CN105837688B

CN105837688B - 单域抗体及其编码基因，免疫毒素及其编码基因、制备方法、表达载体、应用，及宿主细胞

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Publication number: CN105837688B
Application number: CN201510808316.8A
Authority: CN
Inventors: 赵永娟; 李汉璋; 黎婷
Original assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Current assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Priority date: 2015-11-20
Filing date: 2015-11-20
Publication date: 2019-02-26
Anticipated expiration: 2035-11-20
Also published as: CN105837688A

Abstract

本发明公开了CD38单域抗体及其编码基因，CD38的免疫毒素及其制备方法、表达载体、在制备用于治疗多发性骨髓瘤药物与慢性淋巴样白血病药物中的应用，以及宿主细胞；本发明通过采用单域抗体及免疫毒素融合技术，实现了针对CD38的免疫毒素，具有制备工艺简单、成本低、高效靶向杀伤肿瘤细胞的优点，并且采用以CD38单域抗体为基础的免疫毒素，以利于多发性骨髓瘤及慢性淋巴样白血病等疾病的治疗。

Description

单域抗体及其编码基因，免疫毒素及其编码基因、制备方法、表达载体、应用，及宿主细胞

技术领域

本发明涉及CD38的研究，尤其涉及的是，一种CD38单域抗体及其编码基因，具有该CD38单域抗体的CD38的免疫毒素及其制备方法，以及该免疫毒素的表达载体，该免疫毒素在制备用于治疗多发性骨髓瘤药物中的应用、与该免疫毒素在制备用于治疗慢性淋巴样白血病药物中的应用，以及具有该表达载体的宿主细胞。

背景技术

二十世纪八十年代，CD38发现于T淋巴细胞表面，被用作细胞分化的标记物。2004年，在多发性骨髓瘤细胞中发现CD38普遍处于高表达状态，而在正常淋巴细胞、骨髓细胞以及一些非造血细胞上处于低表达状态，这使CD38成为治疗骨髓瘤的一个理想靶点。目前，有数个抗CD38的单克隆抗体正在临床试验阶段，包括daratumumab、SAR650984和MOR202等。另外，人们还尝试在单克隆抗体HB7或IB4的基础上，将植物毒素蓖麻毒素或白树毒素与之进行化学交联制备成免疫毒素，对CD38高表达的多发性骨髓瘤或非霍奇金淋巴瘤细胞具有杀伤作用。

例如，筛选针对CD38的具有功效的单克隆抗体，用于治疗多发性骨髓瘤。其实施方案为：CD38作为抗原，免疫小鼠，从免疫的小鼠脾脏中分离浆细胞，分离的浆细胞与不具分泌功能的骨髓瘤细胞融合，筛选出具有分泌抗体功能的杂交瘤细胞，从培养杂交瘤细胞的培养基中纯化得到单克隆抗体，通过检测单克隆抗体与抗原的结合能力和细胞毒性，从中筛选出具有功效的单克隆抗体；鼠源的单克隆抗体需要进行进一步人源化改造。或者，通过构建并筛选噬菌体展示文库的方法，可获得全人源的单克隆抗体。

单克隆抗体的最大缺点是生产成本非常高，因为它一般用哺乳细胞进行生产；单克隆抗体的其他缺点还包括：获得具有细胞毒活性的高亲和力抗体相对困难，且其功效的发挥还与机体的免疫状态相关，往往还因为活性不够需要与其他药物联用等。

例如，获得单克隆抗体后需要在体外与毒素蛋白进行化学交联，获得以单克隆抗体为基础的免疫毒素。该技术的缺点除了单克隆抗体本身制备缺点外，化学交联的均一性较难保证，而且该毒素体内半衰期较长，容易产生免疫原性。

因此，需要开发新的制剂对传统单克隆抗体药物进行补充。

1993年，Hamers-Casterman等人在驼科生物的血液中发现了仅有重链组成的重链抗体(heavy chain antibody，hcAb)。而重链抗体的可变区，是能够与抗原结合的最小抗体单元，其体积约为传统抗体的1/10，具有与重链抗体相似的抗原结合能力，称为单域抗体(single domain antibody，sdAb)或纳米抗体(nanobody，Nbs)。与传统抗体不同的是，单域抗体仅由重链的可变结构域构成，并具有结合抗原的功能，因此，与传统单克隆抗体相比，单域抗体有以下优势：(1)分子量小，穿透性好；(2)有更好的溶解性和稳定性；(3)易大量生产，可以在细菌、酵母或植物中表达，所以成本很低；(4)不易聚集；(5)免疫原性低，更容易改造或人源化。

