TW201738275A - 蛋白Ａ結合多肽、抗ＥｐｈＡ２抗體及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供諸多抗體(例如scFv)，該等抗體包括可賦予該等抗體以適用之性質的CDR及人類構架區。在某些實施例中，此類性質包括熱穩定性(例如增高之解鏈溫度)、與金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A之有效結合或兩者。在某些態樣中，該等抗體為可特異性結合腫瘤相關抗原EphA2之內在化抗體。

Description

蛋白A結合多肽、抗EphA2抗體及其使用方法 〔對相關申請案之交叉引用〕
本申請案主張2016年3月16日申請之美國臨時申請案第62/309,365號及2016年3月16日申請之美國臨時申請案第62/309,383號及2016年3月16日申請之美國臨時申請案第62/309,374號的優先權，各案以全文引用之方式併入本文中。
本發明關於蛋白A結合多肽、抗EphA2抗體及其使用方法。
癌細胞往往異常表現多種蛋白質，包括表現或過度表現某些細胞表面抗原，例如細胞表面受體。可採用此類異常表現之蛋白質作為治療抗體之標靶，且對許多癌症上表現之細胞表面受體具有特異性之抗體已用於開發靶向免疫治療劑。許多此類治療劑(包括抗體-藥物結合 物，包括免疫脂質體及免疫毒素)及抗體靶向核酸遞送媒劑需要不僅可結合細胞表面抗原而且可在結合後內在化至細胞中之抗體。舉例而言，已與化學治療劑結合之識別由癌細胞表現之細胞表面受體的抗體目前已用於治療霍奇金氏淋巴瘤(貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin))及轉移性乳癌(腺苷-曲妥珠單抗安坦辛(ado-trastuzumab emtansine))。
因為已知異常表現於若干癌症中而正被考慮用於治療靶向之一種細胞表面受體為EphA2。如US 9,220,772中所描述，使用多步驟篩選方法來分離抗EphA2 scFv抗體，該多步驟篩選方法包括首先進行一般噬菌體選擇以便使用人類乳癌細胞使抗體內在化，繼而針對與表現EphA2之細胞外域之酵母的結合進行選擇。抗體D2-1A7鑑定為由表現EphA2之細胞強力內在化之配位體阻斷scFv。
抗體穩定性為適用性質，從而允許穩固且可規模化之抗體製造方法。另外，為了有助於製造用於治療用途之抗體，需要抗體能夠用親和力樹脂加以純化。對於大部分治療抗體，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A親和力層析為早期重要步驟，因為其可選擇性地且有效地自複雜溶液(諸如所收集之細胞培養液)中結合抗體，從而在單一步驟中便移除>99.5%之產物雜質且提供顯著病毒清除率。
持續需要可結合細胞表面受體且展現適用於 工業生產及醫學使用之穩定性及其他可製造性性質的新抗體。本文中所揭示之新穎工程改造抗體解決此需要且提供額外優勢。
本發明提供諸多抗體(例如scFv)，該等抗體包括可賦予該等抗體以適用之性質的CDR及人類構架區。在某些實施例中，此類性質包括熱穩定性(例如增高之解鏈溫度)、與金黃色葡萄球菌蛋白A之有效結合或兩者。在某些態樣中，該等抗體為可特異性結合腫瘤相關抗原EphA2之內在化抗體。
本發明提供熱穩定(展現67℃或70℃之解鏈溫度)之內在化抗EphA2抗體(Ab)(例如scFv)。亦提供對金黃色葡萄球菌蛋白A展現實質性結合(例如，達至使得負載至金黃色葡萄球菌蛋白A(在下文中，「蛋白A」)樹脂上之Ig中之至少50%、60%或70%結合且保留於該樹脂上之程度，例如使用實例1之分析法)之Ab(例如scFv)。提供賦予所要蛋白A結合性質之多肽以及含有此類蛋白A結合多肽之抗體(例如scFv)；賦予所要蛋白A結合性質之VH CDR2多肽以及含有其之抗體(例如scFv)；提供所要熱穩定性性質之VH及VL構架多肽(包括共有框架區序列)以及具有此種構架序列之抗體(例如scFv)；以及具有此類蛋白A結合多肽、VH CDR2多肽及熱穩定性增強構架之組合的Ab(例如scFv)。另外，所揭示之Ab展現對 於工業規模脂質體接合及其他製造方法以及對於治療用途而言合意之其他性質。
因而，揭示針對工業製造及醫學使用而設計並改適之抗EphA2抗體以及相關結合物、組成物及使用方法。使用方法涵蓋用作脂質體治療劑之靶向組分以及用作診斷劑及用於篩選方法中。
因此，本發明提供一種抗A型Ephrin受體2(EphA2)抗體，其包含：VH，其包含：VH CDR1，其包含胺基酸序列SYAMH(SEQ ID NO：17)；VH CDR2，其包含以下具有17個胺基酸之序列：X17ISPX18GX19NX20YYADSVKG(SEQ ID NO：18)，其中：X17為A或V；X18為A、D、H、N、P、S或T；X19為A、R、H、N或P；且X20為K或T；及VH CDR3，其包含胺基酸序列ASVGATGPFDI(SEQ ID NO：19)；以及VL，其包含：VL CDR1，其包含胺基酸序列QGDSLRSYYAS(SEQ ID NO：20)；VL CDR2，其包含胺基酸序列GENNRPS(SEQ ID NO：21)；及VL CDR3，其包含胺基酸序列NSRDSSGTHLTV(SEQ ID NO：22)；其中該抗體免疫特異性結合EphA2之細胞外域。
本發明亦提供可結合蛋白A之多肽，其中該多肽包含具有下式之胺基酸序列：a)Xa X17IS Xb X18GX19N X20(SEQ ID NO：198)，其中Xa為S、T或A；X17為A或V；Xb為P、R、N或H；X18及X19為任何胺基酸，且在一些實施例中，X18為A、D、H、N、P、S或T；及/或其中X19為A、R、H、N或P；且X20為K或T；b)Xa V I S Xb X18 G X19 N X20(SEQ ID NO：199)，其中Xa為S或T；Xb為P、R或N；X18為任何胺基酸，且在一些實施例中為A、D、H、N、P、S或T；X19為H、N、R、T、A、D、P或S；且X20為K或T；c)Xa V I S Xb X18 G X19 N X20(SEQ ID NO：200)， 其中Xa為S或T；Xb為P、R或N；X18為任何胺基酸，且在一些實施例中為A、D、H、N、P、S或T；X19為H、N、R或T；且X20為T或K；或d)Xa X17 I S Xb X18 G X19 N X20(SEQ ID NO：201)，其中Xa為S或T；X17為V；Xb為P；X18為任何胺基酸，且在一些實施例中為A、D、H、N、P、S或T；X19為H、N、R或T，且在一些實施例中為A、R、H、N或P；且X20為T或K。
在相關實施例中，該蛋白A結合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：177-197之一。
在一些實施例中，該蛋白A結合多肽包含：VH CDR1，其包含胺基酸序列SYAMH(SEQ ID NO：17)；蛋白A結合序列，其包含胺基酸序列SEQ ID NO： 177至201之一；及VH CDR3，其包含胺基酸序列ASVGATGPFDI(SEQ ID NO：19)。
本發明亦提供包含VH及VL之抗體，其中該VH包含如上文所描述之蛋白A結合多肽。
在某些實施例中，該抗體包含以下至少一個構架區：(a)人類VH構架區1(VH FR1)，其包含胺基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：1)，其中X1為除E以外之胺基酸，及/或(b)人類VH構架區2(VH FR2)，其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVX2(SEQ ID NO：2)，其中X2為除S以外之胺基酸；或其中該抗體包含：蛋白A結合多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：177-201之一；人類VH構架區2(VH FR2)，其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：202)，及/或(c)人類VL構架區1(VL FR1)，其包含胺基酸序列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(SEQ ID NO：3)，其中：X3為除Q以外之胺基酸，X4為除V以外之胺基酸，X5為除G以外之胺基酸，X6為除R以外之胺基酸，且X7為除S以外之胺基酸，及/或(d)人類VL構架區1(VL FR1)，其包含胺基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQ ID NO：4)，其中：X8為除Q以外之胺基酸，或X9為除S以外之胺基酸，及 /或(e)人類VL構架區2(VL FR2)，其包含胺基酸序列WYQQX10PGTAPKLLIY(SEQ ID NO：5)，其中X10為除L以外之胺基酸，及/或(f)人類VL構架區3(VL FR3)，其包含胺基酸序列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(SEQ ID NO：6)，其中：X11為除F以外之胺基酸，X12為除K以外之胺基酸，X13為除A以外之胺基酸，或X14為除L以外之胺基酸，及/或(g)人類VL構架區3(VL FR3)，其包含胺基酸序列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO：7)，其中：X15為除F以外之胺基酸，或X16為除K以外之胺基酸。
在某些實施例中，該抗體包含VH FR1，該VH FR1包含胺基酸序列QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：8)。在某些實施例中，該抗體包含VH FR2，該VH FR2包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO：9)或WVRQAPGKGLEWVT(SEQ ID NO：10)。在某些實施例中，該抗體包含VL FR1，其中該VL FR1包含胺基酸序列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(SEQ ID NO：3)，且其中X3為除Q以外之胺基酸，X4為除V以外之胺基酸，X5為除G以外之胺基酸，X6為除R以外之胺基酸，且X7為除S以外之胺基酸。在某些實施例中，該抗體包 含VL FR1，該VL FR1包含胺基酸序列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(SEQ ID NO：3)，且其中X3為S，X4為E，X5為V，X6為T，且X7為T。在某些實施例中，該抗體包含VL FR1，該VL FR1包含胺基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQ ID NO：4)，且其中X8為除Q以外之胺基酸，且X9為除S以外之胺基酸。在某些實施例中，該抗體包含VL FR1，該VL FR1包含胺基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQ ID NO：4)，且其中X8為S或X9為T。在某些實施例中，該抗體包含VL FR1，該VL FR1包含胺基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQ ID NO：4)，且其中X8為S並且X9為T。在某些實施例中，該抗體包含VL FR2，該VL FR2包含胺基酸序列WYQQX10PGTAPKLLIY(SEQ ID NO：5)，且其中X10為除L以外之胺基酸。在某些實施例中，該抗體包含VL FR2，該VL FR2包含胺基酸序列WYQQX10PGTAPKLLIY(SEQ ID NO：5)，且其中X10為K。在某些實施例中，該抗體包含VL FR3，該VL FR3包含胺基酸序列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(SEQ ID NO：6)，且其中X11為除F以外之胺基酸，X12為除K以外之胺基酸，X13為除A以外之胺基酸，且X14為除L以外之胺基酸。在某些實施例中，該抗體包含VL FR3，該VL FR3包含胺基酸序列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC (SEQ ID NO：6)，且其中X11為S，X12為S，X13為T，或X14為A。在某些實施例中，該抗體包含VL構架區3(VL FR3)，該VL FR3包含胺基酸序列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO：7)，其中：X15為除F以外之胺基酸，且X16為除K以外之胺基酸。在某些實施例中，該抗體包含VL FR3，該VL FR3包含胺基酸序列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO：7)，其中：X15為S或X16為G。在某些實施例中，該抗體包含VL構架區3(VL FR3)，該VL FR3包含胺基酸序列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO：7)，其中：X15為S且X16為G。
在某些實施例中，該抗體包含：VH構架區1(VH FR1)，其包含胺基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：1)，其中X1為除E以外之胺基酸；VH構架區2(VH FR2)，其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVX2(SEQ ID NO：2)，其中X2為除S以外之胺基酸；VL構架區1(VL FR1)，其包含胺基酸序列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(SEQ ID NO：3)，其中X3為除Q以外之胺基酸，X4為除V以外之胺基酸，X5為除G以外之胺基酸，X6為除R以外之胺基酸，且X7為除S以外之胺基酸； VL構架區2(VL FR2)，其包含胺基酸序列WYQQX10PGTAPKLLIY(SEQ ID NO：5)，其中X10為除L以外之胺基酸；及VL構架區3(VL FR3)，其包含胺基酸序列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(SEQ ID NO：6)，其中X11為除F以外之胺基酸，X12為除K以外之胺基酸，X13為除A以外之胺基酸，且X14為除L以外之胺基酸。
在某些實施例中，該抗體包含：VH構架區1(VH FR1)，其包含胺基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：1)，其中X1為除E以外之胺基酸；VH構架區2(VH FR2)，其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVX2(SEQ ID NO：2)，其中X2為除S以外之胺基酸；VL構架區1(VL FR1)，其包含胺基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQ ID NO：4)，其中：X8為除Q以外之胺基酸，或X9為除S以外之胺基酸；及VL構架區3(VL FR3)，其包含胺基酸序列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO：7)，其中：X15為除F以外之胺基酸，且X16為除K以外之胺基酸。
在某些實施例中，如使用差示掃描螢光測定法所量測，該抗體具有67℃或更高之解鏈溫度(Tm)。
在某些實施例中，該抗體為單鏈Fv(scFv)、IgG、Fab、(Fab)2或(scFv')2。在某些實施例中，該抗體為scFv。在某些實施例中，該抗體包含人類抗體序列。
在某些實施例中，該抗體為scFv，其包含VH、VL及構架，其中：該VH包含：VH CDR1，其具有胺基酸序列SYAMH(SEQ ID NO：17)；VH CDR2，其具有以下18個胺基酸序列之一：(I)VISPAGNNTYYADSVK(SEQ ID NO：23)；(II)VISPAGRNKYYADSVK(SEQ ID NO：24)；(III)VISPDGHNTYYADSVK(SEQ ID NO：25)；(IV)VISPHGRNKYYADSVK(SEQ ID NO：26)；(V)VISRRGDNKYYADSVK(SEQ ID NO：27)；(VI)VISNNGHNKYYADSVK(SEQ ID NO：28)；(VII)VISPAGPNTYYADSVK(SEQ ID NO：29)；(VIII)VISPSGHNTYYADSVK(SEQ ID NO：30)；(IX)VISPNGHNTYYADSVK(SEQ ID NO：31)；(X)AISPPGHNTYYADSVK(SEQ ID NO：32)；(XI)VISPTGANTYYADSVK(SEQ ID NO：33)；(XII)VISPHGSNKYYADSVK(SEQ ID NO：34)；(XIII)VISNNGHNTYYADSVK(SEQ ID NO：35)；(XIV)VISPAGTNTYYADSVK(SEQ ID NO：36)；(XV)VISPPGHNTYYADSVK(SEQ ID NO：37)； (XVI)VISHDGTNTYYADSVK(SEQ ID NO：38)；(xvii)VISRHGNNKYYADSVK(SEQ ID NO：39)；或(xviii)VISYDGSNKYYADSVK(SEQ ID NO：40)；及VH CDR3，其具有胺基酸序列ASVGATGPFDI(SEQ ID NO：19)；其中該等VH CDR按以下胺基末端至羧基末端順序存在：VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3；且該VL包含：VL CDR1，其具有胺基酸序列QGDSLRSYYAS(SEQ ID NO：20)；VL CDR2，其具有胺基酸序列GENNRPS(SEQ ID NO：21)；及VL CDR3，其具有胺基酸序列NSRDSSGTHLTV(SEQ ID NO：22)；且其中該等VL CDR按以下胺基末端至羧基末端順序存在：VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3；該等scFv構架包含：VH FR1 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRL SCAASGFTFS(SEQ ID NO：8)
VH FR2 WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO：9)
VH FR3 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：11)
VH FR4 WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：12)
