BE905815A

BE905815A - Flavivirus antigeen.

Info

Publication number: BE905815A
Application number: BE2/61092A
Authority: BE
Original assignee: Univ Osaka Res Found
Priority date: 1986-06-05
Filing date: 1986-11-26
Publication date: 1987-03-16
Also published as: GB2191201A; FR2599626B1; CA1270780A; US4810492A; JPS62286930A; DE3641040A1; GB2191201B; NL189207C; FR2599626A1; IT1198289B; JPH0768267B2; DE3641040C2; NL8603017A; NL189207B; GB8628072D0; IT8622505A0

Abstract

Antigen,dat gemakkelijk en veilig tegen lage kosten kan worden geproduceerd door middel van recombinant DNA- techniek,dat geschikt is voor toepassing als vaccin en diagnosticum voor Japanse encefalitis en dat ten minste een gedeelte van een aminozuursequentie van het antigen van een flavivirus omvat,welk gedeelte ten minste één van de epitopen van het flavivirus antigen bevat.

Description

BESCHRIJVING behorende bij een
UITVINDINGSOCTROOIAANVRAGE ten name van : The Research Foundation for Microbial
Diseases of Osaka University, gevestigd te :
Suita, Japan, voor
Flavivirus antigeen
EMI1.1
- ---- Onder inroeping van het recht van voorrang op grond van octrooiaanvrage Nr. 61-131208, ingediend in Japan d. d.

5 juni 1986

De uitvinding heeft betrekking op een flavivirus antigeen. De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op een antigeen, dat ten minste één epitoop bevat, dat reactief is met een anti-flavivirus antilichaam. Het antigeen volgens de uitvinding heeft een hoge zuiverheid en kan worden gebruikt als vaccin voor Japanse encephalitis. Het antigeen volgens de uitvinding kan op veilige wijze op grote schaal en tegen geringe kosten worden geproduceerd. Verder kan het antigeen volgens de uitvinding door zijn hoge specifieke antigene werking met voordeel worden gebruikt als diagnostisch reagens voor antiflavivirus antilichamen, en ook voor de bereiding van antiflavivirus antilichamen.

Japanse encephalitis (verder dikwijls aangeduid als JE) is een besmettelijke ziekte veroorzaakt door infectie van het JE-virus ; de sterfte als gevolg van deze ziekte is hoog en de ziekte heeft ernstige gevolgen. In Japan is het aantal patienten, dat aan JE lijdt, in de afgelopen jaren aanmerkelijk gedaald. Niettemin heerst de ziekte soms in oostelijke, zuidoostelijke en zuidelijke Aziatische landen.

Dit veroorzaakt een sociaal probleem, dat niet beperkt is tot gebieden, waar de ziekte heerst, maar ontwikkelt zich momenteel tot een internationaal probleem, omdat er veel bezoeken tussen de landen worden uitgewisseld. Het JE-virus behoort tot het genus Flavivirus van de familie Togaviridae.

Volgens virus taxonomy behoren ongeveer 50 virussen, waaronder het JE-virus, tot het genus Flavivirus. De virussen, behorende tot het genus Flavivirus, worden eenvoudig flavivirussen genoemd. Tot nu toe werden diverse onderzoeken verricht met betrekking tot verscheidene flavivirussen, namelijk JE virus, gele koorts virus, West Nijl virus, knokkelkoort virus en dergelijke.

Het is bekend, dat de structuur van een flavivirusdeeltje drie typen van structurele proteïnen bevat, namelijk een glycoproteine E (soms aangeduid als V3 antigeen met een molecuulgewicht van ongeveer 53.000) dat het overwegende gedeelte van de omhulling van het flavivirusdeeltje vormt ; een klein proteine M (soms aangeduid als V1 antigeen met een molecuulgewicht van ongeveer 8700) dat in

een omhulling aanwezig is ; en een proteine C (soms aangeduid als V2 antigeen met een molecuulgewicht van ongeveer 13. 500) dat het nucleocapside van het flavivirusdeeltje uitmaakt. In het flavivirus deeltje bevindt zich een viraal genome, dat enkelvoudig gewikkeld RNA met een molecuulgewicht van ongeveer 3,8 x l06 tot ongeveer 4,2 x l06 omvat.

Het virale genome bevat genen, die gecodeerd zijn voor respectievelijk de bovengenoemde drie typen van structurele proteinen. Van de genoemde drie typen van proteinen speelt het proteine E (verder aan te duiden als"V3 antigeen") een belangrijke rol in de eerste fase van virus infectie. Het valt daarom te verwachten, dat het V3 antigeen kan worden gebruikt voor de preventie of diagnose van de infectie van het virus. Er zijn diverse onderzoekingen met betrekking tot het V3 antigeen verricht. Zo zijn bijvoorbeeld de activiteit van het V3 antigeen-neutraliserende antiserum en de hemagglutinerende activiteit, geinfecteerde cellen samensmeltende activiteit, hemolytische activiteit enz. van het V3 antigeen bepaald. Er is literatuur, waaruit blijkt dat ten minste negen epitopen in het V3 antigeen aanwezig zijn.

Ook is bekend dat de flavivirussen van verschillende species antigenen hebben, die met elkaar nauw verwant zijn of sterk op elkaar gelijken.

Conventioneel wordt het V3 antigeen van JE virus als volgt bereid. Met behulp van muizehersens of van een dier afkomstige somatische cellen als gastheer cultuur voor kweken van het virus worden pathogene entvirussen gekweekt, waarna alle virusdeeltjes uit de kweek worden afgescheiden. Vervolgens worden alle virusdeeltjes door een fysico-chemische behandeling gekliefd ter verkrijging van een mengsel van V1, V2 en V3 antigenen, virus RNA en dergelijke, gevolgd door isolering en zuivering van het V3 antigeen. Een dergelijke conventionele werkwijze heeft de volgende nadelen.

(1) De waarschijnlijkheid van biologische risico's

is groot wegens het directe hanteren van pathogene virussen.

(2) De produktiekosten zijn hoog omdat de grondstoffen, bereidingsprocessen en apparatuur zeer gecompliceerd zijn.

(3) Zeer zuiver V3 antigeen is uiterst moeilijk te verkrijgen wegens de grote kans op verontreiniging van het V3 antigeen met onzuiverheden, afkomstig uit de cultuur gastheer en het kweekmedium.

De uitvinders hebben een uitvoerig en intensief onderzoek verricht ter oplossing van de genoemde problemen.

Als resultaat daarvan zijn zij er in geslaagd een cDNA te klonen dat codeert voor de V3 antigeen van JE virus, dat een belangrijke rol speelt in de infectie van JE virus, en de base sequens te bepalen van het cDNA, dat codeert voor het V3 antigeen van het JE virus. Verder werd onverwacht gevonden, dat wanneer het cDNA wordt onderworpen aan expressie door de recombinant DNA techniek, een proteine (verder aan te duiden als"V-proteine") met een aminozuur sequens, overeenkomende met het V3 antigeen van JE virus en met dezelfde antigeniciteit als die van het JE virus veilig en stabiel op grote schaal kan worden verkregen. Op basis van de genoemde ontdekkingen werd de uitvinding voltooid.

Een doel van de uitvinding is het verschaffen van een nieuw flavivirus antigeen, dat uitermate effectief is als JE vaccin en veilig op grote schaal en tegen lage kosten kan worden geproduceerd.

Dit doel en andere doeleinden, aspecten en voordelen van de uitvinding worden in het hiernavolgende toegelicht aan de hand van de tekening, waarin :
Figuren 1a tot 1i de base sequenties coderend voor V3 proteinen van JE virus, gele koorts virus en West Nijl virus en de aminozuur-sequenties van V3 pro- teinen van de genoemde virussen tonen ; figuren 2a tot 2f de base sequentie coderend voor

V3 proteine van JE virus (verder dikwijls aangeduid als "JEV3 proteine") (bovenste rij) en de aminozuur sequentie van JEV3 proteïne (onderste rij) tonen ; fig. 3 een stroomschema toont van de constructie pS22XS uit pS22 ; fig. 4 een stroomschema toont van de constructie van pJMl05 ; fig. 5 de structuren van diverse gereconstrueerde plasmiden van pJEV3 en een structuur van pJM105 toont ;

en fig. 6 een weergave is van de resultaten van de elektroforese voor de identificatie van V3 proteïne van JE virus.

In figuren la tot 1i zijn de sequenties in de volgende volgorde vanaf de bovenste rij tot de onderste rij gerangschikt : (1) base sequentie coderend voor V3 proteïne van JE virus (2) aminozuur sequentie van V3 proteine van JE virus, afgeleid uit de base sequentie (1) (3) bas e sequentie coderend voor V3 proteine van West Nijl virus (4) aminozuur sequentie van V3 proteïne van West Nijl virus, afgeleid uit de base sequentie (3) (5) base sequentie coderend voor V3 proteine van gele koorts virus (6) aminozuur sequentie van V3 proteine van gele koorts virus, afgeleid uit de base sequentie (5).

Verder betekent in figuren la tot 1i het symbool dat dit gedeelte in de base sequentie of aminozuur sequentie hetzelfde codon of aminozuur is als dat van de base sequentie of aminozuur sequentie van JEV3 proteine in het corresponderende gedeelte ; het symbool"---" betekent dat dit gedeelte in de base sequentie of aminozuur sequentie ontbreekt, zodat twee codons of aminozuren, die dit symbool aan beide zijden begrenzen, direct verbonden zijn.

De uitvinding verschaft een antigeen, omvattende ten minste een gedeelte van een aminozuur sequentie, voorgesteld door de volgende formule (1) :
Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp
Phe Ile Glu Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp
Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys
Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr
Leu Asp Val Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala
Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys
Tyr His Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr
Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala
His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr
Val Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly
Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys
Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser
Cys Thr Ser Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile
Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Gly
Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu
Asn His Gly Asn Tyr Ser Ala Gln Val Gly
Ala Ser Gln Ala Ala Lys Phe Thr Ile Thr
Pro Asn Ala Pro Ser Ile

Thr Leu Gly Leu
Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr Leu Asp Cys
Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala
Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser 5 Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His Asp
Leu Ala Leu Pro Trp Thr Ser Pro Ser Ser
Thr Ala Cys Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met

Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly Bis Leu Lys Cys Arg Met Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Leu Leu Val Glu Met

Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Asp Lys Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala .....

(1)

waarin Ala staat voor een alaninerest, Arg voor een argininerest, Asn voor een asparaginerest, Asp voor een aspartinezuurrest, Cys voor een cysteinerest, Gln voor een glutaminerest, Glu voor een glutaminezuurrest, Gly voor een glycinerest, His voor een histidinerest, Ile voor een isoleucinerest, Lys voor een lysinerest, Leu voor een leucinerest, Met voor een methioninerest, Phe voor een fenylalaninerest, Pro voor een prolinerest, Ser voor een serinerest, Thr voor een threoninerest, Trp voor een tryptofaanrest, Tyr voor een tyrosinerest, en Val voor een valinerest, welk gedeelte tenminste een epitoop bevat, dat reactief is met een anti-flavivirus antilichaam.

Verder verschaft de uitvinding een deoxyribo- nucleinezuur, omvattende een base sequentie coderend voor een antigeen omvattende tenminste een gedeelte van een aminozuur sequentie, voorgesteld door formule (1), welk gedeelte ten minste één epitoop bevat, dat reactief is met een anti-flavivirus antilichaam.

