CN114805561A - 针对呼吸道合胞病毒的蛋白结合分子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种针对RSV的蛋白结合分子，还涉及针对RSV F蛋白的单域抗体在预防和治疗RSV相关疾病中的应用。所述单域抗体对于RSV病毒具有比目前上市药更好的中和抑制效果。

Description

针对呼吸道合胞病毒的蛋白结合分子

本申请为申请号为202010743933.5的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及医药生物领域，具体地说涉及一种单域抗体及其衍生蛋白。

本发明还涉及上述抗体及蛋白的用途。

背景技术

呼吸道合胞病毒(简称“RSV”)属于副粘病毒科肺病毒属，是一种有包膜的单股负链RNA病毒。RSV病毒感染导致细胞病变最主要的特征是病毒合胞体的形成。

RSV具有两种主要膜糖蛋白,G蛋白和F蛋白，G蛋白是介导病毒结合细胞表面的附着蛋白，F蛋白介导病毒和宿主细胞膜的融合，让病毒核壳体进入细胞质并开始病毒的复制。F蛋白是高度保守并形成三聚体刺突，其在激活下发生构象变化。针对F蛋白的抗体可以抑制其介导的感染周期的起始阶段并中和病毒的感染性从而保护人体免受RSV感染。

RSV是引起婴儿和幼童严重下呼吸道感染包括细支气管炎(bronchiolitis)和肺炎(pneumonia)的主要病原体，并在冬季月份期间引发年度流行病。该病毒还在老年人中引发实质性疾病负担，患心肺病症和免疫抑制疾病的成人也有RSV重症感染的危险，而且针对RSV病毒免疫反应并不能预防重复感染。

目前世界范围内没有疫苗可用于预防RSV感染引起的相关疾病，市场上唯一的药物产品是针对F蛋白的人源化的单克隆抗体

它通过与呼吸道合胞病毒融合蛋白结合而阻止病毒向下呼吸道扩散。目前该药只在患严重RSV感染极高风险的儿童中预防性地使用，这种限制性应用至少部分地归因于这种产品的高成本。因而发展一种成本低且可以特异性地预防或治疗RSV感染相关疾病的抗体药物是当务之急。

单域抗体(single domain antibody，sdAb)，又称纳米抗体(nanobody)，仅有一个重链可变区结构域(VHH)。该结构域最初发现于骆驼科动物和鲨鱼的血清中分离出的一种重链抗体(heavy chain antibody，hcAb)，通过基因手段，扩增出其中的VHH片段。VHH是目前己知的可结合目标抗原的最小单位。单域抗体具有结构简单，亲和力及稳定性高，组织渗透力强和免疫原性低等一系列优点，是抗体药物领域里的最新技术。目前，应用单域抗体技术来解决病毒感染类疾病已成为国内外科学家的共识。

发明内容

本发明的一个目的是提供针对呼吸道合胞病毒(RSV)的蛋白结合分子(RSVF蛋白结合分子)。

本发明的第二个目的是提供一种分离的核苷酸，其编码上述RSVF蛋白结合分子。

本发明的第三个目的是提供含有上述RSVF的蛋白结合分子的药物组合物。

本发明的第四个目的是提供上述RSVF蛋白结合分子的用途。

根据本发明的一方面，利用单个B细胞单域抗体快速筛选技术筛选得到的具有高特异性、高亲和力和高稳定性的针对呼吸道合胞病毒的蛋白结合分子。所述蛋白结合分子针对RSV的F蛋白，所述RSV F蛋白结合分子为包含一免疫球蛋白单一可变结构域的抗体，与现有技术的氨基酸序列和抗体相比，具有更好的针对RSV病毒的中和抑制功能。具体的技术方案为：

通过基因合成的方法优化抗原F蛋白(SEQ ID NO.1)，并按照人的密码子偏好性进行密码子优化，合成优化的F蛋白基因(SEQ ID NO.2)，并亚克隆至真核表达载体中，瞬时转染293F细胞后再表达纯化获得抗原F蛋白。用抗原F蛋白免疫羊驼，采集羊驼外周血分离出外周血单个核细胞(PBMC)，使用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)偶联的RSV F蛋白以及647-Anti-Camelid VHH抗体同时孵育PBMC进行流式分选,筛选出表达针对F蛋白的单域抗体的单个B细胞并克隆单个B细胞的抗体序列，再表达纯化验证，最终获得抗RSV的单域抗体及其序列。

本发明提供了RSV F蛋白结合分子，其包含至少一个能够特异性结合RSV F蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域。在一些实施方案中，所述RSV F蛋白结合分子仅包含一个特异性结合RSV F蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域。在一些实施方案中，所述RSV F蛋白结合分子包含两个或更多个特异性结合RSV F蛋白的VHH。

在一些实施方案中，所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3：

(1)如SEQ ID NO.4所示的CDR1，如SEQ ID NO.5所示的CDR2和如SEQ ID NO.6所示的CDR3；(HB10)

(2)如SEQ ID NO.9所示的CDR1，如SEQ ID NO.10所示的CDR2和如SEQ ID NO.11所示的CDR3；(HC12)

(3)如SEQ ID NO.14所示的CDR1，如SEQ ID NO.15所示的CDR2和如SEQ ID NO.16所示的CDR3；(HB1)

(4)如SEQ ID NO.19所示的CDR1，如SEQ ID NO.20所示的CDR2和如SEQ ID NO.21所示的CDR3；(HF8)

(5)如SEQ ID NO.24所示的CDR1，如SEQ ID NO.25所示的CDR2和如SEQ ID NO.26所示的CDR3；(HG3)

(6)如SEQ ID NO.29所示的CDR1，如SEQ ID NO.30所示的CDR2和如SEQ ID NO.31所示的CDR3；(HG10)

(7)如SEQ ID NO.34所示的CDR1，如SEQ ID NO.35所示的CDR2和如SEQ ID NO.36所示的CDR3；(HA6)和

(8)如SEQ ID NO.39所示的CDR1，如SEQ ID NO.40所示的CDR2和如SEQ ID NO.41所示的CDR3(HH9)。

根据本发明的优选实施方式，本发明所述的针对RSV F的蛋白结合分子包括选自具有下述氨基酸序列的氨基酸：

(a)如SEQ ID NO.3所示的氨基酸；(HB10)

(ii)如SEQ ID NO.8所示的氨基酸；(HC12)

(iii)如SEQ ID NO.13所示的氨基酸；(HB1)

(iv)如SEQ ID NO.18所示的氨基酸；(HF8)

(v)如SEQ ID NO.23所示的氨基酸；(HG3)

(vi)如SEQ ID NO.28所示的氨基酸；(HG10)

(vii)如SEQ ID NO.33所示的氨基酸；(HA6)和

(viii)如SEQ ID NO.38所示的氨基酸。(HH9)

根据本发明的优选实施方式，一种分离的核苷酸，其编码上述RSV F的蛋白结合分子，其核苷酸序列为：

(a)如SEQ ID NO.7所示的核苷酸；(HB10)

(b)如SEQ ID NO.12所示的核苷酸；(HC12)

(c)如SEQ ID NO.17所示的核苷酸；(HB1)

(d)如SEQ ID NO.22所示的核苷酸；(HF8)

(e)如SEQ ID NO.27所示的核苷酸；(HG3)

(f)如SEQ ID NO.32所示的核苷酸；(HG10)

(g)如SEQ ID NO.37所示的核苷酸；(HA6)或

(h)如SEQ ID NO.42所示的核苷酸。(HH9)

本发明也涉及含有上述核苷酸的表达载体和宿主细胞，所述表达载体和宿主细胞可以用于表达和制备本发明的单域抗体。

本发明至少提供了八个针对RSV F蛋白的单域抗体，其CDR序列，氨基酸序列和核苷酸序列如表2所列，所述抗体均可以与RSV的F蛋白特异性结合。

本发明也提供所述RSV F蛋白结合分子的衍生蛋白，这些衍生蛋白包括：与本发明所述的CDR1-3的序列同源性高的序列，也可以得到特异性针对F蛋白的单域抗体。在一些实施例中，与所述抗体(1)-(8)中的序列具有“至少80％同源性”的序列，或者“至少85％同源性”、“至少90％同源性”、“至少95％同源性”、“至少98％同源性”的序列都可以实现本发明目的，也即本发明所述的衍生蛋白的范畴。

