CN113166254A - 三特异性抗cd38、抗cd28和抗cd3结合蛋白和用于治疗病毒感染的使用方法 - Google Patents

三特异性抗cd38、抗cd28和抗cd3结合蛋白和用于治疗病毒感染的使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开文本提供使用三特异性结合蛋白治疗病毒感染的方法，所述三特异性结合蛋白包含形成特异性地结合CD38多肽(例如，人和/或食蟹猴CD38多肽)、CD28多肽和CD3多肽的三个抗原结合位点的四条多肽链。

Description

三特异性抗CD38、抗CD28和抗CD3结合蛋白和用于治疗病毒感 染的使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求以下申请的优先权益：2018年10月9日提交的国际申请号PCT/US2018/055084；2019年4月9日提交的美国临时申请序列号62/831,572；2019年4月9日提交的美国临时申请序列号62/831,608；和2019年9月11日提交的欧洲申请号19306097.7；所有上述申请都是通过引用以其整体并入本文。
ASCII文本文件序列表的提交
将以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：183952032140SEQLIST.TXT，记录日期：2019年10月2日，大小：144KB)。
技术领域
本公开文本涉及使用三特异性结合蛋白扩增记忆T细胞(例如，病毒特异性记忆T细胞)和/或治疗慢性病毒感染的方法，所述三特异性结合蛋白包含形成特异性结合CD38多肽(例如，人和/或食蟹猴CD38多肽)、CD28多肽和CD3多肽的三个抗原结合位点的四条多肽链。
背景技术
作为人适应性免疫的一部分，T细胞免疫在控制病毒感染、消除感染细胞方面具有关键作用，这导致病毒感染的清除。在如疱疹病毒感染(HSV、CMV、EBV等)、HIV和HBV的慢性感染性疾病中，病毒通过包括免疫抑制、T细胞耗竭和潜伏期建立在内的多种机制在人体内建立其持久性。然而，病毒感染通常诱导包括抗原特异性CD8 T细胞的病毒抗原特异性免疫，所述抗原特异性CD8 T细胞可以容易地识别感染细胞，用于通过细胞因子释放或细胞毒性T细胞(CTL)介导的杀伤过程来进行控制或杀伤。
因此，在体内和/或离体的病毒抗原特异性T细胞激活和/或扩增可以提供针对慢性病毒感染的治疗策略。
发明内容
本文提供了抗CD38/CD28xCD3三特异性抗体，开发并评价了其在激活T细胞以及随后增殖和/或扩增抗原特异性T细胞方面的潜力。这些三特异性Ab可以有效地在体外扩增CD4和CD8效应和记忆群体，所述群体包括抗原特异性CD8 T中枢记忆细胞和效应记忆细胞。具体地，证明了CMV、EBV、HIV-1、流感特异性CD8中枢记忆细胞和效应记忆细胞的体外扩增。本文所述的抗CD38/CD28xCD3三特异性抗体通过接合CD3/CD28/CD38，从而提供刺激并扩增T细胞的信号传导途径来展现新颖特性，这可以提供治疗慢性感染性疾病(如HSV、CMV、EBV、HIV-1和HBV感染)的有效策略。
为了满足这些和其他需求，本文提供了结合CD38多肽(例如，人和食蟹猴CD38多肽)、CD28多肽和CD3多肽的结合蛋白。
在一些实施方案中，本文提供了扩增病毒特异性记忆T细胞的方法，其包括使病毒特异性记忆T细胞与结合蛋白接触，其中所述结合蛋白包含形成所述三个抗原结合位点的四条多肽链，其中第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
并且第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
并且第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
并且第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接所述CH1与CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；并且
其中VH1和VL1形成结合CD28多肽的第一抗原结合位点，其中VH2和VL2形成结合CD3多肽的第二抗原结合位点，并且其中VH3和VL3形成结合CD38多肽的第三抗原结合位点。
在一些实施方案中，本文提供了包含形成所述三个抗原结合位点的四条多肽链的结合蛋白，其中第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
并且第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
并且第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
并且第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接所述CH1与CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；并且
其中VH1和VL1形成结合CD28多肽的第一抗原结合位点，其中VH2和VL2形成结合CD3多肽的第二抗原结合位点，并且其中VH3和VL3形成结合CD38多肽的第三抗原结合位点，从而使所述结合蛋白用于扩增病毒特异性记忆T细胞。
在一些实施方案中，在体外或离体使所述病毒特异性记忆T细胞与所述结合蛋白接触。在一些实施方案中，使所述病毒特异性记忆T细胞与所述结合蛋白接触引起病毒特异性记忆T细胞的激活和/或增殖。
在一些实施方案中，本文提供了扩增T细胞的方法，其包括在体外或离体使T细胞与结合蛋白接触，其中所述结合蛋白包含形成三个抗原结合位点的四条多肽链，其中第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
并且第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
并且第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
并且第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接所述CH1与CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；并且
其中VH1和VL1形成结合CD28多肽的第一抗原结合位点，其中VH2和VL2形成结合CD3多肽的第二抗原结合位点，并且其中VH3和VL3形成结合CD38多肽的第三抗原结合位点。
在一些实施方案中，本文提供了包含形成所述三个抗原结合位点的四条多肽链的结合蛋白，其中第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
并且第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
并且第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
并且第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接所述CH1与CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；并且
其中VH1和VL1形成结合CD28多肽的第一抗原结合位点，其中VH2和VL2形成结合CD3多肽的第二抗原结合位点，并且其中VH3和VL3形成结合CD38多肽的第三抗原结合位点，从而使所述结合蛋白用于扩增T细胞的方法。
在一些实施方案中，所述T细胞是记忆T细胞或效应T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞在其细胞表面上表达嵌合抗原受体(CAR)或包含编码CAR的多核苷酸。
在一些实施方案中，本文提供了治疗慢性病毒感染的方法，其包括向有需要的个体给予有效量的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含形成所述三个抗原结合位点的四条多肽链，其中第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
并且第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
并且第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
并且第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接所述CH1与CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；并且
其中VH1和VL1形成结合CD28多肽的第一抗原结合位点，其中VH2和VL2形成结合CD3多肽的第二抗原结合位点，并且其中VH3和VL3形成结合CD38多肽的第三抗原结合位点。
在一些实施方案中，本文提供了包含形成所述三个抗原结合位点的四条多肽链的结合蛋白，其中第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
并且第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
并且第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
并且第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接所述CH1与CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；并且其中VH1和VL1形成结合CD28多肽的第一抗原结合位点，其中VH2和VL2形成结合CD3多肽的第二抗原结合位点，并且其中VH3和VL3形成结合CD38多肽的第三抗原结合位点，从而使所述结合蛋白用于治疗慢性病毒感染的方法，其中所述方法包括向有需要的个体给予有效量的所述结合蛋白。在一些实施方案中，本文提供了用于治疗慢性病毒感染的方法的结合蛋白，其中所述方法包括向有需要的个体给予有效量的所述结合蛋白，其中所述结合蛋白包含形成所述三个抗原结合位点的四条多肽链，其中所述结合蛋白的第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
并且所述结合蛋白的第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
并且所述结合蛋白的第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
并且所述结合蛋白的第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接所述CH1与CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；并且
其中VH1和VL1形成结合CD28多肽的第一抗原结合位点，其中VH2和VL2形成结合CD3多肽的第二抗原结合位点，并且其中VH3和VL3形成结合CD38多肽的第三抗原结合位点。
在一些实施方案中，所述个体是人。在一些实施方案中，将所述结合蛋白以包含所述结合蛋白和药学上可接受的载体的药物配制品的形式给予至所述个体。在一些实施方案中，所述结合蛋白的给予导致所述个体体内病毒特异性记忆T细胞的激活和/或增殖。
在可以与本文所述的任何其他实施方案组合的一些实施方案中，所述记忆T细胞是CD8+或CD4+记忆T细胞。在一些实施方案中，所述记忆T细胞是中枢记忆T细胞(TCM)或效应记忆T细胞(TEM)。
在可以与本文所述的任何其他实施方案组合的一些实施方案中，所述CD28多肽是人CD28多肽，其中所述CD3多肽是人CD3多肽，并且其中所述CD38多肽是人CD38多肽。
在可以与本文所述的任何其他实施方案组合的一些实施方案中，所述VH3结构域包含：含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；并且所述VL3结构域包含：含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，所述VH3结构域包含：含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；并且所述VL3结构域包含：含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，所述VH3结构域包含：含有GFTFSSYG(SEQ IDNO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列；并且所述VL3结构域包含：含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，所述VH3结构域包含QVQLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKETPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFKGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列，并且所述VL3结构域包含DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH3结构域包含QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGQGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列，并且所述VL3结构域包含DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASQSVSSYGQGFMHWYQQKPGQPPRLLIYGASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH3结构域包含QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列，并且所述VL3结构域包含DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK(SEQID NO:18)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH3结构域包含QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQGLEWI GYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCART GGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列，并且所述VL3结构域包含DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH3结构域包含QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列，并且所述VL3结构域包含DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH3结构域包含QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWV AVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMFRGAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列，并且所述VL3结构域包含AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYA ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYCLQDYIYYPTFGQGT KVEIK(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。
在可以与本文所述的任何其他实施方案组合的一些实施方案中，所述VH1结构域包含：含有GYTFTSYY(SEQ ID NO:108)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNVNT(SEQ IDNO:109)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有TRSHYGLDWNFDV(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列的CDR-H3序列，并且所述VL1结构域包含：含有QNIYVW(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有KAS(SEQ ID NO:112)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQGQTYPY(SEQ IDNO:113)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，所述VH1结构域包含：含有GFSLSDYG(SEQ ID NO:114)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IWAGGGT(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARDKGYSYYYSMDY(SEQ ID NO:116)的氨基酸序列的CDR-H3序列，并且所述VL1结构域包含：含有ESVEYYVTSL(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有AAS(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQSRKVPYT(SEQ ID NO:119)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，所述VH1结构域包含QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWI GSIYPGNVNTNYAQKFQGRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCTRS HYGLDWNFDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:49)的氨基酸序列，并且所述VL1结构域包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYK ASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQG TKLEIK(SEQ ID NO:50)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH1结构域包含QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSLSDYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGGTNYNPSLKSRKTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARDK GYSYYYSMDYWGQGTTVTVS(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列，并且所述VL1结构域包含DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKL LIFAASNVESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDVANYYCQQSRKVPYT FGQGTKLEIK(SEQ IDNO:52)的氨基酸序列。
在可以与本文所述的任何其他实施方案组合的一些实施方案中，所述VH2结构域包含：含有GFTFTKAW(SEQ ID NO:120)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IKDKSNSYAT(SEQ IDNO:121)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有RGVYYALSPFDY(SEQ ID NO:122)的氨基酸序列的CDR-H3序列，并且所述VL2结构域包含：含有QSLVHNNANTY(SEQ ID NO:123)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有KVS(SEQ ID NO:124)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有GQGTQYPFT(SEQ ID NO:125)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，所述VH2结构域包含：含有GFTFTKAW(SEQ ID NO:126)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IKDKSNSYAT(SEQ ID NO:127)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有GVYYALSPFDY(SEQ ID NO:128)的氨基酸序列的CDR-H3序列，并且所述VL2结构域包含：含有QSLVHNNGNTY(SEQ ID NO:129)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有KVS(SEQ ID NO:130)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有GQGTQYPFT(SEQID NO:131)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，所述VH2结构域包含QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSNSYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:53)的氨基酸序列，并且所述VL2结构域包含DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQS LIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPF TFGSGTKVEIK(SEQ ID NO:54)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH2结构域包含QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKGLEWVAQIKDKSNSYATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC RGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:84)的氨基酸序列，并且所述VL2结构域包含DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQL LIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:85)的氨基酸序列。
在可以与本文所述的任何其他实施方案组合的一些实施方案中，L1、L2、L3或L4中的至少一个独立地为0个氨基酸的长度。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自独立地为零个氨基酸的长度或包含选自以下项的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO:57)、GQPKAAP(SEQ ID NO:58)和GGSGSSGSGG(SEQID NO:59)。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自独立地包含选自以下项的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO:57)、GQPKAAP(SEQ ID NO:58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)。在一些实施方案中，L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO:58)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO:57)，L3包含序列S，并且L4包含序列RT。
在可以与本文所述的任何其他实施方案组合的一些实施方案中，所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG4铰链-CH2-CH3结构域，并且其中所述铰链-CH2-CH3结构域各自包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置234和235的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是F234A和L235A。在一些实施方案中，所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG4铰链-CH2-CH3结构域，并且其中所述铰链-CH2-CH3结构域各自包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置233-236的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236处的缺失。在一些实施方案中，所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG4铰链-CH2-CH3结构域，并且其中所述铰链-CH2-CH3结构域各自包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置228和409的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S228P和R409K。在一些实施方案中，所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG1铰链-CH2-CH3结构域，并且其中所述铰链-CH2-CH3结构域各自包含根据EU索引在对应于人IgG1的位置234、235和329的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是L234A、L235A和P329A。在一些实施方案中，所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG1铰链-CH2-CH3结构域，并且其中所述铰链-CH2-CH3结构域各自包含根据EU索引在对应于人IgG1的位置298、299和300的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S298N、T299A和Y300S。在一些实施方案中，所述第二多肽链的铰链-CH2-CH3结构域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；并且其中所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置354和366的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S354C和T366W。在一些实施方案中，所述第二多肽链的铰链-CH2-CH3结构域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置354和366的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S354C和T366W；并且其中所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
在某些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，并且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列，并且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，并且所述第四多肽链包含SEQ IDNO:69的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，并且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，并且所述第四多肽链包含SEQID NO:69的氨基酸序列。
在可以与本文所述的任何其他实施方案组合的一些实施方案中，所述病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、巨细胞病毒(CMV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人乳头瘤病毒(HPV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-barr virus)(EBV)、人泡沫病毒(HFV)、单纯疱疹病毒1(HSV-1)或单纯疱疹病毒2(HSV-2)。
应当理解，可以将本文描述的各个实施方案的一个、一些或所有特性进行组合以形成本发明的其他实施方案。本发明的这些和其他方面对于本领域技术人员将变得清楚。本发明的这些和其他实施方案由随后的具体实施方式进行进一步描述。
附图说明
图1提供了包含四条多肽链的三特异性结合蛋白的示意图，所述四条多肽链形成结合以下三种靶蛋白的三个抗原结合位点：CD28、CD3和CD38。第一对多肽拥有具有交叉取向的双重可变结构域(VH1-VH2和VL2-VL1)，所述双重可变结构域形成识别CD3和CD28的两个抗原结合位点，并且第二对多肽拥有单一可变结构域(VH3和VL3)，所述单一可变结构域形成识别CD38的单一抗原结合位点。图1中所示的三特异性结合蛋白使用具有“杵臼结构(knob-into-hole)”突变的IgG4恒定区，其中杵位于具有单一可变结构域的第二对多肽上。
图2概述了如通过SPR所测量的所指示三特异性结合蛋白针对其同源抗原(人CD3、CD28和CD38)的结合亲和力。
图3概述了如通过SPR或流式细胞术(FACS)所测量的所指示的抗CD38x抗CD28x抗CD3三特异性结合蛋白对人CD38的结合亲和力。
图4A至图4D显示了对响应于CD38VH1/CD3midxCD28sup三特异性抗体的体外T细胞亚群扩增的表征。通过在不存在外源细胞因子的情况下用350ng/孔的CD38三特异性Ab包被孔来对T细胞亚群扩增进行评价。在所指示的时间点测量T细胞群。使用具有三个突变的抗原结合结构域的三特异性Ab作为阴性对照。使用流式细胞术确定中枢(Tcm)和效应记忆(Tem)CD4 T细胞(图4A)、T辅助细胞(Th1、Th17、Th2)(图4B)、中枢(Tcm)和效应记忆(Tem)CD8T细胞(图4C)以及巨细胞病毒(CMV)pp65特异性CD8细胞(图4D)，如实施例3中所述。通过对来自用CD38三特异性或三重阴性对照抗体处理的HLA-A2 CMV+供体的外周血单核细胞(PBMC)的五聚体染色进行对CMV特异性pp65效应细胞的分析。
图5A至图5B显示了对从CMV感染的供体B收集的PBMC中响应于CD38VH1/CD28sup xCD3mid三特异性抗体的体外T细胞亚群扩增的表征。在所指示的时间点测量T细胞群。使用三重突变体三特异性抗体作为阴性对照。使用流式细胞术对CMV特异性记忆CD8+T细胞(图5A)以及CMV特异性中枢记忆(Tcm)和效应记忆(Tem)CD8+T细胞(图5B)进行定量。CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特异性抗体激活T细胞并促进CMV特异性记忆CD8+T细胞的增殖。
图6A至图6B显示了对从CMV感染的供体C收集的PBMC中响应于CD38VH1/CD28sup xCD3mid三特异性抗体的体外T细胞亚群扩增的表征。在所指示的时间点测量T细胞群。使用三重突变体三特异性抗体作为阴性对照。使用流式细胞术对CMV特异性记忆CD8+T细胞(图6A)以及CMV特异性中枢记忆(Tcm)和效应记忆(Tem)CD8+T细胞(图6B)进行定量。CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特异性抗体激活T细胞并促进CMV特异性记忆CD8+T细胞的增殖。
图7A至图7B显示了对从爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染的供体A收集的PBMC中响应于CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特异性抗体的体外T细胞亚群扩增的表征。在所指示的时间点测量T细胞群。使用三重突变体三特异性抗体作为阴性对照。使用流式细胞术对EBV特异性记忆CD8+T细胞(图7A)以及EBV特异性中枢记忆(Tcm)和效应记忆(Tem)CD8+T细胞(图7B)进行定量。CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特异性抗体激活T细胞并促进EBV特异性记忆CD8+T细胞的增殖。
图8A至图8B显示了对从EBV感染的供体B收集的PBMC中响应于CD38VH1/CD28sup xCD3mid三特异性抗体的体外T细胞亚群扩增的表征。在所指示的时间点测量T细胞群。使用三重突变体三特异性抗体作为阴性对照。使用流式细胞术对EBV特异性记忆CD8+T细胞(图8A)以及EBV特异性中枢记忆(Tcm)和效应记忆(Tem)CD8+T细胞(图8B)进行定量。CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特异性抗体激活T细胞并促进EBV特异性记忆CD8+T细胞的增殖。
图9显示了在基线时(第0天；在与三特异性抗体一起孵育之前)针对HIV Gag特异性CD8+T细胞(与PE缀合的A*02:01-SLYNTVATL(HIV-1gag p1776-84)五聚体，ProImmune)测定的来自所指示的人类免疫缺陷病毒(HIV)阳性供体(底部图和顶部右侧图)的PBMC的流式细胞术谱。使用来自HIV阴性供体的PBMC作为阴性对照(顶部左侧图)。提供了Gag特异性CD8+T细胞群的百分比并显示为插入框。在基线时，来自HIV阳性供体的PBMC含有HIV Gag特异性CD8+T细胞。图9中的供体A-C与图10A至图12B中所示的供体D-F相同。
图10A至图10B显示了对从HIV阳性供体D收集的PBMC中响应于CD38VH1/CD28sup xCD3mid三特异性抗体的体外T细胞亚群扩增的表征。在所指示的时间点测量T细胞群。使用三重突变体三特异性抗体作为阴性对照。使用流式细胞术对HIV特异性记忆CD8+T细胞(图10A)以及HIV特异性中枢记忆(Tcm)和效应记忆(Tem)CD8+T细胞(图10B)进行定量。CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特异性抗体激活T细胞并促进效应记忆(Tem)CD8+T细胞的增殖。
图11A至图11B显示了对从HIV阳性供体E收集的PBMC中响应于CD38VH1/CD28sup xCD3mid三特异性抗体的体外T细胞亚群扩增的表征。在所指示的时间点测量T细胞群。使用三重突变体三特异性抗体作为阴性对照。使用流式细胞术对HIV特异性记忆CD8+T细胞(图11A)以及HIV特异性中枢记忆(Tcm)和效应记忆(Tem)CD8+T细胞(图11B)进行定量。CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特异性抗体激活T细胞并促进效应记忆(Tem)CD8+T细胞的增殖。
图12A至图12B显示了对从HIV阳性供体F收集的PBMC中响应于CD38VH1/CD28sup xCD3mid三特异性抗体的体外T细胞亚群扩增的表征。在所指示的时间点测量T细胞群。使用三重突变体三特异性抗体作为阴性对照。使用流式细胞术对HIV特异性记忆CD8+T细胞(图12A)以及HIV特异性中枢记忆(Tcm)和效应记忆(Tem)CD8+T细胞(图12B)进行定量。CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特异性抗体激活T细胞并促进效应记忆(Tem)CD8+T细胞的增殖。
图13A至图13B显示了对从流感感染的供体A收集的PBMC中响应于CD38VH1/CD28supx CD3mid三特异性抗体的体外T细胞亚群扩增的表征。在所指示的时间点测量T细胞群。使用三重突变体三特异性抗体作为阴性对照。使用流式细胞术对流感(流行性感冒(Flu))特异性记忆CD8+T细胞(图13A)以及流行性感冒特异性中枢记忆(Tcm)和效应记忆(Tem)CD8+T细胞(图13B)进行定量。CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特异性抗体激活T细胞并促进Tem CD8+T细胞(例如，参见第7天、第11天)和Tcm CD8+T细胞(例如，参见第7天)的增殖。
具体实施方式
本公开文本提供了包含四条多肽链的三特异性结合蛋白，所述四条多肽链形成特异性结合CD38多肽(例如，人和食蟹猴CD38多肽)、CD28多肽和CD3多肽的三个抗原结合位点，所述三特异性结合蛋白可以用于例如扩增记忆T细胞(例如，病毒特异性记忆T细胞)和/或治疗慢性病毒感染。
I.通用定义
除非另有说明，否则如根据本公开文本所用，以下术语应理解为具有以下含义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。除非上下文另有明确说明，否则如在本说明书及所附权利要求书中所使用的，单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种分子”任选地包括两种或更多种这样的分子的组合等。
应理解的是，本文所述的本公开文本的方面和实施方案包括“包含(comprising)”多个方面和实施方案，“由……组成(consisting)”以及“基本上由……组成(consistingessentially of)”。
如本文所用术语“多核苷酸”是指长度为至少10个核苷酸的单链或双链核酸聚合物。在某些实施方案中，构成多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或者任一类型的核苷酸的修饰形式。此类修饰包括碱基修饰，如溴尿苷(bromuridine)；核糖修饰，如阿糖胞苷和2',3'-二脱氧核糖；和核苷酸间连接修饰，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、phoshoraniladate和氨基磷酸酯(phosphoroamidate)。术语“多核苷酸”具体地包括单链和双链形式的DNA。
“分离的多核苷酸”是基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或其某种组合的多核苷酸，所述分离的多核苷酸：(1)不与在自然界中发现其所在的多核苷酸的全部或一部分结合，(2)与在自然界中其并不连接的多核苷酸连接，或(3)在自然界中不作为更大序列的一部分存在。