VL FR1 SSELTQPPSVSVAPGQTVTITC(SEQ ID NO：13)
VL FR2 WYQQKPGTAPKLLIY(SEQ ID NO：14)
VL FR3 GVPDRFSGSSSGTSASLTITGAQAEDEADYYC(SEQ ID NO：15)及VL FR4 FGGGTKLTVLG(SEQ ID NO：16)且其中該抗體免疫特異性結合A型ephrin受體2(EphA2)之細胞外域。
在某些實施例中，該scFv VH相對於該VL處於胺基末端。
在某些實施例中，該scFv展現至少約67℃之Tm。在某些實施例中，該scFv展現至少約70℃之Tm。
在某些實施例中，該scFv包含接合VH與VL之連接子，其中該連接子包含選自以下之胺基酸序列：ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：41)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：42)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：43)；ASTGGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO：44)；GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO：45)；TPSHNSHQVPSAGGPTANSGTSGS(SEQ ID NO：46)；及GGSSRSSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO：47)。
在某些實施例中，該scFv連接子包含胺基酸序列ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：41)。在某些實施例中，該抗體包含VH及VL，其中該VH包含與VH及VL之胺基酸序列具有至少95%一致性的胺基酸序列，其中該VH包含與SEQ ID NO：133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173或175之胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在相關實施例中，此等抗體之VL可包含與SEQ ID NO：134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174或176之胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。
在某些實施例中，該抗體在C末端包含Gly Gly Ser Gly Gly Cys(SEQ ID NO：54)。
在某些實施例中，本發明提供一種抗體結合物，其包含如本文中所揭示之抗體及與該抗體結合之部分。在某些實施例中，該部分為脂質奈米粒子。在某些實施例中，該脂質奈米粒子為脂質體。在某些實施例中，該部分包含聚乙二醇(PEG)。在某些實施例中，該部分包含治療劑。在某些實施例中，該治療劑為細胞毒性劑。在某些實施例中，該部分包含可偵測標記。在某些實施例中，該可偵測標記為活體內成像劑。
在某些實施例中，本發明提供一種組成物， 其包含本發明之抗體或結合物及醫藥學上可接受之載劑。在某些實施例中，該組成物經調配以用於非經腸投與。在某些實施例中，本發明提供一種套組，其包含處於容器中之本發明之組成物。
在某些實施例中，本發明提供編碼本發明之scFv的經分離之核酸。
在某些實施例中，本發明提供編碼本發明抗體之可變輕鏈多肽、可變重鏈多肽或兩者的經分離之核酸。
在某些實施例中，本發明提供一種表現載體，其包含本發明之核酸及與該核酸可操作地連接之真核生物啟動子。
在某些實施例中，本發明提供一種非人類宿主細胞，其包含本發明之表現載體。在某些實施例中，該細胞表現可變輕鏈多肽、可變重鏈多肽或兩者。
在某些實施例中，本發明提供一種治療患有表現EphA2之癌症之個體的方法，該方法包括向患有表現EphA2之癌症之個體投與本發明之抗體、抗體結合物或包含抗體及/或抗體結合物之組成物。
在某些實施例中，本發明提供一種組成物，其用於治療表現EphA2之癌症，其中該組成物包含本發明之抗體及/或抗體結合物。
本發明提供組成物用於治療表現EphA2之癌症的用途，其中該組成物包含本發明之抗體及/或抗體結 合物。
圖3及圖4中以數字1至22標識之scFv包含序列表中標識為scFv1至scFv22之相應胺基酸序列，並且將同一標識方案用於編碼scFv1至scFv22之胺基酸序列的核酸序列。核酸序列進一步編碼由表現所編碼之scFv之哺乳動物(例如人類或囓齒動物)細胞裂解除去的N末端前導序列。在用於圖1、圖3及圖4中時，「F5」指示scFv F5。「TS1」指示scFv TS1。「TS1*」指示scFvTS1*(注意，TS1*之VL與TS1之VL一致且在圖1中如此指示)，且「A7」指示scFv D2-1A7。
圖1顯示蛋白A結合分析(參見實例1)之結果。藉由將scFv F5、scFv TS1、scFv TS1*及D2-1A7之VH區與VL區連接在一起來產生scFv。如該圖中所指示，使用蛋白A結合分析來篩選此等混雜scFv以及scFv F5、scFv TS1、scFv TS1*及D2-1A7。將展現合意蛋白A結合性質之F5 scFv用作陽性對照。將scFv D1-2A7用作陰性對照。
圖2(圖A至圖D)顯示經設計而含有scFv TS1之CDR-H2變異體之超過50,000個獨特純系之一組scFv的FACS淘選結果。使用靶向誘變來產生CDR-H2變異體。圖A顯示進行一輪FACS之後的未染色酵母。圖B顯示進行一輪FACS之後的經螢光標記蛋白A(x軸)及針 對EphA2之Ab(y軸)標記之染色酵母。接著再次淘選所分離之純系。圖C顯示未染色酵母，而圖D顯示經針對FLAGTM抗原決定基之Ab(x軸)及針對EphA2之Ab(y軸)標記之染色酵母。
圖3顯示EphA2之蛋白A結合分析之結果。在哺乳動物瞬時系統中將CDR-H2變異體scFv表現為可溶性蛋白質，且使用蛋白A結合分析來量測蛋白A結合。將F5 scFv用作陽性對照，並且將TS1用作陰性對照。
圖4(圖A至圖C)顯示與Ab在表現EphA2之細胞株上之結合及內在化有關之資料。使用CLIA分析(實例5)在三種細胞株中評估抗體結合並內在化之能力。將可結合ErbB2(而不結合EphA2)之F5 scFv用作陰性對照，並且針對scFv TS1之結合及內在化對所有資料進行正規化。
圖5提供如本文中所描述之scFv、scFv連接子、N末端肽、C末端標籤、具有標籤之C末端連接子、含C末端半胱胺酸之序列及EphA2之實例之序列。在scFv1至scFv22之胺基酸序列中加下劃線指示連接子之胺基酸序列(ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：41))，其中相對於加下劃線之序列處於N末端之胺基酸序列為VH胺基酸序列，且相對於加下劃線之序列處於C末端之胺基酸序列為VHL.胺基酸序列。
提供新型適用抗體(例如，單鏈抗體，例如scFv)。亦提供包括該等抗體之結合物、組成物及套組。亦提供使用該等Ab，例如，用於製造免疫脂質體之方法。
定義
如本文中所使用，「抗體」(「Ab」)為展現免疫特異性抗原結合，亦即，由CDR介導之抗原結合的免疫球蛋白(「Ig」)或抗原結合Ig片段或包含獲自或來源於免疫球蛋白(例如單鏈抗體，例如單鏈可變片段(「scFv」))之互補決定區(「CDR」)的其他抗原結合多肽。天然存在之Ab通常包含至少四個多肽鏈，包含至少兩個重鏈與至少兩個輕鏈，但已知某些哺乳動物Ab含有單一(輕)鏈(例如本斯.瓊斯氏蛋白)或含有一個輕鏈與一個重鏈。重鏈可分類為γ、μ、α、δ或ε，由此又定義天然存在之人類Ig類別，分別為IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。典型IgG、IgD或IgE人類Ab之實例為具有由兩對多肽鏈構成之四聚體結構單元的Ab，每一對具有一個「輕」鏈及一個「重」鏈。
如本文中所使用之「人類抗體」(「人類Ab」)不要求藉由任何特定方法來產生該抗體或要求該抗體為天然存在的。相反，如本文中所使用之「人類抗體」係指抗體、其抗原結合片段或包含人類抗體之胺基酸序列 (例如CDR、構架)，其中該等CDR及/或構架不共同存在於自然界中(亦即，並非天然存在的)。
「抗EphA2 Ab」係指免疫特異性結合EphA2，例如EphA2之ECD的Ab。EphA2特異性Ab不會免疫特異性結合EphA2蛋白中不存在之抗原。
「CDR」指示互補性決定區。
「CLIA」指示螯合配位體誘導之內在化分析。
「DiI5」指示染料1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基吲哚二羰菁-5,5'-二磺酸。
「DOD-tri-NTA」指示如以下文獻中所描述之二(十八烷基)胺基-三-NTA化合物(化合物12)：Huang等人，「Facile Synthesis of Multivalent Nitrilotriacetic Acid(NTA)and NTA Conjugates for Analytical and Drug Delivery Applications」,Bioconjugate Chemistry,2006,第17卷，第1692-1600頁。NTA指示次氮基三乙酸。
「DSF」指示差示掃描螢光測定法。
「DSPE」指示1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺。
「ECD」係指跨膜蛋白質之細胞外域。
「EphA2」係指A型Ephrin受體2，亦稱為「上皮細胞激酶(ECK)」，其為可結合Ephrin-A配位體且由其活化之呈受體酪胺酸激酶形式之跨膜蛋白質。術語「EphA2」可能係指EphA2之任何天然存在之同功異型 體。人類EphA2之胺基酸序列記錄為GenBank登錄號NP_004422.2。
「抗原決定基」為與Ab免疫特異性結合之抗原上位點，例如EphA2 ECD上之位點。抗原決定基可由連續胺基酸或藉由形成蛋白質之多肽鏈之摺疊(例如三級摺疊)而毗鄰之非連續胺基酸形成。
「Fab」指示Ig之抗原結合片段(不考慮如何製備)，包括可變域及第一恆定域。
「FACS」指示螢光活化型細胞淘選。
「His6」指示六組胺酸肽。
「HSPC」指示氫化大豆磷脂醯膽鹼。
「Ig」指示免疫球蛋白。Ig輕鏈或重鏈可變區由多個「構架」區(FR)與三個高變區(亦稱為「互補性決定區」或「CDR」)交替構成。可基於與公開資料庫中所發現之序列的同源性來定義構架區及CDR之程度。參見例如「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」E.Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest，第4版.U.S.Dept.Health and Human Services,Public Health Services,Bethesda,MD(1987)。本文中所使用之所有Ab序列編號均如Kabat等人所定義。
「IgG」指示G同型免疫球蛋白。
「經分離」係指相關實體(例如蛋白質，例如Ab)處於與該實體可能天然存在或者製造或合成其之環境 不同的環境中。「經分離」之實體與製造其之細胞或反應容器中伴隨其存在之所有或一些組分分離。標的Ab可為實質上純的。「實質上純」可能係指總組成之至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或超過99%為相關實體(例如，本文中所揭示之抗EphA2 Ab)之組成物。
「Mal-PEG-DSPE」指示馬來醯亞胺基-PEG(2000)-DSPE(1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[馬來醯亞胺(聚乙二醇)-2000]。
「MFI」指示中值螢光強度。
「NTA(Ni)」指示次氮基三乙酸鎳。
「PBS」指示磷酸鹽緩衝生理鹽水。
「PEG」指示聚乙二醇。
「PEG-DSPE」指示甲氧基-PEG(2000)-二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺。
「scFv」指示單鏈Fv，其為由單一多肽鏈構成之蛋白質，其中VH及VL典型地經由連接子肽彼此共價連接，從而允許形成由VH及VL CDR構成之功能抗原結合位點。
「SEC」指示粒徑排阻層析。
「SM」指示鞘磷脂。
「Tm」指示解鏈溫度。
「TS1」指示如以下所揭示之scFv-TS1。
「TS1*」指示如以下所揭示之scFv-TS1*。
「VH」指示Ig重鏈可變區，其亦可稱為VH多肽。
「VL」指示Ig輕鏈可變區，其亦可稱為VL多肽。
抗體
本發明提供抗EphA2 Ab，其包括可賦予該等Ab以適用性質之構架序列及CDR序列。儘管實例中所闡述之Ab為scFv，但本文中所揭示之CDR及人類構架序列可容易地且有利地併入IgA、IgD、IgE、IgG及IgM Ab中。在某些實施例中，此類性質包括穩定性(例如熱穩定性，例如大於65℃、大於或等於67℃或至少約70℃之解鏈溫度)；30%、40%或50%蛋白A結合；或兩者。
構架區
在某些實施例中，本文中所揭示之scFv包括VH FR1、VH FR2、VH FR3、VL FR1、VL FR2及VL FR3之一或任何組合，其中：該VH FR1為人類VH FR1，其包含胺基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：1)，其中X1為除E以外之胺基酸，且在某些實施例中X1為Q；該VH FR2為人類VH FR2，其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVX2(SEQ ID NO：2)，其中X2為除S 以外之胺基酸，且在某些實施例中X2為A；該VL FR1為人類VL FR1，其包含胺基酸序列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(SEQ ID NO：3)，其中：X3為除Q以外之胺基酸，X4為除V以外之胺基酸，X5為除G以外之胺基酸，X6為除R以外之胺基酸，且X7為除S以外之胺基酸；並且在某些實施例中，X4為V，X5為G，且X6為R；在某些實施例中，該VL FR1為人類VL FR1，其包含胺基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQ ID NO：4)，其中X8為除Q以外之胺基酸，且其中X9為除S以外之胺基酸，並且在某些實施例中，X8為S及/或X9為T；該VL FR2為人類VL FR2，其包含胺基酸序列WYQQX10PGTAPKLLIY(SEQ ID NO：5)，其中X10為除L以外之胺基酸，及/或在某些實施例中X10為K；且該VL FR3為人類VL FR3，其包含胺基酸序列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(SEQ ID NO：6)，其中：X11為除F以外之胺基酸，X12為除K以外之胺基酸，X13為除A以外之胺基酸，或X14為除L以外之胺基酸，且在某些實施例中，X11為S，X12為S，X13為T及/或X14為A；在某些實施例中，該VL FR3為人類VL FR3，其包含胺基酸序列 GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO：7)，其中：X15為除F以外之胺基酸，或X16為除K以外之胺基酸，且在某些實施例中，X15為S及/或X16為G。
在某些實施例中，本文中所揭示之Ab包括表1中所闡述之VH FR1、VH FR2、VH FR3、VL FR1、VL FR2及VL FR3之一或任何組合。在一個實施例中，該Ab為scFv且含有表1之所有構架。
在某些態樣中，本文中所揭示之Ab(例如scFv)為熱穩定的，例如，使得該Ab非常適用於進行穩固且可規模化之製造。如本文中所使用，「熱穩定」Ab為具有70℃或更高之解鏈溫度(Tm)的Ab，例如，如使用差示掃描螢光測定法(DSF)所量測。具有適合之解鏈溫度的實例Ab描述於以下實驗部分中。
在某些實施例中，本文中所揭示之Ab展現30%、40%或有利地50%或更大程度之蛋白A結合，例 如，如使用實例1中所描述之分析法所測定。
EphA2結合
尤其相關之抗體包括可結合EphA2多肽之細胞外域(亦即，跨越GenBank登錄號NP_004422.2或UniProt登錄號P29317中所闡述之序列之至少胺基酸殘基25至534之EphA2蛋白部分)的抗EphA2 Ab。
在某些實施例中，本文中所揭示之抗EphA2抗體(例如scFv)包括各自具有如表2A中所闡述之序列的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在其他實施例中，該VH CDR2序列(亦稱為CDRH2)將為選自表2B中所闡述之18個不同的VH CDR2序列中之任一者。
對於表2A及表3中之VH CDR2：X17為A或V；X18為A、D、H、N、P、S或T；X19為A、R、H或P；且X20為K或T。在某些實施例中：X17為A；X18為H或P；或者X19為R或P。在某些實施例中：X17為V； X18為H或P；X19為R或N；且X20為K或T。在某些實施例中：X17為V；X18為H或D；X19為H或N；且X20為T。
適合之VH CDR2序列的十八個特定實例闡述於表2B中：
本發明所提供之scFv之實例提供於圖5中。圖5提供scFv1至scFv22之胺基酸序列以及相應編碼核酸序列。在scFv2至scFv22中之每一者之胺基酸序列中下劃線指示連接子之胺基酸序列(ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：41))。相 對於scFv1至scFv22之加下劃線胺基酸序列處於N末端之胺基酸序列為scFv之VH多肽之胺基酸序列。相對於scFv1至scFv22之加下劃線胺基酸序列處於C末端之胺基酸序列為scFv之VL多肽之胺基酸序列。
因此，本發明提供諸多抗體(包括scFv)，其具有VH及VL，其中該VH具有與如圖5中所闡述之scFv1至scFv22中之任一者之VH具有至少95%一致性的胺基酸序列。本發明亦提供諸多抗體(包括scFv)，其包含VH及VL，其中該VH包含與如圖5中所闡述之scFv1至scFv22中之任一者之VH及VL之VH及VL具有至少95%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。本發明亦提供諸多抗體(諸如scFv)，其包含VH及VL，其中該VH及該VL各自包含圖5之scFv之VH及VL之VH及VL之胺基酸序列。
