KR20160090893A - Ccr9에 대한 항체 및 그의 적용방법 - Google Patents

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카를로스 마르티네즈 알론소
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Abstract

본 발명은 CCR9에 특이적으로 결합하는 항체, 및 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그의 용도 및 상기 항체를 이용하는 진단 방법에 관한 것이기도 하다.

Description

CCR9에 대한 항체 및 그의 적용방법{ANTIBODIES AGAINST CCR9 AND APPLICATIONS THEREOF}
본 발명은 CCR9에 특이적으로 결합하는 항체, 및 그의 용도, 그리고 상기 항체를 이용하는 진단 방법에 관한 것이다.
케모카인(Chemokines)은 7종의 막투과 스패닝 G 단백질-커플링된 수용체에 결합하는, 구조적으로 연관된 작은 단백질 패밀리이다. 케모카인 및 이들의 수용체는 항상 상태 및 염증 상태 양쪽 모두에서, 장기형성 및 림프구 트래피킹(trafficking)에 있어 필수적인 역할을 한다. CXCR4 또는 CCR7와 같은 케모카인 수용체의 비정상적인 종양 세포 발현과 암 진행, 장기-선택적 전이 및 불량한 예후 사이에는 강한 연관성이 존재한다. 인간 케모카인 수용체 CCR9 (GenBank 수탁번호. U45982)은 Zaballos 등 (1999, J Immunol 162:5671-5; EMBL database accession number AJ132337) 및 Youn 등 (1999, Blood 94:2533-6)에 의해 동정되었다. 비록 CCR9에 대한 데이터가 많지는 않지만, 종양 세포에 대한 그의 발현은 소장에서의 전이와 관련이 있다(Letschet al., 2004, J Invest Dermatol 122:685-90; Richmond A, 2008, Clin Cancer Res 14:621-3; Amersiet al., 2008, Clin Cancer Res 14:638-45).
CCR9은 흉선의 림프구 세포에서만 거의 배타적으로 발현하여 순환 메모리 T 림프구 (CCR9+α 4β7 hi), IgA-분비 혈장 세포 및 혈장모양(plasmacytoid) 수지상 세포의 작은 서브세트인 소장 내 세포들에 침윤한다. 유일하게 알려진 CCR9 리간드는 케모카인 TECK (CCL25)인데 이것은 흉선 및 소장의 잠복 상패로부터의 상피와 수지상 세포에 의해 분비된다. CCR9-CCL25 상호반응은 흉선 내 흉선세포 이동과 소장관으로의 세포 귀소에 있어 핵심적인 조절자이다. 난소암종, 전립선암, 유방암 및 흑색종에서의 비정상적인 CCR9 발현은 CCL25에 대한 인 비트로 침윤과 연관되어 있다. 급성 및 만성 T 세포 직계성 백혈병에서의 CCR9 과발현은 질병의 공격성과 연결된다. CCR9는 종양 세포에 대해 경쟁적 장점을 제공한다; CCL25와의 관련성은 유방 및 난소암종에 있어서 포스파티딜이노시타이드 3-키나아제 (PI3K)/Akt 경로를 경유하여 아폽토시스에 대한 내성과 세포 생존을 향상시키고, 백혈병 세포에서 Notch1를 활성화시킴으로써 JNK1 항-아폽토시스 경로를 활성화시키고 증식을 향상시킨다.
이종이식 모델(xenogenic models)에서 성장하는 인간 CCR9+ 종양을 치료하기 위한 특이적인 치료 도구는 독소-커플링된 리간드 (CCL25-PE38 융합 단백질) (Hu et al., 2011, Leukaemia Res 35:1254-60) 또는 단독 또는 세포독성물질인 에토포사이드와 조합된 리간드-특이 항체(Sharma et al., 2010, Int J Cancer 127:2020-30)를 사용하는 것에 한정되어 있다. 이러한 전략에서는, 종양 세포 제거를 위해 CCL25-CCR9 상호반응이 표적화된다; 비록 그 결과가 제한적이긴 하지만, 이들은 CCR9가 암 면역요법에 있어서 잠재적인 표적이라는 증거를 제공한다.
CCR9를 표적으로 하는 치료법이 전무함에 비추어, 이 기술분야에는, CCR9을 발현하는 세포에 수반되는 질병 또는 병태를 진단, 예후 판단 및/또는 치료하는데 적합한, CCR9를 특이적으로 인식하는 물질을 제공할 필요가 있다.
발명의 개요
일 측면에서, 본 발명은:
a) - SEQ ID NO: 1[CDR-H1] 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체;
- SEQ ID NO: 2 [CDR-H2]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체; 및
- SEQ ID NO: 3 [CDR-H3]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체;
로부터 선택된 적어도 하나의 상보성 결정영역(CDR)을 포함하는 중쇄; 및
b) - SEQ ID NO: 4 [CDR-L1]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체;
- SEQ ID NO: 5 [CDR-L2]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체; 및
- SEQ ID NO: 6 [CDR-L3]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체
로부터 선택된 적어도 하나의 상보성 결정영역(CDR)을 포함하는 경쇄
를 포함하는, CCR9에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은:
i) 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산, DNA 또는 RNA, 및
ii) i)에서 정의된 바와 같은 핵산의 상보적인 핵산
으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 유전자 구조물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 핵산 또는 상기 유전자 구조물을 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 핵산, 또는 상기 유전자 구조물, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 특정한 일 구체예에서, 상기 벡터 발현 벡터이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 핵산, 또는 상기 유전자 구조물, 또는 상기 발현 카세트, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 생산을 허여하는 조건 하에서 상기 세포를 성장시키는 것을 포함하는, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 생산방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 인 비트로 진단 및/또는 예후 탐지를 위한 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 어떤 대상자에 있어서 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 진단 및/또는 예후 탐지를 위한 방법에 관한 것으로서, 이 방법은:
a) 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 상기 대상자로부터의 세포를 포함하는 샘플과 접촉시키고;
b) 상기 대상자로부터의 상기 샘플 중의 CCR9를 검출 및/또는 정량하고;
c) 상기 대상자로부터의 상기 샘플에서 검출된 상기 CCR9의 존재여부 및/또는 양 및/또는 분포를 대조군 샘플에서 검출된 CCR9의 그것과 비교하며; 및
d) 얻어진 결과를 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 존재와 결부시키는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 인 비보 진단 및/또는 예후 탐지를 위한 상기 항체, 또는 그의 항원-결합 단편의 용도 또는 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 인 비보 진단 및/또는 예후 탐지를 위한 방법에서 상기 항체, 또는 그의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다; 별법으로, 이 측면은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 인 비보 진단 및/또는 예후 탐지를 위한 조성물의 제조를 위한 상기 항체, 또는 그의 항원-결합 단편의 용도로서 표현할 수 있다. 달리 설명하면, 본 발명의 이 측면은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 인 비보 진단 및/또는 예후 탐지에 사용되기 위한 상기 항체, 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 또는 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 인 비보 진단 및/또는 예후 탐지를 위한 방법에 사용되기 위한 상기 항체, 또는 그의 항원-결합 단편으로서 표현될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
a) 본 발명의 항체를 제1 시점에서 채취한 대상자로부터의 세포를 포함하는 제1 샘플과 접촉시키고;
b) 상기 제1 샘플 내의 CCR9를 검출 및/또는 정량하고;
c) 본 발명의 항체를 제2 시점에서 채취한 상기 대상자로부터의 세포를 포함하는 제2 샘플과 접촉시키고
d) 상기 제2 샘플 내의 CCR9를 검출 및/또는 정량하고;
e) 상기 제1 샘플 및 제2 샘플에서 검출된 CCR9의 존재 및/또는 양 및/또는 분포를 비교하고; 및
f) 얻어진 결과를 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료에 대한 반응과 결부시키는 것
을 포함하는, 치료를 받는 대상자에 있어서 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료에 대한 반응을 모니터링하기 위한 인 비트로 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용되기 위한 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료에 사용되기 위한 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료를 위한 의약을 제조하는데 있어서의 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표적 세포, 즉 CCR9를 발현하는 세포 (CCR9+)를 사멸시키는 것을 포함하는 질병의 치료 방법에 사용되기 위한 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이거나; 또는, 별법으로 표적 세포를 사멸시키는 것을 포함하는 치료를 위한 의약의 제조를 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 조영 기술을 이용함으로써, CCR9를 발현하는 세포 (CCR9+)를 포함하는 종양의 진단에 사용되기 위한 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 별법으로, 조영 기술을 이용함으로써, CCR9를 발현하는 세포 (CCR9+)를 포함하는 종양의 인 비보 진단을 위한 조성물을 제조하는데 있어서의 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CCR9를 발현하는 세포 (CCR9+)를 포함하는 종양에 대하여 약물을 표적화시키는데 사용되기 위한 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 별법으로, CCR9를 발현하는 세포 (CCR9+)를 포함하는 종양에 대하여 약물을 인 비보 표적화하기 위한 조성물의 제조하는데 있어서의 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 염증 질환에서 CCR9를 발현하는 세포를 고갈시킴으로써 상기 염증 질환의 치료에 사용되기 위한 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 별법으로, CCR9를 발현하는 세포를 고갈시킴으로써 염증 질환을 치료하기 위한 의약 조성물을 제조하는데 있어서의 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 샘플 중 CCR-9 단백질의 검출, 위치결정(localization) 및/또는 정량을 위한 바이오테크놀로지 기술에 있어서의 도구(tool)로서의 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 샘플에 존재하는 CCR9 또는 CCR9를 발현하는 세포의 검출 및/또는 정량에 있어서 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 이용함으로써, 샘플에 존재하는 CCR9 또는 CCR9를 발현하는 세포를 검출 및/또는 정량하기 위한 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 적어도 1종 포함하는 키트에 관한 것이며; 특정 구체예에서, 상기 키트는 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 더해, 추가의 치료제를 더 함유하는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 the use of 상기 kit for diagnosing a CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태를 진단하기 위한, 또는 치료를 받는 대상자에 있어서 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료에 대한 반응으르 모니터링하기 위한, 또는 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료를 위한, 또는 CCR9+ 세포를 포함하는 종양에 약물을 표적화하기 위한 상기 키트의 용도 또는 상기 키트의 샘플 내 CCR9 단백질의 검출, 위치결정 및/또는 정량을 위한 바이오테크놀로지 기술의 도구로서, 또는 샘플에 존재하는 CCR9, 또는 CCR9를 발현하는 샘플을 검출 및/또는 정량하기 위한 키트의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료적 유효량과, 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
도 1. 91R mAb 는 인간 케모카인 수용체 CCR9 에 대하여 특이적이다. (A) hCCR9, mCCR9, hCCR4, hCCR5, hCCR6, hCCR8로 안정하게 형질감염된 HEK293 세포(색칠되지 않은 히스토그램) 또는 엠티(empty) pCIneo 벡터 (색칠된 히스토그램)를91R mAb로 염색하고 유세포분석에 의해 분석하였다. (B) 인간 백혈병 MOLT-4 및 Jurkat 세포를 항-인간 CCR9 mAb 91R 및 112509 (색칠되지 않은 히스토그램) 또는 이소타입-매칭된 대조군 mAb (색칠된 히스토그램)로 염색하고 유세포분석에 의해 분석하였다. (C) 91R (색칠된 히스토그램), 112509 (색칠되지 않은 히스토그램), 또는 이소타입-매칭된 mAb (회색 선)의 양을 달리한 (0.12-10 μg/ml) MOLT-4 염색의 대표적인 유세포분석 분석결과 (n = 5). (D) 항-CD4, -CD8 및 91R 항체를 이용한 인간 흉선세포의 유세포분석. CD4/CD8 플롯의 게이트의 양성 세포 백분율을 표시하였다; 각 부분모집단(subpopulation)에서 hCCR9 발현이 나타났다. (E) 91R 및 항-CD3으로 염색된 인간 말초혈액세포를 나타내는 유세포분석, 림프구 게이트에서 CD3 vs 91R 염색 및 총세포 모집단(population). (F) 91R과 함께 인큐베이션된 hCCR9- 또는 pCIneo-형질감염된 HEK293 세포, MOLT-4, 및 Jurkat 세포의 막-강화(membrane-enriched) 분획의 대표적인 웨스턴 블롯; 로딩 대조군으로서 동일한 막을 항-CD71 Ab로 프로브시켰다(n = 3).
도 2. 91R mAb 는 인간 CCR9 N-말단 도메인을 인식한다. (A) 인간 및 마우스 CCR9 그리고 N-말단 도메인 (Nt)이 쥐의 서열에 의해 대체된 인간 CCR9 서열을 산생하는 키메라 CCR9 (mNt/hCCR9)의 다이아그램; 91R mAb (항-hCCR9; 색칠되지 않은 히스토그램), 토끼 폴리클로날 K629 (항-mCCR9; 색칠되지 않은 히스토그램) 및 토끼 대조군 Ab (색칠된 히스토그램)를 이용한 유세포분석. (B) pCIneo-, hCCR9-HEK 및 MOLT-4 세포로부터의 막-강화된 용해물들을 91R 및 로딩 대조군으로서 항-CD71 Ab을 이용하여 웨스턴 블롯에 이용하였다. 표시된 경우, 세포 용해물을PNGase로 처리하여 N-글리코실화된 잔기를 제거하였다. 대표적인 실험 결과를 나타내었다(n = 2).
도 3. 인간 CCL25 는 MOLT-4 세포에 대한 결합을 두고 91R mAb 와 경쟁한다.
단독으로 또는 10 μg/ml hCCL25 또는 hCXCL12 (40 min, 4℃)와 함께 예비인큐베이션시키고, 91R 또는 이소타입-매칭된 mAb으로 염색한 인간 MOLT-4 세포의 대표적인 유세포분석 결과(n　=　3).
도 4. 백혈병 이종이식편 성장은 91R mAb 로 처리된 마우스에서 억제된다. 이종이식편 분석을 위해, MOLT-4 세포를 제0일(d0)에 Rag2-/-마우스에서 피하접종(s.c.)하였다. 실험군에는 91R 또는 무관한 IgG2b mAb를 4회 복강(i.p.) 투여하였다 (제1차 및 제2차, 4 mg/kg; 제3차 및 제4차, 2 mg/kg). 매 3일마다 캘리퍼로 종양 성장을 측정하였다. 마우스를 희생시킨 후 종양을 제거하고 칭량하였다. (A)
각 옆구리(flank)에 종양 세포가 주사된 마우스에 대하여 항체 투여 스케쥴은 제1, 7, 14 및 21일이었다. (B) 종양 성장 동력학(Tumor growth kinetics). 표시된 시점에서 종양 크기를 측정하고 V = [축 직경 길이, mm] x [(회전 직경, mm)2/2] (6 마우스/그룹)로서 나타내었다. (C) d56에서의 IgG2b 처리에 상대적인 종양 무게(%). 평균 ± SEM (n = 6 마우스/그룹). (D) 희생시킬 당시(제56일) IgG2b- 및 91R-처리된 마우스로부터의 종양 이미지. 막대 = 1 cm. (E) 한쪽 옆구리에만 주사된 마우스에 있어서 제7, 14, 21, 및 28일에서의 항체 투여 스케쥴. (F) 종양 크기를 C에서와 같이 계산하였다(10 마우스/그룹). (G) d72에 IgG2b 처리에 상대적인 종양 무게 백분율. 결과를 평균 ± SEM으로 나타내었다 (n = 10 마우스/그룹). (H) 희생 당시(제72일) IgG2b- 및 91R-처리된 마우스로부터의 종양의 이미지. 막대 = 1 cm. Student's t-검정, ***　p<0.001, ** p<0.01, * p<0.05.
도 5. 백혈병 이종이식편 성장의 91 RmAb -유도된 감소의 단기간 동력학 . (A) d0에 Rag2-/- 마우스들의 각 옆구리에 s.c. 접종된 발광 MOLT-4 세포 (MOLT-4-luc)를 이용한 처리 스케쥴. 실험군에게는 91R 또는 대조군 IgG2b mAb를 d1 (4　mg/kg) 및 d6 (2 mg/kg)에 복강 접종하였다. 발광 이미지를 제1일부터 제28일에 분석하고; d62에 마우스를 희생시켜 종양을 제거하였다. (B) 세포-접종 후 표시된 시점에서 각 그룹으로부터의 대표적인 마우스의 이미지. (C) 종양 이식 후 종양 성장 동력학. 상대적인 생물발광 유닛을 평균 ± SEM으로서 나타내었다. (D) d62에 IgG2b 처리에 대한 종양 부담(tumor burden)의 백분율. 결과를 평균 ± SEM으로 나타내었다. (E) 마우스 당 종양 무게; 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. C-E, n = 7 마우스/그룹. Student's t-검정, *** p<0.001, ** p<0.01, *　p<0.05.
도 6. 91R mAb 는 종양 이종이식편에서 아폽토시스 및 괴사를 촉진하여 세포 증식 및 혈관신생을 감소시킨다. (A-D) 이종이식된 MOLT-4 종양의 조직학 분석 (n = 5 마우스/그룹). (A) 91R 또는 대조군 IgG2b mAb로 처리된 이종이식된 MOLT-4 종양으로부터의 헤마톡실린/에오신-염색된 섹션들; 막대 = 2 mm. 우측, 보다 고배율에서의 이미지; 막대 = 25 μm. (B) 그래프는 종양 당 괴사 면적 백분율로서 표현되는 괴사 단계에 의한 종양 분류를 나타낸다(<1%, 1-30% 및 >30%). Chi-square 검정 , ***p<0.0001. (C) 종양에서의 아폽토시스 수준을 TUNEL 분석법으로 알아보았다. PCNA 면역염색에 의해 증식 수준을 구하였다. CD31 염색에 의해 혈관을 검색하였다. 조직 절편들을 DAPI-카운터염색하였다. 막대 = 50 μm. (D) 광학 필드 당 TUNEL- 및 PCNA-양성 핵 및 혈관의 정량 분석. Mann-Whitney 검정, ***　p<0.001, ** p<0.01, * p<0.05.
도 7. 91R mAb 는 백혈병 MOLT-4 세포에서 인 비트로 보체 -의존성 세포독성을 촉진한다. MOLT-4 세포를 91R 또는 이소타입-매칭된 mAb (40　μg/ml, 30 min, 37℃)로 식균처리(opsonized)하고, 세척한 다음 25% 활성 (37℃) 또는 불활성 (56℃) 베이비 토끼 보체(baby rabbit complement:BRC)와 함께 인큐베이션하였다 (1h); 7-AAD 염색에 의한 유세포분석으로 세포 생존능을 평가하였다. (A) 항체 부재 또는 91R, 112509mAb, 또는 이소타입-매칭된 mAb (IgG2a 또는 IgG2b) 존재시 특이적 보체 용해(specific complement lysis). 각 조건을 3중 분석하였다. 데이터는 4회의 독립적인 실험에 대한 평균 ± SEM이다. (B) 표시된 농도로 91R 및 대조군 IgG2b mAb를 이용한 특이적 보체 용해에 대한 투여량-반응 곡선. 데이터는 4회중 대표적인 1회에 있어서의 평균 ± SEM을 나타낸 것이다. (C) BRC에 대한 시간 노출 효과. 데이터는 2회 중 대표적인 1 실험으로부터의 삼중 측정된 평균 ± SEM이다. (D) BRC에 대한 투여량 반응 곡선에서의 특이 보체 용해. 데이터는 2회 중 대표적인 1 실험으로부터의 삼중 측정된 백분율 평균 ± SEM을 나타낸다. Student's t-검정, ***p<0.001, **　p<0.01, * p<0.05.
도 8. 92R mAb 는 내인성 케모카인 수용체 CCR9 를 발현하는 인간 T 세포를 특이적으로 인식하여 CCR9 결합을 두고 91R과 경쟁한다. (A) 인간 T 세포 백혈병 MOLT-4 및 Jurkat 세포를 항-인간 CCR9 mAb 92R (색칠되지 않은 히스토그램) 또는 이소타입-매칭된 대조군 mAb (색칠된 히스토그램)으로 염색하고 유세포분석에 의해 분석하였다. (B) 91R mAb는 MOLT-4 세포에 대한 결합을 두고 92R mAb와 경쟁한다. 10 μg/ml mAb (대조군 IgG2b, 92R 또는 91R)과 함께 예비 인큐베이션되고 바이오틴-표지된 92R mAb (92R-Biot) 및 이어서 FITC 컨쥬게이트된 아비딘으로 염색된 MOLT-4 세포의 대표적인 유세포분석 결과. (C) mAbs 91R 및 92R은 hCCR9 아미노산 2-22를 포함하는 합성 펩타이드에 대한 결합을 두고 서로 경쟁한다. ELISA 플레이트를 hCCR9의 아미노산 2-22에 대응하는 합성 펩타이드로 코팅하였다. PBS와 함께 인큐베이션한 후, 대조군 IgG2b, 92R 또는 91R, 91R-Biot 또는 92R-Biot mAb를 첨가하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 아비딘을 이용하여 플레이트를 디벨로핑하였다. 데이터는 하나의 대표적인 실험에 대한 평균 ± SEM을 나타낸 것이다. Student's t-검정, *** p<0.001, **　p<0.01, * p<0.05.
도 9. 91R, 92R 및 3 C3 mAbs 의 6종의 CDR 의 서열 정렬.
91R, 92R 및 3C3 mAbs의 6가지 CDR들 (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)의 아미노산 서열을 정렬시켰다. Key: "*"는 동일한 잔기를 나타낸다; ":"는 보존된 치환을 나타낸다; "."는 반-보존된(semi-conserved) 치환을 나타낸다.
도 10. 91R 및 3 C3 mAbs 는 내인성 케모카인 수용체 CCR9 및 hCCR9 -형질감염 된 HEK -293 세포를 발현하는 인간 T 세포를 특이적으로 인식한다. (A) 91R 및 3C3 mAbs는 CCR9+ 인간 급성 림프모구성 백혈병 T 세포주인 MOLT4 세포에 특이적으로 결합한다. 인간 백혈병 MOLT-4 (hCCR9+) 및 Jurkat (hCCR9-) 세포 (2x105 세포/웰)를 이소타입-매칭된 대조군 mAbs (10 μg/ml, 색칠된 히스토그램) 또는 항-인간 CCR9 mAbs 91R 또는 3C3 (10 μg/ml, 색칠되지 않은 히스토그램)으로 염색하였다. 세척 후, 세포들을 PE-표지된 염소 항 마우스 면역글로불린 항체와 함께 인큐베이션하고 유세포분석에 의해 분석하였다. 한 가지 대표적인 실험을 나타냈다 (n = 3).(B) 91R 및 3C3 mAbs는 hCCR9-형질감염된 HEK-293에 대해 서로 다른 인식 패턴을 갖는다. 특히, 3C3 mAb는 목(mock)-형질감염된 세포에 대해서, 91R mAb에 비해 더 높은 비특이적 결합을 나타낸다. 엠티 pCIneo 벡터 또는 hCCR9에 의해 안정하게 형질감염된 인간 HEK-293 세포들 (2x105 세포/웰)을 이소타입-매칭된 대조군 mAbs (10 μg/ml, 색칠된 히스토그램) 또는 항-인간 CCR9 mAbs 91R 또는 3C3 (10 μg/ml, 색칠되지 않은 히스토그램)으로 염색하였다. 세척 후, 세포들을 PE-표지된 염소 항 마우스 면역글로불린 항체와 함께 인큐베이션하고 유세포분석에 의해 분석하였다. 한 가지 대표적인 실험을 나타냈다(n = 2).
도 11. ELISA 플레이트에서 hCCR9 - 유래된 펩타이드에 대한 91R 및 3 C3 mAbs 의 결합. 플레이트들을 hCCR9의 아미노산 2-22 (SEQ ID NO: 11) 및 13-30 (SEQ ID NO: 12)에 대응하는 합성 펩타이드, 펩타이드 BOT (무관한 대조군 합성 펩타이드), 염소 항 마우스 카파 경쇄 항체 (GaM 카파 LC) 또는 소 태아 혈청(BSA)으로 코팅하였다. BSA로 차단 후, 3C3, 91R, BOT 또는 이소타입 대조군 mAbs를 첨가하였다. 세척 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 염소 항 마우스 면역글로불린을 첨가하고 인큐베이션하였다. 마지막으로, 플레이트를 세척하고 OPD 및 H2O2로 디벨로핑시켰다. 결과를 490 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 정량하였다. 블랭크를 빼지 않았다. 하나의 대표적인 실험을 나타내었다(n = 2).
도 12. 91R, 92R 및 3 C3 mAbs 및 MOLT4 세포를 이용한 경쟁적 결합 분석. MOLT4 세포 (2x105 세포/웰)를 50 μl의 PBSst (색칠된 히스토그램) 또는 3C3, 91R, 92R 또는 이소타입 대조군 mAbs (20 μg/ml, 색칠되지 않은 히스토그램)과 함께 예비 인큐베이션시켰다. 4℃에서 30분 후, 50 μl의 바이오틴-표지된 3C3, 91R 또는 92R mAbs(5 μg/ml)를 첨가하고 다시 20분 동안 계속 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포들을 PE-표지된 아비딘과 함께 인큐베이션하고 유세포분석에 의해 분석하였다. 대표적인 한 가지 실험을 나타냈다 (n = 2).
도 13. CCR9 리간드 CCL25 에 의해 유도된 MOLT-4 세포 이동의 차단. MOLT-4 세포의 이동에 미치는 항-CCR9 항체의 효과를 5 μm 트랜스웰 삽입물을 이용하여 시험하였다. 단독으로 또는 이소타입 대조군, 91R 또는 3C3 mAbs(100 μg/ml)와 함께 미리 예비-인큐베이션된 3 x 105 MOLT-4 세포를 200 nM CCL25을 함유하는 배지에 도말하여 배지 내로 이동하도록 하였다. 3시간 후, 이동된 세포들의 수를 유세포분석기를 이용하여 평가하였다. 데이터는 대표적인 한 가지 실험에 대한 사중의 평균 ± SEM을 나타낸 것이다 (n = 2). Student's t-검정, *** p<0.001, ** p<0.01, * p<0.05.
발명의 상세한 설명
본 발명의 항체
본 발명은:
a) - SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR (NFWMN) [CDR-H1] 또는 그의 변이체;
- SEQ ID NO: 2 (EIRLKSNNYATHYAESVKG) [CDR-H2]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체; 및
- SEQ ID NO: 3 (DGWFAY) [CDR-H3]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체;
로부터 선택된 적어도 하나의 상보성 결정영역(CDR)을 포함하는 중쇄; 및
b) - SEQ ID NO: 4 (RSSQSLLHSNGNTYVQ)[CDR-L1] 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체;
- SEQ ID NO: 5 (KVSNRFP)[CDR-L2]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체; 및
- SEQ ID NO: 6 (AQSTHVPRT) [CDR-L3] 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체
로부터 선택된 적어도 하나의 상보성 결정영역(CDR)을 포함하는 경쇄
를 포함하는, CCR9에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편에 (이하 "본 발명의 항체"라 칭함)를 제공한다.
