JPH01171489A - 狂犬病ウイルス糖蛋白質をコードする遺伝子断片およびこれを用いた狂犬病ウイルス糖蛋白質の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、狂犬病のワクチンや診断試薬に有効な狂犬病
ウィルス糖蛋白質に間するものであり、さらに詳細には
、狂犬病ウィルスの糖蛋白質をコードする遺伝子断片、
およびこの遺伝子断片を用いて発現された組換え狂犬病
ウィルス糖蛋白質、さらにその狂犬病ウィルス糖蛋白質
の製法に関する。

発ＩＩＬ量 狂犬病は最も古くから人類に知られていた病気の一つで
あり、全ての哺乳動物について、感染発症した場合には
、はぼ１００χ死亡するという極めて危険な人畜共通伝
染病である。

我が国は島国であるという好条件に恵まれたことと、重
病の人への主たる伝播者である犬を対象に狂犬病予防法
が制定され毎年予防注射が実施されてきたことにより、
１９５７年にはついに重病の根絶に成功した。以来、今
日まで１／４世紀以上の長期間にわたり、重病の発生の
ない、世界でも数少ない狂犬病予防法となっている。し
かしながら、わが国のように狂犬病の根絶された国は珍
しく、世界にはまだ流行が続いており、１９８２年のＷ
ＨＯの統計によるとベトナム、タイ、フィリピン、イン
ド、ブラジルおよびエクアドルなどにおいて狂犬病の流
行が多く、インドだけでも年間５万人に及ぶ狂犬病の死
者がいると推測されている。また、日本においても、狂
犬病の問題は完全に無くなったわけではなく、東南アジ
アを中心とした海外渡航者等にとって、狂犬病に対する
ワクチン接種は依然として重要な予防接種として取り扱
われている。

狂犬病ワクチンを歴史的に振り返ると、フランスのパス
ツール研究所による減毒ワクチンに始まり、その後哺乳
動物の脳を材料とした不活化ワクチンやそれらの部分精
製ワクチンへ、さらに哺乳動物や鳥類の培養細胞を用い
た細胞培養によるワクチンへと改善されてきている。し
かしながら、これらはいずれもいわゆる第一世代ワクチ
ンであり、安全性及び生産性等においてまだ問題を残し
ている。

今日の日本における、狂犬病撲滅に大きく貢献した動物
用及び人体用のワクチン株は、西ケ原株（系）と呼ばれ
る株であり、このウィルス株は、フランス国パスツール
研究所で作出された狂犬病ウィルスパスツール固定前が
家兎継代における潜伏期が５〜６日であったものを、日
本国農務省西ケ原獣疫調査所に於て、近勝らが幼若モル
モットと家兎を交互に継代し、継代数的９０代で潜伏期
を当時最短の３〜４日に短縮させたものである。　（猷
疫調査所研究報告第１号大正７年（１９１８年）１１月
発行）。

また、これまでに知られている他の狂犬病ウィルス株と
しては、ＥＲＡ株、ＣＶＳ株、ｐｖ株等が代表的なウィ
ルス株として挙げられる。これらの狂犬病ウィルスは、
共通した構造として、Ｌ。

Ｇ、Ｎ、Ｍｌ、Ｍ２の６つの蛋白質より構成されている
ことが確認されており、今日においては、これらのウィ
ルス構成蛋白質の中で、糖蛋白質であるＧ蛋白質が有効
なワクチン材料となることが知られている［　Ｖｉｋｔ
ｏｒら、Ｊ、　Ｉｓｇ＋ｕｎｏ１．　１１０゜ｐ２６９
−２７６　（１９７３）］、　最近、狂犬病ウィルスの
各々の構成蛋白に対するモノクローナル抗体が作出され
、これまで明らかでなかった狂犬病ウィルス株間の比較
が可能となってきている。　　ＦＬＡＭＡＮＤら（Ｊ、
Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、、４８，１０５〜１０９＜１９８
０））は、数多くの狂犬病ウィルスの中和抗体産生能や
感染防御に関与しているＧ蛋白質をモノクローナル抗体
を用いて比較し、Ｇ蛋白質に対する抗原決定基が少なく
とも１４種以上あることや、これらの一連の反応パター
ンから狂犬病ウィルス株間の区別が可能であることを示
している。その後、多くの研究者がＮ蛋白に対するモノ
クローナル抗体の一連のパネルを用いて世界各地で分離
された街上毒ウィルスの抗原性を調べた。その結果、分
離地域や分離動物ごとにウィルスの抗原性状が異なって
いる場合の多いことが分かっている。このような事実は
、ある意味では、一つのワクチン株で世界中の狂犬病を
予防し得るかという点に重大な問題を提起していると言
えるが、本発明における狂犬病ウィルス株は西ケ原株に
由来し、先にも述べたように、我が国の狂犬病根絶とい
う歴史的事実によりその優位性が証明されているもので
ある。

１来且１ これまでに、遺伝子組換え技術を用いた狂犬病ウィルス
蛋白質の発現に間しては、Ｇ蛋白質を標的にしたものを
中心として、既にいくつか報告されている０例えば、Ｌ
、　Ｔ、　Ｌａ誓ｅｎｃｅらは、狂犬病ウィルスＥＲＡ
株の糖蛋白質をコードする遺伝子を大腸菌（ε５ｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の発現系に導入しその発現を
試みている。その結果、糖蛋白遺伝子は大ｌ！菌内で発
現はしたものの、宿主が大ｉａｔｗであるため°に糖鎖
の付加はなく、免疫原として有効な抗原は得ろなかった
ことを報告している［　Ｖａｃｃｉｎｅ　８４．　ｐ２
０３−２０８コールド・スプリング・ハーバ−研究所（
Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ）編コ。

また、同様に大腸菌を用いての狂犬病ウィルス糖蛋白質
発現実験が、Ｅ、　Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎらによっても報
告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ、２１９　ｐ６
４１−６１９　（１９８３））。この報告においても、
ワクチンとして有効な抗原が得られたような結果は示さ
れていない。その後、さらに進んで、真核細胞である酵
母や動物細胞を用いてＧ蛋白の発現を行った例が特許公
表公報として報告されている（特許公表公報昭８ｌ−５
００９４９）、　　この報告においては、糖鎖が付加し
たＧ蛋白質が発現されたことが記載されているが、実際
に動物を用いて免疫試験を行った結果等は示されていな
い。

上記の報告のように、Ｇ蛋白質の発現にはいくつかの報
告において成功しているものの、実用化レベルにおける
これらを用いた有効な狂犬病ワクチンが開発された例は
まだ報告されていない。

え豆Ω旦ヱ このような状況において、本発明者らは、現存の第１世
代の狂犬病ワクチンに優る、遺伝子組換え技術を応用し
た安全かつ有効なワクチン開発を　′目的とし、鋭意探
究を重ねた結果、目的の狂犬病糖蛋白質を遺伝子組換え
技術により得ることに成功した。すなわち、狂犬病ウィ
ルス西ケ原株に由来するウィルス株のＧ蛋白質をコード
するｃＤＮＡをクローニングし、これを真核細胞用発現
ベクターに組込み、真核細胞内で発現させたところ、真
核細胞に目的の狂犬病ウィルス糖蛋白質を発現させるこ
とに成功し、さらに発現された糖蛋白質がワクチンとし
て有効であることを確認し本発明を完成するに至った。

