KR101287777B1 - 가용성 ｃｅａ에 대한 내성을 가지는 약학적 조성물 - Google Patents

가용성 ｃｅａ에 대한 내성을 가지는 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간의 상피 종양의 치료를 위한 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 약학적 조성물은 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인, 인간 CEA에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 가지는 이중특이적 단일 사슬 항체를 포함하며, 여기서 상기 제2 결합 도메인은 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 일부의 CDR-H3 또는 완전한 CDR-H3을 적어도 포함한다. 또한, 상기 약학적 조성물의 제조 방법, 및 인간 CD3 항원 및 인간 CEA 항원에 대한 특이성을 보유하는 특정의 이중특이적 단일 사슬 항체 분자에 대한 의학적/약학적 용도가 개시된다.

Description

가용성 ＣＥＡ에 대한 내성을 가지는 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS WITH RESISTANCE TO SOLUBLE CEA}
Gold 및 Freedman이 인간 결장암 조직 추출물에서 종양 관련 암종배아 항원 (CEA)을 제일 먼저 기술한 것으로부터 30년이 넘었다(Gold and Freedman; J. Exp. Med. 122 (1965); 467-481).
그동안, CEA 유전자 군(gene family)과 관련된 28종의 다른 유전자/위유전자(genes/pseudogenes)가 발견되었다. CEA 유전자 군의 구성원에 대해 사용되는 명명법을 단순화하기 위한 시도로서, 상기 군을 최근 "CEA-관련 세포 부착 분자" (CEACAMs)로 개명하였고, 그 구성원에 대한 명명법이 통일되었다(Beauchemin, Exp. Cell Res. 252 (1999), 243-249). 예를 들어, 이 명명법에 따르면, 인간 CEA (CD66e)는 CEACAM5로 명명된다.
인간 CEA 유전자 군은 염색체 19q13.2에서 클러스터된다(Olsen 등 Genomics 23 (1994); 659-668). 그 29 유전자 및 위유전자는 세 개의 서브그룹, 즉 7개의 발현된 유전자를 포함하는 CEA 서브그룹, 11개의 발현된 유전자를 포함하는 임신-특이적-당단백질(PSG) 서브그룹, 및 위유전자만을 포함하는 제3 서브그룹으로 나눌 수 있다(Hammarstrom, Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67-81 ; Beauchemin, Exp. Cell Res. 252 (1999), 243-249). CEA 및 기타 군 구성원의 아미노산 서열의 분석 은, 이들이 면역글로불린(Ig) 초군(superfamily)에 속한다는 것을 밝혀냈다(Williams and Barclay, Annul. Rev. Immunol. 6 (1988), 381-405). CEA 서브그룹의 모든 구성원은 세포 표면막에 부착되는데: 쓸개 당단백질(CEACAM1 ; BGP1 ; TM-CEA; CD66a), CEA 유전자 군 구성원 1(CEACAM3; CGM1 ; CD66d) 및 CEA 유전자 군 구성원 7(CEACAM4; CGM7)는 소수성 막횡단 도메인을 갖는 반면, 암종배아 항원(암종배아 항원-관련 세포 부착 분자 5; CEACAM5; CEA; CD66e), 비-특이적 교차 반응 항원(CEACAM6; NCA; NCA-50/90; CD66c), CEA 유전자 군 구성원 2 (CEACAM7; CGM2) 및 CEA 유전자 군 구성원 6 (CEACAM8; CGM6; CD66b)은 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 지질 모이어티에 의해 형질 막에 연결된다. Ig 도메인의 수에 의존하여, CEA 단백질은 대략 300kDa에 이르는 분자량으로 고도로 글리코실화된다.
CEA 단백질의 생물학적 활성에 대해서, 종양 세포주로의 시험관 내 연구는, 몇몇 CEA 아군(subfamily)이 쓸개 당단백질을 포함하고, 종양 세포 표면에서 발현되었을 때, CEA 및 비-특이적 교차 반응 항원이 동종친화성(homophilic) 및 이형(heterotypic) 세포 부착 분자로서 작용할 수 있음을 시사했다(Oikawa 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 186 (1992), 881-887; Zhou 등, Cancer Res. 53 (1993), 3817-3822). 보다 최근에, 미생물의 공격으로부터 결장을 보호하는 선천적인 면역 방어에서 비-특이적 교차 반응 항원 및 CEA의 가능한 역할이 논의되었다(Hammarstrom and Baranov, Trends Microbiol. 9 (2001), p. 119- 125). 구체적으로, 이러한 단백질은, 미세융모의 상피세포에 도달하고 침입하는 것을 방지하는 미생물과 결합하고 이를 포획하는 것이 제안되었다.
CEA는 태아의 시기에 발현되는 종양태아성 항원이고, 건강한 성인에서는 나타나지 않으며, 암에서 재발현된다는 가설을 세웠다. 그러나, CEA는 정상의 성인 조직에서도 발현된다. 예를 들어, 쓸개 당단백질, CEA, 비 특이적 교차 반응 항원 및 CEA 유전자 군 구성원 2는 정상의 인간 결장에서 발현되며, 특히 창자 루멘과 면하는 성숙한 원주 상피 세포 및 움 입(crypt mouth)에서 고도로 분화된 세포에서 발현된다(Frangsmyr 등, Cancer Res. 55 (1995), 2963-2967; Frangsmyr 등, Tumor Biol. 20 (1999), 277-292). 보다 구체적으로, 이들 단백질은 자유로운 관강내 표면(luminal surface)을 라이닝하는 성숙한 결장 세포의 브러시 보더 당질층에 국부화된다. 쓸개 당단백질, CEA 및 비 특이적 교차 반응 항원은 또한 상피 기원의 다수의 종양에서 발현된다(Hammarstrom, Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67-81 ; Shively and Beatty CRC Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2 (1985), 355-399).
이미 1970 년대 말 및 1980년대 초에, CEA는 직장 및 기타 상피 종양의 방사성면역화(radioimmunolocalization)에 대한 선호되는 타겟 항원이 되었다. 이는 CEA가 95%의 위장관 및 췌장암에서 과발현될 뿐 아니라, 대부분의 소세포 및 비소세포 폐 암종에서도 과발현된다는 사실에 기인한다. 이는 또한 유방암종 및 두경부의 편평세포 암종에서 발현된다(Primus 등, Cancer 42 (1978), 1540-1545). 사실상, CEA는 가장 광범위하게 사용되는 임상적 종양 마커 중 하나이다. 이는 또한 직장 및 일부 기타 암에 대한 혈청 종양 마커로서 사용되는데, 그 이유는 안정성, 정상의 성인 조직에서 극도로 제한된 발현 및 상피 기원 종양에서의 높은 발현 때 문이다. 건강한 개인에서는 대량의 CEA가 결장에서 생성된다. 이는 성숙한 원주 세포의 정점의 표면으로부터 창자 루멘으로 방출되며, 분변(feces)과 함께 사라진다. 따라서, 통상적으로 건강한 개인의 혈액에서 극히 적은 수준만이 관찰된다. 예컨대, 건강한 개인의 혈액에서 CEA 수준은 2μg/l 미만이다. 반대로, 직장 및 기타 암종을 가진 환자로부터의 혈청 중 CEA 수준은 2000μg/l을 넘는 범위까지 증가한다(Thomson 등, PNAS 64 (1969), 161-167). 특히, 진행성, 악성, 또는 말기 단계 상피 종양은 높은 혈청 농도의 가용성 CEA를 빈번하게 동반한다(Fletcher; Ann. Intern. Med. 104 (1986), 66-73). CEA를 포함하는 형질 막으로부터의 성분은 형질-막 유래 소수포(vesicles)로서 표면으로부터 계속적으로 벗겨지는 것으로 알려져 있고(Taylor and Black, J. Natl. Cancer Inst. 74 (1985), 859-866; Sack 등, J Clin Invest. 82 (1988), 586-93), 이는 림프 및 혈관을 흘러서 혈액 중에서 소실된다. 종양 크기가 증가함에 따라, 더 많은 CEA가 혈액 내에 축적될 것이다. 종양 마커로서 혈청 CEA 편향(determination)의 주 사용은 결장암의 수술 후 감시에 있다. 증가한 CEA 수준은 각각, 환자의 81 % (Minton 등, Cancer 55 (1985), 1284-1290) 및 89% (Wanebo 등, Surg. Gynecol. Obstet. 169 (1989), 479-487)에서 재발 질환의 제1 징후였다. 혈청 CEA 수준은 또한 예후인자 인디케이터로서도 사용될 수 있다(Mulcahy and Benson, Curr. Oncol. Rep. 1 (1999), 168-172).
