CN116478296B - 截短的呼吸道合胞病毒f蛋白及其用途 - Google Patents

截短的呼吸道合胞病毒f蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本申请涉及生物医药领域，具体而言，本申请涉及一种融合蛋白，以及包含编码所述融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子。本申请还涉及包含所述融合蛋白或所述核酸分子的疫苗。进一步的，本发明还涉及这些融合蛋白、核酸分子和疫苗用于预防和/或治疗RSV感染或由RSV感染所引起的疾病和/或症状的方法。

Description

截短的呼吸道合胞病毒F蛋白及其用途
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体而言，本申请涉及一种融合蛋白，以及包含编码所述融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子。本申请还涉及包含所述融合蛋白或所述核酸分子的疫苗。进一步的，本发明还涉及这些融合蛋白、核酸分子和疫苗用于预防和/或治疗RSV感染或由RSV感染所引起的疾病和/或症状的方法。
背景技术
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是世界范围内引起婴幼儿下呼吸道感染最主要的病原体之一。据统计，全球每年5岁以下儿童感染RSV人数达3300万，造成近16万人的死亡。RSV感染后无法获得持续免疫，可出现反复感染，超过99％的2岁以下儿童至少感染过一次RSV，且其中70％患者发生住院感染并发细支气管炎、肺炎及哮喘。除婴幼儿及儿童外，免疫力低下的老年人及免疫抑制人群也是RSV感染的高危人群，老人常导致阻塞性肺病且伴有心肺并发症。尽管给全球造成严重的疾病和经济负担，目前针对RSV仍然没有安全有效的疫苗。
RSV属于肺炎病毒属、肺病毒科，是一种有包膜的单股负链RNA病毒。基因组全长约15.2kb，转录十个基因，共编码十一种蛋白。其中黏附糖蛋白G及膜融合蛋白F位于病毒膜表面，相比于G蛋白，F蛋白在保守性上更具优势，因此被认为是RSV的最重要的保护性抗原。
RSV的F蛋白属于Ⅰ型整合膜蛋白，其前体蛋白F0由574个氨基酸组成，三个F0之间通过疏水作用形成三聚体，在通过高尔基体时被宿主的弗林蛋白酶在第109、110位氨基酸之间及136、137位氨基酸之间进行切割。切割后的F蛋白释放出含有27个氨基酸的短肽P27，其余两段F2及F1通过两个二硫键连接形成成熟的F蛋白，通过出芽的方式展示到细胞膜或病毒体表面。此时的F蛋白处于高能级亚稳态，十分不稳定，被称为pre-F。在F1的N末端是一段高度疏水的融合肽FP，位于三聚体的疏水空腔内，在目前未知因素的触发下，F1的N末端发生一系列剧烈的结构变化，这个过程使得FP可以插到细胞膜表面帮助病毒完成膜融合从而感染细胞，也导致pre-F结构变成稳定的低能态的post-F构象。
2013年，McLellan等人首次通过点突变的方式获得了稳固的pre-F蛋白并命名为DS-Cav1，随后又有几个pre-F蛋白被相继报道，包括DS-Cav1-Cys-zipper、SC-TM以及SC-DM、SC-TM。相比于post-F蛋白，这些pre-F蛋白被证实可以激发显著更高水平的中和抗体滴度。RSV的pre-F蛋白可分为两部分：近膜端的“柄”区域，包括结构域I和结构域II，主要由β链结构组成，终止于进入膜的c端螺旋；和一个膜远端部分，RSV F“头部”区域，包括结构域III，主要是α-螺旋。RSV F头部含有至少两个与中和抗体相关的表位。Site位于pre-F三聚体的顶端，可被包括D25、AM22和5C4在内的强中和抗体识别。Site II位于pre-F三聚体的中部，是商品化抗体palivizumab的结合位点。同样被低效抗体识别的site I和site IV位于pre-F蛋白的柄区。Pre-F蛋白的柄区占三聚体总表面积的55％，可能与头部区的高中和表位site/>或site II竞争，导致针对高中和表位的抗体应答减弱。
以F蛋白为主要保护性抗原的RSV疫苗研究的主要目的在于产生高中和滴度的抗体，提高以F蛋白作为保护性抗原的RSV疫苗的免疫原性对RSV疫苗研发具有重要意义。
发明内容
在第一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含第一截短体，第二截短体，以及连接所述第一截短体和第二截短体的连接体；其中，
第一截短体与野生的呼吸道合胞病毒(RSV)的F2蛋白相比，在野生的RSV的F2蛋白的N端截短了5个至25个氨基酸(例如，5个-8个，9个-12个，13个-16个，17个-20个，21个-25个)，以及C端截短了3-5个氨基酸(例如，3个，4个，5个)；
第二截短体与野生的RSV的F1蛋白相比，在野生的RSV的F1蛋白的N端截短了7-9个氨基酸(例如，7个，8个，9个)，以及C端截短了238个至268个氨基酸(例如，238个-241个，242个-245个，246个-249个，250个-253个，254个-257个，258个-261个，262个-265，266个-268个)。
在某些实施方案中，第一截短体的C端的截短长度具有一定的范围(即，截短238个至268个氨基酸)，第二截短体的N端的截短长度具有一定的范围(即，截短5个至25个氨基酸)，这是由于在这些范围内，第一截短体和第二截短体仍然能够使维持构象稳定性的几种蛋白质二级结构保持完整，例如β2/β7、α1和α4等。
在某些实施方案中，所述第一截短体与野生的RSV的F2蛋白相比，在野生的RSV的F2蛋白的N端截短了5个或25个氨基酸，以及C端截短了4个氨基酸。