De uitvinding verschaft tevens een werkwijze ter bereiding van een antigeen, dat tenminste een gedeelte van een aminozuur sequentie bevat, voorgesteld door formule (1), welk gedeelte ten minste een epitoop bevat, dat reactief is met een anti-flavivirus antilichaam, welke werkwijze omvat : (a) ligatering van een deoxyribonucleinezuur, dat een base sequentie omvat coderend voor het antigeen, aan een repliceerbare expressie-vector ter verkrijging van een repliceerbaar recombinant DNA, omvattende het deoxyribonucleinezuur en de repliceerbare expressie-vector ; (b) transformering van cellen van een microörganisme of celcultuur met het repliceerbare recombinant DNA onder vorming van transformanten ;

(c) selectie van de transformanten uit moedercellen van het micro-organisme of de celcultuur, (d) incubatie van de transformanten om expressie van het deoxyribonucleinezuur en vorming van een antigeen

door de transformanten te veroorzaken en (e) isolatie van het antigeen uit de geincubeerde transformanten.

Het antigeen volgens de uitvinding omvat ten minste een gedeelte van een aminozuur sequentie, weergegeven door formule (1). De aminozuur sequentie van formule (1) komt overeen met de volledige aminozuursequentie van het V3 antigeen van JE virus. Het onderhavige antigeen kan de gehele aminozuur sequentie met formule (t) omvatten. Het antigeen met de gehele aminozuur sequentie van formule (1) wordt verder aangeduid als JEV3 proteine. Ook kan het onderhavige antigeen een gedeelte van de aminozuur sequentie met formule (1) omvatten, voor zover dat gedeelte ten minste één epitoop bevat, dat reactief is met een anti-flavivirus antilichaam.

Het"epitoop"is een antigene determinant waarmee een structuur in een antigeen wordt bedoeld, die de specificiteit van antigeen-antilichaam reactie bepaalt.

Als het gedeelte van de aminozuur sequentie met formule (1) kan bijvoorbeeld worden genoemd een gedeelte, overeenkomend met de aminozuur sequentie vanaf het 45e-tot het 159e aminozuur, geteld vanaf de eindstandige N van de aminozuur sequentie met formule (1), een gedeelte overeenkomend met de aminozuur sequentie vanaf het 375e tot het 456e aminozuur, geteld vanaf de eindstandige N van de aminozuur sequentie van de formule (1), enz.

Het antigeen volgens de uitvinding met de aminozuur sequentie met formule (1) (d. w. z. JEV3 proteïne) kan worden bereid door een werkwijze, die de onderstaand genoemde trappen (1) tot (9) omvat.

In trap (1) wordt een genomisch RNA geëxtraheerd uit JE virus. In deze trap kunnen conventionele technieken worden toegepast, zoals fenolextractie en dergelijke.

In trap (2) wordt een dubbel gevlochten cDNA, complementair met het in trap (1) verkregen virus RNA, bereid.

In deze trap kan een conventionele methode worden toegepast, waarbij gebruik wordt gemaakt van reverse transcriptase.

In trap (3) wordt het cDNA gekloond en wordt de base sequentie van het gekloonde cDNA bepaald. De vector voor het klonen kan worden gekozen uit de bekende vectors, zoals plasmiden met geschiktheid voor een prokaryotische cel zoals Escherichia coli, Bacillus subtilis en dergelijke en vectors, afgeleid van bacteriofagen zoals fage,
T4 fagefi en dergelijke. Het is in deze trap gewenst, dat een geschikte combinatie van een kloonvector en een gast- heercel wordt gekozen.

In trap (4) wordt een gekloond cDNA, bevattende een gen coderend voor JEV3 proteine (verder aangeduid als "JEV3 gen") geïdentificeerd.

Gewoonlijk hebben structurele genen, afgeleid van cellen, een specifieke base sequentie in het gebied van de initiering en beeindiging van translatie, en de regulator genen zijn analoog van structuur. Het is daarom betrekkelijk gemakkelijk de gebieden van dergelijke structurele genen te ontdekken en te identificeren. Anderzijds zijn in het geval van JEV3 gen door het ontbreken van de gebieden van de initiering en beèindiging van translatie en van de regulatorgenen geen specifieke base-sequenties bruikbaar als index, zodat de detectie en identificatie van de gebieden van JEV3 gen uiterst moeilijk zijn. Deze moeilijkheid is echter door de uitvinders overwonnen.

Door analyse van de base-sequentie van het gekloonde cDNA, expressie van het gekloonde cDNA en immunologische detectie en identificatie van het door expressie verkregen produkt, gevolgd door vergelijking van de base sequentie van het gekloonde cDNA met de reeds bekende aminozuursequentie van V3 proteine en base sequentie van genen met betrekking tot V3-genen van het gele koorts virus en het West Nijl virus, ter bepaling van de base sequentie van het cDNA van JEV3 gen.

Als resultaat werd gevonden dat het JEV3 gen een base sequentie met de volgende formule (2) bezit :

TTT AAT TGT CTG GGA ATG GGC AAT CGT GAC TTC ATA GAA GGA GCC AGT GGA GCC ACT TGG GTG GAC TTG GTG CTA GAA GGA GAT AGC TGC TTG ACA ATC ATG GCA AAC GAC AAA CCA ACA TTG GAC GTC CGC ATG ATT AAC ATC GAA GCT AGC CAA CTT GCT GAG GTC AGA AGT TAC TGC TAT CAT GCT TCA GTC ACT GAC ATC TCG ACG GTG GCT CGG TGC CCC ACG ACT GGA GAA GCT CAC AAC GAG AAG CGA GCT GAT AGT AGC TAT GTG TGC AAA CAA GGC TTC ACT GAT CGT GGG TGG GGC AAC GGA TGT GGA CTT TTC GGG AAG GGA AGC ATT GAC ACA TGT GCA AAA TTC TCC TGC ACC AGC AAA GCG ATT GGA AGA ACA ATC CAG CCA GAA AAC ATC AAA TAC GAA GTT GCC ATT TTT GTG CAT GGA ACC ACC ACT TCG GAA AAC CAT GGG AAT TAT TCA GCG CAA GTT GGG GCG TCC CAG GCG GCA AAG TTT ACA ATA ACA CCC AAT CGT CCT TCG ATA ACC CTC GGG

CTT GGT GAC TAC GGA GAA GTC ACG CTG GAC TGT GAG CCA AGG AGT GGA CTG AAC ACT GAA GCG TTT TAC GTC ATG ACC GTG GTG TCA AAG TCA TTT CTG GTC CAT AGG GAA TGG TTT CAT GAC CTC GCT CTC CCC TGG ACG TCC CCT TCG AGC ACA GCG TGC AGA AAC AGA GAA CTC CTC ATG GAA TTT GAA GAG GCG CAC GCC ACA AAA CAG TCC GTT GTT GCT CTT GGG TCA CAG GAA GGA
GGC CTC CAT CAG GCG TTG GCA GGA GCC ATC
GTG GTG GAG TAC TCA AGC TCA GTG AAG TTA

ACA TCA GGC CAC CTG AAA TGT AGG ATG AAA ATG GAC AAA CTG GCT CT-AAA GGC ACA ACC TAT GGC ATG TGT ACA GAA AAA TTC TCG TTC
EMI12.1
GCG AAA AAT CCG GCG GGC CAC GGA ACA GTT GTC ATT GAA CTA TAC TCT GGG AGT GAT GGC CCC TGC AAA ATT CCG ATT GTC TCC GTT GCG AGC CTC AAT GAC ATG ACC CCC GTT GGG CGG CTG GTG ACA GTG AAC CCT TTC GTC GCG ACT TCC AGT GCC AAC TCA AAG CTG CTG GTC GAG ATG GAA CCC CCC TTC GGA GAC TCC TAC ATC GTG GTT GGG AGG GGA GAC AAG CAG ATC AAC CAC

CAT TGG CAC AAA GCT GGA AGC ACG CTA GGC AAG GCC TTT TCA ACA ACT TTG AAG GGA GCT CAA AGA CTG GCA GCG TTG GGC GAC ACA GCC TGG GAC TTT GGC TCC ATT GGA GGG GTC TTC AAC TCC ATA GGA AAA GCC GTT CAC CAA GTG TTT GGT GGT GCC TTC AGA ACA CTC TTT GGG GGA ATG TCT TGG ATC ACA CAA GGG CTA ATG GGT GCC CTA CTA CTC TGG ATG GCC GTC AAC GCA CGA GAC CGA TCA ATT GCT TTG GCC TTC TTA GCC ACA GGA GGT GTG
EMI12.2
CTC GTG TTC TTA GCG ACC AAT GTG CAT GCT ..... C'

waarin A een deoxyadenylinezuurrest, G een deoxyguanilinezuurrest, C een deoxycytidylinezuurrest en T een deoxythymidylinezuurrest voorstellen, en de linker-en rechteruiteinden van formule (-2) resp. de 5'-hydroxylgroepzijde en 3'-hydroxylgroepzijde voorstellen.

In overeenstemming met degeneratie van genetische code, is het mogelijk ten minste één base van de basesequentie van een gen te vervangen door een ander type base, zonder dat de aminozuursequentie van het uit het gen bereide polypeptide wordt veranderd. Vandaar dat de DNA code voor JEV3 proteine een base sequentie kan hebben, die gewijzigd is door substitutie in overeenstemming met degeneratie van genetishe code. In diegeval is de aminozuur sequentie, afgeleid van de base sequentie, die verkregen is door de bovengenoemde substitutie, identiek met de aminozuursequentie met formule (1).

In trap (5) wordt het cDNA van JEV3 gen geligateerd aan een repliceerbare expressie-vector.

In deze trap wordt het cDNA van JEV3 gen bereid uit het gekloonde cDNA, dat verkregen is in trap (4) en geligateerd aan een repliceerbare expressievector onder vorming van een repliceerbaar recombinant DNA. De in deze trap gebruikte repliceerbare expressievector kan worden gekozen uit bekende vectors, zoals expressie plasmiden, expressie'*shuttle"vectors en expressie vectors afgeleid van virussen, zoals vaccinia virus en SV40 die geschiktheid bezitten voor de te gebruiken gastheercellen. Wat de gastheercellen betreft wordt in het volgende een toelichting gegeven.

De ligatering van het cDNA van JEV3 gen aan een repliceerbare expressie-vector kan op gebruikelijke wijze geschieden. Wat de uitvoering van de ligatering betreft wordt opgemerkt, dat daar het cDNA van JEV3 gen geen gebieden voor de initiering en beëindiging van translatie bevat, het cDNA moet worden gesuppleerd door DNA's, die base sequenties bevatten, welke met zulke gebieden overeenkomen.

Verder kan een expressievector, waaraan het cDNA van JEV3 gen moet worden geligateerd, worden gemodificeerd teneinde : (l) de antigeniciteit en immunogeniciteit van een expressie-produkt (JEV3 proteïne) te vergroten ; (2) de stabiliteit van het cDNA van JEV3 gen in een expressievector en in een gastheercel te verhogen ; (3) de opbrengst van het JEV3 proteìne, geproduceerd door gen expressie, te verhogen ; en (4) het JEV3 antigen, geproduceerd door gen expressie in een gastheercel, uit de gastheercel af te scheiden, zodat de extractie en zuivering van het antigen wordt vereenvoudigd.

