JP2019515645A - プロテインA結合ポリペプチド、抗EphA2抗体、及びそれらの使用方法 - Google Patents
プロテインA結合ポリペプチド、抗EphA2抗体、及びそれらの使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019515645A JP2019515645A JP2018541670A JP2018541670A JP2019515645A JP 2019515645 A JP2019515645 A JP 2019515645A JP 2018541670 A JP2018541670 A JP 2018541670A JP 2018541670 A JP2018541670 A JP 2018541670A JP 2019515645 A JP2019515645 A JP 2019515645A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- sequence
- antibody
- scfv
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
- A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
- A61K47/6913—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome the liposome being modified on its surface by an antibody
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本開示により提供されるのは、抗体に有用な性質を付与するCDR及びヒトフレームワーク領域を含む抗体(例えば、scFv)である。ある特定の実施形態において、そのような性質として、熱安定性(例えば、上昇した融点)、Staphylococcus aureusプロテインAとの効率的な結合、またはその両方が挙げられる。ある特定の態様において、抗体は、腫瘍関連抗原EphA2に特異的に結合する内部移行抗体である。【選択図】図1
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2016年3月16日出願の米国仮出願第62/309,365号、及び2016年3月16日出願の米国仮出願第62/309,383号、及び2016年3月16日出願の米国仮出願第62/309,374号の優先権を主張し、これらはそれぞれ、その全体が本明細書に参照として援用される。
本出願は、2016年3月16日出願の米国仮出願第62/309,365号、及び2016年3月16日出願の米国仮出願第62/309,383号、及び2016年3月16日出願の米国仮出願第62/309,374号の優先権を主張し、これらはそれぞれ、その全体が本明細書に参照として援用される。
がん細胞は、様々なタンパク質を異常発現することが多く、例えば、細胞表面受容体などある特定の細胞表面抗原の発現または過剰発現が起こる。そのような異常発現したタンパク質は、治療抗体の標的として活用することができ、複数のがんで発現する細胞表面受容体に特異的な抗体は、標的免疫療法の開発に利用されてきた。そうした治療薬の多くは、抗体薬物複合体(免疫リポソーム及び免疫毒素を含む)、及び抗体による標的指向性核酸送達ビヒクルも含めて、細胞表面抗原に結合するだけでなく、結合することで細胞内への内部移行も起こす抗体を必要とする。例えば、がん細胞が発現する細胞表面受容体を認識する抗体は、既に化学療法薬との結合が行われており、現在、ホジキンリンパ腫(ブレンツキシマブベドチン)及び転移性乳癌(アド−トラスツズマブエムタンシン)の治療に使用されている。
治療のための標的に検討されている細胞表面受容体の1つは、複数のがんで異常発現することが知られていることから、EphA2である。US9,220,772の記載によれば、抗EphA2 scFv抗体は、多段階スクリーニングプロセスを用いて単離され、このプロセスは、ヒト乳癌細胞を用いて内部移行する抗体を選出する最初の総合ファージ選択、続いてEphA2の細胞外ドメインを発現する酵母菌に対する結合で選出することを含む。抗体D2−1A7は、EphA2発現細胞により強力に取り込まれるリガンドブロックscFvとして同定された。
抗体安定性は、着実かつ規模変更が可能な抗体製造プロセスを可能にする、有用な性質である。さらに、治療用途の抗体製造を促進するために、抗体は、親和性樹脂で精製することが可能であることが望ましい。ほとんどの治療用抗体について、Staphylococcus aureusプロテインAアフィニティークロマトグラフィーは、初期の重要な工程である。なぜなら、これは、複合溶液、例えば回収した細胞培養液などから抗体と選択的かつ効率的に結合することが可能であり、1回の工程で生成不純物の>99.5%を除去して、大幅なウイルスクリアランスをもたらすからである。
細胞表面受容体に結合し、しかも工業生産及び医薬用途に適した安定性及び他の製造関連性質を示す新規抗体は引き続き必要とされている。本明細書に開示される新規改変抗体は、この需要を解決するとともに、さらなる利点を提供する。
本開示は、抗体に有用な性質を付与するCDR及びヒトフレームワーク領域を含む抗体(例えば、scFv)を提供する。ある特定の実施形態において、そのような性質として、熱安定性(例えば、上昇した融点)、Staphylococcus aureusプロテインAとの効率的な結合、またはその両方が挙げられる。ある特定の態様において、抗体は、腫瘍関連抗原EphA2に特異的に結合する内部移行抗体である。
本開示は、熱安定性を持つ(≧67℃または≧70℃の融点を示す)内部移行する抗EphA2抗体(Ab)(例えば、scFv)を提供する。同じく提供されるのは、Staphylococcus aureusプロテインAとの実質的な(例えば、実施例1のアッセイを用いて、例えば、S.aureusプロテインA(本明細書に以下、「プロテインA」)樹脂に添加されたIgの少なくとも50%、60%、または70%が結合し、その樹脂に保持されるような度合いでの)結合を示すAb(例えば、scFvs)である。所望のプロテインA結合性を付与するポリペプチド、ならびにそのようなプロテインA結合ポリペプチドを含有する抗体(例えば、scFv);所望のプロテインA結合性を付与するVH CDR2ポリペプチド、ならびにそれを含有する抗体(例えば、scFv);所望の熱安定性を提供するVH及びVLフレームワークポリペプチド(共通フレームワーク配列を含む)、ならびにそのようなフレームワーク配列を有する抗体(例えば、scFv);ならびにそのようなプロテインA結合ポリペプチド、VH CDR2ポリペプチド、及び熱安定性向上フレームワークの組み合わせを有するAb(例えば、scFv)が、提供される。また、開示されるAbは、商業規模のリポソーム結合及び他の製造プロセスに、ならびに治療用途に望ましい他の性質を示す。
すなわち、商業生産用及び医療用途向けに設計され適合した抗EphA2抗体、ならびに関連する複合体、組成物、及び使用方法が開示される。使用方法は、リポソーム治療薬用の標的指向性要素としての使用、ならびに診断薬としての、及びスクリーニング方法における使用を包含する。
したがって、本開示は、以下:
以下を含むVH:
アミノ酸配列SYAMH(配列番号17)を含む、VH CDR1;
17のアミノ酸からなる以下の配列を含むVH CDR2:
X17ISPX18GX19NX20YYADSVKG(配列番号18)、配列中:
X17は、AまたはVであり;
X18は、A、D、H、N、P、S、またはTであり;
X19は、A、R、H、N、またはPであり;及び
X20は、KまたはTであり;及び
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を含むVH CDR3;ならびに
以下を含むVL:
アミノ酸配列QGDSLRSYYAS(配列番号20)を含むVL CDR1;
アミノ酸配列GENNRPS(配列番号21)を含むVL CDR2;及び
アミノ酸配列NSRDSSGTHLTV(配列番号22)を含むVL CDR3;
を含む抗エフリンA型受容体2(EphA2)抗体であって、EphA2の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する抗体を提供する。
以下を含むVH:
アミノ酸配列SYAMH(配列番号17)を含む、VH CDR1;
17のアミノ酸からなる以下の配列を含むVH CDR2:
X17ISPX18GX19NX20YYADSVKG(配列番号18)、配列中:
X17は、AまたはVであり;
X18は、A、D、H、N、P、S、またはTであり;
X19は、A、R、H、N、またはPであり;及び
X20は、KまたはTであり;及び
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を含むVH CDR3;ならびに
以下を含むVL:
アミノ酸配列QGDSLRSYYAS(配列番号20)を含むVL CDR1;
アミノ酸配列GENNRPS(配列番号21)を含むVL CDR2;及び
アミノ酸配列NSRDSSGTHLTV(配列番号22)を含むVL CDR3;
を含む抗エフリンA型受容体2(EphA2)抗体であって、EphA2の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する抗体を提供する。
本開示は、プロテインAと結合するポリペプチドも提供し、このポリペプチドは、以下の式のアミノ酸配列:
a)XaX17ISXbX18GX19NX20(配列番号198)、配列中
Xaは、S、T、またはAであり;
X17は、AまたはVであり;
Xbは、P、R、N、またはHであり、
X18及びX19は、任意のアミノ酸であるが、実施形態によっては、X18は、A、D、H、N、P、S、またはTであり;及び/または、配列中、X19は、A、R、H、N、またはPであり;及び
X20は、KまたはTであり;
b)XaVISXbX18GX19NX20(配列番号199)、配列中
Xaは、SまたはTであり、
Xbは、P、R、またはNであり、
X18は、任意のアミノ酸であるが、実施形態によっては、A、D、H、N、P、S、またはTであり;
X19は、H、N、R、T、A、D、P、またはSであり;及び
X20は、KまたはTであり;
c)XaVISXbX18GX19NX20(配列番号200)、配列中
Xaは、SまたはTであり、
Xbは、P、R、またはNであり、
X18は、任意のアミノ酸であるが、実施形態によっては、A、D、H、N、P、S、またはTであり;
X19は、H、N、R、またはTであり;及び
X20は、TまたはKであり;
あるいは
d)XaX17ISXbX18GX19NX20(配列番号201)、配列中
Xaは、SまたはTであり、
X17は、Vであり;
Xbは、Pであり、
X18は、任意のアミノ酸であるが、実施形態によっては、A、D、H、N、P、S、またはTであり;
X19は、H、N、R、またはTであるが、実施形態によっては、A、R、H、N、またはPであり;及び
X20は、TまたはKである、
を含む。
a)XaX17ISXbX18GX19NX20(配列番号198)、配列中
Xaは、S、T、またはAであり;
X17は、AまたはVであり;
Xbは、P、R、N、またはHであり、
X18及びX19は、任意のアミノ酸であるが、実施形態によっては、X18は、A、D、H、N、P、S、またはTであり;及び/または、配列中、X19は、A、R、H、N、またはPであり;及び
X20は、KまたはTであり;
b)XaVISXbX18GX19NX20(配列番号199)、配列中
Xaは、SまたはTであり、
Xbは、P、R、またはNであり、
X18は、任意のアミノ酸であるが、実施形態によっては、A、D、H、N、P、S、またはTであり;
X19は、H、N、R、T、A、D、P、またはSであり;及び
X20は、KまたはTであり;
c)XaVISXbX18GX19NX20(配列番号200)、配列中
Xaは、SまたはTであり、
Xbは、P、R、またはNであり、
X18は、任意のアミノ酸であるが、実施形態によっては、A、D、H、N、P、S、またはTであり;
X19は、H、N、R、またはTであり;及び
X20は、TまたはKであり;
あるいは
d)XaX17ISXbX18GX19NX20(配列番号201)、配列中
Xaは、SまたはTであり、
X17は、Vであり;
Xbは、Pであり、
X18は、任意のアミノ酸であるが、実施形態によっては、A、D、H、N、P、S、またはTであり;
X19は、H、N、R、またはTであるが、実施形態によっては、A、R、H、N、またはPであり;及び
X20は、TまたはKである、
を含む。
関連実施形態において、プロテインA結合ポリペプチドは、配列番号:177〜197のアミノ酸配列のうち1つを含む。
実施形態によっては、プロテインA結合ポリペプチドは、以下:
アミノ酸配列SYAMH(配列番号17)を含むVH CDR1;
配列番号:177〜201のアミノ酸配列のうち1つを含むプロテインA結合配列;及び
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を含むVH CDR3
を含む。
アミノ酸配列SYAMH(配列番号17)を含むVH CDR1;
配列番号:177〜201のアミノ酸配列のうち1つを含むプロテインA結合配列;及び
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を含むVH CDR3
を含む。
本開示は、VH及びVLを含む抗体も提供し、VHは、本明細書に上記で記載のとおり、プロテインA結合ポリペプチドを含む。
ある特定の実施形態において、抗体は、以下のフレームワーク領域:
(a)アミノ酸配列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)を含むヒトVHフレームワーク領域1(VH FR1)、配列中、X1は、E以外のアミノ酸である、及び/または
(b)アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWVX2(配列番号2)を含むヒトVHフレームワーク領域2(VH FR2)、配列中、X2は、S以外のアミノ酸である;もしくは、抗体が、配列番号:177〜201のアミノ酸配列のうち1つを含むプロテインA結合ポリペプチドを含む場合、アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWV(配列番号202)を含むヒトVHフレームワーク領域2(VH FR2)、及び/または
(c)アミノ酸配列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(配列番号3)を含むヒトVLフレームワーク領域1(VL FR1)、配列中:X3は、Q以外のアミノ酸であり、X4は、V以外のアミノ酸であり、X5は、G以外のアミノ酸であり、X6は、R以外のアミノ酸であり、及びX7は、S以外のアミノ酸である、及び/または
(d)アミノ酸配列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(配列番号4)を含むヒトVLフレームワーク領域1(VL FR1)、配列中:X8は、Q以外のアミノ酸であり、もしくはX9は、S以外のアミノ酸である、及び/または
(e)アミノ酸配列WYQQX10PGTAPKLLIY(配列番号5)を含むヒトVLフレームワーク領域2(VL FR2)、配列中、X10は、L以外のアミノ酸である、及び/または
(f)アミノ酸配列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(配列番号6)を含むヒトVLフレームワーク領域3(VL FR3)、配列中:X11は、F以外のアミノ酸であり、X12は、K以外のアミノ酸であり、X13は、A以外のアミノ酸であり、もしくはX14は、L以外のアミノ酸である、及び/または
(g)アミノ酸配列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(配列番号7)を含むヒトVLフレームワーク領域3(VL FR3)、配列中:X15は、F以外のアミノ酸であり、もしくはX16は、K以外のアミノ酸である、
の少なくとも1つを含む。
(a)アミノ酸配列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)を含むヒトVHフレームワーク領域1(VH FR1)、配列中、X1は、E以外のアミノ酸である、及び/または
(b)アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWVX2(配列番号2)を含むヒトVHフレームワーク領域2(VH FR2)、配列中、X2は、S以外のアミノ酸である;もしくは、抗体が、配列番号:177〜201のアミノ酸配列のうち1つを含むプロテインA結合ポリペプチドを含む場合、アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWV(配列番号202)を含むヒトVHフレームワーク領域2(VH FR2)、及び/または
(c)アミノ酸配列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(配列番号3)を含むヒトVLフレームワーク領域1(VL FR1)、配列中:X3は、Q以外のアミノ酸であり、X4は、V以外のアミノ酸であり、X5は、G以外のアミノ酸であり、X6は、R以外のアミノ酸であり、及びX7は、S以外のアミノ酸である、及び/または
(d)アミノ酸配列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(配列番号4)を含むヒトVLフレームワーク領域1(VL FR1)、配列中:X8は、Q以外のアミノ酸であり、もしくはX9は、S以外のアミノ酸である、及び/または
(e)アミノ酸配列WYQQX10PGTAPKLLIY(配列番号5)を含むヒトVLフレームワーク領域2(VL FR2)、配列中、X10は、L以外のアミノ酸である、及び/または
(f)アミノ酸配列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(配列番号6)を含むヒトVLフレームワーク領域3(VL FR3)、配列中:X11は、F以外のアミノ酸であり、X12は、K以外のアミノ酸であり、X13は、A以外のアミノ酸であり、もしくはX14は、L以外のアミノ酸である、及び/または
(g)アミノ酸配列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(配列番号7)を含むヒトVLフレームワーク領域3(VL FR3)、配列中:X15は、F以外のアミノ酸であり、もしくはX16は、K以外のアミノ酸である、
の少なくとも1つを含む。
ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号8)を含むVH FR1を含む。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWVA(配列番号9)またはWVRQAPGKGLEWVT(配列番号10)を含むVH FR2を含む。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(配列番号3)を含むVL FR1を含み、配列中、X3は、Q以外のアミノ酸であり、X4は、V以外のアミノ酸であり、X5は、G以外のアミノ酸であり、X6は、R以外のアミノ酸であり、及びX7は、S以外のアミノ酸である。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(配列番号3)を含むVL FR1を含み、配列中、X3はSであり、X4はEであり、X5はVであり、X6はTであり、X7はTである。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(配列番号4)を含むVL FR1を含み、配列中、X8は、Q以外のアミノ酸であり、及びX9は、S以外のアミノ酸である。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(配列番号4)を含むVL FR1を含み、配列中、X8はSであり、またはX9はTである。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(配列番号4)を含むVL FR1を含み、配列中、X8はSであり、及びX9はTである。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列WYQQX10PGTAPKLLIY(配列番号5)を含むVL FR2を含み、配列中、X10は、L以外のアミノ酸である。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列WYQQX10PGTAPKLLIY(配列番号5)を含むVL FR2を含み、配列中、X10はKである。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(配列番号6)を含むVL FR3を含み、配列中、X11は、F以外のアミノ酸であり、X12は、K以外のアミノ酸であり、X13は、A以外のアミノ酸であり、及びX14は、L以外のアミノ酸である。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(配列番号6)を含むVL FR3を含み、配列中、X11はSであり、X12はSであり、X13はTであり、またはX14はAである。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(配列番号7)を含むVLフレームワーク領域3(VL FR3)を含み、配列中:X15は、F以外のアミノ酸であり、X16は、K以外のアミノ酸である。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(配列番号7)を含むVL FR3を含み、配列中:X15はSであり、またはX16はGである。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(配列番号7)を含むVLフレームワーク領域3(VL FR3)を含み、配列中:X15はSであり、及びX16はGである。
ある特定の実施形態において、抗体は、以下:
アミノ酸配列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)を含むVHフレームワーク領域1(VH FR1)、配列中、X1は、E以外のアミノ酸である;
アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWVX2(配列番号2)を含むVHフレームワーク領域2(VH FR2)、配列中、X2は、S以外のアミノ酸である;
アミノ酸配列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(配列番号3)を含むVLフレームワーク領域1(VL FR1)、配列中、X3は、Q以外のアミノ酸であり、X4は、V以外のアミノ酸であり、X5は、G以外のアミノ酸であり、X6は、R以外のアミノ酸であり、及びX7は、S以外のアミノ酸である;
アミノ酸配列WYQQX10PGTAPKLLIY(配列番号5)を含むVLフレームワーク領域2(VL FR2)、配列中、X10は、L以外のアミノ酸である;ならびに
アミノ酸配列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(配列番号6)を含むVLフレームワーク領域3(VL FR3)、配列中、X11は、F以外のアミノ酸であり、X12は、K以外のアミノ酸であり、X13は、A以外のアミノ酸であり、及びX14は、L以外のアミノ酸である、
を含む。
アミノ酸配列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)を含むVHフレームワーク領域1(VH FR1)、配列中、X1は、E以外のアミノ酸である;
アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWVX2(配列番号2)を含むVHフレームワーク領域2(VH FR2)、配列中、X2は、S以外のアミノ酸である;
アミノ酸配列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(配列番号3)を含むVLフレームワーク領域1(VL FR1)、配列中、X3は、Q以外のアミノ酸であり、X4は、V以外のアミノ酸であり、X5は、G以外のアミノ酸であり、X6は、R以外のアミノ酸であり、及びX7は、S以外のアミノ酸である;
アミノ酸配列WYQQX10PGTAPKLLIY(配列番号5)を含むVLフレームワーク領域2(VL FR2)、配列中、X10は、L以外のアミノ酸である;ならびに
アミノ酸配列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(配列番号6)を含むVLフレームワーク領域3(VL FR3)、配列中、X11は、F以外のアミノ酸であり、X12は、K以外のアミノ酸であり、X13は、A以外のアミノ酸であり、及びX14は、L以外のアミノ酸である、
を含む。
ある特定の実施形態において、抗体は、以下:
アミノ酸配列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)を含むVHフレームワーク領域1(VH FR1)、配列中、X1は、E以外のアミノ酸である;
アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWVX2(配列番号2)を含むVHフレームワーク領域2(VH FR2)、配列中、X2は、S以外のアミノ酸である;
アミノ酸配列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(配列番号4)を含むVLフレームワーク領域1(VL FR1)、配列中:X8は、Q以外のアミノ酸であり、またはX9は、S以外のアミノ酸である;ならびに
アミノ酸配列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(配列番号7)を含むVLフレームワーク領域3(VL FR3)、配列中:X15は、F以外のアミノ酸であり、及びX16は、K以外のアミノ酸である
を含む。
アミノ酸配列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)を含むVHフレームワーク領域1(VH FR1)、配列中、X1は、E以外のアミノ酸である;
アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWVX2(配列番号2)を含むVHフレームワーク領域2(VH FR2)、配列中、X2は、S以外のアミノ酸である;
アミノ酸配列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(配列番号4)を含むVLフレームワーク領域1(VL FR1)、配列中:X8は、Q以外のアミノ酸であり、またはX9は、S以外のアミノ酸である;ならびに
アミノ酸配列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(配列番号7)を含むVLフレームワーク領域3(VL FR3)、配列中:X15は、F以外のアミノ酸であり、及びX16は、K以外のアミノ酸である
を含む。
ある特定の実施形態において、抗体は、示差走査蛍光定量法を用いて測定した場合に67℃以上の融点(Tm)を有する。
ある特定の実施形態において、抗体は、一本鎖Fv(scFv)、IgG、Fab、(Fab)2、または(scFv’)2である。ある特定の実施形態において、抗体は、scFvである。ある特定の実施形態において、抗体は、ヒト抗体配列を含む。
ある特定の実施形態において、抗体は、VH、VL、及びフレームワークを含むscFvであり、scFv中:
VHは、以下を含み:
アミノ酸配列SYAMH(配列番号17)を有するVH CDR1;
以下の18のアミノ酸配列のうち1つを有するVH CDR2:
(I)VISPAGNNTYYADSVK(配列番号23)、
(II)VISPAGRNKYYADSVK(配列番号24)、
(III)VISPDGHNTYYADSVK(配列番号25)、
(IV)VISPHGRNKYYADSVK(配列番号26)、
(V)VISRRGDNKYYADSVK(配列番号27)、
(VI)VISNNGHNKYYADSVK(配列番号28)、
(VII)VISPAGPNTYYADSVK(配列番号29)、
(VIII)VISPSGHNTYYADSVK(配列番号30)、
(IX)VISPNGHNTYYADSVK(配列番号31)、
(X)AISPPGHNTYYADSVK(配列番号32)、
(XI)VISPTGANTYYADSVK(配列番号33)、
(XII)VISPHGSNKYYADSVK(配列番号34)、
(XIII)VISNNGHNTYYADSVK(配列番号35)、
(XIV)VISPAGTNTYYADSVK(配列番号36)、
(XV)VISPPGHNTYYADSVK(配列番号37)、
(XVI)VISHDGTNTYYADSVK(配列番号38)、
(XVII)VISRHGNNKYYADSVK(配列番号39)、
または
(XVIII)VISYDGSNKYYADSVK(配列番号40);
及び
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を有するVH CDR3;
そこで、VH CDRは、アミノからカルボキシル末端に向かって以下の順で存在し:VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、
ならびに
VLは、以下を含み:
アミノ酸配列QGDSLRSYYAS(配列番号20)を有するVL CDR1、
アミノ酸配列GENNRPS(配列番号21)を有するVL CDR2、及び
アミノ酸配列NSRDSSGTHLTV(配列番号22)を有するVL CDR3;
そこで、VL CDRは、アミノからカルボキシル末端に向かって以下の順で存在し:VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3;
scFvフレームワークは、以下を含み:
VH FR1 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号8)
VH FR2 WVRQAPGKGLEWVA(配列番号9)
VH FR3 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(配列番号11)
VH FR4 WGQGTLVTVSS(配列番号12)
VL FR1 SSELTQPPSVSVAPGQTVTITC(配列番号13)
VL FR2 WYQQKPGTAPKLLIY(配列番号14)
VL FR3 GVPDRFSGSSSGTSASLTITGAQAEDEADYYC(配列番号15)
及び
VL FR4 FGGGTKLTVLG(配列番号16)
かつ、抗体は、エフリンA型受容体2(EphA2)の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する。
VHは、以下を含み:
アミノ酸配列SYAMH(配列番号17)を有するVH CDR1;
以下の18のアミノ酸配列のうち1つを有するVH CDR2:
(I)VISPAGNNTYYADSVK(配列番号23)、
(II)VISPAGRNKYYADSVK(配列番号24)、
(III)VISPDGHNTYYADSVK(配列番号25)、
(IV)VISPHGRNKYYADSVK(配列番号26)、
(V)VISRRGDNKYYADSVK(配列番号27)、
(VI)VISNNGHNKYYADSVK(配列番号28)、
(VII)VISPAGPNTYYADSVK(配列番号29)、
(VIII)VISPSGHNTYYADSVK(配列番号30)、
(IX)VISPNGHNTYYADSVK(配列番号31)、
(X)AISPPGHNTYYADSVK(配列番号32)、
(XI)VISPTGANTYYADSVK(配列番号33)、
(XII)VISPHGSNKYYADSVK(配列番号34)、
(XIII)VISNNGHNTYYADSVK(配列番号35)、
(XIV)VISPAGTNTYYADSVK(配列番号36)、
(XV)VISPPGHNTYYADSVK(配列番号37)、
(XVI)VISHDGTNTYYADSVK(配列番号38)、
(XVII)VISRHGNNKYYADSVK(配列番号39)、
または
(XVIII)VISYDGSNKYYADSVK(配列番号40);
及び
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を有するVH CDR3;
そこで、VH CDRは、アミノからカルボキシル末端に向かって以下の順で存在し:VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、
ならびに
VLは、以下を含み:
アミノ酸配列QGDSLRSYYAS(配列番号20)を有するVL CDR1、
アミノ酸配列GENNRPS(配列番号21)を有するVL CDR2、及び
アミノ酸配列NSRDSSGTHLTV(配列番号22)を有するVL CDR3;
そこで、VL CDRは、アミノからカルボキシル末端に向かって以下の順で存在し:VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3;
scFvフレームワークは、以下を含み:
VH FR1 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号8)
VH FR2 WVRQAPGKGLEWVA(配列番号9)
VH FR3 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(配列番号11)
VH FR4 WGQGTLVTVSS(配列番号12)
VL FR1 SSELTQPPSVSVAPGQTVTITC(配列番号13)
VL FR2 WYQQKPGTAPKLLIY(配列番号14)
VL FR3 GVPDRFSGSSSGTSASLTITGAQAEDEADYYC(配列番号15)
及び
VL FR4 FGGGTKLTVLG(配列番号16)
かつ、抗体は、エフリンA型受容体2(EphA2)の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する。
ある特定の実施形態において、scFvのVHは、VLに対してアミノ末端側である。
ある特定の実施形態において、scFvは、少なくとも約67℃のTmを示す。ある特定の実施形態において、scFvは、少なくとも約70℃のTmを示す。
ある特定の実施形態において、scFvは、VHとVLを連結するリンカーを含み、リンカーは、以下:
ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号41)、
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号42)、
GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号43)、
ASTGGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(配列番号44)、
GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(配列番号45)、
TPSHNSHQVPSAGGPTANSGTSGS(配列番号46)、及び
GGSSRSSSSGGGGSGGGG(配列番号47)
から選択されるアミノ酸配列を含む。
ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号41)、
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号42)、
GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号43)、
ASTGGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(配列番号44)、
GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(配列番号45)、
TPSHNSHQVPSAGGPTANSGTSGS(配列番号46)、及び
GGSSRSSSSGGGGSGGGG(配列番号47)
から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、scFvリンカーは、アミノ酸配列ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号41)を含む。ある特定の実施形態において、抗体は、VH及びVLを含み、VHは、VH及びVLのアミノ酸配列と少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含み、VHは、配列番号133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、または175のアミノ酸配列と少なくとも95%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。関連実施形態において、これらの抗体のVLは、配列番号134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、または176のアミノ酸配列と少なくとも95%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、抗体は、C末端に、GlyGlySerGlyGlyCys(配列番号54)を含む。
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるとおりの抗体;及び抗体と結合した部分を含む、抗体複合体を提供する。ある特定の実施形態において、結合した部分は、脂質ナノ粒子である。ある特定の実施形態において、脂質ナノ粒子は、リポソームである。ある特定の実施形態において、結合した部分は、ポリエチレングリコール(PEG)を含む。ある特定の実施形態において、結合した部分は、治療薬を含む。ある特定の実施形態において、治療薬は、細胞毒性剤である。ある特定の実施形態において、結合した部分は、検出可能な標識を含む。ある特定の実施形態において、検出可能な標識は、in vivo造影剤である。
ある特定の実施形態において、本開示は、本開示の抗体または複合体;及び薬学上許容される担体を含む組成物を提供する。ある特定の実施形態において、組成物は、非経口投与用に配合される。ある特定の実施形態において、本開示は、容器に入った本開示の組成物を含むキットを提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、本開示のscFvをコードする、単離された核酸を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、本開示の抗体の、可変軽鎖ポリペプチド、可変重鎖ポリペプチド、またはその両方をコードする、単離された核酸を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、本開示の核酸、及び核酸と機能的に連結した真核生物プロモーターを含む発現ベクターを提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、本開示の発現ベクターを含む非ヒト宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態において、細胞は、可変軽鎖ポリペプチド、可変重鎖ポリペプチド、またはその両方を発現する。
ある特定の実施形態において、本開示は、EphA2発現がんを有する対象の治療方法を提供し、本方法は、EphA2発現がんを有する対象に、本開示の、抗体、抗体複合体、あるいは抗体及び/または抗体複合体を含む組成物を投与することを含む。
ある特定の実施形態において、本開示は、EphA2発現がんの治療に使用するための組成物を提供し、組成物は、本開示の抗体及び/または抗体複合体を含む。
本開示は、EphA2発現がんの治療における組成物の使用を提供し、組成物は、本開示の抗体及び/または抗体複合体を含む。
図3及び図4で、番号1〜22により識別されるscFvは、配列表でscFv1〜scFv22として識別される該当アミノ酸配列を含み、同一の識別スキームが、scFv1〜scFv22のアミノ酸配列をコードする核酸配列についても使用される。核酸配列は、さらに、コードされたscFvを発現する哺乳類(例えば、ヒトまたは齧歯類)細胞により切り落とされるN末端リーダー配列をコードする。図1、図3、及び図4で使用される場合、「F5」は、scFv F5を示す。「TS1」は、scFv TS1を示す。「TS1*」は、scFv TS1*を示し(なお、TS1*のVLは、TS1のVLと同一であり、図1ではそのように示されている)、「A7」は、scFv D2−1A7を示す。
提供されるのは、新規の有用な抗体(例えば、一本鎖抗体、例えば、scFv)である。同じく提供されるのは、抗体を含む、複合体、組成物、及びキットである。例えば、免疫リポソームの製造における、Abの使用方法も、提供される。
定義
本明細書で使用される場合、「抗体」(「Ab」)は、免疫グロブリン(「Ig」)、または抗原結合Ig断片、あるいは免疫グロブリンから得られるまたは派生する相補性決定領域(「CDR」)を含む他の抗原結合ポリペプチド(例えば、一本鎖抗体、例えば、一本鎖可変断片(「scFv」)など)であり、これらは、免疫特異的抗原結合、すなわち、CDRが介在する抗原結合を示す。天然起源のAbは、一般に、少なくとも4本のポリペプチド鎖を含み、これらの鎖は、少なくとも2本の重鎖及び少なくとも2本の軽鎖の両方を含むが、ある特定の哺乳類Abは、単独の(軽)鎖(例えば、ベンスジョーンズタンパク質)を含有する、または1本の軽鎖及び1本の重鎖を含有することが知られている。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεと分類することができ、これらはさらに、それぞれ、天然起源のヒトIgクラス、IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgE、を定める。典型的なIgG、IgD、またはIgEヒトAbの例として、ポリペプチド鎖の対2つで構成され、各対が1本の「軽」鎖及び1本の「重」鎖を有する、四量体の構造単位を有するものがある。
本明細書で使用される場合、「抗体」(「Ab」)は、免疫グロブリン(「Ig」)、または抗原結合Ig断片、あるいは免疫グロブリンから得られるまたは派生する相補性決定領域(「CDR」)を含む他の抗原結合ポリペプチド(例えば、一本鎖抗体、例えば、一本鎖可変断片(「scFv」)など)であり、これらは、免疫特異的抗原結合、すなわち、CDRが介在する抗原結合を示す。天然起源のAbは、一般に、少なくとも4本のポリペプチド鎖を含み、これらの鎖は、少なくとも2本の重鎖及び少なくとも2本の軽鎖の両方を含むが、ある特定の哺乳類Abは、単独の(軽)鎖(例えば、ベンスジョーンズタンパク質)を含有する、または1本の軽鎖及び1本の重鎖を含有することが知られている。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεと分類することができ、これらはさらに、それぞれ、天然起源のヒトIgクラス、IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgE、を定める。典型的なIgG、IgD、またはIgEヒトAbの例として、ポリペプチド鎖の対2つで構成され、各対が1本の「軽」鎖及び1本の「重」鎖を有する、四量体の構造単位を有するものがある。
「ヒト抗体」(「ヒトAb」)は、本明細書で使用される場合、その抗体がどのような特定の方法により製造されることも必要とせず、また抗体が天然起源であることも必要としない。そうではなく、「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、抗体、その抗原結合断片、またはヒト抗体のアミノ酸配列(例えば、CDR、フレームワーク)を含むが、そのCDR及び/またはフレームワークは、自然には一緒に生じない(すなわち、天然起源ではない)ことを示す。
「抗EphA2 Ab」は、EphA2、例えば、EphA2のECDに免疫特異的に結合するAbを示す。EphA2特異的Abは、EphA2タンパク質に存在しない抗原に対して、免疫特異的に結合しない。
「CDR」は、相補性決定領域を示す。
「CLIA」は、キレート化リガンド誘導型内部移行アッセイを示す。
「DiI5」は、染料1,1’−ジオクタデシル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドジカルボシアニン−5,5’−ジスルホン酸を示す。
「DOD−トリ−NTA」は、以下に記載されるとおりのジオクタデシルアミノ−トリ−NTA化合物(化合物12)を示す:Huang, et al, ‘‘Facile Synthesis of Multivalent Nitrilotriacetic Acid (NTA) and NTA Conjugates for Analytical and Drug Delivery Applications’’, Bioconjugate Chemistry, 2006, vol.17, p. 1692−1600。NTAは、ニトリロ三酢酸を示す。
「DSF」は、示差走査蛍光定量法を示す。
「DSPE」は、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンを示す。
「ECD」は、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを示す。
「EphA2」は、エフリンA型受容体2を示し、これは「上皮細胞キナーゼ(ECK)」とも称する、エフリンAリガンドと結合し、これにより活性化することが可能な受容体チロシンキナーゼである膜貫通タンパク質である。「EphA2」という用語は、EphA2の天然起源のアイソフォームのどれでも示すことができる。ヒトEphA2のアミノ酸配列は、GenBank受入番号第NP_004422.2号として記録されている。
「エピトープ」とは、抗原上のある部位、例えばEphA2 ECD上のある部位であり、そこにAbが免疫特異的に結合する。エピトープは、近接アミノ酸、またはタンパク質を形成するポリペプチド鎖の折り畳み(例えば、三次折り畳み)により並置される非近接アミノ酸のどちらからも形成される可能性がある。
「Fab」は、Igの抗原結合断片(どのように調製されたかを問わず)を示し、可変領域及び第一の定常ドメインを含む。
「FACS」は、蛍光標示式細胞分取法を示す。
「His6」は、ヘキサヒスチジンペプチドを示す。
「HSPC」は、水素添加ダイズホスファチジルコリンを示す。
「Ig」は、免疫グロブリンを示す。Igの軽鎖または重鎖可変領域は、複数の「フレームワーク」領域(FR)が3つの超可変領域(「相補性決定領域」または「CDR」とも称する)と交互に並ぶことで構成されている。フレームワーク領域及びCDRの範囲は、公開データベースで見られる配列との相同性に基づいて定義することができる。例えば、‘‘Sequences of Proteins of Immunological Interest,’’ E. Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 4th ed. U.S. Dept. Health and Human Services, Public Health Services, Bethesda, MD(1987)を参照。本明細書で使用されるAb配列付番は全て、Kabatらにより定義されるとおりである。
「IgG」は、Gアイソタイプの免疫グロブリンを示す。
「単離された」は、関心対象の実体(例えば、タンパク質、例えば、Ab)が、自然発生する可能性のある環境、またはそれが製造もしくは合成される可能性のある環境とは異なる環境にある場合の、その実体を示す。「単離された」実体は、その実体が作られる細胞または反応容器中でその実体に付随する要素の全てまたは一部から、分離されている。対象Abは、実質的に純粋であることが可能である。「実質的に純粋」は、少なくとも組成物全体の少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または99%超が、関心対象の実体(例えば、本明細書で開示される抗EphA2 Ab)である組成物を示すことができる。
「Mal−PEG−DSPE」は、マレイミド−PEG(2000)−DSPE(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[マレイミド(ポリエチレングリコール)−2000]を示す。
「MFI」は、蛍光強度中央値を示す。
「NTA(Ni)」は、ニッケル−ニトリロ三酢酸を示す。
「PBS」は、リン酸緩衝食塩水を示す。
「PEG」は、ポリエチレングリコールを示す。
「PEG−DSPE」は、メトキシ−PEG(2000)−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを示す。
「scFv」は、一本鎖Fvを示し、これは、VH及びVLが、典型的にはVH及びVLのCDRからなる機能的抗原結合部位の形成を可能にするリンカーペプチドを介して、互いに共有結合した一本鎖ポリペプチド鎖で構成されるタンパク質である。
「SEC」は、サイズ排除クロマトグラフィーを示す。
「SM」は、スフィンゴミエリンを示す。
「Tm」は、融点を示す。
「TS1」は、以下に開示されるとおりのscFv−TS1を示す。
「TS1*」は、以下に開示されるとおりのscFv−TS1*を示す。
「VH」は、Ig重鎖の可変領域を示し、これはVHポリペプチドと称する場合もある。
「VL」は、Ig軽鎖の可変領域を示し、これはVLポリペプチドと称する場合もある。
抗体
本開示が提供するのは、Abに有用な性質を付与するフレームワーク配列及びCDR配列を含む、抗EphA2Abである。実施例に記載されるAbはscFvであるものの、本明細書で開示されるCDR及びヒトフレームワーク配列は、IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMAbに、容易にかつ有益に組み込むことができる。ある特定の実施形態において、そのような性質として、安定性(例えば、熱安定性、例えば、65℃超、67℃以上、または少なくとも約70℃の融点)、プロテインAとの≧30%、≧40%、または≧50%の結合、あるいはその両方が挙げられる。
本開示が提供するのは、Abに有用な性質を付与するフレームワーク配列及びCDR配列を含む、抗EphA2Abである。実施例に記載されるAbはscFvであるものの、本明細書で開示されるCDR及びヒトフレームワーク配列は、IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMAbに、容易にかつ有益に組み込むことができる。ある特定の実施形態において、そのような性質として、安定性(例えば、熱安定性、例えば、65℃超、67℃以上、または少なくとも約70℃の融点)、プロテインAとの≧30%、≧40%、または≧50%の結合、あるいはその両方が挙げられる。
フレームワーク領域
ある特定の実施形態において、本明細書で開示されるscFvは、VH FR1、VH FR2、VH FR3、VL FR1、VL FR2、及びVL FR3の1つまたはそれらの任意の組み合わせを含み:
ある特定の実施形態において、本明細書で開示されるscFvは、VH FR1、VH FR2、VH FR3、VL FR1、VL FR2、及びVL FR3の1つまたはそれらの任意の組み合わせを含み:
VH FR1は、アミノ酸配列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)を含むヒトVH FR1であり、配列中、X1は、E以外のアミノ酸であり、及びある特定の実施形態において、X1はQであり;
VH FR2は、アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWVX2(配列番号2)を含むヒトVH FR2であり、配列中、X2は、S以外のアミノ酸であり、及びある特定の実施形態において、X2はAであり;
VL FR1は、アミノ酸配列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(配列番号3)を含むヒトVL FR1であり、配列中:X3は、Q以外のアミノ酸であり、X4は、V以外のアミノ酸であり、X5は、G以外のアミノ酸であり、X6は、R以外のアミノ酸であり、X7は、S以外のアミノ酸であり、及びある特定の実施形態において、X4はVであり、X5はGであり、及びX6はRであり;
ある特定の実施形態において、VL FR1は、アミノ酸配列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(配列番号4)を含むヒトVL FR1であり、配列中、X8は、Q以外のアミノ酸であり、配列中、X9は、S以外のアミノ酸であり、及びある特定の実施形態において、X8はSであり、及び/またはX9はTであり;