さらに本発明における遺伝子組換え技術を用いた狂犬病
ウィルス糖蛋白質の製法によれば、目的の糖蛋白質は、
形質転換細胞の細胞膜に結合した状態ではなく、細胞質
内に局在する状態で発現され、形質転換細胞の代謝にほ
とんど影響を及ぼすことなく、効率的に目的の糖蛋白質
を発現させ、さらにこれらを容易に精製することが可能
となる。このようにして得られた本発明の糖蛋白質は、
狂犬病ウィルスを中和する活性を有するモノクロナール
抗体と反応するばかりではなく、これを動物に免疫した
場合に、狂犬病ウィルス中和活性を有する抗体をも産生
させることができ、本発明の糖蛋白質がワクチンや診断
試薬の利用に適していることが確認された。

■の　　・ 本発明に用いる狂犬病ウィルス株は、前述した西ケ原株
に由来し、その後家兎継代により安定に維持され、現在
に至るまで継代数２，０００代を越しているウィルス株
であり、本明細書中においては、便宜上、Ｎ−ＨＬ株と
呼ぶことにする。

本発明の狂犬病ウィルスＧ、蛋白をコードする遺伝子断
片（Ｇ−ｃＤＮＡ）は、第ｉａに示した塩基配列のうち
、翻訳開始コドンであるＡＴＧから終止コドンであるＴ
ＧＡまでの１５７５塩基対を有する遺伝子断片もしくは
これと等価の遺伝子配列を有する遺伝子断片、またはこ
れらの遺伝子断片のうち、実質的に抗原決定部位をコー
ドする一部の遺伝子を含む遺伝子である。

本発明のＧ−ｃＤＮＡは、狂犬病ウィルスＮ−Ｈ上株か
ら、通常の遺伝子クローニング技術［例えば、Ｇｕｂｌ
ｅｒとＨｏｆｆａ＋ａｎの方法；　Ｇｅｎｅ　２５．　
ｐ２６３−２６９　（１９８３）］を用いることにより
クローニングすることができる。このような狂犬病ウィ
ルスＮ−Ｈ上株のＧ−ｃＤＮＡを絹込んだプラスミドを
持つ大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ　ｉ　
Ｄ）１５ａ　／　ｐＵｃ−Ｎ９１３　：微工研条寄第１
６３１号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１６３１）として本発明者
らにより寄託されている。また、このようなＧ−ｃＤＮ
Ａは、第１図の塩基配列を基にＤＮＡ合成機（例；アプ
ライドバイオシステム社製、タイプ３８１Ａ）を用いて
目的の１５７５塩基対もしくはその一部の必要な遺伝子
を合成することにより得ることもできる。このＧ−ｃＤ
ＮＡは、適当な発現ベクターに組込み、これを真核細胞
に導入することにより目的の狂犬病ウィルスＧ蛋白を細
胞質内に発現させることが可能な遺伝子である。

本発明のＧ−ｃＤＮＡを発現させる場合には、その発現
宿主として真核細胞が用いられる。真核細胞としては、
酵母菌、または哺乳類動物由来の動物細胞もしくは昆虫
細胞由来の培養細胞を用いることが可能である０発現系
の構築方法としては、まず、用いた宿主細胞に応じた発
現ベクターを構築し、これを宿主細胞に導入することに
より目的のＧ蛋白発現形質転換細胞が得られる。以下、
宿主細胞として酵母を用いた場合、培＠細胞を用いた場
合に応じて、それぞれ詳細に記述する。

酵母を宿主として用いる場合には、酵母の遺伝子と大腸
菌の遺伝子を担い、さらに適当なプロモーター領域を担
ったシャトルベクターに該Ｇ−ｃＤＮＡを組込むことが
好ましい。そのようなシャトルベクターとは、酵母の複
製開始点、例えば２μｏｒｉならびに／もしくはａｒｓ
Ｌ　　酵母における選択マーカーとなる遺伝子、酵母由
来のプロモーター領域、大腸菌の複製開始点領域（例え
ばｐＢＲ３２２由来のｏｒｉ領域）、および大腸菌での
選択マーカー遺伝子を持つプラスミドである。ここで言
う酵母の選択マーカーとは、例えば、ロイシン、ヒスチ
ジン、またはトリプトファン等のアミノ酸産生遺伝子で
あり、大腸菌での選択マーカーとなる遺伝子とは、アン
ピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、またはク
ロラムフェニコール等の耐性遺伝子を指す、酵母由来の
プロモーターとは、酵母菌体内で作用することが可能な
形質発現調節領域を指し、例えば抑制性酸性フォスファ
ターゼ（ＰＨ０５）プロモーター、グルタルアルデハイ
ド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰ−ＤＨ）プロモータ
ー等が好ましいものとして挙げられる。このようなシャ
トルベクターの好ましい一例としては、酸性フォスファ
ターゼ形質発現調節領域（プロモーター）を持つｐＡＭ
８２　（特開昭５９−３６６９９号）等が挙げられる。

宿主の酵母菌としては、サツカロミセスφセレビシェ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　　ｅｒｅｖｉｓ’　ｅ）
　Ａｌ２２　（微工研条寄第３１２号）が好ましいもの
として挙げられるが、これに限定されるものではない。

上記のような酵母用発現ベクター（シャトルベクター）
を用いて酵母を形質転換させる場合には、通常の酵母形
質転換方法［伊藤ら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ１１５３
、ｐ１６３−１６８　（１９８３）］により、目的のＧ
蛋白発現が可能な形質転換酵母菌を得ることが出来る。

一方、培養細胞を宿主として用いる場合には、ＳＶ４０
ウィルス遺伝子の一部をＧ−ｃＤＮＡと置換することに
より、形質転換細胞内でＧ蛋白を発現することが可能な
組換えウィルスを得ることができ、これをヘルパーウィ
ルスとともに宿主細胞に導入し、目的のＧ蛋白を得るこ
とができる。

または、宿主細胞内でプラスミド状態で増殖できるウィ
ルス（パピローマウィルスなど）遺伝子の一部とＧ−ｃ
ＤＮＡを結合させ宿主細胞に導入すれば、プラスミド状
態でＧ蛋白目的遺伝子を発現する細胞を得ることができ
る。さらに、大腸菌プラスミドにおいてＧ−ｃＤＮＡの
上流にウィルスや高等動物由来のプロモーターを結合さ
せたプラスミドを培養細胞に導入すれば、宿主染色体に
組込まれたＧ−ｃＤＮＡを得られた形質転換細胞で発現
させることができる。このようなプラスミドとしてｐＳ
ｖＬベクター（ファルマシア社製）などのように市販の
ものを利用することもできる。

上記のようにして得られたＧ蛋白発現形質転換体を下記
のように処理することで目的のＧ蛋白を精製することが
可能である。

まず、得られた形質転換体をその細胞に応じた培地と条
件のもとに培養することにより目的のＧ蛋白を形質転換
体の細胞質中に発現させる。宿主として、酵母を用いた
場合には、超音波もしくはガラスピーズやマントンゴー
リンのような物理的処理や、または必要に応じ界面活性
剤のような化学的処理も加えて処理することにより集め
た菌体を破壊する。一方、培養細胞の場合には、酵母の
場合のような激しい処理は必要とせず、界面活性剤で処
理することにより細胞質内のＧ蛋白を溶出することがで
きる。このようにして得られた破砕液（ライセード）は
、遠心分離等により宿主細胞由来の沈澱物を除いた後、
狂犬病Ｇ蛋白に対す抗体を用いたアブニティークロマト
グラフィーにより目的のＧ蛋白質を容易に精製すること
ができる。