특정한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 중쇄 내에 SEQ ID NOs: 1 내지 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체로부터 선택된 상기 CDR 중 2개를 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 중쇄 내에 SEQ ID NO: 1 [CDR-H1]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체, SEQ ID NO: 2 [CDR-H2]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체, 및 SEQ ID NO: 3 [CDR-H3]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체를 포함한다.
바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 중쇄 내에 SEQ ID NO: 1 [CDR-H1]에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR, SEQ ID NO: 2 [CDR-H2]에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR, 및 SEQ ID NO: 3 [CDR-H3]에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR을 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 경쇄 내에 SEQ ID NOs: 4 내지 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체로부터 선택된 상기 CDR 중 2개를 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 경쇄 내에 SEQ ID NO: 4 [CDR-L1]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체, SEQ ID NO: 5 [CDR-L2]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체, 및 SEQ ID NO: 6 [CDR-L3]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체를 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 경쇄 내에 SEQ ID NO: 4 [CDR-L1]에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR, SEQ ID NO: 5 [CDR-L2]에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR, 및 SEQ ID NO: 6 [CDR-L3]에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR을 포함한다.
본 발명의 항체는 그 특징이 전술한 바와 같은 CDR 서열들을 여하한 조합으로든 함유할 수 있다; 그럼에도 불구하고, 바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 중쇄 내에 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; 및 그 경쇄 내에 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 것이 좋다.
더욱 바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 중쇄 내에 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3을 포함하고; 및 그 경쇄 내에 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3을 포함하는 것이 좋으며, 이 항체는 하기 실시예에서 91R mAb로 동정된 항체에 해당하는 것이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 중쇄 내에 SEQ ID NOs: 7, 2 및 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체로부터 선택된 상기 CDR 중 2개를 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 중쇄 내에 SEQ ID NO: 7 (KFWMN) [CDR-H1]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체, SEQ ID NO: 2 [CDR-H2]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체, 및 SEQ ID NO: 3 [CDR-H3]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 중쇄 내에 SEQ ID NO: 7[CDR-H3]에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR, SEQ ID NO: 2 [CDR-H2]에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR, 및 SEQ ID NO: 3 [CDR-H3]에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR을 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 경쇄 내에 SEQ ID NOs: 8 내지 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체로부터 선택된 상기 CDR 중 2개를 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 경쇄 내에 SEQ ID NO: 8 (RSSQSLVHSNGNTYLN) [CDR-L1]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체, SEQ ID NO: 9 (KVSNRFS) [CDR-L2]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체, 및 SEQ ID NO: 10(SQSTHFPRT) [CDR-L3]에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 경쇄 내에 SEQ ID NO: 8 [CDR-L1]에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR, SEQ ID NO: 9 [CDR-L2]에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR, 및 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열 [CDR-L3]에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR을 포함한다.
본 발명의 항체는 전술한 바와 같은 특징을 갖는 CDR 서열들을 여하한 조합으로든 함유할 수 있다; 그럼에도 불구하고, 바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 중쇄 내에 SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고, 및 그 경쇄 내에 SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 것이 좋다.
더욱 바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 중쇄 내에 SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1, SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3을 포함하고, 및 그 경쇄 내에 SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, SEQ ID NO: 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3을 포함하며, 상기 항체는 하기 실시예에서 92R mAb로 동정된 항체에 해당한다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 "항원"이라 칭해지는 특정 단백질에 대해 특이적인 결합 활성을 나타내는 당단백질을 가리킨다. 용어 "항체"에는 전 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체, 또는 그의 단편이 포함되며, 및 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 및 비인간 기원의 항체도 포괄한다. "모노클로날 항체"는 단일 부위 또는 항원 "결정기"에 지향된 고도로 특이적인 동종 항체 모집단이다. "폴리클로날 항체"에는 상이한 항원 결정기들에 지향된 이종 항체 모집단이 포함된다.
특정한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 비인간 기원의 항체, 좋기로는 쥐에 기원한 항체인 것이 바람직하다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체이다.
본 발명의 항체는 여하한 이소타입일 수 있다. 이소타입의 선택은 일반적으로 ADCC 유도와 같은, 소망되는 이펙터 기능에 의해 가이드된다. 예시적인 이소타입으로는 IgGl, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 들 수 있다. 인간 경쇄 불변부, 카파 또는 람다 중 어느 하나가 이용될 수 있다. 희망되는 경우, 본 발명의 CCR9 항체의 클래스를 공지 방법에 의해 스위칭시킬 수도 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 인간 기원의 항체 또는 인간화 항체이다.
본 발명의 항체는 CCR9에 특이적으로 결합한다. 본 명세서에서 용어 "CCR9" 또는 "CCR9 케모카인 수용체"는 케모카인 (C-C 모티프) 수용체 9를 가리킨다. CCR9를 지칭하는 또 다른 용어로는 GPR28; CDw199; GPR-9-6; CC-CKR-9를 들 수 있다. CCR9의 특이 리간드는 CCL25이다. 케모카인 수용체 CCR9는 대부분의 소장 고유판(lamina propria) 및 상피내 림프구와 말초혈액 림프구의 작은 서브세트에서 발현된다. 이 수용체는 대부분의 흉선세포, 소장 고유판 및 상피내 림프구, 말초혈액 림프구의 작은 서브세트 및 순환계에 존재하는 메모리 T 세포 α4β7 에서 발현된다. 이것은 또한 IgA를 분비하는 B 세포, 혈장모양 수지상 세포 상에서도 발현된다. CCR9 발현은 T 세포 급성 림프모구 백혈병 세포, 전립선암 세포, 유방암 세포, 난소암 세포, 췌장암 세포 및 흑색종 세포에서 보고되었다. CCR9 양성 세포는 급성 간 염증, 염증성 장질환 및 크론병의 병인학에 있어서 중요하다. 2개의 달리 스플라이스된 전사 변이체가 CCR9를 인코딩하는 유전자로서 설명되어, 이로부터 CCR9 이소폼 A 및 CCR9 이소폼 B가 얻어지고 이들은 2013년 9월 20일에 Swiss-Prot 수탁번호 NP_112477.1 및 NP_001243298.1로 각각 기탁되었다.
CCR9은 하나의 N-말단 세포외 도메인 (Nt), 7개의 막투과 도메인, 3개의 three 세포내 도메인s, 3개의 세포외 도메인 및 하나의 세포내 C-말단 도메인 (Ct)에 대응하는 15개의 도메인으로 조직된다 (도 2A). 특정한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 CCR9 이소폼 A (SEQ ID NO: 11)의 N-말단 세포외 도메인 (Nt)으로부터의 아미노산 2-22를 함유하는 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 항체는 다양한 포유동물 종으로부터의 CCR9 항원에 지향될 수 있다. 본 발명에 적합한 포유동물의 비제한적인 예로는 마우스, 래트, 래빗, 염소, 당나귀, 또는 비인간 영장류 예컨대 원숭이(예컨대 시노몰구스 또는 레수스 원숭이) 또는 유인원 (예컨대 침팬지) 및 인간을 들 수 있다. 특정한 일 구체예에서, CCR9는 인간 기원이다.
항체의 기초적인 구조 유닛은 테트라머를 포함하는 것으로 잘 알려져 있다. 각 테트라머는 각기 경쇄(25 KDa) 및 중쇄 (50-75 KDa)로 구성된 2개의 동일한 폴리펩타이드 사슬 쌍으로 구성된다. 각 사슬의 아미노-말단 영역은 항원 인식에 관여하는, 약 100-110 또는 그 이상의 아미노산들로 된 가변부를 포함한다. 각 사슬의 카르복시-말단 영역은 이펙터 기능을 매개하는 불변부를 포함한다. 경쇄와 중쇄의 각 쌍의 가변부는 항체의 결합부를 형성한다. 그러므로, 온전한 항체는 2개의 결합부를 갖는다. 경쇄는 κ 또는 λ로서 분류된다. 중쇄는 γ, μ, α, δ 및 ε로서 분류되며 이들에 의해 lgG, lgM, lgA, lgD 또는 lgE와 같은 항체의 이소타입이 각기 규정된다.
경쇄와 중쇄의 각 쌍의 가변부는 항체의 결합부를 형성한다. 이들은 상보성 결정영역(CDR)이라 칭해지는 3개의 초가변부에 의해 연결된 프레임워크(FR)이라 칭해지는 비교적 잘 보존된 영역으로 구성된 동일한 일반 구조를 갖는 것으로 특징지어진다 (Kabat et al., 1991, Sequencesof Proteins of Immunological Interest,5th ed., NIH Publication No. 91-3242,Bethesda, MD.; Chothia 및 Lesk, 1987, J MolBiol 196:901-17). 본 명세서에서 용어 "상보성 결정영역(complementarity determining region)" 또는 "CDR"은 항체에서 이 단백질이 항원의 형상을 보완하는 영역을 가리키는 것이다. 그러므로, CDR들은 단백질의 친화도(대략 결합 강도) 및 특정 항원에 대한 특이성을 결정한다. 각 쌍의 2개의 사슬의 CDR들은 프레임워크 영역에 의해 정렬되어, 특이적인 에피토프의 결합 기능을 획득한다. 결국, 중쇄와 경쇄 두 가지 모두는 3개의 CDR들, 즉 CDRH1, 각각 CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3에 의해 특징지어진다.
CDR 서열은 통상적인 기준, 본 발명에서 채택된 바와 같은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 제공된 넘버링에 따라 예컨대 IgBLAST 기준: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/ (Ye et al., 2013, Nucleic Acids Res 41 (Web Server issue:W34-40)에 의거하여 결정될 수 있으며, 또는 Chothia et al. (1989, Nature 342:877-83)에 의해 제공된 넘버링에 따라 결정될 수도 있다
본 명세서에서, 본 발명의 항체는 전장 항체(예컨대, IgG) 뿐만 아니라, 그의 항원-결합 단편, 예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 비인간 기원의 항체, 재조합 항체, 및 유전자조작기술에 의해 제조된 면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩타이드, 예컨대 단일 사슬 Fv (scFv), 다이아바디, 중쇄 또는 그의 단편, 경쇄 또는 그의 단편, VH 또는 그의 다이머, VL 또는 그의 다이머, 다이설파이드 브릿지에 의해 안정화된 Fv 단편(dsFv), 단일 사슬 가변부 도메인을 갖는 분자 (Abs), 미니바디, scFv-Fc, 및 항체 또는 목적하는 특이성의 항원 인식자리를 포함하는 면역글로불린 분자의 기타 변형된 입체배열을 모두 포괄한다. 본 발명의 항체는 또한 이중특이 항체일 수도 있다. 항체 단편은 항체 결합 단편을 지칭하는 것일 수 있다. 항체는 여하한 클래스의 항체, 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG (또는 그의 서브클래스), 및 IgM를 포함할 수 있으며, 항체는 특정 클래스의 것일 필요는 없다. 이에 더해, 본 발명의 항체는 치료제, 독소 등과 같은 추가 화합물에 컨쥬게이트될 수도 있다.
수많은 접근법들이 분자생물학과 유전자기술 예컨대 임상적 및 기타 용도를 위한 그의 특성을 향상시키기 위한 목적으로 면역글로불린 분자의 여러가지 상이한 변형체를 구축하기 위해 면역글로불린의 유전학과 구조에 관해 축적된 깊은 지식을 이용하고 있다. 이들 중 일부는 사용될 종에서 그 분자의 면역원성을 감소시켜, 결과적인 분자가 해당 종과 더욱 상동적이 되도록 하는 경향이 있다. 건강한 인간에서 비윤리적으로 허용가능한 절차를 피하면서 인간 기원의 mAbs를 얻기 위해 다양한 방법들이 이용되어 왔다. 다른 접근법에서는 예컨대 고체 종양 내에서의 해당 분자의 분포를 향상시키기 위해 분자 중량과 크기를 감소시킨다. 그 밖의 가능성으로는 두 개 이상의 표적 분자에 대한 결합 도메인 분자에서 컨쥬게이션시키거나 (이중특이 항체 또는 삼중특이 항체 등) 또는 항체 또는 단편을 목적하는 기능을 갖는 다른 분자, 예컨대 독소 물질, 호르몬, 성장인자, 면역조절제(면역억제제 또는 면역자극제), 세포성장 억제제 등과 컨쥬게이션시키는 것을 들 수 있다. 일반적으로 결과적인 모든 분자들은 항원-항체 결합의 높은 특이성과 친화도 특성을 부여하는, 항체의 가변부를 적어도 1개 유지한다.
이러한 항체들은 다양한 방법으로 제조될 수 있는데, 그 예로는 하이브리도마 배양, 세균 또는 포유동물 세포 배양체에서의 재조합 발현 및 트랜스제닉 동물에서의 재조합 발현을 들 수 있다. 특정 생산법의 선택과 관련하여 문헌상 풍부한 지침이 알려져 있으며, 예컨대 Chadd 및 Chamow, Curr. Opin.Biotechnol., 12:188-194 (2001)를 들 수 있다. 제조방법론의 선택은 소망되는 항체 구조, 항체 상의 탄수화물 모이어티의 중요성, 배양 및 정제 용이성 및 비용 등을 비롯한 몇 가지 인자에 의존한다. 다양한 많은 항체 구조가 표준발현기술을 이용하여 생산될 수 있으며 여기에는 전장 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab 및 Fv 단편, 및 상이한 종들의 성분들을 포함하는 키메라 항체가 포함된다. Fab 및 Fv 단편과 같이 크기가 작고 이펙터 기능이 없으며 제한적인 약동학 활성을 갖는 항체 단편들은 박테리아 발현계에서 생산될 수 있다. 단일 사슬 Fv 단편은 낮은 면역원성을 나타내며 혈액으로부터 신속히 소거된다.
특정한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 CCR9에 대한 결합능을 보유하는 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 단편이다. 상기 항체는 좋기로는 인간 또는 인간화 항체인 것이 바람직하다.
그러므로, 특정한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 인간 항체이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 인간화 항체이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 키메라 항체이다.
인간화 항체:
"인간화 항체( humanised antibody)"라 함은 모 항체(parent antibody)의 항원-결합 특성은 보유하지만, 인간에서 덜 면역원성인, 비인간 항체, 전형적으로는 쥐의 항체로부터 유도된 항체를 의미한다. 이것은 다양한 방법으로 수득가능한데, 그 예로는 (a) 비인간 가변 도메인 전체를 인간 불변부에 그래프팅하여 키메라 항체를 생산; (b) 비인간 상보성 결정영역(CDR들)만을 인간 프레임워크 및 중요한 프레임워크 잔기를 보유하거나 보유하지 않는 불변부에 그래프팅하는 것; 및 (c) 전체 비인간 가변 도메인을 이식하지만, 이들을 표면 잔기 대체에 의해 인간-유사 섹션으로 "은폐(cloaking)"시키는 것을 들 수 있다.
비인간 항체를 인간화시키는 방법이 기술 분야에 설명되어 있다. 좋기로는 인간화 항체는 비인간 기원의 아미노산 잔기 1개 이상이 도입되어 있는 것이 바람직하다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트(import)" 잔기라 칭해지며, 이들은 대체로 "임포트" 가변 도메인으로부터 취해진다.
인간화는 기본적으로, Winter와 공동연구자 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyenet al., Science, 239:1534-1536 (1988))의 방법에 따라, 인간 항체의 대응 서열을 초가변부 서열로 대체시킴으로써 수행가능하다. 실상, 인간화 항체는 전형적으로는 몇몇 초가변부 잔기와 가능하게는 몇몇 프레임워크 영역(FR) 잔기가 설치류 항체의 유사한 위치로부터의 잔기에 의해 치환되어 있는 인간 항체이다. 인간화 항체를 만드는데 사용될 경쇄 및 중쇄 양쪽 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원에 대한 특이성과 친화도를 보유하는 면역원성을 감소시키는데 있어 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏"이라 칭해지는 방법에 따라, 설치류 항체의 가변부 도메인의 서열을 공지의 인간 가변부 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 설치류의 그것과 가장 가까운 인간 서열을 그 인간화 항체에 있어 인간 프레임워크 영역(FR)로서 받아들인다(Suns et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothiaet al., J. Mol. Biol, 196:901 (1987)). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유도된 특정 프레임워크 영역을 이용하는 것이다. 몇가지 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 이용할 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Prestaet al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).
항체의 인간화에 있어서, 항원에 대한 높은 친화성 및 기타 호적한 생물학적 특성을 유지할 것 역시도 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해서는, 바람직한 방법에 따라, 모 서열과 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 다양한 컨셉트상의 인간화 산물 및 모 서열의 분석 공정에 의해 인간화항체를 제조한다.
이 접근법에서 항체를 인간과 보다 유사하게 만들기 위한 추가 단계는 소위 영장류화(primatised) 항체, 즉 원숭이 (또는 기타 영장류) 항체, 특히 시노몰구스 원숭이 항체의 가변부 중쇄 및 경쇄를 함유하도록 조작되고, 및 인간 불변 도메인 서열, 좋기로는 인간 면역글로불린 감마 1 또는 감마 4 불변 도메인 (또는 PE 변이체)를 함유하는, 재조합 항체를 제조하는 것이다. 이러한 항체의 제조는 문헌[Newman et al., Biotechnology, 10: 1458-1460 (1992); US 5,658,570 및 US 6,113,898]에 잘 설명되어 있다. 이들 항체들은 인간 항체에 대해 고도의 상동성, 즉 85-98%를 나타내고, 인간 이펙터 기능을 보이며, 면역원성이 감소되고, 인간 항원에 대해 높은 친화도를 나타낼 수 있는 것으로 보고되었다. 재조합 항체를 생성하는 또 다른 고도로 효과적인 수단이 문헌 [Newman, Biotechnology, 10: 1455-1460 (1992)]에 설명되어 있다.
인간 항체 (Human antibodies):
"인간 항체"라 함은 공지의 표준법에 의해 생산된, 인간 경쇄 및 중쇄 뿐 아니라 불변부를 모두 함유하는 항체를 의미한다.
인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체를 만들 수 있다. 예를 들어, 이제는 면역화 후, 내인성 면역글로불린 생산 없이 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예컨대 마우스)을 생산하는 것이 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결부 PH 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체 생산이 완전히 억제되는 것으로 설명되었다. 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 이러한 생식계열 돌연변이 마우스에 전달하면 면역화 후 인간 항체의 생산이 결과된다. 예컨대, 문헌 [Jakobovitset al., Proc. Mad. Acad. Sci. USA, 90:255 1 (1993); Jakobovitset al., Nature, 362:255-258 (1993), Lonberg, 2005, Nature Biotech. 23:1117-25] 참조.
인간 항체는 또한 인 비트로 활성화된 B 세포 또는 그의 면역계가 인간 세포에 의해 재구성된 SCID 마우스에 의해서도 제조될 수 있다.
일단 인간 항체가 수득되면, 그의 코딩 DNA 서열을 분리, 클로닝하여 적절한 발현계, 즉 세포주, 좋기로는 포유동물 세포주에 도입할 수 있으며 이 세포주는 상기 DNA 서열을 발현하여 이를 배양 배지에 분비하고 이로부터 항체를 분리할 수 있다.
항체 단편:
항체 단편은 예컨대, Fab, F(ab')2, Fab' 및 scFv와 같은 항체의 단편이다. 항체 단편을 생산하기 위해 다양한 기술들이 개발되어 왔다. 전통적으로 이 단편들은 온전한 항체를 단백질분해 절단하여 유도하였지만, 최근에는 재조합 숙주 세포를 이용하여 이들 단편들을 직접 생산할 수 있다. 다른 구체예에서는, 선택된 항체는 부가적으로 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있는 단일사슬 Fv (scFv) 단편이다.
항체를 파파인 분해하면 "Fab" 단편이라 칭해지는 2개의 동일한 항원-결합 단편들이 생산되며, 이들 각각에는 단일 항원-결합부 및 잔여 "Fc" 단편이 있는데 이 명칭은 쉽게 결정화할 수 있는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리에 의해서는 2개의 항원-결합부를 갖는 F(ab')2이 생성되며이 단편은 여전히 항원과 가교할 수 있다.
"Fv"는 완전한 항원-인식부 및 항원-결합부를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 가변 도메인이 밀접하게, 비공유적으로 회합된 다이머로 이루어져있다. 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역이 상호반응하여 VH-VL 다이머 표면에 항원-결합부를 규정하는 것이 이 배열에서 일어난다. 집합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 대해 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 오직 3개의 초가변 영역을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 비록 전체 결합부에 비해 친화도가 낮기는 하지만, 항원을 인식 및 항원과 결합하는 능력이 있다.
Fab 단편 역시 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인(CHI)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 시스테인을 1개 이상 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇몇 잔기가 첨가되었다는 점에서 Fab 단편과 구별된다. 본 명세서에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 적어도 1개의 유리 티올기를 산생하는 Fab'를 부르는 호칭이다. F(ab')Z 항체 단편은 원래 힌지 시스테인을 그 사이에 갖는 Fab' 단편 쌍들로서 제조되었다. 기타 항체 단편의 화학적 커플링 역시도 알려져 있다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 여기서 이들 도메인들은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 좋기로는, Fv 폴리펩타이드는 scFv로 하여금 항원 결합에 소망되는 구조를 형성할 수 있게 하는 폴리펩타이드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함하는 것이 바람직하다. scFv에 대한 검토를 위해서는 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, N.Y., pp. 269-315 (1994)]를 참조할 수 있다.
용어 "다이아바디(diabodies)"는 2개의 항원-결합부를 갖는 작은 항체 단편을 가리키는데, 이들 단편들은 동일한 폴리펩타이드 사슬(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 단편들이다. 동일 사슬 상의 2개의 도메인들 간의 페어링을 허락하도록 매우 짧은 링커를 사용함으로써, 이들 도메인들을 다른 사슬의 상보적인 도메인들과 강제로 쌍을 이루게 하여 2개의 항원-결합부를 만들어낸다. 다이아바디는 예컨대 EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 보다 상세히 설명되어 있다.
본 발명에 포함되는 CCR9에 결합하는 항체의 기능성 단편들은 이들이 유래한 전장 항체의 적어도 하나의 결합 기능 및/또는 조절 기능을 보유한다. 바람직한 기능성 단편들은 대응하는 전장 항체의 항원-결합 기능 (예컨대, 포유동물 CCR9에 결합하는 능력)을 유지한다.
이중특이 항체(Bispecific antibodies):
이중특이 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프들에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이 항체는 CCR9의 2가이 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이러한 다른 항체들은 CCR9에 결합할 수 있고 제2의 세포 표면 마커에도 결합할 수 있다. 이중특이 항체들은 또한 CCR9-발현 세포로 세포독성 물질을 국소화시키는데도 이용될 수 있다. 이러한 항체들은 항-CCR9-결합 암(arm) 및 세포독성 물질(예컨대 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사능활성 동위원소)에 결합하는 암을 갖는다. 이중특이 항체들은 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다 (예컨대 F(ab)2 이중특이 항체, 미니바디, 다이아바디).
여러가지 상이한 접근법에서, 소망되는 결합 특이성을 갖는 항체 가변부 도메인(항체-항원 결합 자리)을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 이러한 융합은 좋기로는 힌지부, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불면 도메인과의 융합인 것이 좋다. 융합체의 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 요구되는 자리를 함유하는 제1 중쇄 불변부 (CHI)를 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 소망되는 경우, 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 DNA가 별도의 발현 벡터 내로 삽입되고, 적절한 숙주 생물 내로 코-형질감염된다. 이에 의해 제조에 이용되는 이들 3 가지 폴리펩타이드 사슬의 불균일한 비율이 최적 수율을 제공하는 구체예에서 이들 3 가지 폴리펩타이드 단편들의 상호 비율을 조절하는데 있어 커다란 유연성이 제공된다. 그러나, 동일한 비율의 적어도 2개의 폴리펩타이드 사슬의 발현이 높은 수율로 이어지거나 또는 그 비율이 별다른 유의성을 갖지 않을 경우라면, 2개 또는 3개 모두의 폴리펩타이드 사슬에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다.
항체 단편들로부터 이중특이 항체를 생성하기 위한 기술 역시 문헌에 설명되어 있다. 예를 들어, 이중특이 항체는 화학적 결합을 이용하여 제조될 수 있다.
CCR9에 결합하는 능력이 있는 단편들 역시도 통상의 기술자에게 공지인 통상의 방법에 의해 수득될 수 있다. 전술한 방법에는 목적하는 모노클로날 항체의 폴리펩타이드 사슬 (또는 그의 단편)을 인코딩하는 DNA를 분리하고 재조합 DNA 기술에 의해 DNA를 조작하는 것이 포함된다. 하나 이상의 아미노산을 첨가, 제거 또는 치환하기 위해, 목적하는 다른 DNA, 또는 변경된 DNA (예컨대 돌연변이에 의해)를 생성시키는데 DNA를 이용할 수 있으며, 예컨대 항체(예컨대 중쇄 또는 경쇄, 가변부 또는 항체 전체)의 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 DNA를 CCR9로 면역화된 마우스로부터 쥐의 B 세포로부터 분리시킬 수 있다. DNA를 분리하고 예컨대 PCR과 같은 종래 방법에 의해 증폭시킬 수 있다.
단일-사슬 항체는 아미노산 브릿지에 의해 중쇄 및 경쇄 (Fv 영역)의 가변부를 결합함으로써 통상적인 방법으로 얻을 수 있다. scFvs는 가변부들(VL 및 VH)의 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA들 간의 링커 펩타이드를 인코딩하는 DNA를 융합시킴으로써 제조가능하다. scFvs의 제조는 많은 문헌들, 예컨대 미국특허 4,946,778, Bird (Science 242: 423, 1988), Huston et al. (Proc. Natl. AcadSci USA 85: 5879, 1988) 및 Ward et al. (Nature 334: 544, 1989)에 설명되어 있다.
통상의 기술자라면 폴리펩타이드의 주요 서열(primary 서열)가 변경된다 해도, CCR9에 대한 항체 결합 능력이 유지되도록, 본 발명의 항체의 아미노산 서열이 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 상기한 치환은 보존적 치환일 수 있고 일반적으로 하나의 아미노산을 이와 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환 (예컨대 글루탐산(음하전된 아미노산)을 아스파르트산으로 치환시키는 것은 보존적 아미노산 치환이다)하는 것을 유도하기 위해 일반적으로 적용된다.