在某些实施方案中，野生的RSV的F2蛋白具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述第一截短体具有如SEQ ID NO:16或17所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第二截短体与野生的RSV的F1蛋白相比，在野生的RSV的F1蛋白的N端截短了9个氨基酸，以及C端截短了252个或268个氨基酸。
在某些实施方案中，野生的RSV的F1蛋白具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述第二截短体具有如SEQ ID NO:14或15所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述连接体包含至少1个(例如，1个，2个)脯氨酸。
在某些实施方案中，所述连接体具有3-20个氨基酸(例如，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，15个，20个)。在某些实施方案中，所述连接体具有5-8个氨基酸。
在某些实施方案中，所述连接体包含多个(例如，2个，3个，4个，5个，6个，7个)甘氨酸以及至少1个(例如，1个，2个)脯氨酸。
在某些实施方案中，所述连接体具有如SEQ ID NO:2或22所示的序列。
在某些实施方案中，所述第一截短体位于所述连接体的N端。
在某些实施方案中，所述第二截短体位于所述连接体的C端。
在某些实施方案中，所述融合蛋白从N端至C端依次包含：第一截短体，连接体，第二截短体。
在某些实施方案中，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述融合蛋白还包含：信号肽，和/或膜锚定区。
在某些实施方案中，所述信号肽具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述膜锚定区具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述信号肽位于第一截短体的N端。在某些实施方案中，所述信号肽通过第一连接肽与第一截短体连接。
在某些实施方案中，所述膜锚定区位于第二截短体的C端。在某些实施方案中，所述膜锚定区通过第二连接肽与第二截短体连接。
在某些实施方案中，所述第一连接肽和第二连接肽各自独立地包含一个或几个(例如1个、2个或3个)如(GmS)n所示的序列，其中m选自1-6的整数，n选自1-6的整数。在某些实施方案中，m为3、4、或5。在某些实施方案中，n为1或2。在某些实施方案中，所述第一连接肽和第二连接肽具有SEQ ID NO：18所示的序列。
在某些实施方案中，所述融合蛋白从N端至C端依次包含：信号肽，第一连接肽，第一截短体，连接体，第二截短体，第二连接肽，膜锚定区。
在某些实施方案中，所述融合蛋白具有SEQ ID NO：19或20所示的序列。
在另一方面，本申请提供了一种核酸分子，其包含编码如前所述的融合蛋白的核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述核苷酸序列根据宿主细胞的密码子偏好性进行了密码子优化或未进行优化。
在另一方面，本申请提供了一种载体，其包含如前所述的核酸分子。
在某些实施方案中，所述载体是病毒载体。
在某些实施方案中，所述病毒载体选自：流感病毒载体，逆转录酶病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体，疱疹病毒载体，痘病毒载体，杆状病毒载体，乳头瘤病毒载体，或乳头多瘤空泡病毒载体。
在另一方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含如前所述的融合蛋白或如前所述的核酸分子或如前所述的载体。
在某些实施方案中，所述宿主细胞选自原核细胞(例如大肠杆菌细胞)，真核细胞。
在某些实施方案中，所述真核细胞是哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含膜锚定区，并展示在所述宿主细胞的细胞膜的表面。
在另一方面，本申请提供了一种表达或产生如前所述的融合蛋白的方法，所述方法包括，在允许蛋白质表达的条件下，培养如前所述的宿主细胞，以及任选地，回收或纯化所表达的融合蛋白。
在另一方面，本申请提供了一种试剂盒，其包含抗原组分，以及能够展示所述抗原组分的载体组分；其中，
所述抗原组分包含(i)如前所述的融合蛋白，(ii)如前所述的核酸分子，和/或(iii)由如前所述的核酸分子转录的mRNA产物；
所述载体组分选自：纳米材料(例如，脂质纳米颗粒、蛋白质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、无机纳米载体和仿生纳米颗粒)，细菌的外膜囊泡(OMVs)，多聚化基座，病毒样颗粒(VLP)，或其任意组合。
在某些实施方案中，所述试剂盒中的抗原组分和载体组分单独提供，或形成复合物提供。
在某些实施方案中，所述抗原组分是单体或多聚体(例如，二聚体，三聚体，四聚体，五聚体)。
在某些实施方案中，所述试剂盒中的多聚化基座和/或VLP以蛋白或包含编码所述蛋白的核苷酸序列的核酸分子的形式提供。
在某些实施方案中，所述多聚化基座具有如SEQ ID NO:21或22所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述VLP是由获自RSV，乙型肝炎病毒(HBV)，人乳头瘤病毒(HPV)，或人类免疫缺陷病毒(HIV)的蛋白组装而成。
