JP6605331B2 - 抗体−薬物複合体治療での使用のための免疫造影剤 - Google Patents
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Description
本発明は、コンパニオン診断用抗体様結合タンパク質及び使用方法に関する。
患者集団における治療上の使用のための薬物の開発において多数の挑戦がある。多くの初期薬剤は、いくつもの理由(例えば、臨床的有用性の欠如又は患者集団において証明された安全性の欠如)のために市場には達しない。効果的でかつ安全な薬物の開発のためのいくつかの臨床上の問題は:(1)薬物が患者集団においてその意図された分子標的と相互作用することを確立すること;(2)特定の標的が同じ患者集団において特定の疾患の処置に関連することを確立すること;及び(3)同じ患者集団において標的に対する薬物の効果に基づいて生物学的最適用量を同定することである。特定の薬物に適切なコンパニオン診断薬(companion diagnostic)の開発は、臨床患者集団における使用のための薬物の開発にかなり役立つ。
ヒト化モノクローナル抗体DS6に基づくコンパニオン診断用抗体様結合タンパク質は、ポジトロン放出断層撮影(PET)生体イメージングのような画像化技術による、腫瘍関連MUC1−シアログリコトープ(sialoglycotope)CA6のインビボ検出及び定量のための診断ツールとしての使用のために開発された。抗体様結合タンパク質は、患者の層別化及び細胞傷害性マイタンシノイドDM4に結合された腫瘍関連MUC1−シアログリコトープCA6に対するヒト化モノクローナル抗体からなるヒト化DS6抗体−薬物免疫複合体huDS6−DM4の治療有効性の早期評価を容易にする。
VL1−L1−VL2−CL [I]
VH1−L2−VH2−CH1 [II]
式中:
VL1はDS6ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2はDS6ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1はDS6ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2はDS6ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、ヒトIGKC免疫グロブリン軽鎖定常ドメインのような免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、ヒト免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインのような免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
L1及びL2はアミノ酸リンカーであり、そして
ここでVL1及びVL2のポリペプチドは、同じか又は異なるDS6ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、そしてVH1及びVH2のポリペプチドは同じか又は異なるDS6ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;そしてここで式Iのポリペプチド及び式IIのポリペプチドは、二価単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成する。CL及びCH1ドメインは、例えばジスルフィド結合により接続され得る。さらに、式I及び式IIのポリペプチドは任意のタグ(例えば、ポリヒスチジン又は6x−Hisタグ)を含み得る。
VL1−L1−VL2−CL [I]
VH1−L2−VH2−CH1 [II]
[式中:
VL1はDS6ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2はDS6ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1はDS6ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2はDS6ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、ヒトIGKC免疫グロブリン軽鎖定常ドメインのような免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、ヒト免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインのような免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
L1及びL2はアミノ酸リンカーである]
により表される構造を有する2つのポリペプチドを含み;
ここで式Iのポリペプチド及び式IIのポリペプチドは、二価単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成し;そして
ここで抗体様タンパク質はキレート剤をさらに含む。
(a) 以下の式[I]及び[II]:
VL1−L1−VL2−CL [I]
VH1−L2−VH2−CH1 [II]
[式中:
VL1はDS6ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2はDS6ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1はDS6ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2はDS6ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、ヒトIGKC免疫グロブリン軽鎖定常ドメインのような免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、ヒト免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインのような免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
L1及びL2はアミノ酸リンカーである]
