ES2595091T3

ES2595091T3 - Composiciones farmacéuticas con resistencia a CEA soluble

Info

Publication number: ES2595091T3
Application number: ES06841112.3T
Authority: ES
Inventors: Ralf Lutterbüse; Petra Mayer; Evelyne Schaller; Doris Rau; Susanne Mangold; Peter Kufer; Alexander Murr; Monika Wissinger; Tobias Raum
Original assignee: Amgen Research Munich GmbH
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH
Priority date: 2005-12-21
Filing date: 2006-12-21
Publication date: 2016-12-27
Anticipated expiration: 2026-12-21
Also published as: WO2007071426A1; KR101287777B1; ZA200805400B; EP2527370A1; KR20080079330A; DK1976880T3; CA2633766A1; US8394926B2; CA2633766C; AU2006328886C1; CN101370827A; RS55181B1; IL192277A; PL1976880T3; LT1976880T; BRPI0620632A2; SG193141A1; RU2010148652A; RU2426743C2; JP5399712B2

Abstract

Una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor epitelial en un ser humano, comprendiendo dicha composición farmacéutica un anticuerpo monocatenario biespecífico que tiene (a) un primer dominio de unión que se une específicamente a CD3 humano, y (b) un segundo dominio de unión que se une específicamente a CEA humano, en el que dicho segundo dominio de unión específico para CEA humano comprende (i) una CDR-H1 que tiene la secuencia de aminoácidos "SYWMH" (SEQ ID NO. 68), una CDR-H2 que tiene la secuencia de aminoácidos "FIRNKANGGTTEYAASVKG" (SEQ ID NO. 67), una CDR-L1 que tiene la secuencia de aminoácidos "TLRRGINVGAYSIY" (SEQ ID NO. 73), una CDR-L2 que tiene la secuencia de aminoácidos "YKSDSDKQQGS" (SEQ ID NO. 72) y una CDR-L3 que tiene la secuencia de aminoácidos "MIWHSGASAV" (SEQ ID NO. 71); (ii) una CDR-H1 que tiene la secuencia de aminoácidos "SYWMH" (SEQ ID NO. 68), una CDR-H2 que tiene la secuencia de aminoácidos "FILNKANGGTTEYAASVKG" (SEQ ID NO. 145), una CDR-L1 que tiene la secuencia de aminoácidos "TLRRGINVGAYSIY" (SEQ ID NO. 73), una CDR-L2 que tiene la secuencia de aminoácidos "YKSDSDKQQGS" (SEQ ID NO. 72) y una CDR-L3 que tiene la secuencia de aminoácidos "MIWHSGASAV" (SEQ ID NO. 71); o (iii) una CDR-H1 que tiene la secuencia de aminoácidos "TYAMH" (SEQ ID NO. 70), una CDR-H2 que tiene la secuencia de aminoácidos "LISNDGSNKYYADSVKG" (SEQ ID NO. 69), una CDR-L1 que tiene la secuencia de aminoácidos "TLRRGINVGAYSIY" (SEQ ID NO. 73), una CDR-L2 que tiene la secuencia de aminoácidos "YKSDSDKQQGS" (SEQ ID NO. 72) y una CDR-L3 que tiene la secuencia de aminoácidos "MIWHSGASAV" (SEQ ID NO. 71); y en el que dicho segundo dominio de unión comprende al menos la secuencia de aminoácidos "DX1X2X3X4FYFDY" (SEQ ID NO. 65), en la que "X2", "X3" o "X4" representa cualquier residuo aminoacídico, y el residuo aminoacídico "D" corresponde a la posición de Kabat 95 de la CDR-H3 del anticuerpo monoclonal murino A5B7 y los residuos aminoacídicos "FYFDY" corresponden a las posiciones de Kabat 100, 100a, 100b, 101, y 102, respectivamente, de la CDR-H3 del anticuerpo monoclonal murino A5B7.

Description

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basados en la dextrosa de Ringer), y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antibióticos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. Además, la composición de la presente invención puede comprender vehículos proteináceos, como, por ejemplo, seroalbúmina o inmunoglobulina, preferentemente de origen humano. Se prevé que el cotratamiento comprenda, además del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento, otros agentes biológicamente activos, dependiendo del uso destinado de la composición. Dichos agentes pueden ser fármacos que actúan sobre el aparato digestivo, fármacos que actúan como agentes antineoplásicos, agentes quimioterápicos, agentes citostáticos, fármacos que previenen la hiperuricemia, fármacos que inhiben inmunorreacciones (por ejemplo, corticoesteroides), fármacos que modulan la respuesta inflamatoria, fármacos que actúan sobre el aparato circulatorio y/o agentes tales como citocinas, conocidos en la técnica.

Preferentemente, el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento se formula en un tampón, un estabilizante y un tensioactivo. El tampón puede ser un tampón fosfato, citrato, succinato o acetato. El estabilizante puede ser (un) aminoácido(s) y/o un azúcar. Los tensioactivos pueden ser detergentes, PEG, o similares. Más preferentemente, el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento se formula en citrato, lisina, trehalosa y Tween 80. Como diluyente para la composición farmacéutica de la invención, es preferente solución salina isotónica y Tween 80.

Como se usa en el presente documento, un “anticuerpo monocatenario biespecífico” indica una única cadena polipeptídica que comprende dos dominios de unión. Cada “dominio de unión” como se usa en el presente documento comprende una región variable de una cadena pesada de anticuerpo (“región VH”), en la que la región VH del primer dominio de unión se une específicamente a dicha primera molécula, es decir, la molécula de CD3 humano, y la región VH del segundo dominio de unión se une específicamente al CEA humano, como se define con más detalle a continuación. Los dos dominios de unión se unen opcionalmente entre sí por un espaciador polipeptídico corto que comprende, en general, del orden de 5 aminoácidos. Cada dominio de unión puede comprender adicionalmente una región variable de una cadena ligera de anticuerpo (“región VL”), uniéndose la región VH y la región VL dentro de cada uno de los dominios de unión primero y segundo entre sí por medio de un enlazador polipeptídico, por ejemplo del tipo divulgado y reivindicado en el documento EP B1 623679, pero en cualquier caso, lo suficientemente largo para permitir que la región VH y la región VL del primer dominio de unión y la región VH y la región VL del segundo dominio de unión se emparejen entre sí de modo que, juntas, puedan unirse específicamente a las respectivas moléculas primera y segunda. La disposición de las regiones V del dominio de unión primero y segundo puede ser VH-VL o VL-VH. Preferentemente, la disposición del primer dominio de unión que se une específicamente a CD3 humano es VH-VL, como se muestra en los siguientes ejemplos. Se prevé que el primer dominio de unión pueda estar situado de forma N-terminal o de forma C-terminal en el segundo dominio de unión. Por tanto, la disposición de los dominios de unión de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento puede ser VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3, VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3, VHCD3-VLCD3-VHCEA-VLCEA o VHCD3-VLCD3-VLCEA-VHCEA. Preferentemente, dicho primer dominio de unión específico para CD3 está situado de forma C-terminal en el segundo dominio de unión. Más preferentemente, los dominios de unión de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento están dispuestos en el orden VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3 o VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3-Incluso más preferente, la disposición es VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3. Lo más preferente es la construcción de anticuerpo monocatenario biespecífico A240 VL-B9 VHxSEQ ID 25 NO. 77 VHVL como se define en SEQ ID NO. 34. Se prevé que dichos dominios de unión primero y/o segundo de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento puedan ser de origen no humano (es decir, derivados de secuencias no humanas). Por ejemplo, dichos dominios de unión primero y/o segundo se pueden derivar de anticuerpos monoclonales murinos. Sin embargo, los anticuerpos monocatenarios biespecíficos derivados de anticuerpos murinos se pueden reconocer como exógenos, cuando se administran a pacientes humanos. Por tanto, dichos dominios de unión primero y/o segundo de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento son preferentemente de origen humano (es decir, derivados de secuencias humanas). Dichos dominios de unión humanos que se unen específicamente a CEA o CD3 se pueden identificar, por ejemplo, por técnicas basadas en presentación en fagos. También se prevé que, por ejemplo, la región VH del primer (o segundo) dominio de unión sea una región VH humana, mientras que la correspondiente región VL del primer (o segundo) dominio de unión pueda ser de origen no humano. Dichos dominios de unión también se pueden denominar dominios de unión quiméricos. O uno de dichos dominios de unión es de origen no humano, mientras que el otro es de origen humano, dando como resultado un anticuerpo monocatenario biespecífico quimérico. Dichos dominios de unión primero y/o segundo se pueden modificar adicionalmente para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo monocatenario biespecífico descrito en el presente documento, cuando se administra a pacientes humanos. Por ejemplo, al menos uno de dichos dominios de unión primero o segundo de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento puede ser humanizado, injertado con CDR, quimérico y/o desinmunizado o humano, como se expone con más detalle a continuación. También se prevé que el enlazador polipeptídico que une la región VH y VL dentro del dominio de unión primero y/o segundo sea desinmunizado. Preferentemente, el enlazador polipeptídico que une la región VH y VL dentro del primer dominio de unión desinmunizado (específico para CD3) es un enlazador polipeptídico desinmunizado que tiene la secuencia “GEGTSTGS(G2S)2GGAD” (SEQ ID NO. 141). Además, se prevé que uno o ambos de dichos dominios de unión de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento lleven las denominadas “marcas” que se pueden usar, por ejemplo, para expresión, purificación, detección o enriquecimiento de proteínas, tales como marcas Flag, marcas c-myc, marcas GST o marcas His. Por ejemplo, para la marca Flag, el octapéptido hidrófilo

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usando más ampliamente ahora es DYKDDDDK (Chubet y Brizzard, Biotechniques 20 (1996): 136-141) aunque estudios recientes sugieren que un péptido más corto, DYKD, se puede reconocer casi con la misma afinidad por el anticuerpo monoclonal M1 (Knappik A, Pluckthun A; Biotechniques 17 (1994):754-761). Las marcas Flag, marcas cmyc, marcas GST, marcas His o similares pueden estar dispuestas en el extremo N-terminal o bien en el extremo Cterminal de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos tales como, por ejemplo, marca-VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3

o VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3-marca. Las fuentes para y las propiedades de dichas marcas con propósitos de expresión, detección o purificación están bien descritas en la técnica; véase, por ejemplo, Lichty, Protein Expr Purif. 41 (2005), 98-105.

Como se usa en el presente documento, el término “Fv monocatenario” o “scFv” se refiere a fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en el que estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Los dominios variables pueden estar dispuestos en el orden VH-VL o VL-VH. En general, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269315 (1994). En un modo de realización específico, la invención se refiere a scFv anti-CEA derivados de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento.