Verder kan bij de uitvoering van de ligatering van het cDNA van JEV3 gen aan een expressie vector, desgewenst, het cDNA van JEV3 gen via een geschikte koppeling aan de expressievector worden geligateerd.

Het in de trap (4) verkregen gekloonde cDNA bevat soms naastde base sequentie coderend voor JEV3 proteïne, een base sequentie, afgeleid van het andere gen van het JE virus dan het JEV3 gen. In een dergelijk geval kan de andere base sequentie dan die voor codering van JEV3 proteine voor de ligatering uit het cDNA worden verwijderd. Ook kan het cDNA als zodanig worden gebruikt.

In trap (6) wordt het repliceerbare recombinant DNA dat het cDNA van JEV3 gen bevat, overgebracht in een gastheercel ter verkrijging van een transformant.

In deze trap geschiedt de transformatie van een gastheercel met het recombinant DNA op gebruikelijke wijze.

Als voorbeelden van de gastheercellen kunnen worden genoemd prokaryotische cellen zoals Escherichia coli en Bacillus subtilis, en eukaryotische cellen, zoals een gist en een hoger organisme celcultuur.

De transformanten, gevormd door de transformatie, worden gekozen uit moedercellen, die met het recombinant DNA ongetransformeerd blijven, waarbij als kriterium bijvoorbeeld wordt gebruikt een fenotypische eigenschap, zoals

drug resistentie, verleend door de repliceerbare expressievector met een gen voor de fenotypische eigenschap.

In trap (7) wordt de transformant gekweekt onder expressie van het cDNA van JEV3 gen en vorming van het JEV3 proteine.

In trap (8) wordt het onderhavige, door expressie gevormde antigen door gebruikelijke extractie-en zuiveringsmethoden geïsoleerd uit de geincubeerde transformant.

In deze trap kunnen conventionele technieken in combinatie worden toegepast. Zo kunnen bijvoorbeeld technieken zoals filtratie, uitzouten, centrifugeren en kolomchromatografie in combinatie worden toegepast voor de extractie en zuivering van het onderhavige antigen.

Aldus verkrijgt men een flavivirus antigen volgens de uitvinding, dat een aminozuur sequentie bevat, voorgesteld door de formule (1) in nagenoeg zuivere vorm.

In trap (9) worden de antigeniciteit en immunogeniciteit van het onderhavige antigen bepaald.

In deze trap kunnen conventionele technieken in combinatie worden toegepast. Zo kunnen bijvoorbeeld technieken, zoals een enzyme-gebonden immunosorbentbepaling (verder aan te duiden als"ELISA") en neutralisatieproef (50% plaquereductiemethode :"Standard for the biological preparation of medicines", blz. 76, onder supervisie van Pharmaceutical and Supply Bureau, Ministry of Health and Welfare, Japan, en uitgegeven door Association of Bacterial Pharmaceutical Preparation, 10 oktober 1985) in combinatie worden toegepast voor de bepaling van de antigeniciteit en immunogeniciteit.

Zoals hierboven beschreven wordt het JEV3 proteïne bereid door middel van recombinant DNA techniek met behulp van het cDNA van JEV3 gen met de base sequentie, voorgesteld door formule (2-). Bij de bedoelde methode wordt het cDNA van JEV3 gen uit het JE virus verkregen door klonen. Het cDNA van JEV3 gen kan echter ook organisch-chemisch worden gesynthetiseerd met behulp van een in de handel verkrijgbare automatische DNA synthesizer, enz.

In het geval waarin het antigen volgens de uitvinding een gedeelte van het JEV3 proteïne omvat, welk gedeelte ten minste één epitoop bevat, dat reactief is met een anti-flavivirus anlichaam, kan een dergelijk antigeen worden bereid door middel van recombinant DNA techniek op nagenoeg dezelfde wijze als hierboven beschreven voor de trappen (5) tot (8), echter met dit verschil, dat in plaats van het cDNA van JEV3 gen een gedeelte van het cDNA van JEV3 gen, overeenkomend met het bovengenoemde gedeelte van het JEV3 proteïne aan een expressie vector wordt geligateerd. Het gedeelte van het JEV3 gen kan worden bereid door klieven van het cDNA van JEV3 gen, bijvoorbeeld met behulp van een geschikt restrictieenzyme, enz.

Ook kan het gedeelte van het cDNA van JEV3 gen organisch-chemisch worden gesynthetiseerd met behulp van een in de handel verkrijgbare automatische DNA synthesizer.

Zoals reeds vermeld kan het antigeen volgens de uitvinding worden geproduceerd door gen-expressie. Het antigen volgens de uitvinding kan ook worden verkregen in de vorm van een versmolten peptide, dat de aminozuursequentie van het JEV3 proteine of een gedeelte daarvan omvatt
EMI16.1
en daaraan gehecht aan zijn eindstandige C-en/of eindstandige N-de aminozuursequentie van een andere peptide, zoals een van een verbinder afgeleid peptide, van een expressievector afgeleid peptide en/of van het andere structurele proteïne van het flavivirus dan het JEV3 proteine afgeleid peptide. In dit geval kan het versmolten peptide chemisch of enzymatisch worden gekliefd en gescheiden in de aminozuur sequentie van JEV3 proteine of het gedeelte daarvan en de aminozuur sequentie van het andere peptide, dat er aan is gehecht.

Ook kan het versmolten peptide als zodanig als antigen worden gebruikt indien de antigeniciteit en immunogeniciteit niet door de aanwezigheid van het andere peptide dan hJEV3 proteine worden beinvloed.

Het antigen volgens de uitvinding kan ook organo-chemisch worden gesynthetiseerd met behulp van een in de handel verkrijgbare automatische peptide synthesizer, enz.

EMI17.1
1 Verder kunnen de herconstructie en modificatie van elke epitoop van het antigen volgens de uitvinding gemakkelijk tot stand worden gebracht volgens bekende gebruikelijke methoden van de eiwittechniek.

Het antigen volgens de uitvinding kan worden gebruikt als een actief bestanddeel van flavivirus vaccins, in het bijzonder JE vaccin.

Het vaccin kan worden bereid door toevoeging van het antigen volgens de uitvinding aan een gesteriliseerde isotonische oplossing zoals een fysiologische zout-of fosfaatbuffer. In dit geval verdient het de voorkeur dat een pepton, aminozuur, saccharide of dergelijke als katalysator in het vaccin wordt opgenomen. Het aldus verkregen vaccin is in vloeibare toestand. Het vaccin kan ook worden omgezet in een geprecipiteerd vaccin door toevoeging van een hulpstof ter versterking van de immunogeniciteit, of ineen gelyofiliseerd vaccin dat zeer stabiel en gemakkelijk transporteerbaar is. Verder kan de immunogeniciteit van het antigen volgens de uitvinding worden versterkt door introductie van een saccharideketen in het antigen door middel van de moleculaire fusietechniek of door modificatie in de cel na de translatie.

Het vaccin, dat het onderhavige antigen bevat, kan in het algemeen worden toegediend in de vorm van een vloeistof of suspensie. Indien het vaccin een gelyofiliseerd vaccin is, wordt het vaccin voor de toediening opgelost of gesuspendeerd in de hierboven genoemde gesteriliseerde isotonische oplossing. De concentratie van het onderhavige antigen in het vaccin voor toediening kan in het algemeen ongeveer 0,001 tot 1000 microgram/ml bedragen. In het algemeen kan het vaccin subcutaan of intramusculair worden toegediend. De dosis van het vaccin voor een volwassene is in het algemeen gelegen tussen 0,1 en 2,0 ml. Voor kinderen kan de dosis in het algemeen de helft zijn van die voor volwassenen.

Het vaccin kan in het algemeen tweemaal worden toegediend met een interval van ongeveer 1 week tot 1 maand en dan

ongeveer l jaar later nogmaals worden toegediend.

Verder kan het antigeen volgens de uitvinding worden gebruikt als immunologisch diagnosticum voor het constateren van infectie van JE virus. Het onderhavige antigen kan ook worden gebruikt als immunologisch diagnosticum voor het constateren van infectie van andere flavivirussen dan JE virus, waarvan de antigeniciteit nauw verwant is met of soortgelijk aan die van het antigen volgens de uitvinding. Zo is bijvoorbeeld het antigen volgens de uitvinding geschikt voor toepassing in ELISA, de hemagcjlutinatie- proef, passieve hemagglutinatieproef, complement fixatieproef en andere diverse proeven, waarin een antigen of antilichaam, resp. gemerkt meteen fluorescerend pigment, een enzyme een radiolsotoop en dergelijke wordt gebruikt.

Het antigen volgens de uitvinding kan worden gebruikt voor het ontdekken en identificeren van een flavivirus antilichaam volgens een der bovengenoemde testmethoden.

Het antigen volgens de uitvinding kan ook worden gebruikt voor de bereiding van een antilichaam tegen het onderhavige antigen. Het aldus geproduceerde antilichaam kan met voordeel worden gebruikt voor de detectie en identificatie van een flavivirus antigen volgens de bovengenoemde testmethoden. De produktie van een dergelijk antilichaam kan geschieden volgens een methode, waarbij het antigen volgens de uitvinding wordt geïnjecteerd in een laboratoriumproefdier waardoor het dier een antilichaam produceert, waarna het bloed of de lichaamsvloeistof van het dier wordt verzameld. Het antilichaam kan ook worden geproduceerd door middel van een gebruikelijke celfusietechniek. Wanneer het antilichaam volgens de eerstgenoemde methode wordt geproduceerd, wordt een polyklonaal antilichaam verkregen.

Wordt echter het antilichaam geproduceerd volgens de laatstgenoemde methode, dan wordt een monoklonaal antilichaam verkregen.

Ook kan het antigen volgens de uitvinding of het

antilichaam tegen het onderhavige antigen worden gebruikt als bioseparator, bioreactor en biosensor onder toepassing van de antigen-antilichaamreactie. In dit geval kan het antigen volgens de uitvinding of het antilichaam tegen het onderhavige antigen op de gebruikelijke wijze worden gehecht aan een substraat of drager. Afhankelijk van het doel kan het antigen volgens de uitvinding of het antilichaam tegen het onderhavige antigen op gebruikelijke wijze worden gemerkt met een fluorescerend pigment, een enzyme, een radiolsotoop of dergelijke.

Het antigen volgens de uitvinding heeft de volgende voordelen.

De moleculaire structuur van het onderhavige antigen is duidelijk. Het is daardoor mogelijk door toepassing van het onderhavige antigen zeer effectieve, zeer veilige, uniforme biologische preparaten en zeer specifieke, zeer effectieve diagnostica te verkrijgen. Verder wordt het onderhavige antigen niet geproduceerd door infectie van een dier met een virus, maar door gen expressie van het DNA coderend voor het onderhavige antigen in een gastheercel. Daardoor wordt de mogelijkheid van biologische risico's tijdens de trappen van de bereiding van het onderhavige antigen nagenoeg geëlimineerd. Ook kunnen de produktiekosten worden verminderd. Daar verder alle materialen van het incubatiesysteem, bijvoorbeeld het medium, qua samenstelling en structuur bekend zijn, is de zuivering niet moeilijk en kan een antigen produkt met een grote zuiverheid worden verkregen.