により表される構造を有するポリペプチド[ここで、式Iのポリペプチド及び式IIのポリペプチドは、二価単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成する]をコードする1つ又はそれ以上の核酸分子を細胞において発現させること;並びに
(b) 抗体様結合タンパク質をキレート剤に結合させること
を含む。
VL1−L1−VL2−CL [I]
VH1−L2−VH2−CH1 [II]
[式中:
VL1はDS6ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2はDS6ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1はDS6ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2はDS6ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、ヒトIGKC免疫グロブリン軽鎖定常ドメインのような免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、ヒト免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインのような免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
L1及びL2はアミノ酸リンカーである]
により表される構造を有する2つのポリペプチドを含み、
ここで式Iのポリペプチド及び式IIのポリペプチドは、二価単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合分子を形成する。
VL1−L1−VL2−CL [I]
VH1−L2−VH2−CH1 [II]
[式中:
VL1はDS6ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2はDS6ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1はDS6ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2はDS6ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、ヒトIGKC免疫グロブリン軽鎖定常ドメインのような免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、ヒト免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインのような免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
L1及びL2はアミノ酸リンカーである]
により表される構造を有するポリペプチドをコードする1つ又はそれ以上の核酸分子を細胞において発現させることを含み、そして
ここで式Iのポリペプチド及び式IIのポリペプチドは、二価単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成する。
本明細書に開示される発明は、PET生体イメージングによるヒトCA6腫瘍抗原のインビボ検出及び定量のための診断ツールとして使用するための、ヒト化モノクローナル抗体DS6に基づくコンパニオン(companion)診断用抗体様結合タンパク質に関する。コンパニオン診断用抗体様結合タンパク質は、患者の層別化、及び細胞傷害性マイタンシノイドDM4に結合された腫瘍関連MUC1−シアログリコトープ(sialoglycotope)のCA6に対するヒト化モノクローナル抗体からなるDS6抗体−薬物免疫複合体huDS6−DM4の治療有効性の早期評価を容易にする。抗体−薬物免疫複合体huDS6−DM4は、例えば国際公開第WO 2005/009369号(参照により本明細書に加入される)に記載される。DS6抗体及びCA6腫瘍抗原は、例えばKearse et al.(Int J Cancer. 2000 Dec 15;88(6):866−72)(参照により本明細書に加入される)に記載される。
本開示に従って利用される以下の用語は、別の指示がなければ、以下の意味を有すると理解されるものとする。状況により他のものが必要とされなければ、単数形の用語は複数形を含むものとし、かつ複数形の用語は単数形を含むものとする。
VL1−L1−VL2−CL [I]
VH1−L2−VH2−CH1 [II]
[式中:
VL1は免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
L1及びL2はアミノ酸リンカーであり;そして
ここで式Iのポリペプチド及び式IIのポリペプチドは、Fabフラグメント(二価単一特異性タンデム免疫グロブリンフラグメント)を形成する]
に従って、直列に配置されかつ短いアミノ酸リンカー配列により隔てられた、抗体からのそれぞれのVL及びVHDNA配列を含む。
(1)疎水性:Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Tyr、Pro;
(2)極性親水性:Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Lys、Ser、Thr;
(3)脂肪族:Ala、Gly、Ile、Leu、Val、Pro;
(4)脂肪族疎水性:Ala、Ile、 Leu、Val、Pro;
(5)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(6)酸性:Asp、Glu;
(7)塩基性:His、Lys、Arg;
(8)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(9)芳香族:His、Trp、Tyr、Phe;及び
(10)芳香族疎水性:Phe、Trp、Tyr。
本発明の抗体又は操作された抗体様結合タンパク質は、1つ又はそれ以上の標的抗原の検出及び定量のための競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイのようないずれかの公知のアッセイ方法において使用され得る。抗体又は操作された抗体様結合タンパク質は、使用されるアッセイ方法に適した親和性で1つ又はそれ以上の標的抗原に結合する。