De acuerdo con la presente invención, el término "dominio de unión" o "región variable" usado en el contexto con la interacción con antígeno derivado de Ig comprende fragmentos y derivados de polipéptidos que al menos comprenden una CDR derivada de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado del mismo. Se prevé por la invención, que el segundo dominio de unión que se une específicamente a CEA humano del anticuerpo monocatenario biespecífico definido en el presente documento comprenda al menos una CDR, preferentemente una CDR-H3, más preferentemente una parte de la CDR-H3 del anticuerpo monoclonal murino A5B7 con la secuencia de aminoácidos “FYFDY” (SEQ ID NO. 112) correspondiente a las posiciones de Kabat 100, 100a, 100b, 101, y 102, respectivamente, de CDR-H3 del anticuerpo monoclonal murino A5B7; incluso más preferente con la secuencia de aminoácidos “DX1X2X3X4FYFDY” (SEQ ID NO. 65), en la que “X1”, “X2”, “X3” o “X4” representa cualquier residuo aminoacídico, y el residuo aminoacídico “D” corresponde a la posición de Kabat 95 de la CDR-H3 del anticuerpo monoclonal murino A5B7 y los residuos aminoacídicos “FYFDY” corresponden a las posiciones de Kabat 100, 100a, 100b, 101, y 102, respectivamente, de la CDR-H3 del anticuerpo monoclonal murino A5B7. Se prevé que “x1” “X2”, “X3” o “X4” correspondiente a las posiciones de Kabat 96 (“X1”), 97 (“X2”), 98 (“X3”) y 99 (“X4”), respectivamente, de CDR-H3 del anticuerpo monoclonal murino A5B7, representen el residuo aminoacídico “R” (arginina), “G” (glicina), “L” (leucina), “Y” (tirosina), “A” (alanina), “D” (ácido aspártico), “S” (serina), “W” (triptófano), “F” (fenilalanina) o “T” (treonina). En el presente documento, se excluye del alcance de la invención que “X1”, “X2”, “X3” y “X4” representen el mismo aminoácido, por ejemplo, que “X1”, “X2”, “X3” y “X4” sean todos “F” (fenilalanina). Preferentemente, “X1” representa “R” (arginina), “F” (fenilalanina), “M” (metionina), “E” (ácido glutámico), o “T” (treonina); “X2” representa “G” (glicina), “Y” (tirosina), “A” (alanina), “D” (ácido aspártico), o “S” (serina); “X3” representa “L” (leucina), “F” (fenilalanina), “M” (metionina), “E” (ácido glutámico), o “T” (treonina); y “X4” representa “R” (arginina), “Y” (tirosina), “A” (alanina), “D” (ácido aspártico), o “S” (serina). O lo más preferente, el segundo dominio de unión que se une específicamente a CEA humano del anticuerpo monocatenario biespecífico definido en el presente documento comprende la CDR-H3 completa de A5B7 con la secuencia de aminoácidos “DRGLRFYFDY” (SEQ ID NO. 66) correspondiente a las posiciones de Kabat 95 – 102 de la CDR-H3 de A5B7. Como se muestra en los siguientes ejemplos, la actividad citotóxica frente a células tumorales del anticuerpo monocatenario biespecífico definido en el presente documento que comprende dicha secuencia de aminoácidos de CDR-H3 derivada del mAb A5B7 “DRGLRFYFDY” (SEQ ID NO. 66) en el segundo dominio de unión que interacciona con CEA es resistente al antígeno CEA soluble, permitiendo de este modo el tratamiento de pacientes con tumores con concentraciones de CEA séricas altas en su plasma. La determinación de las CDR es conocida por el experto en la técnica; véase, por ejemplo, http://www.bioinf.org.Uk/abs/#cdrid. La numeración de las secuencias de aminoácidos en anticuerpos se puede llevar a cabo, por ejemplo, de acuerdo con el esquema de numeración de Kabat descrito en la técnica; véase por ejemplo, Kabat, E. A., T. T. Wu, H. M. Perry, K. S. Gottesman, y C. Foeller. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Bethesda, Md.: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine.

Lo más preferentemente y como se documenta en los ejemplos adjuntos, el “anticuerpo monocatenario biespecífico” que se va a emplear en la composición farmacéutica de la invención es un Fv monocatenario biespecífico (scFv) con un dominio de unión anti-CD3 desinmunizado (documento WO 2005/040220) y un dominio de unión anti-CEA humano que comprende al menos la secuencia de aminoácidos “DRGLRFYFDY” correspondiente a las posiciones de Kabat 95-102 (SEQ ID NO. 66) de la CDR-H3 del anticuerpo monoclonal murino A5B7. Las moléculas monocatenarias biespecíficas son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento WO 99/54440 o Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025.

El término “monocatenario” como se usa de acuerdo con la presente invención quiere decir que dichos dominios primero y segundo de la construcción monocatenaria biespecífica se unen covalentemente, preferentemente en forma de secuencia de aminoácidos colineal codificable por una única molécula de ácido nucleico.

Como se usa en el presente documento, “humano” se refiere a la especie Homo sapiens. Una molécula “humana”, por ejemplo, CEA humano o CD3 humano (CD3 épsilon), es, por lo tanto, la variante de esa molécula tal como se

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expresa de forma natural en Homo sapiens.

El término “tumor epitelial” como se usa en el presente documento indica un tumor de origen epitelial que es positivo para CEA (Cancer Medicine; 6ª ed.; Kufe, Donald W.; Pollock, Raphael E.; Weichselbaum, Ralph R.; Bast, Robert C., Jr.; Gansler, Ted S.; Holland, James F.; Frei III, Emil, editors. Hamilton (Canadá): BC Decker Inc. 2003; http://www.dkfz.de; http://www.krebsinformationsdienst.de/Krebsarten/index.html). El tumor epitelial que se va a tratar puede ser un adenocarcinoma gastrointestinal, un adenocarcinoma de mama o un adenocarcinoma pulmonar. Dicho adenocarcinoma gastrointestinal es preferentemente un adenocarcinoma colorrectal, pancreático, esofágico o gástrico. Como se ha expuesto en el presente documento, la composición farmacéutica de la invención es particularmente ventajosa para el tratamiento de pacientes con tumores progresivos, metástasis, cáncer recidivante, tumores epiteliales en estadio tardío, carga/masa de tumor epitelial alta, o pacientes con tumores con una concentración sérica de CEA mayor de 100 ng/ml (como se determina, por ejemplo, por ELISA), caracterizada por niveles altos de antígeno CEA soluble en el plasma de los pacientes con tumores. También está dentro del alcance de la invención que dicha composición farmacéutica se use después de la extirpación quirúrgica del tumor primario. Por ejemplo, las células tumorales residuales diseminadas derivadas de un tumor epitelial que produce CEA también liberan CEA en sus microentornos. Por tanto, en los alrededores de estas células tumorales, el nivel de CEA soluble también es alto. En consecuencia, la resistencia a CEA soluble de la actividad citotóxica de las composiciones farmacéuticas de la invención también es ventajosa para el tratamiento de la enfermedad residual mínima. Se prevé que dichas composiciones farmacéuticas se puedan administrar en un período en el que los niveles de CEA séricos disminuyan (debido a la retirada de la fuente de CEA, es decir, el tumor primario) para destruir las células tumorales restantes. Las composiciones farmacéuticas también pueden ser útiles después de la retirada del tumor primario, en el caso en el que los niveles de CEA séricos se incrementen debido a la formación de metástasis o tumores secundarios. La concentración sérica de CEA se puede determinar, por ejemplo, por ensayos ELISA de CEA (véase, por ejemplo, IBL CEA EIA, IBL Hamburg, Alemania). Como se ha expuesto anteriormente, en muchos enfoques terapéuticos basados en anticuerpos, dicho CEA sérico inhibe la unión del anticuerpo a CEA unido a membrana en las células tumorales y bloquea la actividad del anticuerpo, empeorando de este modo el éxito del tratamiento antitumoral.

Como se usa en el presente documento, el término “se une específicamente” o expresiones relacionadas tales como “que se une específicamente” o “reactividad específica con/para” etc. se refiere a la capacidad de los dominios de unión primero y/o segundo del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento para discriminar entre la respectiva molécula primera y/o segunda hasta un grado tal que, de un grupo de una pluralidad de diferentes moléculas como compañeros de unión potenciales, sólo dicha respectiva molécula primera y/o segunda se, o se une significativamente. Dichas medidas de unión se pueden realizar de forma rutinaria, por ejemplo, en un aparato Biacore, por ELISA, análisis FACS o similares. Más específicamente, el primer dominio de unión del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento se une a CD3 humano, preferentemente CD3 épsilon humano. El segundo dominio de unión de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos como se define en el presente documento se une a un antígeno de tumor epitelial, es decir, CEA humano (antígeno carcinoembrionario, molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 5; CEACAM5; CD66e), como se expone a continuación. El término “que se une específicamente” quiere decir de acuerdo con la presente invención que la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico puede específicamente interactuar con y/o unirse a al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o incluso más aminoácidos de cada una de la molécula diana humana como se define en el presente documento. Dicho término se refiere a la especificidad de la molécula de anticuerpo, es decir, a su capacidad para discriminar entre las regiones específicas de la molécula diana humana como se define en el presente documento. La interacción específica del sitio de interacción con antígeno con su antígeno específico puede dar como resultado un inicio de una señal, por ejemplo, debido a la inducción de un cambio de la conformación del antígeno, un oligomerización del antígeno, etc. Además, dicha unión se puede ejemplificar por la especificidad de un “principio llave/cerradura”. Por tanto, los motivos específicos en la secuencia de aminoácidos del sitio de interacción con antígeno y del antígeno se unen entre sí como resultado de su estructura primaria, secundaria o terciaria, así como resultado de modificaciones secundarias de dicha estructura. La interacción específica del sitio de interacción con antígeno con su antígeno específico puede dar como resultado también una unión de dicho sitio al antígeno.

La “unión específica” de un anticuerpo se caracteriza principalmente por dos parámetros: un parámetro cualitativo (el epítopo de unión, o donde se une el anticuerpo) y un parámetro cuantitativo (la afinidad de unión, o con qué fuerza se une donde lo hace). Se puede determinar de forma ventajosa el epítopo que se une, por ejemplo, por metodología FACS conocida, identificación genética de posiciones peptídicas, espectroscopía de masas o ELISA peptídico. La fuerza de unión del anticuerpo a un epítopo particular se puede determinar ventajosamente, por ejemplo, por metodologías Biacore y/o ELISA conocidas. Una combinación de dichas técnicas permite el cálculo de una proporción de señal:ruido como medida representativa de la especificidad de unión. En una proporción de señal:ruido de este tipo, la señal representa la fuerza de unión del anticuerpo al epítopo de interés, mientras que el ruido representa la fuerza de unión del anticuerpo a otros epítopos, no relacionados, que difieren el epítopo de interés. Preferentemente, una proporción de señal:ruido para un epítopo de interés que es aproximadamente 50 veces mayor que para otros epítopos diferentes del epítopo de interés se puede tomar como indicativo de que el anticuerpo evaluado se une al epítopo de interés de manera específica, es decir, es un “enlazador específico”.

