KR20150113197A

KR20150113197A - 항체-약물 컨쥬게이트 치료법에 사용하기 위한 면역 영상제

Info

Publication number: KR20150113197A
Application number: KR1020157023998A
Authority: KR
Inventors: 요헨 크루입; 수잔타 케이. 사카르; 마티아스 게바우어; 크리스티안 란게; 인고 포켄
Original assignee: 사노피
Priority date: 2013-02-05
Filing date: 2014-02-05
Publication date: 2015-10-07
Also published as: AU2014213687A1; EP2953977A1; CN105229034A; RU2015137858A; MX2015010145A; LT2953977T; WO2014122529A1; SG11201506054XA; HUE037909T2; ES2657053T3; SI2953977T1; AU2014213687B2; SG10201707391QA; DK2953977T3; EP2953977B1; CN105229034B; CA2900154A1; PT2953977T; JP2016509606A; JP6605331B2

Abstract

본 발명은 종양-관련 MUC1-시알로글리코토프(sialoglycotope)인 CA6의 생체 내 검출 및 정량화를 위한 진단 툴로서 사용되는, 인간화된 모노클로날 항체인 DS6를 기재로 하는 동반 진단적(companion diagnositc) 항체-유사 결합 단백질에 관한 것이다.

Description

항체-약물 컨쥬게이트 치료법에 사용하기 위한 면역 영상제{IMMUNO IMAGING AGENT FOR USE WITH ANTIBODY-DRUG CONJUGATE THERAPY}

본 발명은 동반 진단적(companion diagnostic) 항체-유사 결합 단백질 및 사용 방법에 관한 것이다.

환자 개체군에서 치료용으로 사용하기 위한 약물의 개발에 있어서 수많은 도전들이 있다. 많은 초기 제제들은 여러 가지 이유로 시판되지 못한다(예를 들어, 환자 개체군에서 임상적 이익의 결여 또는 입증된 안전성의 결여). 효과적이며 안전한 약물의 개발을 위한 일부 중요한 관건은, (1) 약물이 환자 개체군에서 이의 의도되는 분자 표적과 상호작용하는 것을 구축하는 것; (2) 특이적 표적이 동일한 환자 개체군에서 특정 질환의 치료와 관련 있는 것을 구축하는 것; 및 (3) 동일한 환자 개체군에서 표적에 대한 약물의 효과를 토대로 생물학적으로 최적인 용량을 확인하는 것이다. 특정 약물에 대한 적절한 동반 진단제를 개발하는 것은 임상 환자 개체군에서 사용될 약물의 개발에 상당한 일조를 한다.

분자 영상제(molecular imaging)와 조합된 동반 진단제는 분자 표적에 대한 강력하면서도 비-침습적인 4-차원적 평가, 및 생체 내에서 약물 분자와의 상호작용을 제공한다. 영상 플랫폼의 일부 예로는, 자기 공명 영상(MRI); 양전자단층촬영(PET); 단일 광자 방출 단층촬영(SPECT); 광학 영상(optical imaging), 컴퓨터 단층촬영(CT); 초음파, X-선 또는 광음향 영상(photoacoustic imaging)이 포함된다. 영상 조영제의 선택은 특정 분자 프로브 및 조직 고유의 특징을 고려한다. 분자 영상제와 동반 진단제의 조합은, 환자에서 특정 약물과 이의 분자 표적과의 상호작용을 보다 잘 이해할 수 있게 하며, 특정 약물에 대한 잠재적인 반응물질(responder)을 확인하는데 일조하고, 약물(및 이의 최적 용량)의 민감성과 내성의 기전을 이해하고 측정하는 것을 도울 수 있다.

인간화된 모노클로날 항체인 DS6를 기재로 하는 동반 진단적 항체-유사 결합 단백질은, 양전자단층촬영(PET) 바이오-영상과 같은 영상 기술에 의해, 종양-관련 MUC1-시알로글리코토프(sialoglycotope)인 CA6를 생체 내에서 검출 및 정량화하기 위한 진단 툴로서 사용하기 위해 개발되었다. 항체-유사 결합 단백질은, 환자 분류, 및 세포독성의 메이탄시노이드(maytansinoid)인 DM4에 컨쥬게이트된, 종양-관련 MUC1-시알로글리코토프인 CA6에 대한 인간화된 모노클로날 항체로 구성된, 인간화된 DS6 항체-약물 면역컨쥬게이트인 huDS6-DM4의 치료 효능의 조기 평가를 용이하게 한다.

동반 진단적 항체-유사 결합 단백질은, CA6 발현율이 높은 조직(예를 들어, 종양 조직)을 표적으로 하는 약물, 예컨대 CA6 에피토프를 표적으로 하는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 이용한 치료에 선호적으로 반응할 수 있는, CA6 발현율이 높은 환자 및 환자 하위개체군을 확인하는 데 사용될 수 있다. ADC는 예를 들어, 세포독성제, 예컨대 DM1 또는 DM4와 같은 메이탄신(maytansine) 유도체, 또는 국제 공개 WO 2005/009369에 기술된 것과 같은 또 다른 제제에 부착된 huDS6 분자일 수 있다. 동반 진단적 항체-유사 결합 단백질은 ADC의 투여 전에 투여되어, 예컨대 개체가 ADC를 이용한 치료에 반응성이 있는지를 결정할 수 있다.

동반 진단적 항체-유사 결합 단백질은 양전자단층촬영(PET)과 같은 바이오-영상 기술에 의해 생체 내에서 CA6를 검출하는 데 사용될 수 있으며, 48시간 내지 24시간 이하와 같은 짧은 노출 시간 및 신속한 촬영을 가능하게 하고, 동반 진단제는 청소율 카이네틱스(clearance kinetics)가 적절한 매우 특이적인 결합제이다.

본원에 개시되는 발명은 CA6에 특이적으로 결합하는 항체-유사 결합 단백질을 제공하며, 항체-유사 결합 단백질은 킬레이터를 추가로 포함한다. 항체-유사 결합 단백질은 PET와 같은 바이오-영상 기술에 의해 인간 CA6 종양 항원을 생체 내에서 검출 및 정량화하기 위한 진단 툴로서 사용될 수 있으며, 항체-유사 결합 단백질은 바이오-영상 추적자(tracer)에의 접합에 적합한 킬레이터에 컨쥬게이트된다.

본원에 개시되는 발명은 CA6에 특이적으로 결합하는 항체-유사 결합 단백질을 추가로 제공하며, 항체-유사 결합 단백질은 킬레이터를 추가로 포함한다. 항체-유사 결합 단백질은 CA6 종양 항원을 발현하는 조직에 대한 영상제 또는 검출제로서 사용될 수 있으며, 항체-유사 결합 단백질은 제제에의 접합에 적합한 킬레이터에 컨쥬게이트된다.

본원에 개시되는 발명은 추가로, 나란히(in tandem) 배치되고 링커 서열에 의해 분리되는, 인간화된 DS6 항체로부터의 각각의 V_L 및 V_H DNA 서열을 포함하는 DS6 항체-유사 결합 단백질의 제조 방법을 제공한다. DS6 V_L-링커-DS6 V_L 및 DS6 V_H-링커-DS6 V_H 구축물은 하기 식 [I] 및 식 [II]에 따르면 DNA 수준에서 인간 불변 도메인 서열에 대한 3'말단에서 융합된다:

V_L1-L₁-V_L2-C_L [I]

V_H1-L₂-V_H2-C_H1 [II]

식에서:

V_L1은 DS6-기재의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;

V_L2는 DS6-기재의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;

V_H1은 DS6-기재의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;

V_H2는 DS6-기재의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;

C_L은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인, 예컨대 인간 IGKC 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;

C_H1은 면역글로불린 C_H1 중쇄 불변 도메인, 예컨대 인간 면역글로불린 C_H1 중쇄 불변 도메인이며;

L₁ 및 L₂는 아미노산 링커이고;

V_L1및 V_L2의 폴리펩타이드는 동일 또는 상이한 DS6-기재의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고, V_H1및 V_H2의 폴리펩타이드는 동일 또는 상이한 DS6-기재의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며; 식 I의 폴리펩타이드 및 식 II의 폴리펩타이드는 2가의 단일특이적인 탠덤(tandem) 면역글로불린 항체-유사 결합 단백질을 형성한다. C_L 및 C_H1 도메인은 예를 들어, 이황화 결합에 의해 결합될 수 있다. 더욱이, 식 I 및 식 II의 폴리펩타이드는 선택적인 태그(예를 들어, 폴리히스티딘 또는 6x-His 태그)를 포함할 수 있다.

본원에 개시되는 발명은 환자에서 암과 같은 장애를 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은, 환자에서 CA6의 발현 수준을 수득하고, 조직이 CA6를 발현하는지 결정하는 단계로서, CA6에 특이적으로 결합하는 항체-유사 결합 단백질을 환자에게 투여하며, 상기 항체-유사 결합 단백질은 킬레이터를 추가로 포함하는, 단계; 및 환자가 대조군 조직에서의 CA6 발현 수준보다 적어도 10% 더 높은 CA6 발현 수준, 예를 들어, 대조군 조직에서의 CA6 발현보다 10%, 20%, 30%, 40% 이상인 발현 수준을 가지는 경우, 환자에게 huDS6-DM4를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에서 특징지어지는 항체-유사 결합 단백질은 혈청 난소 암종(serous ovarian carcinoma), 내막양 난소 암종(endometriod ovarian carcinoma), 자궁경부의 신생물, 자궁내막의 신생물, 외음의 신생물(neoplasm of the vulva), 유방 암종, 췌장 종양 및 요로상피의 종양과 같은 종양 조직에서 CA6의 발현 수준을 측정하는 데 사용된다.

본원에 개시되는 발명은 암 환자가 huDS6-DM4를 이용한 치료의 후보인지 결정하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은, 환자에서 CA6의 발현 수준을 수득하고, CA6 발현 수준이 대조군 조직에서의 CA6 발현 수준보다 적어도 10% 더 높은지, 예를 들어, 대조군 조직에서의 CA6 발현보다 10%, 20%, 30%, 40% 이상인지 결정하는 단계로서, CA6에 특이적으로 결합하는 항체-유사 결합 단백질을 환자에게 투여하며, 상기 항체-유사 결합 단백질은 킬레이터를 추가로 포함하는, 단계; 및 결정이 긍정적인 경우, 암 환자가 huDS6-DM4를 이용한 치료의 후보임을 나타내는 지표(indication)를 제공하는 단계를 포함한다.

본원에 개시되는 발명은 huDS6-DM4를 이용한 치료에 대한 암 환자의 반응을 모니터링하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은, 환자에서 CA6의 발현 수준을 수득하고, CA6에 특이적으로 결합하는 항체-유사 결합 단백질을 huDS6-DM4를 이용한 치료 전과 치료 도중에 환자에게 투여하며, CA6의 발현 수준이 huDS6-DM4를 이용한 치료 결과로서 증가되거나, 동일하거나 또는 감소되는지 결정하는 단계로서, 상기 항체-유사 결합 단백질은 킬레이터를 추가로 포함하는, 단계; 및 환자에서 CA6의 발현 수준이 huDS6-DM4를 이용한 치료 전의 CA6의 발현 수준과 비교해 감소된 경우, 치료를 계속해야 함을 나타내는 지표를 제공하는 단계를 포함한다.

본 발명은 CA6에 특이적으로 결합하는 항체-유사 결합 단백질을 제공하며, 이 항체-유사 결합 단백질은 하기 식 [I] 및 식 [II]로 표시되는 구조를 가진 2개의 폴리펩타이드를 포함하며:

V_L1-L₁-V_L2-C_L [I]

V_H1-L₂-V_H2-C_H1 [II]

식에서:

V_L1은 DS6-기재의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;

V_L2는 DS6-기재의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;

V_H1은 DS6-기재의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;

V_H2는 DS6-기재의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;

L₁ 및 L₂는 아미노산 링커이며;

식 I의 폴리펩타이드 및 식 II의 폴리펩타이드는 2가의 단일특이적인 탠덤 면역글로불린 항체-유사 결합 단백질을 형성하고;

항체-유사 단백질은 킬레이터를 추가로 포함한다.

본 발명은 또한, CA6에 특이적으로 결합하는 항체-유사 결합 단백질의 제조 방법을 제공하며, 이 항체-유사 결합 단백질은 킬레이터를 추가로 포함하며, 이 방법은,

(a) 하기 식 [I] 및 식 [II]로 표시되는 구조를 가진 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 세포에서 발현시키는 단계로서:

V_L1-L₁-V_L2-C_L [I]

V_H1-L₂-V_H2-C_H1 [II]

식에서:

V_L1은 DS6-기재의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;

V_L2는 DS6-기재의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;

V_H1은 DS6-기재의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;

V_H2는 DS6-기재의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;

L₁ 및 L₂는 아미노산 링커이고;

식 I의 폴리펩타이드 및 식 II의 폴리펩타이드는 2가의 단일특이적인 탠덤 면역글로불린 항체-유사 결합 단백질을 형성하는, 단계; 및

(b) 항체-유사 결합 단백질을 킬레이터에 부착시키는 단계를 포함한다.