본 발명은 또한 발명의 상세한 설명에서 동정되고, 본 발명의 범위에 포함되는, 중쇄 및 경쇄의 CDRemfdml 서열을 결정하는 것에 관한 것이기도 하다. 본 발명에서 사용된 바와 같이 용어 "변이체(variant)" 또는 "기능성 변이체(functional variant)"는 그의 동족(cognate) 항원에 결합하는 그의 능력, 즉 친화성/결합능 및/또는 특이성/선택성을 실질적으로 유지하는 실질적으로 유사한 서열을 가리킨다. 변이체는 일반적으로 천연 서열과 정성적 관점에서 동일한 생물학적 활성을 갖는다. CDR의 변이체는 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함하는, 본 발명에서 동정된 폴리펩타이드 서열 유도체일 수 있다. 본 발명에 따라, SEQ ID NO: 1 내지 10 중 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR의 변이체에는 SEQ ID NOs: 1 내지 10 중 하나에 기재된 대응하는 아미노산 서열과 적어도 약 70% 서열 동일성, 좋기로는, SEQ ID NOs: 1 내지 10 중 하나에 기재된 대응하는 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR이 포함된다. 또한 변이체는 CDR의 N-말단, 또는 C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 양쪽 모두에 적어도 1 아미노산, 또는 적어도 2 아미노산, 또는 적어도 3 아미노산, 또는 적어도 4 아미노산, 또는 적어도 5 아미노산, 또는 적어도 6 아미노산, 또는 적어도 7 아미노산, 또는 적어도 8 아미노산, 또는 적어도 9 아미노산, 또는 적어도 10 아미노산 또는 그 이상의 아미노산을 부가하는 것을 상정할 수도 있다. 마찬가지로, 변이체는 CDR의 N-말단, 또는 C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 양쪽 모두에서 적어도 1 아미노산, 또는 적어도 2 아미노산, 또는 적어도 3 아미노산, 또는 적어도 4 아미노산, 또는 적어도 5 아미노산, 또는 적어도 6 아미노산, 또는 적어도 7 아미노산, 또는 적어도 8 아미노산, 또는 적어도 9 아미노산, 또는 적어도 10 아미노산 또는 그 이상의 아미노산의 결실을 포함하는 것을 상정할 수도 있다. 본 발명에 따른 항체의 기능성 변이체는 좋기로는 그의 동계 표적에 대한 결합능이, 상기 항체의 동계 표적에 대한 결합능의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%인 것이 바람직하다.
본 발명의 항체의 CCR9에 대한 결합능은 기술분야에 알려진 여러가지 분석법에 의해 결정할 수 있다. 좋기로는, 하이브리도마 세포의 클론에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법 또는 인 비트로 결합 분석법, 예컨대 방사능면역분석법 (RIA), 효소-결합 면역흡착분석법 (ELISA),s표면 플라즈몬 공명법 또는 by 면역형광 기술 such as 면역조직화학 (IHC), 형광현미경 또는 유세포분석법에 의해 결정한다.
본 발명에 설명된 항체의 아미노산 서열 변형(들)을 고려한다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 기타 생물학적 특징들을 개선시키는 것이 요망될 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 인코딩하는 핵산에 적절한 뉴클레오타이드 변경을 도입하거나 또는 펩타이드 합성에 의해 제조한다. 이러한 변형에는 예컨대, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기들을 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환하는 것이 포함된다. 최종 구조물이 소망되는 특징을 보유하기만 한다면, 최종 구조물을 획득하기 위해 어느 조합으로든 결실, 삽입 및 치환시킬 수 있다. 아미노산 변경은 또한 글리코실화 자리의 수 또는 위치 변경과 같이, 단백질의 번역후 공정에 변경을 가할 수 있다.
아미노산 서열 삽입에는 길이 면에서 하나의 잔기로부터 수백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드의 아미노- 및/또는 카르복실-말단에의 융합 뿐만 아니라, 단일 또는 복수개의 아미노산 잔기의 서열내 삽입이 포함된다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 펩타이드 또는 세포독성 폴리펩타이드에 융합된 항체 폴리펩타이드 사슬이 포함된다. 그 밖의 삽입형 분자 변이체에는 효소 또는 그의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단에 대한 융합이 포함된다.
또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체들은 분자 내에 다른 잔기에 의해 대체된 아미노산 잔기를 적어도 한 개 갖는다. 항체의 치환 돌연변이에 있어 가장 중요한 관심 대상 자리는 초가변부를 포함하지만, FR 변경 역시도 고려된다.
항체의 아미노산 변이체의 또 다른 유형은 항체의 본래의 글리코실화 패턴을 변경하는 것이다. 변경(altering)이라 함은 분자에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 결실, 및/또는 그에 존재하지 않는 글리코실화 자리를 하나 이상 부가하는 것을 의미한다. 폴리펩타이드의 글리코실화는 전형적으로 N-링크된 것이거나 O-링크된 것이다. N-링크되었다 함은 아스파라긴 잔기의 탄수화물 모이어티에 대한 부착을 가리킨다. 트리펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 X는 프롤린을 제외한 여하한 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 그러므로, 이들 트리 펩타이드 서열 중 어느 것이든 폴리펩타이드에 존재하면 잠재적인 글리코실화 자리가 만들어진다. O-링크된 글리코실화라 함은 단당류 또는 단당류 유도체인 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스가 히드록시아미노산, 가장 흔하게는 세린 또는 트레오닌에 부착하는 것을 칭한다 (다만 5-히드록시프롤린 또는 히드록시라이신 역시도 사용될 수 있다). 글리쿠실화 자리를 항체에 부가하는 것은 전술한 트리펩타이드 서열들 (N-링크된 글리코실화 자리의 경우) 중 하나 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변형시킴으로써 간편하게 달성된다. 이러한 변경은 또한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 자리를 본래 항체의 서열 (O-링크된 글리코실화 자리의 경우)에 부가 또는 치환함으로써 이루어질 수도 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체를 인코딩하는 핵산 분자는 기술 분야에 공지인 다양한 방법에 의해 제조된다. 이 방법들의 예로는 천연 서열로부터의 분리 (자연발생적인 아미노산 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오타이드-매개된 (또는 자리-지향된) 돌연변이에 의한 제조, PCR 돌연변이 유발 및 앞서 제조된 변이체의 카세트 돌연변이유발 또는 항체의 비변이체 버젼을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항체를 변형시켜 이펙터 기능을 향상시키는 것, 예컨대 항체의 ADCC 및/또는 CDC를 항샹시키는 것이 요망될 수 있다. 이것은 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다.
당단백질 예컨대 항체의 아미노산 백본에 첨가된 글리코실기는 몇몇 단당류 또는 단당류 유도체에 의해 형성되어 다른 포유동물 또는 조직으로부터의 세포에서 생산된 동일한 항체와 다르르 수 있다. 이에 더해, 글리코실기의 상이한 조성은 항체의 항원-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)를 매개하는데 있어서 그 강도에 영향을 미칠 수 있다. 그러므로, 상이한 여러가지 소스로부터의 항체의 글리코실화 패턴을 연구함으로써 이러한 특성을 향상시키는 것이 가능하다. 이러한 접근법의 일례가 문헌 [Niwaet al., Cancer Res. 2004 Mar 15;64(6):2127-33]에 설명되어 있다.
따라서, 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 퓨코스를 감소시켜 그에 따라 ADCC를 향상시키도록 글리코-조작된다. 퓨코실 잔기가 결여된 항체는 US8207303에 따라 제조한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 보체 활성화를 증강시키도록 조작되었다.
별법으로 또는 이에 더해, 시스테인 잔기(들)을 Fc 영역에 도입하여, 이 영역에서 사슬간(inter사슬) 다이설파이드 결합을 형성할 수 있다. 이렇게 생성된 호모다이머 항체는 향상된 내면화능 및/또는 증가된 보체-매개된 세포 사멸 및 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다 문헌 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)] 참조. 항종야 활성이 증가된 호모다이머 항체들은 또한 문헌 [Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 이종 이기능 가교제를 이용하여 제조될 수도 있다. 별법으로, 2개의 Fc 영역을 갖는 항체를 조작함으로써 향상된 보체 용해능 및 ADCC능을 갖도록 할 수 있다. 문헌[Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:2 19-230 (1989), 및 Davis et al., Protein Eng Des Sel 23:195-202 (2010)] 참조.
항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 US 5,739,277에 설명된 바와 같이, 구제(salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체(특히 항체 단편)에 통합시킬 수 있다. 본 발명에서 용어 "구제(salvage) 수용체 결합 에피토프"라 함은 IgG 분자의 인 비보 혈청 반감기를 증가시키는데 책임이 있는 IgG 분자(예컨대, IgGI, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 가리킨다.
좋기로는, 본 발명의 항체, 예컨대, 모노클로날 항체, scFv 단편, Fab 단편, 또는 본 발명의 모노클로날 항체로부터 유래된 그 밖의 결합 조성물은 CCR9 수용체에 대해 높은 친화도를 갖는다. 모노클로날 항체 및 관련 분자의 CCR9 수용체에 대한 친화도는 통상적인 기술에 의해 측정가능하다.
항원에 대한 항체의 친화성은 그 항원과 결합하는 항체의 효능으로서 정의될 수 있다. 항원-항체 결합은 가역적 결합이며 따라서, 2가지 분자가 모두 동일한 용액 중에 충분한 시간 동안 희석될 경우, 이 용액은 항원-항체 복합체(AgAb), 유리 항원(Ag) 및 유리 항체(Ab)의 농도가 일정한 평형상태에 도달한다. 그러므로 [AgAb]/[Ag]*[Ab] 비율 역시도 Ka라 명명된 회합 상수로서 정의되는 상수이며 이것은 몇몇 항체들의 대응하는 에피토프에 대한 친화성을 비교하는데 이용될 수 있다.
친화도를 측정하는 흔한 방법은 결합 곡선을 실험적으로 구하는 것이다. 이것은 유리 항체의 농도의 함수로서 항체-항원 복합체의 양을 측정하는 것을 포함한다. 이 측정을 수행하는 2 가지 흔한 방법이 있다: (i) 스캣챠드(Scatchard) 분석을 이용하는 전통적인 평형 투석법 및 (ii) 항체 또는 항원이 전도성 표면에 결합되어 항체 또는 항원의 결합이 각기 이 표면의 전기특성에 영향을 미치는 것인 표면 플라즈몬 공명법이 그것이다.
종종 예컨대 본 발명의 항체 및 그의 기능성 변이체의 경우처럼 동일한 에피토프를 연결하는 2개 이상의 항체들의 상대적인 친화도를 측정하기만 하면 되는 경우가 있다. 이 경우 항체들 중 하나의 계대희석물을 일정량의 리간드와 함께 인큐베이션하고, 적절한 트레이서로 표지된 제2 항체를 첨가하는 경쟁적 분석법이 수행될 수 있다. 이 mAb의 결합 후 결합되지 않은 항체들을 세척하고, 제2 항체의 농도를 측정하여 제1 항체의 농도에 상대적으로 플로팅하고 스캣챠드법으로 분석한다. 이에 대한 예가 문헌 [Tamura et al., J. Immunol. 163: 1432-1441 (2000)]에 설명되어 있다. 별법으로, 본 발명의 경우에서와 같이 리간드가 막 결합 항원인 경우, 가용성 리간드가 상기 항원을 발현하는 세포 표면에서 항체에 나타날 수 있다. 그러므로, 항체의 양을 다양화하여 일정량의 리간드와 인큐베이션시킨다.
CCR9에 대한 본 발명의 항체의 친화도는 적어도 10-7 M, 적어도 10-8 M, 적어도 10-9 M, 적어도 10-10 M, 적어도 10-11 M 또는 적어도 10-12 M이다.
본 발명의 핵산, 발현 카세트, 벡터 및 세포
또 다른 측면에서, 본 발명은:
i) 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산, 및
ii) i)에서 정의된 핵산에 상보적인 핵산.
으로 이루어진 군으로부터 선택된, 핵산 (이하, "본 발명의 핵산"이라 칭함)에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어 "핵산"은 포스포디에스테르 결합에 의해 링크된 뉴클레오타이드라 칭해지는 모노머들의 반복에 의해 형성된 폴리머를 가리킨다. 이 용어에는 DNA 및 RNA가 모두 포괄된다.
본 발명의 항체의 상세에 대하여는 이전에 언급된 바 있으며 본 발명에 참조 병합된다.
특정한 일 구체예에서, 본 발명의 핵산은: a) 중쇄 내에 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 및 b) 경쇄 내에 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항체를 인코딩한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산은 항체 comprising: a) 중쇄 내에SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1, SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3, 및 b) 경쇄 내에 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3을 포함하는 항체를 인코딩하되, 상기 항체는 하기 실시예에서 91R mAb로서 동정된 항체에 대응하는 것이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산은: a) 그 중쇄 내에 SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고, 및 b) 그 경쇄 내에 SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항체를 인코딩한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산은: a) 그 중쇄 내에 SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1, SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3을 포함하고, 및 b) 그 경쇄 내에 SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, SEQ ID NO: 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 aSEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3을 포함하는 항체를 인코딩하며, 여기서 상기 항체는 하기 실시예에서 92R mAb로서 동정된 항체에 대응하는 것이다.
본 발명의 상기 핵산은 본 발명의 항체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 위해 작동적으로 링크된 조절 서열을 함유할 수 있으며, 그에 따라, 이하에서 "본 발명의 유전자 구조물"이라 칭해지는 유전자 구조물(gene construct)을 형성한다. 본 명세서에서 용어 "작동적으로 링크된(operatively linked)"이라 함은 본 발명의 핵산 서열에 의해 인코딩된 항체가 발현 조절 또는 제어 서열의 조절 하에 올바른 리딩 프레임에서 발현됨을 의미한다. 그러므로, 또 다른 측면에서, 본 발명은 발현 조절 서열에 작동적으로 링크된 유전자 구조물을 포함하는, 이하에서 "본 발명의 발현 카세트"라 칭하는 발현 카세트를 제공한다. 본 발명의 유전자 구조물은 종래기술에 널리 알려진 기술을 이용하여 수득될 수 있다(Sambrook et al., 2001 "Molecular cloning: to Laboratory Manual", 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3 참조.
조절 서열(control 서열)은 전사 및 적절한 경우, 상기 항체의 번역을 조절 및 제어하는 서열로서, 프로모터 서열, 전사 조절자 인코딩 서열, 리보좀 결합 서열 (RBS) 및/또는 전사 종결 서열이 이에 포괄된다. 본 발명의 발현 카세트는 부가적으로 프로모터 서열에 인접하거나 멀리 떨어져 위치할 수 있고, 그로부터의 전사를 증가하는 기능을 할 수 있는 인핸서를 부가적으로 포함할 수 있다. 특정한 일 구체예에서, 상기 발현 조절 서열은 세균 등과 같은 원핵세포 및 생명체에서 기능한다. 반면 또 다른 특정 구체예에서, 상기 발현 조절 서열은 예컨대 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 세포 등과 같은 진핵 세포 및 생명체에서 기능한다.
이용가능한 여하한 프로모터들을 이 방법론에 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 핵산 구조물에 사용되는 프로모터는 형질감염될 특이적인 세포모집단에서 활성적이다. 본 발명의 발현 카세트에 존재할 수 있는 예시 목적의 비제한적인 보편적인(ubiquitous) 프로모터의 예로는 인간 시토메갈로바이러스 프로모터(hCMV), SV40프로모터, EF1-alpha 프로모터 및 유비퀴틴 프로모터 C를 들 수 있다. 알부민과 같이 세포-유형 특이적인 프로모터 및/또는 조직 특이적인 프로모터의 설명목적의 비제한적인, 예로는 간에 특이적인 것 [[Pinkert et al.(1987) Genes Dev1:268-277], 림프구-특이적 프로모터[Calame et al.; (1988) Adv.Immunol. 43:235-275], 특히 T 세포 수용체의 프로모터[Winoto et al.(1989) EMBO J.8:729-733] 및 면역글로불린[Banerji et al.(1983) Cell 33729-740], 뉴런-특이적인 프로모터 에컨대 뉴로필라멘트 프로모터[Byrne et al.(1989) Proc. Natl. Acad. SciUSA86:5473-5477], 췌장-특이적 프로모터[Edlunch et al.(1985) Science 230:912-916] 또는 유선-특이적 프로모터 예컨대 유청 프로모터 (US Patent No.4,873,316 및 EP No.264,166)를 들 수 있다. 발현 카세트CAG-GS는 닭의 β-액틴의 프로모터인 CMV 인핸서 요소 및 전사후 조절 요소(WPRE) 바이러스 우드척 간염 (Woodchuck Hepatitis Virus, WHP)로 구성된다 [Niwa et al.(1991)Gene108:193-9]. 프로모터와 이 요소와의 조합은 인 비보에서 트랜스유전자의 높은 발현 수준에 유리하다.
본 발명의 발현 카세트가 상기 발현 카세트에 의해 형질전환된 숙주 세포를 선택할 수 있게 해주는 모티프 또는 표현형을 인코딩하는 유전자나 마커를 추가로 포함하는 것이 유리하다. 본 발명의 발현 카세트 내에 존재할 수 있는 상기 마커의 예시적인 예로는 항생제 내성 유전자, 독성 화합물에 대한 내성 유전자를 들 수 있고, 대체로, 유전적으로 형질전환된 세포를 선택할 수 있게 해주는 것이면 무엇이든 무방하다.
본 발명의 유전자 구조물 또는 본 발명의 발현 카세트는 적절한 벡터 내로 삽입될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 유전자 구조물 또는 상기 발현 카세트를 포함하는, 이하에서 "본 발명의 벡터"라 칭하는 발현 벡터와 같은 벡터에 관한 것이다. 벡터의 선택은 이것이 후속적으로 도입될 숙주 세포에 따라 달라진다. 일례로, 상기 핵산 서열이 삽입될 벡터는 플라스미드이거나 또는 숙주 세포에 도입될 경우, 상기 세포의 게놈 내로 통합되거나 되지 않는 벡터일 수 있다. 이 벡터의 수득은 통상의 기술자에게 알려진 통상의 방법에 의해 수행가능하다(Sambrook et al. 2001, cited supra). 특정한 일 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 동물 세포를 형질감염시키는데 유용한 벡터이다.
상기 벡터는 상기 벡터에 의해 형질전환, 형질감염 또는 감염되기 쉬은 세포들을 형질전환, 형질감염 또는 감염시키는데 이용되리 수 있다. 이러한 세포들은 원핵 또는 진핵세포일 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 벡터에 의해 형질전환, 형질감염 또는 감염된 이하에서 "본 발명의 세포"라 칭해지는 세포에 관한 것이다. 상기 형질전환된 세포, 형질감염된 세포 또는 감염된 세포는, 따라서, 본 발명의 핵산, 본 발명의 유전자 구조물 또는 본 발명의 발현 카세트 또는 벡터를 포함한다.
형질전환된 세포, 형질감염된 또는 감염된 세포는 통상의 기술자에게 공지인 통상적인 방법으로 수득가능하다(Sambrook et al.2001, 상기문헌). 본 발명을 수행하는데 적합한 세포들로는 포유동물, 식물, 곤충, 진균 및 세균 세포를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 세균 세포의 비제한적인 예로는 그램 양성 세균 예컨대 바실러스 속, 스트렙토마이세스 속 및 스타필로코커스 속에 속하는 종들, 그램-음성 세균 예컨대 에스케리치아 속 및 슈도모나스 속의 세포를 들 수 있다. 진균 세포는 좋기로는 사카로마이세스, 피치아 파스토리스 및 한세뉼라 폴리모르파와 같은 효모 세포가 바람직하다. 식물 세포에는 곡물과 같은 작물, 약용, 관상용 또는 구근 세포가 포함된다. 본 발명에 적합한 포유동물 세포로는 상피세포주, 골육종 세포주, 신경모세포종 세포주, 상피암종, 신경아교세포, 간세포주, CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포, COS 세포, BHK 세포, HeLa세포, 911 세포, AT1080세포, A549 세포, 293 및 293T세포, PER.C6세포, NTERA-2 인간 ECCs 세포, mESCs 라인의 D3세포, 인간 배아줄기세포 예컨대 HS293, hMSCs 및 BGV01, SHEF1, SHEF2 및 HS181, NIH3T3세포, REH 및 MCF-7세포를 들 수 있다.
특정한 일 구체예에서, 상기 세포는 적절한 벡터에 의해 형질전환, 형질감염 또는 감염된 동물 세포이며 상기 형질전환, 형질감염 또는 감염된 동물 세포는 본 발명의 항체를 발현할 수 있음으로 해서, 상기 벡터는 동물 세포에서 본 발명의 항체를 발현하는데 이용될 수 있다. 용어 "항체" 및 그의 상세는 본 발명의 항체와 관련하여 전술된 바 있으며 본 발명의 핵산, 발현 카세트, 벡터 및 세포와 관련하여 사용되는 경우에도 동일한 의미로 사용된다.
본 발명의 핵산, 유전자 구조물, 발현 카세트, 벡터 또는 세포를 이용하여 본 발명의 항체를 생산할 수 있다. 특정한 일 구체예에서, 본 발명의 핵산, 유전자 구조물, 발현 카세트, 벡터 또는 세포에 의해 발현되거나 생산된 본 발명의 항체는 실시예에서 91R mAb로서 동정된 항체이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 실시에에서 92R mAb로서 동정된 항체이다.
용어 "본 발명의 세포"는 광의로, 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포도 포괄한다. 본 명세서에서 용어 "하이브리도마( hybridoma )"는 항체 사슬 합성 부재시 특이 항체를 생산하는 B 세포를 조직 배양체에서 성장하는 그의 능력 및 항체 사슬 합성의 부재에 대해 선택된 골수종 (B 세포 암) 세포를 융합시켜 형성된 하이브리드 세포를 가리킨다. 하이브리도마에 의해 생산된 항체는 대체로 단일 특이성을 가지므로 모노클로날 항체이다 (폴리클로날 항체와 대조됨). 모노클로날 항체의 생산은 1975년 Cesar Milstein 및 Georges J. F. Koehler에 의해 발명되었다 (Koehler 및 Milstein, 1975, Nature 256:495-7).
그러므로, 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 항체의 생산을 허용하는 조건 하에서 본 발명의 세포를 성장시키는 것을 포함하는, 본 발명의 상기 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 세포 배양을 최적화하기 위한 조건은 사용되는 세포에 따라 다르다. 소망되는 경우, 본 발명의 항체를 생산하는 방법은 상기 항체를 분리 및 정제하는 것을 더 포함한다.
본 발명의 진단/예후 탐지 방법
본 발명의 항체는 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 인 비트로 진단 및/또는 예후 탐지에 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 인 비트로 진단 및/또는 예후 탐지를 위한 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다.
또한, 또 다른 측면에서, 본 발명은 대상자에 있어서 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 인 비트로 진단 및/또는 예후 탐지를 위한 인 비트로 방법에 관한 것으로, 이하에서는 이를 "본 발명의 제1 방법"이라 칭하며 이 방법은:
a) 본 발명의 항체를 상기 대상자로부터의 세포를 포함하는 샘플과 접촉시키는 것;
b) 상기 대상자로부터의 상기 샘플에서 CCR9를 검색 및/또는 정량하는 것;
c) 상기 대상자로부터의 상기 샘플에서 검색된 상기 CCR9의 존재여부 및/또는 양 및/또는 분포를 대조군 샘플에서 검색된 CCR9의 그것과 비교하는 것; 및
d) 얻어진 결과를 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 존재와 결부시키는 것
을 포함한다.
본 발명의 제1 방법은 매우 민감하고도 특이적인 방법이며, 예컨대 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태를 갖거나, 세포의 주어진 모집단 또는 부분모집단에서 CCR9 양성 세포의 수가 증가한 대상자 또는 개체가 절대적인 측면에서건 또는 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 이들 질병 또는 상태의 임상 이력을 갖지 않는 대상자 또는 CCR9를 발현하지 않는 세포(음성 대조군)의 배양체로부터의 대조군 샘플에서의 대응하는 수준과 비교하여서 비교한다.
용어 "항체" 및 "CCR9"는 본 발명의 항체와 관련하여 앞서 자세히 설명되었고 그들의 특징 역시 본 발명의 항체와 관련하여 앞서 자세히 설명되었으며, 본 발명의 제1 방법과 관련하여서도 동일한 의미로 사용된다.
용어 "대상자" 또는 "개체"는 포유동물 종의 일원을 가리키며, 비제한적인 예로서 가축 동물, 영장류 및 인간을 들 수 있다; 대상자는 연령과 인종을 불문하고 남성 또는 여성 인간인 것이 바람직하다.
본 발명의 제1 방법을 실시하기 위해, 생물학적 샘플과 같은 세포를 포함하는 샘플을 연구 대상자로부터 수득한다. 본 명세서에서 용어 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 상이한 유형의 생물학적 플루이드, 영향을 받은 장기의 조직 절편 등을 포함한다. 특정한 일 구체예에서, 샘플은 연구 대상자로부터의 세포를 포함한다. 상기 샘플의 설명목적 상의 비제한적인 예로는 복막액, 흉수, pleural fluid, 관절 낭액, 뇨, 타액, 혈액, 정액, 혈청 등의 다양한 생물학적 플루이드를 들 수 있다. 이들 생물학적 플루이드 샘플은 이 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 통상적인 방법으로 수득가능하다. 별법으로, 상기 샘플은 예컨대 림프샘, 유방, 전립선, 피부, 소장, 대장, 장, 췌장, 난소, 폐, 방광, 신장 등 영향을 받은 장기 조직 샘플의 절편일 수 있으며 생검, 방광경 검사, 외과수술적 절제 등의 수단으로 통상적인 방법에 의해 얻어질 수 있고 조직학 목적에서 채취된 냉동 절편일 수 도 있다.
분석하고자 하는 샘플은 이전에 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태에 걸린 것으로 진단을 받거나 받지 않은 대상자, 또는 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태에 대해 치료를 받고 있거나 이전에 받은 적이 있는 대상자로부터 수득가능하다.
본 발명의 제1 방법의 단계 (a)에 따라, 본 발명의 항체를 통상의 기술자에게 공지인 적절한 조건 하에서 연구 대상자로부터의 샘플과 접촉시킨다.
통상의 기술자는 본 발명의 제1 방법의 단계 (b)를 수행하는데 적합한, 샘플 중의 CCR9을 검색 및/또는 정량하기 위한 통상적인 여러 가지 방법을 이용할 수 있다. 특히 유용한 것은 면역학적 방법이다. 따라서, 특정한 일 구체예에서, 본 발명의 제1 방법은 본 발명의 항체를 상기 샘플 내의 CCR9를 검색 및/또는 정량하기 위해 상기 개체로부터의 종양 세포를 포함하는 샘플과 접촉시키는 것을 포함한다.