绿脓杆菌外毒素常用于构建免疫毒素，它容易在工程细菌中表达，便于改造。PE38是其去除自身配体结合结构域后的变体。

因此，需要研究如何采用单域抗体及免疫毒素融合技术，实现针对CD38的免疫毒素抗体，并研究由单域抗体制备免疫毒素的药效等。

发明内容

本发明提供了CD38单域抗体及其编码基因，CD38的免疫毒素及其制备方法、表达载体、在制备用于治疗多发性骨髓瘤药物与慢性淋巴样白血病药物中的应用，以及宿主细胞；所要解决的技术问题包括：如何采用单域抗体及免疫毒素融合技术，实现针对CD38的免疫毒素抗体。

本发明的技术方案如下：一种CD38单域抗体，其具有如序列表中的SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

其中的一个技术方案中，所述CD38单域抗体的框架区包括如序列表中的SEQ IDNo.5至SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。

其中的一个技术方案中，所述CD38单域抗体的互补决定区包括如序列表中的SEQID No.9至SEQ ID No.11所示的氨基酸序列。

本发明又一技术方案如下：一种CD38单域抗体的编码基因，其具有如序列表中的SEQ ID No.1所示的基因序列。

本发明又一技术方案如下：一种CD38的免疫毒素，其具有如序列表中的SEQ IDNo.4所示的氨基酸序列。

本发明又一技术方案如下：一种CD38的免疫毒素的编码基因，其具有如序列表中的SEQ ID No.3所示的基因序列。

本发明又一技术方案如下：一种CD38的免疫毒素的制备方法，其包括以下步骤：将具有如序列表中的SEQ ID No.1所示的CD38单域抗体基因序列、与绿脓杆菌外毒素突变体PE38的基因序列克隆到表达载体上，然后转化到表达宿主菌株里，将所述宿主菌株扩大培养诱导表达，纯化后得到所述免疫毒素。

例如，所述宿主菌株包括大肠杆菌。

例如，所述纯化包括亲和层析、阴离子交换层析和/或分子筛层析。

本发明又一技术方案如下：一种CD38的免疫毒素的表达载体，其包括具有如序列表中的SEQ ID No.4所示氨基酸序列的CD38免疫毒素。

本发明又一技术方案如下：一种CD38的免疫毒素的表达载体，其包括具有如序列表中的SEQ ID No.1所示的CD38单域抗体的基因序列、以及绿脓杆菌外毒素突变体PE38的基因序列。

本发明又一技术方案如下：一种宿主细胞，其具有所述表达载体。

本发明又一技术方案如下：上述免疫毒素在制备用于治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。

本发明又一技术方案如下：上述免疫毒素在制备用于治疗慢性淋巴样白血病药物中的应用。

上述方案中，本发明采用单域抗体及免疫毒素抗体技术，实现了针对CD38的免疫毒素抗体，具有制备工艺简单、成本低、高效靶向杀伤肿瘤细胞的优点，并且采用以CD38单域抗体为基础的免疫毒素，以利于多发性骨髓瘤及慢性淋巴样白血病等疾病的治疗。

上述方案中，本发明通过将CD38单域抗体与毒素PE38融合，构建融合蛋白免疫毒素，利用纳米抗体的靶向性，将免疫毒素定位于靶细胞，毒素部分内化后，进入细胞后引起细胞死亡，从而清除高表达CD38的肿瘤细胞，具有较高的市场价值。

附图说明

图1是CD38单域抗体的基因电泳图；

图2是绿脓杆菌外毒素突变体PE38的基因电泳图；

图3是pET28a-1053-PE38表达载体的模式图；

图4是免疫毒素1053-PE38在细菌中诱导性表达、镍柱亲和层析的SDS-PAGE分析图；

图5是阴离子交换层析图谱；

图6是图5中收集样品的SDS-PAGE分析图；

图7是分子筛层析图谱；

图8是图7中收集样品的SDS-PAGE分析图；

图9是CD38免疫毒素1053-PE38的质谱分析结果；

图10是CD38免疫毒素1053-PE38对不同细胞的细胞毒性实验结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。需要说明的是，本发明并不限于本文中所述的特定方法、方案、细胞系、构筑体和试剂，并且同样可改变。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。