さらに精製を行う場合には通常の精製方法、例えばイオ
ン交換クロマトグラフィー、密度勾配遠心、種々の７フ
イニテイークロマトグラフイー等によりワクチンとして
使用可能な純度まで精製することができる。

本発明に於ける狂犬病ウィルスＧ−ｃＤＮＡ及びこれを
用いて発現された組換え狂犬病Ｇ蛋白質とその発現系は
、従来報告されたものに比較し、次の特徴を有するもの
である。

ｌ　　　　　　　Ｇ　　　　ｃＤＮＡの声　　１これま
でいくつかの狂犬病ウィルスのｃＤＮＡ塩基配列が報告
されているが、狂犬病ウィルス構成蛋白質のなかの成熟
Ｇ蛋白の相補的なりＮＡ（ｃＤＮＡ）の塩基配列は、１
５１５塩基対からなり、５０５個のアミノ酸をコードし
ている。本発明の狂犬病ウィルスＮψＨＬ株のＧ−ｃＤ
ＮＡ塩基配列をＥＲＡ株、ＣｖＳ株、２７株のそれらと
比較すると、これらのいずれとも塩基配列が異なり、特
に、糖鎖の付加が予想されるＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｓｅ
ｔ）配列によって示される部位は明確に異なっている。

その違いをまとめたものを第１表に示す。

第　　１　　表 ０：糖鎖の付加が可能な部位 Ｘ：糖鎖の付加が不可能な部位 糖の付加（グリコシレージョン）の意義はよく解明され
ていないものの、蛋白質の構造や安定性に関与している
と考えられている。事実、生体の生理活性物質や血清蛋
白等多くの蛋白が糖蛋白質である。グリコシレージョン
シグナルの配列の存在は必ずしも糖の付加を意味するも
のとは４限らないが、この配列は蛋白質の構造や安定性
に関与している可能性が強く、その意味では蛋白質の機
能（生物学的活性）に関与することになるので、グリコ
シレージョンサイトを比較することは、ｃＤＮＡ全体の
ホモロジーを比較することと同等に重要であると考えら
れる。

２　　　　　に１Ｇ 本発明による発現プラスミドを動物環ａｍ胞、例えばＣ
Ｏ５細胞に感染させ、狂犬病ウィルスＧ蛋白の発現部位
を、ウィルスＧ蛋白抗原を免疫して得たポリクローナル
抗体及びウィルスを中和する活性を有するモノクローナ
ル抗体を用いて検索した。

その結果、本発現系では、Ｇ蛋白は細胞質内に顆粒とし
て検出され、細胞膜では検出されなかった。これまで狂
犬病ウィルスＧ蛋白の動物細胞での発現様式でそのよう
な現象の報告はなく、従って本発明における上記発現の
様式は新規なものである。狂犬病ウィルスと同じラブド
ウィルス科に属する水泡性口内炎ウィルス、（ＶＳＶ）
に関して、Ｒｏｓｅらは、ＶＳＶ（７）　Ｇ蛋白ｃＤＮ
Ａを本発明の発現系とほぼ同様に構築し、その発現様式
を報告している［Ｃｅ１ｌ　３０．　Ｐ２Ｓ５−７６２
　（１９Ｂ２）］、　　この報告によれば、形質転換細
胞中で発現された特異抗原は細胞膜に結合した状態にあ
ることが認められている。この事実は、本発明における
Ｇ−ｃＤＮＡ固有の機能が、Ｇ蛋白抗原の細胞質内局在
を誘導していることを示している。

発現産物が培養液中に放出される系を除けば、外来遺伝
子の発現系としては、発現産物が細胞質内に発現され局
在する場合と、発現産物が発現された後細胞膜に結合し
た状態で局在する場合に分けられる。

一般的な現象として、発現産物が細胞膜に結合すると、
その宿主細胞の増殖が阻害を受けやすくなること、さら
には細胞膜随伴性の蛋白（糖蛋白）の精製において、細
胞膜成分が目的の蛋白と結合して、品質や回収率に大き
な影響を及ぼす等が考えられる。従って、本発明の狂犬
病ウィルスＧ蛋白発現系は、目的のＧ蛋白を細胞質内に
発現させることができるため、このような発現効率や精
製における問題を伴わず、目的のＧ蛋白を非常に効果的
に発現させ、さらに精製することが可能である。

３　　　れ１Ｇ　　　に　　　　の 本発明のように、遺伝子組換えにより外来遺伝子を酵母
や培養細胞を用いて発現させる場合には、発現されたペ
プチドが、目的のペプチド（抗原）に対する抗体と反応
はしても、すなわち、発現されたペプチドに抗原性はあ
っても、生物学的製剤としての性質に欠けているという
場合が少なくない。これは、宿主として用いる細胞にお
いて、翻訳された後のペプチドが生物活性を持つように
修飾されるかどうかによるものと思われる。前にも示し
たように、Ｅ、　Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎらは、大腸菌（Ｅ
。

ｃｏｌｉ）を用いて、狂犬病Ｇ蛋白の遺伝子を発現させ
ることに成功し、これがＧ蛋白質に対する抗体と反応す
ることは確認できたが、これを動物に免疫した場合には
抗体を産生させることはできなかったことを報告してい
る。このことは大腸菌に糖鎖を付ける等の修飾機能がな
いことが最も大きな原因であると推察されるが、真核細
胞である酵母や、培養細胞を用いた場合にも発現物質の
生物的活性に間する同様の問題が生じることが少なくな
い。

これは、発現されるペプチドが宿主細胞に対してどの様
な影響を与えるか、または、発現されたペプチドが本来
の生物活性を有するように修飾されるかどうかというよ
うな様々な要素が係わるものと推測され、言い替えれば
、発現を目的として宿主に導入される目的ペプチドの構
造遺伝子に応じて微妙に影響を受けるものであると言え
よう。しかしながら、本発明のＧ−ｃＤＮＡを真核細胞
に導入し発現され、得られるＧ蛋白は、Ｇ蛋白に対する
抗体と反応するだけでなく、これをワクチンとして動物
に注射した場合に狂犬病ウィルスに対して中和活性のあ
る抗体を誘導することが可能てあることが、モルモット
を用いた免疫試験により確認された。さらにその免疫原
性の強さを狂犬病ウィルス由来の精１１Ｇ蛋白質と比較
したところ、同等の結果を示した。このことは、本発明
のＧ蛋白がワクチンとして十分に有効であることを示し
ており、遺伝子組換えにより安価でしかも大量に調製さ
れることが可能な本発明のＧ蛋白を用いたワクチンが、
開発途上国を中心とした狂犬病の駆逐に大いに貢献し得
ることを示してい４゜このように、本発明の特徴は、狂
犬病ウィルスＧ蛋白質を細胞膜に結合させず細胞質にの
み局在させ発現させることが可能であること、またこの
ようにして得られた狂犬病Ｇ蛋白質はウィルスに対する
中和抗体を産生させることが可能であるという点にある
。

以下、実施例に従って、本発明をさらに詳細に説明する
。

各実施例において特に断わりがない限り以下の試薬およ
び方法に従った。

制限酵素および修飾酵素は宝酒造株式会社および東洋紡
績株式会社のものを使用した。

α−３２Ｐ−ｄＣＴＰはアマジャム（コードＮＯ，ＰＢ
１０３８５．８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を使用した。　。