이러한 분석에 사용될 본 발명의 항체는 표지되거나 되지않을 수 있다. 본 명세서에서 용어 "검색가능한 표지" 또는 "표지 물질"은 예컨대 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학 수단에 의해 적절한 절차 및 검출 장비를 이용하여, 그것이 부착된 분자를 검색, 위치결정 및/또는 동정할 수 있게 해주는 분자 표지를 가리킨다. 항체를 표지하는데 적합한 표지 물질로는 방사능핵종, 효소, 플루오로포어, 화학발광시약, 효소 기질 또는 코팩터, 효소 억제제, 입자, 염료 및 유도체 등을 들 수 있다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 표지되지 않은 항체는 예컨대 표지되거나 표지될 제2 항체와 같은 부가적인 시약으로 검색할 필요가 있다. 이것은 시그널을 증폭시켜주기 때문에, 검색 방법의 감도를 증가시키는데 특히 유용하다.
표지되지 않은 본 발명의 항체(1차 항체) 및 표지된 본 발명의 항체(2차 항체)를 사용하는, 본 발명에서 사용가능한 통상적인 분석법이 광범위하게 존재하며; 이들 기술에는 웨스턴 블롯 또는 면역블롯, ELISA (효소-결합 면역흡착 분석법), RIA (방사능면역분석법), 경쟁적 EIA (경쟁적 효소면역분석법), DAS-ELISA (이중 항체 샌드위치-ELISA), 면역세포화학 및 면역조직화학 기술, 유세포분석 또는 본 발명의 항체를 포함하는 단백질 마이크로스피어, 바이오칩 또는 마이크로어레이를 이용하는데 기초한 멀티플렉스 검색 기술 등이 포함된다. 본 발명의 항체를 이용하여 CCR9을 검색 및 정량하는 그 밖의 방법들에는 친화성 크로마토그래피 기술, 리간드 결합 분석법 또는 렉틴 결합 분석법이 포함된다.
본 발명의 제1 방법은 또한 단계 (c)에서, 연구 대상자로부터의 샘플에서 검색 또는 탐지된 상기 CCR9의 존재 및/또는 양 및/또는 분포를 대조군 샘플 내의 CCR9의 그것(레퍼런스 값)과 비교하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "대조군 샘플" 또는 "레퍼런스 샘플"은 정상적인 생리적 조건 하에서 CCR9-발현 세포를 포함하지 않거나 또는 CCR9-발현 세포를 포함하는 샘플을 가리키며, 따라서 레퍼런스 값을 수립하는데 이용될 수 있다. 특정한 일 구체예에서, 레퍼런스 샘플은 비록 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 임상 이력을 갖지 않는 대상자를 비롯하여 다른 대상자로부터 채취될 수도 있겠지만, 건강한 대상자로부터 채취되며, 정상적인 생리 조건 하에서 그 조직 또는 일부로부터 채취될 수 있다. 특정한 일 구체예에서, 대조군 샘플은 건강한 대상자로부터의 샘플이다. 또 다른 특정 구체예에서, 대조군 샘플은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 임상 이력을 갖지 않는 개체로부터의 샘플이며, 이 경우, 얻어진 결과는 그 대상자에서 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 악성, 침윤성, 단계 및/또는 위중도의 진단 또는 예측값을 가질 수 있다. 또 다른 특정 구체예에서, 대조군 샘플은 동일한 대상자로부터의 샘플이지만 건강한 조직 또는 그의 일부로부터의 샘플이다. 양성 대조군, 에컨대 CCR9를 발현하는 세포주 및/또는 음성 대조군, 예컨대 CCR9를 발현하지 않는 세포주도 필요한 경우 부가적으로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "분포(distribution)"는 CCR9가 발현되는 샘플의 모집단 또는 세포 유형을 가리킨다. 따라서, CCR9는 하나 이상의 특정 세포 모집단 또는 유형형에서 발현될 수 있다. 세포 모집단 또는 세포 유형이라 함은 T 세포, B 세포, 대식세포, 상피 세포, 근육 세포, 파골세포, 골모세포, 뉴런 등과 같이 형태학적으로 그리고 표현형적으로 구별되는 세포인 것으로 이해된다. 그러므로, 분석하고자 하는 샘플과 레퍼런스 샘플 간의 CCR9 분포를 비교함으로써, 상기 샘플에 존재하는 여러가지 상이한 세포 모집단에서 CCR9의 존재를 비교하는 것이다.
본 발명의 제1 방법은 부가적으로 단계 (d)를 포함하는데 이 단계는 단계 (c)의 비교로부터 얻어진 결과를 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 존재, 상기 대상자에서 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 상기 질병 또는 상태의 악성, 침윤성, 단계 및/또는 위중도의 탐지 또는 예후와 결부시키는 단계이다.
특정한 일 구체예에서, CCR9가 레퍼런스 샘플에 존재하지 않을 때, 분석하고자 하는 샘플에 CCR9가 존재하면 이는 그 대상자가 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태에 걸린 것임을 가리키는 것이다.
또 다른 특정 구체예에서, 레퍼런스 샘플에서 CCR9의 그것과 관련하여, 분석하고자 하는 샘플 내 CCR9의 분포가 변경되면 이는 그 대상자가 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태에 걸린 것임을 가리키는 것이다. CCR9의 분포는 CCR9가 레퍼런스 샘플과관련하여 상이한 세포 모집단에서 발현되거나, 또는 CCR9가 레퍼런스 샘플과 관련하여 적어도 하나의 상이한 부가적인 세포 모집단에서 발현될 경우, "변경된(altered)" 것으로 간주된다.
또 다른 특정 구체예에서, 상기 레퍼런스 샘플 중 CCR9의 양과 관련하여 상기 대상자로부터의 샘플 중의 CCR9의 양이 증가하면 이는 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태를 가리키는 것이다. 분석 대상 샘플 중의 CCR9의 양은 레퍼런스 샘플에 비해 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 150%, 적어도 200% 또는 그 이상 증가된 경우 레퍼런스 샘플 중의 CCR9의 양에 비해 "증가된" 것으로 간주한다.
상기 정보는 상기 대상자에서 상기 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 악성, 침윤성, 단계 및/또는 위중도를 탐지 또는 평가하거나 예측하는데 이용될 수 있고; 이러한 맥락에서, 통상의 기술자는 경험을 토대로, 연구 대상자로부터의 샘플에서 구해진 CCR9의 양을, 상기 대상자에서 상기 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 악성, 침윤성, 단계 및/또는 위중도와 결부시킬 수 있을 것이다. 마찬가지로, 대조군 샘플이 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태가 있는 것으로 진단된 대상자로부터의 샘플이고, 상기 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태를 치료하기 위한 치료제의 투여 전 또는 투여 동안 분석된 경우, 상기 치료제의 투여 후 주어진 시점에서 상기 대상자로부터의 샘플 중 상기 CCR9의 분포 및/또는 양의 검색 또는 변동과 관련된 정보는, 상기 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태에 걸린 상기 대상자에게 투여된 치료제의 효능 또는 효과를 모니터링하거나 평가하는 역할을 할 것이며, 후술하는 바와 같이, 상기 요법이 효과적이지 않으면, 이의 변경 가능성을 평가할 수 있다.
통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이, 예측은, 진단 또는 평가될 대상자에 대해 100% 정확할 필요는 없다 (물론 정확하면 더 좋다). 그러나, 이 용어는 대상자들의 통계적으로 유의한 부분이 주어진 결과를 가질 확률이 증가된 것으로 동정될 수 있을 것을 요구한다. 대상자로부터 수득된 데이터가 통계적으로 유의한지 여부는 예컨대 신뢰구간 탐지, p-값 결정, 교차-검정 분류 비율 등과 같은 다양한 공지의 통계 평가법을 이용하여 통상의 기술자가 부가적인큰 어려움 없이 탐지할 수 있다. 이에 관한 상세는 문헌 [Dowdy 및 Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983]에서 찾아볼 수 있다. 바람직한 신뢰구간은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%이다. p-값은 0.01, 0.005 또는 그 미만인 것이 바람직하다.
본 명세서에서 용어 "CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태"는 CCR9를 발현하는 세포가 직간접적으로 관여하는 질병 또는 상태를 가리키며 CCR9이 변경된 방식으로 발현되어, 정상 또는 레퍼런스 생리조건 또는 레퍼런스 값에 비해, 예컨대 더 높은 값과 같이 변경된 방식, 위치결정 또는 분포 또는 변경된 양으로 CCR9를 발현하는 질병 또는 상태를 포함한다. 용어 "CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태"는 실질적으로 "CCR9를 발현하는 세포를 부수적으로 갖는 질병 또는 상태" 또는 "CCR9를 발현하는 세포가 직간접적으로 암시된 질병 또는 상태" 또는 이와 유사한 것과 실질적으로 동등하다.
특정한 일 구체예에서, 상기 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태는 종양 질환 및 비종양 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태는 종양 질환이다. 더욱 바람직한 일 구체예에서, 상기 종양 질환은 T-세포 급성 림프모구 백혈병, 전립선암, 유방암, 흑색종, 난소암, 대장암, 폐암, 및 고형 종양으로부터의 순환 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 용어 "T-세포 급성 림프모구 백혈병" 또는 "T-ALL"은 혈액 및 골수에서 T-세포 림프모구세포의 악성 증식성 질환의 일종을 가리키며 림프구성 백혈병의 한 형태이다.
본 명세서에서 용어 "전립선암"은 전립선 세포의 악성 증식성 질환을 가리킨다.
본 명세서에서 용어 "유방암"은 유세포의 여하한 악성 증식성 질환을 가리키는 것으로, 가장 흔하게는 유관의 내층 또는 유관에 젖을 공급하는 소엽의 질환을 가리킨다. 유관으로부터 기원하는 암은 도관계 암종으로 알려져 있고 소엽에 기원하는 암은 소엽 암종으로 알려져 있다.
본 명세서에서 용어 "흑색종"은 멜라닌세포의 악성 피부 종양을 가리킨다.
본 명세서에서 용어 "난소암"은 난소로부터 발생하는 암 성장을 가리킨다.
또한 본 명세서에서 "결장암(colon cancer)", "직장암(rectal cancer)" 또는 "장암(bowel cancer)"이라고도 알려진 용어 "대장암(colorectal cancer)"는 결장, 직장 또는 충수에서의 제어되지 않은 세포 성장에 기인하는 암을 가리킨다.
본 명세서에세 용어 "폐암"은 폐의 조직에서 일어나는 악성 증식성 질환 유형을 가리킨다.
본 명세서에서 용어 "고형 종양으로부터의 순환 세포( circulating cell from a solid tumour )" 또는 CTCs (순환 종양 세포: 순환 종양 Cells)는 원발 종양으로부터 혈관계 내로 뿜어져 나와 혈류 내에서 순환하는 세포를 가리킨다. CTCs는 원발 장기에서의 후속적인 부가적 종양 성장(전이)에 책임이 있을 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태는 비종양 질환(non-tumour disease)이다. 특정한 일 구체예에서, 상기 비종양 질환은 자가면역 질환이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 비종양 질환 또는 상태는 면역 질환을 포함하는 상태이거나 또는 염증성 반응 또는 성분이 존재하는 질환을 가리킨다. 특정 구체예에서, 상기 비종양 질환은 크론병, 염증성 장질환, 간 섬유증, 및 급성 간 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 용어 "크론병"은 입으로부터 항문에 이르는 위장관의 일부에 영향을 미쳐, 다양한 증상을 일으킬 수 있는 염증성 장질환의 한 가지 유형이다. 이것은 주로 복부 통증, 설사(염증이 최고조에 이를 결우 혈변일 수도 있음), 구토 (지속될 수 있음), 또는 체중감소를 일으키지만, 빈혈, 피부발진, 관절염, 눈의 염증, 피로 및 집중력 결여와 같은 위장관 외의 합병증을 일으킬 수도 있다. 크론병은 유전적으로 민감한 개체에서 환경적 인자, 면역학적 인자 및 세균 인자들 간의 상호작용에 기인한다. 이 병은 신체의 면역계가 위장관을 공격하는 만성 염증성 질환을 일으킨다. 크론병이 면역관련질환이기는 하지만, 자가면역질환으로 보이지는 않는다 (면역계가 그 자신의 몸에 의해 격발되지 않는다는 점에서).
본 명세서에서 용어 "염증성 장질환"은 결장 및 소장의 염증성 상태의 일군을 가리키는 것으로, 여기에는 궤양성 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구 결장염, 허혈성 결장염, 전환 결장염, 베쳇병 및 불확정 결장염이 포함된다.
본 명세서에서 " "간 섬유증(hepatic fibrosis)"이라고도 알려진 용어 "간 섬유증(liver fibrosis )"는 대부분의 만성 간질환에서 일어나는 콜라겐을 비롯한 세포외 매트릭스 단백질이 간에 과다하게 축적되는 것을 일컫는 것으로; 이는 선천성 상태 또는 반복된 간 손상에 기인할 수 있다. 진행된 간 섬유증은 경화, 간부전 및 문맥 고혈압을 일으키며 종종 간 이식을 필요로 한다.
본 명세서에서 용어 "급성 간 염증"은 간세포의 파괴 및 간 조직 내 염증 세포의 존재를 특징으로 하는 상태이다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태는 T-세포 급성 림프모구 백혈병이다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, CCR9를 발현하는 세포가 부수되는 질병 또는 상태는 전립선암이다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태는 유방암이다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태는 흑색종이다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태는 난소암이다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태는 대장암이다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태는 폐암이다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태는 고형 종양으로부터의 순환 세포이다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태는 크론병이다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태는 염증성 장질환이다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태는 간 섬유증이다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태는 급성 간 염증이다.
또 다른 특정 구체예에서,
the 세포 in which the expression of CCR9의 발현이 변경되는 세포는 림프구, 골수세포, 수지상세포 , 혈장모양 세포의 부분모집단을 포함하며, 이들은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11, CD14, CD19, CD20, CD25, CD51, CD81, CD146, CD228, CD231, TCR 및 이의 조합을 포함하는 마커들 중 적어도 한 가지에 의해 정의된다.
바람직한 일 구체예는 형광 표지된 본 발명의 항체로 조직 샘플을 염색하는 방법으로 조직을 신속 테스트하는 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 방법에서는 본 발명의 항체, 좋기로는 IgG 이소타입 항체를, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11, CD14, CD19, CD20, CD25, CD51, CD81, CD146, CD228, CD231, TCR을 특이적으로 인식하는 부가적인 항체와 조합시킨다. 또 다른 바람직한 구체예에서는 항체를 Cy3 및 Cy5 또는 Cy3 및 FITC와 같은 여러가지 형광 염료로 직접 표지한다.
시그널 향상이 유리한 일 구체예에서, 항체 및/또는 인식 분자는 표지된 2차 항체 또는 바이오틴-스트렙트아비딘 검색 시스템에 의해 증가된다. 따라서 항체의 불변부에서 상이한 종의 이소타입 및/또는 서열을 이용하는 것이 유리하다. 이 문서에서 사용된 기술과 방법, 예컨대 면역조직기술 및 인식 분자의 적절한 포맷의 선택은 통상의 기술자에게 알려져 있다.
이에 더해, 본 발명의 항체는, 표적세포(즉 CCR9, 또는 CCR9+ 세포를 발현하는 세포)에 특이적으로 결합할 수 있는 능력에 비추어, CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 인 비보 진단 및/또는 예후 탐지에도 이용될 수 있으며; 부연하면, 상기 항체를 의학적 조영, 즉 어떤 질환을 찾거나, 진단하거나 검사할 의료 절차와 같은 임상 목적 또는 정상적인 해부 및 생리학 연구를 비롯한 의과학 목적을 위해 예컨대 인체와 같은 몸 (또는 일부 또는 그의 기능)의 영상을 만들어내는데 사용되는 일련의 기술 및 과정이라 할 수 있는 의학적 조영에 사용될 수도 있다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 인 비보 진단 및/또는 예후 탐지를 위한 본 발명의 항체의 용도, CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 인 비보 진단 및/또는 예후 탐지를 위한 방법에 있어서의 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이며; 별법으로, 이 측면은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 인 비보 진단 및/또는 예후 탐지를 위한 조성물의 제조에 있어서의 본 발명의 항체의 용도라고 표현할 수도 있다. 또 다른 표현으로, 이 측면은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 인 비보 진단 및/또는 예후 탐지에 사용되기 위한 본 발명의 항체 또는 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 인 비보 진단 및/또는 예후 탐지를 위한 방법에 사용되기 위한 본 발명의 항체라고 표현할 수도 있다.
이를 위해, 본 발명의 항체를 기술분야에 공지인 적절한 방법으로 표지하고 예컨대 방사활성 동위원소 또는 형광 염료와 같은 적절한 분자와의 커플링 및/또는 로딩 의해, 방사능면역진단, 포지트론방출 토모그래피(PET), 내시경 면역형광법과 같은 진단 조영법을 위한 제제로서 제공한다. 바람직한 일 구체에에서, 본 발명의 항체는 감마선 방출 동위원소, 예컨대 99mTc, 123I, 및 111In과 커플링되어, 감마 카메라 또는 단일-포톤 방출 컴퓨팅 토모그래피를 이용하여 방사능면역섬광조영술(radioimmunoscintigraphy)에 사용된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 PET에 이용되는 18F, 64Cu, 68Ga, 86Y, 및 124I와 같은 포지트론 방출제와 커플링된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 Cy3,Cy2, Cy5 또는 FITC와 같은 형광 염료와 커플링되어 내시경 면역형광법에 사용된다. 전술한 바와 같이 변형된 항체는 개체에 알맞는 투여량으로 적절한 경로 예컨대 정맥 경로로 투여되어, CCR9의 위치가 공지 방법론에 의해 검색, 탐지 또는 측정된다. 진단 조영을 비롯하여 본 명세서에서 사용된 방법과 기술은 적절한 투여 제형을 제공할 수 있는 통상의 기술자에게 알려져 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 예컨대 111In에 의해 방사능활성 표지되어, 종양 내에 국소적으로 또는 종양 구심성 또는 원심성 또는 전신의 혈관에 진단제로서 제공된다. 이것은 종양 크기 결정을 위한 일 구체예 및 림프절 측정을 위한 추가적인 구체예에서 역할을 한다. 본 명세서에 기재된 방법과 기술은 진단 조영을 비롯하여, 적절한 투여 제형을 제공할 수 있는 통상의 기술자에게 공지이다.
진단 분석법에서 또는 진단제로서 사용되는 본 발명의 방사능표지된 인식 분자는 다른 투여 경로에 의해서도 투여될 수 있다. 이를 위해, 바람직한 경로는 복강내, 림프절내(intranodal), 종양내 경로이다.
또한, 본 발명의 항체는 대상자에게 투여하기에 적합한 조성물로 조성된다. 이를 위해, 이 조성물은 필요한 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 함유한다. 이러한 조성물의 비제한적인 예로는 설명 목적상 후술하는 것들을 들 수 있으며 이들 모두 본 발명에 참조 병합된다.
CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료에 대한 반응을 모 니터링하는 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 중인 대상자에 있어서 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료에 대한 반응을 모니터링하기 위한 인 비트로 방법 ("이하 본 발명의 제2 방법"이라 칭한다)에 관한 것으로, 이 방법은:
a) 본 발명의 항체를 상기 대상자로부터 제1 시점에서 채취된 세포들을 포함하는 제1 샘플과 접촉시키는 단계;
b) 상기 제1 샘플 내의 CCR9를 검색 및/또는 정량하는 단계;
c) 본 발명의 항체를 상기 대상자로부터 제1 시점에서 채취된 세포들을 포함하는 제2 샘플과 접촉시키는 단계;
d) 상기 제1 샘플 내의 CCR9를 검색 및/또는 정량하는 단계;
e) 상기 제1 샘플 및 제2 샘플에서 검색된 CCR9의 존재 및/또는 양 및/또는 분포를 비교하는 단계; 및
f) 얻어진 결과를 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료에 대한 반응과 결부시키는 단계
를 포함한다.
용어 "항체", "CCR9", "샘플", "대상자", "CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태", "분포" 및 이들의 상세에 관하여는 항체 및 본 발명의 제1 방법과 관련한 문단에서 상세히 설명한 바 있으며 본 발명의 제2 방법과 동일한 맥락의 의미로 사용한다.
본 명세서에서 용어 "치료( treatment )"는 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태를 개선하는데 적합한 요법을 가리킨다. CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태에 대한 적절한 치료는 통상적이며 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 제2 방법은 본 발명의 항체를 상기 대상자로부터 제1 시점에서 채취된 샘플을 포함하는 제1 샘플을 접촉시키는 제1 단계를 포함한다. 통상의 기술자라면 이해하는 바와 같이, 본 발명의 제2 방법의 단계 (a)는 상기에서 설명된 바 있는 본 발명의 제1 방법의 단계 (a)와 동일하다. 따라서 본 발명의 제1 방법의 단계 (a)의 상세는 이 부분에 참조 통합된다.
본 발명의 제2 방법의 단계 (b)는 상기 제1 샘플 내의 CCR9를 검색 및/또는 정량하는 것을 포함한다. 본 발명의 제2 방법의 단계 (b)는 상기에서 설명된 바 있는 본 발명의 제1 방법의 단계 (b와 동일하다. 따라서 본 발명의 제1 방법의 단계 (b)의 상세는 이 부분에 참조 통합된다.
본 발명의 제2 방법은 추가로 본 발명의 항체를 제2 샘플과 접촉시키고 상기 제2 샘플 내의 CCR9를 검색 및/또는 정량하는 단계 (c) 및 (d)를 포함하며, 여기서 상기 제2 샘플은 제2 시점에서 채취된 것이다.
본 명세서에서 용어 "시점( time point )"은, 모니터링될 대상자로부터 샘플이 채취되는 순간을 가리킨다. 본 발명의 제2 방법의 문맥상, 제1 샘플이 채취되는 최초 시점인 제1 시점과 제2 샘플이 채취되는 나중 시점인 제2 시점이 있다. 제1 시점과 제2 시점은 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 10일, 적어도 20일, 적어도 30일, 적어도 40일, 적어도 50일, 적어도 60일, 적어도 70일, 적어도 80일, 적어도 90일, 적어도 100일, 적어도 6개월, 적어도 1년, 적어도 2년, 적어도 5년, 적어도 10년, 또는 그 이상 떨어져 있다. 특정한 일 구체예에서, 제1 시점은 제2 시점 전에 일어나, 제2 샘플이 채취되기 전에 제1 샘플을 채취한다.
통상의 기술자가 알아차리는 바와 같이, 특정한 일 구체예에서, 상기 치료에 대한 반응을 완전히 모니터링하기 위해서는, 세포가 참여하는 질병 또는 상태에 대한 치료를 개시하기 전에 대상자로부터 제1 샘플을 채취하는 것이 특히 유용하다. 따라서, 특정한 일 구체예에서, 제1 시점은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태에 대한 치료가 개시되기 전이다. 또 다른 특정 구체예에서, 제1 시점은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태에 대한 치료가 개시되는 때이다. 마찬가지로, 특정한 일 구체예에서, 제1 샘플은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태에 대한 치료 전에 채취되는 반면, 또 다른 특정 구체예에서, 제1 샘플은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태에 대한 치료가 개시되는 때에 채취된다.
상기 치료에 대한 상기 대상자의 반응을 모니터링하기 위해, 대상자가 상기 치료를 개시한 후에 제2 샘플을 채취할 필요가 있다. 그러므로, 또 다른 특정 구체예에서, 제2 시점은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태에 대한 치료 후이다. 특정한 일 구체예에서, 제2 시점은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태에 대한 치료 개시로부터 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 10일, 적어도 20일, 적어도 30일, 적어도 40일, 적어도 50일, 적어도 60일, 적어도 70일, 적어도 80일, 적어도 90일, 적어도 100일, 적어도 6개월, 적어도 1년, 적어도 2년, 적어도 5년, 적어도 10년, 또는 그 이상 경과 후 이다. 특정한 일 구체예에서, 제2 샘플은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태에 대한 치료 개시로부터 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 10일, 적어도 20일, 적어도 30일, 적어도 40일, 적어도 50일, 적어도 60일, 적어도 70일, 적어도 80일, 적어도 90일, 적어도 100일, 적어도 6개월, 적어도 1 year, 적어도 2년, 적어도 5년, 적어도 10년, 또는 그 이상 경과 후에 채취된다.
본 발명의 제2 방법은 또한 상기 제1 샘플 및 제2 샘플에서 검색된 CCR9의 존재 및/또는 양 및/또는 분포를 비교하는 단계[단계 (e)]도 포함하며, 후속되는 단계 [단계 (f)]에서는 단계 (e)의 비교에 의해 얻어진 결과를 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료에 대한 반응과 결부시킨다.
특정한 일 구체예에서, 제1 샘플에 비해 제2 샘플에서 CCR9의 존재가 결여되면 이는 상기 치료에 대한 긍정적인 반응을 가리키는 것이다. 이와 달리, 제1 샘플에 비해 제2 샘플에서 CCR9가 존재하면, 이는 상기 치료에 대한 반응이 부정적인 것이거나 부정적임을 가리키는 것이다.
또 다른 특정 구체예에서, 제1 샘플에 비해 제2 샘플에서의 CCR9의 분포가 변경되면, 즉 제1 샘플에 비해 제2 샘플에서 CCR9가 더 적게 또는 더 낮은 세포 모집단에서 발현되면, 이는 상기 치료에 대한 반응이 긍정적임을 가리키는 것이다. 이와 반대로, 제1 샘플에 비해 제2 샘플에서 CCR9의 분포가 변경되지 않거나 또는 변경되되 그 변경이 제1 샘플에 비해 제2 샘플에서 CCR9가 더 많은 세포 모집단에서 발현되는 것이면, 이는 상기 치료에 대한 반응이 부정적인 것임을 가리킨다. 제1 샘플 내의 CCR9의 양에 비해 제2 샘플 내의 CCR9이 감소하면 이는 상기 치료에 대한 반응이 긍정적임을 가리키는 것이다. 제1 샘플 내의 CCR9에 비해 제2 샘플 내의 CCR9의 양이 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 150%, 적어도 200% 또는 그 이상 감소하면 제2 샘플 내의 CCR9의 양이 감소한 것으로 간주한다. 마찬가지로, 제1 샘플 내의 CCR9에 비해 제2 샘플 내의 CCR9의 양이 증가하면 이는 상기 치료에 대한 반응이 부정적임을 시사한다. 분석 대상 샘플 내의 CCR9의 양이 레퍼런스 샘플 내의 CCR9에 비해 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 150%, 적어도 200% 또는 이상 증가하면 분석 대상 샘플 내의 CCR9이 증가한 것으로 간주된다.