本发明所述的蛋白结合分子包括抗体，其单体，或者多个单体连接，或者和其它的蛋白连接形成的组合物。也包括各种变体，例如：在其可变结构域的一个或多个CDR的N-糖基化位点处包含一个或多个突变，所得去糖基化的抗体保持与亲本非去糖基化抗体相同的功能。

在一些实施方案中，本发明的RSV F蛋白结合分子中的至少一个免疫球蛋白单一可变结构域是VHH。在另一些实施方案中，这些VHH是人源化的VHH，所述人源化的VHH包含与SEQ ID NO:43-53中任一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列。或者，所述VHH的氨基酸序列与SEQ ID NO:43-53中任一相比包含一或多个氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，本发明的RSV F蛋白结合分子是经过亲和力成熟获得的。经亲和力成熟的RSV F蛋白结合分子可以在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致对RSV F蛋白的亲和力相比于亲本RSV F蛋白结合分子有所增加。

在一些实施方案中，本发明的RSV F蛋白结合分子，除了至少一个能够特异性结合RSV F蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域外，还包含免疫球蛋白Fc区。在本发明的RSV F蛋白结合分子中包含免疫球蛋白Fc区可以使所述结合分子形成二聚体，同时延长所述分子的体内半衰期。可用于本发明的Fc区,可以来自不同亚型的免疫球蛋白，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM。

在一些实施方案中，Fc序列上可以引入突变，从而使得突变的Fc更容易形成同二聚体或者异二聚体。如Ridgway,Presta et al.1996以及Carter 2001中提到的利用Fc接触界面氨基酸侧链基团空间作用的knob-hole模型，使得不同Fc突变之间更容易形成异二聚体；再比如如CN 102558355A或者CN 103388013A中，通过改变Fc接触界面氨基酸所带的电荷，进而改变Fc接触界面之间的离子相互作用力，使得不同的Fc突变对之间更容易形成异二聚体(CN102558355A)，亦或是具有相同突变的Fc之间更容易形成同二聚体(CN103388013A)。

所述免疫球蛋白Fc区优选是人免疫球蛋白Fc区，更优选是人IgG1的Fc区。在一些具体实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列示于SEQ ID NO:65，核苷酸序列如SEQID NO.66所示。

在一些具体的实施方案中，本发明的RSV F蛋白结合分子为在表2和表4中所示的具体的抗体与人免疫球蛋白Fc区结合形成的分子。

在另一方面，本发明的RSV F蛋白结合分子还涵盖能够与由本发明中任一的氨基酸序列组成的VHH结合RSV F蛋白上的相同表位的抗RSV F蛋白抗体分子。

本发明的所述RSV F蛋白结合分子结合RSV F蛋白的KD值可以小于1×10^-7M，优选小于1×10^-8M、更优选小于1×10^-9M、更优选小于1×10^-10M、尤其更优选小于1×10^-11M。

本发明的RSV F蛋白结合分子能够抑制RSV生长至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，更优选至少约99％。

此外，本发明的RSV F蛋白结合分子对碱处理和氧化处理具有抗性。例如，强碱(如500mM碳酸氢铵)处理约8小时、优选约16小时、更优选约24小时或更优选约32小时后，本发明的RSV F蛋白结合分子活性保持不变。或者，氧化剂(1％双氧水)处理约2小时、优选约4小时或更优选约8小时后，本发明的RSV F蛋白结合分子活性保持不变。

此外，本发明的RSV F蛋白结合分子具有在高浓度下的稳定性。例如，在约100mg/ml、更优选约150mg/ml、更优选约200mg/ml或更优选约250mg/ml的浓度下，本发明的RSV F蛋白结合分子保持稳定而不出现聚集。

药物组合物

另一方面，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体配制在一起的一种或组合的本发明的RSV F蛋白结合分子。这样的组合物可以包含一种或组合的(例如两种或多种不同的)本发明的RSV F蛋白结合分子或免疫缀合物。例如，本发明的药物组合物可以含有结合靶抗原上的不同表位的抗体分子组合。

根据本发明的再一方面，本发明也包括上述RSV F蛋白结合分子的用途，所述用途包括制药用途，即可将上述抗体或衍生物用于制备预防和/或治疗与RSV感染相关疾病的药物。所述用途也可以包括将所述抗体用于检测与RSV感染相关疾病的检测试剂。

本发明制备和筛选了针对RSV的单域抗体，目前的细胞药效学已经证实该单域抗体对于RSV病毒具有比上市药

更好的中和抑制效果。

附图说明

图1显示FITC蛋白和647双阳性的单个细胞

横坐标表示FITC-F蛋白，纵坐标表示APC-Anti-Camelid VHH抗体，P3的范围中的细胞指的是抗体检测双阳性的单个B细胞。

图2为单个B细胞抗体序列的克隆凝胶电泳图；

其中图2A为S190116号板；图2B为S190117号板。

图3为S190116和S190117号板序列相似性结果；

图4为构建的F蛋白单域抗体表达后FACS检测；

图5显示S190116板抗体的K562-native F protein稳转细胞流式荧光值；

图6显示S190116板抗体的K562细胞株流式荧光值：

图7为S190117板构建的F蛋白单域抗体表达FACS检测；

图8显示S190117板抗体的K562-native F protein稳转细胞流式荧光值；

图9显示S190117板抗体的K562细胞株流式荧光值；

图10显示pDonor-CMV-F protein-puro质粒结构；

图11显示抗RSV F蛋白单域抗体中和抑制RSV病毒的作用；

其中(a)正常HEP-2细胞(b)RSV感染细胞+抗RSV F蛋白单域抗体

(c)RSV感染细胞(d)RSV感染细胞+溶媒对照

图12为表达载体Lenti-hIgG1-Fc2示意图；

图13为人源化F蛋白单域抗体表达后FACS检测；

图14为流式细胞仪检测人源化后抗体与重组细胞K562-native F protein细胞膜表面的抗原结合情况；

图15为流式细胞仪检测人源化后抗体与K562细胞的结合情况；

图16为双价抗体的表达纯化SDS-PAGE检测。

具体实施方式

定义

除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如Sambrook等人,“MolecularCloning:ALaboratory Manual”(第2版),第1-3卷,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)；Lewin,“Genes IV”，Oxford University Press,New York,(1990)；及Roitt等人,“Immunology”(第2版),Gower Medical Publishing,London,New York(1989)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。

除非另有说明，否则可互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中无论是指重链抗体还是指常规4链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合结构域或片段，分别例如VHH结构域或VH/VL结构域)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。

如本文所用，术语(多肽或蛋白的)“结构域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，结构域负责蛋白的单个的功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或结构域的功能。

如本文所用的术语“免疫球蛋白结构域”是指抗体链(例如常规4链抗体的链或重链抗体的链)的球形区域，或是指基本上由这类球形区域组成的多肽。免疫球蛋白结构域的特征在于其维持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，其由排列在两个β折叠中任选由保守二硫键稳定的约7个反平行β折叠股的2层夹层组成。

如本文所用的术语“免疫球蛋白可变结构域”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白结构域，其中所述框架区由本领域及下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔开。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变结构域因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。

如本文所用的术语“免疫球蛋白单一可变结构域”是指能够在不与其他免疫球蛋白可变结构域配对的情况下特异性结合抗原表位的免疫球蛋白可变结构域。本发明含义中的免疫球蛋白单一可变结构域的一个实例为“结构域抗体”，例如免疫球蛋白单一可变结构域VH及VL(VH结构域及VL结构域)。免疫球蛋白单一可变结构域的另一实例为如下文定义的骆驼科的“VHH结构域”(或简称为“VHH”)。

“VHH结构域”，亦称为重链单域抗体、VHH、VHH结构域、VHH抗体片段和VHH抗体，是称为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白的可变结构域(Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,SongaEB,BendahmanN,Hamers R.:“Naturally occurring antibodies devoid of lightchains”；Nature363,446-448(1993))。使用术语“VHH结构域”以将所述可变结构域与存在于常规4链抗体中的重链可变结构域(其在本文中称为“VH结构域”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变结构域(其在本文中称为“VL结构域”)进行区分。VHH结构域特异性结合表位而无需其他抗原结合结构域(此与常规4链抗体中的VH或VL结构域相反，在该情况下表位由VL结构域与VH结构域一起识别)。VHH结构域为由单一免疫球蛋白结构域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。

