CN112457401B - 一种诊断多发性骨髓瘤的分子影像探针 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人CD38特异性单域抗体及其编码基因，制备了一种诊断多发性骨髓瘤的分子影像探针，涉及核医学和分子影像领域，所述探针包括肿瘤靶向基团、螯合剂和放射性核素。本发明实现了对人CD38分子表达的无创可视化，进一步实现了多发性骨髓瘤和淋巴瘤的无创诊断，所述及探针具有制备工艺简单、成本低廉、特异性高、稳定性高、显像周期短、辐射剂量低，并且易于临床转化等优点。

Description

一种诊断多发性骨髓瘤的分子影像探针
技术领域
本发明涉及核医学和分子影像领域，尤其涉及一种诊断多发性骨髓瘤的分子影像探针。
背景技术
多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是一种B细胞来源的血液系统恶性肿瘤，目前临床尚无有效的诊疗措施。CD38是一个高表达于多发性骨髓瘤细胞表面的糖蛋白，是多发性骨髓瘤诊疗的良好靶点。靶向CD38的单克隆抗体达雷妥尤单抗注射液 (Daratumumab)已获批临床，用于新发或复发多发性骨髓瘤的治疗。诸多因素影响达雷妥尤单抗的治疗疗效，其中最主要的因素是多发性骨髓瘤细胞表面CD38蛋白的表达水平。此外，达雷妥尤单抗治疗后多发性骨髓瘤细胞表面CD38蛋白表达水平的动态变化也有助于评估达雷妥尤单抗的治疗疗效。
目前，评估多发性骨髓瘤细胞CD38蛋白表达水平的方式主要是穿刺骨髓液(或组织)的流式细胞学检测(Flow cytometry)或免疫组织化学染色(Immunohistochemicalstaining)，但是骨髓穿刺不仅创伤大、可重复性差，并且取样误差、肿瘤异质性等因素可进一步导致穿刺检查结果呈现假阴性或假阳性，进而影响临床诊疗决策。
免疫PET(Immuno-positron emission tomography，immunoPET)显像是一种的分子影像模式，有机地结合了PET显像的高灵敏度和抗体靶向肿瘤抗原的高特异性 (Wei etal.Chemical Reviews.2020；120(8):3787-3851.；Wei et al.Molecular CancerTherapeutics.2018；17(8):1625-1636.)。免疫PET显像可用于诊断恶性肿瘤、示踪T淋巴细胞及鉴别诊断炎性疾病等。免疫PET显像探针即为经放射性核素随机或定点标记的单克隆抗体、抗体片段或单域抗体。
经长半衰期放射性核素89Zr(Zirconium-89，T1/2＝78.4h)标记达雷妥尤单抗制备的免疫PET显像探针，即89Zr-DFO-daratumumab，已用于多发性骨髓瘤的临床诊断 (Ulaneret al.Radiology.2020；295(3):606-615.)，取得了较好的诊断效果。但单克隆抗体分子量较大(150KDa)，不能经肾小球滤过，因此在体内的循环、滞留时间较长，需要长半衰期的核素标记，如89Zr(T1/2＝78.4h)、64Cu(T1/2＝12.7h)等，但上述金属核素需经固体靶制备，制备常规昂贵。此外，基于放射性核素标记单克隆抗体的免疫PET显像需要3–5次显像才能达到理想的显像靶/本比，即靶组织(肿瘤组织)与本底(背景组织)的信号比。因此，单克隆抗体免疫PET显像显像周期长、辐射剂量大。值得注意的是，89Zr是一种亲骨性金属核素，游离的89Zr容易沉积在骨关节组织，进而干扰多发性骨髓瘤的诊断。
到目前为止，在临床上尚无可无创、精准诊断多发性骨髓瘤，无创评估多发性骨髓瘤浆细胞CD38表达水平的方法。在多发性骨髓瘤的临床诊疗领域，亟需可有效、无创检测CD38表达水平、评估CD38特异性靶向治疗或免疫治疗疗效的分子影像学方法。因此，本领域的技术人员致力于开发一种诊断多发性骨髓瘤的分子影像探针，更好地诊断多发性骨髓瘤并评估多发性骨髓瘤细胞CD38的动态表达水平。
发明内容
1993年，比利时科学家Hamers等人在《Nature》杂志中首次报道在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体(Hamers et al.Nature.1993；363(6428):446-8.)。这种特殊结构的抗体称即为重链抗体(Heavy-chain antibodies,HCAbs)。克隆重链抗体的可变区可以得到只有重链可变区的单域抗体，称为单域抗体(VHH， Variable domain of heavychain of heavy chain antibody)。VHH晶体宽为2.5nm，长4nm，分子量只有15KDa，因此也被称为纳米抗体(
Figure GDA0002909270810000021
Ablynx公司注册商品名)。单域抗体是目前已知的可结合目标抗原的最小抗体单位。单域抗体亲和力高、分子量小(～15kDa)、适合短半衰期核素(如68Ga和18F标记)、制备成本低廉、易于临床转化和推广应用，是构建抗体分子影像探针的首选靶向载体。
有鉴于单克隆抗体免疫PET显像探针制备成本高、辐射剂量大、显像周期长、图像质量欠佳、临床转化应用难度大等诸多缺点，本发明所要解决的技术问题是如何构建一种价格低廉、辐射剂量低、显像周期短且更易临床转化应用的68Ga(T1/2＝1.1h)标记CD38特异性单域抗体探针，并在多发性骨髓瘤和淋巴瘤模型中验证该探针的诊断效能。