본 명세서에서 용어 "치료에 대한 반응( response to treatment )"은 치료 대상인 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 진화(evolution)을 가리키는 것으로, 이는 긍정적(favourable) 반응이거나 부정적(unfavourable) 반응일 수 있다. 일반적으로, 치료에 대한 긍정적 반응은 상기 질병 또는 상태에 의해 야기되는 증상 및/또는 병변의 부분적 또는 전체적 완화 또는 소멸을 포함하는 반면, 치료에 대한 부정적 반응은 상기 질병 또는 상태에 의해 야기되는 증상 및/또는 병변의 악화 악화 또는 퇴행을 포함한다. 통상의 기술자에게는 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료에 대한 반응을 평가하는 다양하고도 통상적인방법이 알려져 있다. 비제한적인 설명 목적을 위한 예시로서, CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태가 암 유형이면, 특히 고형 종양이면, 치료에 대한 반응은 다음과 같이 평가한다:
- 완전 반응(Complete Response: CR): 모든 표적 병변이 사라짐;
- 부분 반응(Partial Response: PR): 표적 병변의 최장 직경(LD)의 합이 적어도 30% 감소함, 레퍼런스는 LD의 베이스라인 합계임;
- 안정적인 감소(Stable Disease: SD): PR로 평가할만큼 충분한 수축이 일어나지도, PD로 평가할만큼 충분한 증가가 일어나지도 않고, 레퍼런스로서 치료 개시 이래 최소의 LD 합계를 취한다 또는
- 진행성 질환(Progressive Disease: PD): 표적 병변의 LDdml 합계의 적어도 20% 증가, 레퍼런스로서 치료 개시 이후 또는 1개 이상의 병변이 나타난 후로부터 최소의 LD를 레퍼런스로 하여, 표적 병변의 LD의 합에서 적어도 20% 증가됨;
여기서 CR 및 PR은 치료에 대한 긍적정 반응이고, PD는 치료에 대한 부정적 반응이다.
본 발명의 이용
CCR9의 에피토프에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 치료적으로는 물론 면역화학 분석법, 예컨대 면역형광 분석법, 유세포분석, 웨스턴 블롯, 면역조직화학분석법, 면역침전법 또는 그 밖에 기술분야에 공지인 면역화학분석법에서 치료적으로 사용될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명은 의약으로서 이용되는 (이하 "본 발명의 제1 용도"로 칭함) 본 발명의 항체이다.
본 발명은 또한 의약 제조에 있어서의 본 발명의 항체의 사용에 관한 것이기도 하다. 별법으로. 이 측면은 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 치료방법으로서 준비될 수도 있다.
본 발명의 발명자들은 이 항체가 CCR9를 발현하는 인간 급성 림프모구 백혈병의 이종이식편 모델을 억제할 수 있고, 괴사와 아폽토시스를 촉진할 수 있을 뿐만 아니라, 혈관형성, 증식을 감소시킬 수 있고 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 매개할 수 있다는 점에서, 본 발명의 항체가 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료에 특히 유용함을 입증하였다.
그러므로, 본 발명의 또 다른 측면은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료에 사용되기 위한 (이하 "본 발명의 제2 용도"라 칭한다), 본 발명의 항체이다.
본 발명은 또한 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료용 의약을 제조하는데 있어서의 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다. 달리 설명하면, 이 측면은 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하는, CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료 방법으로서 준비될 수도 있다.
용어 "항체", "CCR9", "CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태", 및 이들의 상세 내용은 본 발명의 상체와 관련한 문맥에서 상술된 바 있고 본 발명의 제1 용도와 문맥상 동일한 의미로 사용된다.
본 발명의 제1 용도의 특정 구체예에서, CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태는 T-세포 급성 림프모구 백혈병, 전립선암, 유방암, 흑색종, 난소암, 대장암, 폐암, 크론병, 염증성 장질환, 간 섬유증, 급성 간 염증, 고형 종양으로부터의 순환 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
용어 "치료( treatment )" 또는 "요법( therapy )"은 혼용될 수 있으며 질병 또는 장애 또는 재발성 질병 또는 장애의 한 가지 이상의 증상을 예방, 완치, 지연시키거나 위중도를 경감 또는 완화시킬 목적에서 또는 이러한 치료가 없을 경우 예상되는 것보다 환자의 생존을 더 연장시키기 위해 취해지는 임상적 개재라 칭할 수 있다.
통상의 기술자가 인식하는 바와 같이, 본 발명의 항체는 다양한 형태로 치료적으로 적용하는데 유용할 수 있으며, 이의 비제한적인 예로는 온전한 항체, 다른 치료제에 컨쥬게이트된 형태 및 다른 치료제와의 융합 단백질 형태를 들 수 있다. 이러한 치료적 적용은 본 발명의 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "치료적 유효량"이라 함은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 한 가지 이상의 증상을 인지가능하게 예방, 완치, 지연, 위중도 감소 또는 경감시키는데 필요한 본 발명의 항체의 양을 가리킨다.
본 발명의 제1 용도 및 제2 용도의 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 온전한 항체, 즉 면역글로불린의 형태이다. 본 발명의 항체는 면역글로불린의 형태이면, 전형적으로 CCR9-발현 세포에 대한 세포독성 효과를 지향시키는데 있어 조합 메카니즘을 이용한다, 즉: (i) it interacts with components of the immune system through 항체-의존성 세포독성 (ADCC) 또는 (ii) 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 통한 면역계의 성분과 상호반응한다.
항체-의존성 세포독성(ADCC)은 항체가 세포 상 항원에 결합하여 항체 Fc 도메인이 면역 이펙터 세포의 표면에서 Fc 수용체 (FcR)가 관여할 때 발생한다. Fc 수용체의 몇몇 패밀리들이 동정되었으며 특이적인 세포 모집단은 정의된 Fc 수용체를 특징적으로 발현한다. 예를 들어, 호중구는 흔히 인간 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)의 B (지질 앵커됨) 이소폼을 발현한다. 이와 대조적으로, 인간 내추럴 킬러(NK) 세포는 오직 CD16의 A(트랜스막)만을 발현한다. 이 구조는 CD16의 항체 관여에 의해 어댑터 단백질의 동원 및 NK 세포의 활성화를 용이하게 한다.
보체-의존성 세포독성 (CDC)은 항체에 의해 지향될 수 있는 또 다른 세포-살해 방법이다. ADCC와 마찬가지로, 항체들의 상이한 서브클래스들은 CDC 반응을 이끌어내는 다양한 능력을 갖는다. IgM은 보체 활성화에 있어 가장 효과적인 이소타입이고, IgG1 및 IgG3은 두 가지 모두 전통적인 보체 활성화 경로를 통해 CDC에 지향하는데 있어 매우 효과적이다. 이 캐스케이드에서, 항원-항체 복합체의 형성은 참여하는 IgG 분자의 CH2 도메인 상에 매우 근접하게 위치한 복수개의 C1q 결합 자리를 드러내게 한다 (C1q는 보체 C1의 3 가지 서브성분들 중 하나이다). 이들 드러난 C1q 결합 자리는 앞서의 저-친화성 C1q-IgG 상호반응을 높은 친화도를 갖는 것으로 변환시켜, 다른 일련의 성분 단백질들이 관여하는 이벤트 캐스케이드를 촉발하여 이펙터-세포 화학주성/활성화제인 C3a 및 C5a의 단백질 분해 방출을 결과시킨다. 이러한 보체 캐스케이드는 막 공격 복합체의 형성으로 종결되는데, 이에 의해 세포 막에 100 Å의 포어가 형성되어 물과 용액이 세포 내외를 자유로이 통과하는 것을 용이하게 해준다.
본 발명의 제1 및 제2 용도의 또 다른 측정 구체예에서는, 본 발명의 항체가 다른 치료제와 컨쥬게이트되거나 다른 치료제와 융합 단백질 형태로 존재한다.
본 발명의 면역컨쥬게이트를 형성하는데 적합한 치료제에는 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테니포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시안트라시닌디온, 메이탄신 또는 이의 유사체 또는 유도체, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-에히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로파나놀롤 및 퓨로마이신; 칼리케아미신 또는 그의 유사체 또는 유도체; 항대사물질(예컨대 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 데카르바진, 히드록시우레아, 아스파라지나제, 겜시타빈, 클라드리빈), 알킬화제(예컨대 메클로레타민, 티오페아, 클로람부실, 멜팔란, 카르부스틴 (BSNU), 로무스틴(CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만티놀, 스트렙토조토신, 데카르바진 (DTIC), 프로카르바진, 미토마이신 C, 시스플라틴 및 기타 백근 유도체 예컨대 카르보플라틴; 뿐만 아니라 듀오카르미신 A, 듀오카르미신 SA, CC-1065 (a.k.a. 레이철마이신), 또는 CC-1065의 유사체 또는 유도체), 항생제(예컨대 닥티노마이신 (이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 다우노루비신 (이전에 다우노마이신), 독소루비신, 이다루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미토잔트론, 플리카마이신, 안트라마이신(AMC)), 항-유사분열제(예컨대, 튜불린 억제제) 예컨대 모노메틸라아우리스타틴 E, 모노메틸아우리스타틴 F, 또는 돌로스타틴 10의 다른 유사체 또는 유도체; 디프테리아 독소 및 관련 분자 (예컨대 디프테리아 A 사슬 및 그의 활성 단편 및 하이브리드 분자); 리신 독소(예컨대 리신 A 또는 탈글리코실화된 리신 A 사슬 독소), 콜레라 독소, 시가(Shiga)-형 독소(SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), LT 독소, C3 독소, Shiga 독소, 백힐해 독소, 파상풍 독소, 대두 보이만-버크(soybean Bowman-Birk) 단백질 억제제, 슈도모나스 외독소, 알로린, 사포린, 모데신, 겔라닌, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알로이리테스포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 필토락카마리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트리토신, 페노마이신 및 에노마이신 독소를 들 수 있다. 기타 적절한 컨쥬게이트된 분자에는 항미생물제/용해 펩타이드 예컨대 CLIP, 마가이닌 2, 멜리틴, 세크로핀 및 P18; 리보뉴클리아제 (RNase), DNase I, 스타필로코커스 내독소-A, 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질, 디프테린 독소, 슈도모나스 내독소를 들 수 있다. 예컨대 문헌 [Pastan et al. , Cell 47, 641 (1986) 및 Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994)] 참조.
본 발명의 제1 및 제2 용도의 바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 세포독소, 방사능핵종 및 면역억제제, 화학치료약물 또는 시토카인으로 이루어진 군으로부터 선택된 다른 치료제와 컨쥬게이트되거나 이러한 다른 치료제와 융합 단백질을 형성한다.
암의 세포독성 화학요법 또는 방사선요법은 이 치료법들이 악성 세포에 선택적이지 못하기 때문에, 민감한 정상 세포에 대한 독성으로부터 일어나는 위중하고 때때로 생명을 위협하는 부작용으로 인해 제약을 받는다. 이러한 문제를 피하는 한 가지 전략은 종양-관련 항원을 인식하는 항체 또는 다른 리간드에 치료제를 커플링시키는 것이다. 이에 의해 악성 세포에 대한 노출이 증가되고, 정상 세포의 리간드-표적화요법에 대한 노출은 감소된다.
이러한 치료제는 CCR9를 발현하는 세포에 세포독성 방사능을 방출하는 역할을 하는 방사능핵종(radionuclide)일 수 있다. 본 발명의 항체에 커뉴게이트되면, 얻어진 분자는 방사선 면역치료제로서 유용하다.
본 발명의 제1 및 제2 용도의 바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 방사능핵종에 컨쥬게이트된다. 본 발명의 이러한 맥락에서 유용한 예로는, 베타 방출제 에컨대 131I, 90Y, 99mTc, 177Lu, 및 67Cu, 및 알파 방출제 에컨대 213Bi 및 211At를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
치료제는 면역억제제, 즉 치료되는 포유동물의 면역계를 억압 또는 차단하는 기능을 하는 물질일 수 있다. 이것은 시토카인 생산, 자가항원 발현을 하향 조절하거나 억제 또는 MHC 항원을 차단하는 물질을 포함한다.
치료제는 또한 세포독성 물질, 즉 세포의 기능을 억제 또는 예방하거나 및/또는 세포의 파괴를 일으키는 물질일 수 있다. 이 용어는 방사선활성 동위원소(전술한 바와 같음), 화학요법제, 즉 암 치료에 유용한 화학적 화합물 및 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적으로 활성적인 독소 또는 그의 단편을 포함하도록 의도된다.
치료제는 또한 시토카인, 호르몬, 성장인자, 괴사인자 즉 세포내 매개자로서 다른 세포에 작용하는 한 가지 세포 모집단 또는 심지어 동일한 세포 모집단에 의해 방출되는 단백질 또는 펩타이드일 수도 있다. 본 명세서에서 용어 시토카인은 천연 소스로부터 또는 재조합 세포 배양체로부터의 단백질 및 펩타이드를 포함하며 천연 서열 시토카인의 생물학적으로 활성인 등가물도 포함한다.
본 발명의 제1 및 제2 용도의 바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 1종 이상의 독소 분자에 컨쥬게이트된다. 사용가능한 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편의 예로는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 에루지노사로부터 유래함), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파 사르신, 알레우리테스포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스 억제제, 게올닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 들 수 있다.
본 발명은 또한 핵분해(nucleolytic) 활성을 갖는 화합물(예컨대 리보뉴클리아제 또는 데옥시리보뉴클리아제; DNase와 같은 DNA 엔도뉴클리아제)과 컨쥬게이트되는 본 발명의 항체 또는 세포 구조 또는 소기관을 손상시키거나 세포를 살해 또는 세포 생존능을 감소시키는 그 밖의 화합물과 컨쥬게이트될 본 발명의 항체를 포괄한다.
항체와 세포독성제의 컨쥬게이트는 다양한 이중기능 단백질 커플링제 또는 링커를 이용하여 만들 수 있다. 링커는 세포내 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산에 불안정한 링커, 펩티다제-민감성 링터, 디메틸 링커 또는 디설파이드-함유 링커가 사용될 수 있다.
별법으로, 항체와 시토카인 물질을 포함하는 융합 단백질을 예컨대 재조합 기술 또는 펩타이드 합성에 의해 만들 수 있다.
치료제는 또한 모약물에 비해 종양세포에 대한 세포독성이 낮지만 효소적으로 활성화되거나 또는 보다 활성적인 모약물 형태로 전환될 수 있는, 약학적으로 활성적인 물질의 전구체 또는 유도체 형태인 전구약물 일 수도 있다.
본 발명의 제1 및 제2 용도의 바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 전구약물을 활성 항암 약물로 전환시키는, 전구약물 활성화제와 컨쥬게이트될 수도 있다. 이러한 컨쥬게이트의 성분으로는 전구약물을 보다 활성인, 세포독성 형태로 전환시키는 것과 같은 방식으로 전구약물에 작용할 수 있는 물질을 들 수 있다. 이것은 항체-지향된 효소 전구약물 치료 접근(ADEPT)에 있어서 특히 유용하다.
본 발명에 유용한 항체로는 전구약물을 활성 치료제(약물)로 전환시킬 수 있는 것이면 어느 것이든 무방하다. 특정 구체예에서, 효소는 포유동물, 예컨대 인간의 효소로부터 나온 효소이다.
또 다른 특정 구체예에서, 효소는 포유동물 이외의 생명체로부터의 효소이다; 이 마지막 구체예에서 효소의 면역원성은 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등과의 컨쥬게이션에 의해 임의로 감소시킨다. 특정 구체예에 따라, 효소도, 유사한 기질 특이성을 갖는 효소도 전구약물의 투여 경로 또는 바이오분포에 의해 대상자에게 내인적이지 않다.
프로테아제, 글리코시다제, 에스테라제 등은 본 발명에서 사용가능한 일반적인 효소 유형이다. 적절한 효소의 특별한 예로는 글리코시다제 (베타-글루쿠로니다제, 베타-글루코시다제, 베타-갈락토시다제), 베타-락타마제, 셀룰라제, 덱스트라나제, 프럭타제, 아미노펩티다제, 리소자임, 시토신 데아미나제, 카르복시펩티다제, 페니실린 아미다제, 메티오닌 γ 리아제, 및 카르복시에스테라제를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 효소는 선택된 전구약물을 그의 활성 약물 형태로 전환시킬 수 있는 그의 능력에 따라 선택된다. 예컨대, 만일 전구약물이 덱스트란과 치료제와의 컨쥬게이트를 포함하면, 적절한 효소는 덱스트라나제가 될 것이다. 마찬가지로, 셀룰라제는 셀룰로스 기질을 포함하는 전구약물에, 글루쿠로니다제는 글루쿠로나이드를 포함하는 전구약물에 사용될 수 있다.
바람직한 일 구체예에서, 효소는 글리코시다제 (글루쿠로니다제, 베타-글루코시다제, 베타-갈락토시다제), 베타-락타마제, 셀룰라제, 덱스트라나제, 프럭타제, 아미노펩티다제, 리소자임, 시토신 데아미나제, 카르복시펩티다제, 페니실린 아미다제, 메티오닌 γ 리아제, 및 카르복시에스테라제, 또는 촉매활성을 갖는 그의 기능성 변이체 또는 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 이 문맥에 유용한 약물에는 독소, 항생제 또는 화학치료약물, 방사능동위원소, 상자성 이온, 붕소 어덴드, 시토카인, 감광제, 방사능감작화제, 혈관확장제, 면역조절제, 면역억제제, (글루코)코르티코이드등이 포함된다.
특정한 일 구체예에서, 약물은 화학치료제 예컨대 세포독성활성을 갖는 약물이다. 약물 또는 전구약물의 세포독성 활성은 기술분야에 공지인 분석법을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 세포막 온전성을 평가하는 것은 세포의 생존능과 세포독성 효과르르 측정하는 가장 흔한 방법 중 하나인데, 이는, 세포독성 효과를 갖는 화합물들이 종종 세포막 온전성을 약화시키기 때문이다. 바이탈 염료 예컨대 트리판 블루 또는 프로피디움 요오다이드는 일반적으로 건강한 세포의 내부로부터 배제된다; 그러나, 만일 세포막이 약화된 경우에는, 이들이 막을 자유롭게 통과하여 세포내 성분들을 염색시킨다. 별법으로, 막 온전성은 정상적으로는 세포내 격리된 물질이 세포외로 통과하는 것을 모니터링함으로써 평가될 수도 있다. 흔히 측정되는 한 가지 분자는 락테이트 데히드로게나제(LDH)이다.
세포독성은 MTT 분석법에 의해서도 모니터링할 수 있다. 이 분석법은 비색 반응을 이용하여 세포의 환원 전위를 측정한다. 생존 세포들은 디메틸 티아졸리딘페닐테트라졸륨 염(MTT)를 착색된 포르마잔 산물로 환원시킨다. 유사한 산화환원-기반 분석법이 형광 염료인 레사주린를 이용해서도 개발되었다. 생존능 모니터링을 위해 세포의 산화환원 전위를 나타내는 염료를 이용하는 것에 대해, ATP 함량을 생존능의 마커로서 사용하는 분석법들도 이용가능하다. 이러한 ATP-기반 분석법에는 ATP가 루시페라제 반응의 제한 시약인 생물발광분석이 포함된다. 세포독성 역시도 설포로다민 B (SRB) 분석, 수용성 테타르졸륨염(WST) 분석 및 클로노젠 분석법에 의해 측정가능하다. 실시간으로 부착 동물 세포의 세포독성 반응에 따른 무표지 접근법은 세포가 금-필름 일렉트로드 상에 성장할 때 전기임피던스 측정에 기반한다. 이 기술은 전기 세포-기질 임피던스 감작화(ECIS: electric cell-substrate impedance sensing)이라 칭해진다.
또 다른 특정 구체예에서, 약물은 그 약물이 방출되는 대응하는 전구약물보다 더 세포독성적이다. 화합물의 세포독성은 대체로 그의 IC50 인 비보에서 최대 효과의 50%를 달성하는데 필요한 화합물의 농도를 나타내며 절반최대 억제 농도라 칭해진다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 활성 약물은 그의 대응하는 전구약물보다 데 세포독성적이다. 이것은 IC50 of the 전구약물의 IC50 / 약물의 IC50 비율인 QIC50 값을 이용하여 평가할 수 있다. QIC50 값은 5 또는 그 이상, 예컨대 10 또는 그 이상, 102 또는 102 초과 103 또는 103 초과 , 104 또는 than 104 초과, 또는 심지어 그 보다 더 높을 수 있다. 좋기로는 QIC50이 102를 초과하고, 더욱 좋기로는 103보다 큰 것이 바람직하다.
본 발명의 문맥상 사용가능한 전구약물의 설명목적의 비제한적인 예로는 글리코시드 전구약물, 예컨대 듀오카르마이신-유래된 갈락토실전구약물s, N-(베타-D 갈락토피라노실옥시카르보닐)-독소루비신 및 N-[4-(베타-D-갈락토피라노실)-3-니트로벤질옥시카르보닐]다우노마이신; 5-플루오로시토신; 세팔로스포린 전구약물, 예컨대 PROTAX (탁솔의 세팔로스포린 유도체), C-DOX (독소루비신의 세팔로스포린 유도체), CCM (세팔로스포린 머스타드 전구약물), 등; 팔리톡신 전구약물 NHPAP, 독소루비신 전구약물 DPO, 콤브레타스타틴 전구약물 예컨대 콤브레타스타틴 A-4 전구약물 (CA-4PD), 비스포스포네이트 전구약물 예컨대 비스포스폰아미다테클로드로네이트 등을 들 수 있다 (Donald J. Abraham ed., 2001, Wiley) 및 "Design 및 Applications of Prodrugs" (H. Bundgaard ed., 1985, Harwood Academic Publishers) 참조.
별법으로, 적어도 기능적으로 활성적인 본 발명의 효소의 일부에 링크된 본 발명의 항체를 적어도 포함하는 융합 단백질들은 재조합 DNA 기술 및 공지기술을 이용하여 구축될 수 있다.
비록 인간, 특히 인간 또는 인간화 항체가 다양한 응용에 적합하지만, 특히 인간 대상자에서 치료용 의약의 제조에 있어서 다른 항체 다른 기원의 항체항체 사용이 관여된 것들이 특정 용도에 적합할 것이다. 본 발명의 비인간 항체는 예컨대 항체-생산 동물 예컨대 마우스, 래트, 래빗, 염소, 당나귀, 또는 비인간 영장류 예컨대 원숭이 (예컨대, 시노묠구스 원숭이 또는 레수스 원숭이) 또는 유인원 (예컨대, 침팬지)과 같은 항체-산생 동물로부터 유래할 수 있다. 본 발명의 비인간 항체는 에컨대 인 비트 및 세포-배양체 기반 적용에서 사용가능하고, 본 발명의 항체에 대한 면역반응이 일어나지 않는 기타 적용은 일어나지 않으며, 무의미하고 회피가능하며, 고려대상이 아니거나 목적대상이 아니다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 질병의 치료 방법에 사용되기 위한 본 발명의 항체에 관한 것으고, 상기 치료 방법은 표적 세포, 즉, CCR9를 발현하는 세포(CCR9+)를 살해하고; 또는 이 측면에 따라 달리 발현된 세포를 살해하는 것을 포함하며; 본 발명은 질병 치료용 의약을 제조하는데 있어서의 본 발명의 항체의 용도에 관한 것으로, 상기 치료는 표적 세포, 즉, CCR9를 발현하는 세포(CCR9+)를 살해하는 것을 포함하는 것이다. 이러한 적용을 위해, 본 발명의 항체는 이하에 상술되고 참조병합되는 의약 조성물에 포함되어 투여되는 것이 바람직하다. 특정한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체, 예컨대, 실시예에서 91R 및 92R mAbs로 동정된 항체이다. 또 다른 특정 구체예에서, 표적 세포는 CCR9를 발현하는 종양 세포 또는 CCR9를 발현하는 비종양 세포이며, 상기 세포에서 CCR9의 발현 및/또는 양 및/또는 분포가 변경되는 질병 또는 종양에 관여하는 것이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 질병 또는 상태는 T-세포 급성 림프모구 백혈병, 전립선암, 유방암, 흑색종, 난소암, 대장암, 폐암, 고형 종양으로부터의 순환 세포, 크론병, 염증성 장질환, 간 섬유증, 및 급성 간 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 조영 기술을 이용함으로써 종양 진단에서 사용되기위한 본 발명의 항체에 관한 것으로, 여기서 상기 종양은 CCR9를 발현하는 세포 (CCR9+)를 포함하는 것이거나, 또는 달리 표현하면, 이 측면에서, 본 발명은 종양이 CCR9를 발현하는 세포 (CCR9+)와 연관된 것인, 조영 기술을 이용하는 인 비보 종양 진단을 위한 조성물의 제조시 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다. 이를 위해, 본 발명의 항체는 의약 조성물에 첨가 및 투여되는 것이 바람직하다. 특정한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체, 예컨대 실시예에서 91R 및 92R mAbs라로 동정된 것들이다. 또 다른 특정 구체예에서, 조영 기술은 핵 의학에서 사용되는 조영 기술이다. 이들 기술의 예로는 섬광그래피, SPECT, 및 PET를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 통상의 기술자는 이들 기술을 실시하기 위해서는, 본 발명의 항체를 적절한 방사능핵종으로 표지시켜야 함을 이해할 것이다. 이 측면에 이용가능한 적절한 방사능핵종은 본 명세서의 다른 부분에서 설명된 바 있고 이 항목에 참조 병합된다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 종양은 T-세포 급성 림프모구 백혈병, 전립선암, 유방암, 흑색종, 난소암, 대장암, 폐암, 및 고형 종양으로부터의 순환 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CCR9를 발현하는 세포(CCR9+)를 포함하는 종양에 약물을 표적화하는데 사용되기 위한 본 발명의 항체에 관한 것이다; 달리 표현하면, 이 측면에서 본 발명은 CCR9를 발현하는 세포(CCR9+)를 포함하는 종양에 약물을 표적화하기 위한 조성물을 제조하는데 있어서의 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 따라서 종양에 대해 나노-비히클과 같은 비히클인 것으로 간주될 수 있다. 이 적용을 위해, 본 발명의 항체는 의약 조성물에 첨가되어 투여되는 것이 바람직하며 이 의약 조성물에 관하여는 이하에서 보다 상세히 설명한다. 특정한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체, 예컨대, 실시예에서 91R 및 92R mAbs로서 동정된 항체이다. 또 다른 특정 구체예에서, 약물은 독소, 항생제 또는 화학치료약물, 방사능동위원소, 상자성 이온, 붕소 어덴드, 시토카인, 감광제, 방사능감작화제, 혈관확장제, 면역조절제, 면역억제제, (글루코)코르티코이드등으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 그의 상세는 이하에서 더욱 상세히 설명한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 종양은 T-세포 급성 림프모구 백혈병, 전립선암, 유방암, 흑색종, 난소암, 대장암, 폐암, 및 고형 종양으로부터의 순환 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 염증 질환에서 CCR9을 발현하느 세포를 고갈시킴으로써 상기 염증 질환을 치료하는데 사용되기 위한 본 발명의 항체에 관한 것으로; 달리 표현하면, 이 측면에 따라, 본 발명은 CCR9를 발현하는 세포를 고갈시킴으로서 염증 질환을 치료하기 위한 의약 조성물의 제조에 있어서 본 발며의 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 따라서 나노-비히클과 같이 염증 질환에 대한 비히클로서 간주될 수 있다. 일 구체예에서, 염증 질환은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하고 본 발명의 항체가 상기 염증 질환에 참여하는 CCR9를 발현하는 세포를 고갈시키는 것인 염증 질환이다. 이 적용을 위해, 본 발명의 항체는 이하에서 상세하게 설명되는 의약 조성물에 첨가되어 투여되는 것이 바람직하다. 특정한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 예컨대 실시에에서 91R 및 92R mAbs로서 동정된 모노클로날 항체이다. 또 다른 특정 구체예에서, 약물은 독소, 항생제 또는 화학치료약물, 방사능동위원소, 상자성 이온, 붕소 어덴드, 시토카인, 감광제, 방사능감작화제, 혈관확장제, 면역조절제, 면역억제제, (글루코)코르티코이드등으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 그의 상세는 이하에서 더욱 상세히 설명한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 염증 질환은 크론병, 염증성 장질환, 간 섬유증, 및 급성 간 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 측면은 샘플 내 CCR9 단백질을 검색, 위치결정 및/또는 정량하기 위한 바이오테크놀로지 기술에 있어서의 도구(tool)로서의 본 발명의 항체의 용도에 관한 것으로, 이하에서 "본 발명의 제3 용도"라 칭한다.