ＤＮＡの　　　　　＋　　　−−ショゝ各酵素の使用条
件はパンフレット”Ｔａｋａｒａ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　
ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ”及び”ＴＯＹＯＢＯ遺伝子工学研究用
試薬総合カタログの指定する条件に従った。各酵素反応
終了後は、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ、　ｃｌｏｎｉｇ　［Ｔ
、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｐ４５８−４５９、（１９Ｂ２）
コに従い、フェノール処理、クロロホルム処理を行いエ
タノール沈澱によりＤＮＡを回収した。ＤＮＡライゲー
ション反応は、タカラライゲーションキット（宝酒造、
カタログ番号６０２１　）を使用し、それに添付のプロ
トコールに従い行った。また、ＤＮＡ末端へのリンカ−
の付加もこのキットを使用し、それに添付のプロトコー
ルの指示する方法により行った。

ロー　　　゛に　　Ｄ　　　　　のロ ＤＮＡアガロース電気泳動は　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃ
ｌｏｎｉｎｇ　［Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｐ１５０−
１６３　　（１９８２）　］に従い行ったが、特にアガ
ロースゲルより特定のＤＮＡ断片を抽出したい時には、
ローメルティングアガロース（Ｂｏｏ−ＲＡＤ　　カタ
ログ番号１６２−００１７）を使用し、その回収もＭｏ
１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ。

ｐ１７０　　（１９８２）　］に従い行った。

−ミ′の　　φ 形質転換した大腸菌から大量にプラスミドを抽出、精製
する場合はＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　［Ｔ
、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｐ９０−９１　　（１９８２
）　］記載のアルカリ法に従い行った。形質転換後の数
多くの大腸菌の中から、所望のプラスミドで形質転換し
たクローンを選定する場合、次に、述べるコロニーハイ
ブリダイゼーションに従い目的の陽性クローンをまず選
択した。そのクローンから小量のプラスミドを抽出、精
製する方法としてＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
　［Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｐ２Ｏ３（１９８２）　
］に従い、それを抽出し所定の制限酵素で切断しアガロ
ース電気泳動によりその分析を行った。

コロニーハ　　ｌ　　ゼーショゝ・　　−ハヱＵ乞イ’
ｄ−２」Ｌン Ｇ−ｃＤＮＡ断片をニックトランスレーション試薬キッ
ト（ＢＲＬカタログＮｏ、８１６０ＳＢ）と、標識する
基質としてビオチン−１１−ＵＴＰ　（ＢＲＬカタログ
Ｎｏ、９５０７ＳＡ＞を用い、キットに添付されている
プロトコールに従いプローブを調製した。コロニープラ
ークハイブリダイゼーションの条件等は藤多等が細胞工
学Ｖｏ１．４、Ｎｏ、１０、Ｐ２Ｏ３−９００、（１９
８５）で述べている方法に準じて行なった。

！Ｌ！ＬｆＬｌ　：　Ｇ　−ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの調製（１
）ＲＮＡの抽出・ ３７℃、４８時間増殖させたハムスター肺細胞（８ｍＬ
ｕ細胞）に、ｎ＋ｏｉ　０．２で狂犬病ウィルスＮ−Ｈ
Ｌ株を感染させた。４８時間後に、その細胞より全ＲＮ
ＡをＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎｇ［Ｔ、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ、　ｐ１９６（＋９８２）］に従い、抽出し
た。

分光学的な定量法（２６０ｎｍの吸光度が１．０の時、
４０μｇ／ｍ　Ｉ　）により、ローラーボトル１本分の
狂犬病ウィルス感染細胞より１．５１ｍｇのＲＮＡを得
た。このようにして得たＲＮＡが分解していないことを
確認するために、その中から２周を取りＰ　、　Ｔｏｎ
＋ａｓの方法［Ｐｒｏ　Ｎ、Ａ、Ｓ、　７７　ｐ５２０
１−５２０５　（１９８０）］に従い、電気泳動を行っ
た。その結果、その中の大部分は２８ｓ及び１８ｓリボ
ゾームＲＮＡであったが、それらが分解を受けていなか
ったことから、その中に少量台まれるＧ−ｍＲＮＡも分
解を受けていないことが予測された。

次に、Ｐ、Ｔｏ■ａＳの方法に従い電気泳動を行ったＲ
ＮＡをニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　
５ｃｈｕｅｌｌＢＡ８５）にトランスファーし、ｓｅｐ
で標識した狂犬病ウィルスＨＥＰ−ＦＩｕｒｙ＊　Ｇタ
ンパク質ｃＤＮＡ断片をプローブとして　ニトロセルロ
ース上でハイブリダイゼーション（ノーザンプロツテン
グ）を行なった。その結果、同時に泳動したウィルス非
感染ＨｍＬｕ細胞から抽出したＲＮＡには、全くバンド
を見いだせず、ウィルス感染細胞から抽出したものには
２．２ｋｂｐ付近、およびこれの幾分高分子の位置にバ
ンドを見出すことができた。以後、このＲＮＡ＠ｃＤＮ
Ａ合成に供した。

（２）狂犬病ウィルスＮ−ＨＬ株のＧタンパク質ｃＤＮ
Ａのクローニング ｃＤＮＡ合成は、ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎの方法
［Ｇｅｎｅ　２５．　ｐ２６３−２６９　（１９８３）
］、つまりオリゴｄＴ＋２−＋ｓ（ファルマシア社製）
をブライマーとし、ウィルス感染細胞から抽出したＲＮ
Ａ５μ９を鋳型として、逆転写酵素（Ｍｏｌｏｎｙ　ｍ
ｕｒｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ　Ｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔａｓｅ　；　ＢＲＬ社製〉により合成した
一本鎖ｃＤＮＡとハイブリダイズしているＲＮＡ鎖に、
大腸菌ＲＮａｓｅＨによってニックを導入し、それで形
成させたＲＮＡ鎖をブライマーとして、大１１１Ｍポリ
メラーゼＩにより二本鎖ｃＤＮＡを合成した。このよう
にして合成した二本鎖ｃＤＮＡを次の２つの方法により
クローニングした。

■宝酒造ライゲーションキットを用い、両端にｐｓａｌ
ｌリンカ−を付加した２零値ｃＤＮＡと、制限酵素５ａ
ｌｌで切断後、その５９末端のリン酸を除去したクロー
ニングベクターｐＵｃ１９の両者を宝酒造うイゲーショ
ーンキットの添付プロトコールに従い反応（１６℃、３
０分間）させた、これをＢＲＬから市販されているＤ）
１５α（Ｆ−１ｅｎｄＡＩ、ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−１ｍ
ｋ÷）、５ｕｌ）Ｃ４４、ｔｈｉ−１、λ−ｒｅｃＡｌ
、ｇｙｒ９６、ｒｅｌＡｌ、φ８０ｄ　ＩａｃＺΔＭ１
５）のコンピテントセルに感染させた０次に、狂犬病ウ
ィルスへップフラリー（ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ）株Ｇタン
パク質ｃＤＮＡ断片をプローブとし、このようにして得
られたクローンのうち約３　、　Ｇｏｏクローンをコロ
ニーハイブリダイゼーションで調べた結果、１クローン
が発色し、これをｐＵＣ−ＲＮＳＬと命名した。　　ｒ
Ｇ蛋白質発現系の劃１の項で述べるような操作を加えた
このｃＤＮＡを、ＣＯ８細胞及び酵母の発現系に導入し
た。