본 발명은 환자에서 CA6를 발현하는 병든 조직(diseased tissue)을 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은, CA6에 특이적으로 결합하며 킬레이터 및 영상제를 추가로 포함하는 항체-유사 결합 단백질을 환자에게 투여하는 단계; 환자에서 CA6를 발현하는 병든 조직을 양전자단층촬영(PET) 영상에 의해 확인하는 단계; 및 병든 조직에서의 CA6 발현이 참조 표준에서의 CA6 발현의 10% 이상인 경우, 환자가 huDS6-DM4를 이용한 치료의 후보임을 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명은 환자에서 CA6 양성 암을 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은, 환자에서 CA6의 발현 수준에 관한 정보를 수득하는 단계; 및 환자에서 CA6의 발현 수준이 참조 표준에서의 CA6 발현의 10% 이상인 경우, 환자에게 huDS6-DM4를 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 암 환자가 huDS6-DM4를 이용한 치료의 후보인지 결정하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은, 환자에서 CA6의 발현 수준에 관한 정보를 수득하는 단계; 및 환자에서 CA6의 발현 수준이 참조 표준에서의 CA6 발현의 10% 이상인 경우, 환자가 huDS6-DM4를 이용한 치료의 후보임을 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명은 huDS6-DM4를 이용한 치료에 대한 암 환자의 반응을 모니터링하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은, huDS6-DM4를 투여한 후 환자에서 CA6의 발현 수준에 관한 정보를 수득하는 단계; 및 환자에서 CA6의 발현 수준이, huDS6-DM4를 이용한 치료 전의 CA6의 발현 수준과 비교해 감소된 경우, 치료를 계속해야 함을 나타내는 지표를 제공하는 단계를 포함한다.

V_L1-L₁-V_L2-C_L [I]

V_H1-L₂-V_H2-C_H1 [II]

식에서:

V_L1은 DS6-기재의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;

V_L2는 DS6-기재의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;

V_H1은 DS6-기재의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;

V_H2는 DS6-기재의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;

L₁ 및 L₂는 아미노산 링커이고;

식 I의 폴리펩타이드 및 식 II의 폴리펩타이드는 2가의 단일특이적인 탠덤 면역글로불린 항체-유사 결합 단백질을 형성한다.

본 발명은 또한, CA6에 특이적으로 결합하는 항체-유사 결합 단백질의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은, 하기 식 [I] 및 식 [II]로 표시되는 구조를 가진 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 세포에서 발현시키는 단계를 포함하며:

V_L1-L₁-V_L2-C_L [I]

V_H1-L₂-V_H2-C_H1 [II]

식에서:

V_L1은 DS6-기재의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;

V_L2는 DS6-기재의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;

V_H1은 DS6-기재의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;

V_H2는 DS6-기재의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;

L₁ 및 L₂는 아미노산 링커이고;

본 발명의 특정 구현예는 소정의 구현예 및 청구항에 대한 하기의 보다 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.

도 1은 2가의 조작된 항체-유사 결합 단백질인 2가의 단일특이적인 탠덤 면역글로불린 단편(B-Fab)의 도식적인 대표도이다. B-Fab 단백질의 예로는, G4SG4S 링커(SEQ ID NO: 3)와 C-말단 6x-His 태그를 포함하는 B-Fab, G4SG4S 링커(SEQ ID NO: 3)는 포함하지만 C-말단 6x-His 태그를 포함하지 않는 B-Fab, 및 G4S 링커와 C-말단 6x-His 태그를 포함하는 B-Fab가 포함된다.
도 2는 GGGGSGGGGS((G4S)₂) 링커(SEQ ID NO: 3) 및 C-말단 6x-His 태그를 포함하는 B-Fab DS6를 기재로 하는 조작된 항체를, 젤 전기영동(도 2a), 크기-배제 크로마토그래피(SEC)(도 2b) 및 형광 활성화된 세포 소팅(FACS)(도 2c 및 도 2d)으로 평가한 것을 도시한 것이다.
도 3은 (G4S)₂ 링커를 포함하는 B-Fab DS6를 기재로 하는 조작된 항체를, 젤 전기영동(도 3a), SEC(도 3b) 및 FACS(도 3c 및 도 3d)로 평가한 것을 도시한 것이다.
도 4는 GGGGS(G4S) 링커 및 C-말단 6x-His 태그를 포함하는 B-Fab DS6를 기재로 하는 조작된 항체를, 젤 전기영동(도 4a), SEC(도 4b) 및 FACS(도 4c 및 도 4d)로 평가한 것을 도시한 것이다.
도 5는, DOTA를 포함하지 않는 A2780 세포(도 5a), DOTA를 포함하지 않는 WISH 세포(도 5b) 및 DOTA를 포함하는 WISH 세포(도 5c)를 이용한 FACS에 의해, B-Fab DS6를 기재로 하는 조작된 항체를 평가한 결과, DOTA 컨쥬게이션이 DS6 결합을 변화시키지 않는다는 것을 보여주는 도면이다.
도 6은, ⁶⁴Cu-DOTA-DS6 B-Fab 항체-유사 결합 단백질의 평가 결과, ⁶⁴Cu를 이용한 방사성표지화 및 DOTA 컨쥬게이션이 이상적인 방사화학(도 6a) 및 혈청 안정성(도 6b)을 가능하게 한다는 것을 보여주는 도면이다.
도 7은 이중항체(diabody) 스캐폴드를 가진 항체-유사 결합 단백질(도 7a)과 B-Fab 스캐폴드를 가진 항체-유사 결합 단백질(도 7b)을 비교한 도면이다.

본원에 개시되는 발명은, PET 바이오-영상에 의한 인간 CA6 종양 항원의 생체 내 검출 및 정량화를 위한 진단 툴로서 사용되는, 인간화된 모노클로날 항체인 DS6를 기재로 하는 동반 진단적 항체-유사 결합 단백질에 관한 것이다. 동반 진단적 항체-유사 결합 단백질은, 환자 분류, 및 세포독성의 메이탄시노이드인 DM4에 컨쥬게이트된, 종양-관련 MUC1-시알로글리코토프인 CA6에 대한 인간화된 모노클로날 항체로 구성된, DS6 항체-약물 면역컨쥬게이트 huDS6-DM4의 치료 효능의 조기 평가를 용이하게 할 것이다. 항체-약물 면역컨쥬게이트인 huDS6-DM4는 예를 들어, 원용에 의해 본 명세서에 포함된 국제 공개 WO 2005/009369에 기술되어 있다. DS6 항체 및 CA6 종양 항원은 예를 들어, 원용에 의해 본 명세서에 포함된 Kearse et al.(Int J Cancer. 2000 Dec 15;88(6):866-72)에 기술되어 있다.

HuDS6-DM4는 우선, 세포독성의 메이탄시노이드 DM4에 컨쥬게이트된, 종양-관련 MUC1-시알로글리코토프 CA6에 대한 인간화된 모노클로날 항체(huDS6)로 구성된 항체-약물 면역컨쥬게이트 부류에 속한다. 뮤신 단백질은 상피 표면상에 보호성 점막 벽을 형성하는 데 필수적인 역할을 하며, 폐, 유방, 난소, 위 및 췌장을 비롯한 많은 상이한 조직의 점막 표면을 이루는(line) 상피 세포의 정단면 상에 발현된다. MUC1(뮤신-1)은 다수의 상피세포 암에서 과발현되는 것으로 알려져 있으며, CA6 과발현은 인간 암에서의 공격적인 거동 및 불량한 환자 결과와 연관이 있다. CA6는 성인의 정상 조직에서는 분포가 제한되어 있으며, 따라서, DS6 항체는 CA6 양성 종양(예를 들어, 난소, 자궁, 췌장, 유방 또는 폐의 종양)의 선택적인 치료를 위한 유망한 제제가 된다. 항체/항원 결합 및 내재화(internalization) 시, huDS6-DM4 면역컨쥬게이트는 DM4를 방출하고, 이 DM4는 튜불린에 결합하여 미세소관의 조립/해체 기작을 방해함으로써, CA6-발현 종양 세포의 유사 분열을 정지시킨다. HuDS6-DM4는 현재 CA6 항원 양성 고형 종양을 진단받은 환자에서 I상 임상 시험중에 있다.

종양에서 CA6 발현을 나타내며, 따라서 huDS6-DM4를 이용한 치료에 반응할 수 있는 환자를 확인하기 위해, CA6에 높은 친화성으로 결합하는 동반 진단 툴이 개발되었다. 더욱이, 이 동반 진단적 항체-유사 결합 단백질은, huDS6-DM4 치료법에 대한 환자의 반응을 비-침습적으로 모니터링하기 위한 보조 툴을 제공하는 조기 효능 마커로서 작용함으로써, 임상 시험 또는 임상 치료에서 환자 분류를 용이하게 한다(즉, 불충분한 효능과 관련된 표적 하향-조절 또는 종양 위축과 상관관계가 있는 CA6 신호의 감소). 이러한 동반 진단제는 유효 약제의 소모를 감소시키고 환자에의 보다 빠른 전달을 도울 수 있다. 본원에 개시되는 바와 같은 동반 진단적 항체-유사 결합 단백질은 또한, PET 바이오-영상에 의한 생체 내 CA6 검출에 사용될 수 있다. 짧은 노출 시간 및 신속한 영상화, 예를 들어, 48시간 내지 24시간 이하 및 종양 : 혈액의 높은 신호를 위해서는, 청소율 카이네틱스가 적절한 매우 특이적인 결합제가 필요하였다.

DS6 항체 서열로부터 유래된 서로 다른 신규 항체-유사 결합 단백질은 PET 영상에 필요한 규격(예를 들어, 보다 양호한 종양 침투, 보다 신속한 청소율 카이네틱스 및 우수한 종양 : 혈액 비)을 충족시키기 위해 적절한 킬레이터 및 방사성표지를 포함하도록 개발되었다. 예정된 영상 이득 지표(imaging figures of merit; IFOM)를 토대로, 특이성 평가 및 궁극적인 임상적 번역(eventual clinical translation)을 위해 약 70 kDa의 항체 단편(2가의 단일특이적인 탠덤 면역글로불린으로서 B-Fab로 지칭됨)이 선별되었다. B-Fab 포맷은, (1) 열 스트레스(42℃에서 1주일 동안 인큐베이션)에 대한 높은 안정성; (2) 인간 혈청(37℃에서 24시간 동안 인큐베이션)에서의 높은 안정성; 및 (3) 일시적인 세포 배양에서의 합리적인 생산성(약 2 mg/L)이라는 이점을 제공하였다. 전장 항체(약 150 kDa)와 비교해, 항체 단편(약 50 kDa 내지 75 kDa)은 보다 신속한 신장 제거율 및 혈액 청소율을 나타내며, 이는 PET 바이오-영상 동안 노이즈에 대한 신호의 비를 높이게 된다.

B-Fab DS6 항체-유사 결합 단백질은 DS6 인간화된 모노클로날 항체의 CA6 항원 인지 부위를 기재로 하는 2개의 CA6 항원 인지 부위를 포함하며, CA6 항원에 대해 높은 결합 친화성을 나타낸다. 킬레이터(예를 들어, DOTA, NOTA, DTPA 또는 TETA)와 컨쥬게이션한 후, DS6 B-Fab를 방사성표지하고 생체 내 PET 바이오-영상 실험에 사용하였다.

표준 재조합 DNA 방법론을 이용해, 본 발명의 동반 진단적 항체(DS6 항체를 기재로 함)를 형성하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 구축하고, 이들 폴리뉴클레오타이드를 재조합 발현 벡터에 혼입한 후, 이러한 벡터를 숙주 세포에 도입하였다. 예를 들어, Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed.)을 참조한다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업체의 사양에 따라, 당해 기술분야에서 보편적으로 달성되는 바와 같이, 또는 본원에 기술되는 바와 같이 수행될 수 있다. 구체적인 정의가 제공되지 않는 한, 본원에 기술되는 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의료 및 약학 화학과 관련하여 사용되는 명명법, 및 실험 절차와 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 당해 기술분야에서 보편적으로 사용된다. 마찬가지로, 종래 기술은 화학 합성, 화학 분석, 약학 제조, 제형화, 전달 및 환자 치료에 이용될 수 있다.

1. 일반적인 정의

본 개시내용에 따라 사용되는 바와 같이, 하기의 용어는 다르게 언급되지 않는 한, 하기의 의미를 가지는 것으로 이해되어야 한다. 문맥상 다르게 요구되지 않는 한, 단수형은 복수형을 포함해야 하며, 복수형은 단수형을 포함해야 한다.

본원에서, 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 길이가 적어도 10개 뉴클레오타이드인 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산 폴리머를 지칭한다. 소정의 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 둘 중 어느 한 타입의 뉴클레오타이드의 변형된 형태일 수 있다. 이러한 변형으로는, 브롬유리딘과 같은 염기 변형, 아라비노사이드 및 2',3'-다이데옥시리보스와 같은 리보스 변형, 및 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로다이셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐라데이트(phoshoraniladate) 및 포스포로아미데이트와 같은 인터뉴클레오타이드 연결 변형이 포함된다. 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 구체적으로 단일-가닥 및 이중-가닥 형태의 DNA를 포함한다.

"단리된 폴리뉴클레오타이드"는 게놈, cDNA, 합성 기원 또는 이들의 일부 조합의 폴리뉴클레오타이드이며, 이의 기원으로 인해 단리된 폴리뉴클레오타이드는, (1) 자연상에서 단리된 폴리뉴클레오타이드가 확인되는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부와 연계되어 있지 않거나, (2) 자연상에서는 연결되지 않는 폴리뉴클레오타이드에 연결되거나, 또는 (3) 자연상에서는 더 긴 서열의 일부로서 발생하지 않는다.

"단리된 폴리펩타이드"는, (1) 정상적으로는 함께 확인될 다른 폴리펩타이드를 적어도 일부 포함하지 않거나, (2) 동일한 소스, 예를 들어, 동일한 종으로부터 유래되는 다른 폴리펩타이드를 본질적으로 포함하지 않거나, (3) 상이한 종으로부터 유래되는 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연상에서는 함께 연계되어 있는 폴리뉴클레오타이드, 지질, 탄수화물 또는 다른 물질의 적어도 약 50%로부터 분리되어 있으며, (5) 자연상에서는 "단리된 폴리펩타이드"가 함께 연계되어 있는 폴리펩타이드의 일부와 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 연계되어 있지 않거나, (6) 자연상에서는 연계되지 않는 폴리펩타이드와 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 작동적으로 연계되어 있거나, 또는 (7) 자연상에서 발생하지 않는다. 이러한 단리된 폴리펩타이드는 합성 기원의 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 다른 RNA, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 인코딩될 수 있다. 바람직하게는, 단리된 폴리펩타이드는, 자연적인 환경에서 확인되며 이의 용도(치료, 진단, 예방, 연구 또는 기타 용도)를 방해할 폴리펩타이드 또는 다른 오염원을 실질적으로 포함하지 않는다.