圖5之scFv1至scFv22之VH及VL之胺基酸序列如下：scFv1之VH及VL(分別為SEQ ID NO：133及134)；scFv2之VH及VL(分別為SEQ ID NO：135及136)；scFv3之VH及VL(分別為SEQ ID NO：137及138)；scFv4之VH及VL(分別為SEQ ID NO：139及140)；scFv5之VH及VL(分別為SEQ ID NO：141及142)；scFv6之VH及VL(分別為SEQ ID NO：143及144)；scFv7之VH及VL(分別為SEQ ID NO：145及146)；scFv8之VH及VL(分別為SEQ ID NO：147及148)；scFv9之VH及VL(分別為SEQ ID NO：149及 150)；scFv10之VH及VL(分別為SEQ ID NO：151及152)；scFv11之VH及VL(分別為SEQ ID NO：153及154)；scFv12之VH及VL(分別為SEQ ID NO：155及156)；scFv13之VH及VL(分別為SEQ ID NO：157及158)；scFv14之VH及VL(分別為SEQ ID NO：159及160)；scFv15之VH及VL(分別為SEQ ID NO：161及162)；scFv16之VH及VL(分別為SEQ ID NO：163及164)；scFv17之VH及VL(分別為SEQ ID NO：165及166)；scFv18之VH及VL(分別為SEQ ID NO：167及168)；scFv19之VH及VL(分別為SEQ ID NO：169及170)；scFv20之VH及VL(分別為SEQ ID NO：171及172)；scFv21之VH及VL(分別為SEQ ID NO：173及174)；或scFv22之VH及VL(分別為SEQ ID NO：175及176)。
本發明亦提供與以下胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列一致性之scFv：SEQ ID NO：60[scFv1]、SEQ ID NO：62[scFv2]、SEQ ID NO：64[scFv3]SEQ ID NO：66[scFv4]、SEQ ID NO：68[scFv5]、SEQ ID NO：70[scFv6]、SEQ ID NO：72[scFv7]、SEQ ID NO：74[scFv8]、SEQ ID NO：76[scFv9]、SEQ ID NO：78[scFv10]、SEQ ID NO：80[scFv11]、SEQ ID NO：82[scFv12]、SEQ ID NO：84[scFv13]、SEQ ID NO：86[scFv14]、SEQ ID NO：88[scFv15]、SEQ ID NO：90[scFv16]、SEQ ID NO：92[scFv17]、SEQ ID NO：94 [scFv18]、SEQ ID NO：96[scFv19]、SEQ ID NO：98[scFv20]、SEQ ID NO：100[scFv21]或SEQ ID NO：102[scFv22]，以及編碼其之核酸。本發明亦提供具有以下胺基酸序列之scFv：SEQ ID NO：60[scFv1]、SEQ ID NO：62[scFv2]、SEQ ID NO：64[scFv3]、SEQ ID NO：66[scFv4]、SEQ ID NO：68[scFv5]、SEQ ID NO：70[scFv6]、SEQ ID NO：72[scFv7]、SEQ ID NO：74[scFv8]、SEQ ID NO：76[scFv9]、SEQ ID NO：78[scFv10]、SEQ ID NO：80[scFv11]、SEQ ID NO：82[scFv12]、SEQ ID NO：84[scFv13]、SEQ ID NO：86[scFv14]、SEQ ID NO：88[scFv15]、SEQ ID NO：90[scFv16]、SEQ ID NO：92[scFv17]、SEQ ID NO：94[scFv18]、SEQ ID NO：96[scFv19]、SEQ ID NO：98[scFv20]、SEQ ID NO：100[scFv21]或SEQ ID NO：102[scFv22]，以及編碼其之核酸。
本發明亦提供可結合蛋白A之多肽，該等多肽可能呈抗體(例如scFv)形式存在且包含以下胺基酸序列：Xa X17IS Xb X18GX19N X20(SEQ ID NO：198)，其中Xa為S、T或A；X17為A或V；Xb為P、R、N或H；X18及X19為任何胺基酸；且 X20為K或T。
在一個實施例中，該多肽(可能呈抗體(例如scFv)形式存在)包含胺基酸序列SEQ ID NO：198，其中X18為A、D、H、N、P、S或T；且X19為A、R、H、N或P。
在一個實施例中，此類多肽自N末端至C末端包含VH CDR1，其包含胺基酸序列SYAMH(SEQ ID NO：17)；具有式SEQ ID NO：198之蛋白A結合序列，其中X18為任何胺基酸或為A、D、H、N、P、S或T；且其中X19為任何胺基酸或為A、R、H、N或P；及VH CDR3，其包含胺基酸序列ASVGATGPFDI(SEQ ID NO：19)。
在SEQ ID NO：198之多肽呈抗體(例如scFv)形式存在時，該抗體可包含：VL CDR1，其包含胺基酸序列QGDSLRSYYAS(SEQ ID NO：20)；VL CDR2，其包含胺基酸序列GENNRPS(SEQ ID NO：21)；及VL CDR3，其包含胺基酸序列NSRDSSGTHLTV(SEQ ID NO：22)。在多肽為抗體(例如scFv)之一個實施例中，該抗體(例如scFv)包括VH FR1及VH FR2中之一或兩者，其中該VH FR1包含胺基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：1)，其中X1為除E以外之胺基酸且在某些實施例中X1為 Q；該VH FR2包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：202)。此類抗體(例如scFv)亦可包括以下各項中之一或多者：VL FR1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：3；VL FR2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：4；及VL FR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：5；及VL FR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：6。在一個實施例中，此類抗體(例如scFv)包含表1之VH FR1、VH FR2、VH FR3、VL FR1、VL FR2及VL FR3之任何組合中之一或多者。
本發明亦提供可結合蛋白A之多肽，該等多肽可能呈抗體(例如scFv)形式存在且包含以下胺基酸序列：Xa V I S Xb X18 G X19 N X20(SEQ ID NO：199)，其中Xa為S或T；Xb為P、R或N；X18為任何胺基酸；X19為H、N、R、T、A、D、P或S；且X20為K或T。
在一個實施例中，該多肽(可能呈抗體(例如scFv)形式存在)包含胺基酸序列SEQ ID NO：199，其中X18為A、D、H、N、P、S或T。
在一個實施例中，該多肽(可能呈抗體(例如scFv)形式存在)包含胺基酸序列SEQ ID NO：199，其中X18為A、D、H、N、P、S或T；且X19為A、R、H、N 或P。
在一個實施例中，此類多肽自N末端至C末端包含VH CDR1，其包含胺基酸序列SYAMH(SEQ ID NO：17)；具有式SEQ ID NO：199之蛋白A結合序列，其中X18為任何胺基酸或為A、D、H、N、P、S或T；且其中X19為任何胺基酸或為A、R、H、N或P；及VH CDR3，其包含胺基酸序列ASVGATGPFDI(SEQ ID NO：19)。
在SEQ ID NO：199之多肽呈抗體(例如scFv)形式存在時，該抗體可包含：VL CDR1，其包含胺基酸序列QGDSLRSYYAS(SEQ ID NO：20)；VL CDR2，其包含胺基酸序列GENNRPS(SEQ ID NO：21)；及VL CDR3，其包含胺基酸序列NSRDSSGTHLTV(SEQ ID NO：22)。在多肽為抗體(例如scFv)之一個實施例中，該抗體(例如scFv)包括VH FR1及VH FR2中之一或兩者，其中該VH FR1包含胺基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：1)，其中X1為除E以外之胺基酸且在某些實施例中X1為Q；該VH FR2包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：202)。此類抗體(例如scFv)亦可包括以下各項中之一或多者：VL FR1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：3；VL FR2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：4；及VL FR3， 其包含胺基酸序列SEQ ID NO：5；及VL FR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：6。在一個實施例中，此類抗體(例如scFv)包含表1之VH FR1、VH FR2、VH FR3、VL FR1、VL FR2及VL FR3之任何組合中之一或多者。
本發明亦提供可結合蛋白A之多肽，該等多肽可能呈抗體(例如scFv)形式存在且包含以下胺基酸序列：Xa V I S Xb X18 G X19 N X20(SEQ ID NO：200)，其中Xa為S或T；Xb為P、R或N；X18為任何胺基酸；X19為H、N、R或T；且X20為T或K。
在一個實施例中，該多肽(可能呈抗體(例如scFv)形式存在)包含胺基酸序列SEQ ID NO：200，其中X18為A、D、H、N、P、S或T。在一個實施例中，該多肽(可能呈抗體(例如scFv)形式存在)包含胺基酸序列SEQ ID NO：200，其中X18為A、D、H、N、P、S或T；且X19為A、R、H、N或P。
在一個實施例中，此類多肽自N末端至C末端包含VH CDR1，其包含胺基酸序列SYAMH(SEQ ID NO：17)； 具有式SEQ ID NO：200之蛋白A結合序列，其中X18為任何胺基酸或為A、D、H、N、P、S或T；且其中X19為任何胺基酸或為A、R、H、N或P；及VH CDR3，其包含胺基酸序列ASVGATGPFDI(SEQ ID NO：19)。
在SEQ ID NO：200之多肽呈抗體(例如scFv)形式存在時，該抗體可包含：VL CDR1，其包含胺基酸序列QGDSLRSYYAS(SEQ ID NO：20)；VL CDR2，其包含胺基酸序列GENNRPS(SEQ ID NO：21)；及VL CDR3，其包含胺基酸序列NSRDSSGTHLTV(SEQ ID NO：22)。在多肽為抗體(例如scFv)之一個實施例中，該抗體(例如scFv)包括VH FR1及VH FR2中之一或兩者，其中該VH FR1包含胺基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：1)，其中X1為除E以外之胺基酸且在某些實施例中X1為Q；該VH FR2包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：202)。此類抗體(例如scFv)亦可包括以下各項中之一或多者：VL FR1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：3；VL FR2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：4；及VL FR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：5；及VL FR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：6。在一個實施例中，此類抗體(例如scFv)包含表1之VH FR1、VH FR2、VH FR3、VL FR1、VL FR2及VL FR3之任何組合中之一或多者。
本發明亦提供可結合蛋白A之多肽，該等多 肽可能呈抗體(例如scFv)形式存在且包含以下胺基酸序列：Xa X17 I S Xb X18 G X19 N X20(SEQ ID NO：201)，其中Xa為S或T；X17為V；Xb為P；X18為任何胺基酸；X19為H、N、R或T；且X20為T或K。
在一個實施例中，該多肽(可能呈抗體(例如scFv)形式存在)包含胺基酸序列SEQ ID NO：201，其中X18為A、D、H、N、P、S或T。
在一個實施例中，該多肽(可能呈抗體(例如scFv)形式存在)包含胺基酸序列SEQ ID NO：201，其中X18為A、D、H、N、P、S或T；且X19為A、R、H、N或P。
在一個實施例中，此類多肽自N末端至C末端包含VH CDR1，其包含胺基酸序列SYAMH(SEQ ID NO：17)；具有式SEQ ID NO：201之蛋白A結合序列，其中X18為任何胺基酸或為A、D、H、N、P、S或T；且其中X19為任何胺基酸或為A、R、H、N或P；及 VH CDR3，其包含胺基酸序列ASVGATGPFDI(SEQ ID NO：19)。
在SEQ ID NO：201之多肽呈抗體(例如scFv)形式存在時，該抗體可包含：VL CDR1，其包含胺基酸序列QGDSLRSYYAS(SEQ ID NO：20)；VL CDR2，其包含胺基酸序列GENNRPS(SEQ ID NO：21)；及VL CDR3，其包含胺基酸序列NSRDSSGTHLTV(SEQ ID NO：22)。在多肽為抗體(例如scFv)之一個實施例中，該抗體(例如scFv)包括VH FR1及VH FR2中之一或兩者，其中該VH FR1包含胺基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：1)，其中X1為除E以外之胺基酸且在某些實施例中X1為Q；該VH FR2包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：202)。此類抗體(例如scFv)亦可包括以下各項中之一或多者：VL FR1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：3；VL FR2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：4；及VL FR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：5；及VL FR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：6。在一個實施例中，此類抗體(例如scFv)包含表1之VH FR1、VH FR2、VH FR3、VL FR1、VL FR2及VL FR3之任何組合中之一或多者。
在其他實施例中，本發明提供可結合蛋白A之多肽，該等多肽可能呈抗體(例如scFv)形式存在且包含選自如圖5中所闡述之SEQ ID NO：177-197之胺基酸序列。
在一個實施例中，該等多肽(該等多肽可能呈抗體(例如scFv)形式存在)包含胺基酸序列SEQ ID NO：177-197之一。
在一個實施例中，此類多肽自N末端至C末端包含VH CDR1，其包含胺基酸序列SYAMH(SEQ ID NO：17)；蛋白A結合序列，其為SEQ ID NO：177-197之一；及VH CDR3，其包含胺基酸序列ASVGATGPFDI(SEQ ID NO：19)。
在SEQ ID NO：177-197之多肽呈抗體(例如scFv)形式存在時，該抗體可包含：VL CDR1，其包含胺基酸序列QGDSLRSYYAS(SEQ ID NO：20)；VL CDR2，其包含胺基酸序列GENNRPS(SEQ ID NO：21)；及VL CDR3，其包含胺基酸序列NSRDSSGTHLTV(SEQ ID NO：22)。在多肽為抗體(例如scFv)之一個實施例中，該抗體(例如scFv)包括VH FR1及VH FR2中之一或兩者，其中該VH FR1包含胺基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：1)，其中X1為除E以外之胺基酸且在某些實施例中X1為Q；該VH FR2包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：202)。此類抗體(例如scFv)亦可包括以下各項中之一或多者：VL FR1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：3； VL FR2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：4；及VL FR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：5；及VL FR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：6。在一個實施例中，此類抗體(例如scFv)包含表1之VH FR1、VH FR2、VH FR3、VL FR1、VL FR2及VL FR3之任何組合中之一或多者。
在某些實施例中，本文中所揭示之Ab為內在化抗EphA2 Ab。此類Ab在適當條件下與活細胞外表面上所存在之EphA2分子之ECD結合導致該Ab內在化，其特徵在於Ab轉運至該細胞之細胞膜結合內部。內在化Ab得以例如作為媒劑用於藥物、毒素、酶、奈米粒子(例如脂質體)、DNA等之靶向遞送，例如用於治療應用。
本文中所描述之某些Ab為單鏈Fv Ab，例如scFv或(scFv')2。在此類Ab中，VH及VL多肽以兩種取向(亦即，以VH N末端至VL，或以VL N末端至VH)中之任一種直接或經由胺基酸連接子與彼此接合。此類連接子之長度可為例如1至50、5至40、10至30或15至25個胺基酸。在某些實施例中，胺基酸連接子之殘基之80%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多或者100%為絲胺酸(S)及/或甘胺酸(G)。適合之scFv連接子之實例可為或包括以下序列：ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：41)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：42)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：43)；ASTGGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO：44)；GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO：45)；TPSHNSHQVPSAGGPTANSGTSGS(SEQ ID NO：46)；或GGSSRSSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO：47)。