De uitvinding wordt aan de hand van de volgende voorbeelden nader toegelicht.

Voorbeeld I
Trap 1 (extractie van het genomisch RNA van het Japanse encefalitis virus)
JE virus, stam JaOArS982 werd gedurende 48 uur in een nutrient cultuurmedium bij 280C gekweekt met als cultuurgastheer cellen van een cellenlijn C6/36, afkomstig van Aedes albopictus, een muggesoort (A. Igarashi, J. Gen. Virol. 40 (1973) 531). Vervolgens werd de bovenstaande vloeistof van

het cultuurmedium verzameld. Aan deze bovenstaande vloeistof werden toegevoegd 6 g/dl polyethyleenglycol 6000 en 2,22 g/dl natriumchloride, waarna het verkregen mengsel gedurende 15 minuten werd geroerd. Het mengsel werd gedurende 30 minuten gecentrifugeerd bij 12000 g onder precipitatie van virusdeeltjes. De virusdeeltjes werden verzameld en gesuspendeerd in STE buffer (0,1 M NaCl, 0,01 M tris-HCl en 0, 001 M EDTA, pH 7,6).

De aldus verkregen suspensie werd als laag aangebracht over een l5% ¯sucrose-oplossing in een centrifugebuis en gedurende 120 minuten gecentrifugeerd bij 37000 toeren per minuut ter verkrijging van precipitaten.

De gevormde precipitaten werden opgelost in STE-0, 1% SDS (natriumdodecylsulfaat). Vervolgens werd aan de verkregen oplossing hetzelfde volume met STE verzadigde fenol toegevoegd teneinde het genomische RNA van het virus te extraheren en het verkregen mengsel werd grondig geroerd. De waterige laag van het mengsel werd verwijderd en aan deze waterige laag werd een volume ethanol toegevoegd, dat 2 maal zo groot was als dat van de waterige laag. Men liet het aldus verkregen mengsel gedurende 1 nacht bij-20 C met rust, waarna het mengsel gedurende 30 minuten werd gecentrifugeerd bij 15000 toeren per minuut onder precipitatie van RNA. Het geprecipiteerde RNA werd verzameld en gelyofiliseerd en daarna gesuspendeerd in STE-0,1% SDS.

De verkregen suspensie werd als een laag aangebracht over een sucrose-oplossing in een centrifugebuis, welke sucrose-oplossing 0,01% SDS bevatte en een dichtheidsgradient van 15-30% (gew./gew.) vertoonde en gedurende 180 minuten gecentrifugeerd bij 45000 toeren per minuut. Een fractie met een sedimentatieconstante van 42S werd uit de centrifugebuis verzameld en samengevoegd, en blootgesteld aan precipitatie met behulp van ethanol ter verkrijging van precipitaten. De precipitaten werden gedroogd en opgelost in 50 mM Tris-HCl (pH 7,9) ter verkrijging van een gezuiverde virus RNA-oplossing.

Trap 2 (Bereiding van een dubbelgevlochten cDNA, bevattende een DNA, dat complementair is met het genomische RNA).

Aan 50 microliter van de virus RNA oplossing, bevattende 10 microgram van het genomische RNA, werden toegevoegd 10 mM MgC12, 250 mM NaCl, 2,5 mM MnCl 0, 5 mg/ml runderserum albumine (verder dikwijls aangeduid als"BSA"), 1 mM ATP, 30 eenheden RNase inhibitor en 1 eenheid poly (A) polymerase, en het verkregen mengsel werd gedurende 5 minuten bij 370C geincubeerd. Vervolgens werd het mengsel blootgesteld aan extractie door fenol en precipitatie door ethanol onder precipitatie van RNA, gevolgd door centrifugeren ter verkrijging van precipitaten. De precipitaten werden gedroogd ter verkrijging van een gedroogd RNA.

Vervolgens werd het verkregen RNA opgelost in 50 microliter van een oplossing) bevattende 0,1 M KC1, 10 mM MgC12'10 mM DTT, 1 mM dNTP, 20 microgram oligo (dT) 12-18' 50 mM Tris-HCl (pH 7,9) en 30 eenheden reverse transcriptase, waarna het verkregen mengsel gedurende 60 minuten werd blootgesteld aan incubatie
EMI21.1
bij 420C. Aan het mengsel werd toegevoegd 150 microliter van een enzym-oplossing, bevattende 0, 1 mM MgSO, 5 mg/ml BSA, 1 mM dNTP, 100 micro M NAD, 0,5 M Tris-HCl (pH 7,9), 25 eenheden RNase. H, 1 eenheid DNA ligase en 20 eenheden DNA polymerase I onder vorming van een mengsel van 200 microliter.

Het mengsel werd gedurende 2 uur bij 150C blootgesteld aan incubatie. Het verkregen reactiemengsel werd blootgesteld aan extractie door fenol en precipitatie door ethanol ter verkrijging van precipitaten. De precipitaten werden opgelost in 100 microliter van een waterige oplossing, bevattende 10 mM MgC12'50 rnM NaCl, 0,1 mg/ml BSA, 1 mM DTT, 1 mM dNTP en 50 mM Tris-HCl (pH 7, 9). Aan de verkregen oplossing werden 2 eenheden T4DNA polymerase toegevoegd en het verkregen mengsel werd gedurende 10 minuten bij 370C geincubeerd. Na de incubatie werd het mengsel blootgesteld aan extractie door fenol en precipitatie door ethanol ter verkrijging van een dubbelgewikkeld cDNA dat een DNA bevatte, dat complementair is met het virale genomische RNA.

Trap 3 (klonen van het cDNA en bepaling van de base sequentie daarvan).

Het in trad-2 verkregen dubbel gewikkelde cDNA werd opgelost in een waterige oplossing, bevattende 60 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM Iv1gC12'10 mM DTT en 1 mN ATP. Aan de aldus verkregen oplossing werden toegevoegd een BamHI verbinder en T4DNA ligase, gevolgd door incubatie bij 40C gedurende 16 uur ter bevordering van een ligatiereactie van het cDNA met de verbinuer. Daarna werd de onomgezet gebleven BamHI verbinder verwijderd door gelfiltratie met behulp van CL-4B gel, dat in evenwicht was gebracht met TEN50 buffer, bestaande uit 10 1 Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl en 1 mM EDTA.

Vervolgens werd de in overmaat aan het cDNA geligateerde verbinder verwijderd door digerering van de verbinder met BamHI en uitvoering van een gelfiltratie met behulp van CL-4B gel. Aldus werd een dubbel gewikkeld cDNA bereid, aan beide uiteinden waarvan BamHI verbinder was geligateerd. Het aldus verkregen cDNA werd gestoken in de BamHI plaats van een kloonvector pUC13 (vervaardigd en in de handel gebracht door Pharmacia Fine Chemicals AB, Sweden). Toelichtenderwijze gesteld werd pUC13 gekliefd door BamHI. Het cDNA, aan beide uiteinden waarvan een BamHI verbinder was geligateerd, werd toegevoegd aan het gekliefde pUC13 en het verkregen mengsel werd gedurende 16 uur in tegenwoordigheid van T4DNA ligase bij 40C tot reactie gebracht onder ligatering van het cDNA met de vector pUC13.

Vervolgens werd het resulterende ligateringsprodukt, d. w. z. recombinant DNA, overgebracht in een cel van Escherichia coli stam DH1 (ATCC No. 33849) ter verkrijging van een transformant. Vervolgens werdeicDNA fragmenten met diverse lengten als volgt uit het cDNA bereid. Eerst werd het cDNA bereid uit áe bovengenoemde transformant en opgelost in 100 microliter van een Bal31 buffer, bestaande
EMI22.1
uit 50 mM Tris-HCl (pH 8, 0), 12 mM CaC12, mM MgC12 en 400 mM NaCl. Aan de verkregen oplossing werden 2 eenheden exonuclease Bal31 toegevoegd, gevolgd door incubatie bij 20 C.

Na verloop van 3,6, 10 en 15 minuten na de incubatie werd 20 microliter van het reactiemengsel verzameld en onderworpen aan extractie door fenol en precipitatie door ethanol ter

verkrijging van cDNA-fragmenten. Vervolgens werden de cDNAfragmenten opgelost in een T4DNA polymerasebuffer, bevattende 70 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC12'5 mM dithiothreitol en 200 microM dNTP, en werd aan de verkregen oplossing T4 DNA polymerase toegevoegd. Het verkregen mengsel werd gedurende 30 minuten bij 370C geincubeerd ter omzetting van beide uiteinden van elk van de cDNA-fragmenten in stompe uiteinden.

Vervolgens werden de cDNA-fragmenten afzonderlijk gestoken in een HincII plaats van kloonvector pUC19 (vervaardigd en in de handel gebracht door Pharmacia Fine Chemicals AB, Zweden ter vorming van recombinantvectors. De recombinantvectors werden afzonderlijk overgebracht in E. coli stam JM 83 ter verkrijging van transformanten, die cDNA fragmenten van verschillende afmetingen bevatten. De transformanten werden afzonderlijk gekweekt ter verkrijging van de cDNAfragmentklonen. De base sequenties van de verkregen klonen werden bepaald volgens de dideoxy keten termineringsmethode (F. Sanger, e. a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, M, (1977) 5463 en M. Hattori, e. a., Anal. Biol. 152, (1986) 232).

Gevonden werd dat een van de klonen een cDNA was, bestaande uit ongeveer 4000 base paren (verder aangeduid als"bp"), hetgeen overeen-
EMI23.1
komt met een partiele base sequentie van het genomische RNA van het JE virus, welke partiele base sequentie begint vanaf de plaats ongeveer 2000 bp benedenstrooms van het 5'-uiteinde van het genomische RNA en zich uitstrekkende tot een positie van ongeveer 4000 base paren. Deze kloon werd aangeduid als K68. De kloon 68 bleek een base sequentie te bevatten, overeenkomende met een deel van het V3 gene van JE virus, maar niet een volledige sequentie van het V3 gene.

Vervolgens werd een oligonucleotide (26 mer) met de volgende base sequentie, die complementair is aan een deel van het V3 gene in het genomische RNA van het JE virus en aanwezig in de sequentie van de kloon K68, organo-chemisch gesynthetiseerd : d G T A C G G C T T C C C A C A T T T G G T G C T C C, 2 6 mer

Trap 4 (klonen van kloon S22, bevattende een DNAgebied coderend voor V3 proteine),
Nagenoeg dezelfde procedures als in trap 2, behalve dat het oligonucleotide (26 mer), bereid in trap 3, werd gebruikt als inleiding voor de cDNA synthese werden herhaald ter verkrijging van cDNAs.

De aldus verkregen cDNAs werden afzonderlijk gestoken in een klaring vector pUC13 ter verkrijging van recombinant vectors, waarna de recombinant vectors afzonderlijk werden overgebracht in de bovengenoemde E. coli stam ter vorming van transformanten. Uit elke transformant werd de recombinant vector geïsoleerd volgens een akali-extractiemethode (Nucleic Acid Res., 2 (6), (1979) 1513- 1523), waarna de base sequentie werd bepaald volgens de in trap 3 beschreven methode.