본원에서, 용어 "항체"는 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체 및 뮤린 항체를 포함한다.

본원에서, 용어 "인간 항체"는 인간 생식세포계열의(germline) 면역글로불린 서열에 실질적으로 상응하는 가변 도메인 및 불변 도메인을 가진 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 항체는 마우스 및 래트와 같은 설치류, 토끼와 같은 토끼목(lagomorph)을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 비-인간 포유류에서 생성된다. 다른 구현예에서, 인간 항체는 하이브리도마 세포에서 생성된다. 보다 다른 구현예에서, 인간 항체는 재조합에 의해 생성된다.

자연적으로 존재하는 항체는 전형적으로 테트라머를 포함한다. 이러한 각각의 테트라머는 전형적으로 2개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 사슬로 이루어지며, 각각의 쌍은 하나의 전장 "경"쇄(전형적으로 분자량이 약 25 kDa임) 및 하나의 전장 "중"쇄(전형적으로 분자량이 약 50 kDa 내지 70 kDa임)를 포함한다. 본원에서, 용어 "중쇄" 및 "경쇄"는, 표적 항원에 대한 특이성을 부여하기에 충분한 가변 도메인 서열을 가진 임의의 면역글로불린 폴리펩타이드를 지칭한다. 각각의 경쇄 및 중쇄의 아미노-말단 부위는, 전형적으로 항원 인지에 관여하는 약 100개 내지 110개 이상의 아미노산으로 구성된 가변 도메인을 전형적으로 포함한다. 각각의 사슬의 카르복시-말단 부위는 전형적으로, 효과기 기능에 관여하는 불변 도메인을 규정한다. 따라서, 자연적으로 존재하는 항체에서, 전장 중쇄 면역글로불린 폴리펩타이드는 가변 도메인(V_H) 및 3개의 불변 도메인(C_H1, C_H2 및 C_H3)을 포함하며, V_H 도메인은 폴리펩타이드의 아미노-말단에 있으며 C_H3 도메인은 카르복실-말단에 있고, 전장 경쇄 면역글로불린 폴리펩타이드는 가변 도메인(V_L) 및 불변 도메인(C_L)을 포함하며, V_L 도메인은 폴리펩타이드의 아미노-말단에 있으며 C_L 도메인은 카르복실-말단에 있다.

포유류 경쇄, 특히 인간 경쇄는 전형적으로 카파 및 람다 경쇄로 분류되며, 인간 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 입실론으로 분류되고 항체의 아이소타입을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 규정한다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 몇몇 하위부류를 가진다. IgM은 IgM1 및 IgM2를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 하위부류를 가진다. IgA 역시 마찬가지로 IgA1 및 IgA2를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 하위부류로 세분된다. 전장 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 도메인 및 불변 도메인은 전형적으로 약 12개 이상의 아미노산으로 구성된 "J" 영역에 의해 접합되며, 중쇄는 약 10개 초과의 아미노산으로 구성된 "D" 영역을 또한 포함한다. 예를 들어, 그 전체가 모든 목적을 위해 원용에 의해 포함된 FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul, W., ed., Raven Press, 2nd ed., 1989)를 참조한다. 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 도메인은 전형적으로 항원 결합 부위를 형성한다. 자연적으로 존재하는 항체의 가변 도메인은 전형적으로, 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 명명되는 3개의 초가변 도메인에 의해 접합된 상대적으로 보존된 골격 영역(FR)의 동일한 일반적인 구조를 나타낸다. 각각의 쌍의 2개 사슬로부터 유래되는 CDR은 전형적으로 골격 영역과 정렬되며, 특이적인 에피토프에의 결합을 가능하게 할 수 있다. 아미노-말단으로부터 카르복실-말단까지, 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인 모두 전형적으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 도메인을 포함한다.

본원에서, 용어 "천연 Fc"는, 모노머 또는 멀티머 형태에서, 항체의 분해 또는 다른 수단에 의해 생성되는 비-항원-결합 단편의 서열을 포함하며 힌지(hinge) 영역을 포함할 수 있는 분자를 지칭한다. 천연 Fc의 본래의 면역글로불린 소스는 바람직하게는 인간 기원이며, 임의의 면역글로불린일 수 있지만 IgG1 및 IgG2가 바람직하다. 천연 Fc 분자는, 공유 결합(즉, 이황화 결합) 및 비-공유 연계에 의해 다이머 또는 멀티머 형태로 연결될 수 있는 모노머 폴리펩타이드로 구성된다. 천연 Fc 분자의 모노머 서브유닛들 간의 분자간 이황화 결합의 수는 부류(예를 들어, IgG, IgA 및 IgE) 또는 하위부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 및 IgGA2)에 따라 1 내지 4이다. 천연 Fc의 일례는 IgG의 파파인 분해에 의해 생성되는 이황화-결합된 다이머이다. 본원에서, 용어 "천연 Fc"는 모노머, 다이머 및 멀티머 형태를 포괄한다.

본원에서, 용어 "Fc 변이체"는, 천연 Fc로부터 변형되지만 인양 수용체(salvage receptor), FcRn(신생아의 Fc 수용체)에 대한 결합 부위를 여전히 가지고 있는 분자 또는 서열을 지칭한다. 예시적인 Fc 변이체, 및 이것과 인양 수용체간의 상호작용은 당해 기술분야에 알려져 있다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는 비-인간 천연 Fc로부터 인간화된 분자 또는 서열을 포함할 수 있다. 더욱이, 천연 Fc는, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질에 필요하지 않은 구조적 특징 또는 생물학적 활성을 가지기 때문에 제거될 수 있는 영역을 포함한다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는, 하나 이상의 천연 Fc 부위 또는 잔기가 결여되어 있거나 또는 하나 이상의 Fc 부위 또는 잔기가 변형되어 있으며, (1) 이황화 결합 형성, (2) 선별된 숙주 세포와의 비융화성, (3) 선별된 숙주 세포에서 발현 시 N-말단 이종성, (4) 당화, (5) 보체와의 상호작용, (6) 인양 수용체 이외의 Fc 수용체에의 결합, 또는 (7) 항체-의존적 세포독성(ADCC)에 영향을 미치거나 또는 이에 관여하는 분자 또는 서열을 포함한다.

본원에서, 용어 "Fc 도메인"은 천연 Fc 및 Fc 변이체, 및 상기 정의된 바와 같은 서열을 포함한다. Fc 변이체 및 천연 Fc 분자의 경우, 용어 "Fc 도메인"은 전체 항체로부터 분해되거나 또는 다른 수단에 의해 생성되든지 간에, 모노머 또는 멀티머 형태의 분자를 포함한다.

본원에서, 용어 "항체-유사 결합 단백질"은 적어도 하나의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 비-자연적으로 존재하는 (또는 재조합) 조작된 분자를 지칭한다. 항체-유사 결합 단백질은 예를 들어, F(ab) 단편, F(ab') 단편 및 이중항체를 포함한다.

소정의 측면에서, "항체-유사 결합 단백질"은, 하기 식 [I] 및 식 [II]에 따라, 나란히 배치되고 짧은 아미노산 링커 서열에 의해 분리되는, 항체 유래의 각각의 V_L 및 V_H DNA 서열을 포함하며:

V_L1-L₁-V_L2-C_L [I]

V_H1-L₂-V_H2-C_H1 [II]

식에서:

V_L1은 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;

V_L2는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;

V_H1은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;

V_H2는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;

C_L은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;

C_H1은 면역글로불린 C_H1 중쇄 불변 도메인이며;

L₁ 및 L₂는 아미노산 링커이고;

식 I의 폴리펩타이드 및 식 II의 폴리펩타이드는 Fab 단편 (2가의 단일특이적인 탠덤 면역글로불린 단편)을 형성한다.

소정의 측면에서, V_L1 및 V_L2는 동일한 폴리펩타이드이며, 소정의 측면에서 V_H1 및 V_H2는 동일한폴리펩타이드이다.

소정의 측면에서, 또는 전형적으로, C_L 및 C_H1 도메인은 이황화 결합에 의해 연결된다.

소정의 측면에서, L₁ 및 L₂ 각각의 길이는 적어도 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 아미노산이다.

소정의 측면에서, L₁ 및 L₂ 각각은 GGGGS 또는 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 3)이다.

소정의 측면에서, 식 [I]의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.

소정의 측면에서, 식 [II]의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 7과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.

소정의 측면에서, 상기 항체-유사 결합 단백질은 적어도 하나의 방사성표지, 영상제, 치료제 또는 진단제를 추가로 포함한다.

소정의 측면에서, 상기 항체-유사 결합 단백질은 적어도 1 Ci/μMole, 1.1 Ci/μMole, 1.2 Ci/μMole, 1.3 Ci/μMole, 1.4 Ci/μMole 또는 1.5 Ci/μMole의 비 방사능(specific activity)을 가진다.

소정의 측면에서, 상기 항체-유사 결합 단백질은, 예를 들어, 결합을 유리(free) 항체-유사 결합 단백질을 사용하여 FACS에 의해 측정하는 경우, 최대 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM 또는 4 nM의 겉보기 Kd(apparent Kd)를 가질 수 있다.

소정의 측면에서, 상기 항체-유사 결합 단백질은 열 스트레스에 대해 높은 안정성을 나타낸다. 보다 구체적으로, 용해성 항체-유사 결합 단백질 중 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만이 42℃에서 1주일 동안 인큐베이션한 후 소실될 수 있다.

소정의 측면에서, 상기 항체-유사 결합 단백질은 인간 혈청에서 높은 안정성을 나타낸다. 보다 구체적으로, 항체-유사 결합 단백질 중 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%가 인간 혈청에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후에도 모노머일 수 있다.

"단리된" 항체-유사 결합 단백질은, 확인되었으며 이의 자연 환경의 구성성분으로부터 분리 및/또는 회수된 것이다. 이의 자연 환경의 오염원 구성성분은 항체-유사 결합 단백질의 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질로서, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체-유사 결합 단백질은, (1) 로리법(Lowry method)에 의해 측정 시 항체의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99중량% 초과로 정제되거나, (2) 스피닝 컵 시쿼네이터(spinning cup sequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열 중 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (3) 환원 조건 또는 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해, 코마씨 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용해, 동질성까지 정제될 것이다. 단리된 항체-유사 결합 단백질은, 항체-유사 결합 단백질의 자연 환경의 구성성분이 적어도 하나 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내에서 인 시추(in situ)에서 항체-유사 결합 단백질을 포함한다.

본원에서, 용어 "실질적으로 순수한" 또는 "실질적으로 정제된"은, 우세하게 존재하는(즉, 몰량 기준으로, 조성물 내의 임의의 다른 개별 화학종보다 더 많이 존재하는) 화학종인 화합물 또는 화학종을 지칭한다. 일부 구현예에서, 실질적으로 정제된 분획은, 화학종이 존재하는 모든 거대분자 화학종들의 적어도 약 50%(몰량 기준)를 포함하는 조성물이다. 다른 구현예에서, 실질적으로 순수한 조성물은 이 조성물에 존재하는 모든 거대분자 화학종들의 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 초과를 포함할 것이다. 보다 다른 구현예에서, 화학종은 필수적인 동질성(오염원 화학종은 종래의 검출 방법에 의해서는 조성물에서 검출될 수 없음)까지 정제되며, 조성물은 본질적으로, 단일 거대분자 화학종으로 구성된다.

본원에서, 용어 "항원" 또는 "표적 항원"은, 항체 또는 항체-유사 결합 단백질에 의해 결합될 수 있으며, 부가적으로는 해당 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생성하기 위해 동물에서 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 표적 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 항체-유사 결합 단백질에 의해 인지되는 각각의 표적 항원에 대해, 항체-유사 결합 단백질은 표적 항원을 인지하는 본래의 항체와 경쟁할 수 있다. "다중특이적" 또는 "다관능성" 항체-유사 결합 단백질 이외의 "2가" 항체-유사 결합 단백질은 동일한 항원 특이성을 가진 항원 결합 부위를 포함하는 것으로 이해된다.

이중특이적 또는 이관능성 항체는 전형적으로, 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위 또는 에피토프를 가진 인공적인 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는, 하이브리도마의 융합 또는 F(ab') 단편의 연결을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 다양한 방법들에 의해 생성될 수 있다.

Fab로도 지칭되는 F(ab) 단편은 전형적으로, 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 V_H 및 C_H1 도메인을 포함하며, F(ab) 단편의 V_H-C_H1 중쇄 부위는 또 다른 중쇄 폴리펩타이드와 이황화 결합을 형성할 수 없다. 본원에서, F(ab) 단편은 또한, 아미노산 링커에 의해 분리되는 2개의 가변 도메인을 포함하는 하나의 경쇄, 및 아미노산 링커에 의해 분리되는 2개의 가변 도메인 및 C_H1 도메인을 포함하는 하나의 중쇄를 포함할 수 있다. F(ab) 단편은 또한, C_L과 C_H1사이에 이황화 결합을 포함할 수 있다.

F(ab') 단편은 전형적으로, 사슬간 이황화 결합이 2개의 중쇄 사이에 형성되어 F(ab')₂ 분자가 형성될 수 있는 방식으로, 하나의 경쇄, 및 (C_H1과 C_H2 도메인 사이에) 보다 많은 불변 도메인을 포함하는 하나의 중쇄의 일부를 포함한다.