그러므로, 본 발명의 항체는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학 수단에 의해 그의 위치 결정 및/또는 동정을 가능케하는 검색가능한 표지 또는 표지 물질로 표지될 수도 있다. 따라서, 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 표지 물질을 포함한다.
본 명세서에서 "검색가능한 표지( detectable label )" 또는 "표지 물질(labelling agent )"은 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학 수단에 의해 적절한 검색 절차 및 rwkdql를 이용하여, 그것이 부착된 분자의 검색, 위치결정 및/또는 동정으르 가능케 하는 분자 표지를 가리킨다.
따라서, 특정한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 후속적이 검색이 가능하도록 변형된다. 따라서, 본 발명은 항체 검색을 가능케 하는 검색가능한 물질로 본 발명의 항체를 변형시킬 가능성도 포괄한다. 검색가능한 물질의 비제한적인 예로는 방사능 동위원소 및 형광 그룹을 들 수 있다.
특정한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 방사능동위원소에 의해 변형된다. 본 발명에 사용되기에 적합한 방사능동위원소의 비제한적인 예로는 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At 및 213B를 들 수 있다. 방사능동위원소 표지는 DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA 및 TETA와 같이 금속 이온을 착화시킬 수 있는 킬레이팅 리간드를 이용함으로서 흔히 수행된다. 방사능동위원소를 단백질에 컨쥬게이트시키는 방법은 종래기술로부터 잘 알려져 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 형광 그룹으로 표지된다. 형광 그룹은 연결기를 통해 또는 직접 아미노산의 측쇄에 부착될 수 있다. 폴리펩타이드 형광 시약을 컨쥬게이트 시키는 방법은 종래기술로부터 잘 알려져 있다.
항생제와 같이 폴리펩타이드를 형광 그룹으로 표지시키는데 적절한 시약에는 단백질의 측쇄에서 다양한 수록 기들과 반응하는 능력을 나타내는 화학 그룹이 포함되며 아미노기 및 티올기가 이에 속한다. 그러므로, 발명에 따른 항체를 변형하는데 이용될 수 있는 화학기의 비제한적인 예로는 말레이미드, 할로아세틸, 요오도아세트아미드숙신이미딜 에스테르 (예컨대 NHS, N-히드록시숙신이미드), 이소티오시아네이트, 술포닐 클로라이드, 2,6-디클로로트리아지닐, 펜타플루오로페닐 에스테르, 포스포르아미다이트 및 등을 들 수 있다. 적절한 반응성 관능기의 예로는 카르복실기에 의해 변형된 검출가능한 기의 N -히드록시숙신이미드 에스테르 (NHS)를 들 수 있다. 일반적으로, 형광 화합물을 변형시키는 카르복실기는 상기 화합물을 카르보디이미드 시약(예컨대, 디시클로헥실카르보디이미드, 디이소프로필카르보디이미드, 우로늄 또는 시약 예컨대 TSTU (O-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트), HBTU((O-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트), 또는 HATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트), 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt) 유형의 활성화제 및 표지의 NHS 에스테르를 부여하는 N-히드록시숙신이미드)과 접촉시킴으로써 활성화된다.
본 발명의 제3의 용도에 사용하기에 적합한 형광 화합물로는 에티디움 브로마이드, SYBR 그린, 플루오레신 이소티오시아네이트 (FITC), 로다민테트라메틸isotiol (TRIT), 5-카르복시플루오레신, 6-카르복시플루오레신, 플루오레신, HEX (6-카르복시-2',4,4',5',7,7'-헥사클로로플루오레신), 오레곤 그린 488, 오레곤 ㄱ그린 500, 오레곤 그린 514, Joe (6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시 플루오레신), 5-카르복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레신,5-카르복시로다민, 로다민, 테트라메틸로다민 (Tamra), Rox (카르복시-X-로다민), R6G (로다민 6G), 프탈로시아닌, 아조메타지나스, 시아닌 (Cy2,Cy3 및 Cy5), 텍사스 레드, 프린스턴 레드, BODIPY FL-Br2, BODIPY 530/550, BODIPY TMR, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY TR, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, DABCYL, 에오신, 에리쓰로신, 에티디움 브로마이드, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 그의 유사체, 무기-기반 형광 반도체 나노결정(Quantum Dot)을 들 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 결합쌍의 제1 멤버에 컨쥬게이션에 의해 표지된다. 바람직한 일 구체예에서, 이 변형은 공유적 바이오티닐화이다. 본 명세서에서 용어 "바이오티닐화"는 바이오틴을 분자(일반적으로 단백질)에 공유 결합시키는 것을 가리킨다. 바이오티닐화는 상기 단백질의 측쇄에 컨쥬게이트할 수 있는 바이오틴 시약을 이용하여 수행되며, 상기 단백질의 측쇄에 함유된 일차 아미노기와 티올기상에서 상기 컨쥬게이션이 주로 일어난다. 아미노기의 바이오티닐화에 적합한 시약에는 바이오틴 및 숙신이미드 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르 또는 알킬 할라이드와 같이 아미노기와 반응할 수 있는 기를 포함하는 분자가 포함되며, 여기서 바이오틴 모이어티와 반응성기는 여하한 길이 (예컨대 8-40 아미노산 길이)만큼의 스페이서에 의해 이격되어 있다. 이러한 물질의 몇가지 예로는 바이오티닐화 NHS-바이오틴 (바이오틴과 NHS기 사이에 5개의 탄소원자의 에스테르 결합을 함유), 술포-NHS-바이오틴, NHS-LC-바이오틴, 술포-NHS-LC-바이오틴, NHS-LC-LC-바이오틴, 술포-NHS-LC-LC-바이오틴, 술포-NHS-SS-바이오틴, NHS-PEO4-바이오틴, PFP-바이오틴, TFP-PEO-바이오틴 등을 들 수 있는데, 여기서 "NHS"는 N-히드록시숙신이미드, "LC"는 NHS와 바이오틴 기 사이에 위치하는 6개 탄소 원자의 아미드 결합, "PEO"는 에틸렌옥사이드기를 가리키며, 아래 첨자는 PEO 단위의 갯수를 가리키고, "PFP"는 펜타플루오로페닐기를, "TFP"는 테트라플루오로페닐기를, "술포"는 술포네이트기(SO3)를 가리키고 "SS"는 다이설파이드기를 가리킨다. 티올기가 있는 바이오티닐화 시약의 예로는 여하한 길이의 스페이서에 의해 이격된 말레이미드 또는 알킬 할라이드 타입을 들 수 있다. 바이오티닐화 시약의 예로는 말레이미드-PEG-바이오틴, 바이오틴-BMCC (말레이미도기 N-말단 및 시클로헥실기, 2개의 아미드 및 9개의 탄소 원자 링커를 함유함), PEO-요오도아세틸 바이오틴, 요오도아세틸-LC-바이오틴, 바이오틴-HPDP (피리딜디술파이드를 함유함) 등을 들 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 콜로이달 금 나노입자를 비롯하여 금(Au)와 같은 금속 이온으로 표지되어 정전기적 상호반응을 통해 항체에 직접 결합될 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 콜로이달 금 나노입자는 바이오틴에 미리-커플링되어 항체에 공유결합될 수 있다.
본 발명의 항체를 샘플 내에 존재하는 CCR9, 또는 CCR9를 발현하는 세포의 검색 및/또는 정량에 사용하는 것은 본 발명의 또 다른 측면이다. 본 발명의 항체에 의한 샘플 내에 존재하는 CCR9, 또는 CCR9를 발현하는 세포의 존재를 검색 및/또는 정량은 인 비트로에서 수행가능하다. 본 발명의 항체의 이용은 샘플 내 CCR9, 또는 CCR9를 발현하는 세포의 검색, 동정 및/또는 정량을 위한 여하한 면역화학 또는 면역형광 분석법에 의해 수행가능하다. 면역화학 또는 면역형광 분석법의 예로는 면역센서, 면역침전, 웨스턴 블롯, 도트 블랏, 방사능면역분석법, 면역형광, 면역세포화학, 면역조직화학 및 유세포분석을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
샘플 내 CCR9, 또는 CCR9를 발현하는 세포의 존재를 검색, 동정 및/또는 정량하기 위하여 본 발명의 항체를 사용하려면 샘플 내 CCR9, 또는 CCR9를 발현하는 세포의 존재를 검색, 동정 및/또는 정량하기 위한 인 비트로 방법을 실시할 필요가 있으며, 이 방법은:
i) 테스트 샘플을 본 발명의 항체와 접촉시키고,
ii) 상기 항체와의 면역 복합체의 형성을 검색 및/또는 정량하는 것을 포함한다.
상기 방법은 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다.
본 발명의 방법을 이용하여 광범위한 면역화학 분석 포맷을 이용할 수 있다. 이러한 면역화학 기술 분석에는 ELISA, 면역분서거 스트립 또는 LFIA, 면역센서, 면역친화성 추출 시스템, 면역침전, 웨스턴 블롯, 도트 블랏, 방사능면역분석법, 면역형광, 유세포분석, 면역세포화학 및 면역조직화학이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
통상의 기술자라면 알아차리는 바와 같이, 샘플 내 CCR9의 존재의 검색, 동정 및/또는 정량은 CCR9+ 순환 종양 세포의 검색, 특히 CCR9+ 줄기 세포의 CCR9+ 세포성 부분모집단의 표현형 분석을 비롯하여 많은 응용에 본 발명의 항체를 이용할 수 있게 한다.
CCR9+ 순환 종양 세포의 검색은 일반적으로 순환 종양 세포 강화(enrichment) 단계를 포함하는데, 이것은 물리적 특성(크기, 밀도, 전기전하, 기형성) 및 생물학적 특성(표면 단백질 발현, 대개 EpCAM 발현 및 CCR9 발현)을 포함하여, 주변의 정상 혈액 세포와 이들을 구별짓는 순환 종양 세포의 상이한 특성들에 기초하여 대량의 기술 패널을 포함하는 단계이다. 강화 단계 후에도, 순환 종양 세포 분획은 대체로 백혈구를 실질적인 수로 여전히 함유하며, 따라서, 단일 세포 수준에서 종양 세포를 정상적인 혈액 세포로부터 구별할 수 있는 방법에 의해 순환 종양 세포를 동정할 필요가 있다. 단백질-기반 전략들 중에서도, 세포를 시토케라틴(CK: 양성 마커), 흔한 백혈구 항원 CD45 (음성 마커) 및 핵 염료(DAPI)에 대해 형광 염색하면; 순환 종양 세포가 CK+/CD45-/DAPI+ 세포로서 동정된다. 이어서 순환 종양 세포가 풍부한 샘플을 여러가지 상이한 분석법, 예컨대 본 발명의 항-CCR9 항체를 이용한 직접 검색법 또는 본 발명의 항-CCR9 항체에 의해 코팅된 마이크로포스트 어레이로 이루어진 순환 종양 세포-칩을 이용한 검색법으로 시험할 수 있다.
본 발명의 항체는 예컨대 표현형 포유동물 세포에 대한 마이크로어레이의 일부로서 CCR9+ 세포의 부분모집단, 특히 CCR9+ 줄기 세포의 표현형 분석에 이용가능하다.
본 발명의 항체는 또한 CCR9를 발현하는 세포, 예컨대 중간엽 줄기 세포의 분리 또는 정제에도 이용가능하다. 그러므로, CCR9를 발현하는 세포 예컨대 중간엽 줄기 세포의 분리 및/또는 동정에 본 발명의 항체를 이용하는 것도 본 발명의 또 다른 측면이다. 통상의 기술자는 본 발명을 이용하여 분리된 중간엽 줄기 세포가 세포 재생성 치료법에 유용함을 이해할 것이다.
CCR9를 발현하는 세포의 분리 및/또는 정량을 위해 고형, 가용성 페이즈의 광범위한 포맷이 사용될 수 있다.
본 발명의 항체의 특별한 적용은 백혈구분반술(leukopheresis)와 같은 기술에 사용하는 것이다. 본 명세서에서 "백혈구분반술"은 백색 혈액 세포가 혈액으로부터 분리되고 나머지 성분들은 혈액 순환으로 되돌아가게 되는 공정을 가리킨다. 그러므로 이것은 체외(extracorporeal) 치료법이다 (몸 밖에서 행해지는 의료 행위). 백혈구분반술을 실시하는 한 가지 방법은 본 발명의 항체와 커플링된 선택적인 백혈구분반술 컬럼을 이용하는 것이다. 통상의 기술자는 이러한 응용이 예컨대 염증성 장질환을 치료하는데 유용하다는 것을 알 수 있을 것이다 (Eberhardson et al., 2013, ClinImmunol. 149:73-82).
본 발명의 키트
본 발명은 또한 전술한 방법과 용도를 실시하기 위한 키트도 제공한다.
그러므로, 또 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 본 발명의 항체를 포함하는 키트 (이하에서 "본 발명의 키트"라 칭함)에 관한 것이다.
특정한 일 구체예에서, 본 발명의 키트는 본 발명의 항체에 더해, 추가적인 치료제를 더 포함한다. 상기 치료제에 대하여는 본 발명의 항체의 용도 (예컨대 본 발명의 제1 및 제2 용도)와 관련하여 설명한 바 있으며, 이 부분에 참조 통합한다. 특정한 일 구체예에서, 상기 치료제는 본 발명의 항체에 컨쥬게이트되거나 또는 본 발명의 항체와 함께 융합 단백질을 형성할 수 있다.
본 발명의 문맥 상, "키트"는 본 발명의 방법을 수행하는데 필요한 여러가지 시약들을 한데 포함하여 이를 수송 및 저장하도록 포장한 제품으로서 이해된다. 키트의 성분들을 포장하는데 적합한 소재로는 크리스탈, 플라스틱(폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트 등), 보틀, 바이알, 종이, 엔벨롭 등을 들 수 있다. 이에 더해, 본 발명의 키트는 키트 내의 여러가지 상이한 성분들을 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 사용하기 위한 지침서를 함유할 수 있다. 이러한 지침서는 인쇄된 물질이거나 또는 전기적 저장매체(자성 디스크, 테이프 등), 광학 매체(CD-ROM, DVD) 등에 의해 대상자가 읽을 수 있도록 지침서를 저장할 수 있는 전자 매체 형태일 수 있다. 이에 더해 또는 별법으로, 이러한 매체는 상기 지침을 제공하는 인터넷 주소를 포함할 수도 있다.
본 발명의 키트는 조영 기술을 이용함으로써 특히 CCR9+ 종양 진단을 비롯한 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 진단 및/또는 예후 탐지, 또는 치료 중인 대상자에서 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료에 대한 반응을 모니터링하는 것 또는 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료 방법 특히, 표적 세포(CCR9+)의 살해를 포함하는 치료 방법 및 CCR9를 발현하는 세포의 고갈에 의한 염증 질환의 치료, 또는 CCR9+ 세포를 포함하는 종양에 약물을 표적화하는데 이용되거나 또는 바이오테놀톨로지 기술에서의 도구로서, 예컨대 샘플 중의 CCR9 단백질의 검색, 위치결정 및/또는 정량 또는 샘플 내에 존재하는 CCR9 또는 CCR9를 발현하는 세포의 검색 및/또는 정량을 위해 이용될 수 있다.
그러므로, 또 다른 측면에서, 본 발명은:
- CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 진단 및/또는 예후 탐지를 위해;
- 치료 중인 대상자에서 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료에 대한 반응을 모니터링하기 위해;
- CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태를 치료하기 위해;
- CCR9+ 세포를 포함하는 종양에 약물을 표적화하기 위해;
- 샘플 내 CCR9 단백질의 검색, 위치결정 및/또는 정량을 위한 바이오테크놀로지 기술의 도구로서; 또는
- 샘플 내에 존재하는 CCR9 또는 CCR9를 발현하는 세포의 검색 및/또는 정량을 위한 키트의 사용에 관한 것이기도 하다.
용어 "항체" 및 "CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태"에 대하여는 본 발명의 항체 및 진단/예후 탐지 방법과 관련한 문단에서 상세히 설명한 바 있으며, 그 용어와 상세는 본 발명의 제1 키트에 있어서도 동일하게 적용된다.
본 발명의 키트의 바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 중쇄 내에 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1, SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3를 함유하고, 및 그 경쇄 내에 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2 및 SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3을 포함한다.
본 발명의 키트의 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 그 중쇄 내에 SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1, SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3을 포함하고, 그 경쇄 내에 SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, SEQ ID NO: 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 aSEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3을 포함한다.
의약 조성물
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체, 또는 약학적 허용가능한 그의 유도체 또는 전구약물의 치료적 유효량을 대상자에게 투여하기 위한 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 아쥬반트, 또는 비히클과 함께 포함하는 의약 조성물 (이하 "본 발명의 의약 조성물"이라 칭함)에 관한 것이다. 상기 의약 조성물은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태에 걸린 대상자에게 투여될 경우 CCR9를 발현하는 세포를 살해하거나 또는 아폽토시스를 유도하는데 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 조성물 투여와 공존가능한 모든 용매, 분산매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약학적 활성물질을 위한 이러한 매질 및 물질의 사용은 기술 분야에 잘 알려져 있다. 종래의 매질이나 물질이 활성 화합물과 공용되지 못할 경우 예외적으로 조성물에 이를 사용하는 것을 숙고할 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이어야 하며, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌과 같은 항산화제; 보존제(예컨대 옥트아레실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드, 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파리긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물 예컨대 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; EDTA와 같은 킬레이팅제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당(sugar); 소듐과 같은 염-형성 카운터이온; 금속 복합체(예컨대 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 이에 포함된다.
본 발명의 항생제는 동일한 제형에 포함될 수도 또는 상이한 제형에 첨가되어 투여될 수도 있다. 투여는 동시, 순차로 행할 수 있고 어떠한 순서로든 효과가 있다.
보조 활성 화합물 역시도 본 발명의 의약 조성물에 병합되리 수 있다. 그러므로, 특정한 일 구체예에서, 본 발명의 의약 조성물은 치료하고자 하는 특정 질환에 요구되는 활성 화합물을 두 가지 이상, 좋기로는 서로 악영향을 미치지 않고 보충 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 화학치료제, 시토카인, 진통제 또는 면역억제제를 추가로 제공하는 것이 요망될 수 있다. 이러한 다른 활성물질의 유효량은 특히 의약 조성물에 존재하는 본 발명의 항체의 양, 질병의 유형 또는 진단 목적인지 치료 목적인지 등에 따라 달라진다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체는 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 비롯하여, 조절 방출 제형과 같이, 상기 화합물이 체내로부터 급속히 제거되지 않도록 보호해주는 담체를 이용하여 제조된다 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리아크릴산과 같은 생물분해가능하고 생물적합성인 폴리머가 이용될 수 있다. 이러한 제형의 제조방법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 이들은 예컨대 미국특허 U.S. 4,522,811에 설명된 방법에 의해 통상의 기술자가 만들어낼 수 있다.
본 발명의 항체(또는 그의 단펴)의 투여경로는 종양내 또는 비경구일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "비경구(parenteral)"에는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질내 투여가 포함된다. 비경구 투여 중 정맥내 형태가 일반적으로 선호된다. 치료 또는 진단 효과에 필요한 항체의 양은 물론 선택된 항체, 치료하고자 하는 상태의 특성 및 위중도 그리고 환자에 따라 달라진다.
이에 더해, 항체는 예컨대 항체 투여량을 감소시키면서, 펄스 주입(pulse infusion)에 의해 적절히 투여될 수 있다. 좋기로는 투여는 주사에 의해, 부분적으로는 간단히 또는 만성적으로 투여가 이루어질지에 따라, 정해지되 가장 좋기로는 정맥내 또는 피하 주사가 가장 바람직하다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 의약 조성물은 적절한 단위 투여 제형으로 멸균 용액, 현탁액 또는 동결건조 산물과 같이 비경구 투여를 위해 조정될 수 있다. 주사에 적합한 의약 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 또는 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥 투여를 위해, 적절한 담체는 생리식염수, 정균수, CremophorEM (BASF, Parsippany, N.J.) 또는 인산염완충염수 (PBS)를 들 수 있다. 모든 경우에 있어서, 조성물은 멸균되어야 하며 주사바늘을 통과할 수 있을 정도로 유동성을 갖추어야 한다. 이것은 제조 및 보관 조건하에서 안정하여야 하고 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 담체는 물, 에탄올, 약학적으로 허용가능한 폴리올 예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜 및 그의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예컨대 레시틴 코팅의 사용에 의해, 또는 분산액의 경우 요구되는 입도를 유지함으로써 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용을 예방하는 것은 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항진균 및 항세균제에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예컨대 당, 폴리알코올 예컨대 만니톨, 소르비톨 및 소듐 클로라이드를 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 조성물에 알루미늄모노스테아레이트 및/또는 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 물질을 포함시킴으로써, 주사용 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.
필요량의 적절한 용매에 전술한 1종 이상의 성분들을 조합하여 활성 화합물(예컨대 폴리펩타이드 또는 항체)을 병합시킨 다음, 여과 멸균함으로서 멸균 주사용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 베이직 분산매질 및 필요에 따라 전술한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 병합시켜 제조한다. 멸균 주사용액 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공건조 및 동결건조이며 이 방법에 의해 활성 성분 플러스 여타의 부가적인 요망되는 성분들이 앞서 그의 멸균-여과용액으로부터 수득된다.
특정한 일 구체예에서, 상기 의약 조성물은 정맥내 또는 종양내로 투여된다. 벌크화제, 완충제 또는 계면활성제와 같은 적절한 부형제가 이용될 수 있다. 언급된 제형은 스페인 및 미국 약전 및 그 밖의 유사한 참고문헌에 설명된 표준법을 이용하여 제조할 수 있다.
의약 조성물, 즉 경구 또는 비경구 주성물을 용이한 투여 및 균질한 투여량으로 투여하기 위해 단위 투여 제형으로 조성하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 단위 투여 제형이라 함은 처리 대상자에게 단위 투여하는데 적합한 물리적으로 불연속적인 단위들을 가리키며; 각각의 단위는 요구되는 의약 담체와 함께 소망되는 치료 효과를 나타내도록 계산된 소정량의 활성 화합물(본 발명의 항체)을 함유하는 것이다. 본 발명의 단위 투여 제형의 상세는 활성 화합물 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과 및 개체 치료를 위한 활성 화합물과 같은 컴파운딩에 있어 고유한 제한사항에 따라 정해지거나 그에 직접 의존한다.
일반적으로 본 발명의 항체의 유효 투여량은 선택된 화합물의 상대적 효능, 치료 대상 질병의 위중도 및 환자의 체중에 따라 달라진다. 그러나, 활성 화합물은 일반적으로 하루 1회 이상, 예컨대 하루에 1, 2, 3 또는 4회로 투여되되 전형적인 1일 총 투여량은 0.001 내지 1,000 mg/kg 체중/일, 좋기로는 약 0.01 내지 약 100 mg/kg 체중/일, 가장 좋기로는 약 0.05 내지 10 mg/kg 체중/일의 범위이다.
환자에 대한 항체의 투여 외에, 이러한 적용은 유전자 치료법에 의한 항체 투여도 고려한다. W096/07321은 세포내 항체 생성을 위한 유전자 요법의 이용에 관한 것이다.
의약 조성물은 용기, 팩 또는 디스펜서에 투여 지침과 함께 포함될 수 있다.
본 발명의 항체 및 의약 조성물은 복합 요법 제공을 위해 다른 약물과 병용될 수 있다. 다른 약물들은 동일한 조성물으 일부를 구성할 수 있으며 또는 동시에 또는 이시에 투여되기 위한 별도 조성물로서 제공될 수도 있다. 복합 요법에 적합한 약물의 비제한적인 예로는 US2005/0049286에 설명된 바와 같은 CCR9의 안타고니스트, CCL25-PE38 융합 단백질을 들 수 있다 (Hu et al., 2011, cited supra).
본 발명의 항체 및 의약 조성물은 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 및 상태와 같은 의학적 상태, 특히 T-세포 급성 림프모구 백혈병, 전립선암, 유방암, 흑색종, 크론병, 염증성 장질환을 치료하는데 유용하다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 적어도 1종의 치료제가 로딩된 나노용기에 커플링된다. 투여 후, 이 본 발명의 항체와 커플링된 이 나노용기는 표적 세포, 즉 CCR9을 발현하는 세포에 지향된다. 리포좀 및 나노입자는 흔히 사용되는 나노용기의 예시적 형태이다. 리포좀은 좋기로는 직경이 200 나노미터 미만인 것이 바람직하다. 직경이 50 내지 150 나노미터인 리포좀이 바람직하다. 특히 바람직한 것은 외부 직경이 약 80 나노미터인 다른 나노용기 또는 리포좀이다. 리포좀의 적절한 유형은 중성 인지질 예컨대 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세롤-3-포스포콜린 (POPC), 디포스파티딜포스포콜린, 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 또는 콜레스테롤을 리포좀 내 DNA를 안정화시키기 위해 소량(1%)의 양이온성 지질, 예컨대 디도데실디메틸암모늄 브로마이드(DDAB)와 함께 사용하여 제조한다.