Gevonden werd dat een van de recombinant vectors een cDNA fragment bevatte met een molecuullengte van ongeveer 2500 bp, welk cDNA-fragment overeenkomt
EMI24.1
met een partiele base sequentie van het genomische RNA van het JE virus, welke partiele sequentie begint vanaf het 5'- uiteinde van het genomische RNA en zich uitstrekt tot een positie van ongeveer 2500 bp. Het cDNA fragment wordt aangeduid als kloon S22. De base sequentie van de kloon S22 en de aminozuur sequentie waarvoor door de base sequentie wordt gecodeerd, werden vergeleken met de base sequenties van het genomische RNA van twee andere flavivirussen dan JE virus, namelijk gele koorts virus en West-Nijl virus, en de aminozuursequentie, waarvoor door het genomische RNA wordt gecodeerd, welke sequenties zijn beschreven in Science, 229, 1985,726 en Virology, 147, (1985) 264.

Gevonden werd dat de kloon S22 het DNA-gebied bevatte, coderend voor V3 proteine van het Japanse encefalitis virus.

De resultaten worden getoond in fig. 2a tot 2f. De recombinant vector, die de kloon S22 droeg werd aangeduid als plasmide pS22 (zie fig. 3). De Escherichia coli, bevattende
EMI24.2
de recombinant vector die de kloon S22 draagt, werd aangeduid als E. coli stam JM83/pS22 en gedeponeerd bij het Fermentation Research Institute onder Accession No. FE1 BP-1074.

Trap 5 (constructie van een expressieplasmide, dat een V3 proteine gene draagt)
Het plasmide pS22, dat de DNA fragment kloon S22 draagt, heeft een MluI plaats bij 49 bp bovenstrooms van het 5'-uiteinde van het V3 proteïne gene en heeft een SphI-plaats bij 7 bp bovenstrooms van het 3'-uiteinde van het gene.

Het plasmide van pS22 werd afgescheiden van E. coli stam JM83/pS22 op nagenoeg dezelfde wijze als beschreven in trap 4 en opgelost in een oplossing, bevattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl en 7 mM MgC12. Aan de aldus verkregen oplossing werden restrictie enzymen MluI en EcoRI toegevoegd,
EMI25.1
gevolgd door incubatie bij 370C gedurende 2 uren ter klieving van twee plaatsen, nl. MluI plaats en de EcoRI-plaats van het plasmide, welke EcoRI plaats zich verder stroomopwaarts van het 5'-uiteinde van het V3 proteine gene bevond dan de MluIplaats. Na de klieving werd het mengsel onderworpen aan extractie door fenol en precipitatie door ethanol ter winning van een DNA.

Het DNA werd opgelost in de bovengenoemde T4DNA polymerase buffer en 30 minuten op 370C verwarmd ter omzetting van beide uiteinden van het DNA in stompe uiteinden. Het verkregen mengsel werd onderworpen aan extractie door fenol en precipitatie door ethanol ter winning van een DNA. Een XhoI verbinder werd geligateerd met elk van beide uiteinden van het DNA op nagenoeg dezelfde wijze als beschreven in trap 3.

E. coli stam JM83 werd met het verbinder geligateerde DNA getransformeerd ter verkrijging van een transformant. Door kweken van de transformant werd het verbinder-geligateerde DNA gekloond. Het gekloonde verbinder-geligateerde DNA werd aangeduid als S22X (zie fig. 3). Het plasmide, dat het S22X droeg, werd aangeduid als plasmide pS22X.

Het plasmide pS22X, dat de kloon S22X droeg werd opgelost in een oplossing, bevattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl en 7 mM MgCl, en gedurende 2 uur bij 370C gedigereerd met restrictie-enzymen SphI en BamHI. Winning van een DNA en omzetting van beide uiteinden van het DNA in stompe uiteinden met behulp van het T4 DNA polymerase geschieden op

nagenoeg dezelfde wijze als hierboven beschreven. Een universele terminator (in de handel gebracht door Pharmacia Fine Chemicals Co., Zweden), werd aan het DNA geligateerd en het terminator geligateerde DNA werd gebruikt voor transformatie van de E. coli stam JM83. Het aldus verkregen DNA werd aangeduid als kloon S22XS (zie fig. 3).

Anderzijds werd als expressie vector gebruik gemaakt van vector YEp133PCT. Deze vector werd als volgt geconstrueerd.

Eerst werd met betrekking tot het plasmide YEp13 (ATCC Accession No. 37115) het LEU2 gen-fragment daarvan, dat verkregen was door klieving met het XhoI en SalI van het plasmide, herligateerd aan het resterende plasmide fragment in omgekeerde richting om de XhoI en SalI plaatsen aan beide uiteinden van het gene-fragment te doen verdwijnen. In de tweede plaats werd het BamHI-SalI fragment, aanwezig in het Tcr gene van het plasmide vervangen door een BamHI-SalI fragment met een lengte van ongeveer 650 bp dat de PH05-promotor bevatte, afgeleid van pPH05 (zie Nucl. Acid Res. 11 (1983) 1657).

In de derde plaats werd het aldus vervangen BamHI-SalI-fragment met behulp van exonuclease Bal31 ontdaan vanaf de SalI plaats daarvan tot het 3'-uiteinde van de daarin aanwezige promotor.

In de vierde plaats werd een XhoI verbinder in de promotor gebracht aan het 3'-uiteinde daarvan ter invoering van een kloon-plaats. In de vijfde plaats werd een DNA-fragment met een lengte van ongeveer 800 bp, bereid door ligatering van XhoI en SalI verbinders op respectievelijk de HindIII en EcoRI plaatsen aan het HindIII-EcoRI fragment, bevattende een TRP1 terminator en een ARS (autonome replicatie sequentie), welk HindIII-EcoRI fragment was verkregen uit YRp7 (ATCC Accession No. 37060) ingebracht in de op de hierboven beschreven wijze bereide kloning vector, waarbij expressie vector YEp133PCT werd verkregen.

Het cDNA van V3 proteïne gene werd ingebracht in de aldus verkregen expressievector. Toelichtenderwijze gesteld werd pS22XS gedigereerd met restrictie enzymen XhoI en SalI, en

het verkregen mengsel werd onderworpen aan agarosegel elektroforese ter winning van een DNA-fragment met een molecuullengte van ongeveer 1600 bp. Het gewonnen DNA-fragment
EMI27.1
werd geligateerd aan de expressie vector YEpl33PCT op de XhoI-plaats daarvan. E. coli stam JM83 werd met het resulterende plasmide getransformeerd onder vorming van een transfor- mant. De transformant werd geïsoleerd en gekweekt in L-medium (1 gew. /vol. % bactotrypton, 0,5 gew. /vol. % gistextract, 0,5 gew. /vol. % natriumchloride, 25 microgram/ml ampicilline, pH 7, 2-7, 4).

Het plasmide werd uit de transformant geëxtraheerd volgens de hierboven genoemde alkali-extractiemethode.

Vervolgens werd de richting, waarin het DNA-fragment, dat het V3 gene bevatte, was geligateerd door het YEp133PCT in het geëxtraheerde plasmide bevestigd door digerering van het plasmide met diverse restrictie-enzymen en onderwerping van het digereringsmengsel aan agarosegel elektroforese. Het plasmide werd aangeduid als plasmide pJEV3 (zie fig. 4). Gist werd met het plasmide getransformeerd en gekweekt. Produktie van het V3 protelne in de geincubeerde gist werd bevestigd volgens de ELISA methode. Er werden diverse proeven uitgevoerd voor de reconstructie van het plasmide pJEV3 ter verhoging van de produktie-efficiency van het V3 proteine. De resultaten worden in fig. 5 getoond. In het bijzonder werd het pJEV3 DNA gedigereerd met restrictie-enzyme XhoI en beide uiteinden van het gedigereerde DNA werden met behulp van T4DNA polymerase omgezet in stompe uiteinden.

Het verkregen DNA werd gedigereerd met restrictie-enzyme BamHI en onderworpen aan agarosegel elektroforese ter winning van een DNA-fragment met een lengte van 13. 000 bp. Dit DNA komt overeen met het pJEV3 zonder het PH05 promotor gebied. Anderzijds werd ter benutting van het translatie-initiëringscodon ATG van het PH05 structurele gene pPH05 gedigereerd met restrictie-enzymen BamHI en DraI, en werd het gedigereerde mengsel onderworpen aan agarosegel elektroforese ter winning van een 550 bp lang DNA-fragment van het PH05 promotorgebied.

Het bovengenoemde DNA fragment met een lengte van 13.000 bp werd aan dit DNA fragment met

een lengte van 550 bp geligateerd. E. coli stam JM83 werd met het geligateerde DNA getransformeerd en gekweekt om het geligateerde DNA te klonen. Het resulterende gekloonde DNA werd aangeduid als plasmide pJM105. Het stroomschema van fig. 4 toont de procedures voor de bereiding van pJM105.

Het gebruik van het aldus gekloonde pJM105-leidt tot de produktie van een polypeptide, bestaande uit 519 aminozuren en met een zodanige aminozuursequentie, dat de volgende aminozuren achtereenvolgens zijn gebonden in de volgorde van : (a) twee aminozuren, nl. Met-Phe-, afgeleid van PH05 ; (b) twee aminozuren, nl.-Ser-Arg-, afgeleid van het gedeelte tussen de PH05 promotor en het onderstaand genoemde cDNA van V1 proteine gene ; (c) 16 aminozuren, nl.-Arg-Val-Val-Phe-Thr-Ile-LeuLeu-Leu-Leu-Val-Ala-Pro-Ala-Tyr-Ser-, afgeleid van het cDNA van V1 proteine gene, dat in het genomische RNA van JE virus stroomopwaarts van het V3 proteine gene is gelegen ;

(d) 498 aminozuren afgeleid van het cDNA van V3 proteine en met een zodanige aminozuur sequentie, dat 2 aminozuren, nl.-His-Ala, zijn verwijderd uit het C-einde van de aminozuursequentie voorgesteld door formule (1) ; en (e) een aminozuur, nl.-Ala, afkomstig van de universele terminator.

Trap 6 (transformatie van gist met het expressie plasmide pJM105 en isolering van de getransformeerde gist).

De gist Sacchoromyces cerevisiae stam SHY4 (ATCC Accession No. 44772) werd met het expressie plasmide pJM105 getransformeerd volgens de alkalikationmethode. Toelichtenderwijze gesteld werd de gist gekweekt in YPD medium (2 gew. /vol. % bactopepton, 1 gew./vel. % gistextract, 2 gew. /vol. % dextrose), waarna 5 ml van de cultuur gedurende 5 minuten werd gecentrifugeerd bij 2500 toeren per minuut om de cellen te oogsten. De cellen werden gesuspendeerd in 5 ml TE buffer (10 mM Tris-HCl
EMI28.1
pH 8, 0, 0, 1 mM EDTA), en gecentrifugeerd om de cellen te oogsten. De cellen werden hersuspendeerd in 0, TE buffer.

Aan 0,5 ml van de suspensie werd 0,5 ml 0,2 M lithiumacetaat toegevoegd, waarna de suspensie gedurende 60 minuten bij 300C werd geincubeerd. Daarna werd 8 microliter van het plasmide

DNA toegevoegd aan 0,1 ml van de cultuur, gevolgd door 30 min incubatie bij 30 C. Aan de resulterende cultuur werd 0,1 ml 70 gew. /vol. % polyethyleenglycol 4000 toegevoegd, gevolgd door 60 min incubatie bij 30 C. Verder werd 2 ml gedestilleerd water aan de cultuur toegevoegd, gevolgd door 5 minuten centrifugeren bij 2500 toeren per minuut voor het oogsten van
EMI29.1
cellen.