“分离的多肽”是如下多肽，其：(1)不含通常与其一起被发现的至少一些其他多肽，(2)基本上不含来自相同来源(例如，来自相同物种)的其他多肽，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)已经从至少约50％的在自然界中与所述分离的多肽结合的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其他物质分离，(5)不与在自然界中与所述“分离的多肽”结合的多肽的部分(通过共价或非共价相互作用)结合，(6)与在自然界中不与所述分离的多肽结合的多肽可操作地(通过共价或非共价相互作用)结合，或(7)在自然界中不存在。这种分离的多肽可以由基因组DNA、cDNA、mRNA或具有合成来源的其他RNA或其任何组合来编码。优选地，分离的多肽基本上不含在其自然环境中发现的会干扰其应用(治疗、诊断、预防、研究或其他应用)的多肽或其他污染物。
天然存在的抗体通常包含四聚体。每种这样的四聚体通常由两个相同的多肽链对构成，每一对具有一条全长“轻”链(通常具有约25kDa的分子量)和一条全长“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。如本文所用术语“重链”和“轻链”是指具有足以赋予对靶抗原的特异性的可变结构域序列的任何免疫球蛋白多肽。每条轻链和重链的氨基末端部分通常包括约100至110或更多个氨基酸的可变结构域，所述可变结构域通常负责抗原识别。每条链的羧基末端部分通常定义负责效应子功能的恒定结构域。因此，在天然存在的抗体中，全长重链免疫球蛋白多肽包括一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，其中所述VH结构域位于多肽的氨基末端并且CH3结构域位于羧基末端，并且全长轻链免疫球蛋白多肽包括一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)，其中所述VL结构域位于多肽的氨基末端并且所述CL结构域位于羧基末端。
通常将人轻链分类为κ和λ轻链，并且通常将人重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有多个亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。将IgA类似地细分为多个亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。在全长轻链和重链内，可变结构域和恒定结构域通常通过约12个或更多个氨基酸的“J”区接合，并且重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。参见例如，Fundamental Immunology(Paul,W.,编辑,Raven Press,第2版,1989)，所述文献是出于所有目的通过引用以其整体并入。每个轻/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。天然存在的抗体的可变结构域通常展现通过三个高变区(也称为互补决定区或CDR)接合的相对保守的框架区(FR)的相同总体结构。来自每一对的两条链的CDR通常通过框架区对齐，这可以使得能够结合至特异性表位。从氨基末端到羧基末端，轻链和重链可变结构域二者通常均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
术语“CDR集”是指一组存在于能够结合抗原的单一可变区中的三个CDR。这些CDR的确切边界已经根据不同系统以不同方式加以定义。Kabat所述的系统(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest(美国国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health),贝塞斯达(Bethesda),马里兰州)(1987)和(1991))不仅提供适用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，还提供定义三个CDR的准确残基边界。这些CDR可以被称为Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-17；Chothia等人,1989,Nature 342:877-83)发现，虽然在氨基酸序列水平上具有显著多样性，但是Kabat CDR内的某些子部分采用几乎相同的肽骨架构象。这些子部分被命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指定轻链和重链区域。这些区域可以被称为ChothiaCDR，它们具有与Kabat CDR重叠的边界。与Kabat CDR重叠的定义CDR的其他边界已经描述于以下文献中：Padlan,1995,FASEB J.9:133-39；MacCallum,1996,J.Mol.Biol.262(5):732-45；和Lefranc,2003,Dev.Comp.Immunol.27:55-77。仍有其他CDR边界定义可能不严格遵循本文中的一个系统，但仍然会与Kabat CDR重叠，不过鉴于特定残基或残基组或甚至整个CDR不显著影响抗原结合的预测或实验发现，所述其他CDR边界可能会被缩短或延长。本文所用方法可以利用根据这些系统中的任一个系统定义的CDR，但是某些实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。使用氨基酸序列鉴定所预测的CDR是本领域中所熟知的，如在以下文献中：Martin,A.C.“Protein sequence and structure analysis of antibodyvariable domains,”In Antibody Engineering,第2卷.Kontermann R.,Dübel S.,编辑Springer-Verlag,柏林,第33-51页(2010)。还可以通过其他常规方法(例如，通过与其他重链和轻链可变区的已知氨基酸序列进行比较以确定具有序列超变性的区域)来检查重链和/或轻链可变结构域的氨基酸序列以鉴定CDR的序列。可以通过目测，或通过采用比对程序(如CLUSTAL程序套件中的一种)来比对已编号的序列，如以下文献中所述：Thompson,1994,Nucleic Acids Res.22:4673-80。便捷地使用分子模型来正确描绘框架和CDR区域，并由此校正基于序列的比对。
在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链或重链中的CDR/FR定义应基于IMGT定义(Lefranc等人Dev.Comp.Immunol.,2003,27(1):55-77；www.imgt.org)来确定。
如本文所用术语“Fc”是指包含得自抗体消化或通过其他手段产生的非抗原结合片段的序列的分子，所述分子呈单体或多聚体形式，并且所述“Fc”可以含有铰链区。天然Fc的原始免疫球蛋白来源优选地是人来源的，并且可以是任何免疫球蛋白。Fc分子由可通过共价(即，二硫键)和非共价结合连接成二聚体或多聚体形式的单体多肽组成。取决于类别(例如，IgG、IgA和IgE)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2和IgG4)，天然Fc分子的单体亚基之间分子间二硫键的数目在1至4范围内。Fc的一个例子是得自IgG的木瓜蛋白酶消化的二硫键合的二聚体。如本文所用术语“天然Fc”是单体、二聚体和多聚体形式通用的。
F(ab)片段通常包括一条轻链以及一条重链的VH和CH1结构域，其中F(ab)片段的VH-CH1重链部分无法与另一个重链多肽形成二硫键。如本文所用，F(ab)片段也可以包括含有被氨基酸接头隔开的两个可变结构域的一条轻链，以及含有被氨基酸接头隔开的两个可变结构域和CH1结构域的一条重链。
F(ab')片段通常包括一条轻链和含有更多恒定区的一条重链的一部分(在CH1与CH2结构域之间)，使得可以在两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')2分子。
如本文所用术语“结合蛋白”是指非天然存在的(或重组的或工程化的)分子，所述分子与至少一种靶抗原(例如，本公开文本的CD38多肽)特异性地结合。
“重组”分子是已经通过重组手段制备、表达、产生或分离的分子。
本公开文本的一个实施方案提供了对介于一种与三种之间的靶抗原具有生物和免疫特异性的结合蛋白。本公开文本的另一个实施方案提供了包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码形成此类结合蛋白的多肽链。本公开文本的另一个实施方案提供了包含核酸分子的表达载体，所述核酸分子包含编码形成此类结合蛋白的多肽链的核苷酸序列。本公开文本的又另一个实施方案提供了表达此类结合蛋白(即，包含编码形成此类结合蛋白的多肽链的核酸分子或载体)的宿主细胞。
如本文所用术语“可交换性”是指在结合蛋白形式内并且在保持折叠和最终结合亲和力的情况下可变结构域的互换性。“完全可交换性”是指在维持结合蛋白的完全功能性(如通过结合亲和力的保持所证实)的同时，交换式I的多肽链或式II的多肽链中的VH1和VH2结构域二者的顺序，并且由此交换VL1和VL2结构域的顺序(即，颠倒所述顺序)的能力。另外，应注意，名称VH和VL仅是指结构域在呈最终形式的特定蛋白质链上的位置。例如，VH1和VH2可以衍生自亲代抗体中的VL1和VL2结构域并被置入结合蛋白中的VH1和VH2位置中。同样，VL1和VL2可以衍生自亲代抗体中的VH1和VH2结构域并被置于结合蛋白中的VH1和VH2位置中。因此，VH和VL名称是指目前的位置而不是在亲代抗体中的原始位置。VH和VL结构域因此是“可交换的”。
如本文所用术语“抗原”或“靶抗原”或“抗原靶标”是指分子或分子的一部分，所述分子或分子的一部分能够被结合蛋白结合，并且另外能够被用于动物中以产生能够与该抗原的表位结合的抗体。靶抗原可具有一个或多个表位。关于由结合蛋白识别的每种靶抗原，所述结合蛋白能够与识别所述靶抗原的完整抗体竞争。
“CD38”是分化簇38多肽，并且是在许多免疫细胞的表面上发现的糖蛋白。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白结合一种或多种CD38多肽的细胞外结构域。示例性CD38细胞外结构域多肽序列包括但不限于人CD38的细胞外结构域(例如，如由SEQ ID NO:1表示)和食蟹猴CD38的细胞外结构域(例如，如由SEQ ID NO:30表示)。
术语“T细胞衔接器(engager)”是指针对宿主的免疫系统(更具体地针对T细胞的细胞毒活性)以及针对肿瘤靶蛋白的结合蛋白。
术语“单特异性结合蛋白”是指与一种抗原靶标特异性地结合的结合蛋白。
术语“单价结合蛋白”是指具有一个抗原结合位点的结合蛋白。
术语“双特异性结合蛋白”是指与两种不同抗原靶标特异性地结合的结合蛋白。在一些实施方案中，双特异性结合蛋白与两种不同抗原结合。在一些实施方案中，双特异性结合蛋白与相同抗原上的两种不同表位结合。
术语“二价结合蛋白”是指具有两个结合位点的结合蛋白。
术语“三特异性结合蛋白”是指与三种不同抗原靶标特异性地结合的结合蛋白。在一些实施方案中，三特异性结合蛋白与三种不同抗原结合。在一些实施方案中，三特异性结合蛋白与相同抗原上的一种、两种或三种不同表位结合。
术语“三价结合蛋白”是指具有三个结合位点的结合蛋白。在特定实施方案中，三价结合蛋白可以与一种抗原靶标结合。在其他实施方案中，三价结合蛋白可以与两种抗原靶标结合。在其他实施方案中，三价结合蛋白可以与三种抗原靶标结合。
“分离的”结合蛋白是已经鉴定并且从其天然环境的组分分离和/或回收的结合蛋白。其天然环境的污染物组分是会干扰结合蛋白的诊断或治疗应用的物质，并且可能包括酶、激素和其他蛋白质的或非蛋白质的溶质。在一些实施方案中，将结合蛋白纯化至：(1)如通过劳里法(Lowry method)所确定的抗体重量大于95％，并且最优选重量大于99％，(2)足以获得通过使用旋杯式序列分析仪所测的至少15个残基的N末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)通过在还原或非还原条件下的SDS-PAGE使用考马斯蓝或优选银染色，达到同质。分离的结合蛋白包括重组细胞内的原位结合蛋白，因为结合蛋白的天然环境中的至少一种组分将不存在。
如本文所用术语“基本上纯的”或“基本上纯化的”是指作为存在的主要种类(即，以摩尔计，其比组合物中的任何其他单独种类更丰富)的化合物或种类。在一些实施方案中，基本上纯化的级分是如下组合物，在所述组合物中所述种类占存在的所有大分子种类的至少约50％(以摩尔计)。在其他实施方案中，基本上纯的组合物将包含组合物中存在的大于约80％、85％、90％、95％或99％的所有大分子种类。在仍其他实施方案中，将所述种类纯化至基本同质(通过常规检测方法不能检测到组合物中的污染物种类)，其中所述组合物基本上由单一大分子种类组成。
术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性地结合的任何决定簇、优选多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团(grouping)，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是抗原中被抗体或结合蛋白结合的区域。在某些实施方案中，当结合蛋白在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，称结合蛋白特异性地结合抗原。在一些实施方案中，当平衡解离常数≤10-8M时、更优选地在平衡解离常数≤10-9M时并且最优选地在解离常数≤10-10M时，称结合蛋白特异性地结合抗原。
结合蛋白的解离常数(KD)可以例如通过表面等离子体共振来确定。通常，表面等离子体共振分析通过表面等离子体共振(SPR)使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor；皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州)测量配体(生物传感器基质上的靶抗原)与分析物(溶液中的结合蛋白)之间的实时结合相互作用。表面等离子体分析也可以通过固定分析物(生物传感器基质上的结合蛋白)并呈递配体(靶抗原)来进行。如本文所用术语“KD”是指特定结合蛋白与靶抗原之间的相互作用的解离常数。
如本文所用的关于结合蛋白的术语“与……结合”是指结合蛋白或其抗原结合片段以至少约1x10-6M、1x10-7M、1x10-8M、1x10-9M、1x10-10M、1x10-11M、1x10-12M或更大的Kd与含有表位的抗原结合的能力，和/或以比所述结合蛋白或其抗原结合片段对非特异性抗原的亲和力大至少两倍的亲和力与表位结合的能力。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白与两种或更多种抗原(例如，人和食蟹猴CD38多肽)结合。
在一些实施方案中，本公开文本的抗原结合结构域和/或结合蛋白与人和食蟹猴CD38多肽(例如，CD38细胞外结构域，如SEQ ID NO:1(人CD38亚型A)、SEQ ID NO:105(人CD38亚型E)和SEQ ID NO:30(食蟹猴CD38))“交叉反应”。在对以下两种抗原的EC50在类似范围内时，与抗原1(Ag1)结合的结合蛋白可与抗原2(Ag2)“交叉反应”。在本申请中，当Ag2的亲和力与Ag1的亲和力的比率等于或小于10(例如5、2、1或0.5)时，与Ag1结合的结合蛋白可与Ag2交叉反应，两种抗原的亲和力是用相同方法测量的。
在对两种抗原的亲和力极为不同时，与Ag1结合的结合蛋白与Ag2“不显著地交叉反应”。如果结合反应过低，对Ag2的亲和力可能无法测量。在本申请中，当在相同实验环境中和在相同抗体浓度下，结合蛋白与Ag2的结合反应小于相同结合蛋白与Ag1的结合反应的5％时，与Ag1结合的结合蛋白与Ag2不显著地交叉反应。在实践中，所用结合蛋白浓度可以是EC50或达到用Ag1获得的饱和平稳状态所需的浓度。
如本文所用术语“接头”是指在免疫球蛋白结构域之间插入的一个或多个氨基酸残基，它们为轻链和重链的结构域提供足够的移动性，以折叠成在双重可变区免疫球蛋白上的交叉。在序列水平上，接头分别是在可变结构域之间或可变结构域与恒定结构域之间的过渡处插入。因为免疫球蛋白结构域的大致大小已经被充分理解，所以可以鉴定结构域之间的过渡。结构域过渡的准确位置可以通过定位没有形成(如通过实验数据所显示或者如通过建模或二级结构预测的技术可以假定的)二级结构元件(如β片层或α螺旋)的肽延伸段来确定。本文所述接头被称为L1，其位于VL2结构域的C末端与VL1结构域的N末端之间的轻链上；以及L2，其位于VL1结构域的C末端与CL结构域的N末端之间的轻链上。重链接头被称为L3，其位于VH1结构域的C末端与VH2结构域的N末端之间；以及L4，其位于VH2结构域的C末端与CH1结构域的N末端之间。
如本文所用术语“载体”是指用于将编码信息转移至宿主细胞的任何分子(例如，核酸、质粒或病毒)。术语“载体”包括能够运输已经与其连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它是指可以将另外的DNA区段插入其中的环状双链DNA分子。另一种类型的载体是病毒载体，其中可以将另外的DNA区段插入病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在被引入宿主细胞中之后整合至宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”(或者简单地，“表达载体”)。一般来说，用于重组DNA技术中的表达载体通常呈质粒形式。术语“质粒”和“载体”在本文中可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本公开文本意图包括发挥同等功能的其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷性逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所用短语“重组宿主细胞”(或“宿主细胞”)是指已经将重组表达载体引入其中的细胞。重组宿主细胞或宿主细胞意图不仅是指特定的受试者细胞，而且是指这种细胞的子代。因为后代中可能由于突变或环境影响而发生某些修饰，所以这种子代可能实际上与亲代细胞不同，但是此类细胞仍包括在如本文所用术语“宿主细胞”的范围内。众多种宿主细胞表达系统可以用于表达结合蛋白，所述表达系统包括细菌、酵母、杆状病毒和哺乳动物表达系统(以及噬菌体展示表达系统)。合适的细菌表达载体的例子是pUC19。为了重组表达结合蛋白，用携带编码结合蛋白多肽链的DNA片段的一种或多种重组表达载体转化或转染宿主细胞，使得在所述宿主细胞中表达所述多肽链并且优选地分泌到培养所述宿主细胞的培养基中，从而可以从所述培养基回收所述结合蛋白。
如本文所用术语“转化”是指细胞的遗传特征的变化，并且当细胞被修饰而含有新DNA时，所述细胞已经被转化。例如，如果细胞从其天然状态进行遗传修饰，则所述细胞被转化。在转化后，转化DNA可以通过物理整合至细胞的染色体中与细胞的DNA重组，或者可以在不被复制的情况下短暂维持为附加型元件，或者可以作为质粒独立复制。当DNA随着细胞分裂进行复制时，认为细胞已经被稳定转化。如本文所用术语“转染”是指细胞摄取外来或外源DNA，并且当已经将外源DNA引入细胞膜内时，细胞已经被“转染”。多种转染技术是本领域中熟知的。此类技术可以用于将一种或多种外源DNA分子引入合适的宿主细胞中。
如本文所用并应用于对象的术语“天然存在的”是指以下事实：所述对象可以在自然界中发现并且尚未被人操纵。例如，可以从自然界中的来源分离并且尚未被人有意修饰的存在于生物体(包括病毒)中的多核苷酸或多肽是天然存在的。类似地，如本文所用的“非天然存在的”是指在自然界中没有发现或者已经被人进行结构修饰或合成的对象。
如本文所用，二十种常规氨基酸和它们的缩写遵循常规用法。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，d-氨基酸)；非天然氨基酸和类似物(如α-,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸)也可以是结合蛋白多肽链的合适组分。非常规氨基酸的例子包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸以及其他类似氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽表示法中，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向并且右手方向是羧基末端方向。
可以基于常见测量特性将天然存在的残基分为多个类别：
(1)疏水性的：Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Tyr、Pro；
(2)极性亲水性的：Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Lys、Ser、Thr；
(3)脂肪族的：Ala、Gly、Ile、Leu、Val、Pro；
(4)脂肪族疏水性的：Ala、Ile、Leu、Val、Pro；
(5)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(6)酸性的：Asp、Glu；
(7)碱性的：His、Lys、Arg；
(8)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(9)芳香族的：His、Trp、Tyr、Phe；和
(10)芳香族疏水性的：Phe、Trp、Tyr。
保守氨基酸取代可以涉及这些类别中一个类别的成员与同一类别中另一个成员的交换。非保守取代可以涉及这些类别中一个类别的成员与另一个类别的成员的交换。
技术人员将能够使用熟知的技术确定结合蛋白多肽链的合适变体。例如，本领域技术人员可以通过靶向被认为对活性不重要的区域来鉴定多肽链中可以在不破坏活性的情况下改变的合适区域。可替代地，本领域技术人员可以鉴定分子中在相似多肽之间保守的残基和部分。另外，甚至也可以使可能对生物活性或对结构重要的区域在不破坏生物活性的情况下或在不对多肽结构造成不良影响的情况下经历保守氨基酸取代。
如本文所用术语“患者”包括人和动物受试者(例如，哺乳动物，如狗、猪、马、猫、牛等)。
如本文所用术语“治疗”(treatment或treat)是指治疗性治疗和预防性的或预防的措施二者。需要治疗的那些包括患有障碍的那些以及易患障碍的那些或要预防障碍的那些。在特定实施方案中，结合蛋白可以用于治疗患有慢性病毒感染的人，或改善人受试者的慢性病毒感染。
如本文所用术语“药物组合物”或“治疗组合物”是指在适当给予至患者时能够诱导所需治疗效果的化合物或组合物。
如本文所用术语“药学上可接受的载体”或“生理上可接受的载体”是指适于实现或增强结合蛋白的递送的一种或多种配制材料。
术语“有效量”和“治疗有效量”在关于包含一种或多种结合蛋白的药物组合物使用时是指足以产生所需治疗结果的量或剂量。更具体地，治疗有效量是足以将与所治疗病症相关的一种或多种临床上定义的病理过程抑制一定时间段的结合蛋白的量。有效量可以根据所用的特定结合蛋白而变化，并且还取决于与所治疗患者和障碍的严重程度相关的多种因素和状况。例如，如果要在体内给予结合蛋白，则诸如患者的年龄、体重和健康状况以及在临床前动物工作中获得的剂量反应曲线和毒性数据等因素将属于所考虑的那些因素。给定的药物组合物的有效量或治疗有效量的确定是本领域技术人员熟练掌握的。
本公开文本的一个实施方案提供包含药学上可接受的载体和治疗有效量的结合蛋白的药物组合物。
三特异性结合蛋白
本公开文本的某些方面涉及三特异性结合蛋白(例如，其结合CD38、CD28和CD3多肽)。本文所述的任何抗原结合蛋白的任何CDR或可变结构域可以用于本公开文本的三特异性结合蛋白中。
在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白是包含四条多肽链的三特异性结合蛋白，所述四条多肽链形成结合一种或多种(例如，三种)不同抗原标靶或靶蛋白的三个抗原结合位点。在一些实施方案中，第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
并且第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
并且第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
并且第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接所述CH1与CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链具有形成两个不同抗原结合位点的交叉取向。
在一些实施方案中，VH1和VL1形成结合CD28多肽的第一抗原结合位点，其中VH2和VL2形成结合CD3多肽的第二抗原结合位点，并且其中VH3和VL3形成结合CD38多肽的第三抗原结合位点。在一些实施方案中，CD28多肽是人CD28多肽。在一些实施方案中，CD3多肽是人CD3多肽。在一些实施方案中，CD38多肽是人CD38多肽。在一些实施方案中，三特异性结合蛋白包含下文所述的一个或多个抗原结合位点。
本公开文本的结合蛋白可以使用从任何人抗体或非人抗体(包括例如，人抗体、鼠抗体或人源化抗体)获得或衍生的结构域或序列来制备。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白是抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
抗CD38结合位点
本公开文本的某些方面涉及包含结合CD38多肽(例如，人和食蟹猴CD38多肽)的抗原结合位点的结合蛋白。
在一些实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段与人CD38(例如，人CD38亚型A和/或亚型E多肽)和食蟹猴CD38交叉反应。在一些实施方案中，结合蛋白诱导CD38+细胞的细胞凋亡。在一些实施方案中，结合蛋白将T细胞募集至CD38+细胞并任选地(例如，通过TCR刺激和/或共刺激)激活T细胞。
在一些实施方案中，结合CD38的结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和/或抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，结合CD38的结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和/或抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQG(SEQ ID NO:132)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有LAS(SEQID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ IDNO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，结合蛋白包含来自以下项的抗体VH和/或VL结构域序列的1、2、3、4、5或6个CDR：抗CD38_C2-CD38-1、抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1、抗CD38_C2-CD38-1_VH3-VL3、抗CD38_C2-CD38-1_VH5-VL3、抗CD38_C2-CD38-1_VH6-VL3、CD38HHY1370(在本文中也可以称为抗CD38_1370)、抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG4FALA、抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3midIgG1LALAP329A、抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA、CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA、CD38HHY1370xCD28supxCD3midIgG1LALA P329A或CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA，如表G、H或I中所示。
在一些实施方案中，结合CD38的结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)或QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有LAS(SEQ ID NO:35)或GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
在一些实施方案中，结合CD38的结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和/或抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，结合CD38的结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在其他实施方案中，结合CD38的结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和/或抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，结合CD38的结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有QSVSSYGQGF(SEQID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
在一些实施方案中，VH结构域从N末端至C末端包含序列FR1—CDR-H1—FR2—CDR-H2—FR3—CDR-H3—FR4；其中FR1包含序列QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:86)、QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:87)或QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(SEQ ID NO:88)；其中FR2包含序列MHWVKEAPGQRLEWIGY(SEQ ID NO:90)或MHWVKEAPGQGLEWIGY(SEQ IDNO:91)；其中FR3包含序列NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(SEQ ID NO:93)或NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(SEQ ID NO:94)；并且其中FR4包含序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:96)。在一些实施方案中，VL结构域从N末端至C末端包含序列FR1—CDR-L1—FR2—CDR-L2—FR3—CDR-L3—FR4；其中FR1包含序列DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRAS(SEQ ID NO:97)；其中FR2包含序列MHWYQQKPGQPPRLLIY(SEQID NO:99)；其中FR3包含序列SRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:101)；并且其中FR4包含序列FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:103)。
在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；并且/或者VL结构域包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQID NO:17的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；并且/或者VL结构域包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；并且/或者VL结构域包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；并且/或者VL结构域包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；并且/或者VL结构域包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；并且VL结构域包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQID NO:17的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；并且VL结构域包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；并且VL结构域包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；并且VL结构域包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；并且VL结构域包含与SEQ IDNO:14的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；并且VL结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；并且VL结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQID NO:21的氨基酸序列；并且VL结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；并且VL结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；并且VL结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，结合CD38的结合位点包含：含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的抗体重链和/或含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含：含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的抗体重链和/或含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含：含有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的抗体重链和/或含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含：含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的抗体重链和/或含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含：含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的抗体重链和/或含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的抗体轻链。
在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含：含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含：含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含：含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含：含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQID NO:20的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含：含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的抗体轻链。
在一些实施方案中，结合CD38的结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和/或抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有LQDYIYYPT(SEQID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，结合CD38的结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARMFRGAFDY(SEQ IDNO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有QGIRND(SEQID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
在一些实施方案中，VH结构域从N末端至C末端包含序列FR1—CDR-H1—FR2—CDR-H2—FR3—CDR-H3—FR4；其中FR1包含序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS(SEQ ID NO:89)；其中FR2包含序列MHWVRQAPGKGLEWVAV(SEQ ID NO:92)；其中FR3包含序列YYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO:95)；并且其中FR4包含序列WGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:96)。在一些实施方案中，VL结构域从N末端至C末端包含序列FR1—CDR-L1—FR2—CDR-L2—FR3—CDR-L3—FR4；其中FR1包含序列AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS(SEQ ID NO:98)；其中FR2包含序列GWYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:100)；其中FR3包含序列SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYC(SEQ ID NO:102)；并且其中FR4包含序列WGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:104)。