在本发明的上下文中，术语“重链单域抗体”、“VHH结构域”、“VHH”、“VHH结构域”、“VHH抗体片段”、“VHH抗体”以及

及

结构域”(“Nanobody”为Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商标)可互换使用。

例如Riechmann及Muyldermans,J.Immunol.Methods 231,25-38(1999)的图2中所示，对于骆驼科的VHH结构域所应用的氨基酸残基，根据Kabat等人给出的VH结构域的一般编号法来编号(“Sequence of proteins of immunological interest”,US PublicHealthServices,NIH Bethesda,MD,公开案第91号)。根据该编号法，

-FR1包含在位置1-30处的氨基酸残基，

-CDR1包含在位置31-35处的氨基酸残基，

-FR2包含在位置36-49处的氨基酸，

-CDR2包含在位置50-65处的氨基酸残基，

-FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，

-CDR3包含在位置95-102处的氨基酸残基，且

-FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。

然而应注意，如本领域中对于VH结构域及VHH结构域所公知的，各CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即根据Kabat编号的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat编号所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据Kabat的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。

本领域中已知对VH结构域的氨基酸残基进行编号的替代方法，所述替代方法还可以类似地应用于VHH结构域。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将遵循如上所述的根据Kabat且适于VHH结构域的编号。

VHH结构域中的氨基酸残基的总数将通常在110至120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意较小及较长序列也可适于本文所述的目的。

VHH结构域及含有其的多肽的其他结构特性及功能性质可总结如下：

VHH结构域(其已经天然“设计”以在不存在轻链可变结构域且不与轻链可变结构域相互作用的情况下与抗原功能性结合)可用作单一且相对较小的功能性抗原结合结构单元、结构域或多肽。此区分VHH结构域与常规4链抗体的VH及VL结构域，这些VH及VL结构域自身通常不适于作为单一抗原结合蛋白或免疫球蛋白单一可变结构域进行实际应用，但需要以某种形式或另一形式组合以提供功能性抗原结合单元(如以诸如Fab片段等常规抗体片段的形式；或以由与VL结构域共价连接的VH结构域组成的scFv的形式)。

由于这些独特性质，使用VHH结构域—单独或作为较大多肽的一部分—提供许多优于使用常规VH及VL结构域、scFv或常规抗体片段(例如Fab-或F(ab’)2-片段)的显著优势：

-仅需要单一结构域以高亲和力及高选择性结合抗原，从而使得既不需要存在两个单独结构域，也不需要确保该两个结构域以适当空间构象及构型存在(例如scFv一般需要使用经特别设计的接头)；

-VHH结构域可自单一基因表达且不需要翻译后折叠或修饰；

-VHH结构域可容易地改造成多价及多特异性格式(格式化)；

-VHH结构域高度可溶且无聚集趋势；

-VHH结构域对热、pH、蛋白酶及其他变性剂或条件高度稳定，且因此可在制备、储存或运输中不使用冷冻设备，从而达成节约成本、时间及环境；

-VHH结构域易于制备且相对廉价，甚至在生产所需的规模上亦如此；

-VHH结构域与常规4链抗体及其抗原结合片段相比相对较小(大约15kDa或大小为常规IgG的1/10)，因此相比于常规4链抗体及其抗原结合片段，显示较高的组织渗透性且可以较高剂量给药；

-VHH结构域可显示所谓腔结合性质(尤其由于与常规VH结构域相比其延长的CDR3环)，从而可到达常规4链抗体及其抗原结合片段不可到达的靶及表位。

获得结合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已公开于以下文献中：R.vanderLinden et al.,Journal of Immunological Methods,240(2000)185–195；Lietal.,JBiol Chem.,287(2012)13713–13721；Deffar et al.,African Journal ofBiotechnologyVol.8(12),pp.2645-2652,17June,2009和WO94/04678。

源自骆驼科的VHH结构域可通过以人常规4链抗体VH结构域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换原始VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基而经“人源化”(本文中亦称为“序列优化”，除人源化外，“序列优化”也可涵盖通过提供VHH改良性质的一个或多个突变对序列进行的其他修饰，例如移除潜在的翻译后修饰位点)。人源化VHH结构域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一具体实施方案中，可含IGHV3的人框架区序列。

如本文所用，术语“结构域抗体”(亦称为“Dab”及“dAb”)特别用于指代非骆驼科哺乳动物的抗体(特别是人4链抗体)的VH或VL结构域。为了以单一抗原结合结构域的形式(即在不与VL域或VH域分别配对的情况下)结合表位，需要例如通过使用人单一VH或VL结构域序列的文库对所述抗原结合性质进行具体选择。

与VHH一样，结构域抗体的分子量为约13kDa至约16kDa，且若源自完全人序列，则不需要进行人源化以供例如人治疗使用。正如在VHH结构域的情况下，结构域抗体在原核表达系统中也很好地得以表达，从而显著降低总制造成本。

“结构域抗体”已公开于例如以下文献中：Ward,E.S.,等人:“Bindingactivitiesof arepertoire of single immunoglobulin variable domains secretedfromEscherichia coli”；Nature341:544-546(1989)；Holt,L.J.等人:“Domainantibodies:proteins for therapy”；TRENDS in Biotechnology 21(11):484-490(2003)。

此外，本领域技术人员还将了解，有可能将一个或多个上述CDR“移植”于其他“支架”(包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架)上。适于所述CDR移植的支架及技术在本领域中是已知的。

如本文所用，术语“表位”或可互换使用的术语“抗原决定簇”指抗体的互补位所结合的抗原上的任何抗原决定簇。抗原决定簇通常包含分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性”表位或“构象”表位。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in MethodsinMolecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。

可使用本领域中熟知的许多表位定位技术鉴别给定抗原的表位。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。举例而言，线性表位可通过例如以下方法来确定：在固体支持物上同时合成大量肽，其中这些肽对应于蛋白质分子的各部分，且使这些肽在仍然与支持物连接的情况下与抗体反应。这些技术在本领域中为已知的且描述于例如美国专利第4,708,871号；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3998-4002；Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715中。类似地，构象表位可通过诸如通过例如x射线结晶学及2维核磁共振确定氨基酸的空间构形加以鉴别。参见例如Epitope Mapping Protocols(同上)。

可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请WO03/48731中。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得与本发明的抗体分子竞争结合RSVF蛋白上的相同表位的抗体及其抗原结合片段。

一般而言，术语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的免疫球蛋白单一可变结构域)分子可结合的不同类型抗原或表位的数目。可基于抗原结合分子的亲和力和/或亲合力确定其特异性。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(KD)所表示的亲和力，是表位与抗原结合蛋白上抗原结合位点之间结合强度的量度：KD值越小，表位与抗原结合分子之间的结合强度越强(或者，亲和力也可表示为缔合常数(KA)，其为1/KD)。如本领域技术人员将了解，取决于具体感兴趣的抗原，可以以已知方式测定亲和力。亲合力为抗原结合分子(例如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变结构域或含有其的多肽)与相关抗原之间结合强度的量度。亲合力与以下两者有关：与其抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力，以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数目。

如本文所用，术语“RSV F蛋白结合分子”意指任何能够特异性结合RSV F蛋白的分子。RSV F蛋白结合分子可以包括针对RSV F蛋白的如本文定义的抗体或其缀合物。RSV F蛋白结合分子还涵盖所谓的“SMIP”(“小模块免疫药物”)，或者免疫球蛋白超家族抗体(IgSF)或CDR移植分子。

“RSVF蛋白结合分子”或者可以指结合RSV的F蛋白的单价分子(即与RSV的F蛋白的一个表位结合的分子)，以及二价或多价结合分子(即结合一个以上表位的结合分子)。本发明的“RSV F蛋白结合分子”可以包含至少一个结合RSV F蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域如VHH。在一些实施方案中，本发明的“RSV F蛋白结合分子”可以包含两个结合RSV F蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域如VHH。含有一个以上的免疫球蛋白单一可变结构域的RSV F蛋白结合分子亦称为“格式化的”RSV F蛋白结合分子。格式化的RSV F蛋白结合分子除结合RSV F蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域外也可包含接头和/或具有效应器功能的部分，例如半衰期延长部分(如结合血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域)、和/或融合配偶体(如血清白蛋白)和/或缀合的聚合物(如PEG)和/或Fc区。在一些实施方案中，本发明的“RSVF蛋白结合分子”还涵盖双特异性抗体，其含有结合不同抗原的免疫球蛋白单一可变结构域。