"이중항체"는 전형적으로, 2개의 단일-사슬 가변 단편(scFv)의 다이머로서, 각각의 scFv는, 가변 도메인을 함께 접기(fold)에는 너무 짧아 scFv를 다이머화시키는 작은 펩타이드 링커에 의해 연결된 중쇄 가변(V_H) 및 경쇄 가변(V_L) 도메인으로 구성된다.

본 발명의 항체-유사 결합 단백질과 관련하여 구어 "생물학적 특성," "생물학적 특징," 및 용어 "활성"은 본원에서 상호호환적으로 사용되며, 에피토프 친화성 및 특이성, 항원 표적(또는 표적화된 폴리펩타이드)의 활성을 길항시키는 능력, 항체-유사 결합 단백질의 생체 내 안정성, 및 항체-유사 결합 단백질의 면역원성을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 항체-유사 결합 단백질의 다른 확인가능한 생물학적 특성 또는 특징으로는, 예를 들어, (즉, 일반적으로 항원 표적의 비-인간 호모로그, 또는 다른 항원 표적이나 조직과의) 가교-반응성, 및 포유류 세포에서 높은 단백질 발현 수준을 보존하려는 능력을 포함한다. 전술한 특성 또는 특징은, ELISA, 경쟁적 ELISA, 표면 플라스몬 공명 분석(surface plasmon resonance analysis), 시험관 내 및 생체 내 중화 분석법, 및 인간, 영장류 또는 필요에 따라 임의의 다른 소스를 비롯한 상이한 소스들로부터의 조직 박편을 이용한 면역조직화학법을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는, 당해 기술분야의 기술을 이용해 관찰 또는 측정될 수 있다.

본원에서, 용어 "면역학적으로 기능성인 면역글로불린 단편"은, 폴리펩타이드 단편이 유래된 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 CDR을 적어도 포함하는 폴리펩타이드 단편을 지칭한다. 면역학적으로 기능성인 면역글로불린 단편은 표적 항원에 결합할 수 있다.

본원에서, "중화성" 항체-유사 결합 단백질은, 이것이 결합하는 표적 항원의 효과기 기능을 차단하거나 또는 실질적으로 감소시킬 수 있는 분자를 지칭한다. 본원에서, "실질적으로 감소시킨다"는, 표적 항원의 효과기 기능을 적어도 약 60%, 바람직하게는 적어도 약 70%, 보다 바람직하게는 적어도 약 75%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 85%, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 감소시킨다는 것을 의미한다.

용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정기, 바람직하게는 폴리펩타이드 결정기를 포함한다. 소정의 구현예에서, 에피토프 결정기는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴기 또는 설포닐기와 같이 화학적으로 활성의 표면 기를 포함하며, 소정의 구현예에서는 특이적인 3-차원 구조적 특징 및/또는 특이적인 전하적 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체 또는 항체-유사 결합 단백질에 의해 결합되는 항원의 영역이다. 소정의 구현예에서, 항체-유사 결합 단백질은, 이것이 단백질 및/또는 거대분자의 복잡한 혼합물에서 이의 표적 항원을 우선적으로 인지하는 경우, 항원에 특이적으로 결합한다고 일컬어진다. 바람직한 구현예에서, 항체-유사 결합 단백질은, 평형 해리 상수가 10^-8 M 이하, 보다 바람직하게는 평형 해리 상수가 10^-9 M 이하, 가장 바람직하게는 해리 상수가 10^-10 M 이하인 경우, 항원에 특이적으로 결합한다고 일컬어진다.

항체-유사 결합 단백질의 해리 상수(K_D)는 예를 들어, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정될 수 있다. 일반적으로, 표면 플라스몬 공명 분석은 리간드(바이오센서 매트릭스 상의 표적 항원)와 분석물(용액 중의 항체-유사 결합 단백질) 간의 실시간 결합 상호작용을 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ)을 이용한 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정한다. 표면 플라스몬 분석은 또한, 분석물 (바이오센서 매트릭스 상의 항체-유사 결합 단백질)을 고정하고 리간드(표적 항원)를 제시함으로써 수행될 수도 있다. 본원에서, 용어 "K_D"는, 특정 항체-유사 결합 단백질과 표적 항원 간의 상호작용의 해리 상수를 지칭한다.

본원에서, 용어 "특이적으로 결합한다"는, 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이, 에피토프를 포함하는 항원에 적어도 약 1 x 10^-6 M, 1 x 10^-7 M, 1 x 10^-8 M, 1 x 10^-9 M, 1 x 10^-10 M, 1 x 10^-11 M, 1 x 10^-12 M 이상의 Kd로 결합하거나, 및/또는 비특이적인 항원에 대한 친화성보다 적어도 2-배 더 큰 친화성으로 에피토프에 결합하는 능력을 지칭한다.

본원에서, 용어 "링커"는, 면역글로불린 도메인들 사이에 삽입되어 경쇄 및 중쇄의 도메인들에 충분한 이동성을 제공하여 이중(dual) 가변 도메인 면역글로불린 위로 접혀서 가교되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 비-제한적인 예로는, 글리신/세린 링커, 예컨대 GGGGS 또는 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 3), 및 글리신/알라닌 링커가 포함된다. 링커는 서열 수준에서 각각 가변 도메인들 사이의 전환부(transition) 또는 가변 도메인과 불변 도메인 사이의 전환부에 삽입된다. 도메인들 사이의 전환부는, 면역글로불린 도메인의 적절한 크기가 잘 이해되기 때문에, 확인될 수 있다. 도메인 전환부의 정확한 위치는, 실험 데이터에서 나타나듯이 또는 모델링 기술 또는 2차 구조 예측에 의해 추정될 수 있듯이, 베타-병풍 또는 알파-나선과 같은 2차 구조의 요소를 형성하지 않는 펩타이드 신장부(stretch)를 위치시킴으로써 측정될 수 있다. 링커는 독립적이지만, 일부 경우에서는 동일한 서열 및/또는 길이를 가질 수 있다. 예시적인 아미노산 링커는 당해 기술분야에 알려져 있으며, 본원에 기술된 용도에 적합하다.

본원에서, 용어 "태그"는, 통상적으로 프레임-내에서, 폴리펩타이드 또는 항체-유사 결합 단백질의 임의의 위치(전형적으로 N-말단 또는 C-말단 종결부)에서 융합되는 임의의 연결 분자(linked molecule) 또는 친화성-기재의 서열을 지칭한다. 적절한 태그의 존재는 항체-유사 단백질의 검출, 정제 또는 다른 특징화를 향상시키는 역할을 할 수 있다. 적합한 친화성-기재의 태그는, 또 다른 모이어티(비-제한적인 예로는, 폴리-히스티딘, 6x-히스티딘, FLAG, V5, 비오틴, HA, GST 또는 MBP가 포함됨)에 특이적으로 결합될 수 있는 임의의 서열을 포함한다. 일부 경우에, 연결 분자는, 폴리펩타이드의 존재를 보고할 수 있는 임의의 도메인을 포함할 수 있는 발광 리포터일 수 있다. 적합한 발광 리포터 도메인은 루시퍼라제, 형광 단백질 또는 이의 발광 변이체를 포함한다.

본원에서, 용어 "벡터"는 숙주 세포에 코딩 정보를 전달하는 데 사용되는 임의의 분자(예를 들어, 핵산, 플라스미드 또는 바이러스)를 지칭한다. 용어 "벡터"는, 이것이 연결되어 있는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 일 타입의 벡터는 "플라스미드"로서, 이는 부가적인 DNA 분절이 삽입될 수 있는 원형의 이중-가닥 DNA 분자를 지칭한다. 또 다른 타입의 벡터는 부가적인 DNA 분절이 바이러스 게놈 내에 삽입될 수 있는 바이러스 벡터이다. 소정의 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포(예를 들어, 박테리아 복제 기원을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜(episomal) 포유류 벡터)에서 자율 복제할 수 있다. 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있으며, 그리하여, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 소정의 벡터는, 이들이 작동적으로 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간략하게는 "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 이용가능한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태로 존재한다. 플라스미드가 가장 보편적으로 사용되는 벡터 형태이기 때문에, 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 본원에서 상호호환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터를 포함하고자 한다.

본원에서, 용어 "작동적으로 연결된"은 측면(flanking) 서열의 배치를 지칭하는 데 사용되며, 여기서, 기술되는 측면 서열들은 이들의 통상적인 기능을 수행하도록 배열 또는 조립된다. 따라서, 코딩 서열에 작동적으로 연결된 측면 서열은 코딩 서열의 복제, 전사 및/또는 번역을 수행할 수 있을 것이다. 예를 들어, 코딩 서열은, 프로모터가 해당 코딩 서열의 전사를 지시할 수 있는 경우, 프로모터에 작동적으로 연결된다. 측면 서열은, 이것이 올바르게 작용하는 한, 코딩 서열에 인접해 있을 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 번역되지는 않았지만 전사된 개재(intervening) 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있으며, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동적으로 연결된" 것으로 간주될 수 있다.

본원에서, 구어 "재조합 숙주 세포"(또는 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 재조합 숙주 세포 또는 숙주 세포는 특정 개체의 세포뿐만 아니라, 이런 세포의 자손도 지칭하고자 한다. 소정의 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 이런 세포는 여전히 본원에서 용어 "숙주 세포"의 범위에 속한다. 박테리아, 효모, 바큘로바이러스 및 포유류 발현 시스템(뿐만 아니라 파지 디스플레이 발현 시스템)을 비롯한 매우 다양한 숙주 세포 발현 시스템이 본 발명의 항체-유사 결합 단백질을 발현시키는 데 사용될 수 있다. 적절한 박테리아 발현 벡터의 일례는 pUC19이다. 항체-유사 결합 단백질을 재조합적으로 발현시키기 위해, 숙주 세포는 항체-유사 결합 단백질의 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 DNA 단편을 운반하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염되어, 폴리펩타이드 사슬은 숙주 세포에서 발현하게 되며, 바람직하게는, 숙주 세포가 배양되는 배지 내로 분비되고, 해당 배지로부터 항체-유사 결합 단백질이 회수될 수 있다.

본원에서, 용어 "형질전환"은 세포의 유전적 특징의 변화를 지칭하며, 세포는 새로운 DNA를 포함하도록 변형된 경우 형질전환된 것이다. 예를 들어, 세포는 이의 천연 상태로부터 유전적으로 변형된 경우 형질전환된다. 형질전환 후, 형질전환시키는 DNA는 세포의 염색체 내로 물리적으로 통합됨으로써 세포의 DNA와 재조합될 수 있거나, 또는 복제되지 않은 채 에피솜 요소로서 일시적으로 유지될 수 있거나, 또는 플라스미드로서 독립적으로 복제될 수 있다. 세포는, DNA가 세포 분열 시 복제되는 경우 안정하게 형질전환된 것으로 간주된다. 본원에서, 용어 "형질감염"은 외래 DNA 또는 외인성 DNA가 세포에 의해 취해지는 것을 지칭하며, 세포는 외인성 DNA가 세포막 내부에 도입된 경우 "형질전환"된다. 많은 형질감염 기술들이 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 이러한 기술이 사용되어, 하나 이상의 외인성 DNA 분자를 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다.

본원에서 사용되며 물체에 적용되는, 용어 "자연적으로 존재하는"은, 물체가 자연상에서 확인될 수 있으며 사람에 의해 조작된 적이 없다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 자연상의 소스로부터 단리될 수 있으며 사람에 의해 의도적으로 변형된 적이 없는 (바이러스를 포함하는) 유기체에 존재하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 자연적으로 존재하는 것이다. 마찬가지로, 본원에서, "비-자연적으로 존재하는"은, 자연상에서 확인되지 않거나 또는 사람에 의해 구조적으로 변형 또는 합성된 적이 있는 물체를 지칭한다.

본원에서, 20개의 통상적인 아미노산 및 이들의 약어는 종래의 사용을 따른다. 20개의 통상적인 아미노산의 입체이성질체(예를 들어, D-아미노산); 비천연적인(unnatural) 아미노산, 예컨대 α-, α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 젖산, 및 다른 비통상적인 아미노산 역시, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 폴리펩타이드 사슬에 적합한 구성성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예로는, 4-하이드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시라이신, σ-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산(예를 들어, 4-하이드록시프롤린)이 포함된다. 본원에 사용되는 폴리펩타이드 표기법에서, 표준 사용법 및 관례에 따라 좌측 방향은 아미노 말단 방향이고, 우측 방향은 카르복실-말단 방향이다.

자연적으로 존재하는 잔기는 보편적인 측쇄 특성을 기준으로 하기의 부류들로 분류될 수 있다:

(1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro;

(2) 극성 친수성: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr;

(3) 지방족: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro;

(4) 지방족 소수성: Ala, Ile, Leu, Val, Pro;

(5) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(6) 산성: Asp, Glu;

(7) 염기성: His, Lys, Arg;

(8) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;

(9) 방향족: His, Trp, Tyr, Phe; 및

(10) 방향족 소수성: Phe, Trp, Tyr.

보존적 아미노산 치환은 이들 부류 중 한 부류의 구성원을 동일한 부류의 또 다른 구성원으로 교환하는 것을 수반할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은, 전형적으로 생물학적 시스템에서의 합성보다는 화학적 펩타이드 합성에 의해 혼입되는 비-자연적으로 존재하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이들은 펩티도미메틱(peptidomimetic) 및 다른 역전된(reversed) 또는 역(inverted) 형태의 아미노산 잔기를 포함한다. 비-보존적 치환은 이들 부류 중 한 부류의 구성원을 또 다른 부류의 구성원으로 교환하는 것을 수반할 수 있다.