內在化抗EphA2 Ab之實例包括scFv TS1： (SEQ ID NO：48)。
在以上TS1中，該等CDR加下劃線且按以下順序存在：VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。因而，在scFv TS1中且在本文中所揭示之某些其他scFv中，scFv之VH處於scFv之胺基末端且由連接子(此處以斜體表示)連接至VL。
亦提供scFv TS1變異體，其中TS1之所有構架區及CDR均未改變，除了用選自以上表2B中所闡述之18個不同的CDRH2序列中之任一者的CDR替換VH CDR2。
Ab產生方法
使用本文中所提供之資訊，可使用標準技術來製備本文中所揭示之Ab。舉例而言，本文中所提供之胺基酸序列可用於確定編碼該等Ab之適當核酸序列，且接著將該等核酸序列用於表現該等Ab中之一或多者。可 根據標準方法對核酸序列進行最佳化以體現對各種表現系統之特定密碼子「偏好」。
使用本文中所提供之序列資訊，可根據許多標準方法來合成該等核酸。在市售固相寡核苷酸合成機上便利地進行寡核苷酸合成，或使用例如固相亞磷醯胺三酯法人工合成。一旦合成編碼本文中所揭示之Ab的核酸，便可根據標準方法對其進行擴增及/或選殖。
編碼本文中所揭示之Ab之天然或合成核酸之表現可藉由將編碼Ab之核酸可操作地連接至啟動子(其可為組成型或誘導型)並且將該構築體併入表現載體中以產生重組表現載體來達成。該等載體可能適於在原核生物、真核生物或兩者中進行複製並整合。典型選殖載體含有適用於調控編碼Ab之核酸之表現的在功能上適當取向之轉錄及轉譯終止子、引發序列及啟動子。該等載體視情況含有通用表現卡匣，該等通用表現卡匣含有至少一個獨立終止子序列、允許在真核生物與原核生物兩者中複製卡匣之序列(例如，如在穿梭載體中所發現)及用於真核生物系統與真核生物系統兩者之選擇標記物。
為了獲得所選殖核酸之高表現水準，通常構築含有各自相對於彼此且相對於蛋白質編碼序列呈功能取向之用於指導轉錄之強啟動子、用於轉譯引發之核糖體結合位點及轉錄/轉譯終止子的表現質體。亦可將Ab基因次選殖至表現載體中，從而允許在該Ab(例如scFv)之C末端或N末端添加標籤序列(例如FLAGTM或His6)以有助於 鑑別、純化及控制。一旦分離並選殖編碼該Ab之核酸，便可在多種經重組工程改造之細胞中表現該核酸。此類細胞之實例包括細菌、酵母、絲狀真菌、昆蟲及哺乳動物細胞。
本文中所揭示之Ab之分離及純化可藉由自分泌Ab之細胞之培養物上清液中分離繼而使用親和力層析進行純化來實現，或可利用純化，例如藉由親和力層析(例如使用蛋白A或蛋白G)自經基因修飾以組成性及/或在誘導後表現該蛋白質之細胞的溶解產物中或自合成反應混合物中分離。可藉由滲析及蛋白質純化中正常採用之其他方法進一步純化經分離之Ab。
本發明亦提供可產生標的Ab之細胞。舉例而言，本發明提供用一或多個包含編碼本文中所揭示之Ab之核苷酸序列的核酸或其多肽鏈進行基因修飾之重組宿主細胞。將DNA選殖至例如細菌(例如噬菌體)、酵母(例如釀酒酵母或畢赤氏酵母)、昆蟲(例如桿狀病毒)或哺乳動物表現系統中。一種適合之技術使用絲狀噬菌體載體系統。參見例如US 5,885,793、US 5,969,108及US 6,512,097。
Ab修飾
本發明涵蓋經修飾以提供所要特徵，例如以有助於遞送至個體中之特定類型組織及/或細胞(例如至腫瘤)、以增加血清半衰期、以增補抗癌活性等之Ab(及編碼Ab之核酸)。本文中所揭示之Ab可在具有修飾或不具 有修飾的情況下提供，且例示為人類Ab，但可容易地修飾並製備為人類化Ab或嵌合Ab。用於修飾Ab(例如scFv)之一種方式為將一或多個其他元件結合(例如連接)在該Ab所包含之多肽鏈之N末端及/或C末端或至該Ab之任何胺基酸(包括內部胺基酸)。此類其他元件包括例如脂質體、另一蛋白質、可偵測標記(例如放射性同位素、產生可偵測產物之酶、螢光蛋白質、發色蛋白質、染料、螢光發射金屬、化學發光化合物及其類似物)、藥物及/或載劑分子。視情況，此種結合係經由連接該Ab與該(等)其他元件之連接子部分來進行。
經一或多個其他元件修飾之本文中所揭示之Ab保留其結合特異性，同時利用該一或多個其他元件之性質來賦予一或多種其他特徵。
在某些實施例中，本文中所揭示之Ab係藉由附接至治療部分，諸如至脂質奈米粒子(例如脂質體、固體脂質奈米粒子或膠束)之外部或至諸如類美登素(例如腺苷-曲妥珠單抗安坦辛之化學治療部分DM1)或奧里斯他汀(例如貝倫妥單抗維多汀之化學治療部分單甲基奧里斯他汀E)之化學治療劑來進行調配。當附接至脂質微粒時，該Ab可共價附接至與適合插入脂質膜中之脂質結合的聚合物(例如至該聚合物之末端)。Ab結合之脂質體在本文中稱為「免疫脂質體」。本文中所揭示之Ab可充當免疫脂質體靶向組分，使得該免疫脂質體能夠特異性結合癌細胞表面上之EphA2。免疫脂質體可經負載而含有一或多種抗 癌劑，諸如小分子(例如化學治療劑)或核酸(例如siRNA)。製造及負載脂質奈米粒子(諸如脂質體及免疫脂質體)之方法描述於例如US 2010/0068255、US 2010/0008978、US 2009/0171077、US 2009/0155272、US 2007/0116753、US 2007/0110798、US 2007/0031484、US 2006/0147513、US 2005/0112065、US 2004/0037874、US 2004/0209366、US 2003/0003143、US 7,135,177、US 7,022,336、US 6,803,053、US 6,528,087、US 6,214,388、US 6,210,707、US 6,110,491、US 5,980,935、US 5,380,531、US 7,507,407、US 7,479,276及US 7,462,603中。
附接至Ab之以上元件中之任一者均可經由連接子，例如可撓性連接子，例如肽連接子或聚乙二醇連接子而連接至該Ab。若存在，則該連接子分子一般具有足以容納該Ab及所連接之部分的長度，以便在結合時允許該Ab進行一定程度之可撓性運動，例如至脂質奈米粒子之表面。
組成物
本發明亦提供組成物，例如包括本文中所描述之任何Ab或結合物或者編碼本文中所揭示之任何Ab之核酸的組成物。在某些態樣中，該等組成物得以用於治療個體(例如人類)之癌症，且可能適用於在該疾病之任何階段期間進行治療。含有一種、兩種或更多種不同的Ab 的組成物可作為醫藥組成物提供且投與有需要之哺乳動物(例如人類)。
如以上所描述，該脂質體可含有一或多種與本文中所揭示之Ab不同的Ab。該脂質體可為雙特異性的、多特異性的等，因為該脂質體附接有多個不同的Ab，而且除本文中所揭示之Ab所結合之EphA2抗原決定基以外，亦對至少一個其他抗原決定基或抗原具有特異性。
組合可提供於單一調配物中或可提供為單獨調配物，例如於單獨容器中，該等容器又可包括在較大容器中作為套組，其中該等單獨調配物可含有例如單一Ab或多種不同的Ab。此類單獨調配物可在投與之前組合或藉由單獨注射來投與。
本文中所揭示之Ab或免疫脂質體可調配於醫藥學上可接受之載劑中，例如，經調配以用於非經腸投與，從而用於所描述之方法中。在某些實施例中，例如，在Ab作為可注射液體(例如適用於靜脈內注射)投與時，Ab調配物可為包含鹽(例如以調節張力)、緩衝劑、防腐劑、胺基酸及其他醫藥學上可接受之載劑及賦形劑中之一或多種或全部的無菌無熱原質水溶液，且可提供為例如即用型劑型或可復原儲存穩定粉末或液體。用於經由對流增強型遞送投與之調配物可如例如US 20090208422中所描述。
本發明之組成物可包括治療有效量之標的抗 體，以及任何其他相容組分，視需要而定。「治療有效量」意謂以單次劑量、作為一系列相同或不同的抗體或組成物之一部分向個體投與該量可有效減少個體之癌細胞增殖及/或轉移或提供任何其他可偵測治療益處。抗體之此種治療有效量及其對細胞生長之影響包括連同一或多種其他療法(例如免疫療法、化學療法、輻射療法等)一起協作及/或協同抑制細胞生長。如以下所指出，治療有效量可結合給藥方案及對個體病狀之診斷分析(例如，使用EphA2特異性抗體監測存在或不存在細胞表面抗原決定基)及其類似因素加以調節。
量及劑量
熟習此項技術者將可確定準確劑量。劑量可視多種因素而定，包括所採用之特定化合物之強度、個體之病狀及個體之體重，以及疾病嚴重程度及疾病階段。劑量亦將由可能伴隨特定化合物之投藥的任何不利副作用之存在、性質及程度來決定。如此項技術中已知，可能必需基於年齡、體重、性別、飲食、投與時間、藥物相互作用及病狀嚴重程度加以調節，並且將可由熟習此項技術者利用常規實驗來確定。治療有效量亦為治療上有益之效應超過該抗體之任何毒性或不利效應的量。
在本發明之情形下投與個體(例如人類)之組成物的量應足以在合理時限內在動物中實現預防或治療反應，並且視投與目標、欲治療個體之健康及身體狀況、年 齡、所要消退程度、抗體組成物之配方、治療臨床醫師對醫學情形之評定及其他相關因素而變化。因而，預期該量將屬於相對較寬之範圍內，但仍可藉由個體之各種特徵(諸如以上所指出)以常規方式確定。
作為一個實例，標的抗體之治療或預防有效量之非限制性範圍為約0.1mg/kg至約20mg/kg，例如約1mg/kg至約10mg/kg。
醫藥調配物中之抗體濃度可自以重量計小於約0.1%、通常在或至少約2%變化至多達20%至50%以上，並且將根據所選擇之特定投與模式及患者需要主要藉由考慮體液體積、黏度等加以選擇。
亦可藉由與已知會影響所要生長抑制或免疫抑制反應之抗癌劑或免疫抑制劑相比較來確定適合之劑量及劑量方案。此類劑量包括在無顯著副作用之情況下對細胞生長產生低劑量抑制之劑量。在適當劑量下且在適當投與某些化合物之情況下，本發明之化合物可提供多種細胞內效應，例如自部分抑制至基本上完全抑制細胞生長。劑量治療可為單次劑量方案或多次劑量方案(例如，包括勻變劑量及維持劑量)。如以下所指示，標的組成物可連同其他藥劑一起投與，且因而劑量及方案在此種情形下亦可變化以適合個體之需要。
組合療法
多種癌症療法中之任一種均可組合在含本發 明抗體之組成物中。舉例而言，用於化學治療性治療或生物反應調節劑治療之藥劑可存在於包含該抗體之醫藥組成物(諸如免疫脂質體)中。
化學治療劑為可減少癌細胞增殖之非蛋白質化合物，且涵蓋細胞毒性劑及細胞抑制劑。化學治療劑之非限制性實例包括烷基化劑、亞硝基脲、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、植物(例如長春花)生物鹼、核酸(諸如抑制核酸，例如siRNA)及類固醇激素。
舉例而言，抗代謝物藥劑包括葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物及腺苷脫胺酶抑制劑。
適合天然產物及其衍生物(例如長春花生物鹼、抗腫瘤抗生素、酶、淋巴因子及表鬼臼毒素)可用作抗癌劑。舉例而言，紫杉烷(諸如太平洋紫杉醇)以及任何活性紫杉烷衍生物(諸如多烯紫杉醇)或紫杉烷前藥(諸如2'-(2-(N,N'-二乙基胺基)丙醯基)-太平洋紫杉醇、7-(2-(N,N'-二乙基胺基)丙醯基)-太平洋紫杉醇、2'-(2-(N,N'-二乙基胺基)丙醯基)-多烯紫杉醇或7-(2-(N,N'-二乙基胺基)丙醯基)-多烯紫杉醇)為適合的。
其他抗增殖性細胞毒性劑為納維本(navelbene)、CPT-11(伊立替康(irinotecan))、阿那曲唑(anastrazole)、來曲唑(letrazole)、卡培他濱(capecitabine)、雷洛昔芬(reloxafine)、環磷醯胺、異環磷醯胺(ifosamide)及屈洛昔芬(droloxafine)。具有抗增殖活性之微管影響劑亦適合使用。激素調節劑及類固醇(包括 合成類似物)適合使用。
方法 治療方法
本發明之抗體得以治療性用於多種癌症。本文中所描述之療法及診斷法預期用於患有癌症、疑似患有癌症或處在發展癌症之風險下的個體。
「治療」意謂至少達成改善與宿主所罹患之病狀相關之症狀，其中改善以廣義使用以係指至少降低與所治療之病狀相關之參數(例如症狀)之量值。因而，治療亦包括病理學病狀或至少與其相關之症狀受到完全抑制(例如防止發生或中止，例如終止)，使得宿主不再受該病狀或至少表徵該病狀之症狀困擾的情形。因而治療包括：(i)預防，亦即，降低發展臨床症狀之風險，包括致使臨床症狀不發展，例如防止疾病進展至有害狀態；(ii)抑制，亦即，使臨床症狀之發展或進一步發展停滯，例如緩解或完全抑制活性疾病，例如，以便減少腫瘤負載，該減少可包括消除可偵測之癌細胞(例如轉移性癌細胞)；及/或(iii)解除，亦即，使臨床症狀消退。
根據該方法，可治療多種個體。一般而言，此類個體為「哺乳動物」，其中此等術語廣泛用於描述在哺乳動物類內之生物體，包括肉食動物目(例如狗及貓)、嚙齒目(例如小鼠、豚鼠及大鼠)及靈長目(例如人類、黑猩猩及猴子)。在許多實施例中，個體將為人類。
在一相關實施例中，所治療之個體患有表現(例如過度表現)腫瘤相關抗原及/或EphA2之癌症。該抗原表現於癌細胞表面上且往往以比相應非癌細胞更高之水準存在。此態樣在本發明方法之情形下可能為有益的，因為表現或呈現EphA2之細胞可能順應於用本發明抗體進行之治療。該抗體可例如在抗原之存在不可偵測時開始治療之情況下投與個體，且因而不欲具有限制性。亦可能在疾病症狀之第一徵象之前、在可能之疾病的第一徵象時或者在疾病診斷之前或之後開始抗體療法。
癌症
本發明之抗EphA2抗體組成物及/或抗EphA2抗體結合物組成物可用於抗癌療法，尤其在癌細胞於細胞外可及細胞表面上呈現EphA2時。舉例而言，本文中所描述之抗體組成物及/或治療抗體結合物組成物可投與個體(例如人類患者)以減少癌細胞增殖，例如，以減小腫瘤尺寸、減少癌症負載、減少轉移及/或改良患者之臨床結果。與本文中所預期之癌症有關之方法包括例如單獨或與抗癌疫苗或療法組合使用抗體療法。
尤其順應於抗體療法之癌症可藉由與本文中所描述之診斷方法類似之方法及此項技術中已知的其他方法加以鑑別。
在抗癌療法包括投與先前所描述之抗體組成物時，該抗癌療法可尤其針對表現標的抗體所結合之細胞 表面可及及/或溶劑暴露抗原決定基之癌細胞，包括轉移性癌症。
順應於療法之表現EphA2之癌症之實例包括實體腫瘤、半實體腫瘤及液體腫瘤。順應於療法之表現EphA2之癌症之實例包括但未必侷限於EphA2陽性乳癌、腦癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、胰臟癌、食道癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)及胃癌，且可包括結腸癌、外陰癌、皮膚癌(例如黑色素瘤)、腎癌及神經膠質瘤(例如多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤)、白血病及淋巴瘤。
應注意，儘管與非癌細胞相比，EphA2可能以較高水準表現於癌細胞上，但此不限制本文中所揭示之療法。
可能順應於藉由本文中所揭示之方法進行之療法的表現EphA2之癌瘤包括但不限於食道癌、肝細胞癌、基底細胞癌(皮膚癌之一種形式)、鱗狀細胞癌(不同的組織)、膀胱癌(包括移行細胞癌，一種惡性膀胱贅瘤)、支氣管癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌(包括小細胞肺癌及非小細胞肺癌)、腎上腺皮質癌、甲狀腺癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、腎細胞癌、原位導管癌或膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、威爾姆氏腫瘤(Wilm's tumor)、子宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、骨原性癌、上皮癌及鼻咽癌。
可能順應於藉由本文中所揭示之方法進行之 療法的表現EphA2之肉瘤包括但不限於纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、骨原性肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤及其他軟組織肉瘤。
可能順應於藉由本文中所揭示之方法進行之療法的其他表現EphA2之實體腫瘤包括但不限於神經膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡枝神經膠質瘤、腦脊髓膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤。
可能順應於藉由本文中所揭示之方法進行之療法的表現EphA2之白血病包括但不限於a)慢性骨髓增生性症候群(多潛能造血幹細胞之贅生性病症)；b)急性骨髓性白血病(多潛能造血幹細胞或具有有限譜系潛能之造血細胞之贅生性轉型)；c)慢性淋巴細胞性白血病(CLL；免疫不成熟且功能不勝任之小淋巴細胞之純系增殖)，包括B細胞CLL、T細胞CLL、幼淋細胞白血病及毛細胞白血病；以及d)急性淋巴母細胞性白血病(以淋巴母細胞積聚為特徵)。可使用方法治療之淋巴瘤包括但不限於B細胞淋巴瘤(例如伯特基氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma))；霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)；非霍奇金氏淋巴瘤；及其類似物。
可能順應於根據本文中所揭示之方法進行之 治療的其他癌症包括非典型腦膜瘤(腦)、胰島癌(胰臟)、髓樣癌(甲狀腺)、間充質瘤(腸)、肝細胞癌(肝臟)、肝母細胞瘤(肝臟)、明細胞癌(腎臟)及縱隔神經纖維瘤。
可能順應於使用本文中所揭示之方法進行之治療的癌症的其他實例包括但不限於上皮及神經外胚層起源之表現EphA2之癌症。上皮起源之表現EphA2之癌症之實例包括但不限於小細胞肺癌、乳癌、眼晶狀體癌、結腸癌、胰臟癌、腎臟癌、肝臟癌、卵巢癌及支氣管上皮癌。本發明之方法可用於治療已知過度表現EphA2之癌細胞。
神經外胚層起源之表現EphA2之癌症之實例包括但不限於尤因氏肉瘤、脊髓腫瘤、腦腫瘤、嬰兒期幕上原始神經外胚層腫瘤、小管囊腫性癌瘤、黏液性管狀及梭狀細胞癌、腎腫瘤、縱隔腫瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤以及青壯年及青少年肉瘤。
與其他癌症療法之組合
如以上所指出，該等方法之另一特徵在於抗體可與一或多種其他療法組合投與個體。此種療法可組合於組成物中或與標的抗體結合。除與本文中所揭示之抗體進行物理組合(例如，呈結合物形式或者呈脂質體或其他脂質奈米粒子形式)以外，可在投與本文中所揭示之抗體的同時或者之前或之後連同投與一或多種抗癌劑，諸如以上表4中所列出之彼等抗癌劑。
除投與抗體組成物以外之療法或治療可在自投與標的抗體同時至之前或之後多達5小時以上，例如10小時、15小時、20小時以上的任一處投與。相繼投與或施加標的抗體及其他治療干預，例如，其中在另一治療性治療之前或之後投與標的抗體。同時投與標的抗體及其他療法，例如，其中同時投與標的抗體及第二療法，例如，當第二療法為藥物時，其可隨標的抗體一起作為兩種單獨調配物或組合至投與個體之單一組成物中投與。不論是相繼或是同時投與，如以上所說明，出於本發明之目的，該等治療均被視為共同或組合投與。