通常，本发明的RSV F蛋白结合分子将以如于Biacore或KinExA测定中测量的优选10^-7至10^-11摩尔/升(M)、更优选10^-8至10^-11摩尔/升、甚至更优选10^-9至10^-11、甚至更优选10^-10至10^-11或更低的解离常数(KD)，和/或以至少10 ⁷M^-1、优选至少10⁸M^-1、更优选至少10⁹M^-1，更优选至少10¹⁰M^-1、例如至少10¹¹M^-1的缔合常数(KA)结合所要结合的抗原(即RSV F蛋白)。任何大于10^-4M的KD值一般都视为指示非特异性结合。抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以以已知的任何适合方式来测定，包括例如本文所述的表面等离子体共振术(SPR)测定、Scatchard测定和/或竞争性结合测定(例如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)及夹心式竞争性测定。

氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或一字母氨基酸编码加以表示。在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与另一序列相比，在参考序列某一位置处指定数目氨基酸残基的插入、缺失或取代。在取代的情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物性质影响较小或基本上无影响。所述保守氨基酸取代在本领域中是公知的，例如保守氨基酸取代优选是以下组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一组内的另一氨基酸残基所取代：(i)较小脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)极性带正电残基：His、Arg及Lys；(iv)较大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。

两个多肽序列之间的“序列相同性”指示序列之间相同氨基酸的百分比。“序列相似性”指示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。对于序列相同性的确定，可以参见例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,OxfordUniversity Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysisof SequenceData,Part I,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.,Humana Press,NewJersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987和Sequence AnalysisPrimer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.,MStockton Press,NewYork,1991。

相比于其天然生物来源和/或获得该多肽或核酸分子的反应介质或培养基，当其已与至少一种在该来源或介质(培养基)中通常与之相关的其他组分(例如另一蛋白/多肽、另一核酸、另一生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)分离时，多肽或核酸分子视为“基本上分离的”。特别地，多肽或核酸分子在其已纯化至少2倍、特别是至少10倍、更特别是至少100倍且多达1000倍或1000倍以上时被视为“基本上分离的”。经适合的技术(例如适合色谱技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定，“基本上分离的”多肽或核酸分子优选基本上为均质的。

“亲和力成熟”的抗RSV F蛋白抗体，特别是VHH或结构域抗体，在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致对RSV F蛋白的亲和力相比于其各自的亲本抗RSV F蛋白抗体有所增加。亲和力成熟的抗RSV F蛋白抗体可通过例如由以下所述的本领域中已知的方法来制备：Marks等人,1992,Biotechnology 10:779-783或Barbas等人,1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813.；Shier等人,1995,Gene 169:147-155；Yelton等人,1995,Immunol.155:1994-2004；Jackson等人,1995,J.Immunol.154(7):3310-9；及Hawkins等人,1992,J.MoI.Biol.226(3):889896；KS Johnson及RE Hawkins,“Affinitymaturation of antibodies using phage display”,Oxford UniversityPress 1996。

如本文所用的术语“对象”意指哺乳动物，尤其灵长类动物，尤其是人。

本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即抗体分子、免疫缀合物包裹于一种材料中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。

这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。常规介质或试剂，除了任何与活性化合物不相容的范围外，都可能在本发明的药物组合物中。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。

治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。

通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。

可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量根据所治疗的对象和特定给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分，与药学上可接受的载体相组合。

可以调节剂量方案以提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一推注，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的对象的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。

对于抗体分子的给药而言，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至20mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重，10mg/kg体重或20mg/kg体重，或在1-20mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、每3-6个月一次、或起始给药间隔略短(如每周一次至每三周一次)后期给药间隔加长(如每月一次至每3-6个月一次)。

或者，抗体分子也可以作为持续释放制剂来给药，在此情况中需要频率较低的给药。剂量和频率根据抗体分子在患者中的半衰期而不同。通常，人抗体表现出最长的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给药剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时间内以较不频繁的间隔给予相对较低的剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要以较短的间隔给予较高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选直到患者表现为疾病症状部分或完全改善。之后，可以以预防性方案给患者给药。

本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。

本发明的RSV F蛋白结合分子的“治疗有效量”优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于RSV相关疾病的治疗，相对于未接受治疗的对象，“治疗有效量”优选地将病毒生长抑制至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，更优选至少约99％。抑制病毒生长的能力可以在预测对抑制RSV的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查抑制RSV生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。治疗有效量的治疗性缓解对象的症状。本领域技术人员可以根据如下因素确定这种量，如对象的大小、对象症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。

本发明的组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。本发明RSVF蛋白结合分子的优选给药途径包括雾化吸入、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如注射或雾化吸入。

疾病预防和治疗

本发明提供了本发明所述RSV F蛋白结合分子、核酸分子、宿主细胞、免疫缀合物及药物组合物在预防和/或治疗RSV感染的相关的疾病中用途和方法。本发明的一方面提供一种预防和/或治疗对象中的RSV感染性疾病的方法，包括给该对象施用本发明的RSV F蛋白结合分子，使得所述对象的RSV感染性疾病得到预防和/或治疗。

试剂盒

本发明的范围内还包括试剂盒，该试剂盒包括本发明的RSV F蛋白结合分子、免疫缀合物或药物组合物，以及使用说明。该试剂盒可以进一步包括至少一种另外的试剂或一种或多种另外的本发明的RSV F蛋白结合分子(例如，结合RSV F蛋白不同表位的的结合分子)。试剂盒一般包括表明试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。

实施例

以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。

以下实施例中所使用的表达载体pcDNA3.1购自Invitrogen公司，细胞系包括293F细胞，293F-SVP16细胞，K562细胞，HEP-2细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并按照相应的说明进行培养。

以下实施例中使用的阳性对照抗体为Palivizumab

(购自塞迈生物，规格：100mL/支，批号NDC60574-4113-1)。

【实施例1】：针对RSV F蛋白的单域抗体的筛选

1.1文库的构建(针对F蛋白的单个B细胞筛选)：

免疫用的RSV F蛋白由293F细胞表达(表达载体pcDNA3.1-Neoless，按照常规方法制备，经对照抗体Palivizumab磁珠亲和层析纯化得到RSV F蛋白。选取一只美洲无峰驼(alpaca)进行免疫。4次免疫结束后，提取骆驼50mL外周血的淋巴细胞，使用淋巴细胞分离液分选外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),将PBMC分为两份，第一份作为阴性对照，第二份细胞中加入异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)偶联的RSV F蛋白以及647-Anti-Camelid VHH抗体(金斯瑞，Cat#A01994)。冰上避光孵育1小时,4℃离心5分钟，去除含有抗体的上清，再使用预冷的PBS清洗3次后，加入500uL预冷的PBS缓冲液重悬细胞沉淀，采用分选流式细胞仪，分选出FITC和647荧光双阳性的单个B细胞至已加入细胞裂解液的96孔反应板，用于单域抗体的克隆。结果如图1所示，横坐标表示FITC-F蛋白，纵坐标表示APC-Anti-Camelid VHH抗体，P3的范围中的细胞指的是抗体检测双阳性的单个B细胞。1.2单个B细胞裂解产物的逆转录

配置逆转录试剂(无核酸水，IGEPAL(10％)，Random primers(300ng/uL)RNA酶抑制剂(40U/uL)，逆转录酶(200U/uL)，5×逆转录buffer，DL-DTT(100mM)，25mM DNTP，RNA酶抑制剂(40U/uL)加入到上述裂解后的FITC和647双阳性的单个B细胞中，进行PCR对RNA反转录成cDNA。PCR反应结束后，向每孔内加入10uL无菌超纯水对cDNA样本进行稀释；1.3单个B细胞抗体序列的克隆

配置VHH筛选反应体系(Ex Taq HS，10×Buffer，dNTP(25mM)，1st 5′forwardprimer mix(10μM)，1st 3′reverse primer mix(10μM))，加入适当的上述cDNA产物进行VHH的序列筛选,反应结束后，使用1％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，分离400bp左右的目的片段，进行测序分析。结果如图2所示。