在另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和/或赋性剂，以及选自下列(1)至(4)的任意一项或多项：
(1)如前所述的融合蛋白；
(2)如前所述的核酸分子；
(3)如前所述的载体；
(4)如前所述的宿主细胞。
在另一方面，本申请提供了用于产生对抗呼吸道合胞病毒(RSV)的疫苗的方法，这些方法包括提供如前所述的试剂盒或药物组合物，并将其配制成药学上可接受的疫苗。
在另一方面，本申请提供了一种疫苗，其包含如前所述的融合蛋白，或如前所述的核酸分子，或由如前所述的核酸分子转录的mRNA产物，或如前所述的载体。
在某些实施方案中，所述疫苗由如前所述的试剂盒或药物组合物制备而成。
在某些实施方案中，所述疫苗还包含佐剂。
在某些实施方案中，可以将上述疫苗给予受试者，例如人类受试者。用于单独给予的疫苗中的融合蛋白的总剂量可以是例如约0.01μg至约10mg，例如1μg-1mg，例如10μg-100μg。确定所给与的剂量可以通过实验确定，确定剂量对于本领域技术人员来说是常规的。
在另一方面，本申请提供了一种诱导针对RSV的抗体的方法，所述方法包括在体外的细胞中或在受试者体内施用(例如，注射)有效量的如前所述的融合蛋白，或如前所述的核酸分子，或如前所述的载体，或权如前所述的宿主细胞，或如前所述的药物组合物，或如前所述的疫苗。
在某些实施方案中，所述抗体为中和抗体。
在某些实施方案中，施用包括胃肠外给予，如皮内、肌内、皮下、经皮、或粘膜给予，例如鼻内、经口等。在某些实施方案中，通过肌内注射来给予组合物。
此外，本发明的蛋白可以用作诊断工具，例如通过确定受试者的血清中是否存在能够结合本申请的融合蛋白的抗体来测试受试者的免疫状态。
因此，在另一方面，本申请提供了一种用于在体外检测受试者是否存在RSV感染的方法，所述方法包括：使获得自所述受试者的生物样品与如前所述的融合蛋白接触；以及，检测是否存在由所述融合蛋白和抗体形成的复合物。
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如，小鼠，人。
在某些实施方案中，所述生物样品选自全血，血清，血浆，或其任何组合。
在另一方面，本申请提供了筛选能够抑制RSV感染细胞的候选药物的方法，所述方法包括，在将如前所述的融合蛋白，或如前所述的载体，或如前所述的药物组合物，或如前所述的疫苗与宿主细胞接触之前、同时或之后，将所述宿主细胞与所述候选药物接触。
在另一方面，本申请提供了如前所述的融合蛋白，或如前所述的核酸分子，或如前所述的载体，或如前所述的宿主细胞，或如前所述的药物组合物，或如前所述的疫苗在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诱导受试者对RSV的免疫应答。
在某些实施方案中，所述免疫应答包括诱导受试者产生针对RSV的抗体。
在某些实施方案中，所述抗体为中和抗体。
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如，小鼠，人。
在另一方面，本申请提供了如前所述的融合蛋白，或如前所述的核酸分子，或如前所述的载体，或如前所述的宿主细胞，或如前所述的药物组合物，或如前所述的疫苗在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于预防和/或治疗RSV感染或由RSV感染所引起的疾病和/或症状。
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如，小鼠，人。在某些实施方案中，由RSV感染所引起的疾病和症状选自细支气管炎，肺炎，哮喘，阻塞性肺病，心肺并发症。
术语定义
在本文中，术语“呼吸道合胞病毒”和“RSV”具有相同的含义，其是属于肺炎病毒科，肺病毒属的一种病毒。RSV基因组全长约15Kb，包含10个基因，编码11种蛋白，包括8种结构蛋白(F、G、M2-1、M2-2、SH、N、P、L)和3种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3)。其中融合蛋白(fusion protein,F)和粘附蛋白(attachment protein,G)是两个主要的包膜糖蛋白，F蛋白为I型糖蛋白，经细胞蛋白酶裂解为F1和F2后具有生物学活性，能使病毒包膜与宿主细胞膜融合形成多核巨细胞。F蛋白的序列可从公共数据库中获得(例如，GenBank数据库)。在某些实施方案中，野生的F蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
如本文中所使用的，术语“野生的”或“天然的”可互换地使用。当这些术语用于描述核酸分子、多肽或蛋白时，其表示该核酸分子、多肽或蛋白在自然界中存在，发现于自然界，并且未经过人工的任何修饰或加工。如本文中所使用的，野生的呼吸道合胞病毒(RSV)的F1/F2蛋白是指天然存在的，具有生物学活性的F1/F2蛋白。本领域技术人员可以方便地从各种公共数据库(例如GenBank数据库)获得F1和F2蛋白的氨基酸序列。例如，野生的RSV的F2蛋白的氨基酸序列可如SEQID NO：13所示。野生的RSV的F1蛋白的氨基酸序列可如SEQID NO：12所示。
如本文中所使用的，术语“C端截短X个氨基酸”是指，C端最末端连续的X个氨基酸被截短。同理，术语“N端截短X个氨基酸”是指，N端最末端连续的X个氨基酸被截短。