De cellen werden opnieuw gesuspendeerd in een kleine SD hoeveelheid water, geënt aan'agarmedium (0,67 gewicht/volume % bactogist stikstofbase aminozuurvrij (in de handel gebracht door Difco Co., USA), 2 gew. /vol. % dextrose, 20 microgram/ml uracil, 20 microgram/ml L-tryptophan, 20 microgram/ml L-histidine, 2 gew. /vol. % agar) dat een selectief medium is, dat geen leucine bevat, en bij 300C geincubeerd. De door incubatie gevormde kolonie werd geïsoleerd ter verkrijging van een getransformeerde gist. De getransformeerde gist werd aangeduid als SHY4/pJM105.

Trap 7 (incubatie van de getransformeerde gist en extractie van het antigen).

De getransformeerde gist SHY4/pJM105 werd geënt aan Burkholder medium (een volkomen synthetisch medium, bevattende 1, 5 g/l monobasisch kaliumfosfaat (zie Am. J. Botany, 30 (1943) 206, en gedurende 24 uur onder schudden bij 300C geincubeerd.

Na de incubatie werd de cultuur 5 minuten gecentrifugeerd bij 2500 toeren per minuut voor het oogsten van cellen.

De cellen werden eenmaal gewassen met gedetineerd water, geënt aan Burkholder medium, dat 1, 5 g/liter kaliumchloride in plaats van het monobasische kaliumfosfaat bevatte, gevolgd door 48 uur incubatie bij 300C onder schudden. Na de incubatie werden de cellen geoogst door centrifugeren, gewassen en opnieuw gesuspendeerd in 0,01 M fosfaatbuffer (pH 9, 0).

Aan de suspensie werden glasparels toegevoegd, waarna de suspensie krachtig werd geschud om de cellen te breken. De verkregen suspensie werd 10 minuten gecentrifugeerd bij 10.000 toeren per minuut, waarna de bovenstaande vloeistof werd afgescheiden. Op deze wijze werd een gistextract verkregen.

Trap 8 (Antigenproduktie-efficiency van de getransformeerde gist).

De kwantitatieve bepaling van het antigen in het gist-

extract geschiedde volgens de ELISA-methode. De ELISA-titer werd bepaald volgens de sandwich-methode met als vangend antilichaam het gezuiverde IgG, verkregen uit het serum van een muis, die met een overmaat Japans encephalitis virus (Nakayama stam) was geïmmuniseerd en als ontdekkend antilichaam het MWPO (mierikswortelperoxydase)-geconjugeerde anti-Japans encefalitis V3 eiwit monoklonale antilichaam (zie J. Virol. 45 (1983) 124). Bij de uitvoering van de bepaling van de ELISAtiter werd de kleurreactie ontwikkeld door o-fenyleendiamine en werd de absorptie bij 420 nm gemeten.

De ELISA-antigen titer van een proefmonster werd bepaald met behulp van een referentie Japansencqalitis virus-antigen R-181 (National Institute of Health, Japan) als standaard van 100 eenheden.

De resultaten zijn vermeld in tabel A. Bevestigd werd dat de getransformeerde gist SHY4/pJM105 het antigen volgens de uitvinding efficient produceerde.

Tabel A
EMI30.1

<tb>
<tb> Incubatie <SEP> Celpopulatie/ml <SEP> Antigen <SEP> volgens <SEP> de
<tb> periode <SEP> (x106) <SEP> uitvinding
<tb> (uur) <SEP> (ELISA <SEP> antigen <SEP> titer)
<tb> 0 <SEP> 6,1 <SEP> 2,4
<tb> 5 <SEP> 16 <SEP> 30
<tb> 10 <SEP> 43 <SEP> 27
<tb> 18 <SEP> 63 <SEP> 37
<tb> 24 <SEP> 71 <SEP> 57
<tb> 30 <SEP> 72 <SEP> 61
<tb> 48 <SEP> 58 <SEP> 81
<tb> R-18l <SEP> 1) <SEP> 100
<tb> 1) <SEP> Referentie <SEP> Japanese <SEP> encephalitis <SEP> antigen
<tb> lot <SEP> 181
<tb>

Trap 9 (Identificatie en molecuulgewichtsbepaling van het antigen, geproduceerd door de getransformeerde gist SHY4/pJM105 volgens de Westerse vloeitechniek)
Het antigenextract van de gist werd gezuiverd door 20 uur centrifugeren op 20-30 gew. /gew. % sucrosegradiënt bij 21000 toeren per minuut.

De fractie, die een gezuiverd antigen volgens de uitvinding bevatte, werd in 1 gew. /vol. % 2-mercaptoethanol/125 mM Tris-HCl (pH 6,8) gebracht, 20 minuten op kamertemperatuur gehouden en onderworpen aan elektroforese op 10% polyacrylamidegel. Het gel werd verwijderd en het proteine op het gel werd afgevloeid op een nitrocellulosemembraan met behulp van de Transblotcel, in de handel gebracht door Bio-RAD Co., U. S. A. De verkregen nitrocellulosefilm werd blootgesteld aan reactie met het bovengenoemde anti-Japans encephalitis virus V3 monoklonaal antilichaam en vervolgens aan reactie met een MWPO-geconjugeerd anti-muis IgG geit IgG.

De kleurreactie werd ontwikkeld door 4-chloorindonaftol. Aldus werd de identificatie van het antigen verricht. Fig. 6 toont de reactie tussen een proteïne met een molecuulgewicht van ongeveer 53 KD (kilodalton) en het anti-V3 monoklonale antilichaam. Daar het molecuulgewicht in overeenstemming is met het berekende uit de base sequentie coderend voor een peptide, dat de aminozuursequentie zoals vermeld in trap 5 bevat, werd het protelne geidentificeerd als een antigen, dat een zodanige aminozuur-sequentie bevat, dat de eerste en tweede aminozuren, geteld vanaf het C-einde van de aminozuursequentie van het V3 protelne zijn verwijderd.

Trap 10 (Immunogeniciteit van het onderhavige antigen, geproduceerd door de getransformeerde gist).

Het in trap 7 verkregen antigen-extract werd 20 uur op 20-50 gew. /gew. % sucrosegradiënt gecentrifugeerd bij 21000 toeren per minuut ter verkrijging van een partieel gezuiverd antigen. Het antigen werd vermengd met aluminiumhydroxyde als hulpstof ter verkrijging van een antigen-oplossing. De antigenoplossing werd in hoeveelheden van 4,20 en 100 (ELISA antigen titer)-intraperitoneaal geïnjecteerd in in 4 weken oude ddY

muizen teneinde ze te immuniseren. Een week later werden de muizen geïmmuniseerd door injectie van het antigen-extract in dezelfde hoeveelheid. Nog een week later werd van elk van de muizen het bloed verzameld.

In het bloed werd de ELISA antilichaamtiter tegen het Japanse encephalitis virus bepaald volgens de eerder genoemde ELISA-methode en werd de neutraliserende antilichaam titer tegen het Japanse encephalitis virus bepaald volgens de eerder genoemde 50% plakreductiemethode. De resultaten zijn vermeld in tabel B.

Zoals in de tabel getoond werd de ELISA antilichaam titer van het antigen volgens de ELISA-methode gevonden, maar de neutraliserende antilichaam titer niet.

TABEL B
EMI32.1

<tb>
<tb> Antigen <SEP> ELISA <SEP> Anti <SEP> Neutraliserende
<tb> Hulpstof <SEP> titer <SEP> 1) <SEP> titer <SEP> antilicnaam
<tb> titer <SEP> 2i
<tb> 100 <SEP> 100 <SEP> < <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 10
<tb> Al <SEP> (OH) <SEP> 3 <SEP> 20 <SEP> 51 <SEP> n <SEP>
<tb> C. <SEP> 2mg <SEP>
<tb> /dosis <SEP> 4 <SEP> 64
<tb> 100 <SEP> 100 <SEP> < <SEP> 1 <SEP> :

<SEP> 10 <SEP>
<tb> (-) <SEP> 20 <SEP> 54 <SEP> n <SEP>
<tb> 4 <SEP> 20
<tb> R-1813) <SEP> 4 <SEP> 200
<tb>
1) ELISA antigen titer 2) volgens de 50% plaque reductiemethode 3) Referentie Japans encephalitis antigen lot 181

Trap 11 (Immunogeniciteit van het antigeen geproduceerd door de getransformeerde gist)
Een antigenoplossing, die op de in trap 10 beschreven wijze was bereid werd 6 maal met intervallen van 7 dagen (le, 8e, 15e, 22e, 29een 36e dag) geinjecteerd in de buikholte van elk van de muizen. Op de 43e dag werd het bloed van elk van de muizen verzameld. De neutraliserende antilichaam titer van het bloed tegen JE virus werd bepaald, waarbij als het JE-virus de Nakayamastam, Beijing stam, en JaOArS982 stam werden gebruikt. De resultaten zijn vermeld in tabel C.

Zoals in de tabel wordt getoond, werd met betrekking tot alle gebruikte stammen van JE-virus het neutraliserende antilichaam ontdekt.

Tabel C
EMI33.1

<tb>
<tb> 21
<tb> Hulpstof <SEP> Neutraliserende <SEP> antilichaamtiter <SEP>
<tb> Antigen <SEP> Nakayama <SEP> Beiiing <SEP> JaOArS982
<tb> titer <SEP> 1) <SEP> stam <SEP> stam <SEP> stam
<tb> 100 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 117 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 48 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 59
<tb> Al <SEP> (OH) <SEP> 3 <SEP> 20 <SEP> < <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 11
<tb> 0. <SEP> 2mg
<tb> /dos <SEP> ze <SEP> : <SEP> 10
<tb> 100 <SEP> < <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 10 < <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 15
<tb> (-) <SEP> 20" <SEP> < <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 10 <SEP>
<tb> 4 <SEP> " <SEP> " <SEP> "
<tb> R-1813) <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 3500 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 70 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 370
<tb>
1), 2), 3) :

zoals verneld in tabel B

Voorbeeld II
De E. coli stam JM83/pS22, verkregen in trap 4 van voorbeeld I werd gekweekt ter verkrijging van cellen van de stam. Uit de aldus verkregen cellen werd het plasmide pS22 DNA geisoleerd volgens de alkali-extractiemethode, zoals beschreven in trap 4 van voorbeeld I. Het geïsoleerde plasmide DNA werd opgelost in een waterige oplossing, bevattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 m ! 1 NaCl en 7 mM MgCl. Aan het verkregen mengsel werden restrictie-enzymen MluI en SphI, toegevoegd, gevolgd door 2 uur incubatie bij 370C ter digerering van het plasmide DNA. Het verkregen mengsel werd onderworpen aan agarose gel elektroforese.