在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；并且/或者VL结构域包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH结构域包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列；并且VL结构域包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列；并且VL结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含：含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的抗体重链或含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的抗体轻链。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含：含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的抗体重链和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的抗体轻链。
抗CD28结合位点
本公开文本的某些方面涉及包含结合CD28多肽(例如，人CD28多肽)的抗原结合位点的结合蛋白。
在一些实施方案中，结合CD28的结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSYY(SEQ ID NO:108)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNVNT(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有TRSHYGLDWNFDV(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和/或抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有QNIYVW(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有KAS(SEQ ID NO:112)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQGQTYPY(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，结合CD28的结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GYTFTSYY(SEQ ID NO:108)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNVNT(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有TRSHYGLDWNFDV(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有QNIYVW(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有KAS(SEQ ID NO:112)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQGQTYPY(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
在一些实施方案中，结合CD28的结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GFSLSDYG(SEQ ID NO:114)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IWAGGGT(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARDKGYSYYYSMDY(SEQ ID NO:116)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和/或抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVEYYVTSL(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有AAS(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQSRKVPYT(SEQ ID NO:119)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，结合CD28的结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GFSLSDYG(SEQ ID NO:114)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IWAGGGT(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARDKGYSYYYSMDY(SEQ ID NO:116)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有ESVEYYVTSL(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有AAS(SEQ IDNO:118)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQSRKVPYT(SEQ ID NO:119)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
抗CD3结合位点
本公开文本的某些方面涉及包含结合CD3多肽(例如，人CD3多肽)的抗原结合位点的结合蛋白。
在一些实施方案中，结合CD3的结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GFTFTKAW(SEQ ID NO:120)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IKDKSNSYAT(SEQ ID NO:121)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有RGVYYALSPFDY(SEQ ID NO:122)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和/或抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有QSLVHNNANTY(SEQ ID NO:123)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有KVS(SEQ ID NO:124)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有GQGTQYPFT(SEQ ID NO:125)的氨基酸序列的CDR-L3序列。在一些实施方案中，结合CD3的结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GFTFTKAW(SEQ ID NO:120)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IKDKSNSYAT(SEQ ID NO:121)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有RGVYYALSPFDY(SEQ ID NO:122)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有QSLVHNNANTY(SEQ ID NO:123)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有KVS(SEQ IDNO:124)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有GQGTQYPFT(SEQ ID NO:125)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
在一些实施方案中，结合CD3的结合位点包含：抗体重链可变(VH)结构域，其包含含有GFTFTKAW(SEQ ID NO:126)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IKDKSNSYAT(SEQ ID NO:127)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有GVYYALSPFDY(SEQ ID NO:128)的氨基酸序列的CDR-H3序列；和/或抗体轻链可变(VL)结构域，其包含含有QSLVHNNGNTY(SEQ ID NO:129)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有KVS(SEQ ID NO:130)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有GQGTQYPFT(SEQ ID NO:131)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
在本公开文本的任何三特异性结合蛋白的一些实施方案中，一个抗原结合结构域与CD3多肽(例如，人CD3)结合并且一个抗原结合结构域与CD28多肽(例如，人CD28)结合。在一些实施方案中，VH1结构域包含如表H中所示的来自SEQ ID NO:49或51的三个CDR，并且VL1结构域包含如表H中所示的来自SEQ ID NO:50或52的三个CDR。在一些实施方案中，VH2结构域包含如表H中所示的来自SEQ ID NO:49或51的三个CDR，并且VL2结构域包含如表H中所示的来自SEQ ID NO:50或52的三个CDR。在一些实施方案中，VH1结构域包含如表H中所示的来自SEQ ID NO:53或84的三个CDR，并且VL1结构域包含如表H中所示的来自SEQ ID NO:54或85的三个CDR。在一些实施方案中，VH2结构域包含如表H中所示的来自SEQ ID NO:53或84的三个CDR，并且VL2结构域包含如表H中所示的来自SEQ ID NO:54或85的三个CDR。
在一些实施方案中，VH1结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，VL1结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，VH2结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，并且VL2结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH2结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，VL2结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，VH1结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，并且VL1结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH1结构域包含SEQID NO:51的氨基酸序列，VL1结构域包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，VH2结构域包含SEQ IDNO:53的氨基酸序列，并且VL2结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH2结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，VL2结构域包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，VH1结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，并且VL1结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH1结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，VL1结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，VH2结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，VL2结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，VH3结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且VL3结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH1结构域包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，VL1结构域包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，VH2结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，VL2结构域包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，VH3结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，并且VL3结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第二多肽链包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第三多肽链包含与SEQ ID NO:62的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，并且第四多肽链包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列。在某些实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第二多肽链包含与SEQ IDNO:64的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第三多肽链包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，并且第四多肽链包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列。在某些实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第二多肽链包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第三多肽链包含与SEQ ID NO:67的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，并且第四多肽链包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列。在某些实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第二多肽链包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第三多肽链包含与SEQ IDNO:68的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，并且第四多肽链包含与SEQ ID NO:69的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列。在某些实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第二多肽链包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第三多肽链包含与SEQ ID NO:70的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，并且第四多肽链包含与SEQ ID NO:69的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列。在某些实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第二多肽链包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，第三多肽链包含与SEQ ID NO:71的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列，并且第四多肽链包含与SEQID NO:69的氨基酸序列至少95％相同的多肽序列。
在某些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，并且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列，并且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，并且所述第四多肽链包含SEQ IDNO:69的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，并且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，并且所述第四多肽链包含SEQID NO:69的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含表G中所示的抗体序列的1、2、3、4、5或6个CDR序列。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含表H中所示的抗体序列的1、2、3、4、5或6个CDR序列、VH结构域序列和/或VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含表I中所示的抗体序列的1、2、3、4、5或6个CDR序列、VH结构域序列和/或VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含表I中所示的1、2、3或4个多肽序列。
表G.抗CD38结合蛋白的CDR序列。
Figure BDA0003093959560000411
Figure BDA0003093959560000421
表H.抗CD38和其他结合蛋白的可变结构域序列。
Figure BDA0003093959560000422
Figure BDA0003093959560000431
Figure BDA0003093959560000441
注意：在上文氨基酸序列中，CDR序列为粗体并加下划线。
表I.结合蛋白的全长序列。
Figure BDA0003093959560000451
Figure BDA0003093959560000461
Figure BDA0003093959560000471
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Figure BDA0003093959560000571
Figure BDA0003093959560000581
表J.结合蛋白的全长多核苷酸序列。
Figure BDA0003093959560000582
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Figure BDA0003093959560000601
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Figure BDA0003093959560000781
CD38多肽
在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含结合人CD38多肽的细胞外结构域和食蟹猴CD38多肽的细胞外结构域的抗原结合位点。用于确定抗原结合位点是否结合抗原的示例性测定描述于本文中并且是本领域中已知的。在一些实施方案中，结合是通过ELISA测定来确定的，例如，如下文所述。在一些实施方案中，结合是通过SPR测定来确定的，例如，如下文所述。在一些实施方案中，结合是通过流式细胞术测定使用在其细胞表面上表达CD38多肽的细胞来确定的，例如，如下文所述。
在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白结合包含SEQ ID NO:1和/或30的氨基酸序列的纯化的多肽或其片段(例如，如通过ELISA或SPR所测量)。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白结合当在细胞表面上表达时包含SEQ ID NO:1和/或30的氨基酸序列的多肽(例如，如通过流式细胞术所测量)。
在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白与CD38亚型A多肽(例如，包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列)结合。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白与CD38亚型E多肽(例如，包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列并且不包含SEQ ID NO:1的完整氨基酸序列，由SEQID NO:105的氨基酸序列组成，或者基本上由SEQ ID NO:105的氨基酸序列组成)结合。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白与CD38亚型A多肽(例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列)和CD38亚型E多肽(例如，包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列并且不包含SEQ ID NO:1的完整氨基酸序列，由SEQ ID NO:105的氨基酸序列组成，或者基本上由SEQ ID NO:105的氨基酸序列组成)结合。不希望受理论束缚，认为与CD38亚型E多肽结合可以例如，在使本公开文本的结合蛋白靶向表达CD38亚型E多肽的一种或多种细胞方面是有利的。
人CD38亚型A细胞外结构域多肽序列
RWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAF KGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI(SEQ ID NO:1)
人CD38亚型E多肽序列
RWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRHFWECGSP(SEQ ID NO:105)
在一些实施方案中，人CD38多肽的细胞外结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，食蟹猴CD38多肽的细胞外结构域包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
食蟹猴CD38多肽序列
RWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI(SEQ ID NO:30)
接头
在一些实施方案中，接头L1、L2、L3和L4在无氨基酸(长度＝0)至约100个氨基酸的长度的范围内，或小于100、50、40、30、20或15个氨基酸或更小。接头还可以是10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸的长度。一种结合蛋白中的L1、L2、L3和L4可以都具有相同氨基酸序列或者可以都具有不同氨基酸序列。
合适的接头的例子包括单个甘氨酸(Gly)残基；二甘氨酸肽(Gly-Gly)；三肽(Gly-Gly-Gly)；具有四个甘氨酸残基的肽；具有五个甘氨酸残基的肽；具有六个甘氨酸残基的肽；具有七个甘氨酸残基的肽；和具有八个甘氨酸残基的肽。可以使用氨基酸残基的其他组合，如肽GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、肽GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、肽TKGPS(SEQID NO:57)、肽GQPKAAP(SEQ ID NO:58)和肽GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)。上文列出的例子不意图以任何方式限制本公开文本的范围，并且已经显示包含选自以下项的随机选择的氨基酸的接头在结合蛋白中是合适的：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸和脯氨酸。对于接头序列的其他描述，参见例如，WO 2012135345和国际申请号PCT/US2017/027488。
接头中氨基酸残基的身份和序列可以根据接头中需要实现的二级结构元件的类型而变化。例如，甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸对于具有最大柔性的接头是最佳的。如果需要刚性更强且延长的接头，则可使用甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸的一些组合。根据所需的特性，必要时可以将任何氨基酸残基与其他氨基酸残基的组合视为接头，以构建较大肽接头。
在一些实施方案中，L1、L2、L3或L4中至少一个独立地为0个氨基酸的长度。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L4各自独立地为至少一个氨基酸的长度。在一些实施方案中，L1的长度是L3的长度的至少两倍。在一些实施方案中，L2的长度是L4的长度的至少两倍。在一些实施方案中，L1的长度是L3的长度的至少两倍，并且L2的长度是L4的长度的至少两倍。在一些实施方案中，L1为3至12个氨基酸残基的长度，L2为3至14个氨基酸残基的长度，L3为1至8个氨基酸残基的长度，并且L4为1至3个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，L1为5至10个氨基酸残基的长度，L2为5至8个氨基酸残基的长度，L3为1至5个氨基酸残基的长度，并且L4为1至2个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，L1为7个氨基酸残基的长度，L2为5个氨基酸残基的长度，L3为1个氨基酸残基的长度，并且L4为2个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，L1为10个氨基酸残基的长度，L2为10个氨基酸残基的长度，L3为0个氨基酸残基的长度，并且L4为0个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自具有0至15个氨基酸(例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)的独立选择的长度，其中至少两种接头具有1至15个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)的长度。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自为0个氨基酸的长度。
在一些实施方案中，L1、L2、L3和/或L4在抗体可变结构域与抗体恒定结构域之间的接合处包含衍生自天然存在的序列的序列(例如，如WO2012/135345中所述)。例如，在一些实施方案中，接头包含在内源VH与CH1结构域之间或在内源VL与CL结构域(例如，κ或λ)之间的过渡处发现的序列。在一些实施方案中，接头包含在内源人VH与CH1结构域之间或在内源人VL与CL结构域(例如，人κ或λ)之间的过渡处发现的序列。
在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自独立地为零个氨基酸的长度，或者包含选自以下项的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO:57)、GQPKAAP(SEQ ID NO:58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自独立地包含选自以下项的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO:57)、GQPKAAP(SEQ ID NO:58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)。
在一些实施方案中，L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO:58)，L2包含序列TKGPS(SEQID NO:57)，L3包含序列S，并且L4包含序列RT。在一些实施方案中，L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)，L3为0个氨基酸的长度，并且L4为0个氨基酸的长度。在一些实施方案中，L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)，L3为0个氨基酸的长度，并且L4为0个氨基酸的长度。在一些实施方案中，L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)，L2为0个氨基酸的长度，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)，并且L4为0个氨基酸的长度。
Fc区域和恒定结构域
在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含全长抗体重链或含有Fc区域的多肽链。在一些实施方案中，Fc区域是人Fc区域，例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区域。在一些实施方案中，Fc区域包括抗体铰链、CH1、CH2、CH3以及任选的CH4结构域。在一些实施方案中，Fc区域是人IgG1 Fc区域。在一些实施方案中，Fc区域是人IgG4 Fc区域。在一些实施方案中，Fc区域包括下文所述的一种或多种突变。
在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包括一个或两个Fc变体。如本文所用术语“Fc变体”是指从天然Fc修饰但仍包含补救受体FcRn(新生儿Fc受体)的结合位点的分子或序列。示例性Fc变体及其与补救受体的相互作用是本领域中已知的。因此，术语“Fc变体”可以包含从非人天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含如下区域，所述区域可以被去除，因为其提供本发明的抗体样结合蛋白不需要的结构特征或生物活性。因此，术语“Fc变体”包含缺少一个或多个天然Fc位点或残基或其中一个或多个Fc位点或残基已经被修饰的分子或序列，所述位点或残基影响或涉及：(1)二硫键形成，(2)与所选宿主细胞的不相容性，(3)在所选宿主细胞中表达后的N末端异质性，(4)糖基化，(5)与补体的相互作用，(6)与除了补救受体以外的Fc受体的结合，或(7)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
在一些实施方案中，Fc区域包含一个或多个突变，所述突变降低或消除Fc区域的Fc受体结合和/或效应子功能(例如，Fc受体介导的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC))。
在一些实施方案中，Fc区域是人IgG1 Fc区域，其包含根据EU索引在对应于人IgG1的位置234、235和/或329的位置处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是L234A、L235A和/或P329A。在一些实施方案中，Fc区域是人IgG1 Fc区域，其包含根据EU索引在对应于人IgG1的位置298、299和/或300的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S298N、T299A和/或Y300S。
在一些实施方案中，Fc区域是人IgG4 Fc区域，其包含降低或消除FcγI和/或FcγII结合的一个或多个突变。在一些实施方案中，Fc区域是人IgG4 Fc区域，其包含降低或消除FcγI和/或FcγII结合但不影响FcRn结合的一个或多个突变。在一些实施方案中，Fc区域是人IgG4 Fc区域，其包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置228和/或409的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S228P和/或R409K。在一些实施方案中，Fc区域是人IgG4Fc区域，其包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置234和/或235的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是F234A和/或L235A。在一些实施方案中，Fc区域是人IgG4 Fc区域，其包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置228、234、235和/或409的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S228P、F234A、L235A和/或R409K。在一些实施方案中，Fc区域是人IgG4 Fc区域，其包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置233-236的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236处的缺失。在一些实施方案中，Fc区域是人IgG4 Fc区域，其包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置228、233-236和/或409的取代处的氨基酸突变。在一些实施方案中，氨基酸突变是S228P；E233P、F234V、L235A和在236处的缺失；和/或R409K。
在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含一个或多个突变以例如通过调节对纯化试剂的亲和力来改善纯化。例如，已知如果异二聚体形式的两个Fc区域中的一个含有降低或消除与蛋白A的结合的一个或多个突变，则可以将异二聚体结合蛋白从其同二聚体形式选择性纯化出来，因为与任一同二聚体形式相比，异二聚体形式将具有对基于蛋白A的纯化的中间亲和力并且可以例如通过使用不同pH从蛋白A选择性地洗脱(参见例如，Smith,E.J.等人(2015)Sci.Rep.5:17943)。在一些实施方案中，突变包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置435和436的位置处的取代，其中所述氨基酸取代是H435R和Y436F。在一些实施方案中，结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，所述第一Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；和第三多肽链，所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，所述第二Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；并且其中第一和第二Fc区域中仅一个包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置435和436的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是H435R和Y436F。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含杵和臼突变以及用于改善纯化的一个或多个突变。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区域是人IgG1 Fc区域。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区域是人IgG4 Fc区域。
在一些实施方案中，一个或两个Fc区域是人IgG4 Fc区域，所述人IgG4 Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置233-236的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236处的缺失。在一些实施方案中，Fc区域是人IgG4Fc区域，其包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置228、233-236和/或409的取代处的氨基酸突变。在一些实施方案中，氨基酸突变是S228P；E233P、F234V、L235A和在236处的缺失；和/或R409K。在一些实施方案中，一个或两个Fc区域是人IgG1 Fc区域，所述人IgG1 Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG1的位置234、235和/或329的位置处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是L234A、L235A和/或P329A。在一些实施方案中，Fc区域是人IgG1 Fc区域，其包含根据EU索引在对应于人IgG1的位置298、299和/或300的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S298N、T299A和/或Y300S。
为了提高一些结合蛋白(例如，双特异性或三特异性结合蛋白)的产量，可以通过“杵臼结构”技术改变CH3结构域，所述杵臼结构技术通过几个例子详细描述于例如以下文献中：国际公开号WO 96/027011；Ridgway等人,1996,Protein Eng.9:617-21；和Merchant等人,1998,Nat.Biotechnol.16:677-81。具体地，改变两个CH3结构域的相互作用表面以增加含有这两个CH3结构域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域中的每一个可以是“杵”，而另一个是“臼”。二硫桥的引入进一步稳定异二聚体(Merchant等人,1998；Atwell等人,1997,J.Mol.Biol.270:26-35)并增加产量。在特定实施方案中，杵位于具有单一可变结构域的第二对多肽上。在其他实施方案中，杵位于具有交叉取向的第一对多肽上。在又其他实施方案中，CH3结构域不包括臼中的杵。