如本文中所使用的，术语“载体”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本领域技术人员所知晓的，密码子存在简并性。即，在蛋白质的翻译过程中，每个氨基酸可对应1种或多种密码子，例如可对应多达6种密码子。不同的物种在使用编码某一氨基酸的简并密码子时存在着很大的差异，有着不同的偏好。这种偏好现象即被称为“密码子偏好性”。因此，如本文中所使用的，术语“密码子偏好性”是指某一物种偏爱使用某些特定的密码子来编码氨基酸的情况。根据密码子偏好性来优化核酸分子的序列在某些情况下是特别有利的，例如，可能有助于提高核酸分子所编码的蛋白质的表达水平。例如，当使用大肠杆菌(或人细胞)来表达蛋白或其片段时，针对大肠杆菌(或人细胞)的密码子偏好性来优化编码蛋白或其片段的核酸序列将是潜在有利的。
如本文中所使用的，术语“病毒样颗粒(VLP)”是一种多聚体颗粒，其结构与天然的病毒颗粒相似或不相似。在某些实施方案中，VLP是天然的病毒颗粒。在某些实施方案中，VLP是由蛋白组装成的病毒样颗粒。经证实，一些病毒(例如，RSV，HBV，HEV，HPV)的蛋白(例如，衣壳蛋白，表面蛋白，包膜蛋白)在适当的表达系统中重组表达之后，可以自发形成VLP。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的”意指，制药领域公认的可用于动物，特别是可用于人的。如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂(包括但不限于磷酸盐缓冲液)，表面活性剂(包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80)，佐剂，离子强度增强剂(包括但不限于氯化钠)，稀释剂，赋形剂，用于容纳或施用治疗剂的介质，以及其任何组合。
如本文中所使用的，药学上可接受的载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括源自石油、动物、植物的或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当静脉内施用药用组合物时，生理盐水是优选的载体。盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液态载体，特别是用于可注射溶液。
如本文中所使用的，药学上可接受的赋形剂可包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。如果需要，药物组合物还可以包含润湿剂，或乳化剂例如透明质酸钠，或pH缓冲剂。药物组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释配方等形式。
如本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于，人，啮齿类动物(小鼠，大鼠，豚鼠)，狗，马，牛，猫，猪，猴，黑猩猩等。优选地，受试者是人。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
发明的有益效果
本申请的融合蛋白包含独特截短方式的RSV F1截短体和F2截短体，截短的融合蛋白诱导特异性抗体的能力与全长的pre-F蛋白相当，还能够诱导显著高于全长pre-F蛋白的中和抗体滴度。在这其中，融合蛋白所包含的连接体也起到了提高pre-F特异性表位siteΦ的稳定性的作用。
本申请的融合蛋白表现出了良好的保护性及安全性，适用于各种形式的疫苗平台，例如核酸疫苗、重组蛋白疫苗、病毒载体疫苗及颗粒化疫苗等。因此，本申请的融合蛋白在诱导受试者对RSV的免疫应答，以及预防和/或治疗RSV感染或由RSV感染所引起的疾病和/或症状中具有较大的潜力。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了包含不同连接肽的F蛋白转染293t细胞后，高中和抗体表位site II及site的表达结果。
图2显示了野生型F蛋白Fwt及F蛋白截短体LC2的结构示意图。
图3显示了AlphaFold 2预测的F蛋白截短体LC2的结构示意图。
图4为免疫印迹法(Western blot)检测F蛋白截短体的表达，第一泳道为Marker，第二泳道为pre-F蛋白SC-TM，第三泳道为F蛋白截短体LC2。
图5为免疫荧光(Immunofluorescence)检测F蛋白截短体LC2与site II特异性抗体mota(图5中的A)和site特异性抗体D25、AM22(图5中的B、C)的结合。
图6为编码F蛋白截短体的mRNA诱导小鼠产生的血清结合抗体滴度及血清抗体分型。
图7为编码F蛋白截短体的mRNA诱导小鼠产生的中和抗体滴度结果示意图。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
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具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。
另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1.F蛋白截短体的柔性连接肽的筛选实验
RSV F蛋白在变构过程中，疏水空腔内融合肽的释放是一个非常关键的触发事件。为了帮助融合肽稳定在疏水空腔内以稳固pre-F构象，在F2(SEQ ID NO:12)的C端及F1(SEQID NO:11)的N端引入不同长度的柔性连接肽。共设计了6种柔性连接肽，氨基酸序列分别如SEQ ID NO:23，2，24，25，26和27所示。上述柔性连接肽修饰的F蛋白核苷酸序列提交上海生工生物工程公司进行人源化密码子优化，在5’端及3’端分别引入HindIII及xBaI酶切位点，接入pcDNA3.1真核表达载体，构建含柔性连接肽的F蛋白重组质粒，分别命名为LA，LB，LC，LD，LE和LF。使用免疫荧光检测柔性连接肽修饰的F蛋白高中和抗体表位site II及site的表达。