本发明的一个实施例是，一种CD38单域抗体，其具有如序列表中的SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。其作为相关免疫毒素抗体部分。例如，一种CD38单域抗体，包括框架区(FR)和互补决定区(CDR)。

其中的一个实施例中，所述CD38单域抗体的框架区包括如序列表中的SEQ IDNo.5至SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。其中的一个实施例中，所述CD38单域抗体的互补决定区包括如序列表中的SEQ ID No.9至SEQ ID No.11所示的氨基酸序列。

例如，所述CD38单域抗体的框架区包括以下各项：FR1:MDVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCTGSG，FR2:MAWFRQAPGKEREFVA，FR3:YADFAKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYSC，及，FR4:WGQGTQVTVSSEPKTPKPQPA。

及，所述CD38单域抗体的互补决定区包括以下各项：CDR1:RTFRNYP，CDR2:GITWVGASTL，及，CDR3:AAGRGIVAGRIPAEYAD。

例如，所述CD38单域抗体的结构为FR1+CDR1+FR2+CDR2+FR3+CDR3+FR4。

本发明又一实施例如下：一种CD38单域抗体的编码基因，其具有如序列表中的SEQID No.1所示的基因序列。例如，其用于编码所述CD38单域抗体，例如，所述CD38单域抗体的编码基因具有如序列表中的SEQ ID No.1所示的基因序列，用于编码具有如序列表中的SEQID No.2所示的氨基酸序列的所述CD38单域抗体。

本发明又一实施例如下：一种CD38的免疫毒素，其具有如序列表中的SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。其中，所述免疫毒素包括CD38单域抗体部分和细菌外毒素突变体部分。例如，所述细菌为绿脓杆菌。例如，所述免疫毒素包括CD38单域抗体部分和绿脓杆菌外毒素突变体部分。例如，所述免疫毒素包括顺序设置的如序列表中的SEQ ID No.16所示的人工序列、如序列表中的SEQ ID No.17所示的羊驼序列、如序列表中的SEQ ID No.18所示的人工序列、以及如序列表中的SEQ ID No.19所示的绿脓杆菌序列。

本发明又一实施例如下：一种CD38的免疫毒素的编码基因，其具有如序列表中的SEQ ID No.3所示的基因序列。例如，其用于编码所述CD38的免疫毒素，或称为CD38重组免疫毒素蛋白，例如，所述CD38的免疫毒素的编码基因具有如序列表中的SEQ ID No.3所示的基因序列，用于编码具有如序列表中的SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的所述CD38的免疫毒素。例如，所述CD38的免疫毒素的编码基因包括顺序设置的如序列表中的SEQ ID No.12所示的人工序列、如序列表中的SEQ ID No.13所示的羊驼序列、如序列表中的SEQ IDNo.14所示的人工序列、以及如序列表中的SEQ ID No.15所示的绿脓杆菌序列。

本发明又一实施例如下：一种CD38的免疫毒素的表达载体，其包括具有如序列表中的SEQ ID No.4所示氨基酸序列的CD38免疫毒素。例如，一种CD38的免疫毒素的表达载体，其具有如序列表中的SEQ ID No.1所示的基因序列、以及绿脓杆菌外毒素突变体PE38的基因序列。其中具体实现所涉及的基因拼接和DNA重组可以采用常规方式。例如，一种表达载体，它包含CD38单域抗体基因序列和绿脓杆菌外毒素突变体的基因序列。又如，一种具有如序列表中的SEQ ID No.1所示的基因序列以及绿脓杆菌外毒素突变体PE38的基因序列的表达载体。表达载体使编码序列插入特定的位点，能够转录和翻译成蛋白质。

本发明又一实施例如下：一种宿主细胞，其具有所述表达载体。例如，一种大肠杆菌宿主细胞，其具有所述表达载体。其中，所述宿主细胞意指包含所述表达载体的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、F配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。其中，多核苷酸包括单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。

本发明又一实施例如下：一种CD38的免疫毒素的制备方法，其包括以下步骤：将具有如序列表中的SEQ ID No.1所示的CD38单域抗体基因序列、与绿脓杆菌外毒素突变体PE38的基因序列克隆到表达载体上，然后转化到表达宿主菌株里，将所述宿主菌株扩大培养诱导表达，纯化后得到所述免疫毒素。即，该制备方法先将具有如序列表中的SEQ IDNo.1所示的CD38单域抗体基因序列与绿脓杆菌外毒素突变体PE38的基因序列克隆到表达载体上，然后转化到表达宿主菌株里，将所述宿主菌株扩大培养诱导表达，纯化后得到所述免疫毒素。例如，从羊驼中筛选得到的CD38单域抗体1053基因序列，需要说明的是，将该CD38单域抗体编号为1053，还可以采用其它克隆实现。