■長田ら、実験医学Ｖｏ１．４、Ｎｏ、訳８７−９２（
１９８６）に記載している方法に従い、まず２末鎖ｃＤ
ＮＡＯ，５μ９をＥｃｏＲＩ−メチラーゼで処理し、Ｅ
ｃｏＲＩ切断部位をメチル化後、宝酒造ライゲーション
キットによりそのＤＮＡの両端にｐＥｃｏＲＩりンカー
を付加した。そのＤＮＡをクローニングする為、既にＥ
ｃｏＲＩで切断されているλｇｔｌＯのアームをストラ
テジーン社（５ＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）　　（ＧＴＩＯ）
より購入し、そのパンフレットに記載されているプロト
コールに従いそれらＤＮＡをライゲーションさせた。次
にストラテジーン社より市販されているインビトロパッ
ケージングエクストラクト（商品名：Ｇｉｇａｐａｃｋ
　ｐｕｌｓ　　ストラテジーン社１り及びそれに添付の
宿主菌ＶＣＳ２５Ｂ、もしくはＣ６００ｈｆ　ｌを用い
たインビトロパッケージ法によりＧ−ｃＤＮＡをクロー
ニングした。総数で約３５万個のクローンを得、そのう
ち７，０００個を１枚のプレートにまき、プラークハイ
ブリダイゼーションの結果から２１個の陽性クローンを
得た。

（３）ｐＲＮＳＬ全塩基配列決定 Ｇ−ｃＤＮＡ断片を得るために、２０μ９のｐＲＮＳＬ
を制限酵素５ａｌ１５０単位と、それに添付のバッファ
ーを用い、３７℃、４時間反応させた。そのＤＮＡｌｔ
ｌ％ローメルティングアガロースにより２つの断片にわ
け、２．１にｂｐに相当するＧ−ｃＤＮＡ断片を抽出、
回収した。

■このＧ−ｃＤＮＡをより小さく断片化するために、０
．１μｇＧ−ｃＤＮＡを４塩基認識の制限酵素１１ａｅ
　ｍ、　Ｒｓａ　ｌ、Ａｌｕ　Ｉ、　Ｔａｇ　ｌ、　５
ａｕ３Ａ　Ｌで　各々６、５，６，９．７個の断片に分
断した。その断片化Ｇ−ｃＤＮＡのうち　Ｈａｅｌ［、
Ｒｓａ　ｌ、Ａｌｕ　ｌ切断Ｇ−ｃＤＮＡについてはＳ
ｅａ　ｌで切断したＭ１３ｍｐｌＢもしくはＳＦ＋＋ａ
！とＳａｌ　ｌで切断したＭ１３ｍｐ１９と、Ｔａｑ　
ｌ切断フラグメントはＡｃｃ　Ｉで切断した１３ｓ＋ｐ
１Ｂと、また５ａｕ３Ａｌ断片の場合はＢａｍＨＩ、も
しくはＢａａ　ｌと５ａｌｌでダブルに切断したＭ１３
■ｐ１９と各々、宝酒造ＤＮＡライゲーションキットで
、ライゲーションさせた。

■制限酵素Ｋｐｎ　ｌとＢａｗＨＩで切断したｐＵＣ−
ＲＮＳＬを宝酒造キロシークエンス用プリージョンキッ
ト（カタログＮｏ、６０３０）と、それに添付のプロト
コールに従い、ＢａｍＨＩ切断部位からプリージョンさ
せ、その程度の異なるＧ−ｃＤＮＡ、ｔ−調製した０次
にこれを５ａｌｌで切断した。このようにして得たプリ
ージョンＧ−ｃＤＮＡをＳｓａ　Ｉと５ａｌｌで二重切
断したＭ１３＋ｗｐ１Ｂを、タカラライゲーションキッ
トを用い、ライゲーションさせた。

東洋紡インストラクションマニュアルの方法に従い、Ｊ
ＭＩＯＩのコンピテント細胞を調製し■、■の処理で得
たＤＮＡでコンピテント細胞を形質転換させた。その形
質転換の手順およびその後−末鎖ＤＮＡの抽出、精製は
すべて東洋紡Ｍ１３クローニングキット（コードＮｏ、
Ｍ１３−００１）とその“インストラクションマニュア
ル”に従い行った。このようにして得た一本鎖ＤＮＡは
、東洋紡Ｍ１３シークエンシングキット（コードＮｏ、
Ｍ１３−００３）とＢＲＬ電気泳動装置（モデルＳ２カ
タログＮｏ、１１０５）を用いたＢＲＬシークエンシン
グゲル電気泳動システムとそれに添付のプロトコールに
従い行った。

その結果、ｐＲＮＳＬは２，１２３塩基対（ｂｐ）から
なり、その中にアミノ酸５２４個からなる狂犬病Ｇ蛋白
質をコードするを１，５７５塩基対のオーブンリーブイ
ブフレームが存在することが確認された（第１図参照）
。

塩基配列の結果から、クローニングしたＧ−ｃＤＮＡの
５′末端にはアデニンのクラスターが３２個存在するこ
とがわかった。それをＳＶ４０後期、および酵母酸性ホ
スファターゼプロモーターの下流に接続した場合、この
アデニンクラスターはその転写を著しく阻害することが
予想された。そこで以下に示す手順でそれを除去した。

まずｐＵＣ−ＲＮＳＬ　２ａｇを制限酵素Ｐｓｔ　ｌで
切断（３７℃、２時間〉した、そのＤＮＡを、宝酒造ヌ
クレアーゼＢａ１３１５（カタログＮｏ、２５１ＯＡ）
により反応温度３０℃、反応時間２分で　下記の反応組
成で消化を行った。

ＤＮＡ（Ｐｓｔｌ　　切断済）　　　　２３μ＋５ｘＢ
ａ１３１バツフアー（※）６μＩＢ　ａ　　Ｉ　３１Ｓ
　（２ｕｎｉｔｓ／ｇ＋ｌ）　　　　　　　１　　ｕ　
Ｉ（※）　５ＸＢａ１３１バ・ンフ７−　；１００ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−）１ｃＩ　、　　３ＭＮａＣｌ、　８０ｍ
Ｍ　ＣａＣｌ２．６０ｍＭ　ＭｇＣ１ａ、　５ＩＩＭ　
ＥＤＴＡこの後、２ａｇ　ｐｓａｌ　Ｉリンカ−（東洋
紡５ＡＬ−８０１）を宝酒造ライゲーションキットを用
いて、このヌクレアーゼＢａ１３１消化ＤＮＡ両端に付
加した。

そのＤＮＡを制限酵素５ａｌｌで十分切断し、ローメル
ティングアガロース電気泳動により約２．１ｋｂｐ付近
のブロードとなったＤＮＡバンドを切り出しそのＤＮＡ
を回収した。そのＤＮＡを制限酵素５ａｌｌで切断した
ｐＵｃ１９とライゲーションキットを用いライゲーショ
ンさせ、ＢＲＬ　（カタログＮ００８２６３ＳＡ）より
購入したコンピテント細胞ＤＨ５αを形質転換させるこ
とでクローニングを行った。

このようにして得られたクローンの５′末端側の塩基配
列を東洋紡Ｍ１３クローニングキット（コードＮｏ、Ｍ
１３−００１）とその“インストラクションマニュアル
”に従って行ない、それを決定した（第２図参照）、こ
の中でＮ９−１３をＧ蛋白質ｃＤＮＡとして、後のＣＯ
５細胞、および酵母の発現系に導入した。この遺伝子断
片を有するプラスミドｐＵＣ−Ｎ９１３は、大腸菌に組
込まれた状態でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｄ
Ｈ５ａ　／ｐＵｃ−Ｎ９１３　［微工研条寄第１６３１
号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１６３１）　］として寄託されて
いる。