操作された抗体様結合タンパク質を含む組成物は、本発明の範囲内である。このような診断用、治療用又は医薬組成物は、診断又は治療有効量の抗体様結合タンパク質、又は抗体様結合タンパク質−薬物複合体を、投与形式との適合性について選択された薬学的又は生理学的に許容しうる製剤化剤と混合して含み得る。
臨床上有用な分子造影剤は、投与後に妥当な量の時間内に高コントラスト画像を生じ、腫瘍浸透を示し、より速いクリアランス動態を有し、そして優れた腫瘍対血液比を示す。生体イメージングにおいてインタクトな天然抗体を使用することの警告(caveat)は、腫瘍取り込み及び血液クリアランスの本質的に遅い動態であり;これらは高いバックグラウンドを有し、腫瘍の鮮明な画像を得るために長時間(数時間から数日)を要する傾向もある。
対応する構築物の重鎖及び軽鎖をコードする発現プラスミドを、E.coli DH5α細胞において増殖させた。トランスフェクションに使用したプラスミドを、Qiagen EndoFree Plasmid Mega Kit(B−Fab抗体様結合タンパク質についてのポリペプチド配列及びDNA配列は表2にある)を使用してE.coliから製造した。
huDS6−DM4についてのイメージングベースのコンパニオン診断用抗体様結合タンパク質を開発するために、ヒト化DS6モノクローナル抗体からのCA6結合配列に基づく3つの操作された抗体様結合タンパク質(B−Fab、図1を参照のこと)を生成した。3つの操作された抗体様結合タンパク質を以下に記載されるようにそれぞれ精製し、そして試験した;結果を表3に示す。ポリ−ヒスチジン(6x−His)タグの存在がPETトレーサーに影響を及ぼすかどうかを決定するための所望の特徴としては、HPLC又はSDS−PAGEにより純度>95%、約10mg/mL濃度、安定なペプチド、DS6抗体と類似した結合が挙げられる。さらなる選択基準としては:>5%ID/gの腫瘍シグナル;3:1の腫瘍対筋肉比;効率的な腎クリアランス;及びブロックされていない取り込みとブロックされた取り込みとの間の統計学的に有意な差異(p<0.05)が挙げられる(放射標識キレート化B−Fabについての品質基準の要約については表4を参照のこと)。
分析用SECを、TSKgel G3000SWXLカラム(7.8mmx30cm)及びTSKgel SWXLガードカラム(Tosoh Bioscience)を備えたAEKTA explorer 10(GE Healthcare)を使用して行った。分析を、250mM NaCl、100mM リン酸Na pH6.7を使用して280nmで検出しながら1mL/分で行った。タンパク質サンプル30マイクロリットル(0.5〜1mg/mL)をカラム上にアプライした。分子サイズの推定のために、カラムをゲルろ過標準混合物(MWGF−1000、SIGMA Aldrich)を使用して較正した。データ評価をUNICORNソフトウェアv5.11を使用して行った。
各サンプルを0.01mg/mLの濃度に希釈し、次いでDTT(最終10mM)を加えることにより還元した。分離前に、サンプルを20分間捕捉し、そして20μL/分で一体型トラップカラムで2%アセトニトリル/0.1%TFA(体積/体積)を用いて脱塩し、その後15%溶離液A(H2O/0.05%TFA)〜50%溶離液B(アセトニトリル/0.05%TFA)のグラジエントを用いて溶出した。
目的のレーンを穿孔し、カルバミドメチル化し、そしてエンドプロテイナーゼトリプシンで消化した。その後、サンプルをOrbiTrap XL質量分析計を使用してLC−MS/MSにより分析した。得られたスペクトルを、所定の構築物が加えられたユーザー定義データベースSwiss−Prot PPと、さらにはデータベースSwiss−Prot全種と比較した。
a) B−Fab (G4S)2リンカー及びC末端6x−Hisタグ
B−Fab 1151は、GGGGSGGGGS ((G4S)2) (配列番号3)としてL1及びL2リンカーの両方を含有し、かつ発現されたC末端6x−Hisタグを含有するDS6ベースの操作された抗体様結合タンパク質である。タンパク質をIMAC及びSECにより精製し、そしてインビトロ結合溶液を1.8mg/mlでPBS中で調製し、そして結合親和性をWISH CA6+細胞株においてフローサイトメトリーを使用して特徴づけした(図2C及び図2D)。
B−Fab 1153は、(G4S)2としてL1及びL2リンカーの両方を含有し、かつC末端6x−Hisタグを含有しないDS6ベースの操作された抗体様結合タンパク質である。このタンパク質はHisタグを欠いているので、このタンパク質はIMAC、Kappa−select及びSECにより精製した。インビトロ結合溶液を、1.6mg/mlでPBS中で調製し、そして結合親和性をWISH CA6+細胞株においてフローサイトメトリーを使用して特徴づけした(図3C及び図3D)。
B−Fab 1152は、G4Sの単一コピーとしてL1及びL2リンカーの両方を含有し、かつC末端6x−Hisタグを含有するDS6ベースの操作された抗体様結合タンパク質である。このタンパク質をIMAC及びSECにより精製し、そしてインビトロ結合溶液を1.8mg/mlでPBS中で調製し、そして結合親和性をWISH CA6+細胞株においてフローサイトメトリーを使用して特徴づけした(図4C及び図4D)。
DOTA複合体はDS6活性を変更しないということを示すために、DS6抗体様結合タンパク質及びDOTA−DS6結合体化抗体の結合をインビトロでCA6陽性WISH細胞株及びA2780 CA6陰性細胞で試験した。蛍光活性化細胞分取実験により、DOTA複合体がCA6陽性WISH細胞においてDS6結合を変更しないということが決定された(図5を参照のこと)。
銅−64で標識されたDOTA結合DS6 B−Fabを使用するヒト血清安定性研究及び24時間生体内分布研究を、CA6陽性(WISH)又はCA6陰性(A2780)皮下腫瘍(were)のいずれかを保有するヌードマウスにおいて行った。放射化学研究は、64Cu−DOTA−DS6 B−Fab操作抗体様結合タンパク質が約30%の放射化学収率、>95%の放射化学純度、及び1.9 Ci/μmoleの比放射能を有するということを示す(図6Aを参照のこと)。64Cu−DOTA−DS6 B−Fab抗体様結合タンパク質の血清安定性実験を、24時間ヒト血清中で37℃にて行い、そして0時間の時点で97.2%活性及び24時間の時点で96.3%活性を示し、24時間後に活性に有意な損失が無いことを実証した(図6Bを参照のこと)。