El término “unión específica” o “interacción específica” como se usa de acuerdo con la presente invención quiere

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suficiente para mediar en la resistencia a antígeno CEA soluble cuando se usa en un dominio de unión a CEA humano (es decir, dominios de unión humanos que se unen específicamente a CEA humano) de anticuerpos monocatenarios biespecíficos anti-CEAxanti-CD3. Debido a su origen humano, dichas construcciones son poco o no inmunógenas cuando se administran a pacientes humanos con tumores. En resumen, las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos monocatenarios biespecíficos como se define en el presente documento son particularmente útiles para el tratamiento de pacientes con tumores epiteliales con concentraciones de CEA soluble altas en su plasma, como se observa, por ejemplo, durante la progresión tumoral, para cáncer recidivante, para metástasis, para pacientes con carga/masa tumoral alta o tumores en estadio tardío.

En otro modo de realización preferente de la composición farmacéutica de la invención, dicho primer dominio de unión específico para CD3 de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento se sitúa de forma C-terminal al segundo dominio de unión.

Dentro del alcance de la invención y todos modos de realización de la misma, el orden de disposición de los dominios de unión primero y segundo en la única cadena polipeptídica, es decir, dentro del anticuerpo monocatenario biespecífico definido en el presente documento, es relevante. Se prevé que la disposición de los dominios de unión de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento pueda ser VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3-, VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3, VHCD3-VLCD3-VHCEA-VLCEA o VHCD3-VLCD3-VLCEA-VHCEA. Como se muestra en los siguientes ejemplos, las ventajas como se describe anteriormente en el presente documento son particularmente realizables cuando el primer dominio de unión (que se une específicamente a CD3) se sitúa de forma C-terminal al segundo dominio de unión, es decir, más cerca del extremo C-terminal del anticuerpo monocatenario biespecífico que el segundo dominio de unión. Es preferente que el primer dominio de unión que se une específicamente a CD3 humano esté dispuesto en la orientación VH-VL. Por ejemplo, los dominios de unión de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento pueden estar dispuestos en el orden VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3 o VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3. Como se usa en el presente documento, “de forma Nterminal a” o “de forma C-terminal a” y variantes gramaticales del mismo indican una ubicación relativa dentro de la secuencia de aminoácidos primaria en lugar de la disposición en el extremo N-o C-terminal absoluto del anticuerpo monocatenario biespecífico. Por consiguiente, como ejemplo no limitante, un primer dominio de unión que está “situado de forma C-terminal al segundo dominio de unión” simplemente indica que el primer dominio de unión está situado en el lado carboxilo del segundo dominio de unión dentro del anticuerpo monocatenario biespecífico, y no excluye la posibilidad de que una secuencia adicional, por ejemplo una marca como se expone anteriormente, u otro compuesto proteináceo o no proteináceo tal como un radioisótopo, esté situado en el extremo C-terminal final del anticuerpo monocatenario biespecífico.

Preferentemente, dichos dominios de unión de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento están dispuestos en el orden VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3 o VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3. Incluso más preferente, la disposición es VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3. Lo más preferente es la construcción de anticuerpo monocatenario biespecífico A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO. 77 VHVL como se define en SEQ ID NO. 34.

Es preferente que el segundo dominio de unión que se une específicamente a CEA humano del anticuerpo monocatenario biespecífico definido en el presente documento comprenda al menos una CDR, preferentemente una CDR-H3, más preferentemente una parte de la CDR-H3 del anticuerpo monoclonal murino A5B7 con la secuencia de aminoácidos “FYFDY” (SEQ ID NO. 112) correspondiente a las posiciones de Kabat 100, 100a, 100b, 101, y 102, respectivamente, de CDR-H3 del anticuerpo monoclonal murino A5B7; incluso más preferente con la secuencia de aminoácidos “DX1X2X3X4FYFDY” (SEQ ID NO. 65), en la que “X1”, “X2”, “X3” o “X4” representa cualquier residuo aminoacídico, y el residuo aminoacídico “D” corresponde a la posición de Kabat 95 de la CDR-H3 del anticuerpo monoclonal murino A5B7 y los residuos aminoacídicos “FYFDY” corresponden a las posiciones de Kabat 100, 100a, 100b, 101, y 102, respectivamente, de la CDR-H3 del anticuerpo monoclonal murino A5B7. En el presente documento, “X1”, “X2”, “X3” y “X4” corresponden a posiciones de Kabat 96 (“X1”), 97 (“X2”), 98 (“X3”) y 99 5 (“X4”), respectivamente, de CDR-H3 del anticuerpo monoclonal murino A5B7. Se prevé que “X1”, “X2”, “X3” o “X4” representen un residuo aminoacídico “R” (arginina), “G” (glicina), “L” (leucina), “Y” (tirosina), “A” (alanina), “D” (ácido aspártico), “S” (serina), “W” (triptófano), “F” (fenilalanina) o “T” (treonina). En el presente documento, se excluye del alcance de las reivindicaciones de la invención que “X1”, “X2”, “X3” y “X4” representen el mismo aminoácido, por ejemplo, que “X1”, “X2”, “X3” y “X4” sean todos “F” (fenilalanina). Preferentemente, “X1” representa “R” (arginina), “F” (fenilalanina), “M” (metionina), “E” (ácido glutámico), o “T” (treonina); “X2” representa “G” (glicina), “Y” (tirosina), “A” (alanina), “D” (ácido aspártico), o “S” (serina); “X3” representa “L” (leucina), “F” (fenilalanina), “M” (metionina), “E” (ácido glutámico), o “T” (treonina); y “X4” representa “R” (arginina), “Y” (tirosina), “A” (alanina), “D” (ácido aspártico), o “S” (serina). Incluso más preferente, el segundo dominio de unión específico para CEA humano comprende al menos la secuencia de aminoácidos “RFYFDY” (SEQ ID NO. 113), “LRFYFDY” (SEQ ID NO. 114), “GLRFYFDY” (SEQ ID NO. 115), o “RGLRFYFDY” (SEQ ID NO. 116) de CDR-H3 del anticuerpo monoclonal A5B7. Lo más preferente es el CDR-H3 completo de A5B7 con la secuencia de aminoácidos “DRGLRFYFDY” (SEQ ID NO. 66) correspondiente a las posiciones de Kabat 95 (“D”, ácido aspártico), 96 (“R”; arginina), 97 (“G”; glicina), 98 (“L”; leucina), 99 (“R”; arginina), 100 (“F”; fenilalanina), 100a (“Y”; tirosina), 100b (“F”; fenilalanina), 101 (“D”; ácido aspártico), y 102 (“Y”; tirosina), respectivamente. La numeración de acuerdo con el sistema de Kabat se expone, por ejemplo, en Kabat, E. A., T. T. Wu, H. M. Perry, K. S. Gottesman, y C. Foeller. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Bethesda, Md.: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine.

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Como se muestra en los siguientes ejemplos, la actividad citotóxica frente a células tumorales del anticuerpo monocatenario biespecífico definido en el presente documento que comprende dicha secuencia de aminoácidos de CDR-H3 derivada del mAb A5B7 “DRGLRFYFDY” (SEQ ID NO. 66) en el segundo dominio de unión que interacciona con CEA es resistente al antígeno CEA soluble, permitiendo de este modo el tratamiento de pacientes con tumores con concentraciones de CEA séricas altas en su plasma.

Puede ser deseable modificar adicionalmente esta secuencia de aminoácidos de CDR-H3 “DRGLRFYFDY” derivada de A5B7, por ejemplo, para mejorar la afinidad por el antígeno diana CEA (en las células tumorales epiteliales) y/o para optimizar la “especificidad fina” del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento. Para este fin, en la secuencia de aminoácidos “DX1X2X3X4FYFDY” (SEQ ID NO. 65)”, varios residuos aminoacídicos se pueden someter a prueba en las posiciones “X1”, “X2”, “X3” y/o “X4” (correspondientes a las posiciones de Kabat 96 (“X1”), 97 (“X2”), 98 (“X3”) y 99 (“X4”), respectivamente, de CDR-H3 del anticuerpo monoclonal murino A5B7) para identificar una CDR-H3 modificada con una mejora en la afinidad y/o especificidad fina. Por ejemplo, “X1, “X2”, “X3” o “X4” puede representar un residuo aminoacídico “R” (arginina), “G” (glicina), “L” (leucina), “Y” (tirosina), “A” (alanina), “D” (ácido aspártico), “S” (serina), “W” (triptófano), “F” (fenilalanina) o “T” (treonina). En el presente documento, una, dos, tres o todas las cuatro de las posiciones “X” indicadas se pueden intercambiar en comparación con la secuencia de aminoácidos “RGLR” original en las posiciones de Kabat 96 a 99 en la secuencia de aminoácidos de CDR-H3 “DRGLRFYFDY” (SEQ ID NO. 66). Sin embargo, se excluye del alcance de las reivindicaciones de la invención que “X1”, “X2”, “X3” y “X4” representen el mismo aminoácido, por ejemplo, que “X1”, “X2”, “X3” y “X4” sean todos “F” (fenilalanina). La modificación mencionada anteriormente de la secuencia de aminoácidos de CDR-H3 “DRGLRFYFDY” derivada de A5B7 se puede lograr por procedimientos conocidos en la técnica, tales como PCR usando cebadores aleatorizados, lo que permite la generación de anticuerpos monocatenarios biespecíficos con dichas regiones CDR-H3, modificadas en el dominio de unión a CEA. La afinidad o especificidad fina de estos anticuerpos monocatenarios biespecíficos modificados se puede someter a prueba por procedimientos descritos en la técnica, por ejemplo, por ELISA, Biacore o análisis FACS. La resistencia a antígeno CEA soluble de un anticuerpo monocatenario biespecífico con una CDR-H3 modificada de este tipo se puede someter a prueba en ensayos de citotoxicidad en presencia de un incremento en las cantidades de CEA soluble, como se describe en los siguientes ejemplos.

Más preferentemente, dicho segundo dominio de unión específico para CEA humano de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento comprende SEQ ID NO. 65 o 66 y/o una CDR-H1 que tiene la secuencia de aminoácidos “SYWMH” (SEQ ID NO. 68) y/o una CDR-H2 que tiene la secuencia de aminoácidos “FIRNKANGGTTEYAASVKG” (SEQ ID NO. 67) o “FILNKANGGTTEYAASVKG” (SEQ ID NO. 145). Por tanto, dicho segundo dominio de unión específico para CEA humano de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento puede comprender una, dos o tres regiones CDR-H como se define anteriormente. De manera alternativa, dicho segundo dominio de unión específico para CEA humano de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento comprende SEQ ID NO. 65 o 66 y/o una CDR-H1 que tiene la secuencia de aminoácidos “TYAMH” (SEQ ID NO. 70) y/o una CDR-H2 que tiene la secuencia de aminoácidos “LISNDGSNKYYADSVKG” (SEQ ID NO. 569).