裏ＪＩＪＩユニ動物細胞を宿主とした糖蛋白質の発現 （１）ＣＯＳ細胞発現プラスミドの構築ｐＵＣ−Ｎ９１
３を制限酵素５ａｌｌで切断し、インサートしているＧ
蛋白質ｃＤＮＡを得るために制限酵素５ａｌｌでそれを
切断し、２つの断片に分けた＊　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　［Ｔ、　　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　
　１７０　（１９８２）］に記載の方法に従い、ローメ
ルティングアガロースゲル電気泳動によりＧ−ｃＤＮＡ
断片を得た。

発現ベクターとして、ファルマシア社より市販されてい
るｐＳＶＬ　（カタログＮｏ、　２７−４５０９−０１
）を使用した。Ｇ−ＣＤＮＡをこのベクターのプロモー
ター下流に挿入する為に制限酵素Ｘｈｏ　Ｉで切断し、
それの５′末端リン酸を除去した０次にｐｓｖｔ、とＮ
９−１３Ｇ−ｃＤＮＡ断片をタカラライゲーションキ・
ントによりライゲーションさせ、それをＨＢＩＯＩコン
ピテントセルに感染させた。

前記”プラスミドの抽出・精製”及び”コロニーへイブ
リダイゼーション”の項で述べた方法によりＮ９−１３
　Ｇ−ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡがＳＶ４０後期プロモーターの転
写の方向に挿入されたものを選定し、その１つテするｐ
ｓＶＬ−Ｎ９１３　（第３図参Ｎ）をファルマシア社よ
り市販されているＣｅ１ｌ　Ｐｈｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆ
ｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（カタログＮＯ，１？−０５９
５−０１）を用いてＣＯ５細胞に感染させた。

（２）ＣＯＳ細胞でのＧ蛋白質発現確認アフリカミドリ
ザル腎由来ＳＶ４０形質転換細胞（ＣＯ９−１）（大日
本製薬より人手、カタログＮ０．０９−１６５０）を、
１０％子牛血清を含むＭＥＭ培地中に細胞濃度が１０’
　ｃｅｌｌ／ｍｌになるように調整し、３７℃で２４時
間二酸化炭素フラン器で培養した。

２４時間の培養後、培地を除去し、細胞を０．ＯＩＭ　
ＰＢＳ１？１回洗浄した。５０μｓ／ｍ１ＤＥＡＥ−デ
キストラン溶液１００μｍとＧ蛋白発現ベクターｐｓｖ
ｔ。

−Ｎ９１３０．５μｇを混合したものをこの細胞に滴下
し、室温に１５分間放置して感染させた。その後、無血
清ＭＥＭ培地を用いてこの細胞を洗浄し、通常の培養条
件（３７℃、５％二酸化炭素フラン器）で４８時閏培養
した。

次に、このようにして得た細胞がＧ蛋白質を発現してい
ることを確認するために、ウィルス学実験法（国立予防
衛生研究所学友全編、ｐ２９７−３２９）に記載されて
いる方法に従い閉接蛍光抗体法によりｆｌ察を行った。

すなわち、ＤＮＡ感染４８時間後　−の培養上清を除去
し、アセトンを滴下することで目的抗原がはげ落ちたり
、溶出したりしないように前処理を行った。−次抗体と
して、中和抗体を持つモノクロナール抗体と前処理した
細胞を反応させた（１０分、室温）ｅ　０．ＯＩＭ　Ｐ
ＢＳで洗浄後、蛍光色素であるＦ　Ｉ　Ｔ　Ｃ（ｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｎ　１ｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）で標識
した抗マウスＩ　ｇ　Ｇ　（ＦＩＴＣ−Ｒｂｘ　Ｍｏｕ
ｓｅ　Ｉ、ｇＧ（）Ｉ＋Ｌ）、ＺＹＭＥＤ社製カタログ
ＮＯ，６ｌ−６５１１）と反応させた。これを０．０１
Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓで洗浄後、蛍光顕微鏡により観察した。

このようにして観察したｃｏｓｍ胞の蛍光反応の状態を
第４図に示した。

その結果、ＣＯ５細胞内で発現されたＧ蛋白質は細胞膜
に結合した状態ではなく、細胞質内に顆粒状として発現
されていることが確認された。

Ｘ立１１：酵母を宿主とした糖蛋白質の発現（１）酵母
発現プラスミドの構築 ｐＵＣ−Ｎ９１３がインサートしているＧ蛋白質ｃＤＮ
Ａを得るため、制限酵素５ａｌｌでそれを切断し、２つ
の断片に分けた。ローメルティングアガロース電気泳動
により、Ｇ−ｃＤＮＡ断片を得た。

一方、酵母での発現ベクターｐＡＭ８２（特開昭５９−
３６６９９号参照）を、制限酵素ＸｈｏＩで切断した。

その後、アルカリホスファターゼくベーリンガー；製品
番号７０３０２３）を用い５′末端のリン酸をＭｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ　Ｐ１３３−１３４１９８２）に従い除去した。この
ベクターとＮ９−１３の両者をタカラライゲーションキ
ットを用いライゲーションさせ、これを大腸菌ＨＢＩＯ
Ｉのコンピテントセルに感染させた。出現した大腸菌を
、Ｇ−ｃＤＮＡをプローブとしたコロニーパイプリダイ
ゼーションにより陽性クローンｐＡＭＮ９１３を得た（
第５図）。

（２）酵母での糖蛋白質の発現 酵母としてサツカロミセス・セレビシェＡＨ２２［ａ　
１ｅｕ２　ｈｉｓ４　Ｃａｎ１　（Ｃｉｒ＋）］　　（
微工研条寄第３１２号）を用い、これをＹＰＤ培地（２
Ｘポリペプトン、ｌχイーストエキス、２ｘグルコース
）　１００ｍ１に接種し、３０℃で一晩培養した後、遠
心して集菌した。滅菌水２０ｍ１にて菌体を洗浄し、つ
いで１．２Ｍソルビトール及び１００μ９／１チモリア
ーゼ６０．０００　（生化学工業！りの溶液５ｍｌにｇ
濁させ、３０℃で約３０分間保ち、スフェロプラスト化
した。ついで、スフェロプラストを１．２Ｍソルビトー
ル溶液で３回洗浄した後、２門ソルビトール、１０ｍＭ
　ＣａＣｌ２および１０＋＋ｌｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（
ｐＨ７，５）の溶液０．６ｍｌに懸濁させ、その６０−
ずつを小試験管に分注した。これに前に調製した組換え
プラスミドｐＡＭＮ９１３　（１０刈）を加えて、充分
混合し、さらに０．１Ｍ　ＣａＣ１ａ　（３ｇ　ｌ）加
えて最終濃度１０■Ｍ　ＣａＣｌ２とし、室温に５〜ｌ
Ｏ分間放置した。

ついでこれに、２０％ポリエチレングリコール４，００
０．１０ｍＭ　ＣａＣｌ２および１０ｗＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）溶液１ｍｌずつを加えて混合し
、室温に約２０分間放置した。

この混合液０．２ｇ＋ｌずつを４５℃に保温された再生
培地（２２％ソルビトール、２％グルコース、０．７％
イーストニトロゲンベースアミノ酸、２％ＹＰＤ、２０
ｔｔｇ／ｌヒスチヂン、３％寒天）　１０ｍ１に加え、
軽く混合させ、予め準備された１、２Ｍソルビトール含
有最小培地（０，７％イーストニトロゲンベースアミノ
酸、２％グルコース、２０μ９／■１ヒスチヂン、２％
寒天）プレートに重層し、固化させた後、３０℃で培養
してロイシン非要求性酵母のコロニーを得た。このコロ
ニーを２０Ｉｔｇ／−１ヒスチヂンを含むバルクホルダ
ーミニマムメディウム［東江ら；　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｏ
ｌ、、１１３．１１７〜７３Ｂ（１９７３）を参照〕に
て培養して形質転換酵母サツカロミセス・セレビシェを
得た。