당업자는, 공지된 기술을 이용해 본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 폴리펩타이드 사슬의 적절한 변이체를 측정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 당해 기술분야의 당업자는, 활성에 중요한 것으로 여겨지지 않는 영역을 표적으로 함으로써 활성을 파괴하지 않은 채 변화될 수 있는, 폴리펩타이드 사슬의 적합한 영역을 확인할 수 있다. 다른 예로, 당해 기술분야의 당업자는 유사한 폴리펩타이드들 중에서 보존되는 분자의 잔기 및 부위를 확인할 수 있다. 또한, 생물학적 활성 또는 구조에 중요할 수 있는 영역이라도, 생물학적 활성을 파괴하지 않거나 또는 폴리펩타이드 구조에 악영향을 주지 않은 채, 보존적 아미노산 치환을 받을 수 있다.

용어 "킬레이터"는, 적어도 2개의 비금속 이온들에 배위되어 있는 금속을 포함할 수 있는 헤테로사이클릭 고리 형태의 화학적 화합물이다. 항체-유사 결합 단백질 상에 경질 산(hard acid) 양이온 킬레이트 모이어티가 존재하면, 동반 진단제가 생체 내에서 신속하게 청소되는 데 일조할 수 있다.

킬레이터는 표준 바이오컨쥬게이션 방법을 이용해 항체 또는 항체-유사 결합 단백질에 공유 결합된다. 항체 상의 아민-함유 잔기(예를 들어, 라이신 또는 N-말단)는, 활성화된 에스테르(예를 들어, N-하이드록시숙신이미딜 에스테르)를 포함하는 킬레이터와 아미드 결합을 형성한다. 황-함유 잔기(예를 들어, 시스테인)는 활성화된 에스테르 또는 말레이미드 모이어티를 포함하는 킬레이터와 컨쥬게이션된다. 다른 예로, 항체 상의 활성화된 카르복실레이트 잔기가 각각 킬레이터 상의 아민기 또는 티올기와 아미드 결합 또는 티오에스테르 결합을 형성하는 경우, 바이오컨쥬게이트가 형성된다. 예를 들어, PEG-말레이미드(PEG-Mal), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC) 또는 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜티오)프로피오네이트(SPDP)와 같은 이관능성 링커가 필요에 따라 사용된다.

킬레이터는 이들의 금속-결합 특성에 따라 선택되며, 임의대로 변화될 수 있다. NOTA(1,4,7-트리아자-사이클로노난-N,N',N''-트리아세트산), DOTA(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), DTPA(1,1,4,7,7-다이에틸렌트리아민펜타아세트산), 및 TETA(p-브로모아세타미도-벤질-테트라에틸아민테트라아세트산)와 같은 킬레이터는 다양한 방사성표지, 방사성핵종, 방사성동위원소, 금속 및 방사성금속과 함께 사용된다. 리간드가 카르복실레이트기 또는 아민기와 같은 경질 염기(hard base) 킬레이트화 관능기를 포함하는 DOTA-타입 킬레이터가 경질 산 양이온, 특히 IIa족 및 IIIa족 금속 양이온을 킬레이트화하는 데 가장 효과적이다. 이러한 금속-킬레이트 복합체는 고리 크기를 목적하는(of interest) 금속에 맞춤으로써 매우 안정하게 제조될 수 있다. 또한, 하나 초과 타입의 킬레이터는 다수의 금속 이온, 예를 들어, 진단용 방사성핵종 및/또는 치료용 방사성핵종을 결합시키기 위해, 표적가능한 구축물에 컨쥬게이트될 수 있다.

항체 또는 조작된 항체-유사 결합 단백질의 킬레이트제에 결합될 수 있는 특히 유용한 진단용 방사성표지, 방사성핵종 또는 방사성동위원소로는, ¹¹⁰In, ¹¹¹In, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸F, ⁵²Fe, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁸⁶Y, ⁹⁰Y, ⁸⁹Zr, ⁹⁴Tc, ⁹⁴Tc, ^99mTc, ¹²⁰I, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ^154- ¹⁵⁸Gd, ³²P, ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ⁵¹Mn, ^52mMn, ⁵⁵Co, ⁷²As, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ^82mRb, ⁸³Sr, 또는 기타 감마-방출기, 베타-방출기 또는 양전자-방출기를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 진단용 방사성표지는 붕괴 에너지를 25 keV 내지 10,000 keV, 보다 바람직하게는 25 keV 내지 4,000 keV, 보다 더 바람직하게는 20 keV 내지 1,000 keV, 더욱 더 바람직하게는 70 keV 내지 700 keV 범위로 포함한다. 유용한 양전자-방출 방사성핵종의 총 붕괴 에너지는 바람직하게는 2,000 keV 미만, 보다 바람직하게는 1,000 keV 미만, 가장 바람직하게는 700 keV 미만이다. 감마-선 검출을 이용하는 진단제로서 유용한 방사성표지로는, Cr-51, Co-57, Co-58, Fe-59, Cu-67, Ga-67, Se-75, Ru-97, Tc-99m, In-111, In-114m, I-123, I-125, I-131, Yb-169, Hg-197 및 T1-201을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 유용한 감마-선 방출 방사성표지의 붕괴 에너지는 바람직하게는 20 keV 내지 2000 keV, 보다 바람직하게는 60 keV 내지 600 keV, 가장 바람직하게는 100 keV 내지 300 keV이다.

본원에서, 용어 "환자"는 인간 및 동물 개체를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

"장애"는, 본 발명의 항체 또는 조작된 항체-유사 결합 단백질을 사용한 치료로부터 이득을 얻게 될 임의의 병태이다. "장애" 및 "병태"는 본원에서 상호호환적으로 사용되며, 환자가 문제의 장애를 앓게 되는 병리학적 병태를 비롯한 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 소정의 측면에서, 장애는 고형 종양 암과 같은 암이다. 소정의 특정 측면에서, 암은 유방암, 결장암, 난소 암종, 자궁내막암, 골육종, 자궁경부암, 전립선암, 폐암, 활막 암종, 췌장암, 신장암, 림프계암, CA6가 발현되는 육종 또는 암종, 또는 아직은 CA6 글리코토프(glycotope)가 주로 발현되는 것으로 결정되지 않은 다른 암이다. 암은 예를 들어, 혈청 난소 암종, 내막양 난소 암종, 자궁경부의 신생물, 자궁내막의 신생물, 외음의 신생물, 유방 암종, 췌장 종양 및 요로상피의 종양일 수 있다.

선별된 세포군의 살해에 의해 치료될 수 있는 임의의 장애는 본원에 기술되는 항체-유사 결합 단백질을 사용하기에 적합한 것으로서, 예컨대 암, 자가면역 질환, 예컨대 전신성 루푸스, 류마티스 관절염 및 다발성 경화증; 이식 거부반응, 예컨대 신장 이식 거부반응, 간 이식 거부반응, 폐 이식 거부반응, 심장 이식 거부반응 및 골수 이식 거부반응; 숙주편대이식질환; 바이러스 감염, 예컨대 mV 감염, HIV 감염, AIDS 등; 및 기생충 감염, 예컨대 편모충증, 아메바증, 주혈흡충증, 및 당해 기술분야의 당업자에 의해 결정되는 다른 장애이다.

대조군 발현 수준은 예를 들어, 환자의 병들지 않은 조직(예를 들어, 종양을 포함하는 조직과 동일한 조직-타입으로부터의 조직)에서의 CA6 발현 수준일 수 있거나, 또는 참조 표준은 예를 들어, 당해 기술분야에서 허용된 표준으로부터 결정될 수 있는데, 예컨대 개체의 집단으로부터 병들지 않은 조직에서의 발현 수준으로부터 유도될 수 있다.

본원에서, 용어 "치료" 또는 "치료하다"는 치유를 위한 치료 및 예방 또는 방지를 위한 조치 둘 모두를 지칭한다. 치료가 필요한 개체는 장애를 앓고 있는 개체뿐만 아니라 장애를 앓기 쉬운 개체 또는 장애가 방지되어야 하는 개체를 포함한다.

본원에서, 용어 "약제학적 조성물" 또는 "치료학적 조성물"은 환자에게 적절히 투여되는 경우, 원하는 치료 효과를 유도할 수 있는 화합물 또는 조성물을 지칭한다.

본원에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체" 또는 "생리학적으로 허용가능한 담체"는 항체 또는 조작된 항체-유사 결합 단백질의 전달을 달성하거나 또는 증강시키는데 적합한 하나 이상의 제형 물질을 지칭한다.

용어 "유효량" 및 "치료적 유효량"은, 하나 이상의 항체 또는 조작된 항체-유사 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물과 관련하여 사용되는 경우, 원하는 치료 결과를 발휘하기에 충분한 양 또는 투약량을 지칭한다. 보다 구체적으로, 치료적 유효량은, 치료될 병태와 연관된 임상적으로 정의된 병리학적 과정들 중 하나 이상을 일정 기간 동안 저해하기에 충분한, 항체 또는 조작된 항체-유사 결합 단백질의 양이다. 본원에서, "치료적 유효량"은 또한, CA6-발현 조직, 예를 들어, 종양 조직을 가시화하기에 효과적인, 항체-유사 단백질의 양을 지칭한다. 유효량은, 사용되는 특정 항체 또는 조작된 항체-유사 결합 단백질에 따라 다양할 수 있으며, 치료받을 환자 및 장애의 중증도와 관련된 여러 가지 인자들 및 조건들에 좌우한다. 예를 들어, 항체 또는 조작된 항체-유사 결합 단백질이 생체 내에서 투여되는 경우, 환자의 연령, 체중 및 건강상태뿐만 아니라 예비임상 동물 연구에서 수득된 반응 곡선 및 독성 데이터와 같은 인자들이 고려되어야 하는 인자들일 것이다. 주어진 약제학적 조성물의 유효량 또는 치료적 유효량에 대한 결정은 당해 기술분야의 당업자의 능력에 달려 있다.

본원에서, 용어 "획득하다" 또는 "획득하는"은, 예를 들어, 물리적 실체(entity) 또는 값을 "직접적으로 획득하거나" 또는 "간접적으로 획득"함으로써, 물리적 실체 또는 값, 예를 들어, 수치의 소유를 획득하는 것을 지칭한다. "직접적으로 획득하는"은, 물리적 실체 또는 값을 수득하기 위한 과정을 수행하는(예를 들어, 합성 또는 분석 방법을 수행하는) 것을 의미한다. "간접적으로 획득하는"은, 또 다른 단체 또는 소스(예를 들어, 물리적 실체 또는 값을 직접적으로 획득한 제3 단체 실험실)로부터 물리적 실체 또는 값을 수용하는 것을 지칭한다. 물리적 실체를 직접적으로 획득하는 것은, 물리적 성분, 예를 들어 출발 물질의 물리적 변화를 포함하는 과정을 수행하는 것을 포함한다. 예시적인 변화는, 2개 이상의 출발 물질로부터 물리적 실체를 형성하는 것, 성분을 전단(shear) 또는 단편화하는 것, 성분을 분리 또는 정제하는 것, 2개 이상의 개별 실체를 혼합물로 조합하는 것, 공유 결합이나 비-공유 결합의 절단 또는 형성을 포함하는 화학 반응을 수행하는 것을 포함한다. 값을 직접적으로 획득하는 것은, 검체 또는 또 다른 성분에서 물리적 변화를 포함하는 과정을 수행하는 것, 예를 들어, 성분, 예를 들어, 검체, 분석물 또는 시약에서 물리적 변화를 포함하는 분석 과정(본원에서는 종종 "물리적 분석"으로 지칭됨)을 수행하는 것을 포함한다.

간접적으로 획득되는 정보는 보고서 형태로 제공될 수 있는데, 예를 들어, 종이 또는 전자 형태로, 예컨대 온라인 데이터베이스 또는 어플리케이션("App")으로부터 공급될 수 있다. 보고서 또는 정보는 예를 들어, 의료 기관, 예컨대 병원 또는 클리닉; 또는 의료인, 예컨대 의사나 간호사에 의해 제공될 수 있다.

본 발명의 일 구현예는 약제학적으로 허용가능한 담체 및 치료적 유효량의 항체 또는 조작된 항체-유사 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

2. 항체-유사 결합 단백질의 용도

본 발명의 항체 또는 조작된 항체-유사 결합 단백질은 하나 이상의 표적 항원의 검출 및 정량화를 위한 임의의 공지된 분석 방법, 예컨대 경쟁적 결합 분석법, 직접 및 간접 샌드위치 분석법 및 면역침전 분석법에 적용될 수 있다. 항체 또는 조작된 항체-유사 결합 단백질은, 적용되는 분석 방법에 적절한 친화성으로 하나 이상의 표적 항원에 결합할 것이다.

진단용 적용을 위해, 소정의 구현예에서, 조작된 항체-유사 결합 단백질은 검출가능한 모이어티로 표지될 수 있다. 검출가능한 모이어티는 검출가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 생성할 수 있는 임의의 모이어티일 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티는, 방사성표지, 방사성동위원소, 방사성핵종, 영상제, 치료제 또는 진단제, 예컨대 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ¹²⁵I, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹⁸F, ¹¹C, ⁶⁸Ga, ⁶⁴Cu, ⁸⁹Zr, ¹²⁴I 또는 ⁶⁷Ga; 형광 또는 화학발광 화합물, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린; 또는 효소, 예컨대 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)일 수 있다.

적절한 리포터 모이어티는 특정한 영상 기술(예를 들어, PET 영상용 ¹⁸F/¹¹C/⁶⁸Ga/⁶⁴Cu/⁸⁹Zr/¹²⁴I 방사성표지된 리포터, SPECT 영상용 ^99mTc/¹¹¹In 표지된 리포터, 광학 영상용 형광 염료-표지된 리포터, 또는 MRI용 상자성 물질-표지된 리포터)에 의해 검출될 수 있다. 항체 또는 항체-유사 결합 단백질의 생물학적 반감기와 방사성표지의 물리적 반감기 간에 적절한 매치가 이루어질 것이 권고된다(표 1 참조).