可能或可能未連同標的抗體一起投與之其他標準抗癌治療劑包括但不限於免疫療法、化學治療劑及手術(例如，如以下進一步描述之彼等)。另外，標的抗體之治療性投與亦可為用抗癌療法對個體進行治療後治療，其中該抗癌療法可為例如手術、輻射療法、投與化學治療劑及其類似物。亦可使用除本文中所揭示之彼等抗體以外的抗體，尤其可提供靶細胞之補體介導之殺死及/或抗體依賴性細胞毒性介導之殺死的單株抗體。
舉例而言，標的抗體可與一或多種化學治療劑(例如環磷醯胺、阿黴素(doxorubicin)、長春新鹼與強體松(CHOP))組合及/或與輻射治療組合及/或與手術干預(例如在移除腫瘤之手術前後)、放射療法、骨髓移植、生物反應調節劑治療及上述之某些組合組合投與。輻射療法包括但不限於自諸如射束之外部施加來源或由植入小輻射源 遞送之X射線或γ射線。
投與途徑
在實踐該等方法時，投與途徑(使標的抗體進入個體之途徑)可變化，其中以下更詳細描述標的抗體之代表性投與途徑。單獨或處於以上所描述之組合中的標的抗體可全身(例如藉由非經腸、靜脈內、肌肉內、鞘內、心室內或皮下投與)或局部(例如在局部腫瘤部位，例如藉由腫瘤內投與(例如至實體腫瘤中、至淋巴瘤或白血病中所涉及之淋巴結中，或藉由對流增強型遞送，例如至腦中，例如，如US 20090209937中所揭示)、投與至實體腫瘤供應血管中等)投與至體腔或內腔中或至器官中。此等不同的投與途徑可藉由注射或輸注來進行。
適用於非經腸投與之調配物包括水性及非水性等張無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑細菌劑及致使調配物與預定受體之血液等張之溶質；以及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑。調配物可存在於單位劑量或多劑量密封容器中，諸如安瓿及小瓶，且可儲存在冷凍乾燥(凍乾)條件下，從而僅需要在臨使用前添加無菌液體賦形劑，例如注射用水。注射溶液及懸浮液可由先前所描述之種類的無菌粉末、顆粒劑及錠劑製備。製備非經腸可投與組成物之方法對於熟習此項技術者將為已知或顯而易知的。
可在所要時段內重複投與療法，例如在約1天至約5天之時段內重複或在約1個月、約2個月等內每若干天(例如約五天)重複一次。其亦可在其他治療性干預(諸如旨在移除癌細胞之手術干預)之前、同時或之後投與。抗體亦可作為組合療法之一部分投與，其中將免疫療法、癌症化學療法或輻射療法中之至少一種投與個體(如以上更詳細描述)。
偵測方法
本發明提供一種在個體內之生物樣品中或自個體分離之樣品中偵測例如表現EphA2之細胞上之EphA2的方法。該等方法適用於診斷目的及預後目的兩者。標的方法一般包括使含有細胞之樣品與本發明之抗體或抗體結合物接觸；及偵測該抗體或抗體結合物與該樣品中之細胞的結合。該細胞可能在活體外，其中該細胞在獲自疑似具有癌細胞之個體、進行癌症治療之個體或正測試對治療之敏感性的個體的生物樣品中。該細胞可能在活體內，例如，該細胞在疑似具有癌細胞之個體、進行治療之個體或正測試對治療之敏感性的個體中。
本文中所描述之偵測分析可用於確定個體是否患有或多或少順應於使用基於抗體之療法的療法的癌症，以及在個體中監測治療之進展。其亦可用於評定其他組合療法之過程。因而，診斷分析可告知臨床醫師對療法及治療方案之選擇。
抗體可用於經由免疫診斷技術在具有或疑似具有表現EphA2之癌細胞之個體的生物樣品中偵測表現EphA2之細胞。此類診斷可能適用於鑑別順應於稍後於下文揭示之療法的患者及/或監測對療法之反應。
適合之免疫診斷技術包括但未必限於活體外及活體內(成像)方法。舉例而言，可對抗EphA2抗體進行可偵測標記，投與疑似患有以EphA2之細胞表面表現為特徵之癌症的個體，且使用此項技術中可利用之成像方法偵測已結合之經可偵測標記之抗體。
如本文中所使用之片語「活體內成像」係指在整個活哺乳動物中偵測抗體(例如經可偵測標記之2D6)之存在的方法。可藉由活體內成像來偵測光學上可偵測之蛋白質，諸如螢光抗體及螢光素酶結合之抗體。活體內成像可用於提供哺乳動物之2-D以及3-D影像。舉例而言，可將經放射性標記之抗體投與個體且用γ攝影機對個體進行成像。電荷耦合裝置攝影機、CMOS或3D斷層攝影機可用於進行活體內成像。使用電腦化斷層攝影術、磁共振成像、超音波掃描術、質子發射斷層攝影術、單光子發射電腦化斷層攝影術(SPECT)及其類似技術進行活體內成像之方法在此項技術中為熟知的。得自如以上所描述之許多活體內成像方法之資訊可提供關於個體中之癌細胞之資訊。
在方法為活體外方法時，生物樣品可為可能存在癌細胞之任何樣品，包括但不限於血液樣品(包括全 血、血清等)、組織、整細胞(例如完整細胞)及組織或細胞提取物。舉例而言，該分析可包括偵測活細胞或組織學組織樣品中之細胞上的EphA2。特定言之，偵測可評定活細胞之細胞外表面。舉例而言，可固定(例如藉由甲醛處理)組織樣品，且可提供嵌埋於載體中(例如於石蠟中)或經冷凍之未固定組織。
分析可呈現多種形式，諸如競爭、直接反應或夾層型分析。實例包括西方墨點法；凝集測試；酶標記及介導之免疫分析，諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)；生物素/親和素型分析；放射免疫分析；免疫電泳；免疫沈澱；及其類似分析法。該等反應一般包括與抗體結合之可偵測標記。標記包括螢光標記、化學發光標記、放射性標記、酶標記及/或染料分子，或用於偵測樣品中之抗原與跟其反應之抗體之間的複合物形成的其他方法。在使用固體載體時，固體載體通常首先在適合之結合條件下與固相組分反應，使得抗體充分固定至載體。可使用諸如蛋白質(例如血清白蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA))、鑰孔蟲戚血藍素、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白)、聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物及其類似物之偶合劑，以有助於固定至固體載體。
分析可在溶液中進行，以使得抗體與抗原在沈澱條件下形成複合物。可使抗體塗佈之粒子在適合之結合條件下與疑似含有靶抗原之生物樣品接觸，以形成粒子-抗體-抗原複合物聚集物，可使其沈澱且使用洗滌及/或離 心將其與樣品分離。可使用許多標準方法中之任一種，諸如以上所描述之彼等免疫診斷方法來分析反應混合物，以確定存在或不存在抗體-抗原複合物。
本發明之分析法可包括偵測活細胞對本發明抗體及/或抗體結合物之細胞吸收之分析法，例如，作為偵測表現EphA2之癌細胞的方法。在某些實施例中，其中本發明之抗體及/或抗體結合物由表現EphA2之細胞內在化，可使疑似含有表現EphA2之細胞的樣品與此種抗體接觸且培育足以允許抗體及/或抗體結合物內在化之時間。繼而洗滌。可經由細胞所含有之其標記來偵測內在化抗體(例如FACS、光譜儀、放射性同位素計數器等)。亦可如US 7,045,283中所描述來選擇內在化抗體。
以上所描述之分析試劑(包括本發明之抗體)可與適合之說明書及其他必需試劑一起提供於套組中，以便如以上所描述來進行免疫分析。視所使用之特定免疫分析而定，套組亦可含有適合之標記以及其他包裝試劑及材料(亦即，洗滌緩衝液及其類似物)。可使用此等套組來進行標準免疫分析，諸如以上所描述之彼等免疫分析。
提供以下實例作為說明而非限制。
實例 實例1-D2-1A7熱穩定性及蛋白A結合
分析D2-1A7 scFv之熱穩定性及與蛋白A樹脂之結合。
藉由差示掃描螢光(DSF)來進行熱穩定性測定，如下執行：將25μl含10μM scFv及1X Sypro® Orange(Sigma)之1X PBS以1℃/min之速率自20℃加熱至90℃，且收集所產生之螢光資料。使用IQ5即時偵測系統(Bio-Rad®)進行加熱及螢光資料產生。使用GraphPad® Prism軟體分析資料。所報導之Tm為一階導數之最大值處的溫度。
如下測定多個樣品之蛋白A結合：藉由在4000g下離心15分鐘以移除細胞而自培養物中獲得由哺乳動物細胞表現之scFv。使用Fortebio來測定上清液中之scFv效價。使用96孔蛋白A盤(蛋白A 96孔蛋白質純化盤(GE Healthcare：Life Sciences，Protein A HP MultiTrap®)來分析蛋白A結合，該盤含有處於具有多孔底之孔中的蛋白A結合之樹脂，從而允許經由離心或吸力自下方收集孔中之液體。用1X PBS洗滌該盤之各孔，並且將含有250μg蛋白質之上清液負載至各孔中。接著使用真空歧管(Whatman®)在10毫巴壓力下分離上清液與蛋白A樹脂，並且將來自各孔之流經液分別收集至標準96孔盤之空孔中。接著用600μL 1X PBS(pH 7.6)洗滌蛋白A盤之諸孔。為了溶離樹脂結合之Ab，將200μL 0.1M乙酸添加至各孔且在室溫下培育3至10分鐘。將該盤置放在第二盤上以俘獲溶離液且在100x g下離心2分鐘，並且添加20μL 1M Tris pH 8.0以中和溶離液中之Ab。為了測定蛋白A結合百分比，將流經液中剩餘scFv之濃 度與最初負載之蛋白質的量(250ug)相比較。
結論：65℃之量測Tm之低對於有效工業生產脂質體結合而言不可接受，且低於10%之量測蛋白A結合之低對於工業生產而言不可接受。
實例2-構架工程改造以改良Tm
作為增加穩定性特徵(包括Tm)之初步方法，將D2-1A7之CDR接枝至不同的Ig構架。D2-1A7之重鏈可變區之構架為IGHV3-30。VH3一般非常穩定且典型地具有結合蛋白A之能力，並且為治療性Ab之常用構架。因此，決定將重鏈保留在VH3家族內，但將D2-1A7之重鏈接枝至IGHV3-23骨幹上，其為最常見同型。另外，在IGHV3-23構架內製造兩個穩定突變：E6Q及S49A。
D2-1A7之輕鏈可變區之構架為IGVλ3-19，其不常見於天然人類Ab譜系中，故決定將D2-1A7輕鏈CDR接枝至更常見構架IGVλ1-40，亦發現其往往與IGVH3-23配對。設計兩個熱穩定變異體，TS1及TS2。基於同源性建模，認為位置1及位置22與抗原相互作用，且因此使兩個變異體回復突變以具有D2-1A7中之此等位置上所存在的殘基(Q1S、S22T)。在TS1中，保留據信對穩定性非常重要之疏水性袋狀結構(G13V、L78A)，同時調節表面上之電荷(V3E、R18T)。將胺基酸序列與天然序列譜系相比，且引入一致胺基酸，包括L39K(TS1)F65S(兩者)、K66G(TS2)或K66S(TS1)及A74T(TS1)。
結論：TS1在熱穩定性方面展現顯著改良，其中Tm增加六度。此舉適用於或用於額外工程改造以改良蛋白A結合。
實例3-妨礙蛋白A結合之區域的鑑定
在scFv之熱穩定性改良至71度之情況下，接下來將蛋白A親和力工程改造至Ab中以有助於製造。文獻中廣泛報導VH3構架能夠結合蛋白A。將TS1工程改造於VH3-23構架上，但出乎意料地，其不能良好結合蛋白A。在重鏈可變區內，FR1、CDR2及FR3內之殘基已顯示涉及蛋白A結合。TS1之結構分析顯示在已證明對結合重要之位置上的胺基酸不脫離生殖系：H15、H17、H19、H57、H59、H64、H65、H66、H68、H70、H81、H82a、H82b。在得到生殖系序列的情況下，仍不清楚哪些胺基酸對蛋白A與Ab之間的相互作用造成消極影響， 故開發蛋白A結合分析。
設計並製備包含D2-1A7、TS1、TS1*及F5之異源配對重鏈及輕鏈的一組變異scFv。為了直接測試CDR-H2序列之效應，亦製造將TS1之CDR-H2替換為F5(TS1*)之CDR-H2的scFv。將該等變異體瞬時表現於哺乳動物細胞中，使用生物膜層干涉術(fortéBIO®)對所表現之scFv效價進行定量。如實例1中所描述在96孔盤中進行蛋白A結合分析。使用生物膜層干涉術來測定流經液中之剩餘scFv量，且計算與蛋白A樹脂結合之scFv百分比，並且對結果進行繪圖(圖1)。
結論：F5展現75%蛋白A結合。TS1展現29%蛋白A結合，遠低於工業製造視為可接受之50%界限。將F5 CDR-H2接枝至TS1上(產生scFv TS1*)，在廢除EphA2結合的同時顯示蛋白A結合顯著改良(65%)，從而表明TS1之CDR-H2對蛋白A結合賦予消極影響。
實例4-CDR-H2設計及使用酵母呈現之scFv選擇
如Xu等人，(2013)mAb,5：2,237-254中所描述來製備TS1CDRH2之一組變異體以用於酵母呈現，以便篩選保留EphA2結合且展現改良之蛋白A結合的純系。設計該組以包括超過50,000個獨特的CDRH2序列。該組中之各scFv具有併入在其C末端之FLAGTM抗原決定基標籤(DYKDDDDK-SEQ ID NO：49)。該組在疑似對蛋白A結合重要之CDR-H2位置上以及在疑似有助於EphA2 結合之CDR-H2位置上併入多樣性。接著將該設計與自NCBI下載之人類Ab譜系資料庫以及對非免疫患者譜系之NGS定序相比較，並且加以調節，以保留高度保守殘基。最終，鑑別出CDRH2殘基VH49、VH50、VH52A、VH53、VH55及VH57以用於誘變。再次由人類譜系指導，對大部分位置僅選擇胺基酸子集(參見表4)。由此產生並測試經設計以包括53,460個獨特序列之一組scFv。
在Becton Dickenson®(BD)Aria®系統上使用酵母之FACS淘選來對個別地表現於酵母細胞表面上以分 離具有合意性質者之該組scFv進行快速選擇。將誘導之酵母細胞與200nM具有His6標籤之EphA2及10μg/mL經螢光標記之蛋白A一起培育。用FACS緩衝液(1x PBS、0.5% BSA，pH 7.4)將細胞洗滌兩次以移除未結合之抗原。接著將抗原結合之細胞及蛋白A結合之細胞與2μg/mL經Alexa647標記之M2抗FLAGTM Ab及2μg/mL經Alexa 488標記之抗His6 Ab一起培育30分鐘。2次洗滌之後，將細胞再懸浮於FACS緩衝液中且使用BD FACSCalibur®機器來量測螢光信號。使用FlowJo®軟體來確定中值螢光強度(MFI)。將EphA2 MFI(抗His6-Alexa 488)相對於表現MFI(抗Flag-Alexa 647)進行正規化。對於第一輪選擇，對EphA2結合及蛋白A結合進行選擇(圖2，圖B)，由此產生小百分比群體。為了確保已鑑別出與重組EphA2結合之群體，針對EphA2結合對經分離之純系進行再選擇(圖2，圖D)。
結論：獲得展現所要特徵之純系。
實例5-對scFv之熱穩定性、EphA2結合/內在化及蛋白A結合的表徵
對當呈現於酵母上時對蛋白A結合及EphA2結合呈陽性之scFv進行定序，且在Expi293FTM細胞(Invitrogen®)中瞬時表現為可溶性蛋白質。接著如實例1中所描述來量測其蛋白A結合。對如實例4中所描述而獲得之22個獨特變異體進行測試，且其展現介於20%至 80%範圍內之蛋白A結合(圖3)。此22個scFv(scFv1至scFv22)之胺基酸及編碼核酸序列提供於圖5中。
在所測試之22個scFv中，15個導致至少50%蛋白質與蛋白A結合，且因此選擇此等用於進一步表徵。使用DSF量測所有變異體之Tm。除了四個scFv外，所有scFv均具有合意Tm，比65℃高出2℃以上(亦即，至少67℃)。十一個具有70℃之更有利Tm。
結合及內在化分析：
為了測試此等變異scFv之抗EphA2活性，在表現EphA2之細胞株上分析外部裝飾有此等Ab之脂質體的結合及內在化。使用快速高通量螯合配位體誘導之內在化分析(CLIA)(Nielsen等人，BMC immunology,2006, 7：24)來篩選抗EphA2-scFv靶向脂質體以進行結合及內在化評定。測試表現高水準EphA2受體之兩個細胞株OVCAR-3及U-251以及表現鼠類EphA2之小鼠細胞株CT-26(以測試該等經工程改造之scFv是否保留與鼠類EphA2之交叉反應性)。經由各scFv之c末端His6標籤之鎳結合，使scFv與包含NTA(Ni)結合之脂質的經螢光標記之脂質體(DiI5-NTA脂質體)結合。
測試脂質體之製備及內在化分析
如下製備DiI5-NTA脂質體。如Huang等人，Bioconjugate chemistry,2006，第17卷，第1592-1600頁中所描述來合成NTA結合之脂質DOD-Tri-NTA。將氫化大豆磷脂醯膽鹼(HSPC)、膽固醇、甲氧基-PEG(2000)-二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(PEG-DSPE)、DOD-tri-NTA及螢光脂質染料Dil5(ThermoFisher® Invitrogen® Molecular ProbesTM，目錄號D12370)分別以100：66.7：5：0.5：0.3之莫耳比組合在三氯甲烷溶液中，且在真空下將溶液蒸發至乾燥，從而形成脂質膜。在68℃下，在HEPES緩衝生理鹽水(「HBS-6.5」-5mM HEPES、144mM NaCl pH 6.5)中對該膜進行水合，對所得脂質懸浮液進行若干冷凍(乾冰-丙酮)與解凍(68C)循環，且使用LipexTM熱桶擠出機(Northern Lipids，Canada)，經由具有200nm(6次)及100nm(10次)孔徑之兩個堆疊聚碳酸酯膜(Whatman Nuclepore，USA)擠出。此方案典型地產生具有100-110 nm之z平均尺寸及小於0.1之多分散指數的單層囊泡。將擠出之脂質體冷卻至室溫，在Sephadex® G-75(GE Healthcare)管柱上藉由凝膠層析加以純化，用HBS-6.5溶離，接著藉由通過0.2-μm過濾器進行滅菌。接著在酸消化之後使用磷鉬酸鹽分光光度法來測定脂質體磷脂之濃度。在與細胞一起培育之前，在漢克氏平衡鹽溶液(Hank's Balanced Salt Solution，HBSS)中將脂質體稀釋至0.4mM磷脂，且添加NiSO4至0.1mM。將六組胺酸scFv稀釋至細胞培養基(參見下文)中，達至25μg/mL scFv之濃度，並且與相等體積之脂質體溶液混合(「螢光NTA-脂質體/scFv混合物」)。
藉由在培育/用可破壞His6/Ni複合物且從而釋放並移除外部(而非內在化)組胺酸標籤化scFv之咪唑進行洗滌之前及之後量測細胞之螢光，對內在化Ab之百分比進行定量。使測試細胞(人類癌細胞株OVCAR-3及U-251以及鼠類癌細胞株CT-26)以附著狀態在補充有10% FBS、1x青黴素/鏈黴素及L-麩醯胺酸之RPMI-640細胞培養基中生長至90%匯合，且使用0.25%胰蛋白酶-EDTA加以收集。將細胞懸浮液以100,000個細胞/孔分配至96孔「V」形底聚丙烯細胞培養盤中，用1X PBS洗滌細胞，接著再懸浮於100μL螢光NTA-脂質體/scFv混合物中。用盤密封膠帶覆蓋該盤，避光，且在振盪器上在5% CO2氛圍中在37℃下培育4小時。藉由離心使細胞球粒化，吸出上清液，且藉由再懸浮於200μL/孔PBS中將細 胞洗滌兩次以移除任何未結合之細胞外脂質體，或用200μL/孔含有0.25M咪唑(pH 7.5)之PBS將細胞洗滌兩次以移除未結合之細胞外脂質體及表面結合之脂質體而非內在化脂質體。藉由FACS(Cy5螢光通道)評估細胞締合之脂質體之相對量。「結合」量包括細胞表面結合脂質體及內在化脂質體，且與未進行咪唑洗滌時之細胞螢光成比例。其在圖4中顯示為相對於裝飾有scFv TS1之匹配脂質體的脂質體結合的百分比。內在化資料顯示內在化脂質體之量為總細胞締合脂質體之百分比。大多數純系保留與TS1類似之人類及鼠類EphA2結合及內在化(圖4)。僅有一個測試純系scFv-12(及F5陰性對照)不結合EphA2。