Por tanto, de manera alternativa, dicho segundo dominio de unión específico para CEA humano de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento puede comprender una, dos o tres regiones CDR-H como se define anteriormente. Incluso más preferente, dicho segundo dominio de unión específico para CEA humano de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento además de la una, dos o tres regiones CDR-H como se representa anteriormente comprende una CDR-L1 que tiene la secuencia de aminoácidos “TLRRGINVGAYSIY” (SEQ ID NO. 73) y/o una CDR-L2 que tiene la secuencia de aminoácidos “YKSDSDKQQGS” (SEQ ID NO. 72) y/o una CDR-L3 que tiene la secuencia de aminoácidos “MIWHSGASAV” (SEQ ID NO. 71).

La secuencia de aminoácidos de la región VH del segundo dominio de unión específico para CEA humano de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento es preferentemente la SEQ ID NO. 60 que comprende “DRGLRFYFDY” (SEQ ID NO. 66) correspondiente a las posiciones de Kabat 95 – 102 de la CDR-H3 del anticuerpo monoclonal murino A5B7 y una CDR-H1 que tiene la secuencia de aminoácidos “SYWMH” (SEQ ID NO. 68) y una CDR-H2 que tiene la secuencia de aminoácidos “FIRNKANGGTTEYAASVKG” (SEQ ID NO. 67).

La secuencia de aminoácidos de la región VH del segundo dominio de unión específico para CEA humano de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento es preferentemente la SEQ ID NO. 146 que comprende “DRGLRFYFDY” (SEQ ID NO. 66) correspondiente a las posiciones de Kabat 95 – 102 de la CDR-H3 del anticuerpo monoclonal murino A5B7 y una CDR-H1 que tiene la secuencia de aminoácidos “SYWMH” (SEQ ID NO. 68) y una CDR-H2 que tiene la secuencia de aminoácidos “FILNKANGGTTEYAASVKG” (SEQ ID NO. 145).

La secuencia de aminoácidos de la región VH del segundo dominio de unión específico para CEA humano de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento es preferentemente la SEQ ID NO. 58

o SEQ ID NO. 62 que comprende “DRGLRFYFDY” (SEQ ID NO. 66) correspondiente a las posiciones de Kabat 95 – 102 de la CDR-H3 del anticuerpo monoclonal murino A5B7 y una CDR-H1 que tiene la secuencia de aminoácidos “TYAMH” (SEQ ID NO. 70) y una CDR-H2 que tiene la secuencia de aminoácidos “LISNDGSNKYYADSVKG” (SEQ

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ID NO. 69).

La región VL del segundo dominio de unión específico para CEA humano de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento es preferentemente la SEQ ID NO. 64 que comprende una CDR-L1 que tiene la secuencia de aminoácidos “TLRRGINVGAYSIY” (SEQ ID NO. 73) y una CDR-L2 que tiene la secuencia de aminoácidos “YKSDSDKQQGS” (SEQ ID NO. 72) y una CDR-L3 que tiene la secuencia de aminoácidos “MIWHSGASAV” (SEQ ID NO. 71).

Como se ha expuesto anteriormente, el orden o la disposición de las regiones variables del segundo dominio de unión que se une específicamente a CEA puede ser VH-VL o VL-VH. Ambas disposiciones están dentro del alcance de la invención. Para un segundo dominio de unión que comprende la VH de SEQ ID NO. 60 y la VL de SEQ ID NO. 64, la disposición VH-VL se muestra en la SEQ ID NO. 52, mientras que la disposición VL-VH se representa en la SEQ ID NO. 122. Para un segundo dominio de unión que comprende la VH de SEQ ID NO. 146 y la VL de SEQ ID NO. 64, la disposición VH-VL se muestra en la SEQ ID NO. 147.

Para un segundo dominio de unión que comprende la VH de SEQ ID NO. 58 y la VL de SEQ ID NO. 64, la disposición VH-VL se muestra en la SEQ ID NO 50, mientras que la disposición VL-VH se muestra en la SEQ ID NO.

120. Para un segundo dominio de unión que comprende la VH de SEQ ID NO. 62 y la VL de SEQ ID NO. 64, la disposición VH-VL se muestra en la SEQ ID NO. 54, mientras que la disposición VL-VH se representa en la SEQ ID NO. 124. Para un segundo dominio de unión que comprende la VH de SEQ ID NO. 56 y la VL de SEQ ID NO. 64, la disposición VH-VL se muestra en la SEQ ID NO. 48, mientras que la disposición VL-VH se representa en la SEQ ID NO. 118.

Incluso más preferente, las regiones V del segundo dominio de unión específico para CEA de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento se seleccionan del grupo que consiste en:

(a): la región VH consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 60 y la región VL consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 64;

(b): la región VH consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 146 y la región VL consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 64;

(c): la región VH consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 58 y la región VL consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 64;

(d): la región VH consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 62 y la región VL consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 64; y

(e): la región VH consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 56 y la región VL consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 64.

Lo más preferente, dicho anticuerpo monocatenario biespecífico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a): una secuencia de aminoácidos como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO. 6, 8, 16, 18, 24, 26, 32, 34, 40, 42, 126, 130, 134 o 143;

(b): una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico como se muestra en las SEQ ID NO. 5, 7, 15, 17, 23, 25, 31, 33, 39, 41, 125, 129, 133 o 142; y

(c): una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótidos de (b).

En otro modo de realización preferente de la composición farmacéutica de la invención, dicho tumor epitelial que se va a tratar es un adenocarcinoma gastrointestinal, un adenocarcinoma de mama o un adenocarcinoma pulmonar. Dicho adenocarcinoma gastrointestinal es preferentemente un adenocarcinoma colorrectal, pancreático, esofágico o gástrico.

Más preferentemente, dicha composición farmacéutica de la invención es para el tratamiento de tumores progresivos, tumores en estadio tardío, pacientes con tumores con carga/masa tumoral alta, tumores metastásicos, o pacientes con tumores con una concentración sérica de CEA mayor de 100 ng/ml. Dicha concentración sérica de CEA se puede determinar, por ejemplo, por ELISA.

En otro modo de realización preferente de la composición farmacéutica de la invención, al menos uno de dichos dominios de unión primero o segundo de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento es quimérico, humanizado, injertado con CDR, y/o desinmunizado o humano.

El término “quimérico” como se usa en el presente documento se ha definido anteriormente. El término dominio de unión “humano”, por ejemplo, un dominio de unión humano que se une específicamente a CEA humano como se

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usa en el presente documento se debe entender que quiere decir que el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento comprende (una) secuencia(s) de aminoácidos contenida(s) en el repertorio de anticuerpos de la línea germinal humana o repertorio de anticuerpos que tiene al menos la secuencia de aminoácidos “FYFDY” correspondiente a las posiciones de Kabat 100, 100a, 100b, 101, y 102 (SEQ ID NO. 112) de la CDR-H3 del anticuerpo monoclonal murino A5B7 o una CDR-H3 derivada de A5B7 como se define anteriormente. Un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento se puede considerar humano si consiste en (una) secuencia(s) que se desvía(n) de su(s) secuencia(s) de línea germinal humana más próxima(s) no más de lo que se podría esperar debido al sello de hipermutación somática. Adicionalmente, los anticuerpos de muchos mamíferos no humanos, por ejemplo, roedores tales como ratones y ratas, comprenden secuencias de aminoácidos de CDR3 de VH que se puede esperar que existan en el repertorio de anticuerpos humanos expresados, además. Cualquiera de dicha(s) secuencia(s) de origen humano o no humano que se puede esperar que exista en el repertorio humano expresado también se podría considerar "humana" para los propósitos de la presente invención.

Como se usa en el presente documento, el término “humanizado”, “humanización” o “como humano” se usan de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo monocatenario biespecífico que comprende en al menos uno de sus dominios de unión al menos una región determinante de la complementariedad (“CDR”) de un anticuerpo no humano o fragmento del mismo. Los enfoques de humanización se describen, por ejemplo, en los documentos WO 91/09968 y US 6.407.213. Como ejemplos no limitantes, el término engloba el caso en el que una región variable de al menos un dominio de unión comprende una única región CDR, por ejemplo, la tercera región CDR del VH, de otro animal no humano, por ejemplo, un roedor, así como el caso en el que una o ambas regiones variables comprenden en cada una de sus respectivas CDR primera, segunda y tercera, las CDR de dicho animal no humano. En el caso en el que todas las CDR de un dominio de unión del anticuerpo monocatenario biespecífico se hayan reemplazado por sus correspondientes equivalentes de, por ejemplo, un roedor, se habla típicamente de “injerto con CDR”, y este término se debe entender que está englobado por el término “humanizado” o variantes gramáticamente relacionadas con el mismo como se usa en el presente documento. El término “humanizado” o variantes gramáticamente relacionadas con el mismo también engloba casos en los que, además del reemplazo de una o más regiones CDR dentro de un VH y/o VL del dominio de unión primero y/o segundo se ha(n) efectuado otra(s) mutación/mutaciones (por ejemplo, sustituciones) de al menos un residuo(s) aminoacídico(s) individual(es) dentro de las regiones estructurales (“FR”) entre las CDR de modo que los aminoácidos en esa(s) posición/posiciones corresponde(n) al/a los aminoácido(s) en esa(s) posición/posiciones en el animal a partir de que se derivan las regiones CDR usadas para el reemplazo. Como es conocido en la técnica, dichas mutaciones individuales se realizan a menudo en las regiones estructurales después de in injerto con CDR para restablecer la afinidad de unión original del anticuerpo no humano usado como dador de CDR para su molécula diana. El término “humanizado” pueden englobar adicionalmente una sustitución/sustituciones de aminoácidos en las regiones CDR de un animal no humano al/a los aminoácido(s) de una región CDR correspondiente de un anticuerpo humano, además de las sustituciones de aminoácidos en las regiones estructurales como se describe anteriormente.

