotein nach Anspruch 1, einen Vektor nach Anspruch 5 oder eine transformierte Zelle nach Anspruch 8 in einer wirksamen Menge zum Inhibieren der Aktivität des Peptids, von dem Anteil (a) des Fusionsproteins abgeleitet ist und zum Schutz gegen Infektion durch das Pathogen, von dem Anteil (b) des Fusionsproteins abgeleitet ist, bei einem Vertebraten, welcher endogen das Peptid synthetisiert und welcher pathogen durch das Pathogen infiziert sein kann, und einen zur pharmazeutischen oder veterinären Verwendung verträglichen Träger umfasst.
Dualfunktionsimpfstoff zum Inhibieren von GnRH-Aktivität bei Rindern und zum Schutz von Rindern gegen BHV-1-Infektion, der ein Fusionsprotein nach Anspruch 1, einen Vektor nach Anspruch 5 oder eine transformierte Zelle nach Anspruch 8 in einer wirksamen Menge zum Inhibieren von GnRH-Aktivität und Schutz von Rindern gegen BHV-1-Infektion zusammen mit einem zur pharmazeutischen oder veterinären Verwendung verträglichen Träger umfasst.
Impfstoff zum Inhibieren der Aktivität eines GnRH-Peptids bei einem Vertebraten, welcher ein Fusionsprotein nach Anspruch 2, einen Vektor nach Anspruch 5 oder eine transformierte Zelle nach Anspruch 8 in einer wirksamen Menge zum Inhibieren der Aktivität des Peptids zusammen mit einem zur pharmazeutischen oder veterinären Verwendung verträglichen Träger umfasst.
Verwendung eines Fusionsproteins nach Anspruch 1, eines Vektors nach Anspruch 5 oder einer transformierten Zelle nach Anspruch 8 zur Herstellung eines Impfstoffs zum Inhibieren der Aktivität von endogen synthetisiertem GnRH- Peptid bei einem Vertebraten und zum Schutz des Vertebraten gegen BHV-1-Infektion.
Verwendung eines Fusionsproteins nach Anspruch 1, eines Vektors nach Anspruch 5 oder einer transformierten Zelle nach Anspruch 8 zur Herstellung eines Impfstoffs zum Inhibieren der Sexualeigenschaften bei einer Kuh und zum Schutz der Kuh gegen die BHV-1-Infektion.
Verwendung eines Fusionsproteins nach Anspruch 2, eines Vektors nach Anspruch 5 oder einer transformierten Zelle nach Anspruch 8 zur Herstellung eines Impfstoffs zum Inhibieren der Aktivität von endogen synthetisiertem GnRH-Peptid bei einem Vertebraten.
Verwendung eines Fusionsproteins nach Anspruch 2, eines Vektors nach Anspruch 5 oder einer transformierten Zelle nach Anspruch 8 zur Herstellung eines Impfstoffs zum Inhibieren der Sexualeigenschaften bei einem Vertebraten.