为实现上述目的，本发明提供了一种人CD38特异性单域抗体MM01，所述抗体具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
进一步地，所述抗体还具有如SEQ ID No.2所示的基因序列。
本发明还提供了一种人CD38特异性单域抗体MM02，所述抗体具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
进一步地，所述抗体还具有如SEQ ID No.4所示的基因序列。
本发明还提供了一种人CD38特异性单域抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
将权利要求2或4中提供的所述基因序列克隆到表达载体上；
再将所述基因序列转化到表达宿主的菌株里，将所述表达宿主的所述菌株扩大培养、诱导表达，纯化得到所述CD38特异性单域抗体。
本发明还提供了一种诊断多发性骨髓瘤的分子影像探针，即CD38特异性单域抗体探针68Ga-NOTA-MM01，所述探针包括肿瘤靶向基团(VHH)、螯合剂 (Chelator)和放射性核素(Radionuclide)(如图1所示，即为单域抗体探针的一般结构通式)。
进一步地，所述肿瘤靶向基团为权利要求1～4中任意一项所述的CD38特异性单域抗体。
进一步地，所述螯合剂为大环配体或无环配体。
进一步地，所述大环配体包括：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷 -1,4,8,11-四乙酸(TETA)和1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三(亚甲基膦酸)(NOTP)。
进一步地，所述放射性核素包括诊断用放射性核素和治疗用放射性核素。
在本发明所提供的一种诊断多发性骨髓瘤的分子影像探针的较佳实施方式中，CD38特异性单域抗体探针的肿瘤靶向基团(VHH)通过大肠杆菌、酵母或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达。
在本发明所提供的一种诊断多发性骨髓瘤的分子影像探针的较佳实施方式中，CD38特异性单域抗体为MM01或其衍生物，例如不同分子量聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)定点修饰的MM01衍生物以及MM01的多价衍生物。
在本发明所提供的一种诊断多发性骨髓瘤的分子影像探针的较佳实施方式中，PEG定点修饰MM01是通过微生物谷氨酰胺转氨酶(Microbial transglutaminase，mTGase)介导的酶促反应实现。
在本发明所提供的一种诊断多发性骨髓瘤的分子影像探针的较佳实施方式中，大环配体螯合剂优先选择p-SCN-Bn-NOTA，p-SCN-Bn-DOTA， Maleimido-mono-amide-NOTA或NMEB，其结构式如图2所示。
在本发明所提供的一种诊断多发性骨髓瘤的分子影像探针的较佳实施方式中，螯合剂是无环配体，并优选无环配体(±)-H3RESCA-TFP，其结构式如图3所示，该无环配体对应的放射性核素为18F。
在本发明所提供的一种诊断多发性骨髓瘤的分子影像探针的较佳实施方式中，诊断用放射性核素优选：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、I-124、In-111、 Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188、Y-86、Mn-52、Sc-44。
治疗用放射性核素优选：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、 Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、 Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、 Ra-223、Ru-106、Na-24、Sr-89、Tb-149、Th-227、Xe-133、Yb-169、Yb-177。
本发明还提供了一种诊断多发性骨髓瘤的分子影像探针，可进一步主要用于，但不限于，诊断多发性骨髓瘤和淋巴瘤。
本发明还提供了一种降低肾脏68Ga-NOTA-MM01摄取的策略，通过小分子药物果糖和马来酸钠预处理，降低单域抗体探针68Ga-NOTA-MM01在肾脏的聚集，从而有效降低肾脏的辐射剂量。
本发明提供了一种CD38特异性单域抗体及其编码基因，并基于该单域抗体制备了CD38特异性免疫PET显像探针68Ga-NOTA-MM01，进一步在多发性骨髓瘤模型和淋巴瘤模型中验证了该探针的诊断效能，实现了CD38的无创可视化，同时实现了多发性骨髓瘤与淋巴瘤的无创诊断。