영상 동반 진단적 프로브 또는 항체-유사 결합 단백질의 개발은 본질적으로, 약물 발견(예를 들어, 표적 프로브를 이용한 출발, 방사선량 측정법, 양호한 실험실 수행 독성 연구(good laboratory practices toxicity study), 양호한 제작 수행 생산(good manufacturing practice production), 예비임상 평가, 표적 프로브의 예비임상 입증 및 임상 평가)과 유사한 과정을 필요로 한다. 평가될 부가적인 파라미터는, 추적자 투여에 대한 영상의 최적 시점, 생체 외 분석과의 상관관계, 추적자 바이오분포 및 표적 특이성(방사성표지된 비-관련성 단편을 이용해 테스트됨)이다. 일단 완전히 개발되고 나면, 분자적 영상 프로브는 특정 약물 또는 제제에 대한 분자적 영상 동반 진단제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 조작된 항체-유사 결합 단백질은 또한, 생체 내 영상에 유용하다. 검출가능한 모이어티로 표지된 항체-유사 결합 단백질은 동물에게, 바람직하게는 혈류 내로 투여될 수 있으며, 숙주에서 표지된 항체의 존재 및 위치가 분석될 수 있다. 항체-유사 결합 단백질은, 핵 자기 공명, 양전자단층촬영 또는 당해 기술분야에 공지된 다른 검출 수단에 의해, 동물에서 검출가능한 임의의 모이어티로 표지될 수 있다.

생체 내 영상 기술은, 조직에서 CA6 글리코토프의 발현 수준을 평가하기 위해, 종양 조직과 같은 조직을 영상화하는 데 이용될 수 있다. 조직에서 CA6의 발현 수준을 측정하는 것은, 예를 들어, 암 환자와 같은 환자가 CA6 글리코토프를 표적으로 하는 약물을 이용한 치료의 양호한 후보일 것인지 결정하는 데 유용하다. 예를 들어, 항체-유사 결합 단백질은 huDM6-DM4 세포독성제에 대한 동반 진단제로서 유용하다.

일 구현예에서, 환자는 huDM6-DM4와 같은 CA6-표적화 분자를 이용한 치료를 위해 평가된다. 환자는 예를 들어, 종양 조직(예를 들어, 조직 생검)과 같은 병든 조직에서 CA6의 발현 수준에 관한 정보를 획득함으로써 평가되며, CA6의 발현 수준이 대조군 발현 수준의 10%보다 높은(예를 들어, 대조군 수준보다 10%, 20%, 30%, 40% 이상 더 크거나 동일한) 것으로 결정되는 경우, 환자는 CA6-표적화 분자를 이용한 치료의 양호한 후보인 것으로 결정된다. CA6-표적화 분자를 이용한 치료의 양호한 후보인 환자는 분자를 이용한 치료에 긍정적으로 반응하는 것으로 예상된다. CA6 발현 수준이 적절하지 않은 환자, 예를 들어 참조 표준과 비교해 10% 미만의 CA6 발현을 가진 환자는 CA6-표적화 분자를 이용한 치료의 양호한 후보가 아닌 것으로 결정된다.

일 구현예에서, 개체의 조직에서 CA6의 발현 수준은, 예컨대 서비스-제공자, 예컨대 병원이나 클리닉 또는 의사 사무실과 같은 의료 기관, 또는 의사나 간호사와 같은 의료 전문가, 또는 보험 제공업체, 또는 데이터베이스로부터 간접적으로 획득된다. 또 다른 구현예에서, CA6의 발현 수준은, 본 발명에서 특징지어지는 항체-유사 결합 단백질을 개체에게 투여하고 바이오영상 기술에 의해 CA6의 발현 수준을 측정하는 것과 같이, 직접적으로 측정된다.

CA6-표적화 분자를 이용한 치료의 양호한 후보인 것으로 결정된 환자는 선택적으로는, CA6-표적화 분자를 추가로 투여받을 수 있다. 일부 구현예에서, CA6 표적화 분자로 치료받는 환자는, CA6 발현 수준이 CA6 표적화 분자를 이용한 치료 후에 변하는지(예를 들어, 감소하는지) 결정하기 위해, CA6 표적화 분자를 투여받은 후 간격을 두고(예를 들어, 매주, 격주, 매달, 격달로) 모니터링될 것이다. 소정의 시간 후, 또는 환자가 부작용을 나타낸 후, 병든 조직에서 CA6 발현 수준이 변하지 않은 채로 있다면, CA6-표적화 분자를 이용한 치료를 중단할 것인지 또는 계속할 것인지 결정할 수 있다.

일 구현예에서, 환자는 huDM6-DM4와 같은 CA6 표적화 분자를 이용한 치료 동안에 모니터링된다. 환자는 예를 들어, CA6 표적화 분자의 투여 또는 huDM6-DM4와 같은 CA6 표적화 분자를 이용한 치료 후에, 종양 조직과 같은 병든 조직에서 CA6의 발현 수준에 관한 정보를 획득함으로써 모니터링되며, CA6의 발현 수준이 대조군 발현 수준의 10%보다 높은(예를 들어, 대조군 수준보다 10%, 20%, 30%, 40% 이상 더 높거나 동일한) 것으로 결정되는 경우, 환자는 CA6-표적화 분자를 이용한 계속된 치료의 양호한 후보인 것으로 결정된다. A6의 발현 수준이 huDM6-DM4와 같은 CA6 표적화 분자를 이용한 치료 동안에 감소된 것으로 결정되는 경우, 환자는 이 분자를 이용한 치료에 긍정적으로 반응한 것으로 결정되며, huDS6-DM4를 이용한 치료는 계속되어야 한다. CA6 발현 수준이 적절하지 않은 환자, 예를 들어 참조 표준과 비교해 10% 미만의 CA6 발현을 가진 환자, 또는 CA6 발현 수준이 증가된 환자는 CA6-표적화 분자를 이용한 계속된 치료의 양호한 후보가 아닌 것으로 결정된다.

본원에 개시되는 발명은 또한, 생물학적 검체에서 표적 항원 수준을 검출하는 데 유용한 항체-유사 결합 단백질 및 다른 시약을 포함하는 키트에 관한 것이다. 이러한 시약은 검출가능한 표지, 차단용 혈청(blocking serum), 양성 및 음성 대조군 검체, 및 검출 시약을 포함할 수 있다.

4. 조작된 항체-유사 결합 단백질 조성물 및 이의 투여

조작된 항체-유사 결합 단백질을 포함하는 조성물은 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 진단적, 치료학적 또는 약제학적 조성물은, 진단적 유효량 또는 치료적 유효량의 항체-유사 결합 단백질 또는 항체-유사 결합 단백질-약물 컨쥬게이트를, 투여 방식과의 적합성을 위해 선택된 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 제형과 함께 포함할 수 있다.

허용가능한 제형 물질은 바람직하게는, 적용되는 투약량 및 농도에서 수여자에게 무독성이다.

진단적 또는 약제학적 조성물은, 예를 들어, 조성물의 pH, 삼투성, 점도, 투명도(clarity), 색상, 등장성, 냄새, 멸균성, 안정성, 해리 또는 방출 속도, 흡수율 또는 침투도를 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형 물질을 포함할 수 있다. 적합한 제형 물질로는, 아미노산(예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신), 항미생물제, 항산화제(예컨대, 아스코르브산, 소듐 설파이트 또는 소듐 하이드로겐-설파이트), 완충제(예컨대, 보레이트, 바이카르보네이트, Tris-HCl, 시트레이트, 포스페이트 또는 다른 유기 산), 벌킹제(예컨대, 만니톨 또는 글리신), 킬레이트제(예컨대, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA)), 착화제(예컨대, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린 또는 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린), 충진제, 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물(예컨대, 포도당, 만노스 또는 덱스트린), 단백질(예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린), 착색제, 방향제 및 희석제, 유화제, 친수성 폴리머(예컨대, 폴리비닐피롤리돈), 저분자량 폴리펩타이드, 염-형성 반대이온(예컨대, 나트륨), 방부제(예컨대, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 하이드로겐 퍼옥사이드), 용매(예컨대, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜), 당 알코올(예컨대, 만니톨 또는 소르비톨), 현탁제, 계면활성제 또는 습윤제(예컨대, 플루로닉스(pluronics); PEG; 소르비탄 에스테르; 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80; 트리톤; 트로메타민; 레시틴; 콜레스테롤 또는 타일록사팔(tyloxapal)), 안정성 증강제(예컨대, 설탕 또는 소르비톨), 장성 증강제(tonicity enhancing agent)(예컨대, 알칼리 금속 할라이드(바람직하게는 소듐 클로라이드 또는 포타슘 클로라이드) 또는 만니톨 소르비톨), 전달 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 약제학적 보조제(예를 들어, 임의의 목적을 위해 원용에 의해 본 명세서에 포함된 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), 및 동일 문헌의 후속 편집본 참조)를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

최적의 진단적 또는 약제학적 조성물은 예를 들어, 의도되는 투여 경로, 전달 포맷 및 원하는 투약량에 따라 당업자에 의해 결정될 것이다. 이러한 조성물은 항체-유사 결합 단백질의 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출 경로 및 생체 내 청소 경로에 영향을 미칠 수 있다.

진단적 또는 약제학적 조성물에서 일차적인 비히클 또는 담체는 자연상에서 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들어, 주사에 적합한 비히클 또는 담체는 물, 생리 식염수 또는 인공 뇌척수액일 수 있으며, 가능한 경우 비경구 투여용 조성물에 보편적인 다른 물질이 보충될 수 있다. 중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민이 혼합된 식염수는 다른 예시적인 비히클이다. 다른 예시적인 약제학적 조성물은 pH 약 7.0 내지 8.5의 Tris 완충제, 또는 pH 약 4.0 내지 5.5의 아세테이트 완충제를 포함하며, 이는 소르비톨 또는 적절한 대용제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 조작된 항체-유사 결합 단백질 조성물은, 원하는 순도를 가진 선택된 조성물을 동결건조된 케이크(cake) 또는 수용액 형태의 선택적인 제형화제(formulation agent)와 함께 혼합함으로써 보관용으로 제조될 수 있다. 나아가, 항체-유사 결합 단백질은 설탕과 같은 적절한 부형제를 사용하여 동결건조물로서 제형화될 수 있다.

본 발명의 진단적 또는 약제학적 조성물은 비경구 전달용으로 선택될 수 있다. 다른 예로, 조성물은 흡입용으로 선택되거나, 또는 경구와 같은 소화관을 통한 전달을 위해 선택될 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용가능한 조성물의 제조는 당해 기술분야에 포함된다.

제형 구성성분은 투여 부위에 허용가능한 농도로 존재한다. 예를 들어, 완충제는 조성물을 생리학적 pH 또는 약간 더 낮은 pH, 전형적으로 pH 약 5 내지 약 8의 범위로 유지시키는 데 사용된다.

비경구 투여가 고려되는 경우, 본 발명에 사용하기 위한 진단적 또는 치료학적 조성물은, 약제학적으로 허용가능한 비히클에 원하는 항체-유사 결합 단백질을 포함하는, 발열물질-무함유의, 비경구적으로 허용가능한 수용액 형태일 수 있다. 비경구 주사에 특히 적합한 비히클은, 항체-유사 결합 단백질이 멸균된 등장성액으로서 제형화되어 적절하게 보존되는, 멸균 증류수이다. 보다 다른 제조 방법은, 생성물의 조절성 방출 또는 서방성 방출을 제공하는 주사용 미소구체, 생물부식성(bio-erodible) 입자, 폴리머 화합물(예컨대, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포좀과 같은 제제를 이용해 원하는 분자를 제형화하는 것을 수반할 수 있으며, 이는 데폿 주사(depot injection)를 통해 전달될 수 있다. 히알루론산 또한 사용될 수 있으며, 이는 순환 시 지속 기간(sustained duration)을 촉진하는 효과를 가질 수 있다. 원하는 분자를 도입하기 위한 다른 적합한 수단은 이식형 약물 전달 디바이스를 포함한다.

일 구현예에서, 진단적 또는 약제학적 조성물은 흡입용으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 조작된 항체-유사 결합 단백질은 흡입용 건조 분말로서 제형화될 수 있다. 항체-유사 결합 단백질 흡입액은 또한, 에어로졸 전달용 추진제를 이용해 제형화될 수 있다. 보다 다른 구현예에서, 용액은 분무될 수 있다.

또한, 소정의 제형은 경구로 투여될 수 있는 것으로 고려된다. 본 발명의 일 구현예에서, 이러한 방식으로 투여되는 항체-유사 결합 단백질은 정제 및 캡슐과 같은 고체 투약 형태의 컴파운딩(compounding)에 통상 사용되는 담체와 함께 제형화되거나 또는 담체 없이 제형화될 수 있다. 예를 들어, 캡슐은, 생체이용률이 최대화되고 예비-전신적 분해가 최소화되는 경우, 위장관 내 해당 지점에서 제형의 활성 부위를 방출시키도록 설계될 수 있다. 부가적인 제제는 항체-유사 결합 단백질의 흡수를 촉진하도록 포함될 수 있다. 희석제, 방향제, 저 용융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁제, 정제 붕괴제 및 결합제가 또한 적용될 수 있다.

또 다른 진단적 또는 약제학적 조성물은, 정제의 제조에 적합한 무독성 부형제와 함께 혼합물에서 항체-유사 결합 단백질을 유효량으로 포함할 수 있다. 정제를 멸균수 또는 다른 적절한 비히클에 용해시킴으로써, 용액은 단위-투약 형태로 제조될 수 있다. 적합한 부형제로는, 불활성 희석제, 예컨대 칼슘 카르보네이트, 소듐 카르보네이트나 소듐 바이카르보네이트, 락토스 또는 칼슘 포스페이트; 또는 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 또는 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탈크를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

항체-유사 결합 단백질을 서방성-전달 또는 조절성-전달 제형에 포함하는 제형을 비롯한 본 발명의 부가적인 진단적 또는 약제학적 조성물은 당해 기술분야의 당업자에게 명백해질 것이다. 여러 가지 다른 서방성-전달 수단 또는 조절성-전달 수단, 예컨대 리포좀 담체, 생물부식성 미세입자 또는 다공성 비드 및 데폿 주사를 제형화하는 기술 또한 당해 기술분야의 당업자에게 알려져 있다. 서방성 방출 조제물의 부가적인 예는 성형된 물품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태에 반투과성 폴리머 매트릭스를 포함한다. 서방성 방출 매트릭스는 폴리에스테르, 하이드로겔, 폴리락타이드, L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 에틸렌 비닐 아세테이트 또는 폴리-D(-)-3-하이드록시부티르산을 포함할 수 있다. 서방성 방출 조성물은 또한, 당해 기술분야에 공지된 몇몇 방법들 중 임의의 방법으로 제조될 수 있는 리포좀을 포함할 수도 있다.