例如，所述宿主菌株包括大肠杆菌。例如，所述宿主菌株为BL-21(DE3)或Origami2(DE3)。

例如，一种CD38的免疫毒素的制备方法，首先将筛选得到的CD38单域抗体1053基因序列和绿脓杆菌外毒素突变体PE38的基因序列克隆到表达载体pET28a(+)上，得到表达载体CD38免疫毒素1053-PE38，将此表达载体转化到E.coli.表达宿主菌株里，将此菌株扩大培养诱导表达，经亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析法等纯化方式，得到具有治疗多发性骨髓瘤等疾病的重组蛋白，即CD38的免疫毒素。

这样，本发明采用CD38的单域抗体与绿脓杆菌外毒素突变体PE38融合成的免疫毒素，可在E.coli系统中低成本、大规模生产，具有良好的细胞毒性，在多发性骨髓瘤等CD38高表达细胞相关疾病的治疗有很好的潜在应用价值。

例如，如图3所示，对于CD38的免疫毒素表达载体的构建，一个实施例如下。

首先，采用PCR扩增CD38单域抗体1053的基因序列，其中，

上游引物为：acaGAATTCATGGATGTGCAGCTGCAGGA

下游引物为：acaAAGCTTCGCTGGTTGTGGTTTTGG

该PCR扩增在57℃退火，30个循环，回收目的片段，其结果如图1所示，其中泳道1是DNA分子标准，泳道2是PCR扩增的CD38单域抗体1053的基因片段。

其次，使用限制性内切酶EcoR I和Hind III(购自Thermo Scientific)，酶切1ugpET28a(+)载体及100ng 1053基因序列，并用T4DNA连接酶(购自TAKARA公司)连接两个片段。

然后，采用PCR扩增绿脓杆菌外毒素突变体PE38的基因序列，其中，

上游引物：acaAAGCTTGCTAGCACCACGACGCCA

下游引物：aatGCGGCCGCTCACTTCAGGTCCTCGCGCGG

该PCR扩增在62℃退火，30个循环，回收目的片段，结果如图2所示，其中泳道1是DNA分子标准，泳道2是PCR扩增的PE38的基因片段。

然后，使用限制性内切酶Hind III和Not I(购自Thermo Scientific)酶切1ugpET28a-1053载体及100ng PE38基因序列，并用T4DNA连接酶(购自TAKARA公司)连接两个片段，即得CD38免疫毒素的表达载体pET28a-1053-PE38。例如，得到CD38免疫毒素的表达载体，即重组质粒pET28a-1053-PE38；又如，还进行测序鉴定。

其中，CD38免疫毒素在宿主菌中的表达，例如，CD38免疫毒素的表达载体1053-PE38在宿主菌大肠杆菌中的表达，说明如下。

首先，将测序鉴定正确的重组质粒pET28a-1053-PE38转化到表达宿主菌BL21(DE3)中，涂含有50ug/ml卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜；

其次，挑取单个菌落接种到5ml含有50ug/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；

然后，将5ml菌液接种到500ml Kana LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8；

然后，将含菌液的培养瓶放在冰水中降温，使菌液降到室温，加入0.5mM IPTG，18℃诱导表达，诱导时间约12h。

例如，所述纯化包括亲和层析、阴离子交换层析和/或分子筛层析。又如，所述纯化包括顺序执行的亲和层析、阴离子交换层析以及分子筛层析。例如，CD38免疫毒素1053-PE38的纯化，包括顺序执行的亲和层析、阴离子交换层析以及分子筛层析，说明如下。