結論：所測試之22個新純系中有21個(除scFv-12外全部)鑑別為具有可接受之結合及內在化性質。22個中有18個(scFv 1-4、6-13、15-16及18-21)展現合意熱穩定性，Tm 67℃，而此等中有十個(scFv 1-3、8-11、13、15及18)亦滿足工業上更有利之熱穩定性準則，各自展現70℃之Tm。
實例6-測試抗EphA2 scFv之結合穩定性
對所選scFv在其C末端進行重組修飾以移除His6標籤並添加適於脂質體附接之C末端肽Gly Gly Ser Gly Gly Cys(SEQ ID NO：54)。藉由對應於其所來源之scFv名稱繼之以字母C的名稱來標識此等經修飾之scFv。接下來測試Ab與PEG-DSPE(脂質聚合物)之結合 (使用US 6,210,707中所描述之方法)，其中所得脂質聚合物結合之scFv保留結合抗原之能力(量測為抗原結合親和力)以及脂質聚合物結合物有效地插入(經由脂質聚合物之DSPE部分)脂質體外膜中(PEG繫拴之scFv暴露在外)而不損失結合性質之能力(量測為脂質體經由多個已結合scFv與抗原結合之總親和力且以下稱為親合力)。
scFv與脂質聚合物連接子之結合：在30℃下將經純化之scFv溶液用調節至pH 6.0-6.2之15mM L-半胱胺酸、5mM EDTA處理1小時，以還原/活化各scFv之羧基末端半胱胺酸殘基之硫醇基。藉由在Sephadex®管柱上進行凝膠層析來移除過量半胱胺酸，用結合緩衝液(5mM檸檬酸鹽、1mM EDTA、140mM NaCl，pH 6.0)溶離。接下來，如下使Ab與脂質聚合物連接子馬來醯亞胺基-PEG(2000)-DSPE(mal-PEG-DSPE，Avanti Polar Lipids，目錄號880126)結合。將呈水性膠束儲備溶液形式之Mal-PEG-DSPE(Avanti)添加至經處理之scFv，以達成4：1之脂質/蛋白質莫耳比。在室溫下隨攪拌將混合物培育2至4小時，且藉由用半胱胺酸(最終濃度0.5mM)將未反應之馬來醯亞胺淬滅五分鐘來終止反應。在Ultrogel AcA34重力管柱上對已淬滅之反應混合物進行層析且用S10C-6.5(100g/L低內毒素蔗糖、10mM檸檬酸USP，用NaOH調節至pH 6.5)溶離，在280nm下讀取溶離液蛋白質濃度。收集含有經純化之scFv-PEG-DSPE結合物的第一(空隙體積)蛋白質峰。藉由SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)來評定scFv-PEG-DSPE結合物之純度。
製備測試脂質體且將scFv脂質聚合物結合物插入脂質體膜中：在70℃下將卵鞘磷脂(ESM，NOF，Japan，NM-10)、膽固醇(Avant Polar Lipids，編號770100)、甲氧基-PEG(2000)-二硬脂醯基甘油(PEG-DSG，NOF，Japan，Sunbright GS-020)及DiI5(參見實例5)分別以莫耳比100：66.7：8：0.3溶解於無水乙醇中且在70℃下隨攪拌稀釋至10倍體積之CS-250緩衝液(250mM NaCl水溶液、5mM檸檬酸鹽，pH 5.5)中達至100mM磷脂之最終濃度。如以上實例5中所描述在70℃下將脂質懸浮液經由200nm及100nm聚碳酸酯膜式過濾器擠出，並且將擠出之材料冷卻降至室溫，藉由切向流滲濾、使用MiniKros®中空纖維濾筒(Spectrum Laboratories，MWCO 500kD)、經由CS-250緩衝液之10倍體積交換來純化脂質體且通過0.2-μm滅菌過濾器。此方案典型地產生具有100-110nm之z平均尺寸及小於0.1之多分散指數的單層囊泡(「Dil5 SM脂質體」)。在scFv-PEG-DSPE結合物之膜插入之前，在Sephadex® G-25管柱(PD-10，GE Healthcare)上使用粒徑排阻層析(SEC)將脂質體交換至葡萄糖-檸檬酸鹽緩衝液(17%葡萄糖水溶液、20mM檸檬酸鹽，pH 5.7)中。
接著將scFv-PEG-DSPE結合物與Dil5-SM脂質體混合在葡萄糖-檸檬酸鹽緩衝液中以達成10-12g/mol之蛋白質/磷脂比。將混合物快速加熱至60℃且在攪拌之 情況下在此溫度下維持30分鐘。接著在冰上冷卻混合物且在SepharoseTM CL-4B管柱(GE Healthcare)上藉由凝膠層析法分離具有膜插入scFv-PEG-DSPE結合物之脂質體與任何剩餘未插入結合物，用檸檬酸鹽生理鹽水緩衝液溶離。在管柱之空隙體積中收集scFv連接之脂質體，並且使用fortéBIO®分析活體外抗原結合親合力且使用流式細胞術分析細胞吸收，各自如以下所描述。證實脂質體上存在scFv且藉由SDS-PAGE加以定量。
經由fortéBIO®進行之EphA2結合分析
將附加有c末端His6之編碼人類EphA2之核酸選殖至表現載體pCEP4(Invitrogen®，編號V044-50)中，並且在聚乙烯亞胺轉染後瞬時表現於FreeStyleTM 293細胞(Invitrogen®，編號K900001)中。使用Ni-NTA SepharoseTM樹脂(Quiagen®，USA)自細胞培養基中純化出His6標籤化重組人類EphA2蛋白。用his標籤化重組人類EphA2以10μg/ml蛋白質之濃度塗佈fortéBIO® Octet Red 96系統之抗His感測器(fortéBIO®-Pall®，編號18-5116)，歷經300秒，並且在PBS中進行背景運作，歷經60秒。對於scFv-PEG-DSPE結合物，接著將感測器與2.5μg/ml(研究1)或4.0μg/ml(研究2)結合物一起在PBS pH 7.4中培育，且確定培育3秒至13秒之間的締合曲線之斜率，針對僅緩衝液之背景進行修正，並且在變異體間進行比較。將ScFv連接之脂質體與感測器一起在PBS中在 0.025mM脂質體磷脂下培育，確定培育3秒至20秒之間的締合曲線之斜率，針對僅緩衝液之背景進行修正，並且在變異體間進行比較。
結果示於以下表6中，其中第A行提供scFv標識符；第B行指示scFv/脂質聚合物連接子結合物之產率百分比；第C行提供scFv-結合物(未與脂質體結合)EphA2結合速率百分比；第D行提供scFv結合之脂質體EphA2結合速率百分比；且第E行(研究1)及第F行(研究2)提供熱應力後scFv結合物(未與脂質體結合)中剩餘之抗原結合速率百分比。
結論：所有測試純系均結合良好，但scFv 4C、7C、11C、16C及19C在結合熱應力之後展現小於 10%抗原結合。
實例7-對所選變異體之可製造性的分析
與實例6之實驗並行，測試九個純系(及親本純系TS1，作為對照)以確定對工業製造之適合性。設計篩選策略以消除具有低表現、低蛋白A結合能力或高聚集物含量之分子。在FreeStyleTM 293細胞(Invitrogen®，編號K900001)中以1L規模瞬時表現scFv，進行蛋白A純化，且中和至pH 6.0。結果彙總於表7中。
使用生物膜層干涉術(fortéBIO®)來計算所有Ab效價。使用SEC如下量測聚集物之百分比。使用50mM磷酸鈉(+0.4M過氯酸鈉)pH 7.0作為運作緩衝液將50μg樣品注射於TSKgel® SuperSW3000管柱(Tosoh® Bioscience)上。使用配備有自動取樣器、二元泵及二極體陣列偵測器之Agilent® 1100 HPLC進行所有量測。使用ChemstationTM(Agilent®)軟體來分析資料。
如實例1中所描述來量測蛋白A結合能力之改良倍數(與TS1C相比)。
所評估之第一準則為scFv之表現水準。典型地在經穩定轉染之細胞株中(例如在中國倉鼠卵巢「CHO」細胞中)製造抗體。然而，經由瞬時表現獲得之效價預示在經穩定轉染之細胞中的表現特性。如以上表7中所示，許多新Ab具有更佳效價(與TS1C相比改良約2倍以上)。對於一些變異體，中和損失稍高，但與TS1C相比，所有最終純化產率均相當或更佳。最後，對於成功下游方法開發而言，需要具有低聚集物含量。所有變異體之中和後聚集物含量均相當而且可接受。除scFv-2C及scFv-4C外，此等新Ab具有更加改良之表現、聚集及蛋白A結合能力。全部經進一步表徵在結合過程期間的穩定性。
結論：就所測試之參數而言，所有測試純系(純系2、3、4、7、8、9、10、11及13)均展現可接受之商業開發性質。
等效方案
熟習此項技術者僅使用常規實驗便將認識到或能夠確定並實施本文中所描述之特定實施例的許多等效 方案。意欲上述揭示內容及以下申請專利範圍涵蓋此類等效方案。預期特定實施例(及所附申請專利範圍)中所揭示之實施例的任何組合均在本發明之範疇內。
以引用之方式併入
本文中所提及之美國及外國專利及申請中專利申請案及公開案中之每一者的揭示內容均明確以全文引用之方式併入本文中。
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<223> 合成多肽。
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<221> 雜項特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可為除Glu以外之任何胺基酸。
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<223> 合成多肽。
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<221> 雜項特徵
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<223> Xaa可為除Ser以外之任何胺基酸。
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<222> (1)..(1)
<223> Xaa可為除Gln以外之任何胺基酸。
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<221> 雜項特徵
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可為除Val以外之任何胺基酸。
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<221> 雜項特徵
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可為除Gly以外之任何胺基酸。
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<221> 雜項特徵
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<223> Xaa可為除以Arg外的任何胺基酸。
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<221> 雜項特徵
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<223> Xaa可為除Ser以外之任何胺基酸。
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<223> Xaa可為除Gln以外之任何胺基酸。
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<223> Xaa可為除Ser以外之任何胺基酸。
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<223> Xaa可為除Lys以外之任何胺基酸。
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<223> Xaa可為除Ala以外之任何胺基酸。
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<223> Xaa可為除Leu以外之任何胺基酸。
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<223> Xaa可為除Phe以外之任何胺基酸。
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<223> Xaa可為Ala或Val。
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<223> Xaa可為Ala、Asp、His、Asn、Pro、Ser或Thr。
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<221> 雜項特徵
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<223> Xaa可為Ala、Arg、His或Pro。
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<221> 雜項特徵
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 165
<210> 166
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 166
<210> 167
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 167
<210> 168
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 168
<210> 169
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 169
<210> 170
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 170
<210> 171
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 171
<210> 172
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 172
<210> 173
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 173
<210> 174
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 174
<210> 175
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 175
<210> 176
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 176
<210> 177
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 177
<210> 178
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 178
<210> 179
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 179
<210> 180
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 180
<210> 181
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 181
<210> 182
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 182
<210> 183
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 183
<210> 184
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 184
<210> 185
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 185
<210> 186
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 186
<210> 187
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 187
<210> 188
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 188
<210> 189
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 189
<210> 190
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 190
<210> 191
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 191
<210> 192
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 192
<210> 193
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 193
<210> 194
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 194
<210> 195
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 195
<210> 196
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 196
<210> 197
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 197
<210> 198
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> Xaa為S、T或A。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為A或V。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (5)..(5)
<223> Xaa為P、R、N或H。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為任何胺基酸，且在一些實施例中Xaa為A、D、H、N、 P、S或T。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為任何胺基酸且在一些實施例中Xaa為A、R、H、N 或P。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (10)..(10)