本发明公开了一种CD38特异性单域抗体(MM01和MM02)及其编码基因，制备了一种CD38特异性单域抗体免疫PET显像探针68Ga-NOTA-MM01，并报道了其在诊断多发性骨髓瘤(MM)和淋巴瘤中的应用。本发明通过创制CD38特异性单域抗体免疫PET显像探针68Ga-NOTA-MM01，实现了对CD38表达的无创可视化，进一步实现了多发性骨髓瘤和淋巴瘤的无创诊断，具有制备工艺简单、成本低廉、特异性高、稳定性高、显像周期短、辐射剂量低，易于临床转化等优点。本发明制备的探针68Ga-NOTA-MM01具有制备成本低廉，体内循环时间短、药代动力学佳、肿瘤靶向特异性高、显像周期短、辐射剂量低、易于推广临床转化应用的优点。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是单域抗体探针一般结构通式；
图2是部分大环配体螯合剂化学结构式；
图3是(±)-H3RESCA-TFP化学结构式；
图4是MM01小试表达SDS-PAGE检测；
图5是MM01小试表达蛋白质印迹检测；
图6是MM02小试表达SDS-PAGE检测；
图7是MM02小试表达蛋白质印迹检测；
图8是蛋白质印迹检测MM01单域抗体纯度；
图9是蛋白质印迹检测MM02单域抗体纯度；
图10是68Ga-NOTA-MM01放射化学纯度检测；
图11是流式细胞学筛选CD38表达阳性肿瘤细胞；
图12是68Ga-NOTA-MM01免疫PET显像诊断皮下型多发性骨髓瘤；
图13是68Ga-NOTA-MM01免疫PET显像诊断皮下型多发性骨髓瘤定量分析结果；
图14是68Ga-NOTA-MM01诊断皮下型骨髓瘤生物分布实验结果；
图15是68Ga-NOTA-MM01免疫PET显像诊断原位多发性骨髓瘤(上排)及达雷妥尤单抗(daratumumab)封闭后免疫PET显像实验(下排)；
图16是原位骨髓瘤组织苏木素-伊红染色及免疫组织化学染色实验结果；
图17是68Ga-NOTA-MM01免疫PET显像诊断淋巴瘤；
图18是68Ga-NOTA-MM01免疫PET显像诊断淋巴瘤定量分析结果；
图19是68Ga-NOTA-MM01免疫PET显像诊断淋巴瘤生物分布实验结果；
图20是淋巴瘤组织苏木素-伊红染色及免疫组织化学染色实验结果；
图21是小分子药物预处理降低肾脏68Ga-NOTA-MM01摄取。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于本文中所述的特定方法、方案、细胞系、构筑体和试剂，并且同样可改变。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。
目前，多发性骨髓瘤的诊断所做的检查项目包括：血液检查：血常规、肝肾功能(包括白蛋白、乳酸脱氢酶)、电解质(包括钙离子)、凝血功能、血清蛋白电泳(包括M蛋白含量)、免疫固定电泳(在轻链型加做IgD)、β2微球蛋白 (β2-MG)、C反应蛋白、外周血涂片(浆细胞百分数)、血清免疫球蛋白定量(包括轻链)；尿液检查：尿常规、蛋白电泳、尿免疫固定电泳、24h尿轻链；骨髓检查：骨髓细胞学涂片分类、骨髓活检+免疫组织化学染色(针对CD19、CD20、 CD38、CD56、CD138、κ轻链、λ轻链等标志物)；影像学检查，包括全身X线平片(包括头颅、骨盆、股骨、肱骨、胸椎、腰椎、颈椎)和计算机断层扫描(CT) 等。
其中：
1、骨髓穿刺创伤较大、可重复性较差，且对异质性多发性骨髓瘤的检出率较低；
2、现有的分子影像学检查手段，例如X线平片、CT和核磁共振(MRI)等，均是反应疾病的结构性变化，不能反应疾病的功能或分子层面的变化，因此对早期多发性骨髓瘤的检出率较低，且缺乏特异性；
3、目前，CD38是多发性骨髓瘤特异性标志物，目前国内外尚无CD38特异性分子影像检查手段或方法；
4、靶向CD38的单克隆抗体，例如达雷妥尤单抗，已在美国和中国获批用于多发性骨髓瘤的治疗，但目前国内外尚无特异性筛选适合达雷妥尤单抗治疗、评估达雷妥尤单抗或其他类似抗体治疗疗效的方法。
有鉴于单克隆抗体免疫PET显像探针制备成本高、辐射剂量大、显像周期长、图像质量欠佳等诸多缺点，本发明所要解决的技术问题是如何构建一种价格低廉、辐射剂量低、显像周期短且更易临床转化应用的68Ga(T1/2＝1.1h)标记CD38特异性单域抗体探针，并在多发性骨髓瘤和淋巴瘤模型中验证该探针的诊断效能。
本发明制备一种C端带有GGGGSGGGGSLLQS序列的新型CD38特异性单域抗体MM01，所述抗体MM01具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
上述氨基酸序列是单域抗体探针的靶向基团。
CD38特异性单域抗体MM01具有下所示的基因序列(SEQ ID No.2)。
本发明还提供了一种C端带有GGGGSCGSGSGSLLQS序列的新型CD38特异性单域抗体MM02，所述抗体具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
上述氨基酸序列作为单域抗体探针的靶向基团，同时作为PEG定点修饰的前体。
CD38特异性单域抗体MM02还具有下所示的基因序列(SEQ ID No.4)。
本发明还提供一种表达载体，运用常规分子生物学方法，将SEQ ID No.2、SEQ IDNo.4所示基因序列分别克隆到pET-30a(+)表达载体，如表1所示：
Figure GDA0002909270810000061