其中，亲和层析纯化，包括以下步骤：将诱导好的菌液4℃5000rpm离心10min，弃上清，PBS重悬，4℃5000rpm离心10min，弃上清，Binding Buffer(20mM Tris，500mM NaCl，20mM Imidazole，pH 8.22)重悬菌体，按照20ml/g重悬；将重悬的菌体置于冰水中，超声破碎(宁波新芝生物科技股份有限公司超声破碎仪)，使用探头，40％功率超声约直至菌液透亮；然后，将破碎好的菌液4℃15000rpm离心1h(美国BECKMAN公司高效离心机)，取上清进行纯化；采用5倍柱体积Binding Buffer(20mM Tris，500mM NaCl，20mM Imidazole，pH8.22)平衡柱，破菌后上清上样，流出液重复上样3-5次；然后，5倍柱体积Binding Buffer平衡；3倍柱体积Washing Buffer(20mM Tris，500mM NaCl，40mM Imidazole，pH 8.22)洗涤；2倍柱体积Elute Solution(20mM Tris，500mM NaCl，200mM Imidazole，pH 8.22)洗脱。SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，如图4所示，其中泳道1是分子标准，泳道2是IPTG诱导前的细菌总蛋白，泳道3是IPTG诱导后超声破碎、高速离心后的上清可溶性蛋白，泳道4是IPTG诱导后包涵体蛋白，泳道5是上样后流出液蛋白，泳道6是上样后平衡洗出蛋白，泳道7是40mM咪唑溶液洗涤出的蛋白，泳道8是100mM咪唑溶液洗脱得到的目标蛋白。

然后，进行阴离子交换层析，包括以下步骤：将洗脱液置于10K透析袋中，4℃于透析液(20mM Tris，10mM NaCl，pH 8.22)中透析除盐，咪唑稀释10⁶倍左右；样品经过GEHiTrap Q柱，Buffer A(20mM Tris，10mM NaCl，pH 8.22)、Buffer B(20mM Tris，1M NaCl，pH 8.22)按比例混合，线性梯度盐浓度洗脱，收集目的蛋白峰。阴离子交换层析图谱如图5所示，收集样品的SDS-PAGE分析如图6所示，其中泳道1是阴离子交换层析前的样品，泳道2-15是阴离子交换层析收集管14-26接收样品。

然后，进行分子筛层析，包括以下步骤：将阴离子交换层析获得的蛋白液PBS透析；10K超滤管浓缩，4℃10000g离心10min；取上清过分子筛柱，PBS洗脱，将目的蛋白峰收集、浓缩，0.22μm滤膜过滤除菌，得到纯化的目的蛋白。分子筛层析图谱如图7所示，收集样品的SDS-PAGE分析如图8所示，其中泳道1是分子标准，泳道2是分子筛层析前的样品，泳道3-15是分子筛层析接收管1-13接收样品。

对CD38免疫毒素1053-PE38的质谱分析结果如图9所示。

其中一个实施例中，还对CD38的单域抗体免疫毒素进行一定的修饰或改造，例如人源化、PEG化(聚乙二醇修饰)或进行其他修饰，以提高免疫毒素的活性。

其中一个实施例中，还对CD38免疫毒素1053-PE38进行细胞毒性实验，包括以下步骤：铺细胞，96孔板，每孔10⁴细胞，每孔100ul，3孔重复；梯度浓度(0.1-10000ng/ml)CD38免疫毒素1053-PE38处理，37℃5％CO₂培养72h；加WST-1，每孔10ul，37℃5％CO₂孵育1h；然后采用450nm测吸光度，之后作数据处理，计算IC₅₀。CD38免疫毒素1053-PE38对不同细胞的细胞毒性实验结果如图10所示，整理列表如表1所示。

表1：CD38免疫毒素1053-PE38对不同细胞毒作用的IC50

由表1可见，CD38免疫毒素对正常细胞(Normal cells)的半致死浓度大于100nM，对CD38高表达细胞(CD38overexpressing cell)的半致死浓度小于200pM，对CD38高表达的多发性骨髓瘤细胞(MM cells，Multiple myeloma cells)的半致死浓度约为8至246pM，说明该CD38免疫毒素对正常细胞损伤较小，对多发性骨髓瘤细胞具有高效性和特异性。同样的，由于慢性淋巴样白血病同样具有CD38高表达细胞，因此，该CD38免疫毒素同样对慢性淋巴样白血病具有高效性和特异性。例如，经研究发现，跨膜糖蛋白CD38在相当多B细胞性慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)患者中的白血病细胞表面表达，有着高表达CD38的肿瘤细胞的患者更容易发生一些危险情况，死亡率也增加。研究人员发现CD38高水平表达与升高的β-2微球蛋白水平强烈相关(P＝0.00005)。β-2微球蛋白是与B-CLL患者生存时间减少相关的一个预后因素；其它与高表达CD38白血病细胞相关的不良情况还包括肝肿大、血红蛋白水平下降和淋巴结受累等。