Como se usa en el presente documento, el término “desinmunizado” o “desinmunización” indica la modificación del dominio de unión primero y/o segundo con respecto a una construcción natural original haciendo dicha construcción natural no inmunógena o menos inmunógena en seres humanos. Los enfoques de desinmunización se muestran, por ejemplo, en los documentos WO 00/34317, WO 98/52976, WO 02/079415 o WO 92/10755. El término “desinmunizado” también se refiere a construcciones, que muestran una reducción en la propensión a generar epítopos de linfocitos T. De acuerdo con la presente invención, el término “reducción en la propensión a generar epítopos de linfocitos T” se refiere a la retirada de epítopos de linfocitos T que da lugar a la activación de linfocitos T específica. Además, “reducción en la propensión a generar epítopos de linfocitos T” quiere decir sustitución de aminoácidos que contribuyen a la formación de epítopos de linfocitos T, es decir, sustitución de aminoácidos, que son esenciales para la formación de un epítopo de linfocito T. En otras palabras, “reducción en la propensión a generar epítopos de linfocitos T” se refiere una reducción en la inmunogenicidad o reducción en la capacidad para inducir proliferación de linfocitos T independiente de antígenos. El término “epítopo de linfocito T” se refiere a secuencias peptídicas cortas que se pueden liberar durante la degradación de péptidos, polipéptidos o proteínas dentro de células y posteriormente presentarse por moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) para desencadenar la activación de linfocitos T; véase, inter alia, el documento WO 02/066514. Para los péptidos presentados por el MHC clase II, dicha activación de linfocitos T puede dar lugar a continuación a una respuesta de anticuerpos por estimulación directa de linfocitos T para producir dichos anticuerpos. La “reducción en la propensión a generar epítopos de linfocitos T” y/o “desinmunización” se pueden medir por técnicas conocidas en la técnica. Preferentemente, la desinmunización de proteínas se puede someter a prueba in vitro por ensayo de proliferación de linfocitos T. En este ensayo, las PBMC de donantes que representan > 80 % de los alelos HLA-DR en el mundo se criban para determinar la proliferación en respuesta a péptidos naturales o bien desinmunizados. Idealmente, la proliferación celular solo se detecta tras la carga de las células presentadoras de antígenos con péptidos naturales. De manera alternativa, se puede someter a prueba la desinmunización expresando los tetrámeros de HLA-DR que representan todos los haplotipos. Estos tetrámeros se pueden someter a prueba para determinar la unión a péptidos

o cargarse con péptidos sustitutos de las células presentadoras de antígenos en ensayos de proliferación. Para someter a prueba si los péptidos desinmunizados están presentes en los haplotipos de HLA-DR, se puede medir la unión de, por ejemplo, péptidos marcados con fluorescencia en PBMC. Además, se puede probar la desinmunización determinando si los anticuerpos frente a las moléculas desinmunizadas se han formado después

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de la administración en pacientes. Preferentemente, las moléculas derivadas de anticuerpos se desinmunizan en las regiones estructurales y la mayoría de las regiones CDR no se modifican para generar una reducción en la propensión para inducir un epítopo de linfocito T de modo que la afinidad de unión de las regiones CDR no se ve afectada. Incluso la eliminación de un epítopo de linfocito T da como resultado una reducción en la inmunogenicidad.

En resumen, los enfoques anteriores ayudan a reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos terapéuticos como se define en el presente documento cuando se administran a pacientes con tumores epiteliales. Por ejemplo, el primer dominio de unión que se une específicamente a CD3 como se muestra en SEQ ID NO. 77 está desinmunizado; véase también el documento WO2005/040220. Preferentemente, la disposición de las regiones V en este dominio de unión a CD3 es VH-VL.

En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo monocatenario biespecífico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a): una secuencia de aminoácidos como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO. 6, 8, 30 16, 18, 24, 26, 32, 34, 40, 42, 126, 130, 134 o 143;

En un modo de realización, la invención se refiere a una composición que comprende anticuerpos monocatenarios biespecíficos como se define anteriormente. Preferentemente, dichos anticuerpos monocatenarios biespecíficos como se define anteriormente se usan como composiciones farmacéuticas para el tratamiento de un tumor epitelial o tumores epiteliales en un ser humano. Dicho(s) tumor(es) epitelial(es) es/son positivo(s) para CEA. La actividad citotóxica frente a células tumorales epiteliales positivas para CEA de estas composiciones farmacéuticas es resistente incluso a concentraciones altas de antígeno CEA soluble en el plasma de pacientes con tumores. Además, dichos anticuerpos monocatenarios biespecíficos como se define anteriormente o scFv anti-CEA derivados de los mismos se pueden usar como composiciones de diagnóstico para la detección de un tumor epitelial o tumores epiteliales en un ser humano como se expone con más detalle a continuación.

El término “hibridar en condiciones rigurosas” como se usa en el presente documento se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que pueden hibridar, en condiciones de hibridación rigurosas, a secuencias representadas en las SEQ ID NO. 5, 7, 15, 17, 23, 25, 31, 33, 39, 41, 125, 129, 133 o 142, o el complemento de las mismas, y que codifican un anticuerpo monocatenario biespecífico que tiene actividad citotóxica frente a células tumorales positivas para CEA. “Condiciones de hibridación rigurosas” se refiere a una incubación durante la noche a 42 °C en una solución que comprende formamida al 50 %, 5x SSC (NaCI 750 mM, citrato de trisodio 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10 %, y 20 μg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado cortado, seguido de lavado de los filtros en 0,1x SSC a aproximadamente 65 °C.

Si cualquier molécula de ácido nucleico o polipéptido particular es al menos en un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a un nucleótido o secuencia de aminoácidos definida en el presente documento se puede determinar convencionalmente usando programas informáticos conocidos. Un procedimiento preferente para determinar el mejor emparejamiento global entre una secuencia de consulta (una secuencia definida en el presente documento) y una secuencia sujeto, también denominada alineación de secuencias global, se puede determinar usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237245(1990)). En una alineación de secuencias, las secuencias de consulta y sujeto son ambas secuencias de ADN. Una secuencia de ARN se puede comparar convirtiendo U en T.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento. Dicho ácido nucleico se puede utilizar, por ejemplo, para enfoques de tratamiento génico para tratar un tumor epitelial en un ser humano, como se expone con más detalle a continuación.

La invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico como se define anteriormente. Preferentemente, dicho vector comprende además una secuencia reguladora que está unida de forma funcional a dicha secuencia de ácido nucleico definida anteriormente. Más preferentemente, dicho vector es un vector de expresión.

Además, el vector de la presente invención también puede ser un vector de transferencia génica o de selección génica. El tratamiento génico, que se basa en la introducción de ácidos nucleicos o genes terapéuticos en células por técnicas ex vivo o in vivo es una de las aplicaciones más importantes de transferencia génica. Los vectores, procedimientos o sistemas de suministro génico adecuados para tratamiento génico in vitro o in vivo se describen en la literatura y son conocidos para el experto en la técnica; véase, por ejemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodua, Blood 91 (1998), 30-36; Verzeletti, Hum. Gene

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Ther. 9 (1998), 2243-2251; 25 Verma, Nature 389 (1997), 239-242; Anderson, Nature 392 (Sup. 1998), 25-30; Wang, Gene Therapy 4 (1997), 393-400; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; documentos WO 94/29469; WO 97/00957; US 5.580.859; US 5.589.466; US 4.394.448 o Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635640, y referencias citadas en los mismos. Las moléculas de ácido nucleico y vectores como se define en el presente documento se pueden diseñar para su introducción directa o para su introducción por medio de liposomas, vectores víricos (por ejemplo, adenovírico, retrovírico), electroporación, u otros sistemas de suministro en la célula. Adicionalmente, se puede usar un sistema baculovírico como sistema de expresión eucariota para las moléculas de ácido nucleico como se define en el presente documento. La introducción y el enfoque terapéutico génico debe dar lugar, preferentemente, a la expresión de una construcción de anticuerpo monocatenario biespecífico funcional como se define en el presente documento, de este modo dicha construcción de anticuerpo monocatenario biespecífico expresada es particularmente útil en el tratamiento, mejoría y/o prevención de un tumor epitelial en un ser humano.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un huésped transformado o transfectado con un vector o un ácido nucleico como se define anteriormente.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica como se define anteriormente en el presente documento, que comprende además un compuesto proteináceo que puede proporcionar una señal de activación para células efectoras inmunitarias.

Preferentemente, la composición farmacéutica comprende además formulaciones adecuadas de vehículos, estabilizantes y/o excipientes.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de una composición farmacéutica como se define anteriormente, comprendiendo dicho procedimiento cultivar un huésped como se define anteriormente en condiciones que permitan la expresión del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define anteriormente en el presente documento y recuperar el anticuerpo monocatenario biespecífico producido del cultivo.

Otro aspecto de la invención se refiere a un uso de un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define anteriormente en el presente documento o como se produce por el procedimiento como se define anteriormente en el presente documento, una molécula de ácido nucleico como se define anteriormente en el presente documento, un vector como se define anteriormente en el presente documento o un huésped como se define anteriormente en el presente documento para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención, tratamiento o mejoría de un tumor epitelial en un ser humano. Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica de la invención o como se produce de acuerdo con el procedimiento expuesto anteriormente para su uso en un procedimiento para la prevención, tratamiento o mejoría de un tumor epitelial en un ser humano. El experto en la técnica, en particular el médico encargado puede evaluar el tratamiento exitoso del paciente que necesita la administración de la molécula biespecífica/anticuerpo monocatenario biespecífico de la invención. En consecuencia, el esquema de administración así como la dosificación y el tiempo de administración se pueden evaluar por dicho experto en la técnica: Una correspondiente “mejoría” y/o “tratamiento” que se va a evaluar se define a continuación.

Como se usa en el presente documento, una “cantidad eficaz” o “cantidad terapéuticamente eficaz” de una composición farmacéutica de la invención en el contexto de tumores epiteliales se refiere a esa cantidad del agente terapéutico suficiente para destruir, modificar, controlar o retirar tejido tumoral primario, regional o metastásico. Una cantidad terapéuticamente eficaz se puede referir a la cantidad de agente terapéutico suficiente para retrasar o minimizar la propagación del/de los tumor(es) epitelial(es). Una cantidad terapéuticamente eficaz también se puede referir a la cantidad del agente terapéutico o agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o gestión del/de los tumor(es) epitelial(es). Además, una cantidad terapéuticamente eficaz con respecto a un agente terapéutico o agente farmacéutico de la invención quiere decir esa cantidad de agente terapéutico o agente farmacéutico solo, o en combinación con otros tratamientos, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o gestión de un tumor epitelial. Usada junto con una cantidad del anticuerpo monocatenario biespecífico definido en el presente documento, el término puede englobar una cantidad que mejora el tratamiento global, reduce

o evita efectos no deseados, o potencia la eficacia de o sinergias (como se define en el presente documento) con otro agente terapéutico. Preferentemente, una cantidad terapéuticamente eficaz de una opción terapéutica mejora el tratamiento global, reduce o evita efectos no deseados, o potencia la eficacia terapéutica de o sinergias con otro agente terapéutico en el tratamiento de (un) tumor(es) epitelial(es). Por ejemplo, un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento puede provocar una reducción del diámetro de un tumor epitelial de un 20 % si se administra a un paciente como monotratamiento. Por el contrario, una segunda opción terapéutica, por ejemplo, un agente antineoplásico como se define a continuación, puede provocar una reducción tumoral de un 10 %. Sin embargo, si tanto el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento como dicha segunda opción terapéutica se administran en combinación en forma de cotratamiento, se puede observar una reducción tumoral de un 50 %. Un efecto de este tipo se entiende como un efecto sinérgico como se usa en el presente documento.