많은 상피암에서 그 과발현 때문에, CEA는 종양 마커로서 사용될 뿐만 아니라, 항암 치료에 대한 타겟으로서도 사용될 수 있다. 예를 들어, 위장관암은 인간 상피 종양의 많은 부분을 차지하며, 2001년 미국에서는 21,700의 신규 케이스의 위 암 및 135,400건의 신규 케이스의 직장암이 추산된다(Greenlee; CA Cancer J Clin 51 (2001), 15-36). 직장암은 제3의 가장 일반적인 악성종양이고, 남성 및 여성 모두에게서 암으로 인한 죽음을 가져오는 제3의 주된 원인이다(Ries; Cancer 88 (2000), 2398-2424). 이들 암에 대한 신규의 치료법을 발견하기 위한 시도에서, 항-CEA 모노클로널 항체는 CEA-양성 암에 대한 가능한 치료법으로서 조사되었다(Murakami 등, Immunol. Invest. 25 (1996), 23-35). 낮은 종양 로드(낮은 혈청 CEA 수준에 대응함)를 가진 환자들이 성공적으로 치료된 시도에 대한 한 예는 Behr 등에 의해 수행된 연구이다. 이러한 시도에서, 라베투주마브(labetuzumab)(라베투주마브는 항-CEA 모노클로널 항체 MN-14의 인간화된 형태임; Behr 등, Cancer, 94: 1373-1381 , (2002), 1559-64)의 131I-라벨된 변형체는 2상 시험에서 분석되었는데, 여기서 간 전이가 등록된 후 적은 양의 전이 질환을 가진 30명의 CRC 환자들은 5-플루오로우라실 및 폴린산(folinic acid), 또는 애주번트 세팅에 화학저항성(chemorefractory)을 가졌다. 131I-라벨된 라베투주마브의 단일 주사를 제공했다. 19명의 평가가능한 환자들 중, 3명은 부분적인 완화가 있었고, 8명은 15개월까지 지속적으로 적은 반응을 보였다. 애주번트 세팅에서, 9명 중 7명의 환자들은 3년 동안 질환이 없었고, 반면 대조군에서 동일한 기간 중 재발율은 67%였다. 환자들의 혈청 CEA 수준은 3.9 - 45 ng/ml 범위에 있었다(Behr 등, Cancer, 94: 1373-1381 , 2002). 낮은 CEA 혈청 수준(<5ng/ml)을 가진 환자에서의 다른 연구에서, 131I-라베투주마브(loc. cit.)로의 CEA 방사성-면역치료는 간에서 직장암 전이 의 절제 후 생존율을 높이는 것을 나타냈다. 23명의 환자들은 40-60 mCi/m2 131I-라베투주마브의 투여량을 받았다. 5년 생존률은 각각 치료군에 대해서는 51.3%였고, 대조군에 대해서는 7.4%였다(Liersch 등, JCO, 2005, ASCO Proc, VoI 23, No 16S: 3627).
그러나, 높은 혈청 CEA 농도를 다루는 치료적인 시도는 종종 항암 반응이 낮거나, 전혀 없는 것을 초래했다. 예를 들어, 임상에서 인간화된 항-CEA 모노클로널 항체를 평가하기 위하여 수행된 임상 연구에서, MN-14의 CDR-그래프트된 버전(hMN-14; Sharkey, Cancer Res. 55 (23 Suppl) (1995) 5935s- 5945s.)은 131I로 라벨되었다. 진행된 CEA-생성 종양을 가진 19명의 환자들은 131I 라벨된 hMN-14를 받았다. hMN-14의 생체분포, 종양 타케팅, 및 약동학적 거동은 마우스 MN-14에서 본 것과 유사하였다. 그러나, 혈장 중 상승된 CEA (> 200 ng/ml)를 가진 환자들은 주사 후 1h 내에 복합적인 라벨된 항체의 30% 이상을 가졌다. 이들 환자들 중 일부에서, 증가된 합병증은 더 낮은 혈장 CEA를 가진 환자들에서 볼 수 있었던 것보다, 혈액으로부터 더 신속히 제거되는 항체의 향상된 대사를 초래했다(Sharkey, loc. cit.). Yu 등에 의해 수행된 또다른 제1상 임상연구에서, CEA, COL-1 (Muraro, Cancer Res. 45 (1985), 5769-80)에 대한 131I 라벨된 고-친화도 마우스 모노클로널 항체(mAb)는 위장관 악성종양을 가진 환자에게서 연구되었다. 특히, 약동학으로 혈청 CEA 및 종양 덩어리의 영향을 분석하였다. 이를 위해, 진행된 위 장관 악성종양을 가진 18명의 환자들은 10 mCi/m2 내지 75 mCi/m2의 투여량으로, 131I로 라벨된 COL-1 20mg를 받았다. 혈청 CEA 수준은 6 내지 2739 ng/mL 범위였다(평균 +/- SD, 500 +/- 639). 모든 종양-관련 기관의 82%는 양성이었고, 전체의 58%는 병변이었다. 그러나, 상승된 혈청 CEA (> 500 ng/mL) 및 종양 벌크는 혈청 방사능의 제거와 직접적으로 관련된다는 것이 또다시 관찰되었다. 저자는 고도로 상승된, 순환하는 CEA 수준 및/또는 증가된 종양 벌크를 가진 환자들은 순환으로부터 131I로 라벨된 COL-1을 더욱 신속하게 제거하는 것으로 결론지었다(Yu 등, J. CIi. Oncol. 14 (1996), 1798-1809). 전이 위장관 암 및 직장암을 가진 환자들에서 요오드-131로 라벨된 인간화된 MN-14 항-CEA 모노클로널 항체로, Hajjar 등에 의한 연구에서 유사한 결과가 얻어졌다. 이러한 제1상 임상연구에서, 전 외부 빔 방사(prior external beam radiation) 후 또는 표준 화학요법 후의 21명의 환자들을 항체로 치료하였다. 21명의 환자들 중 7명은 인간 항-인간 항체(HAHAs)를 가졌지만, 역효과는 없었다. 어떠한 항암 반응도 관찰되지 않았다. 다시, 상승된 혈장 CEA 수준은 혈액 및 신체 전체로부터 항체의 제거를 증가시키는 것이 발견되었는데(Hajjar 등, Clin Colorectal Cancer, 2 (2002), 31-42), 이는 적어도 부분적으로 이 연구에서 관찰된 항암 반응의 결여에 대한 설명을 제공한다. 혈액 및 신체로부터의 치료적 항체의 신속한 제거 현상은 기관 손상을 방지하기 위하여 신체로부터 신속하게 제거되어야만 하는 면역 복합체의 형성의 증가로 설명될 수 있다. 이러한 연구를 수행한 암 환자들은 어떠한 치료 효과도 관찰할 수 없었는데, 이는 아마도 모노클로널 항체의 신속한 제거에 기인할 것이다.
면역 세포의 Fc 수용체에 의해 인식된 항체의 Fc 부분에 의해 대부분 매개될 치료적 모노클로널 항체의 신속한 제거 및 면역 복합체 형성에 의해 유발되는 문제점들을 회피하기 위하여, Fc 부분이 없는 항체 유도체(예를 들어, scFv 구조체) 또는 단편(예를 들어, Fab 및 Fab2 단편)이 임상에서 도입되고 분석되었다. 이러한 연구의 대부분은 종양 영상화 및 검출/위치선정에 관한 것이다. (예를 들어, Chester 등, Cancer Chemother Pharmacol, 46 (2000) Suppl: S8-12; Mayer 등, Clin Cancer Res, 6: (2000) 1711-1719; Begent 등, Nat Med, 2 참조) 극소수의 연구만이 임상에서 그러한 항체 유도체/단편의 치료적 효능을 연구하였다. 예를 들어, Francis 등(Francis, Br. J. Cancer 87(6) (2002), 600-607)에 의한 임상적 시도에서, scFv-카르복시펩티다아제 구조체의 항암 활성이 연구되었다. 이러한 제1상 임상연구에서, 항체 지시 효소 프로드러그 치료(ADEPT)가, 진행된 직장암종 또는 기타 CEA 생성 종양을 가진 환자들에서 사용되었다. 이를 위해서, 항체-효소 타겟팅 제제로서 박테리아 효소 카르복시펩티다아제(CPG2)에 연결된 CEA (A5B7)에 대한 마우스 모노클로널 항체의 F(ab)2 단편을 구성하는 A5CP과, 비스-요도(bis-iodo) 페놀 머스타드 프로드러그인 ZD2767P가 사용되었다. 그 결과, 어떠한 임상적 또는 방사성 반응도 이러한 연구에서 관찰되지 않았다. 전처리 혈청 CEA 수준은 1000 ng/ml 미만의 범위에 있다. 치료된 암 환자의 혈청 중 이러한 높은 CEA 농도는 이 연구에서 관찰된 항암 효과의 결여에 적어도 부분적으로 원인이 될 수 있다.
전술한 문제점들의 관점에서, 진행성, 악성, 또는 말기 단계의 상피 종양에 대한 효율적인 치료를 위한 수단 및 방법의 제공이 매우 기대된다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 약학적 조성물은 이중특이적 단일 사슬 항체를 포함하며, 이는
(a) 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인, 및
(b) 인간 CEA에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 가지며,
여기서 상기 제2 결합 도메인은 적어도 아미노산 서열 "DX1X2X3X4FYFDY"(서열식별번호 65)을 포함하고, 여기서 "X1", "X2", "X3" 또는 "X4" 는 임의의 아미노산 잔기를 나타내고, 상기 아미노산 잔기 "D"는 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧(Kabat) 위치 95에 대응하고, 아미노산 잔기 "FYFDY"는 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧 위치 100, 100a, 100b, 101, 및 102에 각각 대응한다. 한 구현예에서, "X1"은 "R" (아르기닌), "F" (페닐알라닌), "M" (메치오닌), "E" (글루탐산), 또는 "T"(트레오닌)을 나타내고; "X2"는 "G" (글리신), "Y" (티로신), "A" (알라닌), "D" (아스파르트산), 또는 "S" (세린)을 나타내고; "X3" 은 "L" (류신), "F" (페닐알라닌), "M" (메치오닌), "E" (글루탐산), 또는 "T" (트레오닌)를 나타내고; 및 "X4"는 "R" (아르기닌), "Y" (티로신), "A" (알라닌), "D" (아스파르트산), 또는 "S" (세린)을 나타낸다.