VL FR2は、アミノ酸配列WYQQX10PGTAPKLLIY(配列番号5)を含むヒトVL FR2であり、配列中、X10は、L以外のアミノ酸であり、及び/または、ある特定の実施形態において、X10はKであり;
ならびに
VL FR3は、アミノ酸配列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(配列番号6)を含むヒトVL FR3であり、配列中:X11は、F以外のアミノ酸であり、X12は、K以外のアミノ酸であり、X13は、A以外のアミノ酸であり、またはX14は、L以外のアミノ酸であり、及びある特定の実施形態において、X11はSであり、X12はSであり、X13はTであり、及び/またはX14はAであり;
ある特定の実施形態において、VL FR3は、アミノ酸配列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(配列番号7)を含むヒトVL FR3であり、配列中:X15は、F以外のアミノ酸であり、またはX16は、K以外のアミノ酸であり、及びある特定の実施形態において、X15はSであり、及び/またはX16はGである。
ある特定の実施形態において、本明細書で開示されるAbは、表1に記載されるVH FR1、VH FR2、VH FR3、VL FR1、VL FR2、及びVL FR3の1つまたはそれらの任意の組み合わせを含む。1つの実施形態において、Abは、scFvであり、表1のフレームワークの全てを含有する。
ある特定の態様において、本明細書で開示されるAb(例えば、scFv)は、例えば、そのAbは堅牢かつ規模変更が可能な製造によく適しているような熱安定性を有する。本明細書で使用される場合、「熱安定性」Abとは、例えば、示差走査蛍光定量法(DSF)を用いて測定した場合に、70℃以上の融点(Tm)を有するAbである。適切な融点を有するAbの例は、以下の実験セクションに記載される。
ある特定の実施形態において、本明細書で開示されるAbは、例えば、実施例1に記載されるアッセイを用いて測定した場合に、プロテインAに対して30%、40%、または有益には50%以上の結合を示す。
EphA2結合
特に関心対象である抗体として、EphA2ポリペプチドの細胞外ドメイン、すなわち、GenBank受入番号第NP_004422.2またはUniProt受入番号第P29317に記載の配列の少なくともアミノ酸残基の25〜534位にわたるEphA2タンパク質の一部分に結合する抗EphA2Abが挙げられる。
特に関心対象である抗体として、EphA2ポリペプチドの細胞外ドメイン、すなわち、GenBank受入番号第NP_004422.2またはUniProt受入番号第P29317に記載の配列の少なくともアミノ酸残基の25〜534位にわたるEphA2タンパク質の一部分に結合する抗EphA2Abが挙げられる。
ある特定の実施形態において、本明細書で開示される抗EphA2抗体(例えば、scFv)は、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含み、これらはそれぞれ、表2Aに記載のとおりの配列を持つ。他の実施形態において、VH CDR2配列(CDRH2とも称する)は、表2Bに記載の18の異なるVH CDR2配列から選択される任意の1種となる。
表2A及び表3のVH CDR2について:X17は、AまたはVであり;X18は、A、D、H、N、P、S、またはTであり;X19は、A、R、H、またはPであり;及び、X20は、KまたはTである。ある特定の実施形態において:X17は、Aであり;X18は、HまたはPであり;あるいは、X19は、RまたはPである。ある特定の実施形態において:X17は、Vであり;X18は、HまたはPであり;X19は、RまたはNであり;及び、X20は、KまたはTである。ある特定の実施形態において:X17は、Vであり;X18は、HまたはDであり;X19は、HまたはNであり;及び、X20はTである。
本開示が提供するscFvの例を、図5に提示する。図5は、scFv1〜scFv22のアミノ酸配列、ならびに、対応するコード核酸配列を提示する。scFv2〜scFv22の各アミノ酸配列中の下線部は、リンカーのアミノ酸配列(ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号41)を示す。scFv1〜scFv22の下線のあるアミノ酸配列に対してN末端のアミノ酸配列は、scFvのVHポリペプチドのアミノ酸配列である。scFv1〜scFv22の下線のあるアミノ酸配列に対してC末端のアミノ酸配列は、scFvのVLポリペプチドのアミノ酸配列である。
したがって、本開示は、VH及びVLを有する抗体(scFvを含む)を提供し、このVHは、図5に記載されるとおりのscFv1〜scFv22のいずれか1つのVHと、少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する。本開示はまた、VH及びVLを含む抗体(scFvを含む)を提供し、このVHは、図5に記載されるとおりのscFv1〜scFv22のいずれか1つのVH及びVLのVH及びVLと少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む。本開示はまた、VH及びVLを有する抗体(scFvを含む)を提供し、VH及びVLはそれぞれ、図5のscFvのVH及びVLのVH及びVLのアミノ酸配列を含む。
図5のscFv1〜scFv22のVH及びVLのアミノ酸配列は、以下のとおりである:scFv1のVH及びVL(それぞれ、配列番号133及び134)、scFv2のVH及びVL(それぞれ、配列番号135及び136)、scFv3のVH及びVL(それぞれ、配列番号137及び138)、scFv4のVH及びVL(それぞれ、配列番号139及び140)、scFv5のVH及びVL(それぞれ、配列番号141及び142)、scFv6のVH及びVL(それぞれ、配列番号143及び144)、scFv7のVH及びVL(それぞれ、配列番号145及び146)、scFv8のVH及びVL(それぞれ、配列番号147及び148)、scFv9のVH及びVL(それぞれ、配列番号149及び150)、scFv10のVH及びVL(それぞれ、配列番号151及び152)、scFv11のVH及びVL(それぞれ、配列番号153及び154)、scFv12のVH及びVL(それぞれ、配列番号155及び156)、scFv13のVH及びVL(それぞれ、配列番号157及び158)、scFv14のVH及びVL(それぞれ、配列番号159及び160)、scFv15のVH及びVL(それぞれ、配列番号161及び162)、scFv16のVH及びVL(それぞれ、配列番号163及び164)、scFv17のVH及びVL(それぞれ、配列番号165及び166)、scFv18のVH及びVL(それぞれ、配列番号167及び168)、scFv19のVH及びVL(それぞれ、配列番号169及び170)、scFv20のVH及びVL(それぞれ、配列番号171及び172)、scFv21のVH及びVL(それぞれ、配列番号173及び174)、またはscFv22のVH及びVL(それぞれ、配列番号175及び176)。
本開示はまた、配列番号60[scFv1]、配列番号62[scFv2]、配列番号64[scFv3]、配列番号66[scFv4]、配列番号68[scFv5]、配列番号70[scFv6]、配列番号72[scFv7]、配列番号74[scFv8]、配列番号76[scFv9]、配列番号78[scFv10]、配列番号80[scFv11]、配列番号82[scFv12]、配列番号84[scFv13]、配列番号86[scFv14]、配列番号88[scFv15]、配列番号90[scFv16]、配列番号92[scFv17]、配列番号94[scFv18]、配列番号96[scFv19]、配列番号98[scFv20]、配列番号100[scFv21]、または配列番号102[scFv22]のアミノ酸配列と少なくとも95%アミノ酸配列同一性を有するscFv、ならびにそれらをコードする核酸を提供する。本開示はまた、配列番号60[scFv1]、配列番号62[scFv2]、配列番号64[scFv3]、配列番号66[scFv4]、配列番号68[scFv5]、配列番号70[scFv6]、配列番号72[scFv7]、配列番号74[scFv8]、配列番号76[scFv9]、配列番号78[scFv10]、配列番号80[scFv11]、配列番号82[scFv12]、配列番号84[scFv13]、配列番号86[scFv14]、配列番号88[scFv15]、配列番号90[scFv16]、配列番号92[scFv17]、配列番号94[scFv18]、配列番号96[scFv19]、配列番号98[scFv20]、配列番号100[scFv21]、または配列番号102[scFv22]のアミノ酸配列を有するscFv、ならびにそれらをコードする核酸を提供する。
本開示はまた、プロテインAと結合するポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、抗体(例えば、scFv)中に存在していてもよく、かつ、これは、以下のアミノ酸配列を含む:
XaX17ISXbX18GX19NX20(配列番号198)
配列中
Xaは、S、T、またはAであり;
X17は、AまたはVであり;
Xbは、P、R、N、またはHであり、
X18及びX19は、任意のアミノ酸であり;及び
X20は、KまたはTである。
配列中
Xaは、S、T、またはAであり;
X17は、AまたはVであり;
Xbは、P、R、N、またはHであり、
X18及びX19は、任意のアミノ酸であり;及び
X20は、KまたはTである。
1つの実施形態において、ポリペプチド(これは、抗体(例えば、scFv)中に存在していてもよい)は、配列番号198のアミノ酸配列を含み、配列中、X18は、A、D、H、N、P、S、またはTであり;及び、X19は、A、R、H、N、またはPである。
1つの実施形態において、そのようなポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、以下
アミノ酸配列SYAMH(配列番号17)を含むVH CDR1;
配列番号198の式のプロテインA結合配列、配列中、X18は任意のアミノ酸、または、A、D、H、N、P、S、もしくはTであり;及び配列中、X19は任意のアミノ酸、または、A、R、H、N、もしくはPであり;ならびに
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を含むVH CDR3、
を含む。
アミノ酸配列SYAMH(配列番号17)を含むVH CDR1;
配列番号198の式のプロテインA結合配列、配列中、X18は任意のアミノ酸、または、A、D、H、N、P、S、もしくはTであり;及び配列中、X19は任意のアミノ酸、または、A、R、H、N、もしくはPであり;ならびに
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を含むVH CDR3、
を含む。
配列番号198のポリペプチドが抗体(例えば、scFv)中に存在する場合、抗体は、アミノ酸配列QGDSLRSYYAS(配列番号20)を含むVL CDR1、アミノ酸配列GENNRPS(配列番号21)を含むVL CDR2、及びアミノ酸配列NSRDSSGTHLTV(配列番号22)を含むVL CDR3を含む場合がある。1つの実施形態において、ポリペプチドが抗体(例えば、scFv)である場合、抗体(例えば、scFv)は、VH FR1及びVH FR2の一方または両方を含み、このVH FR1は、アミノ酸配列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)を含み、配列中、X1は、E以外のアミノ酸であり、及び、ある特定の実施形態において、X1はQであり;このVH FR2は、アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWV(配列番号202)を含む。そのような抗体(例えば、scFv)は、配列番号3のアミノ酸配列を含むVL FR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVL FR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVL FR3、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むVL FR3の1つまたは複数も含む場合がある。1つの実施形態において、そのような抗体(例えば、scFv)は、表1のVH FR1、VH FR2、VH FR3、VL FR1、VL FR2、及びVL FR3の任意の組み合わせを1つまたは複数含む。
本開示はまた、プロテインAと結合するポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、抗体(例えば、scFv)中に存在していてもよく、かつ、これは、以下のアミノ酸配列を含む:
XaVISXbX18GX19NX20(配列番号199)、
配列中
Xaは、SまたはTであり、
Xbは、P、R、またはNであり、
X18は、任意のアミノ酸であり;
X19は、H、N、R、T、A、D、P、またはSであり;及び
X20は、KまたはTである。
配列中
Xaは、SまたはTであり、
Xbは、P、R、またはNであり、
X18は、任意のアミノ酸であり;
X19は、H、N、R、T、A、D、P、またはSであり;及び
X20は、KまたはTである。
1つの実施形態において、ポリペプチド(これは、抗体(例えば、scFv)中に存在していてもよい)は、配列番号199のアミノ酸配列を含み、配列中、X18は、A、D、H、N、P、S、またはTである。
1つの実施形態において、ポリペプチド(これは、抗体(例えば、scFv)中に存在していてもよい)は、配列番号199のアミノ酸配列を含み、配列中、X18は、A、D、H、N、P、S、またはTであり;及び、X19は、A、R、H、N、またはPである。
1つの実施形態において、そのようなポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、以下
アミノ酸配列SYAMH(配列番号17)を含むVH CDR1;
配列番号199の式のプロテインA結合配列、配列中、X18は任意のアミノ酸、または、A、D、H、N、P、S、もしくはTであり;及び配列中、X19は任意のアミノ酸、または、A、R、H、N、もしくはPであり;ならびに
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を含むVH CDR3
を含む。
アミノ酸配列SYAMH(配列番号17)を含むVH CDR1;
配列番号199の式のプロテインA結合配列、配列中、X18は任意のアミノ酸、または、A、D、H、N、P、S、もしくはTであり;及び配列中、X19は任意のアミノ酸、または、A、R、H、N、もしくはPであり;ならびに
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を含むVH CDR3
を含む。
配列番号199のポリペプチドが抗体(例えば、scFv)中に存在する場合、抗体は、アミノ酸配列QGDSLRSYYAS(配列番号20)を含むVL CDR1、アミノ酸配列GENNRPS(配列番号21)を含むVL CDR2、及びアミノ酸配列NSRDSSGTHLTV(配列番号22)を含むVL CDR3を含む場合がある。1つの実施形態において、ポリペプチドが抗体(例えば、scFv)である場合、抗体(例えば、scFv)は、VH FR1及びVH FR2の一方または両方を含み、このVH FR1は、アミノ酸配列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)を含み、配列中、X1は、E以外のアミノ酸であり、及び、ある特定の実施形態において、X1はQであり;このVH FR2は、アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWV(配列番号202)を含む。そのような抗体(例えば、scFv)は、配列番号3のアミノ酸配列を含むVL FR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVL FR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVL FR3、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むVL FR3の1つまたは複数も含む場合がある。1つの実施形態において、そのような抗体(例えば、scFv)は、表1のVH FR1、VH FR2、VH FR3、VL FR1、VL FR2、及びVL FR3の任意の組み合わせを1つまたは複数含む。
本開示はまた、プロテインAと結合するポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、抗体(例えば、scFv)中に存在していてもよく、かつ、これは、以下のアミノ酸配列を含む:
XaVISXbX18GX19NX20(配列番号200)
配列中
Xaは、SまたはTであり、
Xbは、P、R、またはNであり、
X18は、任意のアミノ酸であり;
X19は、H、N、R、またはTであり;及び
X20は、TまたはKである。
配列中
Xaは、SまたはTであり、
Xbは、P、R、またはNであり、
X18は、任意のアミノ酸であり;
X19は、H、N、R、またはTであり;及び
X20は、TまたはKである。
1つの実施形態において、ポリペプチド(これは、抗体(例えば、scFv)中に存在していてもよい)は、配列番号200のアミノ酸配列を含み、配列中、X18は、A、D、H、N、P、S、またはTである。1つの実施形態において、ポリペプチド(これは、抗体(例えば、scFv)中に存在していてもよい)は、配列番号200のアミノ酸配列を含み、配列中、X18は、A、D、H、N、P、S、またはTであり;及び、X19は、A、R、H、N、またはPである。
1つの実施形態において、そのようなポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、以下
アミノ酸配列SYAMH(配列番号17)を含むVH CDR1;
配列番号200の式のプロテインA結合配列、配列中、X18は任意のアミノ酸、または、A、D、H、N、P、S、もしくはTであり;及び配列中、X19は任意のアミノ酸、または、A、R、H、N、もしくはPであり;ならびに
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を含むVH CDR3
を含む。
アミノ酸配列SYAMH(配列番号17)を含むVH CDR1;
配列番号200の式のプロテインA結合配列、配列中、X18は任意のアミノ酸、または、A、D、H、N、P、S、もしくはTであり;及び配列中、X19は任意のアミノ酸、または、A、R、H、N、もしくはPであり;ならびに
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を含むVH CDR3
を含む。
配列番号200のポリペプチドが抗体(例えば、scFv)中に存在する場合、抗体は、アミノ酸配列QGDSLRSYYAS(配列番号20)を含むVL CDR1、アミノ酸配列GENNRPS(配列番号21)を含むVL CDR2、及びアミノ酸配列NSRDSSGTHLTV(配列番号22)を含むVL CDR3を含む場合がある。1つの実施形態において、ポリペプチドが抗体(例えば、scFv)である場合、抗体(例えば、scFv)は、VH FR1及びVH FR2の一方または両方を含み、このVH FR1は、アミノ酸配列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)を含み、配列中、X1は、E以外のアミノ酸であり、及び、ある特定の実施形態において、X1はQであり;このVH FR2は、アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWV(配列番号202)を含む。そのような抗体(例えば、scFv)は、配列番号3のアミノ酸配列を含むVL FR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVL FR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVL FR3、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むVL FR3の1つまたは複数も含む場合がある。1つの実施形態において、そのような抗体(例えば、scFv)は、表1のVH FR1、VH FR2、VH FR3、VL FR1、VL FR2、及びVL FR3の任意の組み合わせを1つまたは複数含む。
本開示はまた、プロテインAと結合するポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、抗体中(例えば、scFv)に存在していてもよく、かつ、これは、以下のアミノ酸配列を含む:
XaX17ISXbX18GX19NX20(配列番号201)、
配列中
Xaは、SまたはTであり、
X17は、Vであり;
Xbは、Pであり、
X18は、任意のアミノ酸であり;
X19は、H、N、R、またはTであり;及び
X20は、TまたはKである。
配列中
Xaは、SまたはTであり、
X17は、Vであり;
Xbは、Pであり、
X18は、任意のアミノ酸であり;
X19は、H、N、R、またはTであり;及び
X20は、TまたはKである。
1つの実施形態において、ポリペプチド(これは、抗体(例えば、scFv)中に存在していてもよい)は、配列番号201のアミノ酸配列を含み、配列中、X18は、A、D、H、N、P、S、またはTである。
1つの実施形態において、ポリペプチド(これは、抗体(例えば、scFv)中に存在していてもよい)は、配列番号201のアミノ酸配列を含み、配列中、X18は、A、D、H、N、P、S、またはTであり;及び、X19は、A、R、H、N、またはPである。
1つの実施形態において、そのようなポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、以下
アミノ酸配列SYAMH(配列番号17)を含むVH CDR1;
配列番号201の式のプロテインA結合配列、配列中、X18は任意のアミノ酸、または、A、D、H、N、P、S、もしくはTであり;及び配列中、X19は任意のアミノ酸、または、A、R、H、N、もしくはPであり;ならびに
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を含むVH CDR3
を含む。
アミノ酸配列SYAMH(配列番号17)を含むVH CDR1;
配列番号201の式のプロテインA結合配列、配列中、X18は任意のアミノ酸、または、A、D、H、N、P、S、もしくはTであり;及び配列中、X19は任意のアミノ酸、または、A、R、H、N、もしくはPであり;ならびに
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を含むVH CDR3
を含む。
配列番号201のポリペプチドが抗体(例えば、scFv)中に存在する場合、抗体は、アミノ酸配列QGDSLRSYYAS(配列番号20)を含むVL CDR1、アミノ酸配列GENNRPS(配列番号21)を含むVL CDR2、及びアミノ酸配列NSRDSSGTHLTV(配列番号22)を含むVL CDR3を含む場合がある。1つの実施形態において、ポリペプチドが抗体(例えば、scFv)である場合、抗体(例えば、scFv)は、VH FR1及びVH FR2の一方または両方を含み、このVH FR1は、アミノ酸配列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)を含み、配列中、X1は、E以外のアミノ酸であり、及び、ある特定の実施形態において、X1はQであり;このVH FR2は、アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWV(配列番号202)を含む。そのような抗体(例えば、scFv)は、配列番号3のアミノ酸配列を含むVL FR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVL FR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVL FR3、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むVL FR3の1つまたは複数も含む場合がある。1つの実施形態において、そのような抗体(例えば、scFv)は、表1のVH FR1、VH FR2、VH FR3、VL FR1、VL FR2、及びVL FR3の任意の組み合わせを1つまたは複数含む。
さらなる実施形態において、本開示は、プロテインAと結合するポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、抗体(例えば、scFv)中に存在していてもよく、かつ、これは、図5に記載されるとおりの配列番号:177〜197から選択されるアミノ酸配列を含む。
1つの実施形態において、このポリペプチドは、抗体(例えば、scFv)中に存在していてもよく、かつ、これは、配列番号:177〜197のうちの1つのアミノ酸配列を含む。
1つの実施形態において、そのようなポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、以下
アミノ酸配列SYAMH(配列番号17)を含むVH CDR1;
配列番号:177〜197のうちの1つのプロテインA結合配列;及び
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を含むVH CDR3
を含む。
アミノ酸配列SYAMH(配列番号17)を含むVH CDR1;
配列番号:177〜197のうちの1つのプロテインA結合配列;及び
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を含むVH CDR3
を含む。