Como se denomina en el presente documento, el término “tratamiento” se refiere a cualquier esquema, procedimiento y/o agente de administración que se puede usar en la prevención, tratamiento o mejoría de un tumor epitelial. El término “prevención, tratamiento o mejoría de un tumor epitelial” se expone con más detalle a continuación. Los términos “tratamientos” y “tratamiento” se pueden referir a un tratamiento biológico, tratamiento

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complementario, quimioterapia, radioterapia y/u otros tratamientos útiles en el tratamiento, prevención, o mejora de un tumor epitelial, o uno o más síntomas del mismo.

Como se usa en el presente documento, los términos “tratar”, “tratamiento” y “tratando” en el contexto de administrar un tratamiento o tratamientos a un paciente se refieren a la reducción o mejoría de la progresión, gravedad y/o duración de un tumor epitelial. Dicho(s) tumor(es) epitelial(es) puede(n) estar asociado(s) con la expresión anómala, por ejemplo, sobreexpresión o actividad de CEA, y/o la mejoría de uno o más síntomas de los mismos de la administración de uno o más tratamientos (incluyendo la administración de uno o más agentes farmacéuticos o terapéuticos).

El modo de administración más preferente es una administración intravenosa durante un tiempo/período de tiempo dado. Aunque el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento se puede administrar solo, es preferente la administración en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, liposomas, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden dichos vehículos se pueden formular por procedimientos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar al sujeto en una dosis adecuada. El régimen de dosificación se determinará por el médico especialista y por factores clínicos. Como es bien conocido en la técnica médica, las dosificaciones para un paciente cualquiera dependen de muchos factores, incluyendo la talla del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular que se va a administrar, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se estén administrando simultáneamente. Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas o no acuosas estériles, y suspensiones. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, suspensiones o soluciones acuosas, incluyendo medios tamponados y solución salina. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer con lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en la dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antibióticos, antioxidantes, agentes quelantes, y gases inertes y similares. Además, la composición puede comprender vehículos proteináceos, como, por ejemplo, seroalbúmina o inmunoglobulina, preferentemente de origen humano. Se prevé que el cotratamiento pueda comprender, además del anticuerpo monocatenario biespecífico proteináceo, otros agentes biológicamente activos, dependiendo del uso destinado de la composición farmacéutica. Dichos agentes pueden ser agentes que actúan sobre el sistema gastrointestinal, agentes que actúan como agentes citostáticos, agentes que previenen la hiperuricemia, agentes que inhiben reacciones inmunitarias (por ejemplo, corticoesteroides, FK506), fármacos que actúan sobre el sistema circulatorio y/o agentes tales como moléculas coestimuladores de linfocitos T o citocinas conocidas en la técnica. Preferentemente, el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento se formula en un tampón, un estabilizante y un tensioactivo. El tampón puede ser un tampón fosfato, citrato, succinato o acetato. El estabilizante puede ser (un) aminoácido(s) y/o un azúcar. Los tensioactivos pueden ser detergentes, PEG, o similares. Más preferentemente, el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento se formula en citrato, lisina, trehalosa y Tween 80. Como diluyente para dicha composición farmacéutica, es preferente solución salina isotónica y Tween 80.

El término “mejoría” como se usa en el presente documento se refiere una mejora o una moderación en la gravedad de una enfermedad, es decir, un tumor epitelial. Por ejemplo, una mejoría de este tipo puede ser el logro de una enfermedad estable (o incluso más preferentemente) una reducción del/de los tumor(es) epitelial(es), es decir, una respuesta mínima, parcial o respuesta completa, debido a la administración de las composiciones farmacéuticas de la invención. “Enfermedad estable” se refiere a un estado de enfermedad en el que ninguna progresión/crecimiento tumoral o progresión/crecimiento tumoral significativo se puede observar o detectar por procedimientos de diagnóstico clínico e/o histológico. Por ejemplo, una reducción del tumor mayor de una reducción de un 50 % de la suma de las áreas transversales de las lesiones indicadoras se puede considerar como una “respuesta parcial”. Una “respuesta completa” indica un estado en el que ya no se puede(n) detectar lesión/lesiones después de tratamiento. Una respuesta con una reducción tumoral entre una enfermedad estable y una respuesta parcial se puede considerar como una respuesta mínima. Por ejemplo, una reducción de un 20 %, 25 % o 30 % de la suma de las áreas transversales de lesiones indicadoras se puede denominar una respuesta mínima.

El término “mejoría” como se usa en el presente documento engloba también una reducción del número de tumores epiteliales. Adicionalmente indica la prevención/ralentización de la progresión tumoral. Además, una mejora de la supervivencia global de los pacientes con tumores tratados en comparación con pacientes con tumores no tratados se puede considerar como una “mejoría” como se usa en el presente documento. Esto se aplica mutatis mutandis a una mejora de la supervivencia sin progresión o la supervivencia sin recaída de pacientes con tumores tratados en comparación con pacientes con tumores no tratados. Además, el término “mejoría” también se puede referir a una reducción de la intensidad de los síntomas de un tumor epitelial, dando como resultado, por ejemplo, una mejora de la calidad de vida de los pacientes con tumores tratados.

El término “prevención de un tumor epitelial” como se usa en el presente documento se debe entender como sigue: Después de la retirada quirúrgica del/de los tumor(es) epitelial(es) primario(s) de un paciente humano y/o después del tratamiento quimioterápico o radioterápico del/de los tumor(es) epitelial(es) primario(s), puede darse el caso de

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que no todas las células tumorales se puedan eliminar del cuerpo. Sin embargo, estas células tumorales restantes pueden dar lugar a cáncer recidivante, es decir, recidiva y/o metástasis local en el paciente. La metástasis es una complicación frecuente del cáncer, aunque el proceso a través de que se diseminan las células cancerosas desde el/los tumor(es) primario(s) para formar colonias a distancia es poco conocido. Los cánceres metastásicos son, casi sin excepción, incurables, lo que eleva la necesidad de nuevas modalidades terapéuticas. La composición farmacéutica de la invención se puede usar para destruir estas células tumorales diseminadas para prevenir la formación de tumores secundarios (que se originan desde las células tumorales que permanecen en el cuerpo después de un tratamiento primario). De esta forma, la composición farmacéutica ayuda a prevenir la formación de recidiva local y/o metástasis en pacientes con tumores.

Se puede realizar un seguimiento del éxito del tratamiento antitumoral por procedimientos estándar establecidos para las respectivas entidades de enfermedad, por ejemplo, por tomografía axial computerizada, rayos X, tomografía por resonancia magnética nuclear (por ejemplo, para la evaluación de la respuesta en base a los criterios del National Cancer Institute [Cheson (1999), J. Clin. Oncol.; 17(4):1244]), tomografía por emisión de positrones, endoscopia, separación celular activada por fluorescencia, aspirado medular, de líquido pleural o peritoneal, histologías tisulares, y varios parámetros químicos clínicos específicos de tumores epiteliales (por ejemplo, concentración de CEA soluble en suero) y se pueden usar otros procedimientos estándar establecidos. Además, se pueden usar ensayos que determinan la activación de linfocitos T; véase por ejemplo, el documento WO99/054440. También se pueden usar estadísticas para la determinación de la supervivencia global, supervivencia sin progresión

o supervivencia sin recaída de pacientes con tumores tratados en comparación con pacientes con tumores no tratados.

Preferentemente, dicho tumor epitelial es un adenocarcinoma gastrointestinal, un adenocarcinoma de mama o un adenocarcinoma pulmonar. Dicho adenocarcinoma gastrointestinal es más preferentemente un adenocarcinoma colorrectal, pancreático, esofágico o gástrico.

Incluso más preferentemente, dicha composición farmacéutica de la invención es para el tratamiento de tumores progresivos, tumores en estadio tardío, pacientes con tumores con carga/masa tumoral alta, tumores metastásicos, o pacientes con tumores con una concentración sérica de CEA mayor de 100 ng/ml (como se determina, por ejemplo, por ELISA).

En otro modo de realización preferente de los usos o procedimientos de la invención, dicha composición farmacéutica como se define anteriormente en el presente documento es adecuada para administrarse en combinación con un fármaco adicional, es decir, como parte de un cotratamiento.

En determinados modos de realización, el anticuerpo monocatenario biespecífico o composición farmacéutica como se define en el presente documento se administra en combinación con uno o más de otros tratamientos. En determinados modos de realización, el anticuerpo monocatenario biespecífico o composición farmacéutica como se define en el presente documento se administra a un paciente simultáneamente con uno o más de otros tratamientos. Preferentemente, dichos tratamientos son útiles para el tratamiento de tumores epiteliales. El término "simultáneamente" no se limita a la administración de composiciones farmacéuticas o agentes terapéuticos exactamente al mismo tiempo, sino más bien quiere decir que el anticuerpo monocatenario biespecífico o composición farmacéutica como se define en el presente documento y el/los otro(s) agente(s) se administran a un paciente en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo tal que el anticuerpo monocatenario biespecífico o composición farmacéutica como se define en el presente documento puede actuar junto con el otro agente para proporcionar un incremento en el beneficio mayor que si se administraran de otro modo. Por ejemplo, cada agente terapéutico se puede administrar al mismo tiempo o secuencialmente en cualquier orden a diferentes puntos temporales; sin embargo, si no se administran al mismo tiempo, se deben administrar lo suficientemente próximos en el tiempo como para proporcionar el efecto terapéutico deseado.

Cada agente terapéutico se puede administrar por separado, es una forma apropiada y por cualquier vía adecuada. En otros modos de realización, el anticuerpo monocatenario biespecífico o composición farmacéutica como se define en el presente documento se administran antes, simultáneamente o después de una intervención quirúrgica. Preferentemente, la intervención quirúrgica retira completamente los tumores epiteliales localizados o reduce el tamaño de los tumores epiteliales grandes. También se puede realizar una intervención quirúrgica como medida preventiva o para aliviar el dolor.