<223> Xaa為K或T。
<400> 198
<210> 199
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> Xaa為S或T。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (5)..(5)
<223> Xaa為P、R或N。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為任何胺基酸，且在一些實施例中Xaa為A、D、H、N、 P、S或T。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為H、N、R、T、A、D、P或S。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (10)..(10)
<223> Xaa為K或T。
<400> 199
<210> 200
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> Xaa為S或T。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (5)..(5)
<223> Xaa為P、R或N。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為任何胺基酸，且在一些實施例中為A、D、H、N、P、 S或T。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為H、N、R或T。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (10)..(10)
<223> Xaa為T或K。
<400> 200
<210> 201
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> Xaa為S或T。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為V。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (5)..(5)
<223> Xaa為P。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為任何胺基酸，且在一些實施例中為A、D、H、N、P、 S或T。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為H、N、R或T，且在一些實施例中為A、R、H、N或P。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (10)..(10)
<223> Xaa為T或K。
<400> 201
<210> 202
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 202

Claims (66)

  1. 一種抗A型Ephrin受體2(EphA2)抗體，其包含：VH，其包含：VH CDR1，其包含胺基酸序列SYAMH(SEQ ID NO：17)；VH CDR2，其包含以下具有17個胺基酸之胺基酸序列：X17ISPX18GX19NX20YYADSVKG(SEQ ID NO：18)，其中：X17為A或V；X18為A、D、H、N、P、S或T；X19為A、R、H、N或P；且X20為K或T；及VH CDR3，其包含胺基酸序列ASVGATGPFDI(SEQ ID NO：19)；以及VL，其包含：VL CDR1，其包含胺基酸序列QGDSLRSYYAS(SEQ ID NO：20)；VL CDR2，其包含胺基酸序列GENNRPS(SEQ ID NO：21)；及VL CDR3，其包含胺基酸序列NSRDSSGTHLTV(SEQ ID NO：22)； 其中該抗體免疫特異性結合EphA2之細胞外域。
  2. 一種可結合蛋白A之多肽，其中該多肽包含以下胺基酸序列：a)Xa X17IS Xb X18GX19N X20(SEQ ID NO：198)，其中Xa為S、T或A；X17為A或V；Xb為P、R、N或H；X18及X19為任何胺基酸；且X20為K或T；b)Xa V I S Xb X18 G X19 N X20(SEQ ID NO：199)，其中Xa為S或T；Xb為P、R或N；X18為任何胺基酸；X19為H、N、R、T、A、D、P或S；且X20為K或T；c)Xa V I S Xb X18 G X19 N X20(SEQ ID NO：200)，其中Xa為S或T；Xb為P、R或N；X18為任何胺基酸；X19為H、N、R或T；且X20為T或K； 或d)Xa X17 I S Xb X18 G X19 N X20(SEQ ID NO：201)，其中Xa為S或T；X17為V；Xb為P；X18為任何胺基酸；X19為H、N、R或T；且X20為T或K。
  3. 如申請專利範圍第2項之多肽，其中該多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：177-197之一。
  4. 如申請專利範圍第2項或第3項之多肽，其中該多肽包含：VH CDR1，其包含胺基酸序列SYAMH(SEQ ID NO：17)；蛋白A結合序列，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：177至201之一；及VH CDR3，其包含胺基酸序列ASVGATGPFDI(SEQ ID NO：19)。
  5. 一種抗體，其包含VH及VL，其中該VH包含如申請專利範圍第2項至第4項中任一項之多肽。
  6. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體為人類抗體或人類化抗體。
  7. 如申請專利範圍第5項之抗體，其中該抗體為人 類抗體或人類化抗體。
  8. 如申請專利範圍第1項或第6項之抗體，其中該抗體包含至少一個選自由以下各項組成之群的構架區：(a)人類VH構架區1(VH FR1)，其包含胺基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：1)，其中X1為除E以外之胺基酸；(b)人類VH構架區2(VH FR2)，其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVX2(SEQ ID NO：2)，其中X2為除S以外之胺基酸；(c)人類VL構架區1(VL FR1)，其包含胺基酸序列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(SEQ ID NO：3)，其中：X3為除Q以外之胺基酸，X4為除V以外之胺基酸，X5為除G以外之胺基酸，X6為除R以外之胺基酸，且X7為除S以外之胺基酸；(d)人類VL構架區1(VL FR1)，其包含胺基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQ ID NO：4)，其中：X8為除Q以外之胺基酸，或X9為除S以外之胺基酸；(e)人類VL構架區2(VL FR2)，其包含胺基酸序列WYQQX10PGTAPKLLIY(SEQ ID NO：5)，其中X10為除L以外之胺基酸；及(f)人類VL構架區3(VL FR3)，其包含胺基酸序列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(SEQ ID NO：6)，其中：X11為除F以外之胺基酸，X12為除K以外之胺基酸，X13為除A以外之胺基酸，或X14為 除L以外之胺基酸；及(g)人類VL構架區3(VL FR3)，其包含胺基酸序列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO：7)，其中：X15為除F以外之胺基酸，或X16為除K以外之胺基酸。
  9. 如申請專利範圍第5項或第7項之抗體，其中該抗體包含至少一個選自由以下各項組成之群的構架區：(a)人類VH構架區1(VH FR1)，其包含胺基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：1)，其中X1為除E以外之胺基酸；(b)人類VH構架區2(VH FR2)，其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：202)；(c)人類VL構架區1(VL FR1)，其包含胺基酸序列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(SEQ ID NO：3)，其中：X3為除Q以外之胺基酸，X4為除V以外之胺基酸，X5為除G以外之胺基酸，X6為除R以外之胺基酸，且X7為除S以外之胺基酸；(d)人類VL構架區1(VL FR1)，其包含胺基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQ ID NO：4)，其中：X8為除Q以外之胺基酸，或X9為除S以外之胺基酸；(e)人類VL構架區2(VL FR2)，其包含胺基酸序列WYQQX10PGTAPKLLIY(SEQ ID NO：5)，其中X10為除L以外之胺基酸；及(f)人類VL構架區3(VL FR3)，其包含胺基酸序列 GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(SEQ ID NO：6)，其中：X11為除F以外之胺基酸，X12為除K以外之胺基酸，X13為除A以外之胺基酸，或X14為除L以外之胺基酸；及(g)人類VL構架區3(VL FR3)，其包含胺基酸序列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO：7)，其中：X15為除F以外之胺基酸，或X16為除K以外之胺基酸。
  10. 如申請專利範圍第1項及第5項至第7項中任一項之抗體，其中該抗體包含VH FR1，該VH FR1包含胺基酸序列QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：8)。
  11. 如申請專利範圍第1項及第6項中任一項之抗體，其中該VH FR2包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO：9)或WVRQAPGKGLEWVT(SEQ ID NO：10)。
  12. 如申請專利範圍第1項及第5項至第11項中任一項之抗體，其中該抗體包含VL FR1，該VL FR1包含胺基酸序列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(SEQ ID NO：3)，且其中X3為除Q以外之胺基酸，X4為除V以外之胺基酸，X5為除G以外之胺基酸，X6為除R以外之胺基酸，且X7為除S以外之胺基酸。
  13. 如申請專利範圍第1項及第5項至第11項中任一項之抗體，其中該抗體包含VL FR1，該VL FR1包含 胺基酸序列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(SEQ ID NO：3)，且其中X3為S，X4為E，X5為V，X6為T，且X7為T。
  14. 如申請專利範圍第1項及第5項至第11項中任一項之抗體，其中該抗體包含VL FR1，該VL FR1包含胺基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQ ID NO：4)，且其中X8為除Q以外之胺基酸，且X9為除S以外之胺基酸。
  15. 如申請專利範圍第1項及第5項至第11項中任一項之抗體，其中該抗體包含VL FR1，該VL FR1包含胺基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQ ID NO：4)，且其中X8為S或X9為T。
  16. 如申請專利範圍第1項及第5項至第11項中任一項之抗體，其中該抗體包含VL FR1，該VL FR1包含胺基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQ ID NO：4)，且其中X8為S並且X9為T。
  17. 如申請專利範圍第1項及第5項至第16項中任一項之抗體，其中該抗體包含VL FR2，該VL FR2包含胺基酸序列WYQQX10PGTAPKLLIY(SEQ ID NO：5)，且其中X10為除L以外之胺基酸。
  18. 如申請專利範圍第1項及第5項至第16項中任一項之抗體，其中該抗體包含VL FR2，該VL FR2包含胺基酸序列WYQQX10PGTAPKLLIY(SEQ ID NO：5)，且其中X10為K。
  19. 如申請專利範圍第1項及第5項至第18項中任一項之抗體，其中該抗體包含VL FR3，該VL FR3包含胺基酸序列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(SEQ ID NO：6)，且其中X11為除F以外之胺基酸，X12為除K以外之胺基酸，X13為除A以外之胺基酸，且X14為除L以外之胺基酸。
  20. 如申請專利範圍第1項及第5項至第18項中任一項之抗體，其中該抗體包含VL FR3，該VL FR3包含胺基酸序列GVPDRESGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(SEQ ID NO：6)，且其中X11為S，X12為S，X13為T，或X14為A。
  21. 如申請專利範圍第1項及第5項至第18項中任一項之抗體，其中該抗體包含VL構架區3(VL FR3)，該VL FR3包含胺基酸序列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO：7)，其中：X15為除F以外之胺基酸，且X16為除K以外之胺基酸。
  22. 如申請專利範圍第1項及第5項至第18項中任一項之抗體，其中該抗體包含VL FR3，該VL FR3包含胺基酸序列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO：7)，其中：X15為S或X16為G。
  23. 如申請專利範圍第1項及第5項至第18項中任一項之抗體，其中該抗體包含VL構架區3(VL FR3)，該VL FR3包含胺基酸序列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO：7)，其中：X15為S，且X16為G。
  24. 如申請專利範圍第1項或第6項之抗體，其包含：VH構架區1(VH FR1)，其包含胺基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：1)，其中X1為除E以外之胺基酸；VH構架區2(VH FR2)，其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVX2(SEQ ID NO：2)，其中X2為除S以外之胺基酸；VL構架區1(VL FR1)，其包含胺基酸序列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(SEQ ID NO：3)，其中X3為除Q以外之胺基酸，X4為除V以外之胺基酸，X5為除G以外之胺基酸，X6為除R以外之胺基酸，且X7為除S以外之胺基酸；VL構架區2(VL FR2)，其包含胺基酸序列WYQQX10PGTAPKLLIY(SEQ ID NO：5)，其中X10為除L以外之胺基酸；及VL構架區3(VL FR3)，其包含胺基酸序列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(SEQ ID NO：6)，其中X11為除F以外之胺基酸，X12為除 K以外之胺基酸，X13為除A以外之胺基酸，且X14為除L以外之胺基酸。
  25. 如申請專利範圍第1項、第6項或第24項之抗體，其包含：VH構架區1(VH FR1)，其包含胺基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：1)，其中X1為除E以外之胺基酸；VH構架區2(VH FR2)，其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVX2(SEQ ID NO：2)，其中X2為除S以外之胺基酸；VL構架區1(VL FR1)，其包含胺基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQ ID NO：4)，其中：X8為除Q以外之胺基酸，或X9為除S以外之胺基酸；及VL構架區3(VL FR3)，其包含胺基酸序列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO：7)，其中：X15為除F以外之胺基酸，且X16為除K以外之胺基酸。
  26. 如申請專利範圍第5項或第7項之抗體，其包含：VH構架區1(VH FR1)，其包含胺基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：1)，其中X1為除E以外之胺基酸；VH構架區2(VH FR2)，其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVX2(SEQ ID NO：2)，其中X2為除S 以外之胺基酸；VL構架區1(VL FR1)，其包含胺基酸序列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(SEQ ID NO：3)，其中X3為除Q以外之胺基酸，X4為除V以外之胺基酸，X5為除G以外之胺基酸，X6為除R以外之胺基酸，且X7為除S以外之胺基酸；VL構架區2(VL FR2)，其包含胺基酸序列WYQQX10PGTAPKLLIY(SEQ ID NO：5)，其中X10為除L以外之胺基酸；及VL構架區3(VL FR3)，其包含胺基酸序列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(SEQ ID NO：6)，其中X11為除F以外之胺基酸，X12為除K以外之胺基酸，X13為除A以外之胺基酸，且X14為除L以外之胺基酸。