본 발명의 약학적 조성물의 한 구현예에서, 여기서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 인간 CEA에 대해 특이적인 상기 제2 결합 도메인은, 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧 위치 95-102에 대응하는 아미노산 서열 "DRGLRFYFDY" (서열식별번호 66)를 적어도 포함한다.
본 발명은 혈장 중 높은 가용성 CEA 농도를 가진 상피 종양 환자의 치료에 대해 특히 적합한 수단 및 방법을 제공한다. 그러한 높은 가용성 CEA 농도는 진행성 종양, 재발, 전이, 말기 단계 종양을 가진 상피 종양 환자의 혈청/혈장에서 및 높은 종양 로드/부하(load/burden)를 가진 환자들에서 발견되었다. 아미노산 서열 "DRGLRFYFDY" (서열식별번호 66) CEA 결합 도메인을 가진 이중특이적 단일 사슬 항체는, CEA-양성 타겟 세포뿐만 아니라, 가용성 CEA에도 결합하는 것으로 밝혀졌으며; 본 발명의 실시예 3 및 도 2와, EP B1 491031을 참조한다. 지시된 아미노산 서열 "DRGLRFYFDY"은 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧 위치 95-102에 대응한다(Harwood, Br J Cancer. 54 (1986), 75-82). 놀랍게도, 가용성 CEA에 결합함에도 불구하고, 상기 이중특이적 단일 사슬 항체는, 높은 농도의 가용성 CEA의 존재 중일지라도(1μg/ml에 이르는 가용성 CEA까지 테스트함), CEA-함유 종양 세포를 죽인다. 다시 말해, 상기 이중특이적 구조체는 CEA-양성 종양 세포에 대한 그들의 세포독성 활성에서 가용성 CEA에 의해 저해되지 않는다.
(도 5, 6, 8, 10, 19, 20, 22 및 27과 조합하여) 다음 실시예 5 및 8에서 보는 바와 같이, 아미노산 서열 "DRGLRFYFDY"을 포함하는 CEA 결합 도메인을 가지는 이중특이적 단일 사슬 항체는, 높은 농도의 가용성 CEA의 존재 중일지라도, CEA-양성 종양 세포에 대한 세포독성을 매개한다. 예를 들어, 도 10은 증가하는 양의 가용성 CEA 항원의 존재 중에서, Kato III 세포(CEA-양성 인간 위암 세포주)에 대해 재지시된(redirected) CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조체의 세포독성 분석을 나타낸다. 자극된 인간 CD8 양성 세포독성 T 세포(CTLs)가 작동 세포(effector cell)로서 사용되었다. CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL-매개 세포독성은 가용성 CEA에 대한 내성을 갖는다. 반대로 CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL-매개 세포독성 활성은 가용성 CEA의 증가하는 양에 의해 억제된다. CEAI는 마우스 mAb A5B7로부터 유도된 가변 영역이며, 여기서 CEAII VHVL는 mAb T84.66으로부터 유도된다.
중요하게도, 아미노산 서열 "DRGLRFYFDY"은 항-CEAx 항-CD3 이중특이적 단일 사슬 항체의 인간 CEA-결합 도메인(예를 들어, 인간 결합 도메인은 인간 CEA에 특이적으로 결합함)에서 사용되었을 때, 가용성 CEA에 대한 내성을 매개하는데 충분한 것으로 밝혀졌으며, 예를 들어, 도 19, 20, 22 및 27을 참조한다. 따라서, 하기에서, 여기에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체는 가용성 CEA 항원에 대한 내성이 있는 것으로 언급된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "가용성 CEA 항원에 대한 내성", "가용성 CEA에 대한 내성" 또는 관련된 용어는, 상기 이중특이적 단일 사슬 항체에 의해 매개된 종양 세포 또는 CEA-양성 타겟에 대한 세포독성이 가용성 CEA의 농도의 증가에 의해 영향을 받지 않는다는 사실을 의미한다. 특히, 세포독성 활성은 높은 농도의 가용성 CEA(1μg/ml 까지 테스트됨)에 의해서도 억제되지 않는다. 전술한 바와 같이, 건강한 개인들의 혈액 중 CEA 수준은 2ng/ml 미만이다. 암 환자의 혈청/혈장에서 높은 가용성 CEA 농도는 진행성, 재발, 전이, 또는 말기 단계 암, 및 높은 종양 로드를 가진 환자에 대한 특징이다. 따라서, 본 발명은 혈장 중 그러한 높은 가용성의 CEA 농도를 가진 상피 종양 환자의 치료에 특히 적합한 수단 및 방법을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "높은 가용성의 CEA 농도"는 10, 20, 50, 70, 80, 90 또는 100 ng/ml보다 높은 가용성 혈청/혈장-CEA 농도를 나타낸다. 이러한 혈청/혈장-CEA 농도는 특히, ELISA에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 가용성 혈청/혈장-CEA 농도는, 예를 들어 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 100 ng/ml보다 높다.
가용성 CEA 항원에 대한 내성을 가지는 상기 이중특이적 단일 사슬 항체의 생성은 하기 실시예들로부터 명백한 바와 같이, 쉬운 일이 아니다. 예를 들어, 막-부착 CEA에는 결합하지만, 가용성 CEA에는 결합하지 않는 것으로 알려진, 모노클로널 항체(mAb)로부터 유도된 CEA 결합 도메인을 가지는 이중특이적 단일 사슬 항체, 즉, mAb PR1A3 (Durbin, Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (1994), 4313-7)는 생성될 수 없고: 이중특이적 단일 사슬 항체 형태로 사용될 때에, 항-CD3x 항-CEA 이중특이적 단일 사슬 구조체의 어떠한 발현/분비도 달성될 수 없다. 상기 생성을 위해 PR1A3 (Durbin, loc. cit.)의 인간화된 버전이 사용되었을 때, 이중특이적 단일 사슬 항체 구조체는 숙주 세포로부터 발현되고 분비된다. 그러나, 막 부착 CEA에 대한 항-CEA 결합 도메인의 어떠한 결합도 얻을 수 없었다.
상세히 설명된 모노클로널 항체 T84.66 (Neumaier, M. 등, Cancer Res 50 (1990), 2128-34) 또는 MFE-23 (Boehm, M. K. Biochem J 2 (2000), 519-28)으로부터 유도된 이중특이적 단일 사슬 항체가 생성되었을 때, 이들 이중특이적 항체는 가용성 CEA 항원에 대해 매우 민감하며, 즉, CEA-양성 타켓 또는 종양 세포에 대한 그들의 세포독성 활성이 가용성 CEA 항원의 존재 중에서 차단되었다. 상기 구조체가 가용성 CEA에 대해 결합하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 가용성 CEA 항원이 항체가 막-부착 CEA에 결합하는 것을 방지하며, 그에 의해 항체-매개 세포독성 활성을 차단하는 것으로 결론지어졌다. 예를 들어, 도 7은 가용성 인간 CEA의 존재 중 CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포로 재지시된 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조체의 세포독성 분석을 나타낸다. 자극된 인간 CD8 양성 세포독성 T 세포(CTLs)가 작동 세포로서 사용되었다. CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL의 세포독성 활성은 증가하는 양의 가용성 CEA에 의해 완전하게 억제된다. CEAII VHVL는 mAb T84.66으로부터 유도되고; SEQ ID NO.77은 항-CD3 VH-VL 도메인이다.
가용성 CEA 항원에 대한 내성은 이중특이적 단일 사슬 항체에 대해서만 발견될 수 있으며, 그 CEA 결합 도메인은 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 아미노산 서열 "DRGLRFYFDY"를 포함한다(Harwood, Br J Cancer. 54 (1986), 75-82). MFE-23- 및 T84.66-유도 이중특이적 단일 사슬 구조체에 대해서, A5B7-유도 이중특이적 단일 사슬 항체는 가용성 CEA에 결합한다. MFE-23- 및 T84.66-유도 이중특이적 단일 사슬 구조체에 대해 얻어진 결과의 견지에서, 가용성 CEA가 A5B7-유도 단일 사슬 이중특이적 항체 구조체에서의 세포독성 활성에 영향을 미치지 않는 것을 기대할 수 없었다.