このようにして得られた形質転換酵母のコロニーをさら
に２０μ８／１ヒスチジンを含むバルクホルダーミニマ
ムメディウムの寒天プレート上に塗布し、３０℃にて培
養してコロニーを形成させた（ロイシン非要求性となっ
た形質転換体の再確認のため）、ついでこのコロニーか
ら菌体を分離し、２０μ８／履１ヒスチジンを含むバル
クホルダーミニマムメディウム１０ｍ１に接種し、３０
℃にて培養を行う。

約２４時間後、対数増殖期にある菌体を遠心して集菌し
、これをリン酸を含まない最小培地（バルクホルダーミ
ニマムメディウムに含まれるにＨ２ＰＯ４をにＣ１で置
換し、さらに２０μ８／１ヒスチジンを加えたもの）１
０１に菌体数的４にｔｏｅ個／１になるように懸濁し、
３０℃にて約２４時間培養を続けたのち、４０００回転
、１０分ｍｍ遠心により菌体を集めた。

この菌体を１．２Ｍソルビトール、５０ｓ＋ＭＩＪン酸
緩衝液（ｐＨ７，２）、１４ｍＭ２−メルカプトエタノ
ールμ８／−；ザイモリエース６０，０００の溶液３ｍ
ｌに懸濁させ、３０℃にて３０分分閏るやかに擺とうし
てスフ二ロブラスト化し、遠心分離によりこれを集めた
。

このスフェロプラストを１％トリトンＸ−１００を添加
した５０■Ｈリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）　１ｍｌに懸
濁し、グラスビーズを加えて攪はんして菌体を破砕した
。

この破砕液を５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上溝に
ついて次のＧ蛋白測定法によりＧ蛋白抗原活性を測定し
た．　即ち、第１抗体として、抗Ｇ蛋白モノクローナル
抗体を５０＋＋＋Ｍ炭酸緩衝液（　ｐＨ９．５）で希釈
し、ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートに３７℃、２時間もし
くは室温４時閉コートした．次にＰＢＳ　（リン酸緩衝
生理食塩水）　／　０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液（Ｐ
　Ｂ　Ｓ　−Ｔｖｅｅｎ）で３回洗浄し、１％ＢＳＡを
含むＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎ　（　Ｂ　Ｓ　Ａ　−　Ｐ　
Ｂ　Ｓ　−　Ｔｗｅｅｎ）で４℃−夜マスキングした．
ついで、各々のサンプルをＰ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｖｅｅｎで
適当に希釈しプレートに分注し、３７℃、１時間保温し
た．その後、ｐ　Ｉ３　５　−　Ｔｗｅｅｎで６回洗浄
し、パーオキシダーゼ棟識した抗Ｇ蛋白モノクローナル
抗体を含むＢ　Ｓ　Ａ　−　Ｐ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗｅｅｎ溶
液をプレートに添加した後、３７℃、１時間保温した．
その後、Ｐ　Ｂ　Ｓ　−　Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、基
質としてＴＭＢＺ（テトラメチルベンジジン塩酸塩）の
ＥＤＴＡ溶液（　０．００６％過酸化水素）をプレート
に添加し、発色させた．発色の程度をオートリーダー（
ＯＤ４５０ｔｖ）で測定して、第２表の結果を得た．陰
性対照としてＧ−ｃＤＮＡを組込んでいないプラスミド
ｐＡＭ８２を用いて形質転換した形質転換酵母を用いて
同様に処理したものについてのＧ蛋白抗原活性も同時に
測定した 第２表 この表から明らかなように、本発明のＧ−ｃＤＮＡを絹
込んだシャトルベクターを導入した酵母のみに非常に高
いＧ蛋白抗原活性が検出できた。

裏立■Ａ：マウスによる免疫原性試験 （１）免疫用抗原の調整および免疫 ウィルス中和活性を有するモノクローナル抗体をリガン
ドとしたアフィニティークロマトグラフィーを用いて、
ｐＡＭＮ９１３で形質転換した酵母のライセードから免
疫試験に使用するためのＧ蛋白質を精製した。これに水
酸化アルミニウムゲルを加え、１ド一スｌμｇになるよ
うに調整し、免疫用抗原とした０体重４５０〜６５０ｇ
のハートレー系モルモット（雌）２０匹を用い、その内
１０匹に上記で調整した免疫用抗原を腹腔内に注射し、
さらに初回注射から１週後に同様に２回目の注射を行っ
た。残りの１０匹は非免疫対照群として生理食塩液を同
様に注射した。

（２）中和試験 中和用ウィルスはＨｍＬｕ−１６１胞に順化され、かつ
成熟マウスの脳内注射でこれを発症死させ得る毒性を有
する狂犬病ウィルスＮ−ＨＬ株を用“いた。

免疫群すべてのモルモットについて、注射前、および２
回目注射２週後に採血を行った。非免疫対照群について
も同様に採血を実施した０次にこれらの血清を５６℃で
３０分間加熱非働化を行い、この血清をまず、２倍段階
希釈し、その５０μｌにウィルス量が２００ＴＣＩ　Ｄ
ｓ　ａになるように調整したウィルス液５０μｍを３７
℃で９０分部間応させた０次にその５０μｍづつを９６
穴マイクロプレートに培養させた。ＨｍＬｕ−１細胞に
接種し、３７℃で１．０時間吸着を行ったのち、細胞維
持用培地（イーグルＭＥＭ培地）１５０μｍを加えて３
７℃で４日間培養を行った。培養後のプレートについて
西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ
　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を標識した抗狂犬病糖蛋白モ
ノクローナル抗体（標識抗体）を反応させた。その結果
において標識抗体と反応しない血清はウィルス非感染の
ものであ−ることを示し、中和抗体陽性を示す、このよ
うにウィルス感染を完全に抑えた血清の最高希釈倍数の
逆数を求め、これを中和抗体価とした。その結果、本発
明のＧ蛋白を免疫して得られた血清には中和抗体を有す
ることがわかった。その結果を第３表に示した。

以下余白 第３表 （４）ウィルス攻撃試験 前記（２）で述べた方法に準じて２回免疫したモルモッ
トを２回目免疫から２週間後（初回免疫から３週日）に
、約１０ＬＤｓｓ１０．２ｍｌの狂犬病ウィルスＣｖＳ
株を口筋内に接種（攻撃）した、対照群に対しても同様
に攻撃を行った。攻撃後２週問症状の有無を観察し、無
症状に経過したものを感染防御能陽性モルモットとした
。その結果を第４表に示した。