在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白(例如，三特异性结合蛋白)包含第二多肽链上的“杵”突变和第三多肽链上的“臼”突变。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含第三多肽链上的“杵”突变和第二多肽链上的“臼”突变。在一些实施方案中，“杵”突变包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置354和/或366的位置处的一个或多个取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S354C、T366W、T366Y、S354C和T366W，或S354C和T366Y。在一些实施方案中，“杵”突变包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置354和366的位置处的取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S354C和T366W。在一些实施方案中，“臼”突变包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置407以及任选的349、366和/或368的位置处的一个或多个取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是Y407V或Y407T以及任选的Y349C、T366S和/或L368A。在一些实施方案中，“臼”突变包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置处的取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，所述第一Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第一Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置366以及任选的354的位置处的一个或多个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是T366W或T366Y以及任选的S354C；并且其中所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，所述第二Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第二Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置407以及任选的349、366和/或368的位置处的一个或多个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是Y407V或Y407T以及任选的Y349C、T366S和/或L368A。
在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，所述第一Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第一Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置407以及任选的349、366和/或368的位置处的一个或多个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是Y407V或Y407T以及任选的Y349C、T366S和/或L368A；并且其中所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，所述第二Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第二Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置366以及任选的354的位置处的一个或多个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是T366W或T366Y以及任选的S354C。
在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，所述第一Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第一Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置366的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是T366W；并且其中所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，所述第二Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第二Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置366、368和/或407的位置处的一个或多个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是T366S、L368A和/或Y407V。
在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，所述第一Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第一Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4位置366、368和/或407的位置处的一个或多个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是T366S、L368A和/或Y407V；并且其中所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，所述第二Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第二Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置366的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是T366W。
在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，所述第一Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第一Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置354和366的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S354C和T366W；并且其中所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，所述第二Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第二Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，所述第一Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第一Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；并且其中所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，所述第二Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第二Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置354和366的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S354C和T366W。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区域是人IgG1 Fc区域。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区域是人IgG4Fc区域。
在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，其中所述第一Fc区域是人IgG4 Fc区域，所述人IgG4 Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第一Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置228、354、366和409的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S228P、S354C、T366W和R409K；并且其中所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，其中所述第二Fc区域是人IgG4 Fc区域，所述人IgG4 Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第二Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置228、349、366、368、407和409的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S228P、Y349C、T366S、L368A、Y407V和R409K。在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，其中所述第一Fc区域是人IgG4 Fc区域，所述人IgG4 Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第一Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置228、349、366、368、407和409的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S228P、Y349C、T366S、L368A、Y407V和R409K；并且其中所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，其中所述第二Fc区域是人IgG4 Fc区域，所述人IgG4 Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第二Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置228、354、366和409的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S228P、S354C、T366W和R409K。
在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，其中所述第一Fc区域是人IgG4 Fc区域，所述人IgG4 Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第一Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置234、235、354和366的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是F234A、L235A、S354C和T366W；并且其中所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，其中所述第二Fc区域是人IgG4 Fc区域，所述人IgG4 Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第二Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置234、235、349、366、368和407的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是F234A、L235A、Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，其中所述第一Fc区域是人IgG4 Fc区域，所述人IgG4 Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第一Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置234、235、349、366、368和407的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是F234A、L235A、Y349C、T366S、L368A和Y407V；并且其中所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，其中所述第二Fc区域是人IgG4 Fc区域，所述人IgG4 Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第二Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置234、235、354和366的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是F234A、L235A、S354C和T366W。
在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，其中所述第一Fc区域是人IgG4 Fc区域，所述人IgG4 Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第一Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置228、234、235、354、366和409的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S228P、F234A、L235A、S354C、T366W和R409K；并且其中所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，其中所述第二Fc区域是人IgG4 Fc区域，所述人IgG4 Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第二Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置228、234、235、349、366、368、407和409的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S228P、F234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V和R409K。在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，其中所述第一Fc区域是人IgG4 Fc区域，所述人IgG4 Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第一Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置228、234、235、349、366、368、407和409的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S228P、F234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V和R409K；并且其中所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，其中所述第二Fc区域是人IgG4 Fc区域，所述人IgG4 Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第二Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置228、234、235、354、366和409的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S228P、F234A、L235A、S354C、T366W和R409K。
在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含一个或多个突变以提高血清半衰期(参见例如，Hinton,P.R.等人(2006)J.Immunol.176(1):346-56)。在一些实施方案中，突变包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置428和434的位置处的取代，其中所述氨基酸取代是M428L和N434S。在一些实施方案中，结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，所述第一Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；和第三多肽链，所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，所述第二Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第一和/或第二Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置428和434的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是M428L和N434S。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含杵和臼突变以及用于提高血清半衰期的一个或多个突变。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区域是人IgG1 Fc区域。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区域是人IgG4 Fc区域。
在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含一个或多个突变以改善例如IgG4的铰链区和/或二聚体界面的稳定性(参见例如，Spiess,C.等人(2013)J.Biol.Chem.288:26583-26593)。在一些实施方案中，突变包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置228和409的位置处的取代，其中所述氨基酸取代是S228P和R409K。在一些实施方案中，结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，所述第一Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；和第三多肽链，所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，所述第二Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；其中所述第一和第二Fc区域是人IgG4 Fc区域；并且其中所述第一和第二Fc区域各自包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置228和409的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S228P和R409K。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含杵和臼突变以及用于改善稳定性的一个或多个突变。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区域是人IgG4 Fc区域。
在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含一个或多个突变以例如通过调节对纯化试剂的亲和力来改善纯化。例如，已知如果异二聚体形式的两个Fc区域中的一个含有降低或消除与蛋白A的结合的一个或多个突变，则可以将异二聚体结合蛋白从其同二聚体形式选择性地纯化出来，因为与任一同二聚体形式相比，异二聚体形式将具有对基于蛋白A的纯化的中间亲和力并且可以例如通过使用不同pH从蛋白A选择性地洗脱(参见例如，Smith,E.J.等人(2015)Sci.Rep.5:17943)。在一些实施方案中，突变包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置435和436的位置处的取代，其中所述氨基酸取代是H435R和Y436F。在一些实施方案中，结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，所述第一Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；和第三多肽链，所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，所述第二Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；并且其中第一和第二Fc区域中仅一个包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置435和436的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是H435R和Y436F。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含杵和臼突变以及用于改善纯化的一个或多个突变。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区域是人IgG1 Fc区域。
在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区域是人IgG4 Fc区域。
在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含一个或多个突变以提高血清半衰期(参见例如，Hinton,P.R.等人(2006)J.Immunol.176(1):346-56)。在一些实施方案中，突变包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置428和434的位置处的取代，其中所述氨基酸取代是M428L和N434S。在一些实施方案中，结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，所述第一Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；和第三多肽链，所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，所述第二Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中所述第一和/或第二Fc区域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置428和434的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是M428L和N434S。在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含杵和臼突变以及用于提高血清半衰期的一个或多个突变。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区域是人IgG1 Fc区域。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区域是人IgG4 Fc区域。
在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含一个或多个突变以降低效应子功能，例如，Fc受体介导的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，所述第一Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；其中所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，所述第二Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；其中所述第一和第二Fc区域是人IgG1 Fc区域；并且其中所述第一和第二Fc区域各自包含根据EU索引在对应于人IgG1的位置234和235的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是L234A和L235A。在一些实施方案中，第二和第三多肽链的Fc区域是人IgG1 Fc区域，并且其中所述Fc区域各自包含根据EU索引在对应于人IgG1的位置234和235的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是L234A和L235A。在一些实施方案中，第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，所述第一Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；其中所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，所述第二Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；其中所述第一和第二Fc区域是人IgG1 Fc区域；并且其中所述第一和第二Fc区域各自包含根据EU索引在对应于人IgG1的位置234、235和329的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是L234A、L235A和P329A。在一些实施方案中，第二和第三多肽链的Fc区域是人IgG1 Fc区域，并且其中所述Fc区域各自包含根据EU索引在对应于人IgG1的位置234、235和329的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是L234A、L235A和P329A。在一些实施方案中，第二和第三多肽链的Fc区域是人IgG4 Fc区域，并且所述Fc区域各自包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置234和235的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是F234A和L235A。在一些实施方案中，结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链进一步包含与CH1连接的第一Fc区域，所述第一Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；和第三多肽链，所述第三多肽链进一步包含与CH1连接的第二Fc区域，所述第二Fc区域包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；并且其中所述第一和第二Fc区域各自包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置234和235的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是F234A和L235A。
在一些实施方案中，本公开文本的结合蛋白包含杵和臼突变以及用于降低效应子功能的一个或多个突变。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区域是人IgG1 Fc区域。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区域是人IgG4 Fc区域。关于在位置329处的Fc突变的进一步描述，参见例如，Shields,R.L.等人(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604和WO1999051642。
在一些实施方案中，上述突变的类型可以以任何顺序或组合来组合。例如，本公开文本的结合蛋白可以包含上述的两个或更多个“杵”和“臼”突变、用于提高血清半衰期的一个或多个突变、用于改善IgG4稳定性的一个或多个突变、用于改善纯化的一个或多个突变和/或用于降低效应子功能的一个或多个突变。
核酸
使用标准重组DNA方法构建编码形成结合蛋白的多肽的多核苷酸，将这些多核苷酸并入重组表达载体中，并将此类载体引入宿主细胞中。参见例如，Sambrook等人,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第3版)。可以根据制造商的说明书来进行酶反应和纯化技术，如本领域通常所实现的或如本文所述。除非提供具体定义，否则关于本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的术语以及本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的实验室程序和技术是本领域中熟知且常用的那些。类似地，常规技术可以用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、递送和患者的治疗。
本公开文本的其他方面涉及分离的核酸分子，其包含编码任何本文所述的结合蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:60-83至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同和/或显示于表J中的序列。
本公开文本的某些方面涉及多核苷酸的试剂盒。在一些实施方案中，一个或多个多核苷酸是载体(例如，表达载体)。所述试剂盒尤其可以用于产生一种或多种本文所述的结合蛋白，例如，本公开文本的三特异性结合蛋白。在一些实施方案中，所述试剂盒包含一种、两种、三种或四种表J中所示的多核苷酸(例如，抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG4FALA、抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1LALAP329A、抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA、CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA、CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A或CD38HHY1370CD28supxCD3mid IgG1 NNSA)。在一些实施方案中，多核苷酸的试剂盒包含：含有SEQ ID NO:73的序列的第一多核苷酸、含有SEQ ID NO:72的序列的第二多核苷酸、含有SEQID NO:74的序列的第三多核苷酸和含有SEQ ID NO:75的序列的第四多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸的试剂盒包含：含有SEQ ID NO:73的序列的第一多核苷酸、含有SEQ IDNO:76的序列的第二多核苷酸、含有SEQ ID NO:77的序列的第三多核苷酸和含有SEQ IDNO:75的序列的第四多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸的试剂盒包含：含有SEQ IDNO:73的序列的第一多核苷酸、含有SEQ ID NO:78的序列的第二多核苷酸、含有SEQ ID NO:79的序列的第三多核苷酸和含有SEQ ID NO:75的序列的第四多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸的试剂盒包含：含有SEQ ID NO:73的序列的第一多核苷酸、含有SEQ ID NO:72的序列的第二多核苷酸、含有SEQ ID NO:80的序列的第三多核苷酸和含有SEQ ID NO:81的序列的第四多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸的试剂盒包含：含有SEQ ID NO:73的序列的第一多核苷酸、含有SEQ ID NO:76的序列的第二多核苷酸、含有SEQ ID NO:82的序列的第三多核苷酸和含有SEQ ID NO:81的序列的第四多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸的试剂盒包含：含有SEQ ID NO:73的序列的第一多核苷酸、含有SEQ ID NO:78的序列的第二多核苷酸、含有SEQ ID NO:83的序列的第三多核苷酸和含有SEQ ID NO:81的序列的第四多核苷酸。
在一些实施方案中，分离的核酸与异源启动子可操作地连接，以指导编码结合蛋白的核酸序列的转录。启动子可以是指指导核酸的转录的核酸控制序列。在第一核酸序列被置于与第二核酸序列具有功能性关系的位置中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子与结合蛋白的编码序列可操作地连接。启动子的例子可以包括但不限于从病毒(如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)等)的基因组获得的启动子、异源真核启动子(如肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子等)、CAG启动子(Niwa等人,Gene 108(2):193-9,1991)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、四环素诱导型启动子(Masui等人,Nucleic Acids Res.33:e43,2005)、lac系统、trp系统、tac系统、trc系统、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域、3-磷酸甘油酸激酶的启动子、酵母酸性磷酸酶的启动子和酵母α交配因子的启动子。编码本公开文本的结合蛋白的多核苷酸可以处于以下启动子的控制下：组成型启动子、诱导型启动子、或本文所述的任何其他合适的启动子、或本领域技术人员将易于识别的其他合适的启动子。
在一些实施方案中，将分离的核酸并入载体中。在一些实施方案中，载体是表达载体。表达载体可以包括与要表达的多核苷酸可操作地连接的一个或多个调控序列。术语“调控序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。合适的增强子的例子可以包括但不限于来自哺乳动物基因的增强子序列(如球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白、胰岛素等)、和来自真核细胞病毒的增强子序列(如复制起点的后侧上的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点的后侧上的多瘤增强子、腺病毒增强子等)。合适的载体的例子可以包括例如质粒、粘粒、附加体、转座子和病毒载体(例如，腺病毒、痘苗病毒、辛德毕斯病毒(Sindbis-viral)、麻疹、疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒载体等)。表达载体可以用于转染宿主细胞，例如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。能够在宿主体内表达并复制的生物功能病毒和质粒DNA载体是本领域中已知的，并且可以用于转染感兴趣的任何细胞。
本公开文本的其他方面涉及载体系统，所述载体系统包括编码任何本文所述结合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽链的一种或多种载体。在一些实施方案中，载体系统包括编码结合蛋白的第一多肽链的第一载体、编码结合蛋白的第二多肽链的第二载体、编码结合蛋白的第三多肽链的第三载体和编码结合蛋白的第四多肽链的第四载体。在一些实施方案中，载体系统包括编码结合蛋白的第一和第二多肽链的第一载体、和编码结合蛋白的第三和第四多肽链的第二载体。在一些实施方案中，载体系统包括编码结合蛋白的第一和第三多肽链的第一载体、和编码结合蛋白的第二和第四多肽链的第二载体。在一些实施方案中，载体系统包括编码结合蛋白的第一和第四多肽链的第一载体、和编码结合蛋白的第二和第三多肽链的第二载体。在一些实施方案中，载体系统包括编码结合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽链的第一载体。载体系统的一种或多种载体可以是任何本文所述载体。在一些实施方案中，所述一种或多种载体是表达载体。
分离的宿主细胞
本公开文本的其他方面涉及分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含本文所述的一种或多种分离的多核苷酸、多核苷酸试剂盒、载体和/或载体系统。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是酵母细胞(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是昆虫细胞。昆虫宿主细胞的例子可以包括例如果蝇属(Drosophila)细胞(例如，S2细胞)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(例如，High FiveTM细胞)和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞(例如，Sf21或Sf9细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。哺乳动物宿主细胞的例子可以包括例如人胚肾细胞(例如，293细胞或亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293细胞)、Expi293TM细胞、CHO细胞、幼仓鼠肾细胞(例如，BHK，ATCC CCL 10)、小鼠支持细胞(例如，TM4细胞)、猴肾细胞(例如，CV1 ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(例如，VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(例如，HELA，ATCC CCL2)、犬肾细胞(例如，MDCK，ATCC CCL34)、布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(例如，BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(例如，W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞(例如，Hep G2，HB 8065)、小鼠乳房肿瘤细胞(例如，MMT 060562，ATCC CCL51)、TRI细胞、MRC 5细胞、FS4细胞、人肝细胞瘤系(例如，Hep G2)和骨髓瘤细胞(例如，NS0和Sp2/0细胞)。
结合蛋白的方法和用途