전술한 바와 같이, 인간에서 CEA-함유 상피 종양에 대해 지시된 많은 치료적 시도는 암 환자의 혈장에 있는 가용성 CEA 항원의 높은 수준의 존재에 의해 심각하게 방해된다. 예를 들어, 혈장 중 높은 CEA 농도의 존재에서 치료적인 항-CEA 모노클로널 항체의 증가된 면역-복합체 형성 및 소실은 몇몇 임상적 연구에서 관찰되었다. 또한, 가용성 CEA 항원 - 진행성 종양, 재발 암, 전이암, 높은 종양 로드/부하, 또는 말기 종양을 가진 암 환자의 혈청 중에 종종 높은 농도로 존재함 - 은 CEA-양성 종양 세포에 대해 지시된 치료를 저해하고, 그에 따라, 종양 세포 인식 및 파괴를 방해한다. 따라서, 종양에 도달하는 치료제의 실제 양은 감소되고, 이는 감소되거나, 낮은 또는 심지어는 항함 활성이 전혀 없게 되는 것을 초래한다. 이러한 한계는 예를 들어, 치료적 종양 세포 상호작용을 방지할 가망 없이 매우 적은 양의 가용성 CEA 항원을 가진 환자들에 대한 항체-기반 접근을 지금껏 제한하고 있다.
본 발명에서는, 인간 CD3 및 인간 CEA에 대해 특이성을 가진 이중특이적 단일 사슬 항체-치료제를 생성하는 것이 가능한 것을 발견하였으며, 여기서 종양 세포에 대해 지시된 세포독성 활성은, 심지어 높은 농도의 가용성 CEA 항원(1μg/ml에 이르는 가용성 CEA까지 테스트됨)에 대한 내성을 가진다. 이러한 발견은 본 발명의 이중특이적 단일 사슬 항체가 가용성 CEA 항원에 결합한다는 사실의 관점에서 전혀 예측되지 않았다(본 발명의 실시예 3 및 도 2 참조; 및 EP B1 491031 참조). 그럼에도 불구하고, 여기서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체는, 종양 세포에 대한 그 세포독성 활성에서 매우 높은 수준의 가용성 CEA의 존재에 대해 완전히 내성을 갖는다. 따라서, 본 발명은 재발 암에 대해서, 전이에 대해서, 높은 종양 로드/부하를 가진 환자들에 대해서, 또는 말기암에 대해서 예를 들어, 종양 진행 중 관찰된 바와 같이, 혈장 중 높은 가용성 CEA 농도를 가진 종양 환자의 치료에 대해 특히 적합한 수단 및 방법을 제공한다.
본 발명에 따라서, 용어 "약학적 조성물"은 인간 환자에게 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 담체(carrier), 안정화제(stabilizer) 및/또는 부형제(excipient)의 적절한 제형을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 비경구, 경피(transdermal), 관강내(intraluminal), 동맥내(intraarterial), 경막내(intrathecal), 및/또는 비강내 투여 또는 조직 내 직접 주사를 위한 조성물을 포함한다. 특히 상기 약학적 조성물은 주입(infusion) 또는 주사(injection)를 통해 환자에게 투여되는 것으로 고안된다. 적절한 조성물의 투여는 상이한 방법으로, 예를 들어 정맥내, 피하, 복강내, 근육내, 국소 또는 경피 투여에 의해 수행할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 적절한 약제학적 담체의 예는 당업계에 잘 알려져 있으며, 인산염 완충 염수액, 물, 유화액, 다양한 유형의 습윤제, 멸균액, 리포솜 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 공지된 종래의 방법으로 제형화 할 수 있다. 이들 약학적 조성물은 대상에게 적절한 투여량으로 투여할 수 있으며, 이는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 가용성 혈청 CEA 항원에 대한 내성을 나타내는 이중특이적 단일 사슬 항체의 투여량을 증가시켜 투여하는 것에 의한 투여량 점진 증가 연구에 의해 결정될 수 있다. 전술한 바와 같이, 가용성 혈청 CEA 항원에 대한 내성을 가지는, 본 명세서에 기재된 이중특이적 단일 사슬 항체는, 진행성 종양, 재발 암, 전이 종양, 높은 종양 로드/부하, 또는 말기 종양과 같이 높은 CEA 혈청 농도를 가진 암 환자의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 이들 조성물은 또한 다른 단백질성 및 비-단백질성 약물과 조합하여, 예를 들어 동시-요법(co-therapy)의 형태로 투여될 수 있다. 이들 약물은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이적 단일 사슬 항체를 포함하는 조성물과 동시에 투여되거나, 상기 이중특이적 항체의 투여 전 또는 후에 별도로 시간적으로 정의된 간격 및 투여량으로 투여될 수 있다. 투여량 요법은 주치의 및 임상 요소에 의해 결정될 것이다. 의약 기술에서 잘 알려진 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여용량은 환자 크기, 몸 표면적, 나이, 투여할 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적 건강 및 동시에 투여된 다른 약물을 포함하는 많은 인자에 의존한다. 비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 및 서스펜션을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트이다. 수성 담체는 염수 및 완충 매체를 비롯하여, 물, 수성 용액, 또는 서스펜션을 포함한다. 비경구 매개체(vehicle)는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 또는 락트화(lactated) 링거를 포함한다. 정맥내 매개체는 유체 및 영양 보충물, 전해질 보충물 (예를 들어 링거 덱스트로스 계통) 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제는 또한 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제, 및 불활성 기체 등일 수 있다. 그 외에, 본 발명의 약학적 조성물은 혈청 알부민 또는 면역 글로불린과 같은 단백질계 담체, 바람직하게는 인간 기원의 것을 포함할 수 있다. 동시-요법은 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체에 더하여, 본 조성물의 의도한 용도에 따라 추가의 생물학적 활성제를 포함하는 것으로 고안된다. 이러한 제제는 위장계에 작용하는 약물, 항종양제로 작용하는 약물, 화학요법제, 세포증식억제제, 고요산 혈증을 예방하는 약제, 면역반응을 억제하는 약제 (예, 코르티코스테로이드), 염증성 반응을 조절하는 약물, 순환계에 작용하는 약물, 및/또는 당업계에 알려진 사이토카인과 같은 제제일 수 있다.
바람직하게는, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체는 완충액, 안정화제, 및 계면활성제로 제형화된다. 상기 완충액은 포스페이트, 시트레이트, 숙시네이트 또는 아세테이트 완충액일 수 있다. 상기 안정화제는 아미노산(들) 및/또는 당일 수 있다. 상기 계면활성제는 세정제, PEG 등일 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체는 시트레이트, 리신, 트레할로스 및 트윈 80(Tween 80)으로 제형화된다. 본 발명의 약학적 조성물에 대한 희석제로서는, 등장 염수 및 트윈 80이 바람직하다.
본 명세서에서 사용된, "이중특이적 단일 사슬 항체"는 두 개의 결합 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬을 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 각각의 "결합 도메인"은 항체 중쇄(heavy chain)로부터의 한 가변 영역("VH 영역")을 포함하며, 여기서 제1 결합 도메인의 VH 영역은 상기 제1 분자, 즉, 인간 CD3 분자에 특이적으로 결합하고, 제2 결합 도메인의 VH 영역은 하기에서 더 상세히 정의된 바와같은, 인간 CEA에 특이적으로 결합한다. 두 개의 결합 도메인은 일반적으로 대략 5개의 아미노산을 포함하는 짧은 폴리펩티드 스페이스에 의해 임의로 서로에 대해 연결된다. 각각의 결합 도메인은 항체 경쇄("VL 영역")로부터의 한 가변 영역을 추가로 포함할 수 있고, 각각의 제1 및 제2 결합 도메인 내의 VH 영역 및 VL 영역은, 예를 들어 EP B1 623679에 기재되고 청구된 유형의 폴리펩티드 링커를 통해 서로 연결될 수 있지만, 제1 결합 도메인의 VH 영역 및 VL 영역과, 제2 결합 도메인의 VH 영역 및 VL 영역이 서로 짝짓는 것이 가능할 만큼 긴 경우에는, 이들이 함께 각각의 제1 및 제2 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 제1 및 제2 결합 도메인의 V 영역의 배열은 VH-VL 또는 VL-VH일 수 있다. 바람직하게는 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인의 배열은, 하기 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이 VH-VL이다. 제1 결합 도메인은 제2 결합 도메인에 대해 N-말단에 또는 C-말단에 위치될 수 있는 것으로 고안된다. 따라서, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 결합 도메인의 배열은 VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3, VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3, VHCD3-VLCD3-VHCEA-VLCEA 또는 VHCD3-VLCD3-VLCEA-VHCEA일 수 있다. 바람직하게는, CD3에 특이적인 상기 제1 결합 도메인은 제2 결합 도메인에 대해 C-말단에 위치된다. 보다 바람직하게는, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 결합 도메인은 VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3 또는 VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3의 순서로 정렬된다. 보다 더 바람직하게는, 상기 배열이 VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3이다. 