本发明又一实施例如下：上述免疫毒素在制备用于治疗多发性骨髓瘤药物中的应用，即，本发明任一实施例所述免疫毒素治疗多发性骨髓瘤疾病的用途以及在制备用于治疗多发性骨髓瘤药物中的用途。需要说明的是，上述免疫毒素在制备用于治疗多发性骨髓瘤药物中的应用，包括可用于治疗、预防任何多发性骨髓瘤病症或其任何并发症或以其它方式降低其严重性的任何药物及其中间体；所述并发症包括本文中所述多发性骨髓瘤相关的任何病状、疾病或并发症。

本发明又一实施例如下：上述免疫毒素在制备用于治疗慢性淋巴样白血病药物中的应用，即，本发明任一实施例所述免疫毒素治疗慢性淋巴样白血病的用途以及在制备用于治疗慢性淋巴样白血病药物中的用途。需要说明的是，上述免疫毒素在制备用于治疗慢性淋巴样白血病药物中的应用，包括可用于治疗、预防任何慢性淋巴样白血病病症或其任何并发症或以其它方式降低其严重性的任何药物及其中间体；所述并发症包括本文中所述慢性淋巴样白血病相关的任何病状、疾病或并发症。

综上，本发明采用可溶性高的单域抗体融合细菌毒素，制得以CD38单域抗体为基础的免疫毒素，并在细菌中实现了大量的可溶性表达，然后通过色谱纯化得到大量较纯的重组蛋白，具有制备工艺简单、成本低的优点，对于CD38高表达的多发性骨髓瘤细胞的半致死浓度低至10pM，而对正常人外周血白细胞的半致死浓度大于100nM，说明本发明所描述的抗-CD38免疫毒素对于多发性骨髓瘤的细胞毒活性具有高效性和特异性，具有高效靶向杀伤肿瘤细胞的优点，通过将CD38单域抗体与毒素PE38融合，构建融合蛋白免疫毒素，利用纳米抗体的靶向性，将免疫毒素定位于靶细胞，毒素部分内化后，进入细胞后引起细胞死亡，从而清除高表达CD38的肿瘤细胞，具有较高的市场价值。

进一步地，本发明的实施例还包括，上述各实施例的各技术特征，相互组合形成的CD38单域抗体及其编码基因，具有该CD38单域抗体的CD38的免疫毒素及其制备方法，以及该免疫毒素的表达载体，该免疫毒素在制备用于治疗多发性骨髓瘤药物中的应用、与该免疫毒素在制备用于治疗慢性淋巴样白血病药物中的应用，以及具有该表达载体的宿主细胞。

需要说明的是，本发明的说明书及其附图中给出了本发明的较佳的实施例，但是，本发明可以通过许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例，这些实施例不作为对本发明内容的额外限制，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。并且，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；进一步地，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种CD38单域抗体，其特征在于，具有如序列表中的SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述CD38单域抗体，其特征在于，所述CD38单域抗体的框架区包括如序列表中的SEQ ID No.5至SEQ ID No.8所示的氨基酸序列；及，所述CD38单域抗体的互补决定区包括如序列表中的SEQ ID No.9至SEQ ID No.11所示的氨基酸序列。

3.一种CD38单域抗体的编码基因，其特征在于，具有如序列表中的SEQ ID No.1所示的基因序列。

4.一种CD38的免疫毒素，其特征在于，具有如序列表中的SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。

5.一种CD38的免疫毒素的编码基因，其特征在于，具有如序列表中的SEQ ID No.3所示的基因序列。

6.一种如权利要求4所述的CD38的免疫毒素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将具有如序列表中的SEQ ID No.1所示的CD38单域抗体的基因序列、与绿脓杆菌外毒素突变体PE38的基因序列克隆到表达载体上，然后转化到表达宿主菌株里，将所述宿主菌株扩大培养诱导表达，纯化后得到所述免疫毒素。

7.一种CD38的免疫毒素的表达载体，其特征在于，包括具有如序列表中的SEQ ID No.3所示的CD38免疫毒素的编码基因。

8.一种宿主细胞，其特征在于，具有如权利要求7所述表达载体。

9.如权利要求4所述免疫毒素在制备用于治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。

10.如权利要求4所述免疫毒素在制备用于治疗慢性淋巴样白血病药物中的应用。