本公开文本的某些方面涉及用于扩增病毒特异性记忆T细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使病毒特异性记忆T细胞与本公开文本的结合蛋白接触，所述结合蛋白是例如包含结合CD28多肽的第一抗原结合位点、结合CD3多肽的第二抗原结合位点和结合CD38多肽的第三抗原结合位点的三特异性结合蛋白。
在一些实施方案中，在体外或离体使所述病毒特异性记忆T细胞与所述结合蛋白接触。
在一些实施方案中，使所述病毒特异性记忆T细胞与所述结合蛋白接触引起病毒特异性记忆T细胞的激活和/或增殖。
本公开文本的其他方面涉及扩增T细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使T细胞与本公开文本的结合蛋白接触，所述结合蛋白是例如包含结合CD28多肽的第一抗原结合位点、结合CD3多肽的第二抗原结合位点和结合CD38多肽的第三抗原结合位点的三特异性结合蛋白。
在一些实施方案中，所述T细胞是记忆T细胞或效应T细胞。
在一些实施方案中，所述T细胞在其细胞表面上表达嵌合抗原受体(CAR)或包含编码CAR的多核苷酸。
本公开文本的其他方面涉及例如在有需要的个体中治疗慢性病毒感染的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的个体给予有效量的本公开文本的结合蛋白，所述结合蛋白是例如包含结合CD28多肽的第一抗原结合位点、结合CD3多肽的第二抗原结合位点和结合CD38多肽的第三抗原结合位点的三特异性结合蛋白。
在一些实施方案中，所述个体是人。
在一些实施方案中，将所述结合蛋白以包含所述结合蛋白和药学上可接受的载体的药物配制品的形式给予至所述个体。
在一些实施方案中，所述结合蛋白的给予导致所述个体体内病毒特异性记忆T细胞的激活和/或增殖。
在任何上述方法中，记忆T细胞可以是CD8+或CD4+记忆T细胞。在任何上述方法中，记忆T细胞可以是中枢记忆T细胞(TCM)或效应记忆T细胞(TEM)。
任何本文所述结合蛋白可以用于本公开文本的方法。
在用于检测和定量一种或多种靶抗原的任何已知的测定方法，如竞争性结合测定、直接和间接夹心式测定、和免疫沉淀测定中可以使用所述结合蛋白。结合蛋白将以适合于所用测定方法的亲和力结合所述一种或多种靶抗原。
在某些实施方案中，对于诊断应用，可以用可检测部分标记结合蛋白。可检测部分可以是能够直接或间接产生可检测信号的任何部分。例如，可检测部分可以是放射性同位素，如3H、14C、32P、35S、125I、99Tc、111In或67Ga；荧光或化学发光化合物，如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；或者酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。
结合蛋白也可以用于体内成像。可以将用可检测部分标记的结合蛋白给予至动物，优选地给予至血流中，并测定宿主中经标记的抗体的存在和位置。可以用在动物中通过核磁共振、放射学或本领域中已知的其他检测手段可检测的任何部分标记结合蛋白。
在某些实施方案中，对于临床或研究应用，可以将结合蛋白与细胞毒性剂缀合。与细胞毒性剂偶联的多种抗体(即，抗体-药物缀合物)已经用于将细胞毒性有效负载靶向特异性肿瘤细胞。将所述药剂与抗体缀合的细胞毒性剂和接头是本领域中已知的；参见例如，Parslow,A.C.等人(2016)Biomedicines 4:14；和Kalim,M.等人(2017)DrugDes.Devel.Ther.11:2265-2276。
本公开文本还涉及包含结合蛋白和可用于检测生物样品中的靶抗原水平的其他试剂的试剂盒。此类试剂可以包括可检测标记、封闭血清、阳性和阴性对照样品以及检测试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含组合物，所述组合物包含本文所述的任何结合蛋白、多核苷酸、载体、载体系统和/或宿主细胞。在一些实施方案中，试剂盒包含容器以及在所述容器上或与所述容器相连的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由诸如玻璃或塑料的多种材料制成。容器容纳有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物本身或与另一种组合物组合的所述组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉输液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。在一些实施方案中，标签或包装说明书指示，所述组合物用于预防、诊断和/或治疗所选病症。可替代地或另外地，制品或试剂盒可以进一步包含含有药学上可接受的缓冲液(如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)和葡萄糖溶液)的第二(或第三)容器。所述制品或试剂盒可以进一步包括从商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。
结合蛋白治疗组合物及其给予
包含结合蛋白的治疗或药物组合物在本公开文本的范围内。此类治疗或药物组合物可以包含与选择的适合于所述给予方式的药学上或生理上可接受的配制剂混合的治疗有效量的结合蛋白或结合蛋白-药物缀合物。这些药物组合物可以用于本文所述的任何方法和用途(例如，离体、体外和/或体内)。
可接受的配制材料优选地在所用剂量和浓度下对接受者无毒。
药物组合物可以含有用于修改、维持或保存例如组合物的pH、摩尔渗透压浓度、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌度、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的配制材料。合适的配制材料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、抗微生物剂、抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲液(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)、膨胀剂(如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))、络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)、填充剂、单糖、二糖和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成盐抗衡离子(如钠)、防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)、溶剂(如丙三醇、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(如甘露醇或山梨醇)、悬浮剂、表面活性剂或润湿剂(如普朗尼克(pluronics)；PEG；脱水山梨糖醇酯；聚山梨酯(如聚山梨酯20或聚山梨酯80)；triton；氨丁三醇；卵磷脂；胆固醇或泰洛沙泊(tyloxapal))、稳定性增强剂(如蔗糖或山梨醇)、张力调节剂(如碱金属卤化物(优选地氯化钠或氯化钾)或甘露醇山梨醇)、递送媒介物、稀释剂、赋形剂和/或药物佐剂(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版,A.R.Gennaro,编辑,Mack Publishing Company 1990)和其后续版本，所述文献出于任何目的通过引用并入本文)。
最佳药物组合物将由技术人员根据例如计划的给予途径、递送形式和所需剂量来决定。此类组合物可以影响结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
药物组合物中的主要媒介物或载体在性质上可以是水性或非水性的。例如，适用于注射的媒介物或载体可以是水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能补充有用于肠胃外给予的组合物中常用的其他材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其他示例性媒介物。其他示例性药物组合物包含约pH7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，它们可以进一步包括山梨醇或合适的替代物。在本公开文本的一个实施方案中，结合蛋白组合物可以通过将具有所选纯度的组合物与呈冻干饼或水溶液形式的任选配制剂混合来制备用于储存。此外，可以使用适当赋形剂如蔗糖将结合蛋白配制为冻干物。
可以选择本公开文本的药物组合物用于肠胃外递送或皮下递送。可替代地，可以选择组合物用于吸入或用于经消化道递送，如口服。此类药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术范围内。
配制品组分是以给予部位可接受的浓度存在。例如，使用缓冲液将组合物维持在生理pH或略低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。
当考虑肠胃外给予时，所用治疗组合物可以呈无热原的、肠胃外可接受的水溶液形式，其包含在药学上可接受的媒介物中的所需结合蛋白。特别适用于肠胃外注射的媒介物是无菌蒸馏水，其中将结合蛋白配制为适当保存的无菌等渗溶液。又另一种制备可以涉及用提供产物的控制或持续释放的药剂(如可注射微球、生物蚀解性颗粒、聚合化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体)配制所需分子，随后可将所述分子通过积存注射来递送。还可以使用透明质酸，并且这可以具有促进在循环中的持久的持续时间的作用。用于引入所需分子的其他合适的手段包括可植入的药物递送装置。
在一个实施方案中，可以将药物组合物配制用于吸入。例如，可以将结合蛋白配制为干粉用于吸入。也可以将结合蛋白吸入溶液用推进剂来配制用于气溶胶递送。在又另一个实施方案中，可以将溶液雾化。
还考虑到可以将某些配制品口服给予。在本公开文本的一个实施方案中，可以将以这种方式给予的结合蛋白用或不用在固体剂型(如片剂和胶囊)的混配中通常使用的那些载体来配制。例如，胶囊可以设计为在胃肠道中在生物利用度最大化且前系统性降解最小化时释放配制品的活性部分。可以包括另外的试剂以有利于结合蛋白的吸收。还可以采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
另一种药物组合物可以包含在具有适合于制造片剂的无毒赋形剂的混合物中的有效量的结合蛋白。通过将片剂溶解于无菌水或另一种适当媒介物中，可以以单位剂量形式制备溶液。合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或者结合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或者润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
本公开文本的另外的药物组合物对于本领域技术人员将是明显的，所述药物组合物包括在持续或控制递送配制品中包含结合蛋白的配制品。用于配制多种其他持续或控制递送手段的技术(如脂质体载体、生物蚀解性微粒或多孔珠粒和积存注射)也是本领域技术人员已知的。持续释放制剂的另外的例子包括呈成型物品(例如薄膜)或微胶囊形式的半渗透性聚合物基质。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯乙酸乙烯酯或聚-D(-)-3-羟丁酸。持续释放组合物还可以包括脂质体，所述脂质体可以通过本领域中已知的几种方法中的任何方法来制备。
要用于体内给予的药物组合物通常必须是无菌的。这可以通过经无菌滤膜过滤来实现。在将组合物冻干的情况下，可以在冻干和重构之前或之后使用这种方法进行灭菌。用于肠胃外给予的组合物可以以冻干形式或溶液形式储存。此外，通常将肠胃外组合物置于具有无菌进入口的容器中，所述容器例如具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉输液袋或小瓶。
一旦已经配制药物组合物，就可以将其作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。可以将此类配制品以即用形式或以需要在给予前重构(例如，冻干)的形式储存。
本公开文本还涵盖用于产生单一-剂量给予单位的试剂盒。试剂盒可以各自含有具有干燥蛋白质的第一容器和具有水性配制品的第二容器二者。本公开文本的范围内还包括含有单室和多室预填充注射器(例如，液体注射器和冷冻注射器(lyosyringe))的试剂盒。
在治疗上采用的结合蛋白药物组合物的有效量将取决于例如治疗背景和目标。本领域技术人员将了解，治疗的适当剂量水平将因此部分根据以下项而变化：所递送的分子、结合蛋白所用于的适应证、给予途径以及患者的体型(体重、体表或器官大小)和状况(年龄和一般健康状况)。因此，临床医师可以滴定剂量并改变给予途径以获得最佳治疗效果。
给药频率将取决于所用配制品中结合蛋白的药代动力学参数。通常，临床医师将给予组合物直至达到实现所需效果的剂量为止。因此，可以将组合物作为单一剂量、作为随时间的两次或更多次剂量(它们可以含有或不含等量的所需分子)或作为连续输注通过植入装置或导管来给予。适当剂量的进一步改进是由本领域普通技术人员以常规方式进行，并且在本领域普通技术人员常规进行的任务范围内。适当剂量可以通过使用适当的剂量-反应数据来确定。
药物组合物的给予途径与已知方法一致，例如，口服；通过静脉内、腹膜内、大脑内(脑实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门静脉内或病灶内途径注射；通过持续释放系统；或者通过植入装置。在需要时，可以将组合物通过推注注射给予，或通过输注连续给予，或通过植入装置给予。
还可以将组合物通过已经使所需分子吸附或包封于其上的膜、海绵状物或其他适当材料的植入局部地给予。在使用植入装置的情况下，可以将所述装置植入任何合适的组织或器官中，并且所需分子的递送可以通过扩散、定时释放推注或连续给予来进行。
实施例
以下实施例说明本公开文本的具体实施方案，以及它们的各种用途。所述实施例仅出于解释性目的来陈述，并且不应被视为以任何方式限制本发明的范围。
在本文的实施例和附图中，以下术语可以互换使用，是指特异性抗CD38抗原结合结构域或抗体：
抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1或CD38VH1
抗CD38_1370或CD38HHY1370
抗CD38_SB19或艾萨妥昔单抗(isatuximab)
实施例1：抗CD38抗体诱导交叉反应性和细胞凋亡
针对与人和食蟹猴CD38多肽的结合以及针对细胞凋亡的诱导来表征人源化抗CD38变体。
材料和方法
对可溶性CD38细胞外结构域的结合亲和力
使用BIAcore 2000(BIAcore Inc.，乌普萨拉，新泽西州)评价抗CD38 mAb的结合特性。简单来说，将CM5 BIAcore生物传感器芯片对接至仪器中并用250μL的1:1NHS/EDC在室温下激活。将小鼠抗人Fc IgG1(GE Healthcare#BR-1008-39)(13.5μg/mL，在0.05M乙酸盐缓冲液中，pH 5)固定在流动池1中的激活芯片上。所述固定是以5μL/min的流速来实施。然后通过注射55μL乙醇胺盐酸盐(pH 8.5)，然后用50mM NaOH、1M NaCl洗涤五次来封闭芯片。为了测量抗CD38 mAb与人CD38蛋白或食蟹猴CD38蛋白的结合，将抗体以2μg/mL用于BIAcore运行缓冲液(HBS-EP)中。以3至1000nM注射抗原(人CD38-histag(ID2)或食蟹猴CD38-histag(ID3))。在注射阶段完成后，以相同流速在BIAcore运行缓冲液中监测解离360秒。在注射之间使用30μL的50mM NaOH-1M NaCl使表面再生。使用BIAsimulation软件分析单独的传感图。
对表达人CD38的前B细胞的结合亲和力
通过流式细胞术确定抗CD38抗体与在重组鼠前B::300.19细胞的表面上表达的CD38的结合。重组细胞系描述于以下文献中：J.Deckket等人2014Clin.Cancer Res 20:4574-4583。将表达CD38的鼠前B::300.19细胞以40,000个细胞/孔包被于96孔高结合板(MSD L15XB-3)上，并在4℃下添加100μL/孔的抗CD38抗体持续45min，并用PBS 1％BSA洗涤三次。在4℃下添加100μL/孔的与Alexa488(Jackson ImmunoResearch；#109-545-098)缀合的山羊抗人IgG持续45min，并用PBS 1％BSA洗涤三次。在细胞的离心和重悬后通过添加200μl/孔PBS 1％BSA评价抗体结合，并使用
Figure BDA0003093959560001021
easyCyteTM8HT流式细胞术系统读取。分别使用BIOST@T-BINDING和BIOST@T-SPEED软件估计表观KD和EC50值。
重组CD38蛋白
使用衍生自亚型A的具有不同标记和点突变的各种重组CD38蛋白(SEQ ID NO:2、3、4和28)，以及涵盖来自R45-P203的CD38细胞外结构域的CD38亚型E的标记的形式(SEQ IDNO:105)。所述蛋白质是通过在哺乳动物细胞中的瞬时表达来产生的。将编码DNA序列克隆至哺乳动物表达质粒中，在CMV增强子/启动子和SV40多聚A信号下。使用FreeStyleTMMAX293表达系统根据制造商的说明书用所述表达质粒对HEK293细胞(Invitrogen；#K9000-10)进行瞬时转染。
细胞凋亡诱导测定
将细胞以2x105个细胞/mL在含有1.5μg/mL(10nM)所指示抗体的完全培养基(RPMI-1640，10％FBS、2mM L-谷氨酰胺)中在37℃和5％CO2下孵育20小时。将细胞根据制造商说明书(Life Technologies)用AnnexinV-FITC染色。通过流式细胞术在BD FACSAriaTM流式细胞仪上使用用于采集控制和数据分析的BD FACSDiva软件(二者均来自BDBiosciences)来分析样品。
ELISA测定
用PBS中的CD38以0.5μg/孔包被96孔板，并将100μL/孔的抗体添加至板。将所述板在37℃下孵育1h并用含有0.05％Tween-20的PBS(PBS-T)洗涤五次。然后，将100μL的1:25,000稀释度的与辣根过氧化物酶(Jackson Ref:109-035-098)缀合的抗人IgG添加至每个孔。在37℃下在黑暗中孵育1h后，将板用PBS-T洗涤五次。通过添加TMB-H2O2缓冲液将抗体结合可视化并在450nm的波长下读取。使用BIOST@T-SPEED软件估计EC50值。
结果
使用ELISA和表面等离子体共振(SPR)测定，使用BIAcore系统(PharmaciaBiosensor；皮斯卡塔韦，新泽西州)检查所选抗人CD38抗体与可溶人CD38和食蟹猴CD38的结合特性。使用ELISA数据确定对于人源化抗CD38抗体抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1、抗CD38_C2-CD38-1_VH3-VL3、抗CD38_C2-CD38-1_VH5-VL3、抗CD38_C2-CD38-1_VH6-VL3和人抗CD38抗体抗CD38_1370的抗体与人和食蟹猴CD38结合的EC50。
还使用SPR测定来评价人源化抗CD38变体或人抗CD38 mAb与CD38的结合。使用SPR数据确定对于人源化抗CD38抗体抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1、抗CD38_C2-CD38-1_VH3-VL3、抗CD38_C2-CD38-1_VH5-VL3、抗CD38_C2-CD38-1_VH6-VL3和人抗CD38抗体抗CD38_1370的抗体与人和食蟹猴CD38结合的KD和koff。表K中概述的结合数据显示，所有抗CD38mAb都以相似的结合特征与CD38结合。
表K.如通过表面等离子体共振测定所确定的抗CD38 mAb对人CD38和食蟹猴CD38的可溶性细胞外结构域的结合亲和力。
Figure BDA0003093959560001031
使用上述基于FACS的结合测定评估人源化抗CD38变体与表达CD38的细胞结合的能力。使用FACS数据确定对于人源化抗CD38抗体抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1、抗CD38_C2-CD38-1_VH3-VL3、抗CD38_C2-CD38-1_VH5-VL3、抗CD38_C2-CD38-1_VH6-VL3和人抗CD38抗体抗CD38_1370的抗体与人和食蟹猴CD38结合的EC50。表L中所示的结合数据显示，所有人源化抗CD38变体都展现相似的对细胞表面CD38的结合亲和力。
表L.抗CD38 mAb对表达CD38的鼠前B::300.19细胞的结合亲和力。
Figure BDA0003093959560001041
来自上文ELISA、SPR和FACS测定的结合数据以及VH和VL结构域与人V区域的序列同一性一起概述于表L2中。
表L2.表征所指示抗体与人(Hu)和食蟹猴(Cyno)CD38多肽的结合的ELISA、SPR和FACS测定的概述。
Figure BDA0003093959560001042
Figure BDA0003093959560001051
还检查了抗CD38抗体与人CD38亚型A和E二者结合的能力。对于评价与CD38亚型A和亚型E的结合，通过使用亚型A和亚型E蛋白(如上所述制备)作为捕获抗原来进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。用PBS中的任一亚型以0.5μg/孔包被96孔板，并将100μL/孔的抗体添加至板。将所述板在37℃下孵育1h并用含有0.05％Tween-20的PBS(PBS-T)洗涤五次。然后，将100μL的1:25,000稀释度的与辣根过氧化物酶(Jackson Ref:109-035-098)缀合的抗人IgG添加至每个孔。在37℃下在黑暗中孵育1h后，将板用PBS-T洗涤五次。通过添加TMB-H2O2缓冲液将抗体结合可视化并在450nm的波长下读取。使用BIOST@T-SPEED软件估计EC50值。
确定各种抗体与CD38亚型A(SEQ ID NO:1)和亚型E(SEQ ID NO:105)的结合亲和力，如表L3中所示。表M提供各种抗CD38抗体的结合特性的比较。
表L3.如通过ELISA所确定的基于EC50的抗CD38抗体对CD38亚型A和E的结合亲和力。
Figure BDA0003093959560001052
表M.各种抗CD38抗体的结合特征。
Figure BDA0003093959560001053
Figure BDA0003093959560001061
总之，只有抗CD38_C2-CD38-1以亚纳摩尔亲和力与人和食蟹猴CD38二者结合并与CD38亚型A和E结合。
实施例2：三特异性抗CD38结合蛋白的产生
接着，分析在图1中所描绘的三特异性形式中，实施例1中所述的所选抗CD38抗体的抗原结合结构域的结合特性。
材料和方法
三特异性结合蛋白的产生和纯化
三特异性结合蛋白是通过根据制造商的方案使用ExpiFectamineTM293转染试剂盒(Thermo Fisher Scientific)将4种表达质粒瞬时转染至Expi293细胞中来产生。简单来说，将25％(w/w)的每种质粒稀释至Opti-MEM中，在室温(RT)下与预稀释的ExpiFectamine试剂混合20-30分钟，并添加至Expi293细胞(2.5x106个细胞/ml)中。通常使用用于确定质粒最佳比率的转染优化以产生具有良好产量和纯度的三特异性结合蛋白。
在转染后4-5天，从转染的细胞收集上清液并使其通过0.45μm过滤装置(Nalgene)过滤。使用3步式程序纯化上清液中的三特异性结合蛋白。第一，使用蛋白A亲和纯化，并使用“IgG洗脱缓冲液”(Thermo Fisher Scientific)洗脱所结合的Ab。第二，将产物针对PBS(pH 7.4)透析过夜，其中2次更换PBS缓冲液。在下一步骤之前，通过0.45μm过滤装置(Nalgene)进行过滤来清除任何沉淀物。第三，使用尺寸排阻色谱(SEC)纯化(Hiload 16/600Superdex 200pg，或Hiload 26/600Superdex 200pg，GE Healthcare)去除聚集体和制剂中的不同种类。在还原性和非还原性SDS-PAGE上分析所述级分以鉴定含有单体三特异性结合蛋白的级分，然后合并所述级分。可以将纯化的抗体等分并在-80℃下长期储存。
ELISA测定
使用ELISA或SPR方法分析纯化的抗体的结合特性。对于ELISA，在4℃下使用三特异性结合蛋白中每个结合位点的相应抗原，使用PBS(pH 7.4)中的2μg/ml的每种抗原包被96孔免疫板(Nunc 439454，Thermo Fisher Scientific)过夜。使用PBS中的5％脱脂乳+2％BSA将所包被的板在RT下封闭1小时，然后用PBS+0.25％Tween 20洗涤三次(Aqua Max 400，Molecular Devices)。制备抗体(三特异性和对照Ab)的连续稀释液并将其添加至ELISA板(100μl/孔，一式两份)上，在RT下孵育1小时，然后用PBS+0.25％Tween20洗涤5次。
在洗涤后，将HRP缀合的二级抗人Fab(1:5000，目录号109-035-097，JacksonImmunoResearch Inc)添加至每个孔并在RT下孵育30分钟。在用PBS+0.25％Tween 20洗涤5次后，将100μl的TMB Microwell过氧化物酶底物(KPL，盖瑟斯堡，马里兰州，美国)添加至每个孔。通过添加50μl 1M H2SO4终止反应，并使用SpectraMax M5(Molecular Devices)测量OD450，并使用SoftMax Pro6.3软件(Molecular Devices)进行分析。将最终数据传输至GraphPad Prism软件(GraphPad Software，加利福尼亚州，美国)，并如所示绘图。使用相同软件计算EC50。
使用ELISA测定来确定抗CD38xCD28xCD3三特异性抗体或同种型对照抗体(人IgG4)与人CD3(Cambridge Biologics LLC目录号03-01-0051)、CD28(CambridgeBiologics LLC目录号03-01-0303)和CD38(Cambridge Biologics LLC目录号03-01-0369)的结合。使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗Fab二级抗体(Jackson ImmunoResearch Inc#109-035-097)检测结合的抗体。
结果
使用SPR在三特异性形式(抗CD38x抗CD28x抗CD3)中测试抗CD38抗原结合结构域在其他抗原结合结构域与其同源配体结合时结合CD38的能力。对于三种抗原与每种三特异性Ab的顺序结合，注射饱和浓度(>10KD)的每种抗原8min，然后进行5min解离。通过在60秒内以30μl/min注射10mM甘氨酸盐酸盐(pH 2.5)来进行表面再生。将数据用1:1动力学结合模型拟合，并使用Biacore S200评价软件1.0版进行分析。使用结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)计算平衡解离常数(KD)。
这种基于SPR的测定显示，不管CD3和/或CD28抗原结合结构域是否也与它们的同源抗原结合，三特异性结合蛋白都能够结合CD38。如通过SPR测量的动力学参数提供于表M2中。
表M2.三特异性抗CD38x抗CD28x抗cd3结合蛋白与1、2或3种同源抗原的结合。
Figure BDA0003093959560001081
这些结果显示，所有三种靶标都可以同时与三特异性结合蛋白结合。使三特异性结合蛋白与CD28、CD3或二者(以任何顺序)预结合没有改变与CD38的结合动力学或结合亲和力。
接着，通过SPR评价CD38SB19xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白的每个抗原结合结构域在其他两个抗原结合结构域处于或不处于饱和的情况下结合同源抗原的能力。表M3和表M4显示这些测定的结果。
表M3.在不存在其他靶标的情况下的靶标结合。
靶标 k<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) k<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(M)
CD38 8.04E+05 1.41E-03 1.75E-09
CD28 1.16E+05 3.14E-04 2.71E-09
CD3 2.90E+04 6.73E-04 2.32E-08
表M4.在其他靶标处于饱和的情况下的靶标结合。
Figure BDA0003093959560001082
Figure BDA0003093959560001091
如表M3和表M4中所示，通过与抗原预结合使两个靶标饱和不影响第三靶标对CD38或CD28的动力学或结合亲和力。在CD3结合的情况下，预结合的CD38和/或CD28导致较快的动力学(对kon和koff值的影响为约4倍)。
在具有两个抗CD28抗原结合结构域(超激动剂“sup”，和常规激动剂“cvn”)和两个抗CD3抗原结合结构域(“mid”和“low”)的三特异性形式中测试抗CD38抗原结合结构域。提供这些抗原结合结构域的可变结构域序列如下：抗CD28sup：SEQ ID NO:49(VH)和SEQ IDNO:50(VL)；抗CD28cvn：SEQ ID NO:51(VH)和SEQ ID NO:52(VL)；抗CD3mid：SEQ ID NO:53(VH)和SEQ ID NO:54(VL)；抗CD3low：SEQ ID NO:84(VH)和SEQ ID NO:85(VL)。检查三特异性结合蛋白的结合的SPR测定的结果显示于图2中。三个抗CD38结合结构域在三特异性结合蛋白形式中具有与在单特异性形式中大致相同的结合亲和力。两个CD3结合结构域在单特异性、双特异性和三特异性形式中具有大约相同的结合亲和力。如与在单特异性形式中相比，CD28结合结构域在双特异性或三特异性形式中显示略低(但仍是纳摩尔的)结合亲和力。与在其他两个抗原结合结构域未与抗原结合时相比，在其他两个抗原结合结构域饱和时，抗CD38SB19和抗CD28sup结合结构域具有类似的结合亲和力。然而，在其他两个抗原结合结构域饱和时，抗CD3mid结合结构域显示更快的动力学。这些结果显示，抗CD38、抗CD28和抗CD3结合结构域适用于三特异性结合蛋白形式。
还将本文所产生的抗CD38抗原结合结构域与现有的抗CD38_SB19的抗CD38抗原结合结构域(分别地，VH序列参见SEQ ID NO:47，并且VL序列参见SEQ ID NO:48)进行了比较。通过流式细胞术确定三特异性分子与在重组鼠前B::300.19细胞的表面上表达的CD38的结合，并且平行测定相应的抗CD38单价抗体。重组细胞系描述于以下文献中：J.Deckket等人2014Clin.Cancer Res 20:4574-4583。将表达CD38的鼠前B::300.19细胞以40,000个细胞/孔包被于96孔高结合板(MSD L15XB-3)上，并在4℃下添加100μL/孔的三特异性分子持续45min，并用PBS 1％BSA洗涤三次。在4℃下添加100μL/孔的与Alexa488(JacksonImmunoResearch；#109-545-098)缀合的山羊抗人IgG持续45min，并用PBS 1％BSA洗涤三次。在细胞的离心和重悬后通过添加200μl/孔PBS 1％BSA评价抗体结合，并使用
Figure BDA0003093959560001101
easyCyteTM8HT流式细胞术系统读取。分别使用BIOST@T-BINDING和BIOST@T-SPEED软件估计表观KD和EC50值。
如上所述使用流式细胞术来检查抗CD38_SB19抗体或具有抗CD38_SB19抗CD38抗原结合结构域的三特异性结合蛋白与在其细胞表面上表达人或食蟹猴CD38多肽的鼠前B细胞的结合。具有抗CD38_SB19抗CD38抗原结合结构域的CD38xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白以比抗CD38_SB19单特异性抗体(EC50＝0.5nM)低8倍的表观亲和力(EC50＝4nM)与表达人CD38的细胞结合。抗CD38_SB19单特异性抗体或具有抗CD38_SB19抗CD38抗原结合结构域的三特异性结合蛋白都不与表达食蟹猴CD38的细胞结合。
还在三特异性形式中针对与表达人或食蟹猴CD38多肽的细胞的结合测试了人源化抗CD38抗体抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1的结合结构域。与抗CD38_SB19不同，具有抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1抗CD38抗原结合结构域的CD38xCD28supxCD3mid和CD38xCD28cvnxCD3mid三特异性结合蛋白，以及抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1单特异性抗体能够结合人和食蟹猴CD38多肽二者。具有抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1抗CD38抗原结合结构域的CD38xCD28cvnxCD3mid三特异性结合蛋白以比亲代抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1抗体(EC50＝0.5nM)低9倍的表观亲和力(EC50＝4.4nM)与表达人CD38的细胞结合。具有抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1抗CD38抗原结合结构域的CD38xCD28cvnxCD3mid三特异性结合蛋白以比亲代抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1抗体(EC50＝1nM)低7.5倍的表观亲和力(EC50＝7.5nM)与表达食蟹猴CD38的细胞结合。具有抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1抗CD38抗原结合结构域的CD38xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白以比具有抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1抗CD38抗原结合结构域的CD38xCD28cvnxCD3mid三特异性结合蛋白(EC50＝4.4nM)低2.5倍的表观亲和力(EC50＝11nM)与表达人CD38的细胞结合。
还针对与表达人或食蟹猴CD38多肽的细胞的结合将人源化抗CD38抗体抗CD38_1370的结合结构域与抗CD38_1370单特异性抗体进行了比较。尽管抗CD38_1370单特异性抗体在nM范围内与表达人(EC50＝11.2nM)或食蟹猴(EC50＝6.6nM)CD38多肽的细胞结合，但具有抗CD38_1370抗CD38抗原结合结构域的CD38xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白在没有饱和的情况下与表达人或食蟹猴CD38多肽的细胞结合。
总之，不论是通过SPR检查与重组人CD38的结合或是通过流式细胞术检查与在细胞表面上表达的人CD38的结合，发现CD38SB19xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白(抗CD38_SB19抗CD38结合结构域)与人CD38结合的亲和力在相同范围内(图3)。类似地，CD38VH1xCD28supxCD3mid/low(抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1抗CD38结合结构域)和CD38VH1xCD28cvnxCD3mid/low三特异性结合蛋白(抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1抗CD38结合结构域)与人CD38的结合的亲和力在两种测定中也在相同范围内。对于CD38HHY1370xCD28supxCD3mid(抗CD38_1370抗CD38结合结构域)，通过SPR确定结合人CD38的KD是1nM，而通过流式细胞术无法估计准确的EC50值(图3)。对具有各种抗CD38结合结构域的三特异性结合蛋白的表观KD值(通过FACS分析获得)的概述提供于表M5中。
表M5.对通过流式细胞术测定获得的表观KD值的概述。
Figure BDA0003093959560001111
Figure BDA0003093959560001121
如所预期，缺少抗CD38结合结构域的ΔCD38xCD28supxCD3mid三特异性结合蛋白未与表达人或食蟹猴CD38多肽的细胞结合。这指示，在这个测定中观察到的结合是CD38抗原结合结构域所特有的。
实施例3：CD38/CD3xCD28 Ab刺激中枢记忆CD4和CD8、Th1和抗原特异性反应
为了确定CD38/CD3xCD28三特异性Ab是否可以增强细胞免疫功能，评价了体外扩增的T细胞的表型。
材料和方法
从由Research Blood Components,LLC(波士顿，马萨诸塞州)收集的健康人供体的血液分离外周血单核细胞。如上文先前所述将PBMC添加至抗体包被的板(350ng/孔)(5x105个细胞/mL)，并在37℃下孵育3天和7天。在特定时间点收集细胞并通过流式细胞术分析T细胞亚群：原初(CCR7+CD45RO-)、Tcm(CCR7+CD45RO+)、Tem(CCR7-CD45RO+)、Tregs(CD4+Foxp3+CD25hi)。还用莫能菌素(GolgiStop)(BD Biosciences，加利福尼亚州)将细胞处理至少6小时，之后进行流动染色以确定细胞内细胞因子表达：Th1(CD4+IFN-γ+)、Th2(CD4+IL-4+)和Th17(CD4+IL-17+)。使用限制于PBMC供体的HLA(A*02:01/NLVPMVATV)(ProImmune，牛津，英国)的荧光缀合的五聚体检测CMV pp65特异性CD8+T细胞。PBMC是从HemaCare(范奈斯，加利福尼亚州)从具有已知CMV阳性群体和HLA类型的供体获得的。使用来自对限制HLA类型呈阴性的供体的PMBC作为阴性对照。根据制造商的方案进行染色。
结果
将来自CMV感染的供体的人PBMC与三特异性Ab或具有三个突变的抗原结合位点的阴性对照三特异性抗体一起在不存在细胞因子的情况下孵育7天。对CD4亚群的分析揭示中枢记忆池中的最大增殖，以及效应记忆细胞的较小增加(图4A)。对CD4亚群的分析也揭示Th1细胞与Th2或Th17细胞相比的最大增殖(>6倍)(图4B)。在CD8亚群中，截至第7天存在中枢记忆CD8亚群的>150倍的增加，以及效应记忆细胞的较小增加(图4C)。重要的是，与阴性对照相比，使用四聚体染色针对血清反应阳性HLA-A2供体中的pp65表位(Gratama JW,vanEsser JW,等人Blood 98:1358-1364(2001))的预先存在的对CMV的抗原特异性CD8应答在存在CD38三特异性的情况下增加>44倍(图4D)。
总而言之，这些数据指示，CD38三特异性Ab刺激可能增强体内抗肿瘤抗病毒免疫力的Th1功能和保护性CD8记忆T细胞应答。
实施例4：CD38/CD28xCD3三特异性抗体促进CMV特异性免疫应答
病毒抗原特异性T细胞的激活和/或增殖可以提供针对病毒感染(如巨细胞病毒(CMV)感染)的治疗策略。确定CD38/CD28xCD3三特异性抗体促进CMV特异性T细胞的激活和扩增的能力。
材料和方法
ELISA测定