表1：基因序列分别克隆到pET-30a(+)表达载体
在大肠杆菌(E.coli)中表达上述目标单域抗体，说明如下：
大肠杆菌转化：首先将BL21(DE3)感受态细胞从-80℃取出，置于冰上解冻；加100ng质粒DNA至BL21(DE3)感受态细胞，轻柔混匀；将感受态细胞至于冰上孵育30分钟；静止状态下，在42℃热冲击处理感受态细胞90秒；至于感受态细胞冰上3分钟；加100μl常温LB培养基至感受态细胞；以200rpm、37℃的条件孵育60分钟；在含50μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上铺板；反转琼脂板，在37℃孵育过夜。
小试表达：从琼脂板随机挑选三个分散较好的单克隆，接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基分别进行培养；在200rpm、37℃的条件下孵育；当OD600测量值达到0.6–0.8时，在其中两个培养管中加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，使其浓度达到0.5mM，然后在15℃、16小时或37℃、4小时的孵育条件分别进行孵育，其中未加IPTG的培养管作为阴性对照；用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)测定蛋白表达水平和溶解度。
样品准备：吸取450μl培养液，离心收集细胞沉淀，加300μl裂解液(50mM Tris,150mM NaCl，5％glycerol，pH＝8.0)，用超声粉碎、裂解细胞1分钟；全细胞溶解产物：加50μl 5×上样缓冲液至100μl细胞裂解液，作为全细胞溶解产物，在100℃加热样品10分钟，然后15,000rpm离心样品5分钟；上清液及细胞裂解碎片：将剩余200μl细胞裂解液在15,000rpm离心10分钟，分别收集上清液和细胞碎片沉淀；加90μl 5×上样缓冲液至180μl上清液，作为细胞裂解上清液；用150μl 5×上样缓冲液重悬细胞沉淀，作为细胞裂解碎片；将上述样品在100℃加热10分钟，并在15,000rpm离心5分钟后加杨检测。
SDS-PAGE和蛋白印迹测定MM01表达情况如图4、图5所示。
在图4中，其中SDS-PAGE(左侧)泳道1为蛋白标签、泳道2为1μg牛血清蛋白(BSA)标准品、泳道3为2μg BSA标准品、泳道4为未经IPTG诱导的细胞裂解液、泳道5为在15℃诱导16小时后的细胞裂解液、泳道6位在37℃诱导4小时后的细胞裂解液、泳道7为未经IPTG诱导的细胞裂解上清液、泳道8为在15℃诱导16小时后的细胞裂解上清液、泳道9为在37℃诱导4小时后的细胞裂解上清液、泳道10为未经IPTG诱导的细胞沉淀、泳道11为在15℃诱导16小时后的细胞裂解碎片沉淀、泳道12为在37℃诱导4小时后的细胞裂解碎片沉淀。
在图5中，蛋白印迹泳道1为未经IPTG诱导的细胞裂解液、泳道2为在15℃诱导16小时后的细胞裂解液、泳道3为在37℃诱导4小时后的细胞裂解液、泳道 4为15℃诱导16小时后的细胞上清液、泳道5为37℃诱导4小时后的细胞裂解上清液、泳道6为15℃诱导16小时后的细胞裂解碎片沉淀、泳道7为37℃诱导4 小时后的细胞裂解碎片沉淀、泳道8为蛋白印迹标签。蛋白质印迹所使用一抗为 anti-His antibody(GenScript,Cat.No.A00186)。
SDS-PAGE和蛋白印迹测定如图6、图7所示。
在图6中，其中SDS-PAGE(左侧)泳道1为1μg牛血清蛋白(BSA)标准品、泳道2为2μgBSA标准品、泳道3为蛋白标签、泳道4为未经IPTG诱导的细胞裂解液、泳道5为在15℃诱导16小时后的细胞裂解液、泳道6位在37℃诱导4小时后的细胞裂解液、泳道7为未经IPTG诱导的细胞裂解上清液、泳道8为在15℃诱导16小时后的细胞裂解上清液、泳道9为在37℃诱导4小时后的细胞裂解上清液、泳道10为未经IPTG诱导的细胞裂解碎片沉淀、泳道11为在15℃诱导16小时后的细胞裂解碎片沉淀、泳道12为在37℃诱导4小时后的细胞裂解碎片沉淀。
在图7中，蛋白印迹泳道1为蛋白印迹标签、泳道2为未经IPTG诱导的细胞裂解液、泳道3为在15℃诱导16小时后的细胞裂解液、泳道4为在37℃诱导4 小时后的细胞裂解液、泳道5为15℃诱导16小时后的细胞上清液、泳道6为37℃诱导4小时后的细胞裂解上清液、泳道7为15℃诱导16小时后的细胞裂解碎片沉淀、泳道8为37℃诱导4小时后的细胞裂解碎片沉淀。蛋白质印迹所使用一抗为 anti-His antibody(GenScript,Cat.No.A00186)。
MM01和MM02在不同条件的小试表达效率总结如表2所示：
名称 菌株 质粒 最佳表达条件 表达量(mg/L) 可溶表达(％)
MM01 BL21(DE3) pET-30a(+) 16h at 15℃ 10 20
MM02 BL21(DE3) pET-30a(+) 16h at 15℃ 15 30
表2：不同诱导条件下CD38特异性单域抗体表达产量