配列番号177〜197のポリペプチドが抗体(例えば、scFv)中に存在する場合、抗体は、アミノ酸配列QGDSLRSYYAS(配列番号20)を含むVL CDR1、アミノ酸配列GENNRPS(配列番号21)を含むVL CDR2、及びアミノ酸配列NSRDSSGTHLTV(配列番号22)を含むVL CDR3を含む場合がある。1つの実施形態において、ポリペプチドが抗体(例えば、scFv)である場合、抗体(例えば、scFv)は、VH FR1及びVH FR2の一方または両方を含み、このVH FR1は、アミノ酸配列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)を含み、配列中、X1は、E以外のアミノ酸であり、及び、ある特定の実施形態において、X1はQであり;このVH FR2は、アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWV(配列番号202)を含む。そのような抗体(例えば、scFv)は、配列番号3のアミノ酸配列を含むVL FR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むVL FR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を含むVL FR3、及び配列番号6のアミノ酸配列を含むVL FR3の1つまたは複数も含む場合がある。1つの実施形態において、そのような抗体(例えば、scFv)は、表1のVH FR1、VH FR2、VH FR3、VL FR1、VL FR2、及びVL FR3の任意の組み合わせを1つまたは複数含む。
ある特定の実施形態において、本明細書で開示されるAbは、内部移行する抗EphA2 Abである。そのようなAbが、適切な条件下、生細胞の外側表面に存在するEphA2分子のECDに結合すると、その結果Abの内部移行が起こる。この内部移行は、Abが、細胞膜を境界とする細胞内部へと輸送されることを特徴とする。内部移行するAbは、例えば、治療用途で、例えば、薬物、毒素、酵素、ナノ粒子(例えば、リポソーム)、DNAなどを標的指向送達するためのビヒクルとしての利用を見出す。
本明細書で開示される特定のAbは、一本鎖FvAb、例えば、scFvまたは(scFv’)2である。そのようなAbでは、VH及びVLポリペプチドは、2通りの向き(すなわち、VLに対してVHがN末端、またはVHに対してVLがN末端)いずれかで、直接またはアミノ酸リンカーを介していずれかで、互いに連結されている。そのようなリンカーは、例えば、長さが1〜50、5〜40、10〜30、または15〜25アミノ酸である場合がある。ある特定の実施形態において、アミノ酸リンカーの残基の80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、または100%が、セリン(S)及び/またはグリシン(G)である。適切なscFvリンカーの例として、以下の配列であるものまたは以下の配列を含むものが可能である:
ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号41)、
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号42)、
GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号43)、
ASTGGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(配列番号44)、
GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(配列番号45)、
TPSHNSHQVPSAGGPTANSGTSGS(配列番号46)、または
GGSSRSSSSGGGGSGGGG(配列番号47)。
ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号41)、
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号42)、
GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号43)、
ASTGGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(配列番号44)、
GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(配列番号45)、
TPSHNSHQVPSAGGPTANSGTSGS(配列番号46)、または
GGSSRSSSSGGGGSGGGG(配列番号47)。
上記のTS1において、CDRは、下線が付してあり、以下の順で存在する:VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3。すなわち、scFv TS1において、及び本明細書で開示されるある特定の他のscFvにおいて、scFvのHVは、scFvのアミノ末端にあり、リンカー(ここでは、斜体になっている)によりVLと連結されている。
同じく提供されるのは、TS1のVH CDR2を除く全てのフレームワーク領域及びCDRが未改変であるが、VH CDR2は、上記の表2Bに記載される18の異なるCDRH2配列から選択されたいずれかのCDRに置き換えられている、scFv TS1の変異体である。
Ab作製方法
本明細書で提供される情報を用いて、本明細書で開示されるAbを、標準技法を用いて調製することができる。例えば、本明細書で提供されるアミノ酸配列を用いて、Abをコードする適切な核酸配列を決定することができ、次いで、核酸配列を用いて、1つまたは複数のAbを発現させることができる。核酸配列(複数可)は、標準方法に従って様々な発現系にとっての特定コドン「優先性」を反映するように最適化することができる。
本明細書で提供される情報を用いて、本明細書で開示されるAbを、標準技法を用いて調製することができる。例えば、本明細書で提供されるアミノ酸配列を用いて、Abをコードする適切な核酸配列を決定することができ、次いで、核酸配列を用いて、1つまたは複数のAbを発現させることができる。核酸配列(複数可)は、標準方法に従って様々な発現系にとっての特定コドン「優先性」を反映するように最適化することができる。
本明細書で提供される配列情報を用いて、核酸を、複数の標準方法に従って合成することができる。オリゴヌクレオチド合成は、市販されている固相オリゴヌクレオチド合成機器で便利に行うことも、手作業で、例えば、固相ホスホルアミダイトトリエステル法を用いて、合成することもできる。いったん本明細書で開示されるAbをコードする核酸が合成されたら、標準方法に従ってそれを増幅及び/またはクローン化することができる。
本明細書で開示されるAbをコードする天然または合成の核酸の発現は、Abをコードする核酸をプロモーター(これは、構成型でも誘導型でもよい)と機能的に連結し、構築物を発現ベクターに組込んで、組換え発現ベクターを作製することにより達成できる。ベクターは、原核生物、真核生物、またはその両方における複製及び組込みに適したものが可能である。典型的なクローニングベクターは、機能的に適切に方向付けられた転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、ならびにAbをコードする核酸の発現の制御に有用なプロモーターを含有する。ベクターは、任意選択で、少なくとも1つの独立したターミネーター配列、例えばシャトルベクターで見られるとおりの真核生物及び原核生物の両方でカセットの複製を許容する配列、ならびに真核生物及び原核生物系両方用の選択マーカーを含有する遺伝子発現カセットを含有する。
クローン化核酸の発現を高レベルで得るため、転写を指示する強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写/翻訳ターミネーターを含有し、これらがそれぞれ互いに対して及びタンパク質コード配列に対して機能的方向にある、発現プラスミドを構築することが一般的である。Ab遺伝子(複数可)は、同定、精製、及び操作をしやすくするためのタグ配列、例えば、FLAG(商標)またはHis6などを、Ab(例えばscFv)のC末端またはN末端に付加することを可能にする発現ベクターにサブクローン導入することもできる。いったんAbをコードする核酸が単離及びクローン化されたら、その核酸を様々な組換え操作された細胞で発現させることができる。そのような細胞の例として、細菌、酵母菌、糸状菌、昆虫、及び哺乳類の細胞が挙げられる。
本明細書で開示されるAbの単離及び精製は、培養上清から、Abを分泌する細胞から単離し、続いてアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することにより達成でき、あるいは、タンパク質を構成的に及び/または誘導に際して発現するように遺伝子修飾された細胞のライセートから、または合成反応混合物から単離することができ、精製、例えば、アフィニティークロマトグラフィー(例えば、プロテインAまたタンパク質Gを用いる)による精製を合わせて行うことができる。単離されたAbは、さらに、透析及びタンパク質精製で通常採用される他の方法により精製することができる。
本開示は、対象Abを産生する細胞も提供する。例えば、本開示は、本明細書で開示されるAb、またはそのポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸で遺伝子修飾された組換え宿主細胞を提供する。DNAは、例えば、細菌(例えば、バクテリオファージ)、酵母菌(例えば、SaccharomycesまたはPichia)、昆虫(例えば、バキュロウイルス)、または哺乳類発現系にクローン導入される。適切な技法の1つは、糸状バクテリオファージベクター系を使用する。例えば、US5,885,793;US5,969,108;及びUS6,512,097を参照。
Ab修飾
本開示は、所望の特長を提供するように、例えば、対象中の特定の組織型及び/または細胞型への(例えば、腫瘍への)送達を促進する、血清半減期を延長する、抗がん活性を追加する、などを行うように修飾されたAb(及びAbをコードする核酸)を包含する。本明細書で開示されるAbは、修飾ありまたはなしで提供することができ、ヒトAbを模範例とするが、ヒト化AbまたはキメラAbとして容易に修飾及び調製することができる。Ab(例えば、scFv)を修飾する1つのやり方は、1つまたは複数の配列要素を、Abに含まれるポリペプチド鎖のN及び/またはC末端で、またはAbの任意のアミノ酸(内部アミノ酸を含む)に結合(例えば連結)させることである。そのような追加配列要素として、例えば、リポソーム、別のタンパク質、検出可能な標識(例えば、例えば、放射性同位体、検出可能な生成物を生成する酵素、蛍光タンパク質、発色タンパク質、色素、蛍光発光金属、化学発光化合物など)、薬物、及び/または担体分子が挙げられる。任意選択で、そのような結合は、Abを追加配列要素(複数可)と接続させるリンカー部分を介している。
本開示は、所望の特長を提供するように、例えば、対象中の特定の組織型及び/または細胞型への(例えば、腫瘍への)送達を促進する、血清半減期を延長する、抗がん活性を追加する、などを行うように修飾されたAb(及びAbをコードする核酸)を包含する。本明細書で開示されるAbは、修飾ありまたはなしで提供することができ、ヒトAbを模範例とするが、ヒト化AbまたはキメラAbとして容易に修飾及び調製することができる。Ab(例えば、scFv)を修飾する1つのやり方は、1つまたは複数の配列要素を、Abに含まれるポリペプチド鎖のN及び/またはC末端で、またはAbの任意のアミノ酸(内部アミノ酸を含む)に結合(例えば連結)させることである。そのような追加配列要素として、例えば、リポソーム、別のタンパク質、検出可能な標識(例えば、例えば、放射性同位体、検出可能な生成物を生成する酵素、蛍光タンパク質、発色タンパク質、色素、蛍光発光金属、化学発光化合物など)、薬物、及び/または担体分子が挙げられる。任意選択で、そのような結合は、Abを追加配列要素(複数可)と接続させるリンカー部分を介している。
1つまたは複数の追加配列要素で修飾された本明細書で開示されるAbは、1つまたは複数の追加配列要素の性質を利用して1つまたは複数の追加特性を与えながらも、その結合特異性は保持する。
ある特定の実施形態において、本明細書で開示されるAbは、治療部分への付加、例えば、脂質ナノ粒子(例えば、リポソーム、中実脂質ナノ粒子、またはミセル)の外側への付加、あるいは化学療法薬、例えば、マイタンシノイド(例えば、DM1、ado−トラスツズマブエムタンシンの化学療法薬部分)またはアウリスタチン(例えば、モノメチルアウリスタチンE、ブレンツキシマブベドチンの化学療法薬部分)などへの付加により配合される。脂質微小粒子に付加される場合、Abは、脂質膜に挿入するのに適した脂質と結合している重合体と(例えば、重合体の末端で)共有結合させることができる。Abが結合したリポソームを、本明細書で、「免疫リポソーム(複数可)」と称する。本明細書で開示されるAbは、免疫リポソーム標的指向化要素として作用することができ、免疫リポソームががん細胞の表面のEphA2に特異的に結合することを可能にする。免疫リポソームには、小分子(例えば、化学療法薬)、または核酸(例えばsiRNA)などの抗がん剤を1種または複数ロードして含有させることができる。リポソーム及び免疫リポソームなど、脂質ナノ粒子を作製及びロードする方法は、例えば、US2010/0068255、US2010/0008978、US2009/0171077、US2009/0155272、US2007/0116753、US2007/0110798、US2007/0031484、US2006/0147513、US2005/0112065、US2004/0037874、US2004/0209366、US2003/0003143、US7,135,177、US7,022,336、US6,803,053、US6,528,087、US6,214,388、US6,210,707、US6,110,491、US5,980,935、US5,380,531、US7,507,407、US7,479,276,及びUS7,462,603に記載されている。
Abに付加させる上記配列要素のどれでも、リンカー、例えば可動性リンカー、例えばペプチドリンカーまたはポリエチレングリコールリンカーを介してAbに連結させることができる。存在する場合、リンカー分子は、一般に、例えば、脂質ナノ粒子の表面に結合した場合に、Ab及びリンカー部分が、Abにある程度運動の自由度を与えられるようにするのに十分な長さのものである。
組成物
同じく本開示が提供するのは、組成物、例えば、本明細書で開示されるAbもしくは複合体、または本明細書で開示されるAbのいずれかをコードする核酸のいずれかを含む組成物である。ある特定の態様において、組成物は、対象(例えば、ヒト)でのがん治療に用途を見出し、疾患のどの段階中でも治療に適している可能性がある。1種、2種、またはそれより多くの異なるAbを含有する組成物は、医薬組成物として提供することができ、それを必要としている哺乳類(例えば、ヒト)に投与することができる。
同じく本開示が提供するのは、組成物、例えば、本明細書で開示されるAbもしくは複合体、または本明細書で開示されるAbのいずれかをコードする核酸のいずれかを含む組成物である。ある特定の態様において、組成物は、対象(例えば、ヒト)でのがん治療に用途を見出し、疾患のどの段階中でも治療に適している可能性がある。1種、2種、またはそれより多くの異なるAbを含有する組成物は、医薬組成物として提供することができ、それを必要としている哺乳類(例えば、ヒト)に投与することができる。
上記のとおり、リポソームは、本明細書で開示されるAbとは異なるAbを1種または複数含有する場合がある。リポソームは、そのリポソームが複数の異なるAbを付加により有しており、本明細書で開示されるAbが結合するEphA2エピトープの他に少なくとも1種のさらなるエピトープまたは抗原に対して特異的であるという点で、二重特異性、多重特異性、などである場合がある。
合剤は、単独の配合物で提供することも、別々の配合物として提供することも可能であり、例えば、キットとして、別々の容器に入っており、これらの容器をさらにより大きな容器に入れることができ、別々の配合物は、例えば、1種類のAb、または複数種の異なるAbを含有することができる。そのような別々の配合物は、投与の前に混合することも、別々に注射することにより投与することもできる。
本明細書で開示されるAbまたは免疫リポソームは、薬学上許容される担体に配合する、例えば、記載される方法で使用するための非経口投与用に配合することができる。ある特定の実施形態において、例えば、Abが注射液(例えば、静脈内注射に適したもの)として投与される場合、Ab配合物は、滅菌、無パイロジェンの水性液剤が可能であり、この液剤は、塩(例えば、浸透圧を調節するための)、緩衝剤、保存剤、アミノ酸、ならびに他の薬学上許容される担体及び賦形剤の1つ、または複数、あるいは全部を含み、またAb配合物は、例えば、すぐに使える剤形として、または再構築可能な貯蔵安定性粉末または液体として提供することが可能である。対流向上送達を介した投与用配合物は、例えば、US20090208422に記載のとおりである場合がある。
本開示の組成物は、治療上有効量の対象抗体、ならびに必要に応じて任意の他の適合成分を含むことができる。「治療上有効量」は、個体にその量で投与することが、単回投与であれ、一連の同一または異なる抗体または組成物の一部であれ、対象におけるがん性細胞の増殖及び/または転移を低減する、あるいは任意の他の検出可能な治療効果を提供するのに有効であることを意味する。そのような治療上有効量の抗体及び細胞増殖に対するその影響として、1つまたは複数の他の療法(例えば、免疫療法、化学療法、放射線療法など)との併用における細胞増殖の協同的及び/または相乗的阻害が挙げられる。以下に記載のとおり、治療上有効量は、投薬レジメン及び対象の状態の診断解析(例えば、EphA2に特異的な抗体を用いて細胞表面エピトープの有無についてモニタリングすること)などと関連して調節することができる。
量及び投薬
正確な用量は、当業者により確認可能となる。投薬量は、様々な要因に依存する可能性があり、そのような要因として、使用される特定化合物の強度、対象の状態、及び対象の体重、ならびに疾病の重篤度及び疾患の段階が挙げられる。投薬量はまた、特定化合物の投与に付随する可能性がある任意の有害副作用の存在、性質、及び程度により決まることになる。当該分野で既知のとおり、年齢、体重、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、及び状態の重篤度に基づいた調節が、必要である場合があり、常用実験を用いて当業者により確認可能となる。治療上有効量は、治療上有益な効果が抗体のどの毒性効果または有害効果にも勝る場合のものでもある。
正確な用量は、当業者により確認可能となる。投薬量は、様々な要因に依存する可能性があり、そのような要因として、使用される特定化合物の強度、対象の状態、及び対象の体重、ならびに疾病の重篤度及び疾患の段階が挙げられる。投薬量はまた、特定化合物の投与に付随する可能性がある任意の有害副作用の存在、性質、及び程度により決まることになる。当該分野で既知のとおり、年齢、体重、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、及び状態の重篤度に基づいた調節が、必要である場合があり、常用実験を用いて当業者により確認可能となる。治療上有効量は、治療上有益な効果が抗体のどの毒性効果または有害効果にも勝る場合のものでもある。
対象、例えば、ヒトに投与される組成物の量は、本開示の文脈において、妥当な時間枠にわたって動物に予防的または治療的反応をもたらすのに十分でなければならず、投与の目的、治療される個体の健康状態及び身体状態、年齢、所望の消散度合い、抗体組成物の配合、治療に当たる医師の病状の評価、ならびに他の関連要因に依存して変化する。すなわち、この量は、比較的広範囲に含まれることが予想されるが、そうであっても、対象の様々な特長、例えば上記したものなどを通じて常用的に決定することができる。
例として、対象抗体の治療的または予防的有効量の範囲は、約0.1mg/kg〜約20mg/kg、例えば、約1mg/kg〜約10mg/kgであるが、これらに限定されない。
医薬配合物中の抗体濃度は、重量で、約0.1%未満、通常は約2%または少なくとも約2%から、最大で20%〜50%以上まで変わる可能性があり、選択した投与の特定様式及び患者の必要に従って、主に液体体積、粘度などを考慮して選択することになる。
同じく、適切な用量及び投薬レジメンは、所望の増殖阻害または免疫抑制反応に影響を及ぼすことが既知である抗がん剤または免疫抑制剤との比較により決定される可能性がある。そのような投薬量として、目立った副作用なしに細胞増殖の低用量阻害をもたらす投薬量が挙げられる。ある特定化合物を適切な用量で適切な投与で用いる場合、本開示の化合物は広範囲の細胞内効果、例えば、細胞増殖の部分阻害から本質的に完全な阻害までをもたらすことができる。投薬治療は、単回用量計画の場合も、複数用量計画の場合もある(例えば、漸増漸減及び維持量を含む)。以下に示すとおり、対象組成物は、他の作用剤と併用して投与することができ、したがって、用量及びレジメンは、この文脈でも同様に、対象の必要を満たすように変化させることができる。
併用療法
多種多様ながん治療のどれであっても、本開示の抗体と組み合わせた組成物にすることができる。例えば、化学療法剤を用いる治療または生体反応修飾剤治療で使用される作用剤が、免疫リポソームなどの抗体を含む医薬組成物中に存在する場合がある。
多種多様ながん治療のどれであっても、本開示の抗体と組み合わせた組成物にすることができる。例えば、化学療法剤を用いる治療または生体反応修飾剤治療で使用される作用剤が、免疫リポソームなどの抗体を含む医薬組成物中に存在する場合がある。
化学療法薬は、がん細胞の増殖を低減する非タンパク質性化合物であり、細胞毒性剤及び細胞分裂阻害剤を包含する。化学療法薬の例として、アルキル化剤、ニトロソ尿素、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、植物アルカロイド(例えば、ビンカアルカロイド)、核酸、例えば抑制性核酸など(例えばsiRNA)、及びステロイドホルモンが挙げられるが、これらに限定されない。
代謝拮抗剤として、例えば、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、及びアデノシンデアミナーゼ阻害剤が挙げられる。
適切な自然産物及びそれらの誘導体(例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍性抗生物質、酵素、リンホカイン、及びエピポドフィロトキシン)は、抗がん剤として使用できる。例えば、タキサン、例えば、パクリタキセルなど、ならびに任意の活性タキサン誘導体、例えばドセタキセルなど、またはタキサンプロドラッグ、例えば2’−(2−(N,N’−ジエチルアミノ)プロピオニル)−パクリタキセル、7−(2−(N,N’−ジエチルアミノ)プロピオニル)−パクリタキセル、2’−(2−(N,N’−ジエチルアミノ)プロピオニル)−ドセタキセル、もしくは7−(2−(N,N’−ジエチルアミノ)プロピオニル)−ドセタキセルなど、が適切である。
他の抗増殖性細胞毒性剤として、ナベルビン(navelbene)、CPT−11(イリノテカン)、アナストロゾール(anastrazole)、レトロゾール(letrazole)、カペシタビン、ラロキシフェン(reloxafine)、シクロホスファミド、イホスファミド(ifosamide)、及びドロロキシフェン(droloxafine)がある。抗増殖性活性を有する微小管作用剤も、使用に適している。ホルモン修飾剤及びステロイド(合成類似体を含む)は、使用に適している。
方法
治療方法
本開示の抗体は、様々ながんに治療用途を見出す。がんを有する、有する疑いがある、または発症するリスクがある対象は、本明細書に記載される療法及び診断法の対象として企図される。
治療方法
本開示の抗体は、様々ながんに治療用途を見出す。がんを有する、有する疑いがある、または発症するリスクがある対象は、本明細書に記載される療法及び診断法の対象として企図される。
「治療」は、宿主に影響を及ぼす健康状態に関連した症候の少なくとも寛解が達成されることを意味し、寛解は、広義で使用されて、治療される健康状態に関連したパラメーター、例えば症候などの規模の少なくとも低下を示す。そのため、治療は、病理学的状態、または少なくともそれに関連した症候が、完全に阻止される、例えば、発生が予防される、または停止される、例えば宿主がその健康状態、もしくは少なくともその健康状態を特徴付ける症候によりもはや苦しんでいないように、終結するなどの状況も含む。すなわち、治療は、以下を含む:(i)予防、すなわち、臨床症候の発生リスクの低下であり、これには、臨床症候が発生しない状態を引き起こすこと、例えば、疾患が有害な段階へと進行するのを防ぐことが含まれる;(ii)阻害、すなわち、臨床症候の発生またはさらなる発生の抑止、例えば、腫瘍量を減少させるように、例えば、活動性疾患を軽減または完全に阻害すること、この減少として、検出可能ながん性細胞(例えば転移性がん細胞)の除去を挙げることができる;及び/または(iii)緩和、すなわち、臨床症候の退縮を引き起こすこと。
様々な対象を、本方法により治療することができる。一般に、そのような対象は、「哺乳類(mammal)」または「哺乳類(mammalian)」であり、これらの用語は、哺乳綱に含まれる生物を記載するために広義で使用され、そのような生物として、食肉目(例えば、イヌ及びネコ)、齧歯目(例えば、マウス、モルモット、及びラット)、ならびに霊長目(例えば、ヒト、チンパンジー、及びサル)が挙げられる。多くの実施形態において、対象は、ヒトになる。
関連実施形態において、治療される対象は、腫瘍関連抗原、及び/またはEphA2を発現する(例えば過剰発現する)がんを有する。抗原は、がん細胞表面で発現し、相当する非がん性細胞上よりも高いレベルで存在することが多い。この態様は、EphA2を発現するまたは提示する細胞が本開示の抗体を用いた治療に適している可能性があるという点で、本開示の方法の文脈において有益となる可能性がある。抗体は、例えば、抗原の存在が検出可能ではない時点で治療が開始される場合に、対象に投与することができ、したがって、何ら制限を意図しない。疾患症候の最初の兆候の前に、または疾患の診断前もしくは後に、抗体治療を開始することも可能である。
がん
本開示の抗EphA2抗体組成物及び/または抗EphA2抗体複合体組成物は、抗がん治療、特にがん性細胞が細胞外から接触可能な細胞表面にEphA2を提示する場合に、使用可能である。例えば、本明細書に記載される抗体組成物及び/または治療抗体複合体組成物は、がん性細胞の増殖を低減させるため、例えば、腫瘍の大きさを減少させる、がん量を減少させる、転移を減少させる、及び/または患者の臨床転帰を改善するために、対象(例えばヒト患者)に投与することができる。本明細書で企図されるがんに関連した方法として、例えば、抗体治療の単独でのまたは抗がんワクチンもしくは治療と併用での使用が挙げられる。