通过ELISA测量CD38/CD28xCD3 T细胞衔接器与每种靶抗原的结合亲和力。简单来说，在4℃下使用每种抗原，使用PBS(pH7.4)中的200ng/孔的每种抗原包被96孔免疫板(Thermo Fisher Scientific)过夜。使用PBS中的5％脱脂乳+2％BSA将所包被的板在RT下封闭1小时，然后用PBS+0.25％Tween 20洗涤三次(Aqua Max 400，Molecular Devices)。制备抗体(三特异性和对照Ab)的连续稀释液并将其添加至ELISA板(100μl/孔，一式两份)上，在RT下孵育1小时，然后用PBS+0.25％Tween 20洗涤5次。在洗涤后，将HRP缀合的二级抗人Fab(1:5000，目录号109-035-097，Jackson ImmunoResearch Inc)添加至每个孔并在RT下孵育30分钟。在用PBS+0.25％Tween 20洗涤5次后，将100μl的TMB Microwell过氧化物酶底物(KPL，盖瑟斯堡，马里兰州，美国)添加至每个孔。通过添加50μl 1M H2SO4终止反应，并使用SpectraMax M5(Molecular Devices)测量OD450，并使用SoftMax Pro6.3软件(Molecular Devices)进行分析。将最终数据传输至GraphPad Prism软件(GraphPadSoftware，加利福尼亚州，美国)，并绘图。使用相同软件计算EC50。
SPR测定
使用人CD38-His抗原(Cambridge Biologics，Cambridge，马萨诸塞州)进行全面动力学分析。使用SPR技术在BIACORE 3000(GE Healthcare)上对纯化的抗体进行动力学表征。使用捕获测定，其利用所研究抗体的人IgG1特异性抗体捕获和取向。对于含有Fc的蛋白质构建体的捕获，使用人抗体捕获试剂盒(GE Healthcare)。对于His标记的抗原的捕获，使用抗His抗体捕获试剂盒(GE Healthcare)。使用标准程序通过研究级CM5芯片(GE LifeSciences)上的伯胺基团(11000RU)固定捕获抗体。使用将导致通常30RU的最大分析物结合信号的调节的RU值以10μL/min的流速捕获所分析的抗体。针对三特异性抗体测量结合动力学。以30μl/min的流速使用HBS EP(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA和0.005％表面活性剂P20)作为测定缓冲液。用相应捕获试剂盒的再生溶液使芯片表面再生。在BIA评价程序包v4.1中使用不具有所捕获抗体的流动池作为参照和具有质量转移的1:1朗缪尔(Langmuir)结合模型分析并计算动力学参数。
体外T细胞增殖测量
通过负向选择使用磁性全T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec GmbH，德国)从人外周血单核细胞(PBMC)供体分离T细胞。通过制备无菌PBS中的抗体并分配50uL至每个孔中(350ng/孔)将抗体包被于96孔细胞培养板上。然后将所述板在37℃下孵育至少2小时，然后用无菌PBS洗涤。将未接触的T细胞添加至抗体包被的板(5x105个细胞/mL)并在37℃下孵育多日。在第4天用新的细胞培养基将所述细胞传代至新鲜的抗体包被板上。在使用7天孵育的某些实验中，在不更换的情况下仅添加新鲜培养基至新鲜的抗体包被板。在特定时间点收集细胞并使用CountBrightTM计数珠粒来计算细胞数。
体外T细胞增殖测定和T细胞亚群确定
从由Research Blood Components,LLC(波士顿，马萨诸塞州)收集的健康人供体的血液分离外周血单核细胞。如上文先前所述将PBMC添加至抗体包被的板(350ng/孔)(5x105个细胞/mL)，并在37℃下孵育3天和7天。在特定时间点收集细胞并通过流式细胞术分析T细胞亚群：原初(CCR7+CD45RO-)、Tcm(CCR7+CD45RO+)、Tem(CCR7-CD45RO+)、Tregs(CD4+Foxp3+CD25hi)。还用莫能菌素(GolgiStop)(BD Biosciences，加利福尼亚州)将细胞处理至少6小时，之后进行流动染色以确定细胞内细胞因子表达：Th1(CD4+IFN-γ+)、Th2(CD4+IL-4+)和Th17(CD4+IL-17+)。分别使用限制于PBMC供体的HLA/病毒肽(A*02:01/NLVPMVATV；SEQ ID NO:26)、(A*02:01/GLCTLVAML；SEQ ID NO:27)、(A*02:01/GILGFVFTL；SEQ ID NO:28)和(A*02:01/SLYNTVATL；SEQ ID NO:25)(ProImmune，牛津，英国)的荧光缀合的五聚体检测CMV pp65特异性、EBV BMLF特异性、甲型流感MP特异性和HIV-1Gag特异性CD8+T细胞。对于具有已知CMV、EBV或甲型流感的供体，PBMC是从HemaCare(Van Nuys，加利福尼亚州)获得，并且对于具有已知HIV-1阳性和HLA类型的供体，PBMC是从BioIVT(Westbury，纽约州)获得。使用来自对限制HLA类型呈阴性的供体的PMBC作为阴性对照。根据制造商的方案进行染色。
CMV特异性T细胞的定量
如上所述，从已知感染CMV的人供体的血液分离PBMC并将其添加至含有三特异性抗体或对照抗体的板。将所述板在37℃下孵育。在所指示的时间点收集细胞并如上所述对其进行分析。
结果
在与从CMV感染的人供体B(图5A至图5B)和CMV感染的人供体C(图6A至图6B)分离的PBMC一起孵育长达10天后，CD38VH1/CD28sup x CD3中三特异性抗体激活T细胞并促进CMV特异性记忆CD8+T细胞的增殖。如图5A(CMV供体B)和图6A(CMV供体C)中所示，相对于三重突变体对照抗体，CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特异性抗体导致CMV特异性记忆CD8+T细胞(细胞/μl)增加。另外，相对于三重突变体对照抗体，CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特异性抗体增加CMV特异性CD8+效应记忆(Tem)和中枢记忆(Tcm)细胞的百分比(CMV供体B，图5B；CMV供体C，图6B)。
总而言之，这些数据指示，CD38/CD28xCD3三特异性抗体促进CMV特异性T细胞(如CMV特异性CD8+T细胞、CMV特异性效应记忆(Tem)CD8+T细胞和CMV特异性中枢记忆(Tcm)CD8+T细胞)的激活和扩增。
实施例5：CD38/CD28xCD3三特异性抗体促进EBV特异性免疫应答
接着，确定CD38/CD28xCD3三特异性抗体促进爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)特异性T细胞的激活和扩增的能力。
材料和方法
EBV特异性T细胞的定量
如上所述，从已知感染EBV的人供体的血液分离PBMC并将其添加至含有三特异性抗体或对照抗体的板。将所述板在37℃下孵育。在所指示的时间点收集细胞并如上所述对其进行分析。
结果
在与从EBV感染的人供体A(图7A至图7B)和EBV感染的人供体B(图8A至图8B)分离的PBMC一起孵育长达11天后，CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特异性抗体激活T细胞并促进EBV特异性记忆CD8+T细胞的增殖。如图7A(EBV供体A)和图8A(EBV供体B)中所示，相对于三重突变体对照抗体，CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特异性抗体导致EBV特异性记忆CD8+T细胞(细胞/μl)增加。另外，相对于三重突变体对照抗体，CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特异性抗体增加EBV特异性CD8+Tem细胞和Tcm细胞的百分比(EBV供体A，图7B；EBV供体B，图8B，例如，参见第7天)。
总而言之，这些数据指示，CD38/CD28xCD3三特异性抗体促进EBV特异性T细胞(如EBV特异性CD8+T细胞、EBV特异性效应记忆(Tem)CD8+T细胞和EBV特异性中枢记忆(Tcm)CD8+T细胞)的激活和扩增。
实施例6：CD38/CD28xCD3三特异性抗体促进HIV特异性免疫应答
接着，确定CD38/CD28xCD3三特异性抗体促进人类免疫缺陷病毒(HIV)特异性T细胞的激活和扩增的能力。
材料和方法
HIV特异性T细胞的定量
如上所述，从已知感染HIV的人供体的血液分离PBMC并将其添加至含有三特异性抗体或对照抗体的板。将所述板在37℃下孵育。在所指示的时间点收集细胞并如上所述对其进行分析。
结果
在第0天(在与三特异性抗体一起孵育之前)，来自HIV阳性供体的PBMC展现HIVGag特异性CD8 T细胞(与PE缀合的A*02:01-SLYNTVATL(HIV-1gag p17 76-84)五聚体，ProImmune)(图9)。例如，与来自HIV阴性供体的PBMC中0.33％的Gag特异性CD8 T细胞相比，三种HIV阳性PBMC供体具有0.86％(HIV供体A)、0.95％(HIV供体B)和2.27％(HIV供体C)的Gag特异性CD8 T细胞。
将PBMC与CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特异性抗体一起孵育长达10天来激活T细胞并促进HIV特异性T细胞的增殖。如图10A(HIV供体D)、图11A(HIV供体E)和图12A(HIV供体F)中所示，相对于三重突变体对照抗体，CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特异性抗体导致HIV特异性记忆CD8+T细胞(细胞/μl)增加。另外，相对于三重突变体对照抗体，CD38VH1/CD28supx CD3mid三特异性抗体增加HIV特异性CD8+效应记忆(Tem)细胞的百分比(例如，参见第7天和第10天)，并且还以较低程度增加CD8+中枢记忆(Tcm)细胞的百分比(HIV供体D，图10B；HIV供体E，图11B；HIV供体F，图12B)。
实施例7：CD38/CD28xCD3三特异性抗体促进流感特异性免疫应答
确定CD38/CD28xCD3三特异性抗体促进流感特异性T细胞的激活和扩增的能力。
材料和方法
流感特异性T细胞的定量
如上所述，从已知感染甲型流感的人供体的血液分离PBMC并将其添加至含有三特异性抗体或对照抗体的板。将所述板在37℃下孵育。在所指示的时间点收集细胞并如上所述对其进行分析。
结果
在与从已知感染流感的人供体(图13A至图13B(流感供体A))分离的PBMC一起孵育长达11天后，CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特异性抗体激活T细胞并促进流感特异性记忆CD8+T细胞的增殖。如图13A中所示，相对于三重突变体对照抗体，CD38VH1/CD28sup xCD3mid三特异性抗体导致流感特异性记忆CD8+T细胞(细胞/μl)增加。另外，相对于三重突变体对照抗体，CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特异性抗体增加流感(流行性感冒)特异性CD8+Tem细胞(例如，参见第7天和第11天)和Tcm细胞(例如，参见第7天)的百分比(图13B)。
总而言之，实施例1-7中呈现的数据显示三特异性抗CD38/CD3/CD28抗体刺激针对多种病毒的有效抗病毒免疫力。不希望受理论束缚，人们相信，CD38/CD3/CD28三特异性抗体可以通过接合T细胞上的所有三种配体来激活并促进T细胞的增殖。具体地，人们相信，CD38/CD3/CD28三特异性抗体接合T细胞上的CD3/CD28启动了T细胞激活、增殖和分化为记忆T细胞。此外，不希望受理论束缚，人们相信，接合CD28提供有利的共刺激信号，所述共刺激信号增强免疫应答的持续时间和量级，并促进T细胞增殖和存活。
虽然本公开文本包括各个实施方案，但是应理解本领域技术人员将想到多种变化和修改。因此，所附的权利要求书意图涵盖在本公开文本的范围内的所有此类等效变化。另外，本文使用的章节标题只是出于组织的目的，而不应解释为限制所描述的主题。
除非明确指示相反含义，否则本文所述的每个实施方案可以与其他任何一个或多个实施方案组合。具体地，除非明确指示相反含义，否则指示为优选或有利的任何特征或实施方案可以与指示为优选或有利的其他任何一个或多个特征或一个或多个实施方案组合。
本申请中引用的所有参考文献均以引用的方式明确地并入本文。
序列表
<110> 赛诺菲
<120> 三特异性抗CD38、抗CD28和抗CD3结合蛋白和用于治疗病毒感染的使用方法
<130> 18395-20321.40
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> EP 19306097.7
<151> 2019-09-11
<150> US 62/831,608
<151> 2019-04-09
<150> US 62/831,572
<151> 2019-04-09
<150> PCT/US2018/055084
<151> 2018-10-09
<160> 132
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 256
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro
1 5 10 15
Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu
20 25 30
Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala
35 40 45
Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro
50 55 60
Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu
65 70 75 80
Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg
85 90 95
Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp
100 105 110
Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser
115 120 125
Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe
130 135 140
Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val
145 150 155 160
His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser
165 170 175
Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln
180 185 190
Thr Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp
195 200 205
Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys
210 215 220
Arg Asn Ile Gln Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe
225 230 235 240
Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile
245 250 255
<210> 2
<211> 265
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro
1 5 10 15
Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu
20 25 30
Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala
35 40 45
Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro
50 55 60
Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu
65 70 75 80
Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg
85 90 95
Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp
100 105 110
Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser
115 120 125
Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe
130 135 140
Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val
145 150 155 160
His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser
165 170 175
Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln
180 185 190
Thr Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp
195 200 205
Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys
210 215 220
Arg Asn Ile Gln Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe
225 230 235 240
Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile
245 250 255
Ser Ala Ser His His His His His His
260 265
<210> 3
<400> 3
000
<210> 4
<211> 265
<212> PRT
<213> 成束猴
<400> 4
Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Arg Phe Pro
1 5 10 15
Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Val His Pro Glu
20 25 30
Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala
35 40 45
Phe Ile Ser Lys Tyr Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro
50 55 60
Leu Val Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Thr Leu Leu
65 70 75 80
Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg
85 90 95
Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Met Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp
100 105 110
Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Phe Glu Ile Asn Tyr Gln Ser
115 120 125
Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe
130 135 140
Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Thr Ala Cys Gly Val Val
145 150 155 160
His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser
165 170 175
Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln
180 185 190
Ala Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp
195 200 205
Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys
210 215 220
Arg Asn Ile Arg Phe Phe Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe
225 230 235 240
Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Leu Ser Gly Ile
245 250 255
Ser Ala Ser His His His His His His
260 265
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Glu Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115
<210> 6
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 7
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Glu Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly
225 230 235 240
Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 8
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 9
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Tyr Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 12
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Tyr Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 13
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Gln Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Gln Gly Ile Arg Asn Asp
1 5
<210> 45
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Ala Ala Ser
1
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Tyr Pro Thr
1 5
<210> 47
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Leu Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Pro Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Lys
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Lys Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115
<210> 52
<211> 111
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Val Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Ser Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Thr Gln Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Thr Lys Gly Pro Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 60
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Lys
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
130 135 140
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp Met His Trp Val Arg Gln
145 150 155 160
Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser
165 170 175
Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
195 200 205
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr
210 215 220
Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Arg Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
245 250 255
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
260 265 270
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
275 280 285
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
290 295 300
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
325 330 335
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
340 345 350
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
355 360 365
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
370 375 380
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
385 390 395 400
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
405 410 415
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
420 425 430
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
435 440 445
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
450 455 460
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
465 470 475 480
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
485 490 495
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
500 505 510
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
515 520 525
Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
530 535 540
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
545 550 555 560
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
565 570
<210> 61
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Ser Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Thr Gln Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
115 120 125
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala
130 135 140
Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
145 150 155 160
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly
165 170 175
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
180 185 190
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
195 200 205
Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
210 215 220
Ile Lys Thr Lys Gly Pro Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
245 250 255
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
260 265 270
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
275 280 285
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
290 295 300
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
305 310 315 320
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
325 330 335
Glu Cys
<210> 62
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 63
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Gln Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 64
<211> 573
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Lys
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
130 135 140
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp Met His Trp Val Arg Gln
145 150 155 160
Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser
165 170 175
Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
195 200 205
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr
210 215 220
Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Arg Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
245 250 255
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
260 265 270
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
275 280 285
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
290 295 300
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
325 330 335
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
340 345 350
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
370 375 380
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
385 390 395 400
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
405 410 415
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
420 425 430
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
435 440 445
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
450 455 460
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
465 470 475 480
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
485 490 495
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
500 505 510
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
515 520 525
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
530 535 540
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
545 550 555 560
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570
<210> 65
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
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195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 66
<211> 573
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Lys
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
130 135 140
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp Met His Trp Val Arg Gln
145 150 155 160
Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser
165 170 175
Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
195 200 205
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr
210 215 220
Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Arg Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
245 250 255
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
260 265 270
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
275 280 285
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
290 295 300
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
325 330 335
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
340 345 350
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
370 375 380
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
385 390 395 400
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
405 410 415
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser Val
420 425 430
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
435 440 445
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
450 455 460
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
465 470 475 480
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
485 490 495
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
500 505 510
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
515 520 525
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
530 535 540
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
545 550 555 560
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570