본 발명의 항체 사용을 위한 그 밖의 적절한 용기로는 덴드리머를 들 수 있다. 용어 "덴드리머(dendrimer)"는 코어 및 코어로부터 뻗어있는 브랜칭 구조의 복수개의 껍질을 갖는 거대분자를 일컫는다. 수지상 담체(dendritic carrier)의 형상과 크기는 다양할 수 있다. 몇몇 경우, 수지상 담체는 그 형상이 대략 구형 또는 공모양일 수 있다. 또한, 수지상 담체는 직경이 약 15 옹스트롬 (A) 내지 약 250 A이고, 대응하는 분자량, 예컨대 약 500 달톤 내지 약 2백만 달톤일 수 있다. 덴드리머는 다양한 소스로부터 시판되는 것을 구입하거나 (예컨대, Dendritech, Midland, Michigan) 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 방법으로 합성할 수도 있다. 수지상 분자는 대략 저분자종과 고분자종으로 나눌 수 있다. 첫 번째 카테고리는 덴드리머 및 덴드론(dendrons)을 포함하는 반면 두 번째 카테고리는 덴드론화 폴리머, 고도분지형 폴리머 및 브러쉬-폴리머(보틀-브러쉬라고도 칭함)를 포함한다. 덴드리머와 덴드론은 반복된 분지형의 단일분산상이고 대체로 고도로 대칭인 화합물들이다. 덴드리머와 덴드론의 정의는 명확히 차이가 나지는 않는다. 덴드론은 대개 초점(focal point)라 칭해지는 단일의 화학적으로 어드레스가능한 기를 함유한다. 몰 질량 분포(molar mass distribution)의 결여로 인해 높은-몰-질량 덴드리머 및 덴드론은 거대분자이지만 폴리머는 아니다. 덴드리머의 특성은 분자 표면에 존재하는 관능기에 의해 좌우된다. 관능 분자의 수지상 캡슐화는 바이오소재 내의 활성부분 구조를 모방하는 구조인 활성 자리의 분리를 가능케 하는데, 이는 수지상 스캐폴드가 내부 기능과 외부 기능을 분리하기 때문이다. 예를 들어, 덴드리머는 그의 말단기가 카르복실기와 같은 친수성 기일 경우 수용성일 수 있다.
덴드리머는 일반적으로 다음 특성을 갖는 것으로 특징지어진다: (i) 하나 이상의 반응 자리 및 점상(point-like) 또는 상당한 크기를 가짐으로 해서 덴드리머의 최종 위상에 영향을 미치는 개시자 코어(I); (ii) 개시자 코어에 결합된 1층 이상의 분지상 반복 단위; (iii) 임의로 링킹기에 의해 덴드리머 표면에 결합된 음이온 또는 양이온기와 같은 관능성 말단기.
본 발명에서 상정되는 덴드리머는 라이신, 또는 라이신 유사체 빌딩 단위를 포함할 수 있다. 용어 "라이신 유사체"는 이전 층의 빌딩 단위에 결합할 수 있는 하나의 최정상 (apex) 카르복실기, 및 추가의 빌딩 단위, 보호기, 링커 또는 아릴산기가 결합할 수 있는 2개 또는 3개의 1차 아민기를 갖는 분자를 지칭한다. 본 발명에서 "라이신 유사체"의 예는 예컨대 글리실-lys와 같이 PCT/AU2007/000352에 설명된 것을 들 수 있다. 몇몇 특정 예에서, 덴드리머는 빌딘 단위로서 라이신만을 또는 1가지 유형의 라이신 유사체르르 포함한다.
본 발명에서 상정되는 기타 덴드리머에는 폴리아미도아민(PAMAM), 폴리(에테르히드록실아민)(PEHAM) 또는 폴리프로필렌이민 빌딘 단위가 포함된다.
코어 모이어티는 빌딩 단위에 대한 오직 1개의 결합점만을 함유하거나 또는 빌딩 단위의 결합에 추가로 이용되거나 이용되지 않을 수 있는 2개, 3개 또는 그 이상의 접점을 함유할 수 있다. 일반적으로, 결합점은 유리 아미노기이다. 코어 모이어티는 빌딩 단위로 이루어지거나 빌딩 단위를 포함하거나 또는 빌딩 단위로부터 유래할 수 있으며 또는 빌당 단위와 다른 분자일 수 있다. 코어 모이어티의 예가 PCT/AU2007/000352에 예시 및 설명되어 있다.
리포좀과 덴드리머는 정맥 투여에 적합한 약학적 담체와 함께 조합될 수 있다. 조성물의 정맥 투여는 가장 덜 침윤적이기 때문에 바람직한 경로이다. 기타 투여 경로도 소망되면 가능하다. 적절한 약학적으로 허용가능한 담체에는 염수, Tris 완충액, 인산염 완충액 또는 기타 수용액이 포함된다. 적절한 투여량은 통상의 기술자에게 알려진 공정에 의해 수립될 수 있다.
본 발명에 따른 항체에 커플링되는 리포좀과 덴드리머는 표적 세포를 살해할 수 있는 전술한 치료제를 캡슐화할 수 있다.
다음의 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하나 본 발명의 범위를 제한하려는 의도로 이해되어서는 아니된다.
실시예
재료 및 방법
세포 및 시약
케모카인 수용체 hCCR6 및 hCCR8에 의해 안정하게 형질감염된 hCCR8 및 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포를 설명에 따라 배양하였다(Zaballoset al ., 1999, J Immunol 162:5671-5; Carramolinoet al ., 1999, J Leukocyte Biol 66:837-44; Goya et al ., 1998, 160:1975-81). hCCR4, hCCR5 및 hCCR9 형질감염체는 A. Zaballos(Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spain)가 선사하였다. MOLT-4 (CRL-182) 및 Jurkat (TIB-152) 인간 T-세포 급성 림프모구 백혈병 세포주는 ATCC (Manassas, VA)로부터 구득하였다. 생물발광 MOLT-4 세포 (MOLT-4-luc)는 EGFP 및 적색 루시페라제를 인코딩하는 재조합 렌티바이러스로 감염시켜 생성시켰다 (Promega, Palo Alto, CA). EGFP를 높은 수준으로 발현하는 감염된 세포들을 FACS로 분리하고, 클로닝 및 증폭시켜 인 비보 생물발광 분석에 이용하였다. MOLT-4-luc 세포 성장은 모세포인 MOLT-4 세포와 유사하였고 이들은 표면 CCR9 발현을 유지하였다. 세포들을 10% 소 태아혈청(FBS, Lonza, Switzerland), 2 mM L-글루타민, 50 U/ml 페니실린 및 50 μg/ml 스트렙토마이신이 보강된 DMEM (완전 배지)에서 배양하였다. 심장교정술 중에 제거한 흉선 단편으로부터의 흉선세포와 인간 말초 혈액 림프구를 헬싱키 선언에 따라 환자에게 고지하여 동의 하에 수득하였다.
재조합 인간 CCL25 및 CXCL12를 Peprotech (London, UK)으로부터 구득하였다. 다음의 항체들을 사용하였다: 항-hCCR9 (112509, 마우스 mAb IgG2a; R&D, Abingdon, UK), mCCR9 (K629; 토끼 Ab; Carramolinoet al.,2001, Blood 97:850-7), hCD3-FITC (UCHT1), hCD4-Pcy5 (13B8.2), hCD8-PE (B9.11) (3종 모두 Beckman Coulter, Miami, FL 제품임), hCD31 (MEC 13.3; 래트 mAb; BD Biosciences, San Jose, CA), hCD71 트랜스페린 수용체 (H300; 토끼 Ab), PCNA (PC10; 마우스 mAb) (both from Santa Cruz Biotech) 및 control antibodies P-020 (마우스 mAb IgG2b; 본 발명자들의 연구실) 및 MPC-11 (마우스 mAb IgG2a; BD Biosciences). 3C3 항-hCCR9 mAb는 LS123-3C3-E3-1 하이브리도마 (ATCC 수탁번호 HB12653)로부터 제조하였다.
인간 CCR9 -특이적 mAb의 생성
인간 CCR9에 대한 쥐의 mAb를 인간 CCR9 서열 toBALB/c 마우스를 산생하는 pCIneo 플라스미드의 유전자 건(Bio-Rad, Hercules, CA) 입자-매개된 DNA 투여에 의해 발생시켰다. DNA를 1.6 nm 금 입자에 코팅하고 DNA/금 복합체 (2 μg/일)를 각 마우스에 전달하였다; 마우스를 제30일 및 제60일에 동량의 플라스미드로 부스트시켰다. 최종 부스트로부터 7-10일 후에 혈청을 수집하고 음성 대조군으로서 pCIneo-HEK293 세포 및 안정하게 형질감염된 hCCR9-HEK293을 이용하여 유세포분석에 의해 검사하였다. 선택된 마우스들을 제 -3일 및 제-2일에 107 hCCR9-HEK293 세포에 의해 정맥 주사하여 부스트시킨 후 P3X63Ag8.653 형질세포종(Kremer et al ., 2004, Methods MolBiol 239:243:60)으로 비장세포에 융합시켰다. 융합 2주일 후, hCCR9-HEK293 세포를 이용하여 CCR9-특이 항체에 대해 배양 상등액을 유세포분석으로 스크리닝하였다. 양성 하이브리도마를 클로닝하고, mAb를 조직 배양 상등액으로부터 정제하여 항체 이소타입을 ELISA에 의해 알아내었다 (Kremer et al ., 2004, 상기 참조).
키메라 CCR9의 생성
NheI-EcoRI 자리에 삽입된 인간 또는 마우스 CCR9 cDNA를 산생하는 pCIneo 발현 벡터를 이용하여 키메라 CCR9를 만들었다. 두 가지 벡터 모두 NheI 및 BspLI로 절단하고, 쥐의 CCR9 서열의 62 N-말단 아미노산을 함유하는 단편을 절단된 인간 CCR9 플라스미드 내로 클로닝하여 mNt/hCCR9 발현 벡터를 만들고 이를 HEK293 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 키메라 CCR9 발현을 유세포분석에 의해 평가하였다.
유세포분석
염색을 위해, 2 x 105 세포/웰을 V-보텀 96-웰 플레이트에서 원심분리하고 및 0.5% 소 태아 혈청(BSA), 1% FBS 및 0.1% 소듐 아자이드 (PBSst)를 함유하는 PBS로 세척하였다. 세포를 40μg/ml 래트 IgG (Sigma, St Louis, MO; 20 min, 4℃)와 함께 예비인큐베이션함으로써 비특이적 결합을 차단하였다. 세포를 1차 Ab(30 min, 4℃)와 함께 인큐메이션하고, 세척한 다음 FITC- 또는 PE-염소 F(ab')2 항-마우스 IgG (H+L) (Beckman Coulter; 30 min, 4℃)와 함께 인큐베이션하였다. 샘플들을 Epics XL 또는 Cytomics 세포분석기 (Beckman Coulter)를 이용하여 분석하였다.
특이적 케모카인을 이용한 경쟁 분석 연구를 위해, 세포들을 50 μl hCCL25 또는 hCXCL12 (10 μg/ml, 40min, 4℃)와 함께 인큐베이션한 다음 50 μl 91R 또는 이소타입-매칭된 mAb (0.5 μg/ml, 30 min, 4℃)를 첨가하였다. 세척 후, FITC-염소 항-마우스 IgG 항체를 첨가하였다 (30 min, 4℃). CCR9 발현을 유세포분석에 의해 평가하였다.
91R, 92RmAbs 및 3C3 항-hCCR9 mAb를 이용한 경쟁 연구를 위해, MOLT4 세포 (2x105 세포/웰)를 50 μl의 PBSst (색칠된 히스토그램) 또는 3C3, 91R, 92R 또는 이소타입 대조군 mAbs (20μg/ml, 색칠되지 않은 히스토그램)와 함께 예비-인큐베이션하였다. 4℃에서 30분 후, 50 μl의 바이오틴-표지된 3C3, 91R 또는 92R mAbs(5 μg/ml)를 다시 첨가하고 다시 20분간 추가로 인큐베이션하였다. 세척 단계 후, MOLT4 세포에 대한 항체 결합을 유세포분석에 의해 평가하였다.
웨스턴 블롯 분석
막 분획을 추출하기 위해, 세포 펠렛 (5 x 106 세포)을 저장성 완충액 (5 mM Tris/HCl pH 7.4, 50 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 2 mM EGTA)에 재현탁하고, 4회의 냉동-해동 사이클을 수행한 다음 원심분리하였다 (750 xg, 2 min, 4℃). 상등액을 원심분리하였다 (18,000 xg, 30 min, 4℃). 막 펠렛을 Halt Protease Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific, Rockford, IL)과 함께 PBS에 재현탁하고 20% SDS, , 100 mM 디티오트레이톨 (30 분, 실온 (RT))에 가용화시고 SDS-PAGE로 분석하였다. 단백질을 Immobilon PVDF 막 (Millipore, Billerica, MA)에 옮기고, 차단 (5% BSA, 5% 비유지 분유 및 PBS 중 0.05% Tween 20)한 다음, 91RmAb (1 μg/ml, 2 h, RT)로 면역블롯팅시키고 퍼옥시다제-커플링된 염소 항-마우스 IgG 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 막을 로딩 대조군으로서 항-hCD71 Ab (0.4 μg/ml, 2 h, RT)에 의해 재프로브시켰다. ECL (GE, Pittsburg, PA)을 이용하여 블롯들을 전개시켰다. 표시된 곳에서, 펩타이드-N-글리코시다제 F를 이용하여 샘플들을 N-글리코실화시켰다(PNGase F, New England Biolabs, Ipswich, MA; 1 h, 37℃).
ELISA
마이크로타이터 플레이트를 합성 펩타이드 [hCCR9 아미노산 2-22 (SEQ ID NO: 11) 또는 13-30 (SEQ ID NO: 12), 또는 BOT, 무관한 대조군 펩타이드], 염소 항 마우스 카파 경쇄 항체 (GaM kappa LC; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) 또는 BSA로 코팅하였다. 플레이트들을 BSA로 차단시키고 3C3, 91R, BOT 또는 이소타입 대조군 mAbs를 첨가하였다. 세척 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 염소 항 마우스 면역글로불린 (Dako, Denmark)을 사용하였다. 인큐베이션 후 플레이트들을 세척하고 OPD 및 H2O2로 전개시켰다. 490 nm에서의 흡광도를 측정하여 결과를 정량하였다.
3C3 mAb의 CDR의 시퀀싱
총 하이브리도마 3C3 (LS129-3C3-E3-1; ATCC 수탁번호 HB12653) RNA를 TRIzolβ Reagent (Ambion) 중 냉동 하이브리도마 세포 용해물로부터 추출하였다. PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara)의 기술설명에 따라 이소타입-특이적인 항-센스 프라이머 또는 범용 프라이머를 이용하여 총 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. VH 및 VL의 항체 단편을 GenScript의 RACE 표준 작업 공정에 따라 증폭시킨 다음 표준 클로닝 벡터 내로 개별적으로 클로닝시키고 시퀀싱하였다 (GenScript). CDR들을 다음의 Kabat 넘버링에 따라 매칭시켰다.
이동 분석( Migration assays )
5 μm 포어 크기 (Corning-Costar)의 트랜스웰 플레이트를 이용하였다. 하부 챔버에 200 nM 재조합 hCCL25 (Peprotech)이 보강된 이동 매질 (DMEM, 0,1% BSA, 10 mM HEPES) 500 μl를 채웠다. 실온에서 대응하는 mAb(100 μg/ml)와 함께 100 μl 이동 매질에서 3x105 MOLT-4 세포를 15분간 예비-인큐베이션시키고, 상부 챔버에 놓고 37℃에서 3 시간 동안 유주시켰다. 하부 챔버에서 이동된 세포들을 유세포분석기로 계수하였다.
이종이식편 분석
CNB 동물시설에서 자란 8주 내지 22주령의 BALB/c Rag2-/- 마우스들 (Taconic Farms, Hudson, NY)을 이용하였다. 동물 실험에 관한 EU 및 정부지침에 따른 유지 및 처리 프로토콜을 준수하였으며 CNB/CSIC 윤리위원회의 승인을 득하였다.
인 비보 실험을 위해 MOLT-4 세포 (2 x 106)를 제0일에 Rag2-/- 마우스의 양 옆구리에 피하 (s.c.) 접종하고; 각 6마리 마우스로 된 2개 그룹에게 항-hCCR9 91R 또는 IgG2b 대조군 mAb를 제1, 7, 14 및 21일에 복강(i.p.) 접종하였다 (제1일 및 제6일에 4 mg/kg; 제13일과 제21일에 2 mg/kg). 2차 실험에서는 MOLT-4 세포 (2 x 106)를 암컷 Rag2-/- 마우스의 한쪽 옆구리에 피하 접종하고; 각 10마리의 마우스로 구성된 2개 그룹에게 항-hCCR9 91R 또는 IgG2b 대조군 mAb를 제7, 14, 21 및 28일에 복강 접종하였다 (제7일과 제14일에 4mg/kg; 제28일과 제35일에 2 mg/kg). 종양 크기를 베르니에 칼리퍼(Mitutoyo, Kanawaga, Japan)로 측정하고 종양 크기(mm3)를 V로서 계산하였다 V = [축의 직경 길이, mm] x [(회전 직경, mm)2/2].
종양 부담(tumour burden)을 IgG2b-처리된 마우스의 그것에 상대적인 종양 크기 백분율로서 표시한다. 마우스들을 실험에 따라 제56일 또는 제69일에 희생시켰다; 마우스와 종양을 칭량하고 조직학 분석을 위해 연구를 진행했다.
생물발광 이종이식편 분석을 위해, 암컷 Rag2-/- 마우스들의 양 옆구리에 2 x　106 MOLT-4-luc 세포를 제0일에 피하 접종하였다. 24시간 후, 마우스들을 마취하고 D-루시페린 (150 mg/kg)을 투여하여 조영하고 실험 그룹에 균형있게 할당하기 위해 발광을 정량하였다. 마우스(7/그룹)에게 제1일 (4 mg/kg) 및 제6일 (2 mg/kg)에 91R 또는 이소타입 대조군 P-020 mAb를 복강 접종하였다. 제62일에 마우스들을 희생시키 전까지 6개 시점에서 마우스들에게 발광 조영을 반복하였다. 분석 10분 전에 마우스들을 Imalgene 500 (2 ml/Kg; Merial Laboratories, France) 및 Xilagesic 2% (0.6 ml/Kg; Calier Laboratories, Spain)으로 마취하였다. 암실 챔버에서 100초 동안 1394 ORCA II ERG 카메라 (Hamamatsu, Japan)를 이용하여 조영을 실시하였다. 데이터를 정량하고 슈도컬러 영상을 만들기 위해 와사비 소프트웨어(Hamamatsu)를 이용하였다.
괴사 면적의 조직학 및 정량
절제된 종양을 절반으로 나누었다; 절반은 4% 파라포름알데히드(pH 7.4)에 밤새 고정시키고 PBS로 세척한 다음 파라핀-포매하여 섹션화하였다 (5 μm).
나머지 절반은 OCT(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)에 임베드시키고, -80℃에서 드라이-아이스로 얼린 이소펜탄에서 스냅 냉동시키고 나중에 절편화하였다(8μm).
파라핀-포매된 섹션들을 표준공정에 따라 헤마톡실린/에오신-염색하고 Micromount 매질 (Leica Microsystems)에 장착하였다. Digital Sight 카메라(Nikㅇon, Japan)가 부착된 Zeiss Axiophot 현미경(Carl Zeiss, Germany)으로 영상을 포착하였다. 총 종양 섹션 및 괴사 면적을 NIH ImageJ 소프트웨어로 정량하였다.
데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 - 매개된 dNTP - 바이오틴 닉 엔드 ( nick end )
표지( TUNEL )
TUNEL에 의한 세포 사멸을 측정하기 위해, 파라핀-포매된 섹션들로부터 왁스를 제거하고 재수화시킨 다음 투과시켰다(PBS, 0.5% Triton X-100; RT, 10 min).TdT 완충 pH 6.6 (Sigma) 및 1 mM CoCl2를 이용하여 슬라이드를 예비-인큐베이션(RT, 암실에서 15분, 습식 챔버)하였다. 섹션들을 반응 믹스(재조합 말단 트랜스페라제 및 바이오틴-16-dUTP; Roche, UK)와 함께 인큐베이션하고 예비인큐베이션 완충액으로 세척하였다 (RT, 10 min). PBS 및 0.01% Tween 20을 이용하여 반응을 종결하고, 슬라이드들을 스트렙트아비딘-Cy5 (Jackson Immunoresearch; Zymed, USA; 1 h, RT)과 함께 인큐베이션하였다.
면역조직화학 ( IHC )
왁스가 제거되고 재수화된 파라핀-포매된 섹션에서 증식 세포 핵 항원(PCNA: proliferating cell nuclear antigen)을 표지함으로써 세포 증식을 정량하였다. 구연산나트륨 완충액에서 스팀 처리함으로써 (15분) 항원들을 노출시키고, 항-PCNA (2 μg/ml, PC10 마우스 mAb, Santa Cruz Biotechnology), 이어서 Alexa Fluor 488-표지된 염소 항-마우스 IgG를 이용하여 Mouse Fluorescence Detection Kit (Max Vision Biosciences, USA) 상에서 MaxFluor Mouse 염색하였다. 종양 혈관을 항-hCD31 mAb로 염색하였다. OCT-매립 섹션들을 100% 아세톤 (-20℃, 10 min)에 고정시키고, 공기건조한 다음 TBS로 세척하였다. 샘플들을 TBS (2 h, RT) 중 2.5% 염소 혈청 및 0.5% BSA로 차단하고 항-CD31 (밤새, 4℃, 80 ng/ml)로 염색하였다. 인큐베이션 및 세척 후, Alexa Fluor 647-표지된 염소 항-마우스 IgG를 첨가하였다. 모든 현미경 관찰과 관련하여 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; Sigma)로 핵을 염색하고 슬라이드에 Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, Al)를 올렸다.
조직 조영 및 분석
라이카 레이져 주사 다스펙트럼 공초점 현미경(TCS SP5, Leica Microsystems)을 이용하여 디지털 이미지를 얻었다. 이미지 스택은 20배율 렌즈를 통해 수득된 5개의 이미지 플레인으로 이루어졌다 (계산된 최적 줌 인자 2, z-step 1.39　μm). 각 종양마다, 적어도 3개의 섹션들과 섹션 당 12 내지 30개의 무작위적이고 인접되지 않으며, 중복되지 않은 필드들을 취하여 시험하였다.
Density per optical field of TUNEL- 및 PCNA-양성 핵의 광학 필드 및 CD31-양성 혈관 단편의 광학 필드 당 밀도를 정량하고 모든 광학 필드로부터의 데이터를 이용하여 계산된 양성 구조의 평균 갯수를 평가하였다. Adobe Photoshop Count Tool를 이용하여 확대된 이미지를 이용하여 정량하였다.
보체 -의존성 세포독성 ( CDC )
MOLT-4 세포 (105 표적 세포/100 μl)를 96-웰 V-보텀 플레이트에 놓고 표시된 농도의 항-hCCR9 또는 이소타입-매칭된 대조군 mAb (30 min, 37℃)과 함께 인큐베이션한 다음 원심분리 및 세척하였다. 활성 또는 56℃-열불활성화된 베이비 토끼 보체 (25%; AbDSerotec, UK)를, 1% BSA가 보강된 무혈청 DMEM 중의 세포에 첨가하였다(1 h, 37℃). 세포를 생존능 배제 마커 7-AAD (BD Biosciences; 10 min, 4℃)로 염색하고 비생존 세포의 수를 유세포분석으로 평가하였다; 각 조건을 3중으로 분석하였다. 특이적 용해를 100x (활성 보체가 있는 죽은 세포 % - 불활성 보체가 있는 죽은 세포 %)/(100% - 불활성 보체가 있는 죽은 세포 %).
통계 분석
GraphPad Prism 4 소프트웨어 (San Diego, CA)를 이용하여 통계 분석을 수행하였다. 달리 언급하지 않는 한, 통계 유의성은 Student's t-검정에 의해 p <0.05에서 수립하였다. 결과를 평균 ± SEM로 나타내었다.
실시예 1
인간 케모카인 수용체 CCR9를 특이적으로 인식하는 91RmAb
진핵 발현 벡터에서 hCCR9의 전장 코딩 서열로 면역화시킨 후 마우스 항-hCCR9 mAb를 만들었다. 엠티 벡터 또는 hCCR9를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에 대해 유세포분석으로 특이성을 먼저 평가하였다. 비록 인간 및 마우스 CCR9는 86% 서열 동일성을 갖지만, 91RmAb는 오직 인간 CCR9만을 인식한다 (도 1A). 91R은
did not crossreact with stable HEK293 transfectants expressing hCCR4, hCCR5, hCCR6 또는 hCCR8 케모카인 수용체를 발현하는 안정한 HEK293 형질감염체와 교차반응하지 않았고 (도 1A), hCCR9과 30-36%ehddlftjddmf 나타냈는데 이는 91R 특이성을 입증하는 것이다.
91R은 T-세포 급성 림프모구 백혈병 MOLT-4 세포주 상의 내인성 인간 CCR9를 인식하였지만 음성 대조군인 Jurkat 세포는 염색하지 않았다 (도 1B) (Zabelet al., 1999, J Exp Med 190:1241-56). 시판되는 항-hCCR9 (112509 mAb)를 나란히 비교하고(도 1B); 동일한 mAb 농도(10 μg/ml)에서, 91R은 112509 mAb (MFI; 49.7 vs. 3.8)에 비해 MOLT-4 세포 상에서 13배 더 높은 평균 형광 강도를 나타냈다(MFI; 49.7 vs . 3.8). 최적하(suboptimal) 농도(0.12　μg/ml)에서, 91R은 10.9의 MFI로 MOLT-4 세포를 100% 염색하였는데 이는 112509의 포화 농도에서의 시그널 보다도 높은 것이다(도 1C); CCR9에 대한 이것은 보다 높은 91RmAb 친화도 및/또는 보다 접근가능한 에피토프의 인식을 나타낸다. 91R은 또한 정상 세포 상의 인성 인간 CCR9도 인식한다. 91R은 T 세포 성숙화의 모든 단계에서 흉선세포를 염색하였으며, CD4+CD8+ DP 세포에 대해 최대 결합하였다 (도 1D). 이에 더해, 2-3%의 말초 혈액 림프구, 주로 CD3+ 모집단이 91R에 의해 염색되었다 (도 1E).
hCCR9- 및 pCIneo-HEK293 형질감염체의 막 추출물을 이용하여 웨스턴 블롯으로 91R 특이성을 추가로 평가하였다 (모의 형질감염 및 hCCR9-HEK293; 도 1G). hCCR9 형질감염체로부터의 샘플에서, 91R은 hCCR9의 평가된 분자량인 43 kDa 밴드를 특이적으로 인식하였다 (369 아미노산; MW 42,016 Da로 평가됨). 마찬가지로, 47 kDa 밴드가 Jurkat 세포 샘플이 아닌 MOLT-4에서 검색되었다. HEK293 및 MOLT-4 세포에서의 hCCR9 밴드들 간에 겉보기 분자량에서의 차이점은 글리코실화 차이에 기인하는 것일 수 있다 (도 1G).