Uit het resulterende agarosegel werden DNA fragmenten met een molecuullengte van ongeveer 1500 bp gewonnen die een base sequentie coderend voor JEV3 proteine bevatten. De DNA fragmenten werden gedigereerd met behulp van restrictie-enzymen op praktisch dezelfde wijze als hierboven beschreven, behalve dat restrictie-enzymen NruI en DdeI werden gebruikt in plaats van de restrictie-enzymen MluI en SphI, ter verkrijging van DNA digesten. De aldus verkregen DNA digesten werden onderworpen aan agarose gel elektroforese. Uit het resulterende agarosegel werden DNA-fragmenten met een molecuullengte van ongeveer 350 bp gewonnen. De gewonnen DNA-fragmenten werden geligateerd aan de in trap 3 van voorbeeld I verkregen vector YEp133PCT op de XhoI plaats daarvan met behulp van een XhoI verbinder ter verkrijging van recombinanten.

De recombinanten werden overgebracht in cellen van E. coli stam DH1 ter verkrijging van transformanten. De keuze van de transformant, die het beoogde DNA fragment van ongeveer 350 bp bevatte uit de op de beschreven wijze verkregen transformanten geschiedde volgens de kolonie hybridiseringsmethode waarbij
EMI34.1
32 als sonde P-gemerkt DNA coderend voor JEV3-proteine werd 32 gebruikt. Het P-gemerkt DNA werd als volgt bereid.

Eerst werd het in trap 5 van voorbeeld I verkregen plasmide pS22XS gedigereerd met restrictie-enzymen XhoI en SalI, waarna het verkregen mengsel werd onderworpen aan agarosegel elektroforese ter winning van een DNA fragment met een

EMI35.1
molecuullengte van ongeveer 1600 bp. Vervolgens werd het 32 gewonnen DNA-fragment gemerkt met 32p door middel van nick- translatie met behulp van een nick translatiekit N. 5000, in de handel gebracht door Amersham Japan Limited. Op deze
EMI35.2
32 wijze werd het bovengenoemde P-gemerkt DNA verkregen.

De aldus gekozen transformant werd gekweekt ter verkrijging van een kloon van de transformant. Uit de kloon werden plasmiden geïsoleerd volgens de alkali-extractiemethode, zoals hierboven vermeld. Met de aldus verkregen plasmiden werden cellen van de giststam SHY4 getransformeerd. De resulterende cellen werden gekweekt op het SD agar medium, zoals beschreven in trap 6 van Voorbeeld I. De door de kweek gevormde kolonie werd geïsoleerd ter verkrijging van een getransformeerde gist.

De getransformeerde gist werd gebruikt voor de produktie van een polypeptide, omvattende een gedeelte van de aminozuursequentie van formule (1), welk gedeelte bestaat uit het 375e tot het 456e aminozuur, geteld vanaf het N-einde van de aminozuursequentie met formule (1). Op nagenoeg dezelfde wijze als in trap 7 van voorbeeld I werd de getransformeerde gist gekweekt ter verkrijging van gistcellen, waarna uit de aldus verkregen gistcellen een gistextract werd verkregen.

Een monster van het verkregen gistextract werd onderworpen aan de hemagglutinering-inhibiteringsproef (HAI) volgens de methode van Clarke en Casals (American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 2 (1958) 561-573) onder toepassing van 4 monoklonale antilichamen resp. tegen 4 antigen determinantgebieden (groepen 1 tot 4) van JEV3 proteine (Journal of Virology, 45 (1) (1983) 124-132. De resultaten
EMI35.3
d zijn vermeld in tabel D. Deze resultaten tonen gistextract van de getransformeerde gist een stof bevat, die zich specifiek verbindt met het monoklonale antilichaam tegen de antigen determinantgebiedgroep 4 van het JEV3 antigen. Het plasmide in de getransformeerde gist werd aangeduid als pV3G4-96 en de getransformeerde gist werd aangeduid als giststam

SHY4/pV3G4-96.

Het gistextract werd op praktisch dezelfde wijze als in trap 9 van voorbeeld I gezuiverd ter verkrijging van een gezuiverd antigen volgens de uitvinding.

Voorbeeld III
Nagenoeg dezelfde procedures als in voorbeeld II werden herhaald ter verkrijging van DNA-fragmenten met een molecuullengte van ongeveer 1500 bp, die een base sequentie coderend voor JEV3 proteine bevatten. De DNA-fragmenten werden achtereenvolgens gedigereerd met restrictie-enzymen HpaII, Bgl31 en StuI, waarbij DNA-digesten werden verkregen. De DNAdigesten werden onderworpen aan agarosegel-elektroforese ter winning van DNA-fragmenten met molecuullengten van ongeveer 700 tot 800 bp. De gewonnen DNA-fragmenten werden aan de vector YEpl33PCT op de XhoI-plaats daarvan geligateerd onder toepassing van een XhoI-verbinder ter verkrijging van recombinanten. De recombinanten werden overgebracht in cellen van E. coli stam DH1 ter verkrijging van transformanten.

De keuze van de transformant, die de beoogde DNA-fragmenten van ongeveer 700 tot 800 bp bevatte, uit de verkregen transformanten geschiedde volgens de kolonie hybridiseringsmethode op nagenoeg dezelfde wijze als in voorbeeld II. Vervolgens werd de gekozen transformant gekweekt ter verkrijging van een kloon van de transformant. Uit de kloon werden plasmiden geïsoleerd volgens de alkali-extractiemethode, zoals eerder genoemd. Met de aldus verkregen plasmiden werden cellen van de giststand SHY4 getransformeerd. De verkregen cellen werden gekweekt op het SD-agarmedium, zoals beschreven in trap 6 van voorbeeld I.

De gevormde kolonie werd geïsoleerd ter verkrijging van een getransformeerde gist.

De getransformeerde gist werd gebruikt voor de bereiding van een polypeptide, omvattende een gedeelte van de aminozuur-sequentie met formule (1), welk gedeelte bestond uit 45e tot het 159e aminozuur, geteld vanaf het N-einde van de aminozuursequentie met formule (1). Op analoge wijze als in trap 7 van voorbeeld I werd de getransformeerde gist gekweekt ter verkrijging van gistcellen, waarna uit de verkregen

gistcellen een gistextract werd verkregen.

Een monster van het gistextract werd op dezelfde wijze als beschreven in voorbeeld II onderworpen aan de HAI-proef. De resultaten zijn vermeld in tabel D. De resultaten tonen dat het gistextract van de getransformeerde gist een stof bevatte, die zich specifiek verbindt met het monoklonale antilichaam tegen de antigen determinantgebiedgroep 1 van JEV3 antigen. Het plasmide in de getransformeerde gist werd aangeduid als pV3G1-38 en de getransformeerde gist werd aangeduid als giststam SHY4/pV3Gl-38.

Het verkregen gistextract werd op nagenoeg dezelfde wijze als in trap 9 van voorbeeld I gezuiverd ter verkrijging van een gezuiverd antigen volgens de uitvinding.

Anderzijds werd een gistextract op nagenoeg dezelfde wijze als in trap 7 van voorbeeld I een gistextract verkregen uit cellen van de giststam SHY4, die geen plasmide bevatten. Het aldus verkregen gistextract werd gebruikt als controle en wordt op dezelfde wijze als eerder beschreven onderworpen aan de HAI-proef. De resultaten zijn eveneens in Tabel D vermeld.

Tabel D
EMI37.1
&verbar;..
EMI37.2

HAI <SEP> titer
<tb> Giststam
<tb> Monoklonaal <SEP> antilichaam
<tb> groep
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Voorbeeld <SEP> II <SEP> SHY4/pV3G4-96 <SEP> 10 <SEP> 10. <SEP> (10 <SEP> 10240
<tb> Voorbeeld <SEP> III <SEP> SHY4/pV3G1-38 <SEP> 5120 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Controle <SEP> SHY4 <SEP> < 10 <SEP> < 10, <SEP> (10 <SEP> 10
<tb>

EMI37.3
, I I Voetnoot : 1) de groepnummers van de monoklonale antilichaamgroep komen overeen met die van groepen van de antigen determinantgebieden, vermeld in Journal of Virology, 45 (1) (1983) 124-132.

Claims

CONCLUSIES 1. Antigeen omvattende ten minste een gedeelte van een aminozuursequentie, voorgesteld door de volgende formule (1) : Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe Ile Glu Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu Asp Val Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala Bis Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr Ser Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn Eis Gly Asn Tyr Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gin Ala Ala Lys Phe Thr Ile Thr 0 Pro Asn Ala Pro Ser Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser <Desc/Clms Page number 39> Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Cys Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Met Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser-Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Leu Leu Val Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Asp Lys Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr <Desc/Clms Page number 40> Gln Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu'Trp Met Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala .....

(1) <Desc/Clms Page number 51> waarin Ala staat voor een alanine rest, Arg voor een arginine rest, Asn voor een asparagine rest, Asp voor een aspartinezuur rest, Cys voor een cystein rest, Gln voor een glutamine rest, Glu voor een glutamine- zuur rest, Gly voor een glycine rest, His voor een histidine rest, Ile voor een isoleucine rest, Lys voor een lysine rest, Leu voor een leucine rest, Met voor een methionin rest, Phe voor een fenyl- alanine rest, Pro voor een proline rest, Ser voor een serine rest, Thr voor een threonine rest, Trp voor een tryptofaan rest, Tyr voor een tyrosine rest en Val voor een valine rest, welk gedeelte ten minste éëh e. pitoop bevat, die reactief is met een anti-flavivirus antilichaam, welke werkwijze omvat :

EMI51.1 (a) ligatering van een deoxyribonucleïnezuur, omvattende een basensequentie die voor het antigeen aan een repli- ceerbare expressie vector onder vorming van een repliceerbaar recombinant DNA, omvattende het deoxyribonucleinezuur en de repliceerbare expressievector ; (b) transformatie van cellen van een microörganisme of celculture met het repliceerbare recombinant DNA onder vorming van transformanten ; (c) keuze van de transformanten uit de moedercellen van het microörganisme of de celculture ; (d) incubatie van de gekozen transformanten, zonder expressie door de transformanten van het deoxyribonucleinezuur en vorming van een antigeen ; en (e) isolatie van het antigeenuit de geincubeerde transformanten.

(1) waarin Ala staat voor een alaninerest, Arg voor een argininerest, Asn voor een asparaginerest, Asp voor een aspartinezuurrest, Cys voor een cystelne- rest, Gin voor een glutamine rest, Glu voor een glutaminezuurrest, Gly voor een glycinerest, His voor histidinerest, Ile voor een isoleucinerest, Lys voor een lysinerest, Leu voor een leucinerest, Met voor een methioninerest, Phe voor een fenylala- ninerest, Pro voor een prolinerest, Ser voor een seri- nerest, Thr voor een threoninerest, Trp voor een tryptofaanrest, Tyr voor een tyrosinerest, en Val voor een valinrest, welk gedeelte ten minste een epitoop bevat, die reac- tief is met een anti-flavivirus antilichaam.