가장 바람직한 것은 서열식별번호 34에 정의된 바와 같은 이중특이적 단일 사슬 항체 구조물 A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL이다. 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 상기 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 비-인간 기원(즉, 비-인간 서열로부터 유도됨)이 될 수 있는 것으로 고안된다. 예를 들어, 상기 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 마우스 모노클로널 항체로부터 유도할 수 있다. 그러나, 마우스로부터 유도된 이중특이적 단일 사슬 항체는 인간 환자에게 투여되었을 때, 외래의 것으로 인식될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 상기 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 바람직하게는 인간 기원(즉, 인간 서열로부터 유도됨)의 것이다. CEA 또는 CD3에 특이적으로 결합하는 상기 인간 결합 도메인은 예를 들어, 파지 디스플레이-기반 기술(phage display-based techniques)에 의해 식별될 수 있다. 또한 예를 들어, 상기 제1(또는 제2) 결합 도메인의 VH 영역이 인간 VH 영역이고, 반면 제1(또는 제2) 결합 도메인의 상응하는 VL 영역이 비-인간 기원일 수 있는 것도 고안된다. 그러한 결합 도메인은 또한 키메라 결합 도메인으로도 언급될 수 있다. 또는 상기 결합 도메인 중 하나는 비-인간 기원의 것인 반면, 나머지 하나는 인간 기원의 것이어서, 키메라 이중특이적 단일 사슬 항체를 만들 수 있다. 인간 환자에게 투여되었을 때, 본 명세서에 기재된 이중특이적 단일 사슬 항체의 면역원성을 감소하기 위하여 상기 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 상기 제1 또는 제2 결합 도메인의 적어도 하나는, 하기에서 더 상세히 설명되는 바와 같이, 인간화, CDR-그래프트, 키메라 및/또는 탈면역화 또는 인간일 수 있다. 또한 상기 제1 또는 제2 결합 도메인 내에서 VH 및 VL 영역을 연결하는 폴리펩티드 링커가 탈면역화되는 것도 고안된다. 바람직하게는, 탈면역화된 제1 결합 도메인 (구체적으로 CD3) 내에서 VH 및 VL 영역을 연결하는 폴리펩티드 링커는 서열 "GEGTSTGS(G2S)2GGAD" (서열식별번호 141)를 갖는 탈면역화된 폴리펩티드 링커이다. 또한 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 상기 결합 도메인 중 하나 또는 양자가 예를 들어, 단백질 발현, 정제, 검출 또는 농축용으로 사용될 수 있는, 소위 "태그(tags)", 예컨대 Flag-태그, c-myc-태그, GST-태그 또는 His-태그를 운반하는 것이 고안된다. 예를 들어, 현재 Flag-태그용으로 가장 광범위하게 사용되는 친수성 옥타펩티드는 DYKDDDDK(Chubet and Brizzard, Biotechniques 20 (1996): 136- 141)이며, 최근의 연구는 더 짧은 펩티드인, DYKD가 M1 모노클로널 항체에 의해 거의 동일한 친화도로 인식될 수 있는 것을 제안했다(Knappik A, Pluckthun A; Biotechniques 17 (1994):754-761). Flag-태그, c-myc-태그, GST-태그, His-태그 등은 예컨대 태그-VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3 또는 VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3-태그와 같이, 이중특이적 단일 사슬 항체의 N-말단 또는 C-말단 중 어느 것에도 위치될 수 있다. 발현, 검출 또는 정제 목적을 위한 상기 태그의 특성 및 소스는 당업계에 잘 설명되어 있으며, 예를 들어 Lichty, Protein Expr Purif. (41 (2005), 98-105)를 참조한다.
본 명세서에 사용된, 용어 "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 의미하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬로 존재한다. 가변 도메인은 VH-VL 또는 VL-VH의 순서로 정렬될 수 있다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인 간 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며, 이는 scFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성하는 것을 가능하게 한다. scFv를 고찰하기 위하여, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)를 참조한다. 구체적 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체로부터 유도된 항-CEA scFvs에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, Ig-유도된 항원-상호작용과 함께 본 명세서에서 사용된 용어 "결합 도메인" 또는 "가변 영역"은 항체, 항체 단편 또는 그들의 유도체로부터 유도된 하나의 CDR을 적어도 포함하는 폴리펩티드 유도체 및 단편을 포함한다. 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 인간 CEA에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인은 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의, 각각, 카밧 위치 100, 100a, 100b, 101, 및 102에 상응하는 아미노산 서열 "FYFDY" (서열식별번호 112)와 함께, 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 적어도 하나의 CDR, 바람직하게는 CDR-H3, 더 바람직하게는 CDR-H3의 일부; 더더욱 바람직하게는 아미노산 서열 "DX1X2X3X4FYFDY" (서열식별번호 65)와 함께이며, 여기서 "X1", "X2", "X3" 또는 "X4" 는 임의의 아미노산 잔기를 나타내고, 아미노산 잔기 "D"는 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧 위치 95에 상응하며, 아미노산 잔기 "FYFDY"는 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧 위치 100, 100a, 100b, 101, 및 102에 각각 상응하는 것이 본 발명에 의해 고안된다. 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧 위치 96 ("X1"), 97 ("X2"), 98 ("X3") 및 99("X4")에 각각 상응하는 "X1", "X2", "X3" 또는 "X4"는 아미노산 잔기 "R"(아르기닌), "G"(글리신), "L"(류신), "Y"(티로신), "A"(알라닌), "D"(아스파르트산), "S"(세린), "W"(트립토판), "F" (페닐알라닌) 또는 "T"(트레오닌)을 나타내는 것이 고안된다. 여기에서, "X1", "X2", "X3" 및 "X4"가 동일한 아미노산을 나타내는 것, 예를 들어, "X1", "X2", "X3" 및 "X4"가 모두 "F"(페닐알라닌)인 것은 본 발명의 범주로부터 제외된다. 바람직하게는, "X1"은 "R" (아르기닌), "F" (페닐알라닌), "M" (메치오닌), "E" (글루탐산), 또는 "T"(트레오닌)을 나타내고; "X2"는 "G" (글리신), "Y" (티로신), "A" (알라닌), "D" (아스파르트산), 또는 "S" (세린)을 나타내고; "X3"은 "L" (류신), "F" (페닐알라닌), "M" (메치오닌), "E" (글루탐산), 또는 "T" (트레오닌)을 나타내고; "X4"는 "R" (아르기닌), "Y" (티로신), "A" (알라닌), "D" (아스파르트산), 또는 "S" (세린)을 나타낸다. 또는 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 인간 CEA에 특이적으로 결합하는 가장 바람직한 제2 결합 도메인은, A5B7의 CDR-H3의 카밧 위치 95-102에 상응하는 아미노산 서열 "DRGLRFYFDY" (서열식별번호 66)과 함께 A5B7의 완전한 CDR-H3을 포함한다. 하기 실시예에서 보는 바와 같이, CEA와 상호작용하는 제2 결합 도메인에서 상기 mAb A5B7-유도 CDR-H3 "DRGLRFYFDY" (서열식별번호 66) 아미노산 서열을 포함하는, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 종양 세포에 대한 세포독성 활성은 가용성 CEA 항원에 대해 내성을 가지고, 그에 의해 혈장에 높은 혈청 CEA 농도를 가진 종양 환자의 치료를 가능하게 한다. CDR의 결정은 당업자에게 공지된 것이며; 예를 들어, http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrid를 참조한다. 항체 중 아미노산 서열의 넘버링은 예를 들어, 당업계에 상세히 설명된 카밧 넘버링 스킴(Kabat numbering scheme)에 따라 수행될 수 있고; 예를 들어, Kabat, E. A., T. T. Wu, H. M. Perry, K. S. Gottesman, and C. Foeller. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, Md.: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine을 참조한다.
가장 바람직하게는 및 하기 실시예에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 약학적 조성물에 채택될 "이중특이적 단일 사슬 항체"는 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧 위치 95 - 102 (서열식별번호 66)에 상응하는 아미노산 서열 "DRGLRFYFDY"를 적어도 포함하는 인간 항-CEA 결합 도메인 및 탈면역화된 항-CD3 결합 도메인(WO 2005/040220)을 구비한 이중특이적 단일 사슬 Fv(scFv)이다. 이중특이적 단일 사슬 분자는 당업계에 공지이며, 예를 들어 WO 99/54440 또는 Mack, PNAS, ((1995), 92, 7021-7025)에 기재되어 있다.