  27. 如申請專利範圍第5項、第6項或第26項之抗體，其包含：VH構架區1(VH FR1)，其包含胺基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：1)，其中X1為除E以外之胺基酸；VH構架區2(VH FR2)，其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVX2(SEQ ID NO：2)，其中X2為除S以外之胺基酸；VL構架區1(VL FR1)，其包含胺基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQ ID NO：4)，其中： X8為除Q以外之胺基酸，或X9為除S以外之胺基酸；及VL構架區3(VL FR3)，其包含胺基酸序列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO：7)，其中：X15為除F以外之胺基酸，且X16為除K以外之胺基酸。
  28. 如申請專利範圍第1項及第5項至第27項中任一項之抗體，其中如使用差示掃描螢光測定法所量測，該抗體具有67℃或更高之解鏈溫度(Tm)。
  29. 如申請專利範圍第1項及第5項至第27項中任一項之抗體，其中該抗體為人類抗體。
  30. 如申請專利範圍第1項及第5項至第27項中任一項之抗體，其中該抗體為單鏈Fv(scFv)、IgG、Fab、(Fab)2或(scFv')2。
  31. 如申請專利範圍第1項及第5項至第27項中任一項之抗體，其中該抗體為scFv。
  32. 如申請專利範圍第1項及第5項至第31項中任一項之抗體，其中該VH CDR2之X17為V；X18為H或D；X19為H或N；且X20為T。
  33. 如申請專利範圍第1項及第5項至第32項中任一項之抗體，其中該VH CDR2包含選自以下之胺基酸序列：a.VISPAGNNTYYADSVKG(SEQ ID NO：23)；b.VISPAGRNKYYADSVKG(SEQ ID NO：24)；c.VISPDGHNTYYADSVKG(SEQ ID NO：25)； d.VISPHGRNKYYADSVKG(SEQ ID NO：26)；e.VISRRGDNKYYADSVKG(SEQ ID NO：27)；f.VISNNGHNKYYADSVKG(SEQ ID NO：28)；g.VISPAGPNTYYADSVKG(SEQ ID NO：29)；h.VISPSGHNTYYADSVKG(SEQ ID NO：30)；i.VISPNGHNTYYADSVKG(SEQ ID NO：31)；j.AISPPGHNTYYADSVKG(SEQ ID NO：32)；k.VISPTGANTYYADSVKG(SEQ ID NO：33)；l.VISPHGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：34)；m.VISNNGHNTYYADSVKG(SEQ ID NO：35)；n.VISPAGTNTYYADSVKG(SEQ ID NO：36)；o.VISPPGHNTYYADSVKG(SEQ ID NO：37)；p.VISHDGTNTYYADSVKG(SEQ ID NO：38)；q.VISRHGNNKYYADSVKG(SEQ ID NO：39)；及r.VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：40)。
  34. 一種抗體，其包含：VH序列，其按胺基末端至羧基末端順序包含：(i)VH FR1序列QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：1)；(ii)VH CDR1 SYAMH(SEQ ID NO：10)；(iii)VH FR2序列WVRQAPGKGLEWVT(SEQ ID NO：3)或VH FR2序列WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO： 2)；(iv)VH CDR2序列X17ISPX18GX19NX20YYADSVKG(SEQ ID NO：11)；(iv)VH FR3序列RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：4)；(v)VH CDR3序列ASVGATGPFDI(SEQ ID NO：12)；(vi)VH FR4序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：5)；及VL序列，其按胺基末端至羧基末端順序包含：(viii)VL FR1序列SSELTQPPSVSVAPGQTVTITC(SEQ ID NO：6)；(ix)VL CDR1序列QGDSLRSYYAS(SEQ ID NO：13)；(x)VL FR2序列WYQQKPGTAPKLLIY(SEQ ID NO：7)；(xi)VL CDR2序列GENNRPS(SEQ ID NO：14)；(xii)VL FR3序列GVPDRFSGSSSGTSASLTITGAQAEDEADYYC(SEQ ID NO：8)；(xiii)VL CDR3序列NSRDSSGTHLTV(SEQ ID NO：15)；(xiv)VL FR4序列FGGGTKLTVLG(SEQ ID NO： 9)；且其中，X17為A或V；X18為A、D、H、N、P、S或T；X19為A、R、H或P；且X20為K或T。
  35. 如申請專利範圍第34項之抗體，其中該VH CDR2包含選自以下之胺基酸序列：a.VISPAGNNTYYADSVKG(SEQ ID NO：23)；b.VISPAGRNKYYADSVKG(SEQ ID NO：24)；c.VISPDGHNTYYADSVKG(SEQ ID NO：25)；d.VISPHGRNKYYADSVKG(SEQ ID NO：26)；e.VISRRGDNKYYADSVKG(SEQ ID NO：27)；f.VISNNGHNKYYADSVKG(SEQ ID NO：28)；g.VISPAGPNTYYADSVKG(SEQ ID NO：29)；h.VISPSGHNTYYADSVKG(SEQ ID NO：30)；i.VISPNGHNTYYADSVKG(SEQ ID NO：31)；j.AISPPGHNTYYADSVKG(SEQ ID NO：32)；k.VISPTGANTYYADSVKG(SEQ ID NO：33)；l.VISPHGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：34)；m.VISNNGHNTYYADSVKG(SEQ ID NO：35)；n.VISPAGTNTYYADSVKG(SEQ ID NO：36)；o.VISPPGHNTYYADSVKG(SEQ ID NO：37)；p.VISHDGTNTYYADSVKG(SEQ ID NO：38)；q.VISRHGNNKYYADSVKG(SEQ ID NO：39)；及r.VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：40)。
  36. 一種抗體，其包含VH及VL，其中該VH及該VL包含與以下各項具有至少95%一致性之胺基酸序列：SEQ ID NO：60[scFv1]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：62[scFv2]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：64[scFv3]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：66[scFv4]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：68[scFv5]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：70[scFv6]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：72[scFv7]之VH及VL之胺基酸序列。SEQ ID NO：74[scFv8]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：76[scFv9]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：78[scFv10]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：80[scFv11]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：82[scFv12]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：84[scFv13]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：86[scFv14]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：88[scFv15]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：90[scFv16]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：92[scFv17]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：94[scFv18]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：96[scFv19]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：98[scFv20]之VH及VL之胺基酸序列；SEQ ID NO：100[scFv21]之VH及VL之胺基酸序列；或 SEQ ID NO：102[scFv22]之VH及VL之胺基酸序列。
  37. 一種呈scFv形式之抗體，其包含：VH，其包含：VH CDR1，其具有胺基酸序列SYAMH(SEQ ID NO：17)；VH CDR2，其具有以下18個胺基酸序列之一：(I)VISPAGNNTYYADSVKG(SEQ ID NO：23)；(II)VISPAGRNKYYADSVKG(SEQ ID NO：24)；(III)VISPDGHNTYYADSVKG(SEQ ID NO：25)；(IV)VISPHGRNKYYADSVKG(SEQ ID NO：26)；(V)VISRRGDNKYYADSVKG(SEQ ID NO：27)；(VI)VISNNGHNKYYADSVKG(SEQ ID NO：28)；(VII)VISPAGPNTYYADSVKG(SEQ ID NO：29)；(VIII)VISPSGHNTYYADSVKG(SEQ ID NO：30)；(IX)VISPNGHNTYYADSVKG(SEQ ID NO：31)；(X)AISPPGHNTYYADSVKG(SEQ ID NO：32)；(XI)VISPTGANTYYADSVKG(SEQ ID NO：33)；(XII)VISPHGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：34)；(XIII)VISNNGHNTYYADSVKG(SEQ ID NO：35)；(XIV)VISPAGTNTYYADSVKG(SEQ ID NO：36)；(XV)VISPPGHNTYYADSVKG(SEQ ID NO：37)； (XVI)VISHDGTNTYYADSVKG(SEQ ID NO：38)；(xvii)VISRHGNNKYYADSVKG(SEQ ID NO：39)；或(xviii)VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：40)；及VH CDR3，其具有胺基酸序列ASVGATGPFDI(SEQ ID NO：19)；其中該等VH CDR按以下胺基末端至羧基末端順序存在：VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3；且該scFv進一步包含：VL，其包含：VL CDR1，其具有胺基酸序列QGDSLRSYYAS(SEQ ID NO：20)；VL CDR2，其具有胺基酸序列GENNRPS(SEQ ID NO：21)；及VL CDR3，其具有胺基酸序列NSRDSSGTHLTV(SEQ ID NO：22)；且其中該等VL CDR按以下胺基末端至羧基末端順序存在：VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3；該scFv進一步包含人類構架：VH QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 且其中該抗體免疫特異性結合A型ephrin受體2(EphA2)之細胞外域。
  38. 如申請專利範圍第37項之呈scFv形式之抗體，其中該VH相對於該VL處於胺基末端。
  39. 如申請專利範圍第37項或第38項之呈scFv形式之抗體，其中該scFv展現至少約67℃之Tm。
  40. 如申請專利範圍第37項至第39項中任一項之呈scFv形式之抗體，其中該scFv展現至少約70℃之Tm。
  41. 如申請專利範圍第1項及第5項至第40項中任一項之抗體，其中該VH相對於該VL處於胺基末端且藉由10至30個胺基酸長度之多肽連接子與該VL接合。
  42. 如申請專利範圍第1項及第5項至第41項中任一項之抗體，其中該連接子包含選自以下之胺基酸序列：ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：41)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：42)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：43)；ASTGGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO：44)；GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO：45)；TPSHNSHQVPSAGGPTANSGTSGS(SEQ ID NO：46)；及GGSSRSSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO：47)。
  43. 如申請專利範圍第42項之抗體，其中該scFv連接子包含序列ASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：41)。
  44. 一種抗體，其包含VH及VL，其中該VH包含與SEQ ID NO：133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173或175之胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。
  45. 如申請專利範圍第44項之抗體，其中該VL包含與SEQ ID NO：134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174或176之胺基酸序列具有至少95% 胺基酸序列一致性的胺基酸序列。
  46. 一種呈scFv形式之抗體，其包含與以下各項之胺基酸序列具有至少95%一致性之胺基酸序列：SEQ ID NO：60[scFv1]；SEQ ID NO：62[scFv2]；SEQ ID NO：64[scFv3]；SEQ ID NO：66[scFv4]；SEQ ID NO：68[scFv5]；SEQ ID NO：70[scFv6]；SEQ ID NO：72[scFv7]；SEQ ID NO：74[scFv8]；SEQ ID NO：76[scFv9]；SEQ ID NO：78[scFv10]；SEQ ID NO：80[scFv11]；SEQ ID NO：82[scFv12]；SEQ ID NO：84[scFv13]；SEQ ID NO：86[scFv14]；SEQ ID NO：88[scFv15]；SEQ ID NO：90[scFv16]；SEQ ID NO：92[scFv17]；SEQ ID NO：94[scFv18]；SEQ ID NO：96[scFv19]；SEQ ID NO：98[scFv20]；SEQ ID NO：100[scFv21]；或 SEQ ID NO：102[scFv22]。
  47. 如申請專利範圍第1項及第5項至第46項中任一項之抗體或scFv，其在C末端進一步包含Gly Gly Ser Gly Gly Cys(SEQ ID NO：54)。
  48. 一種抗體結合物，其包含如申請專利範圍第1項及第5項至第47項中任一項之抗體或scFv及與該抗體結合之部分。
  49. 如申請專利範圍第48項之結合物，其中該部分為脂質奈米粒子。
  50. 如申請專利範圍第49項之結合物，其中該脂質奈米粒子為脂質體。
  51. 如申請專利範圍第48項之結合物，其中該部分包含聚乙二醇(PEG)。
  52. 如申請專利範圍第48項之結合物，其中該部分包含治療劑。
  53. 如申請專利範圍第52項之結合物，其中該治療劑為細胞毒性劑。
  54. 如申請專利範圍第48項之結合物，其中該部分包含可偵測標記。
  55. 如申請專利範圍第54項之結合物，其中該可偵測標記為活體內成像劑。
  56. 一種組成物，其包含：如申請專利範圍第1項及第5項至第55項中任一項之抗體、scFv或抗體結合物；及 醫藥學上可接受之載劑。
  57. 如申請專利範圍第56項之組成物，其中該組成物經調配以用於非經腸投與。
  58. 一種套組，其包含處於容器中之如申請專利範圍第56項或第57項之組成物。
  59. 一種核酸，其編碼如申請專利範圍第1項至第47項中任一項之抗體、多肽或scFv。
  60. 一種經分離之核酸，其編碼如申請專利範圍第1項至第47項中任一項之抗體或scFv之可變輕鏈多肽、可變重鏈多肽或兩者。
  61. 一種表現載體，其包含：如申請專利範圍第59項或第60項之核酸；及與該核酸可操作地連接之真核生物啟動子。
  62. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第61項之表現載體。
  63. 如申請專利範圍第62項之宿主細胞，其中該細胞表現該可變輕鏈多肽、該可變重鏈多肽或兩者。
  64. 一種治療患有表現EphA2之癌症之個體的方法，該方法包括：向患有表現EphA2之癌症之個體投與如申請專利範圍第1項及第5項至第55項之抗體、scFv或抗體結合物，或者如申請專利範圍第56項或第57項之組成物。
  65. 一種組成物，其用於治療表現EphA2之癌症，其中該組成物包含如申請專利範圍第1項及第5項至第55 項中任一項之抗體、scFv或抗體結合物，或者如申請專利範圍第56項或第57項之組成物。
  66. 一種組成物用於治療表現EphA2之癌症之用途，其中該組成物包含如申請專利範圍第1項及第5項至第55項中任一項之抗體、scFv或抗體結合物，或者如申請專利範圍第56項或第57項之組成物。
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