생체 내 투여에 사용되는 본 발명의 진단적 또는 약제학적 조성물은 전형적으로 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조되는 경우, 이 방법을 이용한 멸균은 동결건조화 및 재구성화 이전 또는 이후에 수행될 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 동결건조된 형태로 보관되거나 또는 용액에 보관될 수 있다. 또한, 비경구 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 가진 용기, 예를 들어, 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼(stopper)를 가진 정맥 용액용 백 또는 바이얼에 위치된다.

일단 진단적 또는 약제학적 조성물이 제형화되면, 이는 용액, 현탁액, 젤, 에멀젼, 고체로서 멸균 바이얼에 보관되거나, 또는 탈수 또는 동결건조된 분말로서 멸균 바이얼에 보관될 수 있다. 이러한 제형은 즉시 사용가능한 형태, 또는 투여 전에 재구성될 필요가 있는(예를 들어, 동결건조된) 형태로 보관될 수 있다.

본 발명은 또한, 단일-용량 투여 단위를 제조하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 각각, 건조된 단백질을 가진 제1 용기, 및 수성 제형을 가진 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 범위에는 또한, 단일-챔버형 및 다중-챔버형의 예비-충진된 주사기(예를 들어, 액체 주사기 및 동결주사기(lyosyringe))를 포함하는 키트가 포함된다.

본 조성물은 또한, 막, 스폰지 또는 다른 적절한 물질 상에 원하는 분자가 흡수되거나 또는 캡슐화된 상기 막, 스폰지 또는 다른 적절한 물질의 이식을 통해 국소적으로 투여될 수 있다. 이식 기구가 사용되는 경우, 이 기구는 임의의 적합한 조직 또는 기관 내로 이식될 수 있으며, 원하는 분자의 전달은 확산, 정기-방출성 볼루스(timed-release bolus) 또는 연속 투여를 통해 이루어질 수 있다.

실시예

하기의 실시예는 본 발명의 특정 구현예 및 이의 다양한 용도를 예시한다. 이들은 단지 설명을 위해 제시되어 있을 뿐이며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로 제한하려는 것으로 간주되어서는 안된다.

실시예 1: 인간화된 DS6 모노클로날 항체 및 DS6-DM4의 방사성표지화 및 시험관 내 특징화

임상적으로 유용한 분자적 영상제는 투여 후 합리적인 시간 이내에 높은 대조 영상을 생성하며, 종양 침투를 나타내며, 보다 신속한 청소율 카이네틱스를 가지고, 우수한 종양 : 혈액 비를 나타낸다. 바이오영상에서 본래의 천연 항체를 사용한 카비트(caveat)는 종양 취득(uptake) 및 혈액 청소의 카이네틱스가 본래 느리며; 이들은 또한, 높은 백그라운드를 가지는 경향이 있으며, 종양에 대해 선명한 영상을 수득하기 위해서는 오랜 시간(수시간 내지 수일)을 필요로 한다.

바이오-영상과 조합된 방사성표지된 추적자는 예비임상 종양 모델을 임상 설정으로 전환(translation)시킬 수 있는 것으로 이미 나타난 바 있다(Williams et al., 2008, Cancer Biother and Radiopharm 23(6):797; Liu et al.,(2009) Mol Imaging Biol 12:530). 본 발명자들은 추가로, 방사성표지된 DS6 항체 및 DS6-DM4가 마우스에서 WISH 이종이식 종양을 효과적으로 표적화하였음을 나타내었다. 이들 결과를 토대로, 최적화된 약물동력학을 위해 3개의 조작된 항체-유사 결합 단백질을 영상 기재의 동반 진단제로서 개발하였다.

실시예 2: DS6 조작된 B- Fab의 발현

상응하는 구축물의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 발현 플라스미드를 대장균 DH5α 세포에서 증식시켰다. 형질감염에 사용된 플라스미드는, Qiagen EndoFree 플라스미드 메가 키트(B-Fab 항체-유사 결합 단백질에 대한 폴리펩타이드 및 DNA 서열은 표 2에 기재되어 있음)를 사용하여 대장균으로부터 제조하였다.

DS6 항체-유사 결합 단백질 B-Fab는 FreeStyle F17 배지(Invitrogen)에서 HEK293 세포의 일시적인 형질감염에 의해 제조하였다. 형질감염시킨 지 7일 후에, 상층액을 수집하고, 원심분리 및 0.2 ㎛ 여과 처리하여, 입자를 제거하였다. 정제는 KappaSelect(GE Healthcare) 상에서의 포착(capture)에 의해 수행하였다. KappaSelect 컬럼에 결합시킨 후, 컬럼을 PBS 또는 HEPES 완충제(50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.2, FP12016)로 세정한 다음, 0.1 M 글리신(pH 2.5)을 사용하여 용출시키고, 1 M Tris/HCl pH 9를 사용하여 중화시켰다. 정제 연마 단계는 PBS 또는 HEPES 완충제(50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.2, FP12016)와 함께 Superdex 200(GE Healthcare)를 사용한 크기 배제 크로마토그래피로 구성되었다. 연마 단계 후, 정제 생성물을 한외 여과에 의해 농축시키고, 마지막으로 DS6 B-Fab를 0.22 ㎛ 막을 사용하여 멸균 여과하였다.

단백질 농도는 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 측정하였다. 각각의 배치를 환원 및 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 분석하여, 각각의 서브유닛 및 모노머의 순도 및 분자량을 측정하였다. 정제된 DS6 B-Fab의 품질은 하기 기술된 분석 방법에 의해 검토하였다.

실시예 3: DS6 항체를 기재로 한 조작된 항체-유사 결합 단백질의 개발

huDS6-DM4를 위한 영상 기재의 동반 진단적 항체-유사 결합 단백질을 개발하기 위해, 인간화된 DS6 모노클로날 항체 유래의 CA6 결합 서열을 기재로 하는 3개의 조작된 항체-유사 결합 단백질(B-Fab, 도 1 참조)을 제조하였다. 3개의 조작된 항체-유사 결합 단백질 각각을 하기 기술된 바와 같이 정제하고 테스트하였으며; 그 결과를 표 3에 나타낸다. 바람직한 특징은, HPLC 또는 SDS-PAGE에 의한 95% 초과의 순도, 약 10 mg/mL의 농도, 안정한 펩타이드, DS6 항체와 유사한 결합, 및 폴리-히스티딘(6x-His) 태그의 존재가 PET 추적자에 영향을 미치는가의 여부에 대해 결정하는 것을 포함한다. 부가적인 선별 범주는, 5%ID/g 초과의 종양 신호; 종양 : 근육 비 3:1; 효율적인 신장 청소율; 및 차단되지 않은 취득과 차단된 취득 간의 통계적으로 유의한 차이(p<0.05)를 포함한다(방사성표지된 킬레이트화된 B-Fab에 대한 품질 기준에 대한 요약은 표 4를 참조).

(G4S)₂ 링커를 포함하며 6x-His 태그는 포함하거나 또는 포함하지 않는 B-Fab 항체는, CA6 결합 서열이 기재로 하는 대조군 DS6 모노클로날 항체와 유사한 결합 효율성을 유지한 것으로 결정되었다. 정제된 항체-유사 결합 단백질 각각의 품질은 하기의 분석 방법에 의해 검토하였다:

a) 분석적 크기-배제 크로마토그래피(SEC)

분석적 SEC는 TSKgel G3000SWXL 컬럼(7.8mm x 30cm) 및 TSKgel SWXL 가드 컬럼(Tosoh Bioscience)이 장착된 AKTA explorer 10(GE Healthcare)을 사용하여 수행하였다. 분석은 250 mM NaCl, 100 mM Na-포스페이트 pH 6.7을 사용하여 1 mL/min으로 진행하였으며, 280 nm에서 검출하였다. 단백질 검체(0.5 mg/mL 내지 1 mg/mL) 30 ㎕를 컬럼 상에 적용하였다. 분자 크기의 평가를 위해, 컬럼을 겔 여과 표준 혼합물(MWGF-1000, SIGMA Aldrich)을 사용하여 보정한다. 데이터 평가는 UNICORN 소프트웨어 v5.11을 사용하여 수행하였다.

b) LC-MS에 의한 고유 질량 분석(intact mass analysis)

각각의 검체를 0.01 mg/mL 농도로 희석시킨 다음, DTT(최종 10 mM)를 첨가함으로써 환원시켰다. 분리 전에, 검체를 20분 동안 가두고(trap), 모노리식(monolithic) 트랩 컬럼 상에서 2% 아세토니트릴 / 0.1% TFA(v/v)를 이용해 20 ㎕/min 속도로 탈염시킨 후, 15% 용출제 A(H₂O / 0.05% TFA) 내지 50% 용출제 B(아세토니트릴 / 0.05% TFA) 범위의 구배를 이용해 용출시켰다.

37℃에서 모노리식 컬럼(PSDVB; 100 ㎛ I.D. x 5 cm) 상에서 나노플로우(300 nL/min)에서 작동시켜, 각각의 검체를 분리하였다. 각각의 검체의 도입은, 외경이 365 ㎛이며 내경이 75 ㎛이고 말단 팁 직경이 15 ㎛인 새로운 물체로부터의 전기분무 바늘을 시스 가스(sheath gas)와 함께 사용하여, 수행하였다. QStar XL 상에서 획득한 후, 스펙트럼을 상응하는 시간 범위에 걸쳐 합계하였으며, Applied Biosystems/MDS Sciex사의 BioAnalyst와 함께 전달되는 단백질 재구성 툴을 사용하여 디콘볼루션(deconvolution)하였다.

c) LC-MS를 이용한 펩타이드 질량 핑거프린트 분석에 의한 단백질 확인

목적하는 레인(lane)을 눌러서 꺼낸 후, 카르바미도메틸화하고, 엔도프로테나제 트립신을 사용하여 분해하였다. 후속해서, 검체를 OrbiTrap XL 질량 분광계를 사용하여 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 수득된 스펙트럼을, 주어진 구축물이 첨가된 사용자 정의 데이터베이스 Swiss-Prot PP, 뿐만 아니라 모든 화학종이 첨가된 데이터베이스 Swiss-Prot과 비교하였다.

3개의 조작된 DS6-기재의 항체-유사 결합 단백질 각각을 경질 산 양이온 킬레이터 DOTA(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산)에 화학적으로 컨쥬게이트시키고, ⁶⁴Cu로 방사성표지한 후, 예비임상 종양 모델에서 생체 내 PET 바이오-영상 실험 및 시험관 내 세포 결합 분석법에 사용하여, 3개의 조작된 DS6-기재의 항체-유사 결합 단백질 각각을 특징화하였다. 각각의 조작된 항체에 대한 활성 및 실험 데이터에 대한 요약은 표 5 및 도 2 내지 도 4에서 확인할 수 있다.

상기 항체-유사 결합 단백질 및 이들의 상응하는 DOTA 컨쥬게이트(1.5 내지 2.5 DOTA/단편)는 모두 CA6 양성 세포(WISH 세포주)에 대해 높은 친화성(K_d = 4 nM 내지 20 nM)을 가졌으며, 이는, DOTA 유도체화가 항원에 대한 친화성에 악영향을 미치지 않음을 의미한다. 단편은 CA6 음성 세포(A2780 세포주)에 대해 낮은 친화성을 가졌다. ⁶⁴Cu 표지된 제제를, 인간 혈청 안정성 연구, 및 WISH 또는 A2780 피하 종양을 가진 누드 마우스에서의 생체 내 영상 및 24-시간 바이오분포 연구에서 평가하였다. ⁶⁴Cu-DOTA-B-Fab는 고 수율(RCY - 80%, SA - 55 GBq/μmole, 99% 초과의 순도)로 합성되었으며, 24시간 혈청 안정성 테스트에서 양호한 결과(94±5%, n=3)를 제공하였다. 이종이식 종양을 가진 마우스에서의 생체 내 바이오분포 실험(표 6 참조)은 상대적으로 높은 WISH 종양 취득(7.6±0.87%ID/g, n=4, 20 mg 내지 206 mg) 및 낮은 A2780 종양 취득(5.1±0.92%ID/g, n=3, 50 mg 내지 270 mg)을 나타내었으며, 높은 종양/근육 비(8.7:1), 종양/혈액 비(3.6:1) 및 양성/음성 종양 비(1.8, p<0.05, n=7)와 조합되었다. 신장(62±4%ID/g) 및 간(10±0.75%ID/g)은 종양 취득을 능가하였다.

⁶⁴Cu-DOTA-B-Fab는, WISH를 가진 종양 동물에서 생체 내 차단 연구를 통해 특이성에 대해 추가로 평가하였다. 방사성표지제의 투여 전 각각 2.5시간 또는 25시간째에 B-Fab(2 mg, n=5) 또는 DS6(1 mg, n=4)를 투여함으로써 차단을 수행하였다. B-Fab 차단은 WISH 종양 취득을 23%(p<0.05, n=8) 감소시켰으며, 한편 DS6 차단은 26%(p<0.05, n=7) 감소시켰다. 대조군 종양(n=3)은 이 연구에서 차단되지 않았다. 이들 예비임상 연구는, ⁶⁴Cu-DOTA-B-Fab가 환자에서 huDS6-DM4에 대한 적합한 동반 진단제임을 제시한다.