<210> 67
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 68
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 69
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Tyr Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 70
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 71
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 71
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 72
<211> 1710
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag gtcgtgaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctactaca tccactgggt gcgccaggcc 120
cctggacagg gactggaatg gatcggcagc atctaccccg gcaacgtgaa caccaactac 180
gcccagaagt tccagggcag agccaccctg accgtggaca ccagcatcag caccgcctac 240
atggaactga gccggctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcac ccggtcccac 300
tacggcctgg attggaactt cgacgtgtgg ggcaagggca ccaccgtgac agtgtctagc 360
agccaggtgc agctggtgga atctggcggc ggagtggtgc agcctggcag aagcctgaga 420
ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc accaaggcct ggatgcactg ggtgcgccag 480
gcccctggaa agcagctgga atgggtggcc cagatcaagg acaagagcaa cagctacgcc 540
acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac 600
accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgtcgg 660
ggcgtgtact atgccctgag ccccttcgat tactggggcc agggaaccct cgtgaccgtg 720
tctagtcgga ccgccagcac aaagggccca tcggtgttcc ctctggcccc ttgcagcaga 780
agcaccagcg aatctacagc cgccctgggc tgcctcgtga aggactactt tcccgagccc 840
gtgaccgtgt cctggaactc tggcgctctg acaagcggcg tgcacacctt tccagccgtg 900
ctccagagca gcggcctgta ctctctgagc agcgtcgtga cagtgcccag cagcagcctg 960
ggcaccaaga cctacacctg taacgtggac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 1020
cgggtggaat ctaagtacgg ccctccctgc cctccttgcc cagcccctga agctgccggc 1080
ggaccctccg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 1140
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccaggaag atcccgaggt gcagttcaat 1200
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggaacagttc 1260
aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 1320
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag ggcctgccca gctccatcga gaaaaccatc 1380
agcaaggcca agggccagcc ccgcgagcct caagtgtgta ccctgccccc tagccaggaa 1440
gagatgacca agaaccaggt gtccctgagc tgtgccgtga aaggcttcta ccccagcgac 1500
attgccgtgg aatgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1560
gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg gtgtccaagc tgaccgtgga caagagccgg 1620
tggcaggaag gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1680
acccagaagt ccctgtctct gtccctgggc 1710
<210> 73
<211> 1014
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60
atcagctgca agagcagcca gagcctggtg cacaacaacg ccaacaccta cctgagctgg 120
tatctgcaga agcccggcca gagcccccag tccctgatct acaaggtgtc caacagattc 180
agcggcgtgc ccgacagatt ctccggcagc ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactattgtg gccagggcac ccagtacccc 300
ttcacctttg gcagcggcac caaggtggaa atcaagggcc agcccaaggc cgcccccgac 360
atccagatga cccagagccc cagcagcctg tctgccagcg tgggcgacag agtgaccatc 420
acctgtcagg ccagccagaa catctacgtg tggctgaact ggtatcagca gaagcccggc 480
aaggccccca agctgctgat ctacaaggcc agcaacctgc acaccggcgt gcccagcaga 540
ttttctggca gcggctccgg caccgacttc accctgacaa tcagctccct gcagcccgag 600
gacattgcca cctactactg ccagcagggc cagacctacc cctacacctt tggccagggc 660
accaagctgg aaatcaagac caagggcccc agccgtacgg tggccgctcc cagcgtgttc 720
atcttcccac ctagcgacga gcagctgaag tccggcacag cctctgtcgt gtgcctgctg 780
aacaacttct acccccgcga ggccaaagtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 840
ggcaacagcc aggaaagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 900
agcaccctga cactgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaagtg 960
acccaccagg gcctgtctag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgt 1014
<210> 74
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacgcca tgcactgggt caaagaggcc 120
cctggccaga gactggaatg gatcggctac atctaccccg gccagggcgg caccaactac 180
aaccagaagt tccagggcag agccaccctg accgccgata caagcgccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggat accgccgtgt acttctgtgc cagaacaggc 300
ggcctgaggc gggcctactt tacctattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtctagc 360
gctagcacaa agggcccatc ggtgttccct ctggcccctt gcagcagaag caccagcgaa 420
tctacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgctctgac aagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct ccagagcagc 540
ggcctgtact ctctgagcag cgtcgtgaca gtgcccagca gcagcctggg caccaagacc 600
tacacctgta acgtggacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 660
aagtacggcc ctccctgccc tccttgccca gcccctgaag ctgccggcgg accctccgtg 720
ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaagtgacc 780
tgcgtggtgg tggatgtgtc ccaggaagat cccgaggtgc agttcaattg gtacgtggac 840
ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa cagcacctac 900
cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960
tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc tccatcgaga aaaccatcag caaggccaag 1020
ggccagcccc gcgagcctca agtgtatacc ctgccccctt gccaggaaga gatgaccaag 1080
aaccaggtgt ccctgtggtg tctcgtgaaa ggcttctacc ccagcgacat tgccgtggaa 1140
tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200
gacggctcat tcttcctgta ctccaagctg accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc 1260
aacgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320
ctgtctctgt ccctgggc 1338
<210> 75
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
gacatcgtgc tgacacagag ccctgccacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc 60
atcagctgta gagccagcca gagcgtgtcc agctacggcc agggcttcat gcactggtat 120
cagcagaagc ccggccagcc ccccagactg ctgatctatg gcgccagcag cagagccaca 180
ggcatccccg ccagattttc tggctctggc agcggcaccg acttcaccct gacaatcagc 240
cccctggaac ccgaggactt cgccgtgtac tactgccagc agaacaaaga ggacccctgg 300
accttcggcg gaggcaccaa gctggaaatc aagcgtacgg tggccgctcc cagcgtgttc 360
atcttcccac ctagcgacga gcagctgaag tccggcacag cctctgtcgt gtgcctgctg 420
aacaacttct acccccgcga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc cctgcagagc 480
ggcaacagcc aggaaagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 540
agcaccctga ccctgtccaa ggccgattac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaagtg 600
acccaccagg gcctgtctag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgc 654
<210> 76
<211> 1719
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag gtcgtgaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctactaca tccactgggt gcgccaggcc 120
cctggacagg gactggaatg gatcggcagc atctaccccg gcaacgtgaa caccaactac 180
gcccagaagt tccagggcag agccaccctg accgtggaca ccagcatcag caccgcctac 240
atggaactga gccggctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcac ccggtcccac 300
tacggcctgg attggaactt cgacgtgtgg ggcaagggca ccaccgtgac agtgtctagc 360
agccaggtgc agctggtgga atctggcggc ggagtggtgc agcctggcag aagcctgaga 420
ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc accaaggcct ggatgcactg ggtgcgccag 480
gcccctggaa agcagctgga atgggtggcc cagatcaagg acaagagcaa cagctacgcc 540
acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac 600
accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgtcgg 660
ggcgtgtact atgccctgag ccccttcgat tactggggcc agggaaccct cgtgaccgtg 720
tctagtcgga ccgccagcac aaagggcccc agcgtgttcc ctctggcccc tagcagcaag 780
agcacatctg gcggaacagc cgccctgggc tgcctcgtga aggactactt tcccgagccc 840
gtgaccgtgt cctggaattc tggcgccctg accagcggcg tgcacacctt tccagctgtg 900
ctgcagtcca gcggcctgta cagcctgagc agcgtcgtga cagtgcccag cagctctctg 960
ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 1020
aaggtggaac ccaagagctg cgacaagacc cacacctgtc ccccttgtcc tgcccccgaa 1080
gccgccggag gcccttccgt gttcctgttc cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc 1140
agccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg gtggatgtgt cccacgagga ccctgaagtg 1200
aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gccaagagag 1260
gaacagtaca acagcaccta ccgggtggtg tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 1320
ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg ccctggccgc ccccatcgag 1380
aaaaccatca gcaaggccaa gggccagccc cgcgaacccc aggtgtgcac actgccccca 1440
agcagggacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgagct gtgccgtgaa aggcttctac 1500
ccctccgata tcgccgtgga atgggagagc aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1560
accccccctg tgctggacag cgacggctca ttcttcctgg tgtccaagct gacagtggac 1620
aagtcccggt ggcagcaggg caacgtgttc agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac 1680
aaccactaca cccagaagtc cctgagcctg agccccggc 1719
<210> 77
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacgcca tgcactgggt caaagaggcc 120
cctggccaga gactggaatg gatcggctac atctaccccg gccagggcgg caccaactac 180
aaccagaagt tccagggcag agccaccctg accgccgata caagcgccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggat accgccgtgt acttctgtgc cagaacaggc 300
ggcctgaggc gggcctactt tacctattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtctagc 360
gctagcacaa agggccccag cgtgttccct ctggccccta gcagcaagag cacatctggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaattctg gcgccctgac cagcggcgtg cacacctttc cagctgtgct gcagtccagc 540
ggcctgtaca gcctgagcag cgtcgtgaca gtgcccagca gctctctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660
aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccttgtcctg cccccgaagc cgccggaggc 720
ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc caagagagga acagtacaac 900
agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctggccgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020
aaggccaagg gccagccccg cgaaccccag gtgtacacac tgcccccatg cagggacgag 1080
ctgaccaaga accaggtgtc cctgtggtgt ctggtgaaag gcttctaccc ctccgatatc 1140
gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200
ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga cagtggacaa gtcccggtgg 1260
cagcagggca acgtgttcag ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320
cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347
<210> 78
<211> 1719
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 78
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag gtcgtgaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctactaca tccactgggt gcgccaggcc 120
cctggacagg gactggaatg gatcggcagc atctaccccg gcaacgtgaa caccaactac 180
gcccagaagt tccagggcag agccaccctg accgtggaca ccagcatcag caccgcctac 240
atggaactga gccggctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcac ccggtcccac 300
tacggcctgg attggaactt cgacgtgtgg ggcaagggca ccaccgtgac agtgtctagc 360
agccaggtgc agctggtgga atctggcggc ggagtggtgc agcctggcag aagcctgaga 420
ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc accaaggcct ggatgcactg ggtgcgccag 480
gcccctggaa agcagctgga atgggtggcc cagatcaagg acaagagcaa cagctacgcc 540
acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac 600
accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgtcgg 660
ggcgtgtact atgccctgag ccccttcgat tactggggcc agggaaccct cgtgaccgtg 720
tctagtcgga ccgccagcac aaagggcccc agcgtgttcc ctctggcccc tagcagcaag 780
agcacatctg gcggaacagc cgccctgggc tgcctcgtga aggactactt tcccgagccc 840
gtgaccgtgt cctggaattc tggcgccctg accagcggcg tgcacacctt tccagctgtg 900
ctgcagtcca gcggcctgta cagcctgagc agcgtcgtga cagtgcccag cagctctctg 960
ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 1020
aaggtggaac ccaagagctg cgacaagacc cacacctgtc ccccttgtcc tgcccccgaa 1080
ctgctgggag gcccttccgt gttcctgttc cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc 1140
agccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg gtggatgtgt cccacgagga ccctgaagtg 1200
aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gccaagagag 1260
gaacagtaca acaatgcctc ccgggtggtg tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 1320
ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg ccctgcctgc ccccatcgag 1380
aaaaccatca gcaaggccaa gggccagccc cgcgaacccc aggtgtgcac actgccccca 1440
agcagggacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgagct gtgccgtgaa aggcttctac 1500
ccctccgata tcgccgtgga atgggagagc aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1560
accccccctg tgctggacag cgacggctca ttcttcctgg tgtccaagct gacagtggac 1620
aagtcccggt ggcagcaggg caacgtgttc agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac 1680
aaccactaca cccagaagtc cctgagcctg agccccggc 1719
<210> 79
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 79
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacgcca tgcactgggt caaagaggcc 120
cctggccaga gactggaatg gatcggctac atctaccccg gccagggcgg caccaactac 180
aaccagaagt tccagggcag agccaccctg accgccgata caagcgccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggat accgccgtgt acttctgtgc cagaacaggc 300
ggcctgaggc gggcctactt tacctattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtctagc 360
gctagcacaa agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tatgttgacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
aatgcctccc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag 1080
ctgaccaaga atcaagtcag cctgtggtgc ctggtaaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac tcaaaactca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 1347
<210> 80
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
caggtgcagc tggtggaaag cggcggaggc gtggtgcagc ctggcaggtc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacggaa tgcactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gactggaatg ggtggccgtg atttggtacg acggcagcaa caagtactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agcggcgaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaatgttc 300
agaggcgcct tcgactactg gggccagggc acactcgtga ccgtgtctag tgcgtcgacc 360
aagggcccat cggtgttccc tctggcccct tgcagcagaa gcaccagcga atctacagcc 420
gccctgggct gcctcgtgaa ggactacttt cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaactct 480
ggcgctctga caagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tccagagcag cggcctgtac 540
tctctgagca gcgtcgtgac agtgcccagc agcagcctgg gcaccaagac ctacacctgt 600
aacgtggacc acaagcccag caacaccaag gtggacaagc gggtggaatc taagtacggc 660
cctccctgcc ctccttgccc agcccctgaa gctgccggcg gaccctccgt gttcctgttc 720
cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc agccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg 780
gtggatgtgt cccaggaaga tcccgaggtg cagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa 840
gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag gaacagttca acagcaccta ccgggtggtg 900
tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg 960
tccaacaagg gcctgcccag ctccatcgag aaaaccatca gcaaggccaa gggccagccc 1020
cgcgagcctc aagtgtatac cctgccccct tgccaggaag agatgaccaa gaaccaggtg 1080
tccctgtggt gtctcgtgaa aggcttctac cccagcgaca ttgccgtgga atgggagagc 1140
aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc accccccctg tgctggacag cgacggctca 1200
ttcttcctgt actccaagct gaccgtggac aagagccggt ggcaggaagg caacgtgttc 1260
agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagtc cctgtctctg 1320
tccctgggc 1329
<210> 81
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
gccatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta gagccagcca gggcatccgg aacgacctgg gctggtatca gcagaagcct 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gctagctctc tgcagtccgg cgtgcccagc 180
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga caatctctgg cctgcagccc 240
gaggacagcg ccacctacta ctgtctgcaa gactacatct actaccccac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttcccacct 360
agcgacgagc agctgaagtc cggcacagcc tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgcgagg ccaaagtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gaaagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgaca 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600
ctgtctagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gt 642
<210> 82
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 82
caggtgcagc tggtggaaag cggcggaggc gtggtgcagc ctggcaggtc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacggaa tgcactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gactggaatg ggtggccgtg atttggtacg acggcagcaa caagtactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agcggcgaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaatgttc 300
agaggcgcct tcgactactg gggccagggc acactcgtga ccgtgtctag tgcgtcgacc 360
aagggcccca gcgtgttccc tctggcccct agcagcaaga gcacatctgg cggaacagcc 420
gccctgggct gcctcgtgaa ggactacttt cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaattct 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttt ccagctgtgc tgcagtccag cggcctgtac 540
agcctgagca gcgtcgtgac agtgcccagc agctctctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagagctgc 660
gacaagaccc acacctgtcc cccttgtcct gcccccgaag ccgccggagg cccttccgtg 720
ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaagtgacc 780
tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggac cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac 840
ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag ccaagagagg aacagtacaa cagcacctac 900
cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960
tgcaaggtgt ccaacaaggc cctggccgcc cccatcgaga aaaccatcag caaggccaag 1020
ggccagcccc gcgaacccca ggtgtacaca ctgcccccat gcagggacga gctgaccaag 1080
aaccaggtgt ccctgtggtg tctggtgaaa ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa 1140
tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200
gacggctcat tcttcctgta ctccaagctg acagtggaca agtcccggtg gcagcagggc 1260
aacgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320
ctgagcctga gccccggc 1338
<210> 83
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
caggtgcagc tggtggaaag cggcggaggc gtggtgcagc ctggcaggtc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacggaa tgcactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gactggaatg ggtggccgtg atttggtacg acggcagcaa caagtactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agcggcgaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaatgttc 300