1)第一天晚上接种3×104个/孔293T细胞到96孔板中。
2)第二天，当细胞汇合度达到85％时进行质粒转染。取5μL的opti-MEM培养基于96孔U底板中，加入0.2μg的质粒，0.3μL的P3000，涡旋震荡混匀，标记为A。再取5μL的opti-MEM培养基于96孔U底板中，加入0.3μL的Lipofectamine3000，涡旋震荡混匀标记为B。将A管加入到B管，涡旋震荡混匀，静置15分钟。之后将溶液加到铺好的293t细胞板中，轻轻摇匀后置于细胞培养箱中培养。
3)转染24小时后，加入每孔加入100μL的4％甲醛溶液，室温固定30分钟。
4)弃掉细胞培养液及甲醛溶液，用PBS清洗3次，每次5分钟。
5)每孔加入100μL含2％脱脂奶粉的PBS，室温封闭2小时。
6)PBS清洗一次后，分别加入识别不同表位的抗体(site II：motavizumab，siteAM22、D25)，室温孵育1小时。
7)用PBS清洗3次。
8)每孔加入100μL Alexa Fluor568(1：2000稀释)(厂家：Thermo；目录号：A-11013)荧光二抗，室温孵育1小时。
9)用PBS清洗3次。
10)每孔加入100μL细胞核染料DAPI(厂家：Invitrogen；目录号：D1306)，染色10分钟。
11)用PBS清洗3次。
12)于高内涵成像系统拍照及定量分析。
图1显示了包含不同连接肽的F蛋白转染293t细胞后，高中和抗体表位site II及site的表达结果。结果显示，包含柔性连接肽LA、LC的F蛋白保留了最高水平的site/>的表达。
实施例2.F蛋白截短体的设计方案
自GenBank数据库获得RSV A2 Fusion蛋白氨基酸序列，Fwt的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。F蛋白截短体的氨基酸序列特征为，F2肽链及F1肽链的N端及C端分别进行截短，并且通过含脯氨酸的柔性连接肽将截短后的F2与F1进行连接，帮助稳固pre-F构象。F1肽链的C末端通过柔性连接肽与不同的展示基座连接。共制备了种突变体，具体如下：
(1)将SEQ ID NO:1的第31位到105位氨基酸与146位到322位氨基酸通过含脯氨酸的柔性连接肽(SEQ ID NO:2)连接，截短后的F蛋白全长314个氨基酸，命名为LC1，其氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。LC1保留了sitesite V、site III及siteII表位。
(2)将SEQ ID NO:1的第51位到105位氨基酸与146位到306位氨基酸通过含脯氨酸的柔性连接肽(SEQ ID NO:2)连接，截短后的F蛋白全长284个氨基酸，命名为LC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。LC2保留了sitesite V及siteII表位。
(3)将SEQ ID NO:1的第56位到105位氨基酸与146位到306位氨基酸通过含脯氨酸的柔性连接肽(SEQ ID NO:2)连接，截短后的F蛋白全长280个氨基酸，命名为LC3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。LC3保留了site及siteII表位。
(4)将SEQ ID NO:1的第51位到105位氨基酸与146位到297位氨基酸通过含脯氨酸的柔性连接肽(SEQ ID NO:2)连接，截短后的F蛋白全长276个氨基酸，命名为LC4，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。LC4保留了site及siteII表位。
(5)将SEQ ID NO:1的第56位到105位氨基酸与146位到297位氨基酸通过含脯氨酸的柔性连接肽(SEQ ID NO:2)连接，截短后的F蛋白全长271个氨基酸，命名为LC5，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。LC5保留了siteII表位。
实施例3.表达F蛋白截短体的重组质粒的构建
通过编码柔性连接肽的核苷酸序列分别将编码5种F蛋白截短体的核苷酸序列与编码F蛋白胞质段(氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)的核苷酸序列进行连接。并且在上述截短体的核苷酸序列的5’端引入编码信号肽(氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)的核苷酸序列。将F蛋白截短体的核苷酸序列提交上海生工生物工程公司进行人源化密码子优化，在5’端及3’端分别引入HindIII及xBaI酶切位点，接入pcDNA3.1真核表达载体，构建含F蛋白截短体目的基因的重组质粒。图2显示了F蛋白截短体LC2的连接示意图。图3显示了AlphaFold2预测的F蛋白截短体的结构示意图。另外按照前述方法构建了处于融合前结构的全长F蛋白SC-TM重组质粒作为对照(SC-TM蛋白的序列获自GenBank：5C6B_F)，交由上海生工合成。测序成功的质粒经质粒大提后进行xBaI单酶切，利用毛细管电泳鉴定单酶切结果，鉴定正确后的质粒通过分光光度计检测OD260及OD280，测定其DNA浓度及纯度，-20℃保存质粒。
实施例4：免疫印迹(Western Blot)法检测重组质粒的表达