실시예 4: 예비임상 종양 모델에서 개발된 조작된 항체의 생체 내 PET 연구

a) B- Fab(G4S) ₂ 링커 및 C-말단 6x-His 태그

B-Fab 1151은, L1 및 L2 링커 둘 모두를 GGGGSGGGGS((G4S)₂)(SEQ ID NO: 3)로서 포함하고 발현된 C-말단 6x-His 태그를 포함하는 DS6-기재의 조작된 항체-유사 결합 단백질이다. 단백질을 IMAC 및 SEC에 의해 정제하였으며, 시험관 내 결합 용액을 PBS에서 1.8 mg/ml 농도로 제조하였고, 결합 친화성은 WISH CA6+ 세포주에서 유세포분석을 이용해 특징화하였다(도 2c 및 도 2d).

b) B- Fab(G4S) ₂ 링커

B-Fab 1153은, L1 및 L2 링커 둘 모두를 (G4S)₂로서 포함하고 C-말단 6x-His 태그를 포함하지 않는 DS6-기재의 조작된 항체-유사 결합 단백질이다. 이 단백질은 His 태그를 포함하지 않기 때문에, 단백질을 IMAC, 카파-셀렉트(Kappa-select) 및 SEC에 의해 정제하였다. 시험관 내 결합 용액을 PBS에서 1.6 mg/ml 농도로 제조하였고, 결합 친화성은 WISH CA6+ 세포주에서 유세포분석을 이용해 특징화하였다(도 3c 및 도 3d).

c) B- Fab G4S 링커 및 C-말단 6x-His 태그

B-Fab 1152는 L1 및 L2 링커 둘 모두를 G4S의 단일 복사체로서 포함하고 C-말단 6x-His 태그를 포함하는 DS6-기재의 조작된 항체-유사 결합 단백질이다. 단백질을 IMAC 및 SEC에 의해 정제하고, 시험관 내 결합 용액을 PBS에서 1.8 mg/ml 농도로 제조하였고, 결합 친화성은 WISH CA6+ 세포주에서 유세포분석을 이용해 특징화하였다(도 4c 및 도 4d).

실시예 5: DOTA를 포함하는 DS6 및 DOTA를 포함하지 않는 DS6에 대한 시험관 내 결합 결과

DOTA 컨쥬게이션이 DS6 활성을 변경시키지 않는다는 것을 보여주기 위해, DS6 항체-유사 결합 단백질 및 DOTA-DS6 컨쥬게이트된 항체의 결합을 CA6 양성 WISH 세포주 및 CA6 음성 A2780 세포주 상에서 시험관 내에서 테스트하였다. 형광 활성화된 세포 소팅 실험 결과, DOTA 컨쥬게이션은 CA6 양성 WISH 세포에서 DS6 결합을 변경시키지 않는다는 것으로 결정되었다(도 5 참조).

실시예 6: ⁶⁴ Cu - DOTA -DS6 B- Fab 항체-유사 결합 단백질의 방사성표지화 및 안정성

구리-64로 표지된 DOTA 컨쥬게이트된 DS6 B-Fab를 사용한 인간 혈청 안정성 연구 및 24-시간 바이오분포 연구를 CA6 양성(WISH) 또는 CA6 음성(A2780) 피하 종양을 가진 누드 마우스에서 수행하였다. 방사화학 연구는, ⁶⁴Cu-DOTA-DS6 B-Fab 조작된 항체-유사 결합 단백질이 약 30%의 방사화학 수율, 95% 초과의 방사화학 순도, 및 1.9 Ci/μmole의 비 방사능을 가짐을 보여준다(도 6a 참조). ⁶⁴Cu-DOTA-DS6 B-Fab 항체-유사 결합 단백질의 혈청 안정성 실험을 37℃, 인간 혈청에서 24시간 동안 수행하였으며, 0시간째에 97.2%의 활성 및 24시간째에 96.3%의 활성을 보여주며, 이는 24시간 후에 활성이 유의미하게 손실되지 않음을 의미한다(도 6b 참조).

실시예 7: 상이한 스캐폴드를 가진 항체-유사 결합 단백질간의 비교

상기 기술된 B-Fab 항체-유사 결합 단백질의 특성을 CA6에 특이적으로 결합하는 이중항체의 특성과 비교하여, 어떤 스캐폴드가 영상 동반 진단제로서 사용되기에 가장 적합한지 평가하였다. 호모다이머를 형성하는 해당 항-CA6 이중항체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 12(표 7)로 제시되어 있다. 일부 실험에서, 해당 호모다이머 이중항체는 GGC 태그, SEQ ID NO: 13의 태그 및 SEQ ID NO: 14의 태그로 이루어진 군으로부터 선택되는 C-말단 태그를 추가로 포함하였다.

도 7에 도시된 바와 같이, 이중항체는 B-Fab 항체-유사 결합 단백질의 스캐폴드와 상이한 스캐폴드를 가진다. 예를 들어, 이중항체는 임의의 C_L 또는 임의의 C_H1 도메인을 포함하지 않는다.

결과는 하기 표 8A 내지 표 8C에 제시되어 있다. 이들 결과는, SEQ ID NO: 14의 태그에 융합된 SEQ ID NO: 12의 이중항체를 B-Fab 1153((G4S)2 링커를 포함하지만 His-태그는 포함하지 않음)과 비교함으로써 수득하였다.

이들 결과로부터, B-Fab는 동반 진단제로서 사용되는 데 있어서 이중항체보다 양호하다고 결론지을 수 있다. 예를 들어, 이중항체는 혈장 안정성 분석법 및 온도 스트레스 분석법에서 분해된 반면, B-Fab는 두 분석법 모두에서 안정하였다.

본 발명은 다양한 구현예들과 관련하여 기술되긴 하였지만, 변이 및 변형이 당해 기술분야의 당업자에 의해 이루어질 것으로 이해된다. 따라서, 첨부된 청구항은, 청구되는 본 발명의 범위에 속하는 이러한 등가 변이를 모두 망라하는 것으로 의도된다. 또한, 본원에 사용되는 단락 서두는 단지 구성상 목적을 위한 것이며, 기술되는 주제를 제한하고자 하는 것이 아니다.

본원에서 기술되는 각각의 구현예는 명백하게 다르게 지시되지 않는 한, 임의의 다른 구현예 또는 구현예들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 또는 유리한 것으로 언급되는 임의의 특징 또는 구현예는, 명백하게 다르게 지시되지 않는 한, 바람직하거나 또는 유리한 것으로 언급되는 임의의 다른 특징이나 특징들 또는 구현예나 구현예들과 조합될 수 있다.

본 출원에서 인용되는 모든 참조문헌은 원용에 의해 본 명세서에 표현되어 포함된다.

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aaggtggaac ccaagagctg cgacaagacc cacacc 1056 <210> 11 <211> 1113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 11 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccacag ccaccggcgt gcactctgag 60 gcccagctgg tgcagtctgg cgctgaggtg gtcaagcctg gggccagcgt gaagatgagc 120 tgcaaggcca gcggctacac cttcaccagc tacaacatgc actgggtcaa gcagacccca 180 gggcagggcc tggaatggat tggctacatc taccccggca acggcgccac caactacaac 240 cagaagttcc agggcaaggc taccctgacc gccgacccta gcagcagcac cgcctacatg 300 cagatcagca gcctgaccag cgaggacagc gccgtgtact tctgcgccag aggcgacagc 360 gtgcccttcg cctattgggg ccagggcacc ctggtcacag tgtctgctgg tggcggagga 420 tccggcggag gcggaagcga agcccagctc gtccagagcg gagccgaggt cgtgaaacca 480 ggcgcctctg tgaagatgtc ttgcaaggcc tctggctata cctttacctc ctataatatg 540 cattgggtca aacagacacc tggacaggga ctcgagtgga tcggatatat ctatcctgga 600 aatggggcca caaattacaa tcagaaattt caggggaaag ccacactgac agccgatccc 660 agctcctcca cagcctatat gcagattagc tctctgacct ccgaggactc cgccgtgtat 720 ttttgtgccc ggggagactc cgtgcctttt gcttactggg gacagggcac actcgtgaca 780 gtgtccgccg cttccaccaa gggcccctcc gtgtttcctc tggcccccag cagcaagagc 840 acctctggcg gaacagccgc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgagcccgtg 900 accgtgtctt ggaactctgg cgccctgacc tccggcgtcc acacctttcc agccgtgctg 960 cagagcagcg gcctgtactc tctgagcagc gtcgtgaccg tgcccagcag cagcctgggg 1020 acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaag 1080 gtggaaccca agagctgcga caagacccac acc 1113 <210> 12 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 12 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala His Ser Ser Val Ser Phe Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Gly Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Phe Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Glu Ala Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro 115 120 125 Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 130 135 140 Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu 145 150 155 160 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Gln 165 170 175 Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Pro Ser Ser Ser Thr 180 185 190 Ala Tyr Met Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 195 200 205 Phe Cys Ala Arg Gly Asp Ser Val Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 225 230 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 13 Gly Gly His His His His His His 1 5 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 14 Gly Gly Cys Gly Gly His His His His His His 1 5 10

Claims

CA6에 특이적으로 결합하는 항체-유사 결합 단백질로서,
항체-유사 결합 단백질은 하기 식 [I] 및 식 [II]로 표시되는 구조를 가진 2개의 폴리펩타이드를 포함하며:
V_L1-L₁-V_L2-C_L [I]
V_H1-L₂-V_H2-C_H1 [II]
식에서:
V_L1은 DS6-기재의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
V_L2는 DS6-기재의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
V_H1은 DS6-기재의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
V_H2는 DS6-기재의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
C_L은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인, 예컨대 인간 IGKC 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
C_H1은 면역글로불린 C_H1 중쇄 불변 도메인, 예컨대 인간 면역글로불린 C_H1 중쇄 불변 도메인이며;
L₁ 및 L₂는 아미노산 링커이고;
여기서, 식 I의 폴리펩타이드 및 식 II의 폴리펩타이드는 2가의 단일특이적인 탠덤 면역글로불린 항체-유사 결합 단백질을 형성하는, 항체-유사 결합 단백질.
제1항에 있어서,
L₁이 GGGGS 또는 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 3)인, 항체-유사 결합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
L₂가 GGGGS 또는 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 3)인, 항체-유사 결합 단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
L₁ 및 L₂가 동일한, 항체-유사 결합 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
V_L1 및 V_L2 도메인이 동일한, 항체-유사 결합 단백질.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
V_H1 및 V_H2가 동일한, 항체-유사 결합 단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
식 [I]의 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 1을 포함하는, 항체-유사 결합 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
식 [II]의 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 7을 포함하는, 항체-유사 결합 단백질.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
태그(tag)를 추가로 포함하는, 항체-유사 결합 단백질.
제9항에 있어서,
태그가 6x-히스티딘, 비오틴, MYC, V5, FLAG, MBP, 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 또는 HA인, 항체-유사 결합 단백질.
제10항에 있어서,
태그가 6x-히스티딘 태그인, 항체-유사 결합 단백질.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 방사성표지, 영상제(imaging agent), 치료제 또는 진단제를 추가로 포함하는, 항체-유사 결합 단백질.
제12항에 있어서,
방사성표지, 영상제, 치료제 또는 진단제가 ¹¹⁰In, ¹¹¹In, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸F, ⁵²Fe, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁸⁶Y, ⁹⁰Y, ⁸⁹Zr, ⁹⁴Tc, ⁹⁴Tc, ^99mTc, ¹²⁰I, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ^154- ¹⁵⁸Gd, ³²P, ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ⁵¹Mn, ^52mMn, ⁵⁵Co, ⁷²As, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ^82mRb 또는 ⁸³Sr인, 항체-유사 결합 단백질.
제11항 또는 제12항에 있어서,
방사성표지, 영상제, 치료제 또는 진단제가 자기 공명 영상(MRI); 양전자단층촬영(PET); 단일 광자 방출 단층촬영(SPECT); 광학 영상, 컴퓨터 단층촬영(CT); 초음파, X-선 또는 광음향 영상(photoacoustic imaging)을 위한 하나 이상의 제제를 포함하는, 항체-유사 결합 단백질.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체-유사 결합 단백질의 식 [I] 또는 식 [II]의 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 핵산 분자.
제15항에 있어서,
핵산 분자가 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
제15항에 있어서,
핵산 분자가 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
제18항의 핵산 분자를 포함하는 단리된 숙주 세포.
제19항의 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
제19항 또는 제20항에 있어서,
숙주 세포가 포유류 세포 또는 곤충 세포인, 숙주 세포.
CA6에 특이적으로 결합하는 항체-유사 결합 단백질의 제조 방법으로서,
하기 식 [I] 및 식 [II]로 표시되는 구조를 가진 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 세포에서 발현시키는 단계를 포함하며:
V_L1-L₁-V_L2-C_L [I]
V_H1-L₂-V_H2-C_H1 [II]
식에서:
V_L1은 DS6-기재의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
V_L2는 DS6-기재의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
V_H1은 DS6-기재의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
V_H2는 DS6-기재의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
C_L은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인, 예컨대 인간 IGKC 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
C_H1은 면역글로불린 C_H1 중쇄 불변 도메인, 예컨대 인간 면역글로불린 C_H1 중쇄 불변 도메인이며;
L₁ 및 L₂는 아미노산 링커이고;
여기서, 식 I의 폴리펩타이드 및 식 II의 폴리펩타이드는 2가의 단일특이적인 탠덤 면역글로불린 항체-유사 결합 단백질을 형성하는, 항체-유사 결합 단백질의 제조 방법.
제22항에 있어서,
상기 항체-유사 결합 단백질은 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체-유사 결합 단백질인, 방법.