(1) waarin Ala staat voor een alaninerest, Arg voor een argininrest, Asn voor een asparaginerest, Asp voor een aspartinezuur rest, Cys voor een cystelnerest, Gln voor een glutaminerest, Glu voor een glutamine- zuurrest, Gly voor een glycinerest, His voor een histidinerest, Ile voor een isoleucinerest, Lys voor een lysinerest, Leu voor een leucinerest, Met voor een methioninerest, Phe voor een fenylalaninerest, Pro voor een prolinerest, Ser voor een serinerest, Thr voor een threoninerest, Trp voor een tryptofaan- rest, Tyr voor een tyrosinerest, en Val voor een valinrest,, welk gedeelte ten minste een epitoop bevat, die reactief is met een antiflavivirus antilichaam. EMI40.1
2. Antigeen volgens conclusie l, met het kenmerk, dat het anti-flavivirus antilichaam een anti-Japansencefalitis V3 proteine antilichaam is.
3. Antilichaam volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het desbetreffende aminozuursequentiegedeèlte correspondeert met de aminozuursequentie van de aminozuren 1-498, geteld vanaf de N-terminus van de aminozuursequentie met formule 1.
4. Antilichaam volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het desbetreffende aminozuursequentiegedeelte correspondeert met de aminozuursequentie van de aminozuren 45-159, geteld vanaf de N-terminus van de aminozuursequentie met formule 1.
5. Antilichaam volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het desbetreffende aminozuursequentiegedeelte correspondeert met de aminozuursequentie van de aminozuren 375-456, geteld vanaf de N-terminus van de aminozuursequentie met formule 1. <Desc/Clms Page number 41>
6. Antigeen volgens conclusie 1, dat een versmolten peptide is, omvattende ten minste een gedeelte van een aminozuursequentie met formule (1) met, aan het C-terminus en/of N-terminus daarvan gebonden, een aminozuursequentie van een ander peptide dan het antigeenmet ten minste een gedeelte van een aminozuursequentie, voorgesteld door formule 1.
7. Nagenoeg zuiver antigeen omvattende ten minste een gedeelte van een aminozuursequentie, voorgesteld door de volgende formule (1) : Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe Ile Glu Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu Asp Val Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Ris Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr Ser Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Gly Ile Phe Val Ris Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn His Gly Asn Tyr Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gln Ala Ala Lys Phe Thr Ile Thr Pro Asn Ala Pro Ser Ile Thr Leu Gly

Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala <Desc/Clms Page number 42> Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Cys Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Met Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Leu Leu Val Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile

Val Val Gly Arg Gly Asp Lys Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg <Desc/Clms Page number 43> Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala .....
8. Deoxyribonucleinezuur, omvattende een basensequentie, coderend voor een antigeen, dat ten minste een gedeelte om- vat van een aminozuursequentie, voorgesteld door de volgende formule 1 (l) : <Desc/Clms Page number 44> Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe Ile Glu Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu Asp Val Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala Ser Gin Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gin Gly Phe Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr Ser Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile Gin Pro Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn His Gly Asn Tyr Ser Ala Gin Val Gly Ala

Ser Gin Ala Ala Lys Phe Thr Ile Thr Pro Asn Ala Pro Ser Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Cys Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala Ris Ala Thr Lys Gin <Desc/Clms Page number 45> Ser Val Val Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Met Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Leu Leu Val Glu Met Glu Pro

Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Asp Lys Gln Ile Asn His Bis Trp His Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala ...

(l) <Desc/Clms Page number 46> EMI46.1 1 waarin Ala staat voor een alaninerest, Arg voor een argininerest, Asn voor een asparaginerest, Asp voor aspartLnezuurrest, Cys voor een cystelnerest, Gln voor een glutaminerest, Glu voor een glutaminezuurrest, Gly voor een glycinerest, His voor een histidinerest, Ile voor een isoleucinerest, Lys voor een lysinerest, Leu voor een leucinerest, Met voor een methionine- rest, Phe voor een fenylalaninerest, Pro voor een prolinerest, Ser voor een serinerest, Thr voor een threoninerest, Trp voor een triptofanrest, Tyr voor een tyrosinerest en Val voor een valinrest, welk gedeelte ten minste één epitoop bevat, die reactief is met een anti-flavivirus antilichaam.
9. Deoxyribonucleinezuur dat ten minste één basensequentie omvat gekozen uit een basensequentie welke ten minste een deel van de basensequentie met de hiernavolgende formule 2 omvat, en een aan deze basensequentie complementaire basen- sequentie, welke ten minste een deel van de basensequentie met formule 2 omvat :

TTT AAT TGT CTG GGA ATG GGC AAT CGT GAC TTC ATA GAA GOA GCC AGT GGA GCC ACT TGG GTG GAC TTG GTG CTA GAA GGA GAT AGC TGC TTG ACA ATC ATG GCA AAC GAC AAA CCA ACA , TTG GAC GTC CGC ATG ATT AAC ATC GAA GCT AGC CAA CTT GCT GAG GTC AGA AGT TAC TGC TAT CAT GCT TCA ATC ACT GAC ATC TCG ACG GTG GCT CGG TGC CCC ACG ACT GGA GAA GCT CAC AAC GAG AAG CGA GCT GAT AGT AGC TAT <Desc/Clms Page number 47> GTG TGC AAA CAA GGC TTC ACT GAT CGT GGG TGG GGC AAC GGA TGT GGA CTT TTC GGG AAG GGA AGC ATT GAC ACA TGT GCA AAA TTC TCC TGC ACC AGC AAA GCG ATT GGA AGA ACA ATC CAG CCA GAA AAC ATC AAA TAC GAA GTT GCC ATT TTT GTG CAT GGA ACC ACC ACT TCG GAA AAC CAT GGG AAT TAT TCA GCG CAA GTT GGG GCG TCC CAG GCG GCA AAG TTT ACA ATA ACA CCC AAT CGT CCT TCG ATA ACC CTC GGG CTT GGT GAC TAC GGA GAA GTC ACG CTG GAC TGT GAG CCA AGG AGT GGA CTG AAC ACT

GAA GCG TTT TAC GTC ATG ACC GTG GTG TCA AAG TCA TTT CTG GTC CAT AGG GAA TGG TTT CAT GAC CTC GCT CTC CCC TGG ACG TCC CCT TCG AGC ACA GCG TGC AGA AAC AGA GAA CTC CTC ATG GAA TTT GAA GAG GCG CAC GCC ACA AAA CAG TCC GTT GTT GCT CTT GGG TCA CAG GAA GGA GGC CTC CAT CAG GCG TTG GCA GGA GCC ATC GTG GTG GAG TAC TCA AGC TCA GTG AAG TTA ACA TCA GGC CAC CTG AAA TGT AGG ATG AAA ATG GAC AAA CTG GCT CTG AAA GGC ACA ACC TAT GGC ATG TGT ACA GAA AAA TTf TC-f ! TTC GCG AAA AAT CCG GCG GAC ACT GGC CAC GGA ACA GTT GTC ATT GAA CTA TCC TAC TCT GGG AGT GAT GGC CCC TGC AAA ATT CCG ATT GTC <Desc/Clms Page number 48> TCC GTT GCG AGC CTC AAT GAC ATG ACC CCC GTT GGG CGG CTG GTG ACA GTG AAC CCT TTC GTC GCG ACT TCC AGT GCC AAC TCA AAG CTG CTG GTC GAG ATG GAA CCC CCC TTC GGA GAC TCC TAC ATC GTG GTT GGG AGG GGA GAC AAG CAG ATC AAC CAC CAT TGG CAC AAA GCT GGA AGC ACG CTA GGC AAG GCC TTT

TCA ACA ACT TTG AAG GGA GCT CAA AGA CTG GCA GCG TTG GGC GAC ACA GCC TGG GAC TTT GGC TCC ATT GGA GGG GTC TTC AAC TCC ATA GGA AAA GCC GTT CAC CAA GTG TTT GGT GGT GCC TTC AGA ACA CTC TTT GGG GGA ATG TCT TGG ATC ACA CAA GGG CTA ATG GGT GCC CTA CTA CTC TGG ATG GCC GTC AAC GCA CGA GAC CGA TCA ATT GCT TTG GCC TTC TTA GCC ACA GGA GGT GTG CTC GTG TTC TTA GCG ACC AAT GTG CAT GCT ...... (i) waarin A een deoxyadenylzuur-rest, G een deoxyguanylrest, C een deoxycytidylzuur-rest, en T een deoxythymidylzuurrest voorstellen, en de linker-en rechteruiteinden van formule 2 respectievelijk de S'-hydroxylgroep zijde en EMI48.1 de 3'-hydroxylgroep zijde voorstellen.
10. Deoxyribonucleïnezuur dat een basensequentie omvat, welke verkregen is door ten minste een base van de genoemde basensequenties van het deoxyribonucleinezuur volgens conclusie 9 te wijzigen in overeenstemming met de ontaarding van de genetische code. <Desc/Clms Page number 49>
11. Repliceerbaar recombinant DNA dat een deoxyribonuclelnezuur volgens conclusie % en een repliceerbare expressievector omvat.
12. Microörganisme of celculture, getransformeerd met een repliceerbaar recombinant DNA volgens conclusie 11.
13. Werkwijze ter bereiding van een antigeenomvattende ten minste een gedeelte van een aminozuursequentie, voor- EMI49.1 gesteld door de volgende formule (1) : EMI49.2 Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe Ile Glu Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu Asp Val Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr Ser Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Gly Ile Phe Val Ris Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn His Gly Asn Tyr Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gln

Ala Ala Lys Phe Thr Ile Thr Pro Asn Ala Pro Ser Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala <Desc/Clms Page number 50> Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Cys Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gin Ser Val Val Ala Leu Gly Ser Gin Glu Gly Gly Leu His Gin Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly Eis Leu Lys Cys Arg Met Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr.

Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Leu Leu Val Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Asp Lys Gin Ile Asn Bis Bis Trp His Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gin Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys Ala Val His Gin Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gin Gly Leu Ket Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Tbr Asn Val His Ala .....
14. Vaccin voor flavivirus, omvattende : een effectieve immunogene hoeveelheid van een antigeen dat ten minste een gedeelte van een aminozuursequentie bevat, voorgesteld door de volgende formule (1) : <Desc/Clms Page number 52> Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe Ile Glu Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu Asp Val Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr Ser Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn His Gly Asn

Tyr Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gln Ala Ala Lys Phe Thr Ile Thr Pro Asn Ala Pro Ser Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Cys Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gln <Desc/Clms Page number 53> Ser Val Val Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Met Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn

Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Leu Leu Val Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Asp Lys Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gly Gly Val T. eu Val Phe Le Ala Thr Asn Val His Ala .....

(lt <Desc/Clms Page number 54> waarin Ala staat voor een alanine rest, Arg voor een arginine rest, Asn voor een asparagine rest, Asp voor een aspartinezuur rest, Cys voor een cystein rest, Gln voor een glutamine rest, Glu voor een glu- taminezuur rest, Gly voor een glycine rest, His voor een histidine rest, Ile voor een isoleucine rest, Lys voor een lysine rest, Leu voor een leucine rest, Met voor eenmhionine rest, Phe voor een fe- nylalanine rest, Pro voor een proline rest, Ser voor een serine rest, Thr voor een threonine rest, Trp voor een tryptofaan rest, Tyr voor een tyrosine rest en Val voor een valine rest, welk gedeelte ten minste één epitoop bevat, dat reactief is met een anti-flavivirus antilichaam, alsmede ten minste één farmaceutisch aanvaardbare drager, verdunningsmiddel of excipiens.
15. Vaccin voor flavivirus volgens conclusie 14, dat een vaccin voor Japanse encefalitis is.
16. Microörganisme Escherichia coli stam JM83/pS22, gedeponeerd bij het Fermentation Research Institute onder no.

FERM BP-1074.
17. Plasmide pS22.