本发明更进一步地实施了放大表达，具体实施方式如下：将贮存于甘油的重组BL21(DE3)接种于含相应抗生素的TB培养基，在37℃培养，当OD600达到 1.2左右时，用IPTG在15℃诱导单域抗体表达，诱导时长为16小时，通过离心收集细胞；用裂解液重悬细胞沉淀，并超声裂解；离心后吸取上清液；经镍柱(Nickel column)一步纯化获得目标单域抗体；单域抗体经0.22μm滤膜过滤除菌后贮存于缓冲溶液；以BSA作为标准品，用Bradford法测定蛋白浓度，最后用SDS-PAGE 测定表达单域抗体纯度；并用蛋白质印迹进一步确认。如图8、图9所示，经方法表达所制备MM01和MM02纯度均>90％。
本发明又一实施例如下：一种CD38特异性单域抗体探针68Ga-NOTA-MM01，其中MM01具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，NOTA为大环配体螯合剂 p-SCN-Bn-NOTA，68Ga(T1/2＝1.1h)为一种用于正电子发射计算机断层显像(PET) 的放射性核素。
本发明又一实施例如下：CD38特异性单域抗体探针68Ga-NOTA-MM01制备。制备过程主要包含以下主要步骤：NOTA修饰MM01制备中间体NOTA-MM01、68Ga标记NOTA-MM01制备68Ga-NOTA-MM01、68Ga-NOTA-MM01质量控制、68Ga-NOTA-MM01诊断效能评估。
本发明又一实施例如下：NOTA修饰MM01制备中间体NOTA-MM01。具体步骤如下：将1mg CD38特异性单域抗体MM01溶于磷酸盐缓冲液(PBS)，加等体积0.1M碳酸钠(Na2CO3)缓冲液将单域抗体溶液pH调至9.0–10，反应体系体积1–2mL。以摩尔比p-SCN-Bn-NOTA/MM01＝10:1的比例，将新鲜溶于二甲基亚砜(DMSO)的p-SCN-Bn-NOTA(CAS Number：147597-66-8；Macrocyclics) 加至上述单域抗体溶液。将反应体系置于室温反应2小时，然后以PBS作为流动相，用预平衡的PD-10脱盐柱(GE Healthcare)纯化经NOTA修饰的单域抗体，收集NOTA-MM01；再用截断值为10KDa的超滤管(Merck Millipore)浓缩，用 NanoDrop测定NOTA-MM01浓度，分装备用；分装冻存时可在抗体溶液中加等体积的甘油(单域抗体体积/甘油体积＝1:1；冰点为-26℃)，然后将分装好的抗体溶液置于-20℃冰箱保存，应避免反复冻融；甘油作为冷冻保护剂，当体积浓度为 50％时在-20℃仍为液体状态；另外，甘油可以被细菌污染，使用解冻单域抗体前先用亲水性聚醚砜(PES)或聚偏氟乙烯(PVDF)膜对单域抗体溶液进行除菌过滤。
本发明又一实施例如下：68Ga标记NOTA-MM01制备68Ga-NOTA-MM01。具体步骤如下：用2.5mL 0.1M盐酸溶液(HCl，pH＝1)淋洗锗镓发生器(Eckert& Ziegler RadiopharmaInc)，收集同等体积活度约370–555MBq的68Ga淋洗液；取活度最高的中间段68Ga淋洗液1mL，加1mL 1M乙酸钠溶液(NaAc，pH＝5) 调节68Ga淋洗液pH至4.0–4.5；取经偶连备用的NOTA-MM01 100–200μg加至68Ga 淋洗液，反应体系体积<2.5mL；将反应体系置于恒温振荡器在室温反应5–10分钟；标记反应结束后以PBS作为流动相，再次用预平衡的PD-10脱盐柱分离游离68Ga、纯化终产物；按照上述步骤所得未衰减校正放射化学产率(Radiochemical yield，RCY)>50％。
本发明又一实施例如下：68Ga-NOTA-MM01质量控制。吸取2μL 68Ga-NOTA-MM01在硅胶板上点样，用0.1M柠檬酸钠溶液(pH＝5)作为流动相，用放射性薄层色谱仪(Radio-TLC，Eckert&Ziegler Radiopharma Inc)测定探针的放射化学纯度(Radiochemical purity，RCP)；再用高效液相色谱(HPLC，Agilent) 进一步测定所制备单域抗体探针的完整度和RCP。如图10所示，新鲜制备68Ga-NOTA-MM01 RCP大于99％，在PBS溶液中放置3小时后RCP仍然大于99％，说明68Ga-NOTA-MM01具有较高的体外稳定性。
本发明又一实施例如下：建立CD38表达阳性荷瘤小鼠模型。包括以下步骤：以FITC偶连抗人CD38单克隆抗体(Catalog#：11-0388-42；eBioscienceTM)作为一抗，通过流式细胞学实验发现肺癌细胞系A549、多发性骨髓瘤细胞系MM.1S 和淋巴瘤细胞系Daudi CD38表达阳性，如图11所示；将2×106MM.1S细胞悬浮于PBS和基质胶(Corning)，二者比例为1:1，注射于4–5周龄NCG小鼠 (NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju mice，GemPharmatech)右侧腹部建立皮下型多发性骨髓瘤模型，将0.5×106重悬于100μL PBS的MM.1S细胞注射经尾静脉注射于NCG小鼠建立广泛转移(原位)多发性骨髓瘤模型。