本開示の抗EphA2抗体組成物及び/または抗EphA2抗体複合体組成物は、抗がん治療、特にがん性細胞が細胞外から接触可能な細胞表面にEphA2を提示する場合に、使用可能である。例えば、本明細書に記載される抗体組成物及び/または治療抗体複合体組成物は、がん性細胞の増殖を低減させるため、例えば、腫瘍の大きさを減少させる、がん量を減少させる、転移を減少させる、及び/または患者の臨床転帰を改善するために、対象(例えばヒト患者)に投与することができる。本明細書で企図されるがんに関連した方法として、例えば、抗体治療の単独でのまたは抗がんワクチンもしくは治療と併用での使用が挙げられる。
抗体治療に特に適したがんは、本明細書に記載される診断方法と同様な方法及び当該分野で既知の他の方法により同定することができる。
抗がん治療が、上記の抗体組成物の投与を含む場合、抗がん治療は、対象抗体と結合するエピトープを細胞表面で接触可能なように及び/または溶媒と接触するように発現する、転移性癌をはじめがん性細胞を特に目指すように仕向けることができる。
治療に適したEphA2発現がんの例として、固形腫瘍、半固形腫瘍、及び液性腫瘍が挙げられる。治療に適したEphA2発現がんの例として、乳房、脳、卵巣、膀胱、前立腺、膵臓、食道、肺(例えば、非小細胞肺癌)、及び胃のEphA2陽性癌が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されず、また、結腸、外陰部、皮膚(例えば、黒色腫)、腎臓、及び神経膠腫(例えば、多形神経膠芽腫、星状細胞腫)、白血病、ならびにリンパ腫を挙げることができる。
なお、EphA2は、がん細胞で非がん性細胞よりも高いレベルで発現する可能性があるものの、このことは、本明細書に開示される治療の制限とはならない。
本明細書で開示される方法による治療に適したEphA2発現細胞がんとして、食道癌、肝細胞癌、基底細胞癌(皮膚癌の1形態)、有棘細胞癌(種々の組織)、移行細胞癌(膀胱の悪性新生物)を含む膀胱癌、気管支原性癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、肺の小細胞癌及び非小細胞癌を含む肺癌、副腎皮質癌、甲状腺癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、腎細胞癌、非浸潤性乳管癌または胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、骨原性癌、上皮癌、及び上咽頭癌が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で開示される方法による治療に適したEphA2発現肉腫として、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨原性肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、及び他の軟部組織肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で開示される方法による治療に適したさらなるEphA2発現固形腫瘍として、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で開示される方法による治療に適する可能性があるEphA2発現白血病として、以下:a)慢性骨髄増殖症候群(多分化能造血幹細胞の腫瘍性障害);b)急性骨髄性白血病(多分化能造血幹細胞または系列可能性が限定された造血細胞の腫瘍性形質転換;c)慢性リンパ性白血病(CLL;免疫学的に未熟及び機能的に無能な小リンパ球のクローン増殖)、これにはB細胞CLL、T細胞CLL前リンパ性白血病、及び有毛細胞白血病が含まれる;ならびにd)急性リンパ芽球性白血病(リンパ芽球の蓄積を特徴とする)、が挙げられるが、これらに限定されない。方法を用いて治療可能なリンパ腫として、B細胞リンパ腫(例えば、バーキットリンパ腫);ホジキンリンパ腫;非ホジキンリンパ腫などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で開示される方法による治療に適した他のがんとして、非定型髄膜腫(脳)、膵島細胞癌(膵臓)、髄様癌(甲状腺)、間葉細胞腫(腸管)、肝細胞癌(肝臓)、肝芽腫(肝臓)、腎明細胞癌(腎臓)、及び縦隔神経線維腫が挙げられる。
本明細書で開示される方法を使用する治療に適する可能性があるがんの他の例として、上皮及び神経外胚葉起源のEphA2発現がんが挙げられるが、これらに限定されない。上皮起源のEphA2発現がんの例として、小細胞肺癌、乳房、眼水晶体、結腸、膵臓、腎臓、肝臓、卵巣、及び気管支上皮の癌が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の方法は、EphA2を過剰発現することが既知であるがん細胞の治療に用いることができる。
神経外胚葉起源のEphA2発現がんの例として、ユーイング肉腫、脊椎腫瘍、脳腫瘍、新生児テント上未分化神経外胚葉腫瘍、管状嚢胞癌、粘液性尿細管細胞及び紡錘細胞癌、腎腫瘍、縦隔腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、ならびに思春期及び青年期の肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
他の癌療法との併用
上記のとおり、本方法の別の特長は、抗体が、1種または複数の他の療法と併用して対象に投与可能であるということである。そのような療法は、組み合わせて1つの組成物にする場合も、対象抗体と結合させる場合もある。本明細書に開示される抗体と物理的に組み合わせる(例えば、複合体として、またはリポソームもしくは他の脂質ナノ粒子に入れて)だけでなく、1種または複数の抗がん剤、例えば上記の表4に列挙されるものなどを、本明細書に開示される抗体の投与と併用して、同時にまたは前後いずれかで、投与することができる。
上記のとおり、本方法の別の特長は、抗体が、1種または複数の他の療法と併用して対象に投与可能であるということである。そのような療法は、組み合わせて1つの組成物にする場合も、対象抗体と結合させる場合もある。本明細書に開示される抗体と物理的に組み合わせる(例えば、複合体として、またはリポソームもしくは他の脂質ナノ粒子に入れて)だけでなく、1種または複数の抗がん剤、例えば上記の表4に列挙されるものなどを、本明細書に開示される抗体の投与と併用して、同時にまたは前後いずれかで、投与することができる。
抗体組成物の投与以外の療法または治療は、対象抗体の投与と同時から、それより最長5時間以上、例えば、10時間、15時間、20時間以上前または後までのいつでも投与することができる。対象抗体及び他の治療介入は、順次、例えば、対象抗体を別の治療的処置の前後に投与することで、投与または施行される。対象抗体及び他の治療は、例えば、対象抗体及び第二の治療が同時に投与される、例えば、第二の治療が薬物である場合に、それが対象抗体と併せて、2つの別個の配合物としてまたは1つの組成物に組み合わされて対象に投与される場合に、同時に投与される。投与が、上記のとおり順次であるか同時であるかにかかわらず、これらの治療は、本開示において、一緒にまたは併用で投与されたとみなされる。
対象抗体と併用して投与されるかどうかはわからないが、さらなる標準抗がん治療として、免疫療法、化学療法薬、及び手術(例えば、以下でさらに記載されるとおりのもの)が挙げられるが、これらに限定されない。また、対象抗体の治療的投与は、抗がん治療を受けた対象の治療後処置であることも可能であり、この場合の抗がん治療は、例えば、手術、放射線療法、化学療法薬の投与などが可能である。本明細書に記載されるもの以外の抗体、特に標的細胞の補体介在型死滅、及び/または抗体依存性細胞性細胞障害型死滅をもたらすことが可能なモノクローナル抗体も、使用することができる。
例えば、対象抗体は、1種または複数の化学療法薬(例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾン(CHOP))と併用して、及び/または放射線治療と併用して、及び/または手術介入(例えば、腫瘍除去手術前もしくは手術後)、放射線療法、骨髄移植、生体反応修飾剤治療、及びこれらのある特定の組み合わせと併用して、投与することができる。放射線療法として、ビームとしてなど外部からの照射線源として、または小放射線源の移植により、送達されるX線またはガンマ線が挙げられるが、これらに限定されない。
投与経路
本方法を実施するにあたり、投与経路(対象抗体が対象にもたらされる経路)は変わる可能性があり、対象抗体の代表的な投与経路を、以下にさらに詳細に記載する。上記の対象抗体は、単独でまたは併用して、全身に(例えば、非経口、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、脳室内、もしくは皮下投与により)または局所的に(例えば、局所腫瘍部位で、例えば、腫瘍内投与(例えば、固形腫瘍中へ、リンパ腫もしくは白血病の関連リンパ節中へ、または例えば、US20090209937に開示されるとおり、例えば脳中への対流向上送達により)、固形腫瘍が供給を受けている血管中への投与などにより)、体腔または管腔中に、あるいは臓器に、投与することができる。これらの異なる投与経路は、注射または輸液により行うことができる。
本方法を実施するにあたり、投与経路(対象抗体が対象にもたらされる経路)は変わる可能性があり、対象抗体の代表的な投与経路を、以下にさらに詳細に記載する。上記の対象抗体は、単独でまたは併用して、全身に(例えば、非経口、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、脳室内、もしくは皮下投与により)または局所的に(例えば、局所腫瘍部位で、例えば、腫瘍内投与(例えば、固形腫瘍中へ、リンパ腫もしくは白血病の関連リンパ節中へ、または例えば、US20090209937に開示されるとおり、例えば脳中への対流向上送達により)、固形腫瘍が供給を受けている血管中への投与などにより)、体腔または管腔中に、あるいは臓器に、投与することができる。これらの異なる投与経路は、注射または輸液により行うことができる。
非経口投与に適した配合物として、水性及び非水性の、等張性滅菌注射液剤が挙げられ、これらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び配合物を目的レシピエントの血液と等張性にする溶質を含有することができ、ならびに水性及び非水性の、滅菌懸濁剤が挙げられ、これらは、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤を含むことができる。配合物は、単位用量または複数用量の密閉容器、例えばアンプル及びバイアルなどに入れて提供することができ、また、使用直前に注射用に滅菌液状賦形剤、例えば、水を加えるだけでよい凍結乾燥(凍結乾燥)状態で貯蔵することができる。注射液剤及び懸濁剤は、上記した類の滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製することができる。非経口投与可能な組成物の調製方法は、当業者には既知または自明であるだろう。
治療の投与は、所望の期間にわたり繰り返すことができ、例えば、約1日〜約5日にわたり繰り返す、または約1ヶ月、約2ヶ月などにわたり、数日ごとに、例えば、約5日ごとに1回で繰り返すことができる。治療は、他の治療的介入、例えばがん性細胞を除去する手術介入などの前、同時、または後に投与することもできる。抗体は、併用療法の一部としても投与することができ、併用療法では、免疫療法、がん化学療法、または放射線療法の少なくとも1種が、対象に投与される(上記でより詳細に記載されるとおり)。
検出方法
本開示は、対象中の生体試料中または対象から単離された試料中の、例えば、EphA2発現細胞上の、EphA2を検出する方法を提供する。本方法は、診断目的及び予後診断目的の両方に有用である。対象方法は、概して、細胞含有試料を、本開示の抗体または抗体複合体と接触させること;及び試料中の細胞に対する抗体または抗体複合体の結合を検出することを含む。細胞は、in vitroであることが可能であり、この場合、細胞は、がん細胞を有することが疑われる対象、癌治療を受けている対象、または治療に対する感受性について試験されている対象から得られる生体試料中にある。細胞は、in vivoであることが可能であり、例えば、細胞は、がん細胞を有することが疑われる対象、がん治療を受けている対象、または治療に対する感受性について試験されている対象中にある。
本開示は、対象中の生体試料中または対象から単離された試料中の、例えば、EphA2発現細胞上の、EphA2を検出する方法を提供する。本方法は、診断目的及び予後診断目的の両方に有用である。対象方法は、概して、細胞含有試料を、本開示の抗体または抗体複合体と接触させること;及び試料中の細胞に対する抗体または抗体複合体の結合を検出することを含む。細胞は、in vitroであることが可能であり、この場合、細胞は、がん細胞を有することが疑われる対象、癌治療を受けている対象、または治療に対する感受性について試験されている対象から得られる生体試料中にある。細胞は、in vivoであることが可能であり、例えば、細胞は、がん細胞を有することが疑われる対象、がん治療を受けている対象、または治療に対する感受性について試験されている対象中にある。
本明細書に記載される検出アッセイは、対象の有するがんが、抗体に基づく療法を用いた治療にどれだけ適しているか判断するため、ならびに対象における治療の進行をモニタリングするために使用することができる。このアッセイは、他の併用療法の過程を評価するために使用することもできる。すなわち、診断アッセイは、医師が療法及び治療レジメンを選択するための情報を提供することができる。
抗体は、免疫診断技法を介して、EphA2発現がん性細胞を有するまたは有することが疑われる対象の生体試料中のEphA2発現細胞を検出するために使用することができる。そのような診断は、以下で開示される治療法に適した患者を同定する、及び/または治療法に対する反応をモニタリングするのに有用となる可能性がある。
適切な免疫診断技法として、in vitro及びin vivo(撮像)方法の両方が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。例えば、抗EphA2抗体は、検出可能なように標識化し、EphA2の細胞表面発現を特徴とするがんを有することが疑われる対象に投与して、結合した検出可能な標識化抗体を、当該分野で利用可能な撮像方法を用いて検出することができる。
「in vivo撮像」という語句は、本明細書で使用される場合、生きた哺乳類全身での抗体(例えば検出可能な標識化2D6)の存在の検出方法を示す。光学的に検出可能なタンパク質、例えば、蛍光抗体及びルシフェラーゼ結合抗体などは、in vivo撮像により検出することが可能である。in vivo撮像を使用して、哺乳類の二次元画像ならびに三次元画像を提供することができる。放射標識化抗体を、例えば、対象に投与することができ、その対象をガンマカメラで撮像することができる。電荷結合素子カメラ、CMOS、または三次元断層撮影機を用いて、in vivo撮像を行うことができる。コンピューター断層撮影法、核磁気共鳴画像法、超音波断層法、ポジトロン放出断層撮影法、単一光子放射型コンピューター断層撮影法(SPECT)などを用いたin vivo撮像の方法は、当該分野で周知である。多くのin vivo撮像法から得られる情報は、上記されるものなどと同様に、対象中のがん細胞についての情報を提供することができる。
方法がin vitroのものである場合、生体試料は、がん細胞が存在する可能性のある任意の試料が可能であり、そのような試料として、血液試料(全血、血清などを含む)、組織、細胞全体(例えば、インタクト細胞)、及び組織または細胞抽出物が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、アッセイは、生細胞または組織学的組織試料中の細胞上でEphA2を検出することを含むことができる。特に、検出は、生細胞の細胞外表面で評価することができる。例えば、組織試料は、固定することができ(例えば、ホルマリン処理により)、支持体に(例えば、パラフィンに)包埋させて、または固定されていない組織を凍結させて、提供することができる。
アッセイは、競合、直接反応、またはサンドイッチ型アッセイなど、多種多様な形態を取ることができる。例として、以下が挙げられる:ウエスタンブロット法;凝集検査;酵素標識化及び酵素介在型免疫アッセイ、例えば酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)など;ビオチン/アビジン型アッセイ;放射免疫アッセイ;免疫電気泳動法;免疫沈降法など。反応は、概して、抗体と結合した検出可能標識を含む。標識として、蛍光分子、化学発光分子、放射性分子、酵素分子、及び/または色素分子、あるいは試料中の抗原と、それと反応する抗体(複数可)との複合体形成を検出する他の方法のものが挙げられる。固体支持体が使用される場合、固体支持体は、抗体が支持体に十分に固定されるように、通常、適切な反応条件下、固相成分と最初に反応する。カップリング剤、例えばタンパク質(例えば、血清アルブミン(例えばウシ血清アルブミン(BSA)など)、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、卵白アルブミン)、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体などを用いて、固体支持体への固定を促進することができる。
アッセイは、抗体と抗原が、沈殿条件下で複合体を形成するように、溶液中で行うことができる。適切な結合条件下、抗体で被覆した粒子を、標的抗原を含有することが疑われる生体試料と接触させて、粒子−抗体−抗原複合凝集体を形成させることができ、この凝集体は、沈殿可能で、洗浄及び/または遠心を用いて試料から分離することができる。上記の免疫診断方法など複数ある標準方法のいずれかを用いて、反応混合物を分析して、抗体抗原複合体の有無を判定することができる。
本開示のアッセイは、例えば、EphA2発現がん性細胞の検出方法として生細胞による本開示の抗体及び/または抗体複合体の細胞取り込みを検出するアッセイを含むことができる。ある特定の実施形態において、本開示の抗体及び/または抗体複合体がEphA2発現細胞により取り込まれる場合、EphA2発現細胞を含有することが疑われる試料を、そのような抗体と接触させ、抗体及び/または抗体複合体の内部移行を可能にするのに十分な時間でインキュベートすることができる。続いて洗浄する。内部移行した抗体は、細胞に含有される抗体の標識を介して検出することができる(例えば、FACS、分光計、放射性同位体カウンターなど)。内部移行抗体は、US7,045,283に記載のとおりに選択することもできる。
上記のアッセイ試薬は、本開示の抗体も含めて、上記のとおり免疫アッセイを行う目的で、キットに入れて、適切な説明書及び他の必要な試薬とともに、提供することができる。キットは、使用される特定の免疫アッセイに応じて、適切な標識ならびに他のパッケージ化試薬及び材料(すなわち洗浄緩衝液など)も含有することができる。標準免疫アッセイ、例えば上記で記載されるものなどは、これらのキットを用いて行うことができる。
以下の実施例は例示を提供するもので、限定するものではない。
実施例1−D2−1A7の熱安定性及びプロテインAとの結合
D2−1A7 scFvを、熱安定性について及びプロテインA樹脂との結合について特性分析した。
D2−1A7 scFvを、熱安定性について及びプロテインA樹脂との結合について特性分析した。
熱安定性の測定は、示差走査型蛍光(DSF)により、以下のとおりに行った:10μMのscFv及び1×Sypro(登録商標)Orange(Sigma)を含む1×PBS、25μlを、20℃から90℃まで、速度1℃/分で加熱し、その結果生じる蛍光データを収集した。加熱及び蛍光データの生成は、IQ5リアルタイム検出システム(Bio−Rad(登録商標))を用いて行った。データは、GraphPad(登録商標)Prismソフトウェアを用いて分析した。報告されるTmは、一次導関数の最大値での温度である。
複数試料についてのプロテインA結合を、以下のとおり測定した:哺乳類細胞が発現したscFvを、4000gで15分間遠心して細胞を除去することにより、培養物から得た。上清のscFv力価を、Fortebioを用いて測定した。プロテインA結合は、96ウェルプロテインAプレート(プロテインA96ウェルタンパク質精製プレート(GE Healthcare:Life Sciences、プロテインA HP MultiTrap(登録商標))を用いてアッセイした。このプレートは、多孔質底を持つウェルにプロテインA結合樹脂を含有しており、ウェル中の液体を、遠心または吸引を介して底面から収集することを可能にする。プレートの各ウェルを、1×PBSで洗い、タンパク質250μgを含有する上清を各ウェルに添加した。次いで、真空マニホールド(Whatman(登録商標))を用いて、圧10mbarで上清をプロテインA樹脂から分離し、各ウェルからの流出液を、別々に標準96ウェルプレートの空ウェルへと集める。次いで、プロテインAプレートのウェルを600μLの1×PBS(pH7.6)で洗った。樹脂と結合したAbを溶出させるため、各ウェルに200μLの0.1M酢酸を加え、室温で3〜10分間インキュベートした。プレートを第二のプレートに重ねて、溶出液を捕捉し、100×gで2分間遠心し、20μLの1MのTris(pH8.0)を加えて、溶出液中のAbを中和した。プロテインA結合のパーセンテージを求めるため、流出液に残存するscFvの濃度を、最初に添加したタンパク質の量(250ug)と比較した。
結論:測定された65℃というTmは、有効かつ商業的生産性のあるリポソーム結合には容認し難い低さであり、測定された10%未満というプロテインA結合は、商業生産には容認し難い低さである。
実施例2−Tmを改善するためのフレームワーク操作
Tmを含む安定特性を向上するための最初のアプローチとして、D2−1A7のCDRを、異なるIgのフレームワークに移植した。D2−1A7の重鎖可変領域のフレームワークは、IGHV3−30である。VH3は、一般に、非常に安定であり、典型的には、プロテインAと結合する能力を有し、治療用Abのフレームワークとして一般的に用いられる。したがって、VH3ファミリー内の重鎖は保持して、D2−1A7の重鎖をIGHV3−23骨格に移植することにした。IGHV3−23骨格は、最も一般的なアイソタイプである。さらに、2つの安定化変異をIGHV3−23フレームワーク内で行った:E6Q及びS49Aである。
Tmを含む安定特性を向上するための最初のアプローチとして、D2−1A7のCDRを、異なるIgのフレームワークに移植した。D2−1A7の重鎖可変領域のフレームワークは、IGHV3−30である。VH3は、一般に、非常に安定であり、典型的には、プロテインAと結合する能力を有し、治療用Abのフレームワークとして一般的に用いられる。したがって、VH3ファミリー内の重鎖は保持して、D2−1A7の重鎖をIGHV3−23骨格に移植することにした。IGHV3−23骨格は、最も一般的なアイソタイプである。さらに、2つの安定化変異をIGHV3−23フレームワーク内で行った:E6Q及びS49Aである。
D2−1A7の軽鎖可変領域のフレームワークは、IGVλ3−19であり、これは、天然ヒトAbレパートリー中では一般に見つからない。そのため、D2−1A7軽鎖CDRを、より一般的なフレームワークIGVλ1−40に移植することにした。IGVλ1−40は、IGVH3−23と対になっているのも頻繁に見つかる。2種の熱安定変異体、TS1及びTS2を、設計した。相同性モデリングに基づいて、1位及び22位が、抗原と相互作用すると考えられたので、両変異体を、逆変異させて、D2−1A7中でそれらの位置において生じる残基を有するようにした(Q1S、S22T)。TS1では、表面の電荷を調節しながらも(V3E、R18T)、安定性にとって重要であると思われる疎水性ポケットは保持させた(G13V、L78A)。アミノ酸配列をナイーブ配列のレパートリーと比較して、L39K(TS1)、F65S(両方)、K66G(TS2)またはK66S(TS1)、及びA74T(TS1)を含む共通アミノ酸を導入した。
結論:TS1は、熱安定性に顕著な改善を示し、Tmが6℃上昇する。このクローンは、使用、またはプロテインA結合を改善するための追加操作に適している。
実施例3−プロテインA結合を防ぐ領域の同定
scFvの熱安定性が71℃に改善されたので、次に、プロテインA親和性を操作してAbに導入し、製造しやすくした。VH3フレームワークは、プロテインAと結合できることが文献で広く報告されている。TS1のVH3−23フレームワークを操作したが、残念ながら、TS1は、プロテインAと十分に結合しなかった。重鎖の可変領域内において、FR1、CDR2、及びFR3内の残基は、プロテインA結合に関与することが示されてきている。TS1の構造解析から、以下に示す位置の生殖系列から逸脱したアミノ酸で、結合に重要なものはないことが明らかとなった:H15、H17、H19、H57、H59、H64、H65、H66、H68、H70、H81、H82a、H82b。生殖系列配列を考慮しても、どのアミノ酸がプロテインAとAbの間の相互作用に負の影響を及ぼすのかは不明のままであったので、プロテインA結合アッセイを開発した。
scFvの熱安定性が71℃に改善されたので、次に、プロテインA親和性を操作してAbに導入し、製造しやすくした。VH3フレームワークは、プロテインAと結合できることが文献で広く報告されている。TS1のVH3−23フレームワークを操作したが、残念ながら、TS1は、プロテインAと十分に結合しなかった。重鎖の可変領域内において、FR1、CDR2、及びFR3内の残基は、プロテインA結合に関与することが示されてきている。TS1の構造解析から、以下に示す位置の生殖系列から逸脱したアミノ酸で、結合に重要なものはないことが明らかとなった:H15、H17、H19、H57、H59、H64、H65、H66、H68、H70、H81、H82a、H82b。生殖系列配列を考慮しても、どのアミノ酸がプロテインAとAbの間の相互作用に負の影響を及ぼすのかは不明のままであったので、プロテインA結合アッセイを開発した。