1)第一天晚上接种8×105个/孔293T细胞到6孔板中。
2)第二天，当细胞汇合度达到85％时进行质粒转染。取125μL的opti-MEM(厂家：Gibco；目录号：31985-070)培养基于1.5mL离心管中，加入2μg的质粒，4μL的P3000，涡旋震荡混匀，标记为A。再取125μL的opti-MEM培养基于另一个1.5mL离心管中，加入4μL的Lipofectamine3000(厂家：Invitrogen；目录号：L3000015)，涡旋震荡混匀标记为B。将A管加入到B管，涡旋震荡混匀，静置15分钟。之后将溶液加到铺好的293t六孔板中，轻轻摇匀后置于细胞培养箱中培养。
3)第三天，弃掉培养液，加入预冷的PBS清洗细胞两遍。
4)加入150μL的含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解细胞30分钟。
5)12000rpm，4℃离心20分钟后收集上清。
6)使用BCA定量试剂(厂家：PIERCE；目录号：23225)对上清的蛋白浓度进行测定。
7)电泳样品上样量为20μg/孔，样品中加入β巯基乙醇及Loading buffer，100℃热变性10分钟。
8)加入商品化的12％预制胶，180V的电压，电泳40分钟。
9)电泳完成后，用湿转的方法将蛋白转印到NC膜上。
10)用含5％脱脂奶粉的PBS溶液封闭2小时。
11)PBST清洗一遍。
12)人源单克隆抗体Motavizumab用2％脱脂奶粉1：2000稀释，将NC膜转移到稀释好的抗体中，室温摇床孵育2小时。
13)用PBST清洗三次，每次5分钟。
14)用含2％脱脂奶粉的PBS稀释GAH-HRP，将NC膜转移到稀释好的二抗中，室温摇床孵育1h。
15)用PBST清洗三次，每次五分钟。
16)加入底物显色，于WB成像系统检测并拍照。
17)如图4所示，Western Blot分析F蛋白截短体在293t细胞上的表达水平。检测抗体为Motavizumab。图中最左侧通道为180kD的蛋白Marker。SC-TM为对照的融合前F蛋白，LC2为本发明所述的F蛋白截短体。
实施例5.免疫荧光(Immunofluorescence)检测F蛋白截短体的表位完整性
1)第一天晚上接种3×104个/孔293T细胞到96孔板中。
2)第二天，当细胞汇合度达到85％时进行质粒转染。取5μL的opti-MEM培养基于96孔U底板中，加入0.2μg的质粒，0.3μL的P3000，涡旋震荡混匀，标记为A。再取5μL的opti-MEM培养基于96孔U底板中，加入0.3μL的Lipofectamine3000，涡旋震荡混匀标记为B。将A管加入到B管，涡旋震荡混匀，静置15分钟。之后将溶液加到铺好的293t细胞板中，轻轻摇匀后置于细胞培养箱中培养。
3)转染24小时后，加入每孔加入100μL的4％甲醛溶液，室温固定30分钟。
4)弃掉细胞培养液及甲醛溶液，用PBS清洗3次，每次5min。
5)每孔加入100μL含2％脱脂奶粉的PBS，室温封闭2小时。
6)PBS清洗一次后，分别加入识别不同表位的抗体(site II：motavizumab，siteAM22、D25)，室温孵育1小时。
7)用PBS清洗3次。
8)每孔加入100μL Alexa Fluor568(1：2000稀释)(厂家：Thermo；目录号：A-11013)荧光二抗，室温孵育1小时。
9)用PBS清洗3次。
10)每孔加入100μL细胞核染料DAPI(厂家：Invitrogen；目录号：D1306)，染色10分钟。
11)用PBS清洗3次。
12)于高内涵成像系统拍照及定量分析。
如图5所示，免疫荧光展示了全长pre-F蛋白SC-TM，F蛋白截短体LC2的重组质粒转染293t细胞后，高中和抗体表位site II及site的表达。
实施例6.F蛋白截短体mRNA疫苗的构建
按照Andrew J Bett等人发表的文献(PMID:32128257)中记载的方法将RNA转录相关元件构建于含F蛋白截短体LC2及全长pre-F蛋白SC-TM的体外转录质粒，质粒抽提及鉴定如实施例1所述一致。质粒大提后用限制性内切酶BspQ1线性化。用T7体外转录试剂盒(厂家：南京诺唯赞生物科技有限公司；目录号：DD4202)进行转录获得加帽的mRNA。使用DNaseI消化转录模板。使用氯化锂(厂家：Invitrogen；目录号：AM9480)沉淀纯化mRNA。
将纯化后的mRNA溶解于酸性柠檬酸钠缓冲液中待用。脂纳米颗粒LNP的制备：将阳离子脂质：DSPC：胆固醇：DMG-PEG2000按摩尔比为50：10：38.5：1.5在乙醇中溶解、混合。将mRNA与脂质混合溶液分别按照流速比3：1包封。包封完成后，将其透析到PBS溶液中,获得mRNA疫苗。
实施例7.F蛋白截短体mRNA疫苗的免疫
实验用动物的饲养及实验操作均按照厦门大学实验动物使用和管理委员会制定的程序进行。实验动物为购自北京维通利华实验动物技术有限公司的BALB/c雌性小鼠，6-8周龄，饲养于厦门大学实验动物中心。
1)购买的小鼠随机分组，每组4只。按5μg/只单侧大腿股四头肌注射mRNA-LNP，对照组为不含mRNA-LNP的PBS。
2)初次免疫2周后进行二次加强免疫，共免疫两次。
3)加强免疫后14天眼眶采血，分离血清以备分析。
实施例8.血清抗体滴度及分型检测
1)包被用的pre-F蛋白及post-F蛋白的构建方法如下：从GenBank下载pre-F及post-F蛋白的序列(GenBank ID:LY628284.1,GenBank ID:6APB_A)，将编码两种蛋白的核苷酸序列克隆到pcDNA3.1真核表达载体上，利用CHO真核表达体系进行表达，亲和层析纯化获得pre-F蛋白及post-F蛋白。