Las cantidades de dosificación y las frecuencias de administración proporcionadas en el presente documento se engloban por el término “terapéuticamente eficaz” como se define anteriormente. Típicamente, la dosificación y la frecuencia variarán adicionalmente de acuerdo con factores específicos para cada paciente dependiendo de los agentes terapéuticos o profilácticos específicos administrados, la gravedad y el tipo de tumor epitelial, la vía de administración, así como la edad, peso corporal, respuesta, y los antecedentes personales del paciente. Se pueden seleccionar regímenes adecuados por un experto en la técnica considerando dichos factores y siguiendo, por ejemplo, dosificaciones informadas en la literatura y recomendadas en el Physicians' Desk Reference (59ª ed., 2005).

En algunos modos de realización, el tratamiento por administración del anticuerpo monocatenario biespecífico o

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composición farmacéutica como se define en el presente documento se combina con la administración de uno o más tratamientos tales como quimioterapias, radioterapias, hormonoterapia y/o tratamientos biológicos/inmunoterapias. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, moléculas proteináceas, incluyendo, pero sin limitarse a, péptidos, polipéptidos, proteínas, incluyendo proteínas modificadas postraduccionalmente, anticuerpos etc.; o moléculas pequeñas (menos de 1000 daltons), compuestos orgánicos o inorgánicos; o moléculas de ácido nucleico incluyendo ADN monocatenario o bicatenario, o ARN monocatenario o bicatenario; así como moléculas de ácido nucleico de triple hélice. Los agentes terapéuticos se pueden derivar de cualquier organismo conocido (incluyendo, pero sin limitarse a, animales, plantes, bacterias, hongos y protistas o virus) o de una colección de moléculas sintéticas.

En un modo de realización específico, los procedimientos y usos de la invención engloban la administración del anticuerpo monocatenario biespecífico o composición farmacéutica como se define en el presente documento en combinación con la administración de uno o más agentes terapéuticos que son inhibidores de cinasas tales como Gefitinib (Iressa), Erlotinib (Tarceva), anticuerpos anti-EGFR (por ejemplo, Cetuximab; Erbitux), o anticuerpos antiHer2/neu (por ejemplo, Trastuzumab; Herceptin) descritos en la técnica; véase por ejemplo, Hardie y Hanks (1995) The Protein Kinase Facts Book, I and II, Academic Press, San Diego, California.

En otro modo de realización específico, los procedimientos y usos de la invención engloban la administración del anticuerpo monocatenario biespecífico o composición farmacéutica como se define en el presente documento en combinación con la administración de uno o más agentes terapéuticos que son inhibidores de la angiogénesis tales como anticuerpos anti-VEGF (por ejemplo, Bevacizumab; Avastin), compuestos de moléculas pequeñas (por ejemplo, Vatalanib o Sorafenib) o inhibidores de la COX descritos en la técnica.

En otro modo de realización específico, los procedimientos y usos de la invención engloban la administración del anticuerpo monocatenario biespecífico o composición farmacéutica como se define en el presente documento en combinación con la administración de uno o más agentes terapéuticos que son agentes antineoplásicos tales como 5-fluorouracilo, ácido folínico, capecitabina, oxaliplatino, irinotecán, gemcitabina, doxorubicina, epirubicina, etopósido, cisplatino, carboplatino, taxanos (por ejemplo, docetaxel, paclitaxel) descritos en la técnica.

Preferentemente, un cotratamiento de un paciente con un tumor epitelial usando un anticuerpo monocatenario biespecífico o composición farmacéutica como se define en el presente documento en combinación con (a) otro(s) agente(s) terapéutico(s) da como resultado un efecto sinérgico. Como se usa en el presente documento, el término "sinérgico" se refiere a una combinación de tratamientos (por ejemplo, una combinación de un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento y (un) otro(s) agente(s) terapéutico(s) como se expone anteriormente) que es más eficaz que los efectos aditivos de cualquiera de dos o más tratamientos individuales (por ejemplo, uno o más agentes terapéuticos). Por ejemplo, un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento puede provocar una reducción del diámetro de un tumor epitelial de un 20 % si se administra a un paciente como monotratamiento. Por el contrario, una segunda opción terapéutica, por ejemplo, un agente antineoplásico como se define a continuación, puede provocar una reducción tumoral de un 10 %. Sin embargo, si tanto el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento como dicha segunda opción terapéutica se administran en combinación en forma de cotratamiento, se puede observar una reducción tumoral de un 50 %.

Un efecto sinérgico de una combinación de tratamientos (por ejemplo, una combinación de un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento y (un) otro(s) agente(s) terapéutico(s) como se expone anteriormente) permite el uso de menores dosificaciones de uno o más de los tratamientos (por ejemplo, uno o más agentes terapéuticos) y/o la administración menos frecuente de dichos tratamientos a un paciente con una enfermedad, por ejemplo, un tumor epitelial. La capacidad de utilizar menores dosificaciones de tratamientos (por ejemplo, agentes terapéuticos) y/o de administrar dichos tratamientos con menos frecuencia reduce la toxicidad asociada con la administración de dichos tratamientos a un sujeto sin reducir la eficacia de dichos tratamientos en la prevención o tratamiento de una enfermedad, por ejemplo, un tumor epitelial. Además, un efecto sinérgico puede dar como resultado una mejora en la eficacia de los tratamientos (por ejemplo, agentes terapéuticos) en la prevención, gestión, tratamiento y/o mejoría de un tumor epitelial (que puede estar asociado con la expresión anómala (por ejemplo, sobreexpresión) o actividad de CEA). Finalmente, el efecto sinérgico de una combinación de tratamientos (por ejemplo, agentes terapéuticos) puede evitar o reducir efectos secundarios adversos o no deseados asociados con el uso de cualquier tratamiento individual.

En dicho cotratamiento, se puede incluir opcionalmente un agente activo en la misma composición farmacéutica como el anticuerpo monocatenario biespecífico definido en el presente documento, o se puede incluir en una composición farmacéutica separada. En este último caso, dicha composición farmacéutica separada es adecuada para su administración antes de, simultáneamente con o después de la administración de dicha composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento. La composición farmacéutica o fármaco adicional puede ser un compuesto proteináceo o un compuesto no proteináceo. En el caso en el que el fármaco adicional sea un compuesto proteináceo, es ventajoso que el compuesto proteináceo pueda proporcionar una señal de activación para las células efectoras inmunitarias.

Preferentemente, dicho compuesto proteináceo o compuesto no proteináceo se puede administrar simultáneamente

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o no simultáneamente con un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define anteriormente en el presente documento, una molécula de ácido nucleico como se define anteriormente en el presente documento, un vector como se define como se define anteriormente en el presente documento, o un huésped como se define como se define anteriormente en el presente documento. Preferentemente, dicho sujeto que se va a tratar es un ser humano.

En otro modo de realización, un único anticuerpo biespecífico monocatenario o scFv anti-CEA como se define en el presente documento puede estar conjugado con un agente detectable o de diagnóstico. Dicho diagnóstico y detección se puede lograr acoplando el anticuerpo o scFv a sustancias detectables, por ejemplo, a varias enzimas, tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos, tales como estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, umbelliferona, fluoresceína, fluoresceína isotiocianato, rodamina, diclorotriacinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, luminol; materiales bioluminiscentes, tales como, luciferasa, luciferina y ecuorina; materiales radioactivos e isótopos, tales como cobalto (57Co), indio (115ln, 113ln, 112ln, 111In), yodo (1311, 1251, 1231, 1211), o itrio (90Y), metales emisores de positrones que se usan en varias tomografías por emisión de positrones, e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos.

Las técnicas para conjugar restos a anticuerpos son bien conocidas. Los restos se pueden conjugar a anticuerpos por cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a enlace aldehído/Schiff, enlace sulfidrilo, enlace lábil ácido, enlace cis-aconitilo, enlace hidrazona, enlace enzimáticamente degradable; véase en general, Garnett, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216. Las técnicas adicionales para conjugar restos a anticuerpos son bien conocidas, véase, por ejemplo, Arnon et al., Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy. En Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985). Los procedimientos para condensar o conjugar anticuerpos a restos polipeptídicos son conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, Ashkenazi et al., 1991, PNAS 88: 10535-10539. La fusión de un anticuerpo a un resto no tiene que ser necesariamente directa, sino que se puede producir a través de secuencias enlazadoras. Dichas moléculas enlazadoras son comúnmente conocidas en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define anteriormente en el presente documento, una molécula de ácido nucleico como se define anteriormente en el presente documento, un vector como se define anteriormente en el presente documento, o un huésped como se define anteriormente en el presente documento.

Estos y otros modos de realización se divulgan y se engloban por la descripción y los ejemplos de la presente invención. Las técnicas y procedimientos recombinantes en inmunología se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ª edición 2001; Lefkovits; Immunology Methods Manual; The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Laboratory Press, 2002. Literatura adicional relativa a uno cualquiera de los anticuerpos, procedimientos, usos y compuestos que se van a emplear de acuerdo con la presente invención se puede recuperar de bibliotecas y bases de datos públicas, usando, por ejemplo, dispositivos electrónicos. Se puede utilizar, por ejemplo, la base de datos pública "Medline", disponible en Internet, por ejemplo, en http://www.ncbi.nlm. nih.qov/PubMed/medline.html. Otras bases de datos y direcciones, tales como http://www.ncbi.nim.nih.qov/,http://www.infobioaen.fr/,http://www.fmi.ch/bioloqv/researchtools.html, http://www.infobiaen.fr/, http://www.fmi.ch/bioloqv/researchtools.html, http://www.tiqr.orQ/. que son conocidas para el experto en la técnica también se pueden obtener usando, por ejemplo, http://www.lvxos.com. Para temas relacionados con tumores, véase por ejemplo, http://www.nih.gov o http://www.dkfz.de.

Las figuras muestran:

Figura 1: Análisis de unión FAGS de varias construcciones monocatenarias biespecíficas reactivas con CEA humano a células CHO transfectadas con CEA humano y células HPB-AII positivas para CD3, respectivamente. Como control positivo para la unión a CEA, se ha usado el anticuerpo monoclonal Col-1. Para el control de la unión a CD3 humano, se usó una construcción monocatenaria biespecífica CD19xCD3 como se describe en el documento WO 99/054440. En este control positivo, la línea gruesa representa células incubadas con 10 µg/ml de anticuerpo monocatenario biespecífico CD19xCD3 purificado que se incubó posteriormente con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células incubadas con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección. La actividad de unión para CEA humano (unido a membrana) y CD3 humano fue detectable para CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL, CEAI VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL, CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL, CEAIII VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL y CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL. En los histogramas respectivos correspondientes a los anticuerpos monocatenarios biespecíficos como se describe en la invención, la línea fina representa el control negativo, la línea gruesa clara representa células incubadas con sobrenadante de cultivo, mientras que la línea gruesa oscura (más a la derecha) representa células incubadas con 10 µg/ml de anticuerpo monocatenario biespecífico purificado.