agaggcgcct tcgactactg gggccagggc acactcgtga ccgtgtctag tgcgtcgacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtatgttgac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa caatgcctcc 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat gccgggatga gctgaccaag 1080
aatcaagtca gcctgtggtg cctggtaaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta ctcaaaactc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggt 1338
<210> 84
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 84
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 85
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 85
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Thr Gln Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 86
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 86
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 87
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 87
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 88
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 88
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 89
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 89
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 90
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 90
Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 91
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 91
Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 92
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 92
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Val
<210> 93
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 93
Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr
1 5 10 15
Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Phe Cys
35
<210> 94
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 94
Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr
1 5 10 15
Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Phe Cys
35
<210> 95
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 95
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 96
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 96
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 97
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 97
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 98
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 98
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 99
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 99
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 100
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 100
Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 101
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 101
Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 102
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 102
Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 103
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 103
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 104
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 104
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 105
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 105
Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro
1 5 10 15
Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu
20 25 30
Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala
35 40 45
Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro
50 55 60
Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu
65 70 75 80
Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg
85 90 95
Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp
100 105 110
Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser
115 120 125
Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe
130 135 140
Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg His Phe Trp Glu Cys Gly Ser Pro
145 150 155
<210> 106
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 106
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Leu Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Pro Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 107
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 107
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 108
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 109
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 109
Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr
1 5
<210> 110
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 110
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val
1 5 10
<210> 111
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 111
Gln Asn Ile Tyr Val Trp
1 5
<210> 112
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 112
Lys Ala Ser
1
<210> 113
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 113
Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
1 5
<210> 114
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 114
Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr Gly
1 5
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 115
Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr
1 5
<210> 116
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 116
Ala Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 117
Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu
1 5 10
<210> 118
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 118
Ala Ala Ser
1
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 119
Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 120
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 120
Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp
1 5
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 121
Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr
1 5 10
<210> 122
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 122
Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 123
Gln Ser Leu Val His Asn Asn Ala Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 124
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 124
Lys Val Ser
1
<210> 125
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 125
Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 126
Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp
1 5
<210> 127
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 127
Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr
1 5 10
<210> 128
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 128
Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 129
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 129
Gln Ser Leu Val His Asn Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 130
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 130
Lys Val Ser
1
<210> 131
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 131
Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 132
Gln Ser Val Ser Ser Tyr Gly Gln Gly
1 5

Claims (31)

1.一种扩增病毒特异性记忆T细胞的方法，所述方法包括使病毒特异性记忆T细胞与结合蛋白接触，其中所述结合蛋白包含形成三个抗原结合位点的四条多肽链，其中第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
并且第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
并且第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
并且第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接所述CH1与CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；并且
其中VH1和VL1形成结合CD28多肽的第一抗原结合位点，其中VH2和VL2形成结合CD3多肽的第二抗原结合位点，并且其中VH3和VL3形成结合CD38多肽的第三抗原结合位点。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在体外或离体使所述病毒特异性记忆T细胞与所述结合蛋白接触。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中使所述病毒特异性记忆T细胞与所述结合蛋白接触引起病毒特异性记忆T细胞的激活和/或增殖。
4.一种扩增T细胞的方法，所述方法包括在体外或离体使T细胞与结合蛋白接触，其中所述结合蛋白包含形成所述三个抗原结合位点的四条多肽链，其中第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
并且第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
并且第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
并且第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接所述CH1与CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；并且
其中VH1和VL1形成结合CD28多肽的第一抗原结合位点，其中VH2和VL2形成结合CD3多肽的第二抗原结合位点，并且其中VH3和VL3形成结合CD38多肽的第三抗原结合位点。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述T细胞是记忆T细胞或效应T细胞。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述T细胞在其细胞表面上表达嵌合抗原受体(CAR)或包含编码CAR的多核苷酸。
7.一种治疗慢性病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的个体给予有效量的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含形成所述三个抗原结合位点的四条多肽链，其中第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
并且第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
并且第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
并且第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接所述CH1与CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；并且
其中VH1和VL1形成结合CD28多肽的第一抗原结合位点，其中VH2和VL2形成结合CD3多肽的第二抗原结合位点，并且其中VH3和VL3形成结合CD38多肽的第三抗原结合位点。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述个体是人。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中将所述结合蛋白以包含所述结合蛋白和药学上可接受的载体的药物配制品给予至所述个体。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中给予所述结合蛋白导致所述个体中病毒特异性记忆T细胞的激活和/或增殖。
11.根据权利要求1-6和10中任一项所述的方法，其中所述记忆T细胞是CD8+或CD4+记忆T细胞。
12.根据权利要求1-6、10和11中任一项所述的方法，其中所述记忆T细胞是中枢记忆T细胞(TCM)或效应记忆T细胞(TEM)。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述CD28多肽是人CD28多肽，其中所述CD3多肽是人CD3多肽，并且其中所述CD38多肽是人CD38多肽。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中：
(a)所述VH3结构域包含：含有GYTFTSFN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNGGT(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ IDNO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；并且所述VL3结构域包含：含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有LAS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；
(b)所述VH3结构域包含：含有GYTFTSYA(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGQGGT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ IDNO:33)的氨基酸序列的CDR-H3序列；并且所述VL3结构域包含：含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有GAS(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的CDR-L3序列；或者
(c)所述VH3结构域包含：含有GFTFSSYG(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IWYDGSNK(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的CDR-H3序列；并且所述VL3结构域包含：含有QGIRND(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有AAS(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中：
(a)所述VH3结构域包含QVQLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKETPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFKGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列，并且所述VL3结构域包含DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ IDNO:6)的氨基酸序列；
(b)所述VH3结构域包含QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGQGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:13)的氨基酸序列，并且所述VL3结构域包含DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASQSVSSYGQGFMHWYQQKPGQPPRLLIYGASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列；
(c)所述VH3结构域包含QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:17)的氨基酸序列，并且所述VL3结构域包含DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；
(d)所述VH3结构域包含QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:21)的氨基酸序列，并且所述VL3结构域包含DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；
(e)所述VH3结构域包含QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:23)的氨基酸序列，并且所述VL3结构域包含DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；或者
(f)所述VH3结构域包含QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMFRGAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列，并且所述VL3结构域包含AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYCLQDYIYYPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中：
(a)所述VH1结构域包含：含有GYTFTSYY(SEQ ID NO:108)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNVNT(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有TRSHYGLDWNFDV(SEQ IDNO:110)的氨基酸序列的CDR-H3序列；并且所述VL1结构域包含：含有QNIYVW(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有KAS(SEQ ID NO:112)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQGQTYPY(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的CDR-L3序列；或者
(b)所述VH1结构域包含：含有GFSLSDYG(SEQ ID NO:114)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IWAGGGT(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有ARDKGYSYYYSMDY(SEQ IDNO:116)的氨基酸序列的CDR-H3序列；并且所述VL1结构域包含：含有ESVEYYVTSL(SEQ IDNO:117)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有AAS(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有QQSRKVPYT(SEQ ID NO:119)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
17.根据权利要求16所述的方法，其中：
(a)所述VH1结构域包含QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYAQKFQGRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCTRSHYGLDWNFDVWGKGTTVTVSS(SEQ IDNO:49)的氨基酸序列，并且所述VL1结构域包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIK(SEQ IDNO:50)的氨基酸序列；或者
(b)所述VH1结构域包含QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSLSDYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGGTNYNPSLKSRKTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTTVTVS(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列，并且所述VL1结构域包含DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDVANYYCQQSRKVPYTFGQGTKLEIK(SEQID NO:52)的氨基酸序列。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中：
(a)所述VH2结构域包含：含有GFTFTKAW(SEQ ID NO:120)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IKDKSNSYAT(SEQ ID NO:121)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有RGVYYALSPFDY(SEQID NO:122)的氨基酸序列的CDR-H3序列；并且所述VL2结构域包含：含有QSLVHNNANTY(SEQID NO:123)的氨基酸序列的CDR-L1序列、含有KVS(SEQ ID NO:124)的氨基酸序列的CDR-L2序列和含有GQGTQYPFT(SEQ ID NO:125)的氨基酸序列的CDR-L3序列；或者
(b)所述VH2结构域包含：含有GFTFTKAW(SEQ ID NO:126)的氨基酸序列的CDR-H1序列、含有IKDKSNSYAT(SEQ ID NO:127)的氨基酸序列的CDR-H2序列和含有GVYYALSPFDY(SEQ IDNO:128)的氨基酸序列的CDR-H3序列；并且所述VL2结构域包含：含有QSLVHNNGNTY(SEQ IDNO:129)的氨基酸序列的CDR-L1序列、包含KVS(SEQ ID NO:130)的氨基酸序列的CDR-L2序列和包含GQGTQYPFT(SEQ ID NO:131)的氨基酸序列的CDR-L3序列。
19.根据权利要求18所述的方法，其中：
(a)所述VH2结构域包含QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSNSYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:53)的氨基酸序列，并且所述VL2结构域包含DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKVEIK(SEQ ID NO:54)的氨基酸序列；或者
(b)所述VH2结构域包含QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKGLEWVAQIKDKSNSYATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:84)的氨基酸序列，并且所述VL2结构域包含DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:85)的氨基酸序列。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中L1、L2、L3或L4中的至少一个独立地为0个氨基酸的长度。
21.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中(a)L1、L2、L3和L4各自独立地为零个氨基酸的长度或包含选自以下项的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO:56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO:57)、GQPKAAP(SEQ ID NO:58)和GGSGSSGSGG(SEQ IDNO:59)；或者(b)L1、L2、L3和L4各自独立地包含选自以下项的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO:57)、GQPKAAP(SEQ ID NO:58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:59)。
22.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO:58)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO:57)，L3包含序列S，并且L4包含序列RT。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG4铰链-CH2-CH3结构域，并且其中所述铰链-CH2-CH3结构域各自包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置234和235的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是F234A和L235A。
24.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG4铰链-CH2-CH3结构域，并且其中所述铰链-CH2-CH3结构域各自包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置233-236的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236处的缺失。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG4铰链-CH2-CH3结构域，并且其中所述铰链-CH2-CH3结构域各自包含根据EU索引在对应于人IgG4的位置228和409的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S228P和R409K。
26.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG1铰链-CH2-CH3结构域，并且其中所述铰链-CH2-CH3结构域各自包含根据EU索引在对应于人IgG1的位置234、235和329的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是L234A、L235A和P329A。
27.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述第二和所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域是人IgG1铰链-CH2-CH3结构域，并且其中所述铰链-CH2-CH3结构域各自包含根据EU索引在对应于人IgG1的位置298、299和300的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S298N、T299A和Y300S。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述第二多肽链的铰链-CH2-CH3结构域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；并且其中所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置354和366的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S354C和T366W。
29.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述第二多肽链的铰链-CH2-CH3结构域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置354和366的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S354C和T366W；并且其中所述第三多肽链的铰链-CH2-CH3结构域包含根据EU索引在对应于人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
30.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中：
(a)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ IDNO:60的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，并且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；
(b)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ IDNO:64的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；
(c)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ IDNO:66的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列，并且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；
(d)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ IDNO:60的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，并且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；
(e)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ IDNO:64的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，并且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；或者
(f)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述第二多肽链包含SEQ IDNO:66的氨基酸序列，所述第三多肽链包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，并且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、巨细胞病毒(CMV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人乳头瘤病毒(HPV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、人泡沫病毒(HFV)、单纯疱疹病毒1(HSV-1)或单纯疱疹病毒2(HSV-2)。
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