【实施例2】：针对RSV F的单域抗体的初步评价鉴定

2.1单域抗体的表达载体的构建和表达

将测序分析所获得42株单域抗体的编码序列进行相似性分析(如图3所示)，选取其中33株进行基因合成，与human IgG1Fc串联亚克隆至表达载体Lenti-hIgG1-Fc2(购于addgene公司)中进行培养，采用Qiagen质粒提取质粒并测序验证。取出PBS缓冲液，温热至室温。取500μlPBS至24孔板的一个孔，加入表达载体Lenti-hIgG1-Fc2和LVTransm(Lipofectamine2000和Lipofectamine3000)立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟后。转到1.5mL293F-SVP16细胞(ATCC)中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱，130RPM培养6～8小时后，加入1.5mL新鲜的FreeStyle^TM293培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。连续培养3天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中。

2.2单域抗体的表达纯化

取出PBS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入上述的表达载体Lenti-hIgG1-Fc2和LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟后。转到50mL293F-SVP16细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱，130RPM培养6～8小时后，加入50mL新鲜的FreeStyle^TM293培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化得到抗体。

2.3检测候选抗RSV F蛋白单域抗体对RSV F蛋白的特异性结合

使用无菌PBS稀释RSV F重组蛋白至终浓度为5ug/mL。取一块新的96孔板，加入100uL/孔，4℃包被过夜；

使用PBST(PBS中含有0.05％吐温20)洗涤3次，以洗掉包被液；加入200uL/孔的3％BSA 37℃封闭2小时；使用PBST洗涤孔板3次，以洗掉封闭缓冲液后；加入100ul稀释的抗RSVF蛋白单域抗体(1ug/ml)，室温孵育1小时，对照孔为PBS；并使用PBST洗涤3次，以洗掉孔内的液体；再加入100uL HRP-Protein A(1:10000稀释)，室温孵育1小时；使用PBST洗涤孔板3次，以洗掉孔内的液体后；

加入100uL/孔TMB显色液，室温避光孵育15分钟；加入50uL/孔终止液，使用酶标仪读取孔内的OD值。其中当对RSV F蛋白的OD值除以空白对照(PBS)OD值的比值>＝4时，判断候选抗体能结合RSV F蛋白；同时上述能结合RSV F抗原蛋白的候选抗体，其结合RSV F的OD值除以阳性对照抗体Palivizumab的OD值，比值>＝0.7时，则认为该候选抗体能特异性结合RSV F部分，结果如表1所示。

S190116:

S190117:

2.4通过FACS考察抗RSV F蛋白单域抗体对细胞表面的RSV F蛋白结合

通过向K562细胞(ATCC)转染带有RSV F全长蛋白基因的质粒(pDonor-CMV-Fprotein-puro，iCarTab制备，原始质粒结构如图10所示)，获得在膜上瞬时表达RSV F蛋白的重组K562细胞(K562-native F蛋白细胞株)。

取K562-native F蛋白细胞株和K562细胞株，使用1640含有10％FBS完全培养基调整细胞状态至对数生长期；将两种细胞分别分为若干份，每份细胞的数量为5*10⁵个细胞将表达的抗体分别孵育靶细胞，充分混匀后，室温孵育1小时。室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次；

加入1uL PE标记的Anti-human IgG，充分混匀后，室温避光孵育30分钟；室温离心5分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；使用500uL PBS重悬细胞，进行流式分析。结果如图4所示。

结果显示S190116-HB10,HC12,HE3,HF7和S190117-HB1,HF8,HG3,HG10,HA6,HH9共10个抗体株有很好的结合能力。最终选取8株抗体HB10,HC12,HB1,HF8,HG3,HG10,HA6,HH9做细胞中和抑制实验。筛选出的8株抗体HB10,HC12,HB1,HF8,HG3,HG10,HA6,HH9的CDR序列，氨基酸序列和核苷酸序列如表2：

表2抗RSV的单域抗体

2.5通过细胞中和抑制实验考察抗RSV F蛋白单域抗体的中和抑制效果

稀释抗体：将8株纯化获得的抗体分别进行8倍稀释，然后进行倍比稀释8个梯度，即得到的稀释倍数分别为8、16、32、64、128、256、512、1024。每孔中的样本量为50μL，本次实验做6个复孔。

加入RSV病毒：根据预实验的结果，本次实验病毒的TCID50为3。将病毒用无血清的DMEM稀释到要求的滴度，然后每孔加入50μL，将96孔板放入37℃5％培养箱中，孵育2h。

加入细胞：将准备好的HEP-2细胞CO₂消化计数。根据计数结果，将细胞稀释到10⁵个/mL。将上述孵育够2h的板子取出，加入计数好的HEP-2细胞，每孔100μL。转入37℃5％CO₂培养箱中，培养3～7天，逐日观察。

待有明显的病变后，将液体加入荧光底物，采用化学发光仪读取发光值。荧光值在5000以下表示没有病变，荧光值越高，病毒的含量越多。结果如表3和图11所示。

表3

【实施例3】人源化抗体序列设计

根据实施例2筛选的单域抗体HG10序列，采用表面氨基酸替换的设计进行人源化。

表4抗RSV人源化抗体

3.1人源化抗体基因合成及表达载体构建

将上述设计的人源化抗体分别进行基因合成，与human IgG1Fc(购于addgene公司)串联亚克隆至表达载体Lenti-hIgG1-Fc2中(载体示意图如图12)。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用。

3.2人源化抗体表达及纯化

1.从冰箱中取出LVTransm(Lipofectamine2000和Lipofectamine3000)转染试剂及抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS或HBSS缓冲液，温热至室温。取500μl PBS至24孔板的一个孔，加入4μg Lenti-hIgG1-Fc2，移液枪上下吹打充分混匀后，加入12μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

2.将上述DNA/LVTransm复合物加入到1.5mL 293F-SVP16(ATCC)细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱，130RPM培养6～8小时后，加入1.5mL新鲜的FreeStyle^TM293Expression Medium培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。

3.连续培养3天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，纯化抗体，进行流式检测。

3.3流式检测人源化抗体与靶蛋白的结合

1.从液氮中复苏K562-native F protein细胞株，使用1640、10％FBS完全培养基调整细胞状态至对数生长期.

2.将细胞分别分为若干份，每份细胞的数量为5*10^5个细胞。

3.将表达的抗体分别孵育靶细胞，充分混匀后，室温孵育1小时。

4.800xg室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次。

5.加入1uL PE标记的Anti-human IgG，充分混匀后，室温避光孵育30分钟。

6.800xg室温离心5分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次。

7.使用500uL PBS重悬细胞，进行流式分析。。

3.4ELISA检测重组抗体与靶蛋白的结合

1.使用无菌PBS稀释RSV的F蛋白至终浓度为5ug/mL。取一块新的96孔板，加入100uL/孔4℃包被过夜。

2.去掉抗原包被液，使用PBST(含0.5％的吐温)洗涤3次。

3.加入200uL/孔的3％BSA 37℃封闭2小时；

4.去掉封闭缓冲液后，使用PBST洗涤孔板3次；

5.加入100ul稀释的抗体(1ug/ml)，室温孵育1小时，对照孔为PBS；

6.去掉孔内的液体，并使用PBST洗涤3次；

7.加入100uL HRP-Protein A(1:10000稀释)，室温孵育1小时；

8.去掉孔内的液体后，使用PBST洗涤孔板3次；

9.加入100uL/孔TMB显色液；

10.室温避光孵育15分钟；

11.加入50uL/孔终止液；

12.使用酶标仪读取孔内的O.D值。

3.5人源化抗体的表达纯化

1.从冰箱中取出LVTransm转染试剂及单链抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS或HBSS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入130μg Lenti-hIgG1-Fc2，移液枪上下吹打充分混匀后，加入400μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

2.将上述DNA/LVTransm复合物加入到50mL 293F-SVP16(ATCC)细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱，130RPM培养6～8小时后，加入50mL新鲜的FreeStyle^TM293培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。

3.连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化抗体。

3.6人源化抗体亲和力检测

将RSV的F蛋白使用10mM Acetate缓冲液固定在CM5芯片上，分别以上述制备的阳性人源化抗体及原始抗体作为流动相，检测人源化前后抗体与靶蛋白RSV的F蛋白的结合能力。