D2−1A7、TS1、TS1*、及びF5の重鎖及び軽鎖を異種間で対にして含む、一連の変異体scFvを設計し、調製した。CDR−H2配列の効果を直接試験する目的で、TS1のCDR−H2がF5のCDR−H2で置き換えられた(TS1*)scFvも作製した。変異体を、哺乳類細胞で一過性に発現させ、発現したscFvの力価を、バイオレイヤー干渉法(forteBIO(登録商標))を用いて定量した。プロテインA結合分析を、実施例1に記載のとおり、96ウェルプレートで行った。流出液中に残存するscFvの量を、バイオレイヤー干渉法を用いて測定し、プロテインA樹脂に結合したscFvのパーセンテージを計算し、結果をプロットした(図1)。
結論:F5は、プロテインAに対して75%結合を示した。TS1は、29%というプロテインA結合を示し、商業生産に容認できるとみなされる50%限度よりはるかに低かった。F5のCDR−H2をTS1に移植する(scFv TS1*を得る)と、EphA2結合を抑止しながらも、プロテインA結合の顕著な改善を示し(65%)、このことは、TS1のCDR−H2が、プロテインA結合に負の影響を及ぼしていることを示唆する。
結論:F5は、プロテインAに対して75%結合を示した。TS1は、29%というプロテインA結合を示し、商業生産に容認できるとみなされる50%限度よりはるかに低かった。F5のCDR−H2をTS1に移植する(scFv TS1*を得る)と、EphA2結合を抑止しながらも、プロテインA結合の顕著な改善を示し(65%)、このことは、TS1のCDR−H2が、プロテインA結合に負の影響を及ぼしていることを示唆する。
実施例4−酵母菌ディスプレイを用いたCDR−H2設計及びscFv選択
TS1CDRH2の変異体セットを、Xu et al., (2013) mAbs, 5:2, 237−254に記載のとおりに酵母菌ディスプレイ用に調製し;EphA2結合を保持し、かつプロテインA結合の改善を示すクローンを選出した。このセットは、50,000を超える異なるCDRH2配列を含むように設計された。このセットの各scFvは、C末端に組み込まれたFLAG(商標)エピトープタグ(DYKDDDDK−配列番号49)を有する。このセットは、プロテインA結合に重要であることが疑われるCDR−H2位置、ならびにEphA2結合に寄与することが疑われるCDR−H2位置に多様性を組み込んであった。次いで、設計を、NCBIからダウンロードしたヒトAbレパートリーのデータベースならびに非免疫患者レパートリーのNGS配列決定と比較して、高度に保存された残基を温存するように調節した。最終的に、CDRH2残基のVH49、VH50、VH52A、VH53、VH55、及びVH57を、変異誘発用に特定した。同じくヒトレパートリーに基づいて、ほとんどの位置について、一組のアミノ酸サブセットだけを選択した(表4を参照)。これにより、53,460の異なる配列を含むように設計されたscFvのセットを作製し試験した。
TS1CDRH2の変異体セットを、Xu et al., (2013) mAbs, 5:2, 237−254に記載のとおりに酵母菌ディスプレイ用に調製し;EphA2結合を保持し、かつプロテインA結合の改善を示すクローンを選出した。このセットは、50,000を超える異なるCDRH2配列を含むように設計された。このセットの各scFvは、C末端に組み込まれたFLAG(商標)エピトープタグ(DYKDDDDK−配列番号49)を有する。このセットは、プロテインA結合に重要であることが疑われるCDR−H2位置、ならびにEphA2結合に寄与することが疑われるCDR−H2位置に多様性を組み込んであった。次いで、設計を、NCBIからダウンロードしたヒトAbレパートリーのデータベースならびに非免疫患者レパートリーのNGS配列決定と比較して、高度に保存された残基を温存するように調節した。最終的に、CDRH2残基のVH49、VH50、VH52A、VH53、VH55、及びVH57を、変異誘発用に特定した。同じくヒトレパートリーに基づいて、ほとんどの位置について、一組のアミノ酸サブセットだけを選択した(表4を参照)。これにより、53,460の異なる配列を含むように設計されたscFvのセットを作製し試験した。
所望の性質を持つscFvを単離するための酵母菌細胞表面で個別に発現させたscFvのセットの迅速な選別は、Becton Dickenson(登録商標)(BD)Aria(登録商標)システムで酵母菌をFACS選別することにより行った。誘導された酵母菌細胞を、200nMのHis6タグ付EphA2及び10μg/mLの蛍光標識化プロテインAとともにインキュベートした。細胞を、FACS緩衝液(1×PBS、0.5%のBSA、pH7.4)で2回洗い、未結合抗原を除去した。次いで、抗原結合及びプロテインA結合細胞を、2μg/mLのAlexa647標識化M2抗FLAG(商標)Ab及び2μg/mLのAlexa488標識化抗His6Abとともに30分間インキュベートした。2回洗った後、細胞を、FACS緩衝液に再懸濁させ、蛍光シグナルを、BD FACS Calibur(登録商標)機器を用いて測定した。蛍光強度中央値(MFI)を、FlowJo(登録商標)ソフトウェアを用いて決定した。EphA2 MFI(抗His6−Alexa488)を、発現MFI(抗Flag−Alexa647)に対して正規化した。選択の第一ラウンドについては、EphA2及びプロテインA結合の両方について選出し(図2、パネルB)、選出されたのは集団の数パーセントだった。組換えEphA2に結合した集団が同定されたことを確実にするため、単離されたクローンを、EphA2結合について再選出した(図2、パネルD)。
結論:所望の特徴を示すクローンが得られた。
実施例5−scFvの、熱安定性、EphA2結合/内部移行、及びプロテインA結合に関する特性決定
酵母菌で提示させた場合にプロテインA及びEphA2結合に関して陽性だったscFvを、配列決定し、Expi293F(商標)細胞(Invitrogen(登録商標))で、可溶性タンパク質として一過性発現させた。次いで、それらを、実施例1に記載のとおりに、プロテインA結合について測定した。実施例4に記載のとおりにして得られた22の独特な変異体を試験したところ、20%〜80%の範囲でプロテインA結合を示した(図3)。これら22のscFv(scFv1〜scFv22)のアミノ酸配列及びコード核酸配列を図5に提示する。
酵母菌で提示させた場合にプロテインA及びEphA2結合に関して陽性だったscFvを、配列決定し、Expi293F(商標)細胞(Invitrogen(登録商標))で、可溶性タンパク質として一過性発現させた。次いで、それらを、実施例1に記載のとおりに、プロテインA結合について測定した。実施例4に記載のとおりにして得られた22の独特な変異体を試験したところ、20%〜80%の範囲でプロテインA結合を示した(図3)。これら22のscFv(scFv1〜scFv22)のアミノ酸配列及びコード核酸配列を図5に提示する。
試験した22のscFvのうち、15は、タンパク質の少なくとも50%がプロテインAと結合する結果となったので、これらを、さらなる特性決定用に選択した。全ての変異体のTmを、DSFを用いて測定した。4つを除く全てのscFvが、65℃を2℃より大きく超える(すなわち、少なくとも67℃)の望ましいTmを有していた。11のscFvが、さらにより好ましい≧70℃のTmを有していた。
結合及び内部移行アッセイ:
これらの変異体scFvの抗EphA2活性を試験するため、これらのAbで外側修飾されたリポソームの結合及び内部移行を、EphA2発現細胞株でアッセイした。高速ハイスループットキレート化リガンド誘導型内部移行アッセイ(CLIA)(Nielsen et al., BMC immunology, 2006, 7:24)を用いて、結合及び内部移行評価のための抗EphA2−scFv標的指向性リポソームを選択した。EphA2受容体を高レベルで発現する2種の細胞株、OVCAR−3及びU−251、ならびにマウスEphA2発現マウス細胞株、CT−26(マウスEphA2に対する交差反応性が、改変scFvにより保持されるかどうかを試験するため)を試験した。各scFvのC末端His6タグによるニッケル結合を介して、scFvは、NTA(Ni)結合脂質を含む蛍光標識化リポソーム(Dil5−NTAリポソーム)と結合した。
これらの変異体scFvの抗EphA2活性を試験するため、これらのAbで外側修飾されたリポソームの結合及び内部移行を、EphA2発現細胞株でアッセイした。高速ハイスループットキレート化リガンド誘導型内部移行アッセイ(CLIA)(Nielsen et al., BMC immunology, 2006, 7:24)を用いて、結合及び内部移行評価のための抗EphA2−scFv標的指向性リポソームを選択した。EphA2受容体を高レベルで発現する2種の細胞株、OVCAR−3及びU−251、ならびにマウスEphA2発現マウス細胞株、CT−26(マウスEphA2に対する交差反応性が、改変scFvにより保持されるかどうかを試験するため)を試験した。各scFvのC末端His6タグによるニッケル結合を介して、scFvは、NTA(Ni)結合脂質を含む蛍光標識化リポソーム(Dil5−NTAリポソーム)と結合した。
試験リポソームの調製及び内部移行アッセイ
Dil5−NTAリポソームを、以下のとおり調製した。NTA結合脂質、DOD−トリ−NTAは、Huang et al., Bioconjugate chemistry, 2006, vol.17, p.1592−1600に記載のとおりに合成した。水素添加ダイズホスファチジルコリン(HSPC)、コレステロール、メトキシ−PEG(2000)−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(PEG−DSPE)、DOD−トリ−NTA、及び蛍光脂質色素、Dil5、(ThermoFisher(登録商標)Invitrogen(登録商標)Molecular Probes(商標)、カタログ番号D12370)を、それぞれ100:66.7:5:0.5:0.3のモル比でクロロホルムに混合して溶液にし、溶液を減圧エバポレートして乾固させて脂質フィルムを形成した。フィルムをHEPES緩衝化生理食塩水(「HBS−6.5」−5mMのHEPES、144mMのNaCl、pH6.5)に入れて68℃で水和させ、得られる脂質懸濁液を、凍結(ドライアイス−アセトン)及び融解(68C)のサイクルに数回供し、Lipex(商標)サーモバレル押出機(Northern Lipids、Canada)を用いて、2枚重ねのポリカーボネート膜(Whatman Nuclepore、USA)を通して押し出した。ポリカーボネート膜の孔径は、200nm(6回)及び100nm(10回)であった。このプロトコルは、典型的には、z平均径100〜110nm及び多分散指数0.1未満の単層小胞を生成させる。押し出されたリポソームを室温に冷却し、Sephadex(登録商標)G−75(GE Healthcare)カラムからHBS−6.5で溶出させるゲルクロマトグラフィーにより精製し、次いで、0.2μmフィルターを通過させることにより滅菌した。次いで、酸消化後に、リポソームリン脂質の濃度を、リンモリブデン酸分光測定法を用いて測定した。細胞とともにインキュベーションする前に、リポソームをハンクス平衡塩溶液(HBSS)に希釈して0.4mMのリン脂質とし、NiSO4を0.1mMで加えた。ヘキサヒスチジンscFvを、細胞培養培地(以下を参照)に希釈して、scFvの濃度を25μg/mLとし、等体積のリポソーム溶液と混合した(「蛍光NTA−リポソーム/scFv混合物」)。
Dil5−NTAリポソームを、以下のとおり調製した。NTA結合脂質、DOD−トリ−NTAは、Huang et al., Bioconjugate chemistry, 2006, vol.17, p.1592−1600に記載のとおりに合成した。水素添加ダイズホスファチジルコリン(HSPC)、コレステロール、メトキシ−PEG(2000)−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(PEG−DSPE)、DOD−トリ−NTA、及び蛍光脂質色素、Dil5、(ThermoFisher(登録商標)Invitrogen(登録商標)Molecular Probes(商標)、カタログ番号D12370)を、それぞれ100:66.7:5:0.5:0.3のモル比でクロロホルムに混合して溶液にし、溶液を減圧エバポレートして乾固させて脂質フィルムを形成した。フィルムをHEPES緩衝化生理食塩水(「HBS−6.5」−5mMのHEPES、144mMのNaCl、pH6.5)に入れて68℃で水和させ、得られる脂質懸濁液を、凍結(ドライアイス−アセトン)及び融解(68C)のサイクルに数回供し、Lipex(商標)サーモバレル押出機(Northern Lipids、Canada)を用いて、2枚重ねのポリカーボネート膜(Whatman Nuclepore、USA)を通して押し出した。ポリカーボネート膜の孔径は、200nm(6回)及び100nm(10回)であった。このプロトコルは、典型的には、z平均径100〜110nm及び多分散指数0.1未満の単層小胞を生成させる。押し出されたリポソームを室温に冷却し、Sephadex(登録商標)G−75(GE Healthcare)カラムからHBS−6.5で溶出させるゲルクロマトグラフィーにより精製し、次いで、0.2μmフィルターを通過させることにより滅菌した。次いで、酸消化後に、リポソームリン脂質の濃度を、リンモリブデン酸分光測定法を用いて測定した。細胞とともにインキュベーションする前に、リポソームをハンクス平衡塩溶液(HBSS)に希釈して0.4mMのリン脂質とし、NiSO4を0.1mMで加えた。ヘキサヒスチジンscFvを、細胞培養培地(以下を参照)に希釈して、scFvの濃度を25μg/mLとし、等体積のリポソーム溶液と混合した(「蛍光NTA−リポソーム/scFv混合物」)。
イミダゾールを用いた洗浄はHis6/Ni複合体を破壊し、それにより外部(内部移行していない)ヒスチジンタグ付scFvを放出及び除去するので、インキュベーション/イミダゾールを用いた洗浄の前後で細胞の蛍光を測定することにより、内部移行したAbのパーセンテージを定量する。試験細胞(ヒトがん細胞株OVCAR−3及びU−251ならびにマウスがん細胞株CT−26)を、10%FBS、1×ペニシリン/ストレプトマイシン、及びL−グルタミンを補充したRPMI−640細胞培養培地中、付着状態で、90%コンフルエンスまで増殖させ、0.25%トリプシン−EDTAを用いて回収した。細胞浮遊液を、100,000細胞/ウェルで、96ウェル「V」型底ポリプロピレン細胞培養プレートに分注し、細胞を1×PBSで洗い、次いで、100μLの蛍光NTA−リポソーム/scFv混合液に再懸濁させた。プレートをプレート密封テープで覆い、光から保護して、シェーカー上、5%CO2雰囲気中で、37℃で4時間インキュベートした。細胞を遠心によりペレット化し、上清を吸引し、細胞を、200μL/ウェルのPBSに再懸濁させてあらゆる未結合細胞外リポソームを除去する、または200μL/ウェルの0.25Mイミダゾール含有PBS(pH7.5)に再懸濁させてあらゆる未結合細胞外リポソーム及び表面結合リポソームを除去する、いずれかにより2回洗ったが、ただしこれらは内部移行したリポソームは除去しなかった。細胞付随リポソームの相対量を、FACS(Cy5蛍光チャネル)により評価した。「結合」量には、細胞表面結合及び内部移行リポソームの両方が含まれており、この量は、イミダゾール洗浄なしでの細胞蛍光に比例した。これは、図4に、scFv TS1で装飾されたマッチするリポソームによるリポソーム結合に対するパーセントとして示されている。内部移行データは、内部移行したリポソームの量を、細胞付随リポソーム全体に対するパーセントとして示す。クローンの大部分は、TS1と同様に、ヒト及びマウスEphA2への結合及び内部移行を保持していた(図4)。試験したクローンの1種、scFv−12だけ(及びF5陰性対照)が、EphA2に結合しなかった。
結論:試験した新規クローン22種のうち21種(scFv−12を除く全て)が、容認できる結合及び内部移行性質を有するとして同定された。22種のうち18種(scFv1〜4、6〜13、15〜16、及び18〜21)は、望ましい熱安定性を示し、Tmが≧67℃であったが、それらのうち10種(scFv1〜3、8〜11、13、15、及び18)は、より商業的に好ましい熱安定性基準も満たし、それぞれ、≧70℃のTmを示した。
実施例6−抗EphA2 scFvの結合安定性の試験
選択したscFvを、それらのC末端で組換え修飾して、His6タグを外して、リポソーム結合に適合したC末端ペプチド−−GlyGlySerGlyGlyCys(配列番号54)を付加した。これらの修飾scFvは、それらが由来するscFVの該当する名前に続けて文字Cを付けることにより識別する。AbとPEG−DSPE(リポ重合体)との結合(US6,210,707に記載の方法を用いる)を、得られるリポ重合体結合scFvが、効率的に及び結合性(複数の結合したscFvを介した抗原に対するリポソーム結合の全親和性として測定、以下で結合活性と称する)を失わずに、抗原結合能力を保持しているかどうか(抗原結合親和性として測定して)、ならびにリポ重合体複合体がリポソームの外側膜に進入する(リポ重合体のDSPE部分を介して)能力を持つか(PEGテザーscFvを外側に露出させて残す)と合わせて、次に試験した。
選択したscFvを、それらのC末端で組換え修飾して、His6タグを外して、リポソーム結合に適合したC末端ペプチド−−GlyGlySerGlyGlyCys(配列番号54)を付加した。これらの修飾scFvは、それらが由来するscFVの該当する名前に続けて文字Cを付けることにより識別する。AbとPEG−DSPE(リポ重合体)との結合(US6,210,707に記載の方法を用いる)を、得られるリポ重合体結合scFvが、効率的に及び結合性(複数の結合したscFvを介した抗原に対するリポソーム結合の全親和性として測定、以下で結合活性と称する)を失わずに、抗原結合能力を保持しているかどうか(抗原結合親和性として測定して)、ならびにリポ重合体複合体がリポソームの外側膜に進入する(リポ重合体のDSPE部分を介して)能力を持つか(PEGテザーscFvを外側に露出させて残す)と合わせて、次に試験した。
scFvとリポ重合体リンカーとの結合:精製scFvの溶液を、30℃で1時間、15mMのL−システイン、5mMのEDTA(pH6.0〜6.2に調整)で処理し、各scFvのカルボキシ末端システイン残基のチオール基を還元/活性化した。過剰なシステインを、Sephadex(登録商標)カラムから結合緩衝液(5mMのクエン酸塩、1mMのEDTA、140mMのNaCl、pH6.0)で溶出させるゲルクロマトグラフィーにより除去した。次に、Abを、以下のとおり、リポ重合体リンカー、マレイミド−PEG(2000)−DSPE(mal−PEG−DSPE、Avanti Polar Lipids、カタログ番号880126)と結合させた。処理したscFvに、水性ミセル貯蔵液の形状のMal−PEG−DSPE(Avanti)を加え、脂質/タンパク質モル比を4:1とした。混合物を、攪拌しながら、室温で2〜4時間インキュベートし、システインを最終濃度0.5mMで加えて5分間未反応マレイミドをクエンチすることにより、反応を停止させた。クエンチした反応混合物を、Ultrogel AcA34重力カラムのクロマトグラフィーに供し、S10C−6.5緩衝液(100g/Lの低エンドトキシンスクロース、10mMのクエン酸USP、NaOHでpH6.5に調整)で溶出させ、溶出タンパク質濃度を280nmで読んだ。最初の(空隙容量)タンパク質ピークに精製scFv−PEG−DSPE複合体が含まれていたので、これを収集した。scFv−PEG−DSPE複合体の純度は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)により評価した。
試験リポソームの調製及びscFvリポ重合体複合体のリポソーム膜への挿入:卵スフィンゴミエリン(ESM、NOF、Japan、NM−10)、コレステロール(Avant Polar Lipids、#770100)、メトキシ−PEG(2000)−ジステアロイルグリセロール(PEG−DSG、NOF、Japan、Sunbright GS−020)、及びDiI5(実施例5を参照)を、それぞれ100:66.7:8:0.3のモル比で、70℃で無水エタノールに溶解させ、攪拌しながら、70℃で、10体積分のCS−250緩衝液(250mMの水性NaCl、5mMのクエン酸塩、pH5.5)に希釈して、リン脂質の最終濃度を100mMとした。脂質懸濁液を、上記の実施例5に記載したとおり、70℃で、200nm及び100nmポリカーボネート膜フィルターを通して押し出し、押し出された材料を、室温に冷却し、リポソームを、MiniKros(登録商標)中空繊維カートリッジ(Spectrum Laboratories、MWCO 500kD)を用い、10体積分のCS−250緩衝液交換を介して、及び0.2μm滅菌フィルターを通過させて、タンジェンシャルフロー透析濾過により精製した。このプロトコルは、典型的には、z平均径100〜110nm及び多分散指数0.1未満の単層小胞を生成させる(「Dil5−SMリポソーム」)。scFv−PEG−DSPE複合体の膜挿入の前に、リポソームを、Sephadex(登録商標)G−25カラム(PD−10、GE Healthcare)でのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて、ブドウ糖クエン酸緩衝液(17%水性ブドウ糖、20mMのクエン酸塩、pH5.7)に交換した。
次いで、scFv−PEG−DSPE複合体を、Dil5−SMリポソーム含有ブドウ糖クエン酸緩衝液と混合し、タンパク質/リン脂質比を10〜12g/molとした。混合物を60℃に急速加熱し、攪拌しながら30分間その温度に維持した。次いで、混合物を氷上で冷却し、scFv−PEG−DSPE複合体が膜に進入したリポソームを、セファロース(商標)CL−4B(GE Healthcare)カラムからクエン酸生理食塩水緩衝液で溶出させるゲルクロマトグラフィーにより、あらゆる残存未進入複合体から分離した。scFv連結リポソームをカラムの空隙容量に収集し、in vitro抗原結合活性についてforteBIO(登録商標)を用いて、及び細胞取り込みについてサイトフローメトリーを用いて、それぞれ以下に記載のとおり分析した。リポソーム上のscFvの存在は、SDS−PAGEにより確認及び定量を行った。
forteBIO(登録商標)を介したEphA2結合の分析
C末端にHis6が添付されたヒトEphA2をコードする核酸を、発現ベクターpCEP4(Invitrogen(登録商標)#V044−50)にクローン導入し、FreeStyle(商標)293細胞(Invitrogen(登録商標)#K900001)にポリエチレンイミン形質移入して、一過性で発現させた。His6タグ付組換えヒトEphA2タンパク質をNi−NTAセファロース(商標)樹脂(Quiagen(登録商標)、USA)を用いて、細胞培養培地から精製した。forteBIO(登録商標)Octet Red 96システム用抗Hisセンサー(forteBIO(登録商標)−Pall(登録商標)#18−5116)を、hisタグ付組換えヒトEphA2を用いて、10μg/mlのタンパク質濃度で300秒間コーティングし、バックグラウンド測定をPBS中で60秒間行った。scFv−PEG−DSPE複合体の場合、次いで、センサーを、2.5μg/ml(試験1)または4.0μg/ml(試験2)の複合体含有PBS(pH7.4)とともにインキュベートし、会合曲線の傾きを、インキュベーションの3〜30秒の間で求め、緩衝液のみのバックグラウンドに対して補正し、変異体にまたがって比較した。ScFv連結リポソームは、PBS中、0.025mMのリポソームリン脂質でセンサーとともにインキュベートし、会合曲線の傾きを、インキュベーションの3〜20秒の間で求め、緩衝液のみのバックグラウンドに対して補正し、変異体にまたがって比較した。
C末端にHis6が添付されたヒトEphA2をコードする核酸を、発現ベクターpCEP4(Invitrogen(登録商標)#V044−50)にクローン導入し、FreeStyle(商標)293細胞(Invitrogen(登録商標)#K900001)にポリエチレンイミン形質移入して、一過性で発現させた。His6タグ付組換えヒトEphA2タンパク質をNi−NTAセファロース(商標)樹脂(Quiagen(登録商標)、USA)を用いて、細胞培養培地から精製した。forteBIO(登録商標)Octet Red 96システム用抗Hisセンサー(forteBIO(登録商標)−Pall(登録商標)#18−5116)を、hisタグ付組換えヒトEphA2を用いて、10μg/mlのタンパク質濃度で300秒間コーティングし、バックグラウンド測定をPBS中で60秒間行った。scFv−PEG−DSPE複合体の場合、次いで、センサーを、2.5μg/ml(試験1)または4.0μg/ml(試験2)の複合体含有PBS(pH7.4)とともにインキュベートし、会合曲線の傾きを、インキュベーションの3〜30秒の間で求め、緩衝液のみのバックグラウンドに対して補正し、変異体にまたがって比較した。ScFv連結リポソームは、PBS中、0.025mMのリポソームリン脂質でセンサーとともにインキュベートし、会合曲線の傾きを、インキュベーションの3〜20秒の間で求め、緩衝液のみのバックグラウンドに対して補正し、変異体にまたがって比較した。
結果を以下の表6に示す。表中、欄Aは、scFv識別子を提示する;欄Bは、scFv/リポ重合体リンカー複合体の収率パーセントを示す;欄Cは、scFv−複合体(リポソームが結合していない)EphA2結合の結合速度をパーセントで提示する;欄Dは、scFv−複合体−リポソームEphA2結合の結合速度をパーセントで提示する;ならびに欄E(試験1)及び欄F(試験2)は、熱ストレス後のscFv複合体(リポソームが結合していない)に残存する抗原結合速度をパーセントで提示する。
結論:試験したクローンは全て、十分に結合したが、scFv 4C、7C、11C、16C、及び19Cは、結合の熱ストレス後、10%未満の抗原結合を示した。
実施例7−選択した変異体の製造可能性についての分析
実施例6の実験と並行して、9種のクローン(及び対照として親クローンTS1)を、商業生産のための安定性を求めるため試験した。スクリーニング戦略は、発現が少ない、プロテインA結合能力が低い、または凝集体含有量が高い分子を排除するように設計した。scFvを、1L規模で、FreeStyle(商標)293細胞(Invitrogen(登録商標)#K900001)中一過性で発現させ、プロテインA精製し、pH6.0に中和した。結果を表7にまとめる。