上記のB−Fab抗体様結合タンパク質の特性を、どの骨格がイメージングコンパニオン診断薬としての使用に最も適するかを評価するために、CA6に特異的に結合する二特異性抗体(diabody)の特性と比較した。ホモ二量体を形成するその抗CA6二特異性抗体のアミノ酸配列を配列番号12として示す(表7)。いくつかの実施態様において、そのホモ二量体二特異性抗体は、GGCタグ、配列番号13のタグ、及び配列番号14のタグからなる群より選択されるC末端タグをさらに含んでいた。
Claims (17)
- 腫瘍関連MUC1−シアログリコトープCA6に特異的に結合する抗体様結合タンパク質であって、該抗体様結合タンパク質は、以下の式[I]及び[II]:
VL1−L1−VL2−CL [I]
VH1−L2−VH2−CH1 [II]
[式中:
VL1は配列番号2からなる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は配列番号2からなる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は配列番号8からなる免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は配列番号8からなる免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
L1及びL2はアミノ酸リンカーである]
により表される構造を有する2つのポリペプチドを含み、
ここで式[I]のポリペプチド及び式[II]のポリペプチドは、二価単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成することを特徴とする、上記抗体様結合タンパク質。 - CLはヒト免疫グロブリンカッパ鎖(IGKC)定常ドメインである、請求項1に記載の抗体様結合タンパク質。
- CH1はヒト免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインである、請求項1に記載の抗体様結合タンパク質。
- L1がGGGGS又はGGGGSGGGGS(配列番号3)である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体様結合タンパク質。
- L2がGGGGS又はGGGGSGGGGS(配列番号3)である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体様結合タンパク質。
- 式[I]のポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか
1項に記載の抗体様結合タンパク質。 - 式[II]のポリペプチドが配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗体様結合タンパク質。
- 少なくとも1つの放射標識、造影剤、治療剤、又は診断剤をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗体様結合タンパク質。
- 放射標識、造影剤、治療剤又は診断剤が、110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、又は83Srである、請求項8に記載の抗体様結合タンパク質。
- 放射標識、造影剤、治療剤又は診断剤が、磁気共鳴画像法(MRI);ポジトロン放出断層撮影(PET);単一光子放射断層撮影(SPECT);光学イメージング;コンピュータ断層撮影(CT);超音波;X線;及び光音響イメージングからなる群から選ばれる1つ又はそれ以上のイメージングプラットフォームのための薬剤を含む、請求項8又は9に記載の抗体様結合タンパク質。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗体様結合タンパク質の式[I]及び[II]のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
- 配列番号5及び配列番号10のヌクレオチド配列を含む、請求項11に記載の単離された核酸分子。
- 請求項11または12に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項11または12に記載の核酸分子または、請求項13に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
- 腫瘍関連MUC1−シアログリコトープCA6に特異的に結合する抗体様結合タンパク質を製造する方法であって、以下の式[I]及び[II]:
VL1−L1−VL2−CL [I]
VH1−L2−VH2−CH1 [II]
[式中:
VL1は配列番号2からなる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は配列番号2からなる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は配列番号8からなる免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は配列番号8からなる免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
L1及びL2はアミノ酸リンカーである]
により表される構造を有するポリペプチドをコードする1つ又はそれ以上の核酸分子を細胞において発現させることを含み;そして
ここで式[I]のポリペプチド及び式[II]のポリペプチドは、二価単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成する、上記方法。 - CLはヒト免疫グロブリンカッパ鎖(IGKC)定常ドメインである、請求項15に記載の方法。
- CH1はヒト免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインである、請求項15に記載の方法。
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