3.7人源化后中和抑制试验

试验过程详见2.5

3.8结果

3.8.1抗体表达载体构建测序结果

所有构建的抗体表达载体均经Sanger测序，抗体表达载体均完全正确(图13)。

3.8.2人源化抗体流式细胞检测结果

将人源化的抗体表达载体瞬时转染293F细胞进行小试表达，收集培养基上清，采用流式细胞仪检测人源化后抗体与重组细胞K562-native F protein细胞膜表面的抗原结合情况(图14)，流式细胞仪检测人源化后抗体与K562细胞的结合情况(图15)。

根据流式检测结果，人源化抗体HG10-2，HG10-3，HG10-4和HG10-5均特异性与重组K562-native F protein细胞结合，且结合力与HG10抗体相当。

3.8.3人源化抗体ELISA检测结果如表4

表5：

使用HG10抗体作为阳性对照，根据流式和ELISA检测结果，选择HG10-3和HG10-5进行抗体的表达纯化以及亲和力检测

3.8.4亲和力检测结果

HG10，HG10-3和HG10-5单域抗体与RSVF蛋白的结合测定

表6亲和力检测结果：

结果分析：根据亲和力检测结果，人源化抗体与原始抗体的亲和力一致。

3.8.5人源化后中和抑制试验结果

HG10单域抗体的人源化前后的中和抑制试验

表7中和抑制试验结果

结果分析：根据中和抑制试验结果，人源化的抗体优于未人源化的抗体。

【实施例4】多价连接的抗体序列设计

4.1载体构建

1.Fc标签双价抗体表达载体构建

将前期项目获得的单域抗体HG10和HB1与human IgG1Fc串联，构建双价抗体表达载体(HG10-ggggsggggsggggs-HB1-IgG1Fc)；将人源化抗体HG10-5抗体序列和humanIgG1FC区构建双价抗体表达载体(HG10-5-ggggsggggsggggs-HG10-5-IgG1Fc)；分别进行基因合成，亚克隆至Lenti-hIgG1-Fc2-Puro载体中，构建双价抗体表达载体。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒。

HG10抗体氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示

HB1抗体氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；

HG10-5抗体氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示；

2.His标签双价抗体表达载体构建

将步骤1中构建的两个双价抗体表达载体Fc标签更换为His标签，为了防止His标签隐藏，在抗体序列和His标签之间添加G4S，同时添加2个6×His标签，构建His标签双价抗体表达载体，即HG10-ggggsggggsggggs-HB1-His和HG10-5-ggggsggggsggggs-HG10-5-His。测序验证无误后，制备去内毒素大抽质粒。

4.2双价抗体的表达纯化

1.从冰箱中取出LVTransm转染试剂及单链抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。分别取2mL PBS至6孔板的两个孔，分别加入130μg抗体表达载体，移液枪上下吹打充分混匀后，加入400μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

2.将上述DNA/LVTransm复合物加入到50mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱，130RPM培养6～8小时后，加入50mL新鲜的FreeStyleTM293培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。

3.连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，分别使用Protein A和镍柱亲和柱纯化抗体。

4.SDS-PAGE检测蛋白纯度。

4.3结果

双价抗体的表达纯化SDS-PAGE检测：(见图16)。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州高泓利康生物科技有限公司

<120> 针对呼吸道合胞病毒的蛋白结合分子

<130> JS1981-22P150658

<150> CN201910711455.7

<151> 2019-08-02

<160> 66

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 488

<212> PRT

<213> respiratory syncytial virus

<400> 1

Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser

1 5 10 15

Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile

20 25 30

Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp

35 40 45

Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala

50 55 60

Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Pro Ala Ala Asn Ser

65 70 75 80

Lys Ala Lys Lys Glu Ala Pro Arg Gly Met Arg Tyr Thr Met Asn Leu

85 90 95

Gln Arg Asn Val Asn Val Thr Asp Ser Leu Lys Lys Lys Lys Lys Phe

100 105 110

Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala

115 120 125

Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser

130 135 140

Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val

145 150 155 160

Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys

165 170 175

Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile

180 185 190

Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile

195 200 205

Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr

210 215 220

Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro

225 230 235 240

Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val

245 250 255

Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu

260 265 270

Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys

275 280 285

Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly

290 295 300

Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn

305 310 315 320

Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln

325 330 335

Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser

340 345 350

Glu Val Asn Leu Cys Asn Ile Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys

355 360 365

Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser

370 375 380

Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser

385 390 395 400

Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr

405 410 415

Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr

420 425 430

Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro

435 440 445

Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp

450 455 460

Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe

465 470 475 480

Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu

485

<210> 2

<211> 545

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 密码子优化的F蛋白

<400> 2

Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly

1 5 10 15

Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr

20 25 30

Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg

35 40 45

Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys

50 55 60

Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln

65 70 75 80

Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met

85 90 95

Gln Ser Thr Pro Ala Ala Asn Ser Lys Ala Lys Lys Glu Ala Pro Arg

100 105 110

Gly Met Arg Tyr Thr Met Asn Leu Gln Arg Asn Val Asn Val Thr Asp

115 120 125

Ser Leu Lys Lys Lys Lys Lys Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly

130 135 140

Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu

145 150 155 160

Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala

165 170 175

Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu

180 185 190

Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys

195 200 205

Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln

210 215 220

Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala

225 230 235 240

Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu

245 250 255

Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu

260 265 270

Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met

275 280 285

Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu

290 295 300

Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu

305 310 315 320

Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr

325 330 335

Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro

340 345 350

Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr

355 360 365

Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Ile Asp

370 375 380

Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp

385 390 395 400

Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr

405 410 415

Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys

420 425 430

Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr

435 440 445

Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys

450 455 460

Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu

465 470 475 480

Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu

485 490 495

Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu

500 505 510

Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile

515 520 525

Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu

530 535 540

Arg

545

<210> 3

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HB10抗体

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Pro Phe Ser

20 25 30

Asp Tyr Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Gly Ile Tyr Lys Asp Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Leu Ser Gly Trp Gly Leu Asp Gly Leu Pro Arg Gly Ser Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1/HB10

<400> 4

Gly Phe Pro Phe Pro Phe Ser Asp Tyr

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2/HB10

<400> 5

Tyr Lys Asp Gly Ser Gly

1 5

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3/HB10

<400> 6

Gly Trp Gly Leu Asp Gly Leu Pro Arg Gly Ser

1 5 10

<210> 7

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码HB10的核苷酸

<400> 7

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggcgcagc ctggggggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt ccccttcccc ttcagtgatt atgccatgac ctgggtccgc 120

caggctccag gaaaggagct cgagtgggtg tccggcattt ataaggatgg tagtggcact 180

tactatgcag actccgtgaa ggggcgcttc accatctcca gagacaacgc caagaatatg 240

ctgtatctgc aaatgaacaa cctgaaacct gaggacacgg ggatatatta ctgtttgagt 300

ggatggggct tggacggtct tccccggggt tcctggggcc aggggaccca ggttaccgtc 360

tcctcg 366

<210> 8

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HC12单域抗体

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Leu Gly Ala Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Val Arg Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Leu

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Glu Phe Phe Phe Gly Ser Trp Cys Leu Ser Ser Gly Lys

100 105 110

Ala Ser Gln Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1/HC12

<400> 9

Gly Ser Thr Leu Gly Ala Tyr

1 5

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2/HC12

<400> 10

Ser Ser Asn Gly Gly Ser

1 5

<210> 11

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3/HC12

<400> 11

Lys Glu Phe Phe Phe Gly Ser Trp Cys Leu Ser Ser Gly Lys Ala Ser

1 5 10 15

Gln Ser

<210> 12

<211> 381

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码HC12的核苷酸

<400> 12

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgacactc 60

tcctgtgcag cctctggatc cactttgggt gcttatgcca taggctggtt ccgccaggcc 120

ccagggaagg agcgtgaagg ggtctcatgt attagtagta atggtggtag tacagtgcgg 180

gcagactccg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgctg 240

ctgcagatga acaacctgca acctgaggac acagcaattt actactgtgc agcaaaggag 300

ttcttcttcg gtagctggtg ccttagcagt gggaaagcgt ctcagtcctg gggccagggg 360

acccaggtca ccgtctcctc t 381

<210> 13

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HB1单域抗体

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Leu Gly Thr Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ile Val Val Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Leu Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Asn Leu Gln Leu Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Lys Thr Tyr Phe Phe Gly Ser Trp Cys His Ser Asn Gly Trp Thr