본 발명에 따라 사용된 용어 "단일 사슬"은 이중특이적 단일 사슬 구조의 상기 제1 및 제2 도메인이 공유적으로 결합되어 있고, 바람직하게는 단일 핵산 분자에 의해 코딩가능한 동일-선형의(co-linear) 아미노산 서열의 형태로 결합되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "인간"은 호모 사피언스 종을 의미하는 것이다. 따라서 "인간" 분자, 예를 들어, 인간 CEA 또는 인간 CD3 (CD3 엡실론)은 호모 사피언스에서 천연적으로 발현되는 것과 같은 분자의 변형이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "상피 종양"은 CEA 양성인 상피 기원의 종양을 의미한다(Cancer Medicine; 6th ed.; Kufe, Donald W.; Pollock, Raphael E.; Weichselbaum, Ralph R.; Bast, Robert C, Jr.; Gansler, Ted S.; Holland, James F.; Frei III, Emil, editors. Hamilton (Canada): BC Decker Inc. 2003; http://www.dkfz.de;http://www.krebsinformationsdienst.de/Krebsarten/index.html). 치료될 상피 종양은 위장관 선암종, 유방 선암종 또는 폐 선암종일 수 있다. 상기 위장관 선암종은 바람직하게는 결장직장, 췌장, 식도 또는 위 선암종이다. 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 본 발명의 약학적 조성물은 진행성 종양, 전이, 재발암, 말기 상피 종양, 높은 상피 종양 로드/부하를 가진 환자, 또는 100 ng/ml보다 높은 CEA 혈청 농도를 가진 종양 환자(예를 들어, ELISA에 의해 측정)로서, 혈장에 높은 수준의 가용성 CEA 항원을 특징으로 하는 환자의 치료에 특히 유용하다. 또한 상기 약학적 조성물이 원발 종양(primary tumor)의 수술적 제거 후 사용되는 것도 본 발명의 범주 내에 있다. 예를 들어, CEA 생성 상피 종양으로부터 유도된 파종성 잔류 종양 세포도 CEA를 미세환경으로 발산한다. 따라서, 이들 종양 세포 주변에서 가용성 CEA의 수준 또한 높다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물의 세포독성 활성의 가용성 CEA에 대한 내성은 또한 최소 잔류 질환(minimal residual disease)의 치료용으로도 유용하다. 나머지 종양 세포를 죽이기 위하여 (CEA 소스, 즉 원발 종양의 제거에 기인하여) 혈청 CEA 수준이 감소하는 기간 동안 상기 약학적 조성물이 투여될 수 있는 것이 고안된다. 전이 또는 2차 종양(secondary tumor)의 형태에 기인하여 혈청 CEA 수준이 증가한 경우에, 약학적 조성물은 또한 원발 종양의 제거 후에도 유용할 수 있다. CEA 혈청 농도는 예를 들어 CEA ELISA 분석(예를 들어, IBL CEA EIA, IBL Hamburg, Germany 참조)에 의해 측정될 수 있다. 앞서 정의된 바와 같이, 많은 항체-기반 치료적 시도에서, 상기 혈청 CEA는 종양 세포의 막-부착 CEA에 대한 항체의 결합을 방해하고, 항체의 활성을 막아서, 그에 의해 항암 치료의 성공을 저해한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "특이적으로 결합" 또는 관련된 표현, 예컨대 "특이적으로 결합하는" 또는 "-와/에 특이적인 반응성" 등은, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이적 단일 사슬 항체의 제1 및 제2 결합 도메인의, 잠재적인 결합 짝으로서, 복수의 상이한 분자의 풀(pool)로부터, 상기 각각의 제1 및/또는 제2 분자만이 결합하거나, 또는 유의하게 결합할 정도로 각각의 제1 및/또는 제2 분자 간을 식별하기 위한 능력을 의미한다. 그러한 결합 측정은 예를 들어 ELISA, FACS 분석 등에 의해 Biacore 장비에서 일상적으로 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 제1 결합 도메인은 인간 CD3, 바람직하게는 인간 CD3 엡실론에 결합한다. 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 제2 결합 도메인은, 하기에 정의된 상피 종양 항원, 즉 인간 CEA (암종배아 항원, 암종배아 항원-관련 세포 부착 분자 5; CEACAM5; CD66e)에 결합한다. 본 발명에 따라 용어 "특이적으로 결합"은, 이중특이적 단일 사슬 항체가 본 명세서에서 정의된 각각의 인간 타겟 분자의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상의 아미노산과 특이적으로 상호작용 및/또는 이에 결합할 수 있는 것을 의미한다. 상기 용어는 항체 분자의 특이성, 즉 본 명세서에서 정의된 인간 타겟 분자의 특정 영역 간을 식별하기 위한 그 능력에 관한 것이다. 항원-상호작용-장소의 특정 항원과의 특이적 상호작용은, 예를 들어 항원의 구조의 변화, 항원의 올리고머화(oligomerization) 등의 유도에 기인하여, 신호의 개시를 가져올 수 있다. 따라서, 상기 결합은 "열쇠-자물쇠-원칙(key-lock-principle)"으로 구체적으로 예시될 수 있다. 따라서, 항원-상호작용-장소의 아미노산 서열에 있는 특이적 모티프 및 항원은 그들의 1차, 2차 또는 3차 구조의 결과뿐 아니라, 상기 구조의 2차 변형의 결과로 서로 결합한다. 항원-상호작용-부위와 그 특이적 항원의 특이적인 상호작용은 항원에 대한 상기 부위의 결합도 가져올 수 있다.
항체의 "특이적 결합"은 주로 두 가지 파라미터 : 정성적 파라미터(결합 에피토프, 또는 항체가 결합하는 장소) 및 정량적 파라미터(결합 친화도, 또는 그것이 결합하는 곳에 얼마나 강하게 결합하는지)를 특징으로 한다. 어떠한 에피토프가 항체에 의해 결합하는지는 예를 들어, 공지된 FACS 방법론, 펩티드-스폿 에피토프 맵핑, 질량 분광학 또는 펩티드 ELISA에 의해 유용하게 측정될 수 있다. 특정 에피토프에 결합하는 항체의 강도는 예를 들어, 공지의 Biacore 및/또는 ELISA 방법론에 의해 유용하게 측정될 수 있다. 그러한 기술의 조합은 결합 친화도의 대표적인 측정으로서 신호 : 노이즈 비의 순환을 가능하게 한다. 그러한 신호 : 노이즈 비에서, 신호는 관심있는 에피토프의 항체 결합의 강도를 나타내고, 반면 노이즈는 다른, 관심있는 에피토프와 상이한 비-연관 에피토프에 결합하는 항체의 강도를 나타낸다. 바람직하게는, 관심있는 에피토프와 상이한 다른 에피토프에 대해 약 50배 더 높은, 관심있는 에피토프에 대한 신호 : 노이즈비를, 평가되는 항체가 특이적인 방식으로 관심있는 에피토프에 결합하는 것을 표시하는 것, 즉 "특이적 바인더"로서 취할 수 있다.
본 발명에 따라 사용된 용어 "특이적으로 결합" 또는 "특이적 상호작용"은 이중특이적 단일 사슬 구조체가 유사 구조물의 폴리펩티드와 교차 반응하지 않거나 또는 본질적으로 하지 않는다는 것을 의미한다. 조사 중인 이중특이적 단일 사슬 구조체의 패널의 교차 반응은 예를 들어 관심있는 폴리펩티드는 물론, 다수의 다소 (구조적으로 및/또는 기능적으로) 밀접하게 관련된 폴리펩티드에 통상적인 조건하에서(예를 들어, Harlow and Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 및 Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999 참조), 이중특이적 단일 쇄 구조체의 상기 패널의 결합을 분석하여 테스트할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이중특이적 단일 사슬 항체의 제1 결합 도메인이 인간 CEA (암종배아 항원; CEACAM5; CEA; CD66e), 즉 가용성 CEA 항원 및 막-부착 CEA 모두에 결합하는 것은 본 발명의 범위 내에 있고, 반면 다른 군 구성원, 예컨대 쓸개 당단백질 (CEACAM1 ; BGP1 ; TM-CEA; CD66a)에 결합하는 이중특이적 항체는 본 발명의 범위에서 제외된다. 항원-상호작용-장소와 특이적 항원의 특이적 상호작용에 대한 예로는 그 수용체에 대한 리간드의 특이성을 포함한다. 상기 정의는 그 특이적 수용체에 대한 결합시 신호를 유발하는 리간드의 상호작용을 특히 포함한다. 상응하는 리간드의 예는 그 특이적 사이토카인-수용체와 상호작용하거나/이에 결합하는 사이토카인을 포함한다. 또한 상기 정의에는 셀렉틴(selectin) 군, 인테그린(integrin) 및 EGF 같은 성장인자의 군의 항원과 같은 항원에 대한 항원-상호작용-장소의 결합이 포함된다. 또한 특히 상기 정의에 포함되는 상기 상호작용의 다른 예는, 항체의 항원 결합 장소와 항원 결정인자(에피토프)의 상호작용이다.
용어 "결합/상호작용"은 또한 인간 표적 분자 또는 그 일부 중 두 개의 영역으로 이루어진 불연속(discontinuous) 에티토프, 구조적(structural) 에피토프 또는 입체형체(conformational) 에피토프에 관한 것이다. 본 발명의 명세서에서, 입체형체 에피토프는 폴리펩티드가 원래의 단백질로 접히는(folded) 경우에 분자의 표면상에서 가까워지는 일차 서열에서 분리된 두 개 이상의 불연속(discrete) 아미노산 서열로 정의된다(Sela, (1969) Science 166, 1365 및 Laver, (1990) Cell 61, 553-6).
용어 "불연속 에피토프"는 본 발명의 명세서에서 폴리펩티드 사슬의 원격 부분의 잔기들로 조합되는 비-선형 에피토프를 의미한다. 이들 잔기는 폴리펩티드 사슬이 삼차원 구조로 접혀서 입체형체/구조적 에티토프를 구성하는 경우에, 분자의 표면상에서 가까워진다.