2)第一天晚上将pre-F蛋白(SC-TM)及post-F蛋白分别用PBS稀释，以100ng/孔的用量包被96孔板，4℃过夜。
3)弃掉包被蛋白液，用PBST洗涤一次。
4)以200μL/孔的用量加入含5％胎牛血清的封闭液，37℃放置2小时。
5)弃掉封闭液，用PBST洗涤一次。
6)以100μL/孔的用量加入梯度稀释的小鼠血清(首孔200倍，5倍梯度)，37℃放置1小时。
7)弃掉血清稀释液，用PBST洗涤五次。
8)以100μL/孔的用量加入1：5000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠的IgG抗体、IgG1抗体及IgG2a抗体(厂家：Abcam；目录号：ab97265)，37℃孵育1小时。
9)弃掉二抗，用PBST洗涤五次。
10)以100μL/孔的用量加入显色液，室温避光显色10分钟。
11)以50μL/孔的用量加入终止液，酶标仪检测450nm条件时的吸光度。
12)终点滴度的判断标准为：阴性孔读值的3倍。
实验结果如图5所示。图5中的A显示了本申请的F蛋白截短体LC2诱导了高水平的pre-F结合抗体滴度，与SC-TM(即，全长pre-F蛋白)相当。图6中的B显示了以mRNA疫苗形式免疫时，诱导了更高水平的IgG2a抗体，表明呈现Th-1偏向性。
实施例9.中和抗体滴度的检测
1)眼眶采血后分离的血清于56℃孵育30分钟灭活补体。2)梯度稀释血清：首孔10倍，4倍梯度共稀释10个梯度。3)加入等体积的rRSV-mkatushka2(MOI＝0.1)，混合后于37℃孵育1小时。4)将血清病毒混合液以100μL/孔的体积转移到铺有单层Hela细胞的96孔板中，37℃孵育。5)培养24小时后，使用SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate Reader读板。
实验结果如图7所示。实验结果显示，与SC-TM(即，全长pre-F蛋白)相比，本申请的F蛋白截短体LC2诱导了显著高于SC-TM的中和抗体滴度。
综上所述，本发明实施例所述的F蛋白截短体，相比于全长的F蛋白，诱导了更高水平的pre-F特异性抗体，且诱导了显著更高的中和抗体滴度。表现出了良好的保护性及安全性，适用于各种形式的疫苗平台，例如核酸疫苗、重组蛋白疫苗、病毒载体疫苗及颗粒化疫苗等。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (44)

1.一种融合蛋白，其包含第一截短体，第二截短体，以及连接所述第一截短体和第二截短体的连接体；其中，
第一截短体与野生的呼吸道合胞病毒(RSV)的F2蛋白相比，在野生的RSV的F2蛋白的N端截短了25个氨基酸，以及C端截短了4个氨基酸；其中，所述第一截短体具有如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；
第二截短体与野生的RSV的F1蛋白相比，在野生的RSV的F1蛋白的N端截短了9个氨基酸，以及C端截短了268个氨基酸；所述第二截短体具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；
其中，所述连接体包含多个甘氨酸以及至少1个脯氨酸。
2.权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述野生的RSV的F2蛋白具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
3.权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述野生的RSV的F1蛋白具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
4.权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述连接体具有如SEQ ID NO:2或23所示的序列。
5.权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述第一截短体位于所述连接体的N端。
6.权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述第二截短体位于所述连接体的C端。
7.权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白从N端至C端依次包含：第一截短体，连接体，第二截短体。
8.权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
9.权利要求1-8任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白还包含：信号肽，和/或膜锚定区。
10.权利要求9所述的融合蛋白，其中，所述信号肽具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
11.权利要求9所述的融合蛋白，其中，所述膜锚定区具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
12.权利要求11所述的融合蛋白，其中，所述信号肽位于第一截短体的N端。
13.权利要求11所述的融合蛋白，其中，所述信号肽通过第一连接肽与第一截短体连接，所述第一连接肽具有SEQ ID NO：18所示的序列。
14.权利要求11所述的融合蛋白，其中，所述膜锚定区位于第二截短体的C端。