100 105 110

Ser Glu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Thr

115 120 125

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1/HB1

<400> 14

Gly Ser Thr Leu Gly Thr Tyr Ala

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2/HB1

<400> 15

Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ile

1 5

<210> 16

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3/HB1

<400> 16

Lys Thr Tyr Phe Phe Gly Ser Trp Cys His Ser Asn Gly Trp Thr Ser

1 5 10 15

Glu Ser

<210> 17

<211> 378

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码HB1的核苷酸

<400> 17

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60

tcctgcgcag cctctggatc cactttgggt acttatgcca taggctggtt ccgccaggcc 120

ccagggaagg agcgtgaagg ggtctcatgt attagtagtg gtggtagtat agtcgttgca 180

gactccgtga agggccgatt caccatttcc agagacaacg ccaagaacac ggtgcttctg 240

caaatgaaca acctacaact tgaggacaca gcaatttact actgtgcagc aaagacgtac 300

ttcttcggta gctggtgtca tagcaatggg tggacgtccg agtcctgggg ccaggggact 360

caggtcaccg tctccacg 378

<210> 18

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HF8单域抗体

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr

20 25 30

Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Arg Ser Gly Leu Met Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ala Arg Phe Asp Ser Leu Tyr Gly Ser Ser Cys Phe Arg Ala

100 105 110

Ala Leu Tyr Glu Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1/HF8

<400> 19

Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2/HF8

<400> 20

Ile Ser Arg Ser Gly Leu Met Thr

1 5

<210> 21

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3/HF8

<400> 21

Ala Arg Phe Asp Ser Leu Tyr Gly Ser Ser Cys Phe Arg Ala Ala Leu

1 5 10 15

Tyr Glu Asn

<210> 22

<211> 384

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 编码HF8的核苷酸

<400> 22

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttggat tattatgccg taggctggtt ccgccaggcc 120

ccagggaggg agcgtgaggg ggtctcatgt attagtagga gtggtcttat gacaaactat 180

gccgactccg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acgccaagaa cacggtagat 240

ttgcaaatga acagcctgaa acctgacgac acggccgatt attactgtgc agcagcccgg 300

ttcgactccc tgtatggtag tagttgcttc agagcggcgc tatatgagaa ttggggccag 360

gggacccagg tcaccgtctc ctca 384

<210> 23

<211> 125

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HG3单域抗体

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Cys Ile Thr Val Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Ala Glu Asp Arg Leu Phe Gly Leu Cys Ser Leu Ser Pro Lys Ile Val

100 105 110

Glu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Thr

115 120 125

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1/HG3

<400> 24

Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr

1 5

<210> 25

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2/HG3

<400> 25

Thr Val Gly Gly Arg

1 5

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3/HG3

<400> 26

Glu Asp Arg Leu Phe Gly Leu Cys Ser Leu Ser Pro Lys Ile Val Glu

1 5 10 15

Ser

<210> 27

<211> 375

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码HG3的核苷酸

<400> 27

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagt ctggggggtc tctgagactc 60

tcctgtgagg cctctggatt cactttggat agttatgcca taggctggtt ccgccaggcc 120

ccagggaagg agcgtgaggg ggtctcatgt attactgttg gtggtagaac aaactatgca 180

gacccggtga agggccgatt caccatttcg agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240

caaatgaata gcctgaaacc tgaggacaca gccatttatt actgttcagc agaagatcga 300

ctgttcggcc tttgtagcct atccccaaaa atcgttgagt cctggggcca ggggacccag 360

gtcaccgtct ccacg 375

<210> 28

<211> 125

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HG10单域抗体

<400> 28

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Cys Ile Thr Val Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Ala Asp Asp Arg Leu Phe Gly Leu Cys Ser Leu Ser Pro Lys Ile Val

100 105 110

Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Thr

115 120 125

<210> 29

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1/HG10

<400> 29

Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr Ala

1 5

<210> 30

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2/HG10

<400> 30

Thr Val Gly Gly Arg

1 5

<210> 31

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3/HG10

<400> 31

Asp Asp Arg Leu Phe Gly Leu Cys Ser Leu Ser Pro Lys Ile Val Asp

1 5 10 15

Ser

<210> 32

<211> 375

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码HG10的核苷酸

<400> 32

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagt ctggggggtc tctgagactc 60

tcctgtgagg cctctggatt cactttggat agttatgcca taggctggtt ccgccaggcc 120

ccagggaagg agcgtgaggg ggtctcatgt attactgttg gtggtagaac aaactatgca 180

gacccggtga agggccgatt caccatttct agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240

caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacaca gccatttatt actgttcagc agatgatcga 300

ctgttcggcc tttgtagcct atccccaaaa atcgttgact cctggggcca ggggacccag 360

gtcaccgtct ccacg 375

<210> 33

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HA6单域抗体

<400> 33

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Glu

20 25 30

Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Val Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Ile Glu

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Val Arg Ala Glu Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys

85 90 95

Ala Asp Leu Arg Tyr Phe Asn Pro Tyr Gly Pro Asp Arg Arg Leu Glu

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 34

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1/HA6

<400> 34

Gly Ser Thr Ser Asn Ile Glu

1 5

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2/HA6

<400> 35

Thr Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 36

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3/HA6

<400> 36

Asp Leu Arg Tyr Phe Asn Pro Tyr Gly Pro Asp Arg Arg Leu Glu Val

1 5 10 15

<210> 37

<211> 372

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码HA6的核苷酸

<400> 37

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggactc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggaag cacctctaat atcgaaacca tgggatggta ccgccaggct 120

ccagggaagc agcgcgagtt ggttgcagta attactagtg gtggcagcac aagctatgca 180

gactccatag agggccgatt caccatctcc agagtcagag ccgagaacac actctatctg 240

caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtgtatt actgtaaggc agatcttagg 300

tactttaacc catatggccc cgacaggcgt ctcgaagttt ggggccaggg cacccaggtc 360

accgtctcct ca 372

<210> 38

<211> 123

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HH9单域抗体

<400> 38

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Leu Ser Leu Arg Ala Tyr

20 25 30

Gln Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile

35 40 45

Ser Cys Ser Ile Asp Ser Gly Ala Thr Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Ser Asp Phe Cys Ser Arg Asn Pro Ala Gln Tyr Asn Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 39

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1/HH9

<400> 39

Arg Leu Ser Leu Arg Ala Tyr Gln

1 5

<210> 40

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2/HH9

<400> 40

Ser Ile Asp Ser Gly Ala Thr Ile

1 5

<210> 41

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3/HH9

<400> 41

Arg Ser Asp Phe Cys Ser Arg Asn Pro Ala Gln Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 42

<211> 369

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码HH9的核苷酸

<400> 42

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ccggggggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctccagact ctctttgcgt gcctatcaaa taggctggtt ccgccaggcc 120

ccagggaagg agcgtgaggg gatctcatgt agtatcgata gtggcgcgac cataacttat 180

gcagactccg tgaagggccg attcatcgtc tccagagaca gtgccaagaa cacggtgtat 240

ctgcaaatga acaacctgaa acctgaggac acagccgttt attactgtgc agcacggtcc 300

gacttctgtt cacggaaccc ggcacaatat aactactggg gccaggggac ccaggtaacc 360

gtctcctca 369

<210> 43

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 43

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Val Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Ala Asp Asp Arg Leu Phe Gly Leu Cys Ser Leu Ser Pro Lys Ile Val

100 105 110

Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 44

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 44

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Cys Ile Thr Val Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Ala Asp Asp Arg Leu Phe Gly Leu Cys Ser Leu Ser Pro Lys Ile Val

100 105 110

Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 45

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 45

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Cys Ile Thr Val Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Ala Asp Asp Arg Leu Phe Gly Leu Cys Ser Leu Ser Pro Lys Ile Val

100 105 110

Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 46

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 46

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Cys Ile Thr Val Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Ala Asp Asp Arg Leu Phe Gly Leu Cys Ser Leu Ser Pro Lys Ile Val

100 105 110

Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 47

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 47

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Cys Ile Thr Val Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Ala Asp Asp Arg Leu Phe Gly Leu Cys Ser Leu Ser Pro Lys Ile Val

100 105 110

Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 48

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Val Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Ala Asp Asp Arg Leu Phe Gly Leu Cys Ser Leu Ser Pro Lys Ile Val

100 105 110

Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 49

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 49

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Val Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Pro Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Ala Asp Asp Arg Leu Phe Gly Leu Cys Ser Leu Ser Pro Lys Ile Val

100 105 110

Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 50

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 50

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Val Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Pro Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Ala Asp Asp Arg Leu Phe Gly Leu Cys Ser Leu Ser Pro Lys Ile Val