本发明又一实施例如下：68Ga-NOTA-MM01免疫PET显像诊断皮下型骨髓瘤。包括以下步骤：本研究所涉及的小动物PET/CT显像采集均使用IRIS小动物PET/CT扫描仪(Inviscan Imaging Systems)完成，每只荷瘤NCG小鼠经尾静脉注射3.7–7.4MBq 68Ga-NOTA-MM01(每组3–6只)，在注射后的特定时间点(30 分钟、1小时及2小时)，用混有氧气的异氟烷(浓度为2％)麻醉荷瘤裸鼠，并将进入深度麻醉状态的裸鼠以仰卧位姿势置于PET/CT扫描床上，续惯采集PET 和CT图像，用IRIS系统自带软件完成图像重建，如图12所示，68Ga-NOTA-MM01 免疫PET显像可精准诊断皮下型多发性骨髓瘤，即MM.1S肿瘤；用OsiriXLite图像处理工作站(Pixmeo SARL)在重建后的PET图像上勾画肿瘤、心脏、及主要组织脏器(肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、肌肉)等感兴趣区，以％ID/g(percent of injected doseper gram)为单位计算肿瘤组织及重要组织器官的放射性摄取值，如图13所示，CD38特异性单域抗体探针68Ga-NOTA-MM01在肿瘤组织有较高的摄取，在主要排泄(肾脏)和代谢(肝脏)组织也要较高的非特异性摄取；显像结束后，取肿瘤组织及主要的组织器官做体外生物分布实验，如图14所示，CD38 特异性单域抗体探针68Ga-NOTA-MM01同样有较高的摄取。
本发明又一实施例如下：68Ga-NOTA-MM01免疫PET显像诊断多发性骨髓瘤。如图15所示，在多发性骨髓瘤模型，即原位多发性骨髓瘤模型中，68Ga-NOTA-MM01免疫PET显像可精确显示骨髓瘤病灶累及的骨组织，包括双侧肱骨、双侧肩胛骨、胸骨、椎体、双侧髂骨及双侧股骨等。更进一步，每只荷瘤小鼠提前24小时注射1mg达雷妥尤单抗可有效降低多发性骨髓瘤累及骨骼组织显像剂摄取。达雷妥尤单抗封闭后双侧肱骨、双侧肩胛骨、胸骨、椎体、双侧髂骨及双侧股骨等部位68Ga-NOTA-MM01摄取显著降低，说明68Ga-NOTA-MM01 探针对人CD38具有高度特异性、且68Ga-NOTA-MM01探针和达雷妥尤单抗具有相同的抗原结合位点。更进一步，如图16所示，免疫组织化学染色表明多发性骨髓瘤所累及骨骼骨髓腔内有大量CD138、CD38表达阳性肿瘤细胞，即MM.1S细胞；更进一步，以辣根过氧化物酶偶连的兔抗人IgG H&L(HRP-labeled rabbit anti-human IgG H&L；ab6759；Abcam)作为二抗开展免疫组织化学染色,达雷妥尤单抗封闭后骨髓腔内有明显的达雷妥尤单抗染色，说明达雷妥尤单抗有效结合了 MM.1S细胞，从而封闭了68Ga-NOTA-MM01探针与MM.1S细胞的结合。上述结果表明68Ga-NOTA-MM01探针可无创可视化CD38表达，进一步可用于早期诊断多发性骨髓瘤，并在达雷妥尤单抗或其他类似抗体治疗后评估CD38的动态变化。
本发明又一实施例如下：68Ga-NOTA-MM01免疫PET显像诊断淋巴瘤。图17 表明68Ga-NOTA-MM01免疫PET显像能有效诊断皮下型淋巴瘤，即Daudi肿瘤；图18定量分析结果表明68Ga-NOTA-MM01探针在肿瘤有较高的摄取，同时在肾脏、肝脏等探针排泄或代谢组织器官也有较高的摄取；图19生物分布实验结果进一步揭示了探针8Ga-NOTA-MM01在体内主要组织器官的分布情况；如图20免疫组织化学染色结果所示，Daudi淋巴瘤也显著高表达CD138和CD38。上述结果表明68Ga-NOTA-MM01探针可无创可视化CD38表达，进一步可用于早期诊断淋巴瘤，并在达雷妥尤单抗或其他类似抗体治疗后评估CD38的动态变化。
本发明又一实施例如下：果糖(Fructose)和马来酸钠(Sodium maleate)可显著降低68Ga-NOTA-MM01探针在肾脏组织的摄取。如图21生物分布实验所示，提前五分钟腹腔注射果糖(10,800mg/kg)或尾静脉注射马来酸钠(480mg/kg)可有效降低68Ga-NOTA-MM01探针在肾脏组织的摄取，而甘露醇(Mannitol，480 mg/kg)无此作用。
本发明又一实施例如下：mTGase酶促反应介导单域抗体定点PEG修饰，具体实施路线如下：将3mg C端带有LLQS标签的MM01、1mg PEG-NH2(5KDa) 或2mg PEG-NH2(10KDa)及1mgmTGase溶解于1mL PBS溶液，将反应体系置于恒温振荡器在室温反应1小时；用截断值为10KDa的超滤管(Merck Millipore) 浓缩样本体积至300μL；用配有SuperdexTM 75Increase柱子的
Figure GDA0002909270810000111
pure蛋白纯化仪(Cytiva,formerly GE Healthcare Life Science)纯化、收集经不同分子量PEG 定点修饰的MM01衍生物。
需要说明的是，本发明的说明书及其附图中给出了本发明的较佳实施例，但是，本发明可以通过许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例，这些实施例不作为对本发明内容的额外限制，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。并且，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；进一步地，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属仁济医院