Figura 2: Señales de unión de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos anti-CEA/anti-CD3 CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL, CEAII VHVLxSEQ ID NO. 77 VHVL y CEAIII VHVLxSEQ ID NO. 77 VHVL y anticuerpo anti-CEA Col-1 para CEA soluble detectado por ELISA directo. Los anticuerpos monocatenarios biespecíficos CEAI VHVLxSEQ ID

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CEAII VHVL se deriva del mAb T84.66.

Figura 12: Análisis por citometría de flujo de preparaciones periplásmicas que contienen fragmentos de proteína scFv marcados con Flag de clones seleccionados. Se añadieron preparaciones periplásmicas de fragmentos de proteína scFv soluble a de 100.000 a 200.000 células CHO transfectadas con CEA. Para la detección, se usó un anticuerpo monoclonal anti-Flag seguido de un anticuerpo policlonal antimurino marcado con PE. La unión de ScFv a las células se midió por un incremento en la intensidad de fluorescencia en comparación con las células que se incubaron con PBS solo. La intensidad de fluorescencia se representa en el eje X, el número de acontecimientos se representa en el eje Y. El control negativo (PBS y reactivos de detección) se muestra como una curva sombreada, los scFv respectivos se muestran como líneas grises. El desplazamiento a la derecha indica la unión positiva a las células. Todos los scFv, es decir, A-121, A-183, A-240, A-313, A-290, A-315, A4-35, A4-52 y MP2-A5, se unen a CEA unido a membrana en las células CHO. Cada uno de los scFv consiste en la región VH de A5B7 murino y una región VL humana, como se describe en ejemplo 6.

Figura 13: Análisis citométrico de flujo de preparaciones periplásmicas que contienen fragmentos de proteína scFv marcados con Flag de los seleccionados. Se añadieron preparaciones periplásmicas de fragmentos de proteína scFv soluble a de 100.000 a 200.000 células CHO transfectadas con CEA. La detección se realizó por un anticuerpo monoclonal anti-Flag seguido de un anticuerpo policlonal antimurino marcado con PE. La unión de ScFv a las células se midió por un incremento en la intensidad de fluorescencia en comparación con las células que se incubaron con PBS solo. La intensidad de fluorescencia se representa en el eje X, el número de acontecimientos se representa en el eje Y. El control negativo (PBS y reactivos de detección) se muestra como una curva sombreada, los scFv respectivos se muestran como líneas grises. El desplazamiento a la derecha indica la unión positiva a las células. Las construcciones de scFv completamente humanas MPS10_3-AS.3, MPS10_3-B9.1, y MPS10_3-D8.1 se unen a CEA unido a membrana en las células CHO. Cada uno de estos scFv consiste en una región VH humana y la región VL humana A240, como se describe en ejemplo 7. 240 Vlambda.3 es un scFv que consiste en la región VH de ASB7 murino y la región VL A-240 humana. Esta construcción muestra también la actividad de unión a CEA.

Figura 14: Análisis de unión FACS de varias construcciones monocatenarias biespecíficas reactivas para CEA humano a células Kato Ill y células HPB-AII, respectivamente. La línea gruesa representa células incubadas con sobrenadante de cultivo celular de células CHO transfectadas incubadas con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células incubadas con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección. Las construcciones de anticuerpos monocatenarios biespecíficos humanos AS VHA240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL, B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL, y D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL se unen a CEA humano en células Kato y a CD3 humano en células HPB-AII. CEAI VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL con la región VH del dominio de unión a CEA derivado del mAb ASB7 muestra la misma actividad de unión.

Figura 15: Ensayo citotóxico de las construcciones monocatenarias biespecíficas reactivas para CEA indicadas redirigidas a células CHO transfectadas con CEA, en ausencia de CEA soluble. Se usaron CTL positivos para CD8 humanos estimulados como células efectoras. La actividad citotóxica se pudo detectar para AS VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL, B9 VH-A240 VLx SEQ ID NO.77 VHVL, D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL y CEAI VHA240 VLx SEQ ID NO.77 VHVL. CEAI VH es una región VH derivada del mAb ASB7.

Figura 16: Ensayo citotóxico de las construcciones monocatenarias biespecíficas reactivas para CEA indicadas redirigidas a células CHO transfectadas con CEA, en ausencia de CEA soluble. Se usaron CTL positivos para CD8 humanos estimulados como células efectoras. Esta figura demuestra la actividad citotóxica para A240 VL-AS VHxSEQ ID NO.77 VHVL, A240 VLB9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL, A240 VL-D8 VHx SEQ ID NO.77 VHVL, y A240 VL-CEAI VHx SEQ ID NO.77 VHVL.

Figura 17: Ensayo citotóxico de las construcciones monocatenarias biespecíficas reactivas para CEA indicadas redirigidas a células CHO transfectadas con CEA, en ausencia de CEA soluble. Se usaron CTL positivos para CD8 humanos estimulados como células efectoras. La citotoxicidad frente a células diana CEA+ se muestra para SEQ ID NO.77 VHVLxAS VH-A240 VL, SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240 VL, SEQ ID NO.77 VHVLxD8 VH-A240 VL, SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VH-A240 VL y SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VLVH.

Figura 18: Ensayo citotóxico de las construcciones monocatenarias biespecíficas reactivas para CEA indicadas redirigidas a células CHO transfectadas con CEA, en ausencia de CEA soluble. Se usaron CTL positivos para CD8 humanos estimulados como células efectoras. La actividad citotóxica se muestra para SEQ ID NO.77 VHVLxA240 VL-AS VH, SEQ ID NO.77 VHVLxA240 VL-B9 VH, SEQ ID NO.77 VHVLxA240 VL-D8 VH, y SEQ ID NO.77 VHVLx A240VL-CEAI VH y SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VLVH.

Figura 19: Ensayo citotóxico de las construcciones monocatenarias biespecíficas reactivas para CEA indicadas redirigidas a células CHO transfectadas con CEA en presencia de un incremento en las cantidades de antígeno CEA soluble. Se usaron CTL positivos para CD8 humanos estimulados como células efectoras. La figura demuestra la resistencia de la actividad citotóxica de construcciones de anticuerpos monocatenarios biespecíficos humanos a antígeno CEA soluble, como se ejemplifica para AS VH-A240 VLx SEQ ID NO.77 VHVL y B9 VH-A240 VLx SEQ ID NO.77 VHVL.

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amplificación génica de la construcción se indujo incrementando las concentraciones de MTX hasta una concentración final de MTX hasta 20 nM. Las células transfectadas se sometieron a prueba a continuación para determinar la expresión del antígeno CEA usando un ensayo FACS. Para este propósito, se incubaron 2,5x105 células transfectadas con 5 µg/ml del anticuerpo monoclonal murino COL-1 (No. MS-613-P1ABX, Neomakers; 5 Fremont, CA, EE. UU.). La unión del anticuerpo se detectó con un anticuerpo específico de fragmento Fc-gamma, anti-IgG de ratón caprino, del fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina, diluido 1:100 en 50 µI de PBS con FCS al 2 % (obtenido de Dianova, Hamburg, Alemania). Las células se analizaron por citometría de flujo en un FACS-Calibur (Becton Dickinson, Heidelberg). La tinción de FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies,

10 Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002). Como resultado, los transfectantes demostraron una tinción claramente positiva para el antígeno CEA humano.

EJEMPLO 2: Generación de anticuerpos monocatenarios biespecíficos CEAxCD3

En general, las moléculas de anticuerpos monocatenarios biespecíficos, comprendiendo cada una un dominio con especificidad de unión por el antígeno CEA humano así como un dominio desinmunizado con especificidad de unión

15 por el antígeno CD3 humano representado en SEQ ID NO.77 se diseñaron como se expone en la tabla 1. La disposición de las regiones V en este dominio de unión a CD3 siempre es VH-VL. El dominio de unión anti-CD3 desinmunizado usado en los anticuerpos monocatenarios biespecíficos como se define en el presente documento se ha descrito previamente, por ejemplo, en el documento WO2005/040220.

1. Formatos de moléculas de anticuerpos monocatenarios biespecíficos que comprenden las especificidades anti20 CEA y anti-CD3 (tabla 1)

SEQ ID NO. (secuencia de aminoácidos): Formatos de construcciones de proteína (extremo N-terminal • extremo C terminal)

2: SEQ ID NO.77 VHVL x CEA I VLVH

4: SEQ ID NO.77 VHVL x CEA I VHVL

6: CEA I VLVH x SEQ ID NO.77 VHVL

8: CEA I VHVL x SEQ ID NO.77 VHVL

10: CEA II VHVL x SEQ ID NO.77 VHVL

12: CEA III VLVH x SEQ ID NO.77 VHVL

14: CEA III VHVL x SEQ ID NO.77 VHVL

16: CEA I VH-A240VL x SEQ ID NO.77 VHVL

18: A240VL -CEA I VH x SEQ ID NO.77 VHVL

20: SEQ ID NO.77 VHVL x CEA I VH – A240 VL

22: SEQ ID NO.77 VHVL x A240 VL -CEA I VH

24: A5 VH – A240 VL x SEQ ID NO.77 VHVL

26: A240 VL – A5 VH x SEQ ID NO.77 VHVL

28: SEQ ID NO.77 VHVL x A240 VL – A5 VH

30: SEQ ID NO.77 VHVL x A5 VH – A240 VL

32: B9 VH – A240 VL x SEQ ID NO.77 VHVL

34: A240 VL – B9 VH x SEQ ID NO.77 VHVL

36: SEQ ID NO.77 VHVL x B9 VH – A240 VL

38: SEQ ID NO.77 VHVL x A240 VL – B9 VH

40: D8 VH – A240 VL x SEQ ID NO.77 VHVL

42: A240 VL -D8 VH x SEQ ID NO.77 VHVL

44: SEQ ID NO.77 VHVL x D8 VH – A240 VL

46: SEQ ID NO.77 VHVL x A240 VL -D8 VH

126: A5 VH-A240 VL# x SEQ ID NO.77 VHVL

128: SEQ ID NO.77 VHVLxA5 VH-A240VL#

130: B9 VH-A240 VL# x SEQ ID NO.77 VHVL

132: SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240VL#

134: D8 VH-A240 VL# x SEQ ID NO.77 VHVL

136: SEQ ID NO.77 VHVLxD8 VH-A240VL#

143: SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240VL

Las construcciones mencionadas anteriormente que contienen las regiones de cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) específicas para el antígeno CEA humano derivadas de anticuerpos monoclonales, hibridomas u obtenidas por selección guiada por presentación en fagos (SGPF) se obtuvieron por síntesis génica y posterior 25 clonación en un vector de expresión que comprende las combinaciones VH y VL específicas para CD3. La generación de dichas construcciones monocatenarias biespecíficas también se puede llevar a cabo de acuerdo con técnicas recombinantes descritas, por ejemplo, en Sambrook (loc.cit.). Una instrucción detallada para la misma se

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