실시예 2
91RmAb 에피토프 인식에는 hCCR9 N-말단 도메인이 필요하다
CCR9는 3개의 세포외 N-말단 (Nt), 3개의 세포내, 3개의 세포외 및 하나의 세포내 C-말단 도메인 (도 2A)으로 된 7개의 트랜스막 도메인으로 조직되어 있다. 인간과 쥐의 CCR9는 31개 잔기가 차이가 나서, 86% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 91R에 의해 인식된 hCCR9 도메인을 맵핑하기 위해, hCCR9 Nt가 쥐의 서열(mNt/hCCR9) (도 2A)에 의해 치환된 발현 벡터를 만들어 HEK293 세포에서 발현시켰다. 유세포분석 결과 K629 항-마우스 CCR9 Ab는 키메라 수용체를 인식한 반면, 91R은 그렇지 않은데(도 2A), 이는 hCCR9 Nt 도메인이 91R 에피토프 인식에 필요함을 가리키는 것이다.
hCCR9 Nt 도메인은 Asn32에서 추정되는 N-글리코실화 자리를 가지므로, 이것이 글리코사이드 에피토프 또는 펩타이드 백본을 인식하는지 확인하기 위해 91R의 인식 자리를 테스트하였다. MOLT-4 및 hCCR9-KEK293 세포 용해물을 PNGase로 처리한 다음 전기영동하고 91R로 웨스턴 블롯 처리하였다. 미처리 MOLT-4 세포 추출물은 47 kDa에서 주요 단백질 밴드를, 43 kDa에서 마이너 밴드를 나타낸 반면, PNGase-처리된 용해물에서는 단일의 39 kDa 밴드가 나타났다(도　2C). CCR9-형질감염된 HEK293 세포 추출물에서;91R은 미처리 및 PNGase-처리된 용해물에서 각각 43 및 39 kDa 밴드를 나타냈다. 이 결과는 hCCR9가 N-글리코실화된 단백질임과, 글리코실 모이어티가 91R에 의해 인식되는 에피토프의 일부도, 이를 차단하지도 않음을 확인해주는 것으로, 이 mAb가 hCCR9 펩타이드 백본을 특이적으로 인식함을 시사하는 것이다.
실시예 3
CCR9 리간드 CCL25 는 MOLT-4 세포에 대한 91R 결합을 부분적으로 차단한다
CCL25가 91R에 의한 CCR9 인식에 영향을 미치는지를 연구하기 위해, 수용체 내면화를 억제하기 위해 소듐 아자이드 존재 하에 MOLT-4 세포를 단독으로 또는 hCCL25와 함께 인큐베이션하고(40 min, 4℃), 이어서 91R과 인큐베이션한 다음 유세포분석을 실시하였다. CCL25는 91R 결합을 부분적으로 억제하였다 (도 3A). 대조군 케모카인 CXCL12가 mAb 결합에 영향을 미치지 않기 때문에 이 효과는 특이적이었는데(도 3B), 이는 CCR9 상의 CCL25 및 91R 결합 자리가 부분적으로 중복되거나 매우 근접함을 시사하는 것이다.
실시예 4
91 RmAb 은 이종이식편 내 인간 종양의 인 비보 성장을 억제한다
면역결핍 마우스에 이식된 MOLT-4 세포는 종양으로서 성장한다. 이 모델에서는 91R의 항종양 잠재능을 평가하기 위해 2가지 접근법을 이용하였다. 첫 번째 실험 디자인에서는, 2 그룹의 마우스들에게 MOLT-4 세포를 등의 양쪽 옆에 피하 접종하고(제0일); 이어서 MOLT-4 세포 이식일 다음날에 시작하여 주4회 91R 또는 이소타입-맷칭된 mAb (P-020, IgG2b)을 복강 주사하였다 (도 4A). 종양이 발달하고 이들의 크기를 마우스들을 희생시킨 날인 제56일까지 정기적으로 측정하였다. 91R-처리된 마우스의 경우 이미 제39일에 유의적으로 더 작은 종양이 확연하였다(p=; 도 4B). 제56일에, 각 마우스 그룹으로부터 종양을 제거하고 칭량하였다; 총 종양 부담 계산은, 각 그룹에 대해 종양 무게의 합으로서 측정하였는데 91R-처리군은 대조군에 비해 84 ± 18% 감소하였다 (마우스 당 종양 부담 63.3 ± 30.3 mg vs 397 ± 65 mg; p=0.0009; 도 4C). 91R-처리된 마우스로부터 나온 가장 큰 종양은 대조군 마우스의 종양의 그 어느 것보다도 작았다 (도 4D); 모든 대조군 마우스들은 종양이 발달한 반면 2마리의 91R-처리된 마우스는 종양이 없었다 (n = 6 마우스/그룹).
보다 제한적인 조건에서 91RmAb의 종양 성장을 억제하는 능력을 테스트하기 위해, MOLT-4 세포 이식으로부터 7일 후에 치료를 개시하였다. 전술한 바와 같이 1주일 간격으로 4가지 mAb 투여량으로 투여하고(도 4E) 및 마우스들을 희생시킨 날인 제69일까지 종양 크기를 측정하였다. 2 가지 마우스 그룹 간의 종양 크기의 차이는 제48일이 되자 확연해졌으며 (p=0.012; 도 4F), 종양 부담 데이터는 대조군-처리된 마우스 (163 ± 56 mg vs 451 ± 117 mg; p = 0.039; 도 4G)와 비교하여 91R-처리된 마우스는 64 ± 29% 감소를 나타내었다. 이들 실험을 위해, MOLT-4 세포를 한쪽 옆구리에만 주사하였다; 2마리의 대조군 마우스 및 4마리의 91R-처리된 마우스는 종양이 없었고, 91R-처리된 마우스로부터의 가장 큰 종양 크기는 대조군 마우스로부터의 가장 작은 종양 크기와 비슷하였다 (도 4H).
직접적인 캘리퍼 측정이 불가능하던 초기 단계에서의 종양 성장을 평가하기 n이해, 루시페라제를 발현하는 MOLT-4 세포(MOLT-4-luc)를 Rag2-/- 마우스의 등쪽 양옆구리에 주사하였다. 항체 투여 횟수 감소의 영향을 알아보기 위해, 91R 및 대조군 항체 역시 제1일 (100 μg/마우스) 및 제6일 (50 μg/마우스)에 투여하였다 (도 5A). 이식된 종양을 발광 이미징으로 모니터링하고(도 5B), 및 마우스들을 제62일에 희생시켰다. 발광 분석 결과 제2일부터 종양 성장을 나타냈고 이는 91R-처리된 마우스에서 제12일부터 억제되었다 (p=0.032; 도 5B, C). 91R 처리에 의해, 대조군에 비해 종양 부담이 총 85 ± 11% 감소하였다 (도 5D). 91R-처리된 마우스 7마리 중 3마리는 종양이 없었고, 나머지 4마리 마우스로부터의 종양은 무게 및 상대 발광도(223± 103 mg vs 1,478 ± 262　　mg; p <0.0001; 도 5 E)로부터 알 수 있는 바와 같이 대조군의 종양보다 더 작았다.
이러한 결과는 MOLT-4 마우스 모델에서 91R의 항종양 효과를 가리키는 것이다.
실시예 5
91R-처리된 종양은 증가된 괴사와 아폽토시스 뿐만 아니라 감소된 혈관싱생과 세포증식을 나타낸다
MOLT-4 종양에 미치는 91R 처리 효과를 조직화학분석에 의해 시험하였다. 검시부검으로부터 수집된 종양 이종이식편의 섹션들을 헤마톡실린/에오신-염색하고 총면적에 대한 괴사면적의 백분율을 각 종양 섹션에 대해 계산하였다; 괴사 영역은 세포가 없고 보라색 핵이 조밀하고 밀집된 영역으로 둘러싸인 것으로 정의하였다 (도 6A). 종양을 괴사 면적의 정도에 따라 다음의 3가지 카테고리로 분류하였다: 저수준 (<1%), 중간 준 (1-30%) 및 고수준 (>30%) (도 6B). 고수준의 괴사는 91R-처리된 마우스 (종양의 40%)에서만 관찰되었고; 중간 등급의 수준은 91R-처리된 마우스의 20%와 대조군 마우스의 50%였다. 각 항체 처리에 대한 빈도 분포 차이는 통계적으로 유의하였다 (p <0.0001; 도 6B).
세포 소거에 선행하고 무세포(acellular) 영역을 유도하는 아폽토시스의 정도를 구하기 위해 TUNEL 분석을 이용하였다. 대조군에 비해, 91R-처리된 종양은 아폽토시스 세포 밀도에 있어 유의적인 증가를 나타내었다 (1.93-fold; p<0.0001; 도 6C, D 좌측).
파라핀-포매된 종양 섹션의 증식 세포 핵 항원(PCNA)을 표지함으로써 세포 증식을 정량하였다; 91R-처리된 종양은 대조군 종양에 비해 증식 세포 분획이 유의적으로 감소한 것으로 나타났다 (40%; p<0.0001; 도 6C, D 중앙).
종양 성장은 종양내 혈관 신생 정도와도 연관되어 있다. 내피 마커 CD31의 면역조직화학적 검색에 의해 종양의 혈관형성을 평가하자 대조군 종양에 비해 91R-처리된 종양에서는 미세혈관 밀도가 감소한 것으로 나타났다 (50.7%; p <0.0001; 도 6C, D 우측).
이러한 데이터는 91R이 아폽토시스 세포 사멸과 괴사 수준을 증가시켜 세포 증식 및 종양내 미세혈관 밀도를 감소시킴으로써 종양 성장을 간섭한다는 것을 가리키는 것이다.
실시예 6
91 RmAb 는 보체 -의존성 세포독성을 매개한다
보체-의존성 세포독성 (CDC)은 치료적 항체에 의한 종양 세포 제거의 주요한 인 비보 메카니즘 중 하나로서, 이에 의해 보체 성분 C1q가 항체-식균화(opsonized) 세포(전통적 경로)에 동원되어 그들의 특이적 용해를 촉진하게 된다. MOLT-4 백혈병 세포의 용해를 유도하는 91R의 인 비트로 능력을 보체 고정(complement fixation)에 의해 테스트하였다. MOLT-4 세포를 91R, 112509 또는 적절한 이소타입-매칭된 mAb와 함께 예비인큐베이션한 후 베이비 토끼 보체를 첨가하였다(1 h, 37℃). 7-AAD 인코포레이션의 유세포분석에 의해 특이적인 세포 사멸을 평가하였다.
91R은 MOLT-4 세포의 촉진된 보체-특이 용해 (49 ± 2%; p <0.0001; 도7A)를 112509 mAb (18 ± 2%; p = 0.03; 도 7A)에 비해 더 높은 수준으로 촉진하였다.
91R 사용 조건을 최적화하기 위해, mAb 농도, 보체 농도 및 노출 시간을 평가하였다. 투여량-반응 실험 결과 시그모이드형(sigmoiddal) 반응이 나타났는데, 이는 0.4 μg/ml (18.4 ± 3.2%)의 농도로부터 검색되어 4 μg/ml mAb에서 30분간 40% 세포 용해를 초과하였다 (도 7B). 25% 보체와 함께 40 μg/ml 91R과 1 시간 인큐베이션하자 약 50% MOLT-4 세포 용해가 일어났으며; 보다 길게 인큐베이션하자 (5 h) 용해가 71.7 ± 4.4로 증가하였다 (도 7C). 보체 농도를 높이자 용해가 최대치인 77.3 ± 2.3로 증가하였다 (1 h, 75% 보체) (도 7D). 이러한 결과는 CDC가 마우스에 있어서 91R이 MOLT-4 종양 이종이식편을 감소시키는데 이용하는 메카니즘들 중 하나임을 암시하는 것이다.
실시예 7
92R mAb 는 인간 케모카인 수용체 CCR9 를 인식하고 이 수용체에 대한 91R mAb 의 결합과 경쟁한다
진핵 발현 벡터에 삽입된 hCCR9의 전장 코딩 서열로 면역화시킨 후 마우스 항-hCCR9 mAb 92R을 만들었다. 먼저 엠티 벡터 또는 안정하게 hCCR9를 발현하는 HEK293 세포에 대한 특이성을 유세포분석에 의해 평가하였다. 비록 인간 CCR9과 마우스 CCR9은 86%의 서열 동일성을 갖지만, 92R mAb는 인간 CCR9를 발현하는 세포만 인식한다. 92R은 hCCR9과 30-36% 동일성을 나타내는 hCCR4, hCCR5, hCCR6 또는 hCCR8 케모카인 수용체를 발현하는 안정한 HEK293 형질감염체와는 교차반응하지 않는데, 이는 92R 특이성을 입증하는 것이다. 뿐만 아니라, 92R은 T-세포 급성 림프모구성 백혈병 MOLT-4 세포주 상의 내인성 인간 CCR9를 인식하였지만 음성 대조군인 Jurkat 세포는 염색하지 않았다 (도 8A) (Zabel et al., 1999, J Exp Med 190:1241-56). 이에 더해, 앞서 설명된 mAb 91R와 함께 예비-인큐베이션된 MOLT-4 세포의 유세포 분석 결과 이 항체가 MOLT-4 세포에 대한 결합을 두고 mAb 92R와 경쟁하는 것으로 나타났다 (도 8B).
CCR9는 3개의 세포외 N-말단 (Nt), 3개의 세포내, 3개의 세포외 및 하나의 세포내 C-말단 도메인 (도 2A)으로 된 7개의 트랜스막 도메인으로 조직되어 있다. 인간과 쥐의 CCR9는 31개 잔기가 차이가 나서, 86% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 힝원으로서 hCCR9 (SEQ ID NO:11)의 아미노산 2-22에 해당하는 합성 펩타이드를 이용하여 ELISA 분석한 결과 92R mAb에 의해 인식된 CCR9 에피토프가 Nt 도메인에 국소화한다. 이 분석 결과 mAbs 91R 및 92R 두 가지 모두가 hCCR9 아미노산 2-22를 포함하는 이 합성 펩타이드에 대한 결합을 두고 서로 경쟁하는 것으로 나타낫다(도 8C).
실시예 8
91R, 92R mAbs 는 3 C3 mAb 와 구조적으로 다르다
91R 및 92R mAbs가 종래기술(WO 00/53635)에 설명된 3C3 항-hCCR9mAb와 구조적으로 상이한지 평가하기 위해, 이들의 CDR들을 서열결정(시퀀싱)하였다. 3C3 mAb의 6개의 CDR의 서열을 SEQ ID NO: 13 (CDR-H1), SEQ ID NO: 14 (CDR-H2),SEQ ID NO: 15 (CDR-H3),SEQ ID NO: 16 (CDR-L1),SEQ ID NO: 9 (CDR-L2), SEQ ID NO: 17 (CDR-L3)으로 동정하였다. 도 9에 나타낸 정렬도는 91R 및 92R mAbs의 중쇄 CDR들과 CDR-L1 및 CDR-L3 중 어느 것도 3C3 mAb의 대응하는 CDR과 동일하지 않음을 입증해준다. 실상, 오직 92R mAb와 3C3 mAb의 CDR-L2만이 동일한 서열 (SEQ ID NO: 9)을 공유한다. 이에 더해, 91R 또는 92R mAbs의 각 CDR과 3C3 mAb의 CDR 사이의 서열 동일성 백분율을 계산하였다 (표 1).
항체 91R 또는 92R과 항체 3C3 간의 서열 동일성 백분율.
항체 % 동일성 CDR-H1 % 동일성 CDR-H2 % 동일성 CDR-H3 % 동일성 CDR-L1 % 동일성 CDR-L2 % 동일성 CDR-L3
91R / 3C3 0% 26.3% 12.5% 75% 85.7% 44.4%
92R / 3C3 0% 26.3% 12.5% 87.5% 100% 33.3%
실시예 9
91R 및 92R mAbs 는 3 C3 mAb 에 의해 인식된 것과는 다른 에피토프를 hCCR9에 서 인식한다
91R mAb에 의한 hCCR9 인식 패턴을 3C3mAb의 패턴과 비교하였다. 두 가지 항체 모두 T-세포 급성 림프모구성 백혈병 MOLT-4 세포주 상의 내인성 인간 CCR9를 인식하였지만 음성 대조군인 Jurkat 세포는 염색하지 않았고 (도 10A), 91R 및 3C3 mAbs는 hCCR9-형질감염된 HEK-293의 상이한 인식 패턴을 갖는다 (도 10B). 특히, 모의-형질감염된 세포에 대해 3C3 mAb는 91R mAb보다 더 높은 비특이적 결합을 갖는다. 이러한 차이는 hCCR9로부터 유래한 합성 펩타이드를 이용하는 ELISA에 의해 추가 분석되었다. 도 11에 나타난 결과들은 91R mAb가 hCCR9의 아미노산 2-22 (SEQ ID NO: 11)에 대응하는 펩타이드를 인식하고 hCCR9의 아미노산 13-30 (SEQ ID NO: 12)에 대응하는 펩타이드에 무시해도 좋을 만한 결합을 나타낸 반면, 3C3 mAb은 이들 펩타이드들 중 어느 것과도 결합하지 않음을 가리킨다.
MOLT4 세포에 대한 91R, 92R 및 3C3 mAbs의 경쟁적 결합 분석 결과 91R 및 92R mAbs는 MOLT-4 세포에 대한 결합을 두고 서로 경쟁하는 반면 3C3 mAb는 오직 그 자신과만 경쟁하는 것으로 나타났다(도 12).
실시예 10
91R 및 3 C3 mAbs 는 MOLT4 세포에 대해 상이한 기능을 나타낸다
문헌 WO 00/53635에는 3C3 mAb가 CCR9 리간드 CCL25에 의해 유도된 MOLT4 세포의 이동을 차단한다는 설명이 있다. 91R mAb와 3C3 mAb 간의 기능 차이를 조사하기 위해 이 분석을 재현하였다. 도 13에 나타난 결과로부터 3C3 mAb는 MOLT-4 세포의 CCL25-유도된 이동을 차단하는 반면, 91R mAb는 그렇지 않음을 알 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENT?ICAS <120> ANTIBODIES AGAINST CCR9 AND APPLICATIONS THEREOF <130> P10001PC00 <150> EP13382469.8 <151> 2013-11-25 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 sequence <400> 1 Asn Phe Trp Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 sequence <400> 2 Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 sequence <400> 3 Asp Gly Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 sequence <400> 4 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Val Gln 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 sequence <400> 5 Lys Val Ser Asn Arg Phe Pro 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 sequence <400> 6 Ala Gln Ser Thr His Val Pro Arg Thr 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 sequence <400> 7 Lys Phe Trp Met Asn 1 5 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 sequence <400> 8 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 sequence <400> 9 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 sequence <400> 10 Ser Gln Ser Thr His Phe Pro Arg Thr 1 5 <210> 11 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acids 2-22 from the N-terminal extracellular domain of CCR9 isoform A <400> 11 Thr Pro Thr Asp Phe Thr Ser Pro Ile Pro Asn Met Ala Asp Asp Tyr 1 5 10 15 Gly Ser Glu Ser Thr 20 <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acids 13-30 from the N-terminal extracellular domain of CCR9 isoform A <400> 12 Met Ala Asp Asp Tyr Gly Ser Glu Ser Thr Ser Ser Met Glu Asp Tyr 1 5 10 15 Val Asn <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of 3C3 mAb <400> 13 Ser Ala Tyr Thr Trp His 1 5 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 of 3C3 mAb <400> 14 Tyr Ile His Tyr Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 of 3C3 mAb <400> 15 Asn Arg Tyr Tyr Tyr Phe Asp Val 1 5 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of 3C3 mAb <400> 16 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 of 3C3 mAb <400> 17 Phe Gln Gly Ser Leu Val Pro Pro Thr 1 5

Claims (22)

  1. a) - SEQ ID NO: 1[CDR-H1]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체;
    - SEQ ID NO: 2 [CDR-H2]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체; 및
    - SEQ ID NO: 3 [CDR-H3]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체;
    로부터 선택된 적어도 하나의 상보성 결정영역(CDR)을 포함하는 중쇄; 및

    b) - SEQ ID NO: 4 [CDR-L1]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체;
    - SEQ ID NO: 5 [CDR-L2]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체; 및
    - SEQ ID NO: 6 [CDR-L3]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체
    로부터 선택된 적어도 하나의 상보성 결정영역(CDR)을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, CCR9에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 중쇄 내에 SEQ ID NOs: 1 내지 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR들 또는 그의 변이체로부터 선택된 상기 CDR들 중 2개를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중쇄 내에 SEQ ID NO: 1 [CDR-H1]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체, SEQ ID NO: 2 [CDR-H2]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체, 및 SEQ ID NO: 3 [CDR-H3]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 경쇄 내에 SEQ ID NOs: 4 내지 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR들 또는 그의 변이체로부터 선택된 상기 CDR들 중 2개를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 경쇄 내에 SEQ ID NO: 4 [CDR-L1]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체, a CDR comprising SEQ ID NO: 5 [CDR-L2]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체, 및 SEQ ID NO: 6 [CDR-L3]에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 또는 그의 변이체를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    a) 중쇄 내에 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고, 및 경쇄 내에 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나, 또는
    b) 중쇄 내에 SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고, 및 경쇄 SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, 상기 단편은 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv, scFv-Fc, 미니바디 및 다이아바디로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  8. a) 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산, 및
    b) i)에서 정의된 핵산의 상보성 핵산
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산.
  9. 제8항에 기재된 핵산을 포함하는 벡터.
  10. 제8항에 기재된 핵산 또는 제9항에 기재된 벡터를 포함하는 세포.
  11. 대상자에 있어서 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 진단 및/또는 예후 탐지를 위한 방법으로서:
    a) 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 상기 대상자로부터의 세포를 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계;
    b) 상기 대상자로부터의 상기 샘플 중 CCR9를 검색 및/또는 정량하는 단계;
    c) 상기 대상자로부터의 상기 샘플에서 검색되니 상기 CCR9의 존재 및/또는 양 및/또는 분포를 대조군 샘플에서 검색된 CCR9의 그것과 비교하는 단계; 및
    d) 얻어진 결과를 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 존재와 결부시키는 단계
    를 포함하는 것인, 대상자에 있어서 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 진단 및/또는 예후 탐지를 위한 방법.
  12. 치료를 받는 대상자에 있어서 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료에 대한 반응을 모니터링하기 위한 인 비트로 방법으로서:
    a) 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 상기 대상자로부터 제1 시점에서 채취한 세포를 포함하는 제1 샘플과 접촉시키는 단계;
    b) 상기 제1 샘플 내의 CCR9를 검출 및/또는 정량하는 단계;
    c) 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 상기 대상자로부터 제2 시점에서 채취한 세포를 포함하는 제2 샘플과 접촉시키는 단계;
    d) 상기 제2 샘플 내의 CCR9를 검출 및/또는 정량하는 단계;
    e) 상기 제1 샘플과 제2 샘플에서 검출된 CCR9의 존재 및/또는 양 및/또는 분포를 비교하는 단계; 및
    f) 얻어진 결과를 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료에 대한 반응과 결부시키는 단계
    를 포함하는, 치료를 받는 대상자에 있어서 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료에 대한 반응을 모니터링하기 위한 인 비트로 방법.
  13. 의약으로서 사용되기 위한 것인 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  14. CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료에 사용되기 위한 것인 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  15. 제11항에 기재된 진단 및/또는 예후 탐지를 위한 방법, 또는 제12항에 기재된 모니터링 방법, 또는 제14항에 기재된 용도의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태는 T-세포 급성 림프모구 백혈병, 전립선암, 유방암, 흑색종, 고형 종양으로부터의 순환 세포, 크론병, 염증성 장질환, 간 섬유증, 및 급성 간 염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제11항에 기재된 진단 및/또는 예후 탐지를 위한 방법, 또는 제12항에 기재된 모니터링 방법, 또는 제14항에 기재된 용도의 항체 또는 항원-결합 단편.
  16. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 적어도 1종의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체와 함께 포함하는 의약 조성물.
  17. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 적어도 1종의 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, CCR9을 발현하는 표적 세포를 살해하거나, 또는 CCR9를 발현하는 표적 세포를 살해하는 것을 포함하는 치료 방법에 사용되거나, 또는 조영 기술을 이용함으로써 CCR9를 발현하는 세포 (CCR9+)를 포함하는 종양을 진단하는데 사용되거나, 또는 CCR9를 발현하는 세포 (CCR9+)를 포함하는 종양에 약물을 표적화시키는데 사용되거나, 염증 질환에서 CCR9를 발현하는 세포를 고갈시킴으로서 상기 염증 질환을 치료하는데 사용되기 위한 것인 항체 또는 항원-결합 단편.
  18. 샘플 중 CCR-9 단백질의 검색, 위치결정 및/또는 정량을 위한 바이오테크놀로지 기술, 또는 샘플에 존재하는 CCR9 또는 CCR9를 발현하는 세포의 검색 및/또는 정량에 있어서의 도구로서의 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도
  19. 샘플 중 CCR9, 또는 CCR9를 발현하는 세포의 존재를 검색 및/또는 정량하기 위한 인 빈트 로 방법으로서:
    i) 테스트 샘플을 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 것,
    ii) 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편와의 면역 복합체의 형성을 검색 및/또는 정량하는 것
    을 포함하는 샘플 중 CCR9, 또는 CCR9를 발현하는 세포의 존재를 검색 및/또는 정량하기 위한 인 빈트로 방법.
  20. 제 1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 적어도 1종 포함하는 키트.
  21. 제20항에 있어서, 치료제를 더 포함하는 것인 키트.
  22. - CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태를 진단 및/또는 예후 탐지하거나; 또는
    - 치료 중인 대상자에 있어서 CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태의 치료에 대한 반응을 모니터링하거나;
    - CCR9를 발현하는 세포가 참여하는 질병 또는 상태를 치료하거나; 또는
    - CCR9+ 세포를 포함하는 종양에 약물을 표적화하거나; 또는
    - 샘플 중 CCR9 단백질의 검색, 위치결정 및/또는 정량을 위한 바이오테크놀로지 기술에 있어서의 도구로서; 또는
    - 샘플에 존재하는 CCR9, 또는 CCR9를 발현하는 세포의 검색 및/또는 정량을 위한 것인,
    제20항 또는 제21항 중 어느 하나의 항에 기재된 키트의 용도.
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