<120> 一种诊断多发性骨髓瘤的分子影像探针
<130> 2020
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 145
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
Met His His His His His His Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser
20 25 30
Gly Arg Thr Phe Arg Asn Tyr Pro Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro
35 40 45
Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Thr Trp Val Gly Ala Ser
50 55 60
Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
65 70 75 80
Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
85 90 95
Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys Ala Ala Gly Arg Gly Ile Val Ala Gly
100 105 110
Arg Ile Pro Ala Glu Tyr Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Leu Gln
130 135 140
Ser
145
<210> 2
<211> 450
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
catatgcacc atcatcatca tcacgacgtc caactgcaag aatcgggcgg cggtctggtc 60
caagcgggcg gttccctgcg tctgtcatgc accggcagcg gtcgtacgtt tcgcaactat 120
ccgatggcat ggttccgtca ggctccgggc aaagaacgcg aatttgtggc gggcattacc 180
tgggttggtg ccagtacgct gtacgcagat tttgctaaag gtcgtttcac catctcccgc 240
gacaacgcga aaaatacggt ttatctgcag atgaatagcc tgaaaccgga agataccgca 300
gtctactctt gtgccgcggg tcgtggtatt gttgccggtc gtatcccggc cgaatatgca 360
gactggggcc aaggtacgca ggtgacggtt tcttctggtg gtggcggctc tggtggtggc 420
ggttctctgc tgcaaagtta atgaaagctt 450
<210> 3
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
Met His His His His His His Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser
20 25 30
Gly Arg Thr Phe Arg Asn Tyr Pro Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro
35 40 45
Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Thr Trp Val Gly Ala Ser
50 55 60
Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
65 70 75 80
Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
85 90 95
Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys Ala Ala Gly Arg Gly Ile Val Ala Gly
100 105 110
Arg Ile Pro Ala Glu Tyr Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Leu
130 135 140
Leu Gln Ser
145
<210> 4
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
catatgcatc atcatcatca tcacgacgtc caactgcaag aatctggcgg cggtctggtt 60