15.权利要求11所述的融合蛋白，其中，所述膜锚定区通过第二连接肽与第二截短体连接，所述第二连接肽具有SEQ ID NO：18所示的序列。
16.权利要求11所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白从N端至C端依次包含：信号肽，第一连接肽，第一截短体，连接体，第二截短体，第二连接肽，膜锚定区。
17.权利要求11所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白具有SEQ ID NO：20所示的序列。
18.一种核酸分子，其包含编码权利要求1-17任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列。
19.权利要求18所述的核酸分子，其中，所述核苷酸序列根据宿主细胞的密码子偏好性进行了密码子优化或未进行优化。
20.一种载体，其包含权利要求18或19所述的核酸分子。
21.一种宿主细胞，其包含权利要求1-17任一项所述的融合蛋白或权利要求18或19所述的核酸分子或权利要求20所述的载体。
22.权利要求21所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞选自原核细胞，真核细胞，其中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。
23.权利要求21或22所述的宿主细胞，其中，所述融合蛋白展示在所述宿主细胞的细胞膜的表面。
24.一种表达或产生权利要求1-17任一项所述的融合蛋白的方法，所述方法包括，在允许蛋白质表达的条件下，培养权利要求21-23任一项所述的宿主细胞，以及任选地，回收或纯化所表达的融合蛋白。
25.一种试剂盒，其包含抗原组分，以及能够展示所述抗原组分的载体组分；其中，
所述抗原组分包含(i)权利要求1-17任一项所述的融合蛋白，(ii)权利要求18或19所述的核酸分子，和/或(iii)由权利要求18或19所述的核酸分子转录的mRNA产物；
所述载体组分选自：纳米材料，细菌的外膜囊泡(OMVs)，多聚化基座，病毒样颗粒(VLP)，或其任意组合。
26.权利要求25所述的试剂盒，其中，所述纳米材料选自脂质纳米颗粒、蛋白质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、无机纳米载体和仿生纳米颗粒。
27.权利要求25所述的试剂盒，其中，所述试剂盒中的抗原组分和载体组分单独提供，或形成复合物提供。
28.权利要求25所述的试剂盒，其中，所述抗原组分是单体或多聚体。
29.权利要求25所述的试剂盒，其中，所述抗原组分是二聚体，三聚体，四聚体或五聚体。
30.权利要求25所述的试剂盒，其中，所述试剂盒中的多聚化基座和/或VLP以蛋白或核酸的形式提供。
31.权利要求25所述的试剂盒，其中，所述多聚化基座具有如SEQ ID NO:21或22所示的氨基酸序列。
32.权利要求25所述的试剂盒，其中，所述VLP是由获自RSV，乙型肝炎病毒(HBV)，人乳头瘤病毒(HPV)，或人类免疫缺陷病毒(HIV)的蛋白组装而成。
33.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和/或赋性剂，以及选自下列(1)至(4)的任意一项或多项：
(1)权利要求1-17任一项所述的融合蛋白；
(2)权利要求18或19所述的核酸分子；
(3)权利要求20所述的载体；
(4)权利要求21-23任一项所述的宿主细胞。
34.一种疫苗，其包含权利要求1-17任一项所述的融合蛋白，或权利要求18或19所述的核酸分子，或由权利要求18或19所述的核酸分子转录的mRNA产物，或权利要求20所述的载体。
35.权利要求34所述的疫苗，其中，所述疫苗由权利要求25-32所述的试剂盒制备而成。
36.权利要求34或35所述的疫苗，其中，所述疫苗还包含佐剂。
37.一种筛选能够抑制RSV感染细胞的候选药物的方法，所述方法包括，在将权利要求1-17任一项所述的融合蛋白，或权利要求20所述的载体，或权利要求33所述的药物组合物，或权利要求34-36任一项所述的疫苗与宿主细胞接触之前、同时或之后，将所述宿主细胞与所述候选药物接触。
38.权利要求1-17任一项所述的融合蛋白，或权利要求18或19所述的核酸分子，或权利要求20所述的载体，或权利要求21-23任一项所述的宿主细胞，或权利要求33所述的药物组合物，或权利要求34-36任一项所述的疫苗在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诱导受试者对RSV的免疫应答。
39.权利要求38所述的用途，其中，所述免疫应答包括诱导受试者产生针对RSV的抗体。
40.权利要求39所述的用途，其中，所述抗体为中和抗体。
41.权利要求38所述的用途，其中，所述受试者为哺乳动物。
42.权利要求1-17任一项所述的融合蛋白，或权利要求18或19所述的核酸分子，或权利要求20所述的载体，或权利要求21-23任一项所述的宿主细胞，或权利要求33所述的药物组合物，或权利要求34-36任一项所述的疫苗在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于预防和/或治疗受试者的RSV感染或由RSV感染所引起的疾病和/或症状。
43.权利要求42所述的用途，其中，所述受试者为小鼠或人。
44.权利要求42所述的用途，其中，所述由RSV感染所引起的疾病和症状选自细支气管炎，肺炎，哮喘，阻塞性肺病和心肺并发症。
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