100 105 110

Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 51

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 51

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Val Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Pro Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Ala Asp Asp Arg Leu Phe Gly Leu Cys Ser Leu Ser Pro Lys Ile Val

100 105 110

Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 52

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 52

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Val Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Pro Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Ala Asp Asp Arg Leu Phe Gly Leu Cys Ser Leu Ser Pro Lys Ile Val

100 105 110

Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 53

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 53

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Val Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Ala Asp Asp Arg Leu Phe Gly Leu Cys Ser Leu Ser Pro Lys Ile Val

100 105 110

Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 54

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60

tcttgtgccg ccagcggctt caccctggat agctatgcca tgagctgggt ccgacaggcc 120

cctggcaaag gacttgaatg ggtgtccgcc atcacagtcg gcggcagaac ctactacgcc 180

gactctgtga agggcagatt caccatcagc cgggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 240

cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgtagcgc cgacgataga 300

ctgttcggcc tgtgcagcct gtctcctaag atcgtggatt cttggggcca gggcaccctg 360

gtcacagtct cttct 375

<210> 55

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagt ctggcggctc tctgagactg 60

agctgtgaag ccagcggctt taccctggac agctatgcca tcggctgggt ccgacaggct 120

cctggcaaag gacttgagtg ggtgtcctgc atcacagtcg gcggcaggac caattacgcc 180

gatcctgtga agggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacac cgtgtacctg 240

cagatgaaca gcctgaagcc tgaggacacc gccatctact actgcagcgc cgacgataga 300

ctgttcggcc tgtgttctct gagccccaag atcgtggatt cttggggcca gggcacactg 360

gtcacagtgt catct 375

<210> 56

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60

agctgtgaag ccagcggctt taccctggac agctatgcca tcggctgggt ccgacaggct 120

cctggcaaag gacttgagtg ggtgtcctgc atcacagtcg gcggcaggac caattacgcc 180

gatcctgtga agggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacac cgtgtacctg 240

cagatgaaca gcctgaagcc tgaggacacc gccatctact actgcagcgc cgacgataga 300

ctgttcggcc tgtgttctct gagccccaag atcgtggatt cttggggcca gggcacactg 360

gtcacagtgt catct 375

<210> 57

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60

tcttgtgccg ccagcggctt caccctggat tcttatgcca tcggctgggt ccgacaggcc 120

cctggaaaag gacttgagtg ggtgtcctgc atcacagtcg gcggcaggac caattacgcc 180

gatcctgtga agggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacac cgtgtacctg 240

cagatgaaca gcctgaagcc tgaggacacc gccatctact actgcagcgc cgacgataga 300

ctgttcggcc tgtgttctct gagccccaag atcgtggatt cttggggcca gggcacactg 360

gtcacagtgt catct 375

<210> 58

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60

tcttgtgccg ccagcggctt caccctggat agctatgcca tgagctgggt ccgacaggcc 120

cctggcaaag gacttgaatg ggtgtcctgc atcacagtcg gcggcaggac caattacgcc 180

gatcctgtga agggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacac cgtgtacctg 240

cagatgaaca gcctgaagcc tgaggacacc gccatctact actgcagcgc cgacgataga 300

ctgttcggcc tgtgttctct gagccccaag atcgtggatt cttggggcca gggcacactg 360

gtcacagtgt catct 375

<210> 59

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60

tcttgtgccg ccagcggctt caccctggat agctatgcca tgagctgggt ccgacaggcc 120

cctggcaaag gacttgaatg ggtgtccgcc atcacagtcg gcggcaggac caattatgcc 180

gatcctgtga agggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacac cgtgtacctg 240

cagatgaaca gcctgaagcc tgaggacacc gccatctact actgcagcgc cgacgataga 300

ctgttcggcc tgtgttctct gagccccaag atcgtggatt cttggggcca gggcacactg 360

gtcacagtgt catct 375

<210> 60

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60

tcttgtgccg ccagcggctt caccctggat agctatgcca tgagctgggt ccgacaggcc 120

cctggcaaag gacttgaatg ggtgtccgcc atcacagtcg gcggcagaac ctactatgcc 180

gatcctgtga agggcagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacac cgtgtacctg 240

cagatgaaca gcctgaagcc tgaggacacc gccatctact actgcagcgc cgacgataga 300

ctgttcggcc tgtgttctct gagccccaag atcgtggatt cttggggcca gggcacactg 360

gtcacagtgt catct 375

<210> 61

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60

tcttgtgccg ccagcggctt caccctggat agctatgcca tgagctgggt ccgacaggcc 120

cctggcaaag gacttgaatg ggtgtccgcc atcacagtcg gcggcagaac ctactatgcc 180

gatcctgtga agggcagatt caccatcagc cgggacaaca gcaagaacac cgtgtacctg 240

cagatgaaca gcctgaagcc tgaggacacc gccatctact actgcagcgc cgacgataga 300

ctgttcggcc tgtgttctct gagccccaag atcgtggatt cttggggcca gggcacactg 360

gtcacagtgt catct 375

<210> 62

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60

tcttgtgccg ccagcggctt caccctggat agctatgcca tgagctgggt ccgacaggcc 120

cctggcaaag gacttgaatg ggtgtccgcc atcacagtcg gcggcagaac ctactatgcc 180

gatcctgtga agggcagatt caccatcagc cgggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 240

cagatgaaca gcctgaagcc tgaggacacc gccatctact actgcagcgc cgacgataga 300

ctgttcggcc tgtgttctct gagccccaag atcgtggatt cttggggcca gggcacactg 360

gtcacagtgt catct 375

<210> 63

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60

tcttgtgccg ccagcggctt caccctggat agctatgcca tgagctgggt ccgacaggcc 120

cctggcaaag gacttgaatg ggtgtccgcc atcacagtcg gcggcagaac ctactatgcc 180

gatcctgtga agggcagatt caccatcagc cgggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 240

cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccatctact actgcagcgc cgacgataga 300

ctgttcggcc tgtgttctct gagccccaag atcgtggatt cttggggcca gggcacactg 360

gtcacagtgt catct 375

<210> 64

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60

agctgtagcg ccagcggctt caccctggat agctatgcca tgcactgggt ccgacaggcc 120

cctggcaaag gcctggaata tgtgtctgcc atcaccgtcg gcggcagaac ctactacgcc 180

gattctgtga agggcagatt caccatcagc cgggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 240

cagatgagca gcctgagagc cgaggatacc gccgtgtact actgcagcgc cgacgataga 300

ctgttcggcc tgtgttctct gagccccaag atcgtggatt cttggggcca gggcacactg 360

gtcacagtgt catct 375

<210> 65

<211> 227

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 66

<211> 681

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 66

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 420

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600

aacgtcttct catgctccgt gatgcacgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660

ctctccctgt ctccgggtaa a 681

Claims (9)

1.一种针对呼吸道合胞病毒的单域抗体，所述单域抗体与呼吸道合胞病毒的F蛋白特异性结合，所述单域抗体包含一免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包括三个抗体互补决定区CDR1，CDR2和CDR3，所述互补决定区为：

如SEQ ID NO.34所示的CDR1，如SEQ ID NO.35所示的CDR2和如SEQ ID NO.36所示的CDR3。

2.如权利要求1所述的针对呼吸道合胞病毒的单域抗体，其特征在于所述抗体包括具有下述氨基酸序列的氨基酸：如SEQ ID NO.33所示的氨基酸。

3.如权利要求1所述的针对呼吸道合胞病毒的单域抗体，其特征在于所述的免疫球蛋白单一可变结构域是人源化的重链可变区结构域。

4.如权利要求1所述的针对呼吸道合胞病毒的单域抗体，其特征在于所述抗体还与免疫球蛋白Fc区结合。

5.如权利要求1所述的针对呼吸道合胞病毒的单域抗体，其特征在于所述抗体形成多价链接。

6.核酸分子，其编码权利要求1-5中任一项所述的针对呼吸道合胞病毒的单域抗体。

7.如权利要求6所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNo.37所示。

8.一种药物组合物，含有权利要求1所述的针对呼吸道合胞病毒的单域抗体和药学上可接受的载体。

9.权利要求1所述的针对呼吸道合胞病毒的单域抗体在制备预防和/或治疗与呼吸道合胞病毒感染相关疾病的药物中的用途。

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