본 명세서에서 사용된 "CD3" 은 다분자 T-세포 수용체 복합체의 일부로서 T-세포 상에서 발현되고, 적어도 5개의 상이한 사슬, CD3-감마, -델타, -엡실론, -제타, 및 -에타를 구성하는 항원을 나타낸다. 예를 들어, 고정화된 항-CD3-항체에 의한 T-세포 상의 CD3의 응집은, T-세포 수용체의 맞물림과 유사한 T-세포 활성화를 가져오지만, 그 클론 전형적 특이성(clone typical specificity)과는 무관하다. 실제로, 대부분의 항-CD3-항체는 CD3 엡실론 사슬을 인식한다. CD3 엡실론의 아미노산 서열은 GenBank 접근 번호 NM_000733로 나타내고, 서열식별번호 111을 포함한다.
"CEA"는 암종배아 항원(암종배아 항원-관련 세포 부착 분자 5; CEACAM5; CEA; CD66e), 다수의 상피 기원의 종양에서 발현되는 항원(Hammarstrom, Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67- 81 ; Shively and Beatty CRC Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2 (1985), 355-399)을 나타낸다. 인간 CEA의 아미노산 서열은 GenBank 접근 번호 NM_004363으로 나타내고, 서열식별번호 76을 포함한다.
본 발명에서는, 놀랍게도 인간 CD3 및 인간 CEA에 대한 특이성을 가지는 항체-기반 치료요법을 생성하는 것이 가능한 것을 발견하였으며, 여기서 종양 세포에 대해 지시된 세포독성 활성은 심지어 높은 농도의 가용성 CEA 항원에 대해서도 내성을 가진다. 이러한 발견은 본 발명의 이중특이적 단일 사슬 항체가 가용성 CEA 항원에 결합한다는 사실의 관점에서는 전혀 기대되지 않았다. 예를 들어, 모노클로널 항체 T84.66 또는 MFE-23으로부터 유도된 이중특이적 단일 사슬 항체 구조물이 생성되었을 때, 이들 항체는 가용성 CEA 항원에 대해 고도로 민감하였으며, 다시 말해 그들의 세포독성 활성이 가용성 CEA 항원의 존재 중에서 억제되었다. 가용성 CEA에 의한 상기 구조물의 세포독성 활성의 억제는 또한 항체의 증가된 양으로는 극복될 수 없었다. 이들 구조물은 또한 가용성 CEA에 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 관점에서, 가용성 CEA 항원이, 항체가 그 세포독성 활성을 행사하는 것을 방지하는 것으로 결론지었다. 대조적으로, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체는 종양 세포에 대한 세포독성 활성에서, 심지어 높은 수준의 가용성 CEA의 존재에 대해 완전히 내성을 갖는다. 게다가 그들의 높은 세포독성 활성 때문에, 본 명세서에서 정의된 상기 이중특이적 구조물은 심지어 낮은 농도에서도 그들의 생물학적 활성을 도출한다. 그러므로, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체를 포함하는 약학적 조성물의 소량으로도, 혈청/혈장 중 높은 가용성 CEA 농도를 특징으로 하는 상피 종양 환자에서 치료 효과를 달성하는데 충분하다. 상피 종양 환자의 혈청/혈장에서 높은 가용성 CEA 농도는 진행성, 재발, 전이, 또는 말기 종양의 특징이며, 높은 종양 로드를 가진 환자들의 특징이다. 더더욱 놀랍게도, 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧 위치 95-102에 상응하는 아미노산 서열 "DRGLRFYFDY" (서열식별번호 66)은, 항-CEAx항-CD3 이중특이적 단일 사슬 항체의 인간 CEA 결합 도메인(즉, 인간 CEA에 특이적으로 결합하는 인간 결합 도메인)에서 사용되었을 때, 가용성 CEA 항원에 대한 내성을 매개하는 데 충분한 것으로 밝혀졌다. 인간 기원이기 때문에, 인간 종양 환자에게 투여되었을 때 상기 구조물은 면역원성이 낮거나, 없다. 요약하면, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체를 포함하는 약학적 조성물은, 예를 들어 종양 진행 중, 재발 암에 대해서, 전이에 대해서, 높은 종양 로드/부하를 가진 환자에 대해서, 또는 말기 종양 환자에서 관찰된 바와 같이, 혈장 중 높은 가용성의 CEA 농도를 가진 상피 종양 환자의 치료에 특히 유용하다.
본 발명의 약학적 조성물의 다른 바람직한 구현예에서, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 CD3에 대해 특이적인 상기 제1 결합 도메인은 제2 결합 도메인의 C-말단에 위치된다.
본 발명의 범주 내 및 그들의 모든 구현예에서, 즉, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체에서, 단일 폴리펩티드 사슬 중 제1 및 제2 결합 도메인의 배열의 순서는 상대적이다. 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 결합 도메인의 배열은 VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3, VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3, VHCD3-VLCD3-VHCEA-VLCEA 또는 VHCD3-VLCD3-VLCEA-VHCEA일 수 있도록 고안된다. 하기 실시예들에서 보는 바와 같이, 상기에 설명된 장점들은, 제1 결합 도메인(특이적으로 CD3에 결합함)은 제2 결합 도메인의 C-말단에 위치될 때, 즉 제2 결합 도메인보다 이중특이적 단일 사슬 항체의 C-말단에 더 가깝게 위치될 때 특히 실현 가능하다. 바람직하다.
인간 CD3에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인이 VH-VL 방위로 배열되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 결합 도메인은 VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3 또는 VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3 순서로 배열될 수 있다. 본 명세서에 사용된, "N-말단에" 또는 "C-말단에" 및 그 문법상의 변형은 이중특이적 단일 사슬 항체의 완전한 N- 또는 C-말단에서의 배치라기보다는 1차 아미노산 서열 내의 상대적인 위치를 나타낸다. 그러므로, 비 제한적인 실시예로서, "제2 결합 도메인에 대해 C-말단에 위치된" 제1 결합 도메인은 단순히 제1 결합 도메인이 이중특이적 단일 사슬 항체 내의 제2 결합 도메인의 카르복실 측면에 위치되고, 추가의 서열, 예를 들어 전술한 바와 같은 태그, 또는 다른 단백질성 또는 비 단백질성 화합물, 예컨대 방사성 동위원소가 이중특이적 단일 사슬 항체의 최종의 C-말단에 위치될 가능성을 배제하지 않는 것을 나타낸다.
바람직하게는, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 상기 결합 도메인은 VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3 또는 VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3의 순서로 배열된다. 더더욱 바람직한 배열은 VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3이다. 가장 바람직한 것은 서열식별번호 34로 정의된 바와 같은, 이중특이적 단일 사슬 항체 구조물 A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL이다.
본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 인간 CEA에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인은, 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의, 각각, 카밧 위치 100, 100a, 100b, 101, 및 102에 상응하는 아미노산 서열 "FYFDY" (서열식별번호 112)와 함께, 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 적어도 하나의 CDR, 바람직하게는 CDR-H3, 더 바람직하게는 CDR-H3의 일부를 포함하는 것; 더더욱 바람직하게는 아미노산 서열 "DX1X2X3X4FYFDY" (서열식별번호 65)와 함께인 것이 바람직하며, 여기서 "X1", "X2", "X3" 또는 "X4"는 임의의 아미노산 잔기를 나타내고, 아미노산 잔기 "D"는 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧 위치 95에 상응하며, 아미노산 잔기 "FYFDY"는 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧 위치 100, 100a, 100b, 101, 및 102에 각각 상응한다. 여기에서, "X1", "X2", "X3" 또는 "X4"는 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧 위치 96 ("X1"), 97 ("X2"), 98 ("X3") 및 99("X4")에 각각 상응한다. "X1", "X2", "X3" 또는 "X4"는 아미노산 잔기 "R"(아르기닌), "G"(글리신), "L"(류신), "Y"(티로신), "A"(알라닌), "D"(아스파르트산), "S"(세린), "W"(트립토판), "F" (페닐알라닌) 또는 "T"(트레오닌)을 나타내는 것이 고안된다. 여기에서, "X1", "X2", "X3" 및 "X4"가 동일한 아미노산을 나타내는 것, 예를 들어, "X1", "X2", "X3" 및 "X4"가 모두 "F"(페닐알라닌)인 것은 본 발명의 범주로부터 제외된다. 바람직하게는, "X1"은 "R" (아르기닌), "F" (페닐알라닌), "M" (메치오닌), "E" (글루탐산), 또는 "T"(트레오닌)을 나타내고; "X2"는 "G" (글리신), "Y" (티로신), "A" (알라닌), "D" (아스파르트산), 또는 "S" (세린)을 나타내고; "X3"은 "L" (류신), "F" (페닐알라닌), "M" (메치오닌), "E" (글루탐산), 또는 "T" (트레오닌)을 나타내고; "X4"는 "R" (아르기닌), "Y" (티로신), "A" (알라닌), "D" (아스파르트산), 또는 "S" (세린)을 나타낸다. 더더욱 바람직게는, 인간 CEA에 특이적인 제2 결합 도메인은, 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 아미노산 서열 "RFYFDY" (서열식별번호 113), "LRFYFDY" (서열식별번호 114), "GLRFYFDY" (서열식별번호 115), 또는 "RGLRFYFDY" (서열식별번호 116)을 적어도 포함한다. 가장 바람직하게는 각각 카밧 위치 95 ("D", 아스파르트산), 96 ("R"; 아르기닌), 97 ("G"; 글리신), 98 ("L"; 류신), 99 ("R"; 아르기닌), 100 ("F"; 페닐알라닌), 100a ("Y"; 티로신), 100b ("F"; 페닐알라닌), 101("D"; 아스파르트산), 및 102 ("Y"; 티로신)에 상응하는 아미노산 서열 "DRGLRFYFDY" (서열식별번호 66)과 함께, A5B7의 CDR-H3이다. 카밧 시스템에 따른 넘버링은 예를 들어, Kabat, E. A., T. T. Wu, H. M. Perry, K. S. Gottesman, and C. Foeller. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, Md.: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine에 규정되어 있다.