第４表 その結果において本発明の狂犬病Ｇ蛋白質を免疫した群
では１匹（第３表のＮｏ、６）を除くすべてのモルモッ
トが無症状の経過を示したが、一方の非免疫対照群はす
べてのモルモットが狂犬病特有の症状を呈して死亡した
０以上の成績より、本発明のＧ蛋白質が狂犬病のワクチ
ンとして非常に有効であることが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明者らによりクローニングされた狂犬病
Ｇ蛋白をコードする構造遺伝子およびその側配列からな
る遺伝子配列およびこれから推測されるアミノ酸配列を
示したものである。 第２図は、本発明の狂犬病Ｇ−ｃＤＮＡの調整において
アデニンクラスターの除去を示したものである。 第３図は、ＣＯ５纏胞細胞宿主とした発現ベクターｐｓ
ＶＬ−Ｎ９１３（０１１図を示？。 第４図は、ＣＯ８細胞内で発現された狂犬病Ｇ蛋白を蛍
光反応で示したＣ　、ＯＳ細胞の形態学的変化を示す写
真である。 第５図は、酵母用発現ベクターｐＡＭＮ９１３の構築図
を示す。 ＧＴＧ、ＴＣＡ、ＧＴＣ，ＡＣＣ，ＴＣＣ，ＣＡＡ、Ａ
ＧＣ，ＧＧＧ、ＡＡＡ、’］Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｖａｌ−
Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｇｉｎ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉ
ＧＧＴ、ＧＡＧ、ＡＣＴ、ＧＧＡ、ＣＴＧ、ＴＧＡ、Ａ
ＧＡ、ＴＴＴ、ＧＴＣ，ノＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｅｕ−＊ネ＊ＴＴＣ，ＣＣＴ、ＣＴＡ、ＡＧＣ
，ＴＧＧ、ＧＧＧ、ＧＡＡ、ＴＣＴ、ＣＴＧ、ｒＧＧＧ
、ＴＧＧ、ＡＴＴ、ＣＡＡ、ＡＡＧ、ＴＣＡ、ＴＧＡ、
ＧＡＣ，ＴＴＴ、（ＧＴＡ、ＧＡＴ、ＴＣＴ、ＣＡＴ、
ＡＡＴ、ＴＣＧ、ＧＧＡ、ＡＡＴ、ＣＴＴ、（ＣＣＣ，
ＣＡＧ、ＧＡＡ、ＣＴＧ、ＡＴＧ、ＴＣＡ、ＡＡＧ、Ｇ
ＴＴ、ＧＴＴ、（ＣＧＴ、ＧＧＧ、ＣＣＣ，ＧＧＡ、Ｃ
ＡＧ、ＡＧＧ、ＴＣＡ、ＴＡＧ、ＴＡＣ，ＩＧＡＧ、Ａ
ＡＡ、ＡＧＴ、ＡＡＴ、ＣＴＧ、ＣＣＴ、ＣＣＣ，ＡＴ
Ｇ、ＡＡＧ、ＩＴＣＡ、ＧＣＧ、ＡＡＧ、ＴＧＴ、ＧＣ
Ａ、ＴＡＡ、ＴＴＡ、ＴＡＡ、ＡＧＧ、ＩＡＡＡ、ＡＡ
Ａ、ＡＡＡ、ＡＡＡ、ＡＡＡ、ＡＡＡ、ＡＡＡ。 ｒＴＣ，ＡＴＡ、ＣＣＴ、ＴＣＡ、ＴＧＧ、ＧＡＧ、Ｔ
ＣＧ、ＴＡＴ、ＡＡＡ、ＡＧＴ、ＧＧＧ〉ｈｅ−１１ｅ
−Ｐｒｏ−３ｅ　ｒ　−Ｔｒ　ｐ−Ｇ　１　ｕ−３ｅ　
ｒ−Ｔｙ　ｒ−Ｌｙｓ−３ｅ　ｒ−Ｇ　１ｙＬＴＣ，Ｔ
ＴＴ、ＴＣＧ、ＡＣＧ、ＣＴＴ、ＣＡＡ、ＧＴＴ、ＣＴ
Ｇ、ＡＡＧ、ＡＴＡ、ＡＣＣＣＣＴ、ＴＣＡ、ＡＴＡ、
ＧＴＣ，ＣＴＣ，ＣＴＴ、ＧＡＡ、ＣＴＣ，ＣＡＴ、Ｔ
ＣＡ、ＡＣＡＣＡＴ、ＴＡＡ、ＴＣＡ、ＴＣＴ、ＣＡＧ
、ＴＴＧ、ＡＴＣ，ＡＡＡ、ＣＡＡ、ＧＧＴ、ＣＡＴ：
ＴＡ、　ＧＴＡ、　ＧＴＴ、　ＴＣＡ、　ＧＴＧ、　Ａ
ＣＣ，ＧＡＣ，ＡＧＴ、　ＧＣＴ、　ＴＴＣ，ＡＴＴＴ
ＡＣ，ＧＧＧ、　ＴＣＡ、　ＡＧＡ、　ＧＧＴ、　ＡＴ
Ｔ、　ＴＣＴ、　ＧＡＴ、　ＧＡＣ，ＴＣＣ，ＧＴＧＣ
ＴＣ，ＣＯｘ、　ＴＧＡ、　ＴＡＧ、　ＣＧＧ、　ＡＣ
Ｔ、　ＣＡＧ、　ＣＡＴ、　ＧＡＧ、　ＴＣＧ、　ＡＴ
ＴＧＡＣ，ＡＣＣ，ＧＧＣ，ＡＡＴ、ＡＡＣ，ＴＣＡ、
ＣＡＡ、ＴＣＡ、ＴＣＴ、ＴＧＣ，ＡＴＣＧＧＣ，ＴＡ
Ｇ、　ＡＴＣ，ＡＴＣ，ＴＡＡ、　ＧＣＴ、　ＴＴＴ、
　ＣＡＧ、　ＴＴＧ、　ＡＧＡ、　ＡＡＡ手続補正書（
方式） 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １、　事件の表示 昭和６２年　特許願　第３３０８９６号２、　発明の名
称 狂犬病ウィルス糖蛋白質をコードする遺伝子断片および
これを用いた狂犬病ウィルス糖蛋白備の製法３、　補正
をする者 事件との関係　特許出願人 カ　カ゛クオヨヒ゛クフ　七イ　リ冒り本つ　クン　キ
エクシ曹名称　財団法人化学及血清療法研究所 ノ　　　ナカ　　　サネ　　オ 代表者　野中實男 ４、代理人 住所　　熊本県熊本市清水町大窪６６８番地財団法人　
化学及血清療法研究所内 〒８６０　　　電話　０９６（３４４）１２１１６、　
補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄、および図面（第４図） ７、　補正の内容 （１）明細書第４７頁８〜ｌＯ行目、図面の簡単な説明
の欄における第４図の説明を、次のように補正する。 ［第４図は、ＣｏＳ細胞内で発現された狂犬病Ｇ蛋白を
蛍光反応で示したＣＯ８細胞（生物）の形態を示す蛍光
顕微鏡写真（２００倍）である、」 （２）第４図を別紙のとうり補正する。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）狂犬病ウィルスの糖蛋白質をコードする下記の塩
   基配列、もしくはこれと等価の塩基配列の全部、または
   その一部を含む遺伝子断片。 【遺伝子配列があります】
2. （２）該遺伝子断片が、上記の遺伝子配列の５８番目の
   アデニンから１５７５番目のアデニンまでの塩基配列を
   含む遺伝子である前記第（１）項記載の遺伝子断片。
3. （３）前記第（１）項に記載の遺伝子断片を真核細胞内
   で発現させることにより得られた組換え狂犬病ウィルス
   糖蛋白質。
4. （４）真核細胞内で機能することが可能なプロモーター
   下流に、前記第（１）項に記載の遺伝子断片を組込んだ
   シャトル‐べクターを真核細胞中に導入し、この形質転
   換細胞を培養することにより狂犬病ウィルス糖蛋白質を
   該細胞の細胞質内に産生させることを特徴とする狂犬病
   ウィルス糖蛋白質の製法。