caagcgggcg gtagcctgcg tctgtcatgt accggcagcg gtcgtacgtt tcgcaactat 120
ccgatggcat ggttccgtca ggctccgggc aaagaacgcg aatttgtggc gggcattacc 180
tgggttggtg ccagtacgct gtacgcagat tttgctaaag gtcgtttcac catctcccgc 240
gacaacgcga aaaatacggt ttatctgcaa atgaatagcc tgaaaccgga agataccgca 300
gtctactctt gtgccgcggg tcgtggtatt gttgccggtc gtattccggc cgaatatgca 360
gactggggtc agggtacgca agtcacggtc tcttcaggcg gtggcggttc gtgtggctcg 420
ggctcgggct ctctgctgca atcgtaatga aagctt 456
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Cys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Leu Leu Gln Ser
1 5 10 15

Claims (1)

1.一种诊断多发性骨髓瘤的分子影像探针，其特征在于，所述探针包括肿瘤靶向基团、螯合剂和放射性核素，所述肿瘤靶向基团为一种CD38特异性单域抗体，所述螯合剂为大环配体或无环配体，所述大环配体包括1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)和1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三(亚甲基膦酸) (NOTP)中的一种，所述放射性核素为Ga-68，所述螯合剂为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)，所述单域抗体具有如下氨基酸序列之一：
Met His His His His His His Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly LeuVal Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Arg Thr Phe ArgAsn Tyr Pro Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val AlaGly Ile Thr Trp Val Gly Ala Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ala Lys Gly Arg PheThr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu LysPro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys Ala Ala Gly Arg Gly Ile Val Ala Gly ArgIle Pro Ala Glu Tyr Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser GlyGly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Leu Gln Ser，
或者Met His His His His His His Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly GlyLeu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Arg Thr PheArg Asn Tyr Pro Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe ValAla Gly Ile Thr Trp Val Gly Ala Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ala Lys Gly ArgPhe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser LeuLys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys Ala Ala Gly Arg Gly Ile Val Ala GlyArg Ile Pro Ala Glu Tyr Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser SerGly Gly Gly Gly Ser Cys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Leu Leu Gln Ser。
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