実施例6の実験と並行して、9種のクローン(及び対照として親クローンTS1)を、商業生産のための安定性を求めるため試験した。スクリーニング戦略は、発現が少ない、プロテインA結合能力が低い、または凝集体含有量が高い分子を排除するように設計した。scFvを、1L規模で、FreeStyle(商標)293細胞(Invitrogen(登録商標)#K900001)中一過性で発現させ、プロテインA精製し、pH6.0に中和した。結果を表7にまとめる。
全てのAb力価は、バイオレイヤー干渉法(forteBIO(登録商標))を用いて計算した。凝集体のパーセンテージは、SECを用いて以下のとおり測定した。試料50μgを、泳動緩衝液として50mMリン酸ナトリウム(+0.4M過塩素酸ナトリウム)pH7.0を用いて、TSKgel(登録商標)SuperSW3000カラム(Tosoh(登録商標)Bioscience)に注入した。全ての測定は、オートサンプラー、バイナリポンプ、及びダイオードアレイ検出器を装備したAgilent(登録商標)1100 HPLCを用いて行った。データは、Chemstation(商標)(Agilent(登録商標))ソフトウェアを用いて分析した。
プロテインA結合能力の改善倍数値(TS1Cと比較した場合)は、実施例1に記載のとおりに測定した。
評価した最初の基準は、scFvの発現レベルであった。抗体は、典型的には、安定形質移入細胞株で(例えば、チャイニーズハムスター卵巣「CHO」細胞で)製造される。しかしながら、一過性発現を介して得られた力価は、安定形質移入細胞での発現挙動を予測するものである。上記の表7に示すとおり、新規Abの多くは、これまでより非常に良好な力価を有した(TS1Cと比較した場合約2倍以上の改善)。中和損失は、変異体によっては少し高くなったが、最終精製収率は全て、TS1Cに匹敵するかまたはそれより良好であった。最後に、下流プロセス開発が上手くいくには、凝集体含有量が低いことが望ましい。全ての変異体の中和後凝集体含有量は、同等な及び容認できるものであった。scFv−2C及びscFv−4Cは例外で、これらの新規Abは、大幅に改善された発現、凝集、及びプロテインA結合能力を有していた。全てを、結合プロセス中の安定性についてさらに特性決定した。
結論:試験したクローン(クローン2、3、4、7、8、9、10、11、及び13)は全て、試験したパラメーターについて容認できる商業開発可能性を示した。
等価物
当業者なら、本明細書に記載される具体的な実施形態の多くの等価物がわかるだろう、あるいは常用実験にすぎないものを用いてそれらに気づくまたはそれらを実行することができるだろう。そのような等価物は、上記の説明及び以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。特定の実施形態(及び従属項)に開示される実施形態の任意の組み合わせが、本開示の範囲内に含まれることが企図される。
当業者なら、本明細書に記載される具体的な実施形態の多くの等価物がわかるだろう、あるいは常用実験にすぎないものを用いてそれらに気づくまたはそれらを実行することができるだろう。そのような等価物は、上記の説明及び以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。特定の実施形態(及び従属項)に開示される実施形態の任意の組み合わせが、本開示の範囲内に含まれることが企図される。
参照による援用
本明細書に言及されるありとあらゆる米国及び外国の特許及び出願中の特許ならびに刊行物の開示は、その全体が、本明細書に参照として特別に援用される。
本明細書に言及されるありとあらゆる米国及び外国の特許及び出願中の特許ならびに刊行物の開示は、その全体が、本明細書に参照として特別に援用される。
Claims (66)
- 抗エフリンA型受容体2(EphA2)抗体であって、以下:
以下を含むVH:
アミノ酸配列SYAMH(配列番号17)を含むVH CDR1;
以下を含むVH CDR2
17のアミノ酸からなる以下のアミノ酸配列:
X17ISPX18GX19NX20YYADSVKG(配列番号18)、
配列中:
X17は、AまたはVであり;
X18は、A、D、H、N、P、S、またはTであり;
X19は、A、R、H、N、またはPであり;及び
X20は、KまたはTであり;
ならびに
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を含むVH CDR3;ならびに
以下を含むVL:
アミノ酸配列QGDSLRSYYAS(配列番号20)を含むVL CDR1;
アミノ酸配列GENNRPS(配列番号21)を含むVL CDR2;及び
アミノ酸配列NSRDSSGTHLTV(配列番号22)を含むVL CDR3;
を含み、EphA2の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する、前記抗体。 - プロテインAと結合するポリペプチドであって、以下のアミノ酸配列:
a)XaX17ISXbX18GX19NX20(配列番号198)、配列中
Xaは、S、T、またはAであり;
X17は、AまたはVであり;
Xbは、P、R、N、またはHであり、
X18及びX19は、任意のアミノ酸であり;及び
X20は、KまたはTであり;
b)XaVISXbX18GX19NX20(配列番号199)、配列中
Xaは、SまたはTであり、
Xbは、P、R、またはNであり、
X18は、任意のアミノ酸であり;
X19は、H、N、R、T、A、D、P、またはSであり;及び
X20は、KまたはTであり;
c)XaVISXbX18GX19NX20(配列番号200)、配列中
Xaは、SまたはTであり、
Xbは、P、R、またはNであり、
X18は、任意のアミノ酸であり;
X19は、H、N、R、またはTであり;及び
X20は、TまたはKであり;
あるいは
d)XaX17ISXbX18GX19NX20(配列番号201)、配列中
Xaは、SまたはTであり、
X17は、Vであり;
Xbは、Pであり、
X18は、任意のアミノ酸であり;
X19は、H、N、R、またはTであり;及び
X20は、TまたはKである、
を含む、前記ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドは、配列番号177〜197のうち1つのアミノ酸配列を含む、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、以下:
SYAMH(配列番号17)のアミノ酸配列を含むVH CDR1;
配列番号177〜201のうち1つのアミノ酸配列を含むプロテインA結合配列;及び
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を含むVH CDR3
を含む、請求項2または3に記載のポリペプチド。 - VH及びVLを含む抗体であって、前記VHは、請求項2から4のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む、前記抗体。
- 前記抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項5に記載の抗体。
- 前記抗体は、以下:
(a)アミノ酸配列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)を含むヒトVHフレームワーク領域1(VH FR1)、配列中、X1は、E以外のアミノ酸であり、
(b)アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWVX2(配列番号2)を含むヒトVHフレームワーク領域2(VH FR2)、配列中、X2は、S以外のアミノ酸であり、
(c)アミノ酸配列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(配列番号3)を含むヒトVLフレームワーク領域1(VL FR1)、配列中:X3は、Q以外のアミノ酸であり、X4は、V以外のアミノ酸であり、X5は、G以外のアミノ酸であり、X6は、R以外のアミノ酸であり、及びX7は、S以外のアミノ酸であり、
(d)アミノ酸配列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(配列番号4)を含むヒトVLフレームワーク領域1(VL FR1)、配列中:X8は、Q以外のアミノ酸であり、またはX9は、S以外のアミノ酸であり
(e)アミノ酸配列WYQQX10PGTAPKLLIY(配列番号5)を含むヒトVLフレームワーク領域2(VL FR2)、配列中、X10は、L以外のアミノ酸であり、ならびに
(f)アミノ酸配列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(配列番号6)を含むヒトVLフレームワーク領域3(VL FR3)、配列中:X11は、F以外のアミノ酸であり、X12は、K以外のアミノ酸であり、X13は、A以外のアミノ酸であり、またはX14は、L以外のアミノ酸であり、ならびに
(g)アミノ酸配列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(配列番号7)を含むヒトVLフレームワーク領域3(VL FR3)、配列中:X15は、F以外のアミノ酸であり、またはX16は、K以外のアミノ酸である、
からなる群より選択される少なくとも1つのフレームワーク領域を含む、請求項1または6に記載の抗体。 - 前記抗体は、以下:
(a)アミノ酸配列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)を含むヒトVHフレームワーク領域1(VH FR1)、配列中、X1は、E以外のアミノ酸であり、
(b)アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWV(配列番号202)を含むヒトVHフレームワーク領域2(VH FR2)、
(c)アミノ酸配列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(配列番号3)を含むヒトVLフレームワーク領域1(VL FR1)、配列中:X3は、Q以外のアミノ酸であり、X4は、V以外のアミノ酸であり、X5は、G以外のアミノ酸であり、X6は、R以外のアミノ酸であり、及びX7は、S以外のアミノ酸であり、
(d)アミノ酸配列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(配列番号4)を含むヒトVLフレームワーク領域1(VL FR1)、配列中:X8は、Q以外のアミノ酸であり、またはX9は、S以外のアミノ酸であり
(e)アミノ酸配列WYQQX10PGTAPKLLIY(配列番号5)を含むヒトVLフレームワーク領域2(VL FR2)、配列中、X10は、L以外のアミノ酸であり、ならびに
(f)アミノ酸配列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(配列番号6)を含むヒトVLフレームワーク領域3(VL FR3)、配列中:X11は、F以外のアミノ酸であり、X12は、K以外のアミノ酸であり、X13は、A以外のアミノ酸であり、またはX14は、L以外のアミノ酸であり、ならびに
(g)アミノ酸配列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(配列番号7)を含むヒトVLフレームワーク領域3(VL FR3)、配列中:X15は、F以外のアミノ酸であり、またはX16は、K以外のアミノ酸である、
からなる群より選択される少なくとも1つのフレームワーク領域を含む、請求項5または7に記載の抗体。 - 前記抗体は、アミノ酸配列QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号8)を含むVH FR1を含む、請求項1及び5から7のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記VH FR2は、アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWVA(配列番号9)またはWVRQAPGKGLEWVT(配列番号10)を含む、請求項1及び6のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、アミノ酸配列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(配列番号3)を含むVL FR1を含み、かつ配列中、X3は、Q以外のアミノ酸であり、X4は、V以外のアミノ酸であり、X5は、G以外のアミノ酸であり、X6は、R以外のアミノ酸であり、及びX7は、S以外のアミノ酸である、請求項1及び5から11のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、アミノ酸配列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(配列番号3)を含むVL FR1を含み、かつ配列中、X3はSであり、X4はEであり、X5はVであり、X6はTであり、及びX7はTである、請求項1及び5から11のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、アミノ酸配列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(配列番号4)を含むVL FR1を含み、かつ配列中、X8は、Q以外のアミノ酸であり、及びX9は、S以外のアミノ酸である、請求項1及び5から11のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、アミノ酸配列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(配列番号4)を含むVL FR1を含み、かつ配列中、X8はSであり、またはX9はTである、請求項1及び5から11のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、アミノ酸配列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(配列番号4)を含むVL FR1を含み、かつ配列中、X8はSであり、及びX9はTである、請求項1及び5から11のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、アミノ酸配列WYQQX10PGTAPKLLIY(配列番号5)を含むVL FR2を含み、かつ配列中、X10は、L以外のアミノ酸である、請求項1及び5から16のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、アミノ酸配列WYQQX10PGTAPKLLIY(配列番号5)を含むVL FR2を含み、かつ配列中、X10はKである、請求項1及び5から16のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、アミノ酸配列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(配列番号6)を含むVL FR3を含み、かつ配列中、X11は、F以外のアミノ酸であり、X12は、K以外のアミノ酸であり、X13は、A以外のアミノ酸であり、及びX14は、L以外のアミノ酸である、請求項1及び5から18のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、アミノ酸配列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(配列番号6)を含むVL FR3を含み、かつ配列中、X11はSであり、X12はSであり、X13はTであり、またはX14はAである、請求項1及び5から18のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、アミノ酸配列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(配列番号7)を含むVLフレームワーク領域3(VL FR3)を含み、配列中:X15は、F以外のアミノ酸であり、及びX16は、K以外のアミノ酸である、請求項1及び5から18のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、アミノ酸配列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(配列番号7)を含むVL FR3を含み、配列中:X15はSであり、またはX16はGである、請求項1及び5から18のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、アミノ酸配列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(配列番号7)を含むVLフレームワーク領域3(VL FR3)を含み、配列中:X15はSであり、及びX16はGである、請求項1及び5から18のいずれか1項に記載の抗体。
- 以下:
アミノ酸配列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)を含むVHフレームワーク領域1(VH FR1)、配列中、X1は、E以外のアミノ酸であり;
アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWVX2(配列番号2)を含むVHフレームワーク領域2(VH FR2)、配列中、X2は、S以外のアミノ酸であり;
アミノ酸配列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(配列番号3)を含むVLフレームワーク領域1(VL FR1)、配列中、X3は、Q以外のアミノ酸であり、X4は、V以外のアミノ酸であり、X5は、G以外のアミノ酸であり、X6は、R以外のアミノ酸であり、及びX7は、S以外のアミノ酸であり;
アミノ酸配列WYQQX10PGTAPKLLIY(配列番号5)を含むVLフレームワーク領域2(VL FR2)、配列中、X10は、L以外のアミノ酸であり;ならびに
アミノ酸配列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(配列番号6)を含むVLフレームワーク領域3(VL FR3)、配列中、X11は、F以外のアミノ酸であり、X12は、K以外のアミノ酸であり、X13は、A以外のアミノ酸であり、及びX14は、L以外のアミノ酸である、
を含む、請求項1または6に記載の抗体。 - 以下:
アミノ酸配列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)を含むVHフレームワーク領域1(VH FR1)、配列中、X1は、E以外のアミノ酸であり;
アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWVX2(配列番号2)を含むVHフレームワーク領域2(VH FR2)、配列中、X2は、S以外のアミノ酸であり;
アミノ酸配列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(配列番号4)を含むVLフレームワーク領域1(VL FR1)、配列中:X8は、Q以外のアミノ酸であり、またはX9は、S以外のアミノ酸であり;ならびに
アミノ酸配列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(配列番号7)を含むVLフレームワーク領域3(VL FR3)、配列中:X15は、F以外のアミノ酸であり、及びX16は、K以外のアミノ酸である、
を含む、請求項1、6、または24に記載の抗体。 - 以下
アミノ酸配列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)を含むVHフレームワーク領域1(VH FR1)、配列中、X1は、E以外のアミノ酸であり;
アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWVX2(配列番号2)を含むVHフレームワーク領域2(VH FR2)、配列中、X2は、S以外のアミノ酸であり;
アミノ酸配列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(配列番号3)を含むVLフレームワーク領域1(VL FR1)、配列中、X3は、Q以外のアミノ酸であり、X4は、V以外のアミノ酸であり、X5は、G以外のアミノ酸であり、X6は、R以外のアミノ酸であり、及びX7は、S以外のアミノ酸であり;
アミノ酸配列WYQQX10PGTAPKLLIY(配列番号5)を含むVLフレームワーク領域2(VL FR2)、配列中、X10は、L以外のアミノ酸であり;ならびに
アミノ酸配列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(配列番号6)を含むVLフレームワーク領域3(VL FR3)、配列中、X11は、F以外のアミノ酸であり、X12は、K以外のアミノ酸であり、X13は、A以外のアミノ酸であり、及びX14は、L以外のアミノ酸である、
を含む、請求項5または7に記載の抗体。 - 以下:
アミノ酸配列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)を含むVHフレームワーク領域1(VH FR1)、配列中、X1は、E以外のアミノ酸であり;
アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWVX2(配列番号2)を含むVHフレームワーク領域2(VH FR2)、配列中、X2は、S以外のアミノ酸であり;
アミノ酸配列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(配列番号4)を含むVLフレームワーク領域1(VL FR1)、配列中:X8は、Q以外のアミノ酸であり、またはX9は、S以外のアミノ酸であり;及び
アミノ酸配列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(配列番号7)を含むVLフレームワーク領域3(VL FR3)、配列中:X15は、F以外のアミノ酸であり、及びX16は、K以外のアミノ酸である、
を含む、請求項5、6、または26に記載の抗体。 - 前記抗体は、示差走査蛍光定量法を用いて測定した場合に67℃以上の融点(Tm)を有する、請求項1及び5から27のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、ヒト抗体である、請求項1及び5から27のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、一本鎖Fv(scFv)、IgG、Fab、(Fab)2、または(scFv’)2である、請求項1及び5から27のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、scFvである、請求項1及び5から27のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記VH CDR2の前記X17は、Vであり;X18は、HまたはDであり;X19は、HまたはNであり;及びX20は、Tである、請求項1及び5から31のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記VH CDR2は、以下:
a.VISPAGNNTYYADSVKG(配列番号23)、
b.VISPAGRNKYYADSVKG(配列番号24)、
c.VISPDGHNTYYADSVKG(配列番号25)、
d.VISPHGRNKYYADSVKG(配列番号26)、
e.VISRRGDNKYYADSVKG(配列番号27)、
f.VISNNGHNKYYADSVKG(配列番号28)、
g.VISPAGPNTYYADSVKG(配列番号29)、
h.VISPSGHNTYYADSVKG(配列番号30)、
i.VISPNGHNTYYADSVKG(配列番号31)、
j.AISPPGHNTYYADSVKG(配列番号32)、
k.VISPTGANTYYADSVKG(配列番号33)、
l.VISPHGSNKYYADSVKG(配列番号34)、
m.VISNNGHNTYYADSVKG(配列番号35)、
n.VISPAGTNTYYADSVKG(配列番号36)、
o.VISPPGHNTYYADSVKG(配列番号37)、
p.VISHDGTNTYYADSVKG(配列番号38)、
q.VISRHGNNKYYADSVKG(配列番号39)、及び
r.VISYDGSNKYYADSVKG(配列番号40)
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1及び5から32のいずれか1項に記載の抗体。 - 抗体であって、以下
VH配列、前記VH配列は、アミノからカルボキシル末端に向かって以下の順で:
(i)VH FR1配列QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号1)、
(ii)VH CDR1 SYAMH(配列番号10)、
(iii)VH FR2配列WVRQAPGKGLEWVT(配列番号3)または
VH FR2配列WVRQAPGKGLEWVA(配列番号2)、いずれか
(iv)VH CDR2配列X17ISPX18GX19NX20YYADSVKG(配列番号11)、
(v)VH FR3配列RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(配列番号4)、
(vi)VH CDR3配列ASVGATGPFDI(配列番号12)、
(vii)VH FR4配列WGQGTLVTVSS(配列番号5)、
を含み、
ならびに
VL配列、前記VL配列は、アミノからカルボキシル末端に向かって以下の順で:
(viii)VL FR1配列SSELTQPPSVSVAPGQTVTITC(配列番号6)、
(ix)VL CDR1配列QGDSLRSYYAS(配列番号13)、
(x)VL FR2配列WYQQKPGTAPKLLIY(配列番号7)、
(xi)VL CDR2配列GENNRPS(配列番号14)、
(xii)VL FR3配列GVPDRFSGSSSGTSASLTITGAQAEDEADYYC(配列番号8)、
(xiii)VL CDR3配列NSRDSSGTHLTV(配列番号15)、
(xiv)VL FR4配列FGGGTKLTVLG(配列番号9)、
を含み、
かつ配列中
X17は、AまたはVであり;X18は、A、D、H、N、P、S、またはTであり;X19は、A、R、H、またはPであり;及びX20は、KまたはTである、
を含む、前記抗体。 - 前記VH CDR2は、以下:
a.VISPAGNNTYYADSVKG(配列番号23)、
b.VISPAGRNKYYADSVKG(配列番号24)、
c.VISPDGHNTYYADSVKG(配列番号25)、
d.VISPHGRNKYYADSVKG(配列番号26)、
e.VISRRGDNKYYADSVKG(配列番号27)、
f.VISNNGHNKYYADSVKG(配列番号28)、
g.VISPAGPNTYYADSVKG(配列番号29)、
h.VISPSGHNTYYADSVKG(配列番号30)、
i.VISPNGHNTYYADSVKG(配列番号31)、
j.AISPPGHNTYYADSVKG(配列番号32)、
k.VISPTGANTYYADSVKG(配列番号33)、
l.VISPHGSNKYYADSVKG(配列番号34)、
m.VISNNGHNTYYADSVKG(配列番号35)、
n.VISPAGTNTYYADSVKG(配列番号36)、
o.VISPPGHNTYYADSVKG(配列番号37)、
p.VISHDGTNTYYADSVKG(配列番号38)、
q.VISRHGNNKYYADSVKG(配列番号39)、及び
r.VISYDGSNKYYADSVKG(配列番号40)
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項34に記載の抗体。 - VH及びVLを含む抗体であって、前記VH及びVLは、以下:
配列番号60[scFv1]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号62[scFv2]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号64[scFv3]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号66[scFv4]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号68[scFv5]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号70[scFv6]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号72[scFv7]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号74[scFv8]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号76[scFv9]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号78[scFv10]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号80[scFv11]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号82[scFv12]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号84[scFv13]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号86[scFv14]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号88[scFv15]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号90[scFv16]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号92[scFv17]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号94[scFv18]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号96[scFv19]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号98[scFv20]のVH及びVLのアミノ酸配列、
配列番号100[scFv21]のVH及びVLのアミノ酸配列、または
配列番号102[scFv22]のVH及びVLのアミノ酸配列、
と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、前記抗体。 - scFvである抗体であって、以下:
以下を含むVH:
アミノ酸配列SYAMH(配列番号17)を有するVH CDR1;
以下の18のアミノ酸配列のうち1つを有するVH CDR2:
(I)VISPAGNNTYYADSVKG(配列番号23)、
(II)VISPAGRNKYYADSVKG(配列番号24)、
(III)VISPDGHNTYYADSVKG(配列番号25)、
(IV)VISPHGRNKYYADSVKG(配列番号26)、
(V)VISRRGDNKYYADSVKG(配列番号27)、
(VI)VISNNGHNKYYADSVKG(配列番号28)、
(VII)VISPAGPNTYYADSVKG(配列番号29)、
(VIII)VISPSGHNTYYADSVKG(配列番号30)、
(IX)VISPNGHNTYYADSVKG(配列番号31)、
(X)AISPPGHNTYYADSVKG(配列番号32)、
(XI)VISPTGANTYYADSVKG(配列番号33)、
(XII)VISPHGSNKYYADSVKG(配列番号34)、
(XIII)VISNNGHNTYYADSVKG(配列番号35)、
(XIV)VISPAGTNTYYADSVKG(配列番号36)、
(XV)VISPPGHNTYYADSVKG(配列番号37)、
(XVI)VISHDGTNTYYADSVKG(配列番号38)、
(XVII)VISRHGNNKYYADSVKG(配列番号39)、または
(XVIII)VISYDGSNKYYADSVKG(配列番号40)
及び
アミノ酸配列ASVGATGPFDI(配列番号19)を有するVH CDR3;
を含み、
前記VH CDRは、アミノからカルボキシル末端に向かって以下の順で存在し:VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、
ならびに、前記scFvは、さらに以下:
以下を含むVL:
アミノ酸配列QGDSLRSYYAS(配列番号20)を有するVL CDR1、
アミノ酸配列GENNRPS(配列番号21)を有するVL CDR2、及び
アミノ酸配列NSRDSSGTHLTV(配列番号22)を有するVL CDR3;
を含み、
前記VL CDRは、アミノからカルボキシル末端に向かって以下の順で存在し:VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3;
前記scFvは、さらに、以下のヒトフレームワーク:
VH FR1 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号8)
VH FR2 WVRQAPGKGLEWVA(配列番号9)
VH FR3 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(配列番号11)
VH FR4 WGQGTLVTVSS(配列番号12)
VL FR1 SSELTQPPSVSVAPGQTVTITC(配列番号13)
VL FR2 WYQQKPGTAPKLLIY(配列番号14)
VL FR3 GVPDRFSGSSSGTSASLTITGAQAEDEADYYC(配列番号15)
及び
VL FR4 FGGGTKLTVLG(配列番号16)
を含み、
かつ前記抗体は、エフリンA型受容体2(EphA2)の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する、前記抗体。 - 前記VHは、前記VLに対してアミノ末端側である、請求項37に記載のscFvである抗体。
- 前記scFvは、少なくとも約67℃のTmを示す、請求項37または38に記載のscFvである抗体。
- 前記scFvは、少なくとも約70℃のTmを示す、請求項37から39のいずれか1項に記載のscFvである抗体。
- 前記VHは、前記VLに対してアミノ末端側であり、長さが10〜30アミノ酸のポリペプチドリンカーを介して前記VLと連結されている、請求項1及び5から40のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記リンカーは、以下:
ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号41)、
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号42)、
GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号43)、
ASTGGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(配列番号44)、
GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(配列番号45)、
TPSHNSHQVPSAGGPTANSGTSGS(配列番号46)、及び
GGSSRSSSSGGGGSGGGG(配列番号47)
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1及び5から41のいずれか1項に記載の抗体。 - 前記scFvリンカーは、配列ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号41)を含む、請求項42に記載の抗体。
- VH及びVLを含む抗体であって、前記VHは、配列番号133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、または175のアミノ酸配列と少なくとも95%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記抗体。
- 前記VLは、配列番号134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、または176のアミノ酸配列と少なくとも95%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項44に記載の抗体。
- scFvである抗体であって、以下:
配列番号60[scFv1]、
配列番号62[scFv2]、
配列番号64[scFv3]、
配列番号66[scFv4]、
配列番号68[scFv5]、
配列番号70[scFv6]、
配列番号72[scFv7]。
配列番号74[scFv8]、
配列番号76[scFv9]、
配列番号78[scFv10]、
配列番号80[scFv11]、
配列番号82[scFv12]、
配列番号84[scFv13]、
配列番号86[scFv14]、
配列番号88[scFv15]、
配列番号90[scFv16]、
配列番号92[scFv17]、
配列番号94[scFv18]、
配列番号96[scFv19]、
配列番号98[scFv20]、
配列番号100[scFv21]、または
配列番号102[scFv22]、
のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、前記抗体。 - さらに、C末端に、GlyGlySerGlyGlyCys(配列番号54)を含む、請求項1及び5から46のいずれか1項に記載の抗体。
- 請求項1及び5から47のいずれか1項に記載の抗体またはscFv、及び前記抗体と結合した部分、を含む抗体複合体。
- 前記部分は、脂質ナノ粒子である、請求項48に記載の複合体。
- 前記脂質ナノ粒子は、リポソームである、請求項49に記載の複合体。
- 前記部分は、ポリエチレングリコール(PEG)を含む、請求項48に記載の複合体。
- 前記部分は、治療薬を含む、請求項48に記載の複合体。
- 前記治療薬は、細胞毒性剤である、請求項52に記載の複合体。
- 前記部分は、検出可能な標識を含む、請求項48に記載の複合体。
- 前記検出可能な標識は、in vivo造影剤である、請求項54に記載の複合体。
- 以下:
請求項1及び5から55のいずれか1項に記載の抗体、scFv、または抗体複合体;及び
薬学上許容される担体、
を含む、組成物。 - 前記組成物は、非経口投与用に配合される、請求項56に記載の組成物。
- 容器に入った請求項56または57に記載の組成物を含む、キット。
- 請求項1から47のいずれか1項に記載の抗体、ポリペプチド、またはscFvをコードする、核酸。
- 請求項1から47のいずれか1項に記載の抗体またはscFvの、可変軽鎖ポリペプチド、可変重鎖ポリペプチド、またはその両方をコードする、単離された核酸。
- 以下:
請求項59または60に記載の核酸;及び
前記核酸と機能的に連結した真核生物プロモーター、
を含む、発現ベクター。 - 請求項61に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 前記細胞は、前記可変軽鎖ポリペプチド、前記可変重鎖ポリペプチド、またはその両方を発現する、請求項62に記載の宿主細胞。
- EphA2発現がんを有する対象の治療方法であって、前記方法は、以下:
EphA2発現がんを有する対象に、請求項1及び5から55に記載の抗体、scFv、または抗体複合体、あるいは請求項56または57に記載の組成物を投与すること
を含む、前記方法。 - EphA2発現がんの治療に使用するための組成物であって、前記組成物は、請求項1及び5から55のいずれか1項に記載の抗体、scFv、または抗体複合体、あるいは請求項56または57に記載の組成物を含む、前記組成物。
- EphA2発現がんの治療における組成物の使用であって、前記組成物は、請求項1及び5から55のいずれか1項に記載の抗体、scFv、または抗体複合体、あるいは請求項56または57に記載の組成物を含む、前記使用。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662309365P | 2016-03-16 | 2016-03-16 | |
US201662309383P | 2016-03-16 | 2016-03-16 | |
US201662309374P | 2016-03-16 | 2016-03-16 | |
US62/309,374 | 2016-03-16 | ||
US62/309,365 | 2016-03-16 | ||
US62/309,383 | 2016-03-16 | ||
PCT/US2017/022188 WO2017160775A1 (en) | 2016-03-16 | 2017-03-13 | Protein a binding polypeptides, anti-epha2 antibodies and methods of use thereof |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019515645A true JP2019515645A (ja) | 2019-06-13 |
Family
ID=59852234
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018541670A Pending JP2019515645A (ja) | 2016-03-16 | 2017-03-13 | プロテインA結合ポリペプチド、抗EphA2抗体、及びそれらの使用方法 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20170267768A1 (ja) |
EP (1) | EP3429624A4 (ja) |
JP (1) | JP2019515645A (ja) |
KR (1) | KR20180127344A (ja) |
CN (1) | CN108778328A (ja) |
AU (1) | AU2017234275A1 (ja) |
BR (1) | BR112018015898A2 (ja) |
CA (1) | CA3016676A1 (ja) |
MX (1) | MX2018009389A (ja) |
SG (1) | SG11201807336RA (ja) |
TW (1) | TW201738275A (ja) |
WO (1) | WO2017160775A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012012759A2 (en) * | 2010-07-22 | 2012-01-26 | The Regents Of The University Of California | Anti-tumor antigen antibodies and methods of use |
CN109467593A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-03-15 | 北京泽勤生物医药有限公司 | 低pH插入肽的胞外段作为抗原的应用 |
CN114437205A (zh) * | 2020-11-05 | 2022-05-06 | 多玛医药科技(苏州)有限公司 | 抗冠状病毒抗体及其应用 |
EP4349857A1 (en) | 2021-05-25 | 2024-04-10 | Vaxcell-Bio | Monobody-based chimeric antigen receptor and immune cell including same |
CN116970077A (zh) * | 2021-07-16 | 2023-10-31 | 西南医科大学 | 一种抗EphA2全人源双价重组抗体scFv-Fc |
KR20230022810A (ko) * | 2021-08-06 | 2023-02-16 | 한국생명공학연구원 | 신규한 항-EphA2 키메릭 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역세포 |
CN113980138B (zh) * | 2021-08-11 | 2023-08-11 | 卡瑞济(北京)生命科技有限公司 | EphA2嵌合抗原受体以及其用途 |
WO2023196869A1 (en) * | 2022-04-05 | 2023-10-12 | Atreca, Inc. | Epha2 antibodies |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040260068A1 (en) * | 2004-02-26 | 2004-12-23 | Naoya Tsurushita | Humanized chicken antibodies |
US9260522B2 (en) * | 2008-10-01 | 2016-02-16 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Bispecific single chain antibodies with specificity for high molecular weight target antigens |
WO2011102551A1 (en) * | 2010-02-18 | 2011-08-25 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Antibody against serotype e lipopolysaccharide of pseudomonas aeruginosa |
WO2012012759A2 (en) * | 2010-07-22 | 2012-01-26 | The Regents Of The University Of California | Anti-tumor antigen antibodies and methods of use |
US20130310281A1 (en) * | 2011-02-02 | 2013-11-21 | Glaxo Group Limited | Novel antigen binding proteins |
US9499612B2 (en) * | 2011-07-27 | 2016-11-22 | Glaxo Group Limited | Antigen binding constructs |
EP2716298A1 (en) * | 2012-10-03 | 2014-04-09 | Institut Pasteur | A nod2-dependant pathway of cytoprotection of stem cells |
EP3429629A1 (en) * | 2016-03-16 | 2019-01-23 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Ephrin receptor a2 (epha2)-targeted docetaxel-generating nano-liposome compositions |
-
2017
- 2017-03-13 CA CA3016676A patent/CA3016676A1/en not_active Abandoned
- 2017-03-13 JP JP2018541670A patent/JP2019515645A/ja active Pending
- 2017-03-13 CN CN201780009432.0A patent/CN108778328A/zh active Pending
- 2017-03-13 AU AU2017234275A patent/AU2017234275A1/en not_active Abandoned
- 2017-03-13 MX MX2018009389A patent/MX2018009389A/es unknown
- 2017-03-13 WO PCT/US2017/022188 patent/WO2017160775A1/en active Application Filing
- 2017-03-13 US US15/457,857 patent/US20170267768A1/en not_active Abandoned
- 2017-03-13 KR KR1020187026565A patent/KR20180127344A/ko unknown
- 2017-03-13 SG SG11201807336RA patent/SG11201807336RA/en unknown
- 2017-03-13 BR BR112018015898A patent/BR112018015898A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2017-03-13 EP EP17767295.3A patent/EP3429624A4/en not_active Withdrawn
- 2017-03-15 TW TW106108588A patent/TW201738275A/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20170267768A1 (en) | 2017-09-21 |
CN108778328A (zh) | 2018-11-09 |
WO2017160775A1 (en) | 2017-09-21 |
CA3016676A1 (en) | 2017-09-21 |
EP3429624A4 (en) | 2020-04-22 |
TW201738275A (zh) | 2017-11-01 |
MX2018009389A (es) | 2018-11-21 |
EP3429624A1 (en) | 2019-01-23 |
SG11201807336RA (en) | 2018-09-27 |
KR20180127344A (ko) | 2018-11-28 |
BR112018015898A2 (pt) | 2019-01-22 |
AU2017234275A1 (en) | 2018-10-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2019515645A (ja) | プロテインA結合ポリペプチド、抗EphA2抗体、及びそれらの使用方法 | |
ES2595091T3 (es) | Composiciones farmacéuticas con resistencia a CEA soluble | |
JP6865585B2 (ja) | 成長分化因子15(gdf−15)に対するモノクローナル抗体およびがん悪液質およびがんを処置するためのその使用 | |
MX2010011955A (es) | Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas. | |
TWI523867B (zh) | 抗c-met抗體及其使用方法 | |
WO2022068810A1 (zh) | 抗Claudin18.2和CD3的双特异性抗体以及其用途 | |
JP2022514693A (ja) | Muc18に特異的な抗体 | |
CN116323657B (zh) | 同时靶向PD-L1和TGFβ的双功能分子及其医药用途 | |
JP2022514786A (ja) | Muc18に特異的な抗体 | |
JP2021524032A (ja) | Gasp−1顆粒を標的とする結合性タンパク質及びキメラ抗原受容体t細胞並びにそれらの使用 | |
CN116731169B (zh) | 一种分拣蛋白1特异性的纳米抗体及其应用 | |
WO2022237647A1 (zh) | 针对dll3的结合分子及其应用 | |
JP2024506669A (ja) | メソテリンポリペプチドに結合する分子 | |
JP2008507951A5 (ja) | ||
WO2019243428A1 (en) | Antibodies anti tumor associated antigens and method for obtaining them | |
JP2017095417A (ja) | 抗癌剤 | |
CA3136975C (en) | Anti-tie2 antibody and use thereof | |
WO2023231877A1 (zh) | 抗cd228抗体及其药物偶联物 | |
WO2022239766A1 (ja) | 抗cadm1抗体 | |
EP3960763A2 (en) | Anti-tie2 antibody and use thereof | |
CN116367722A (zh) | 抗人神经降压素受体1抗体及其用途 | |
BARAL et al. | Patent 2813133 Summary |