하기 실시예들에서 보는 바와 같이, CEA와 상호작용하는 제2 결합 도메인에 있는 상기 mAb A5B7-유도 CDR-H3 "DRGLRFYFDY" (서열식별번호 66) 아미노산 서열을 포함하는, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 종양 세포에 대한 세포독성 활성은, 가용성 CEA 항원에 대한 내성을 가지고, 그에 따라 혈장 중 높은 혈청 CEA 농도를 가진 종양 환자의 치료를 가능하게 한다. 예를 들어, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 "우수한 특이성(fine specificity)"을 최적화 및/또는 (상피 종양 세포 상) CEA 타겟 항원에 대한 친화성을 향상시키기 위하여, 이러한 A5B7-유도 "DRGLRFYFDY" CDR-H3 아미노산 서열을 추가로 변형하는 것이 바람직할 것이다. 이를 위해, 변형된 CDR-H3의 향상된 친화성 및/또는 우수한 특이성을 확인하기 위하여, 아미노산 서열 "DX1X2X3X4FYFDY" (서열식별번호 65)"에서, "X1", "X2", "X3" 및/또는 "X4" 위치(마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의, 카밧 위치 96 ("X1"), 97 ("X2"), 98 ("X3") 및 99 ("X4")에 각각 상응함)에서, 다양한 아미노산 잔기들이 테스트될 수 있다. 예를 들어, "X1", "X2", "X3" 또는 "X4"는 아미노산 잔기 "R" (아르기닌), "G" (글리신), "L" (류신), "Y" (티로신), "A" (알라닌), "D" (아스파르트산), "S" (세린), "W" (트립토판), "F" (페닐알라닌) 또는 "T" (트레오닌)를 나타낸다. 여기에서, "X" 위치로 나타낸, 하나, 둘, 셋 또는 4개 모두는, CDR-H3 "DRGLRFYFDY" (서열식별번호 66) 아미노산 서열 내의 카밧 위치 96 내지 99에서 원래의 "RGLR" 아미노산 서열과 비교해 볼 때 교환될 수 있다. 그러나, "X1", "X2", "X3" 및 "X4"가 동일한 아미노산을 나타내는 것, 예를 들어, "X1", "X2", "X3" 및 "X4"가 모두 "F"(페닐알라닌)인 것은 본 발명의 특허청구범위의 범주로부터 제외된다. A5B7-유도 "DRGLRFYFDY" CDR-H3 아미노산 서열의 전술한 변경은 랜덤화된 프라이머를 사용하는 PCR과 같이, 당업계에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있고, 이는 CEA- 결합 도메인에 있는 그러한 변형된 CDR-H3 영역과 함께 이중특이적 단일 사슬 항체의 생성을 가능하게 한다. 이들 변형된 이중특이적 단일 사슬 항체의 친화성 및 우수한 특이성은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 ELISA1 Biacore 또는 FACS 분석에 의해 테스트될 수 있다. 그와 같은 변형된 CDR-H3과 함께 이중특이적 단일 사슬 항체의 가용성 CEA 항원에 대한 내성은, 하기 실시예들에서 기재한 바와 같이, 증가하는 양의 가용성 CEA의 존재 중 세포독성 분석에서 테스트될 수 있다.
더 바람직하게는, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 인간 CEA에 대해 특이적인 상기 제2 결합 도메인은, 서열식별번호 65 또는 66 및/또는 아미노산 서열 "SYWMH" (서열식별번호 68)을 갖는 CDR-H1, 및/또는 아미노산 서열 "FIRNKANGGTTEYAASVKG" (서열식별번호 67) 또는 "FILNKANGGTTEYAASVKG" (서열식별번호 145)를 갖는 CDR-H2를 포함한다. 그에 따라, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 인간 CEA에 대해 특이적인 상기 제2 결합 도메인은, 전술한 바와 같이, 하나, 둘 또는 세 개의 CDR-H 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 인간 CEA에 대해 특이적인 상기 제2 결합 도메인은, 서열식별번호 65 또는 66 및/또는 아미노산 서열 "TYAMH" (서열식별번호 70)을 갖는 CDR-H1 및/또는 아미노산 서열 "LISNDGSNKYYADSVKG" (서열식별번호 69)를 갖는 CDR-H2를 포함한다. 따라서, 대안적으로, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 인간 CEA에 대해 특이적인 상기 제2 결합 도메인은, 전술한 바와 같이, 하나, 둘 또는 세 개의 CDR-H 영역을 포함할 수 있다. 더더욱 바람직하게는, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 인간 CEA에 대해 특이적인 상기 제2 결합 도메인은, 전술한 바와 같은 하나, 둘 또는 세 개의 CDR-H 영역 외에, 아미노산 서열 "TLRRGINVGAYSIY" (서열식별번호 73)를 갖는 CDR-L1 및/또는 아미노산 서열 "YKSDSDKQQGS" (서열식별번호 72)를 갖는 CDR-L2 및/또는 아미노산 서열 "MIWHSGASAV" (서열식별번호 71)를 갖는 CDR-L3을 포함한다.
본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 인간 CEA에 대해 특이적인 제2 결합 도메인의 VH 영역의 아미노산 서열은, 아미노산 서열 "SYWMH" (서열식별번호 68)을 갖는 CDR-H1 및 아미노산 서열 "FIRNKANGGTTEYAASVKG" (서열식별번호 67)을 갖는 CDR-H2, 및 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧 위치 95-102에 상응하는 "DRGLRFYFDY" (서열식별번호 66)를 포함하는 서열식별번호 60이다.
본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 인간 CEA에 대해 특이적인 제2 결합 도메인의 VH 영역의 아미노산 서열은, 아미노산 서열 "SYWMH" (서열식별번호 68)을 갖는 CDR-H1 및 아미노산 서열 "FILNKANGGTTEYAASVKG" (서열식별번호 145)을 갖는 CDR-H2, 및 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧 위치 95-102에 상응하는 "DRGLRFYFDY" (서열식별번호 66)를 포함하는 서열식별번호 146이다.
본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 인간 CEA에 대해 특이적인 제2 결합 도메인의 VH 영역의 아미노산 서열은, 아미노산 서열 "TYAMH" (서열식별번호 70)을 갖는 CDR-H1 및 아미노산 서열 "LISNDGSNKYYADSVKG" (서열식별번호 69)을 갖는 CDR-H2, 및 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧 위치 95-102에 상응하는 "DRGLRFYFDY" (서열식별번호 66)를 포함하는 서열식별번호 58 또는 서열식별번호 60이다.
본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 인간 CEA에 대해 특이적인 제2 결합 도메인의 VL 영역은 바람직하게는 아미노산 서열 "TLRRGINVGAYSIY" (서열식별번호 73)을 갖는 CDR- L1 및 아미노산 서열 "YKSDSDKQQGS" (서열식별번호 72)를 갖는 CDR-L2 및 아미노산 서열 "MIWHSGASAV" (서열식별번호 71)을 갖는 CDR-L3을 포함하는 서열식별번호 64이다.
전술한 바와 같이, CEA에 대해 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인의 가변 영역의 배열 또는 순서는 VH-VL 또는 VL-VH일 수 있다. 모든 순서는 본 발명의 범주 내에 있다. 서열식별번호 60의 VH 및 서열식별번호 64의 VL을 포함하는 제2 결합 도메인에 대하여, VH-VL 배열은 서열식별번호 52로 나타내는 반면, VL-VH 배열은 서열식별번호 122로 나타낸다. 서열식별번호 146의 VH 및 서열식별번호 64의 VL을 포함하는 제2 결합 도메인에 대하여, VH-VL 배열은 서열식별번호 147로 나타낸다.
서열식별번호 58의 VH 및 서열식별번호 64의 VL을 포함하는 제2 결합 도메인에 대하여, VH-VL 배열은 서열식별번호 50으로 나타내는 반면, VL-VH 배열은 서열식별번호 120으로 나타낸다. 서열식별번호 62의 VH 및 서열식별번호 64의 VL을 포함하는 제2 결합 도메인에 대하여, VH-VL 배열은 서열식별번호 54로 나타내는 반면, VL-VH 배열은 서열식별번호 124로 나타낸다. 서열식별번호 56의 VH 및 서열식별번호 64의 VL을 포함하는 제2 결합 도메인에 대하여, VH-VL 배열은 서열식별번호 48로 나타내는 반면, VL-VH 배열은 서열식별번호 118로 나타낸다.
더더욱 바람직하게는, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 CEA에 대해 특이적인 제2 결합 도메인의 V 영역은 하기로 구성된 군에서 선택된다.
(a) 서열식별번호 60으로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VH 영역 및 서열식별번호 64로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VL 영역;
(b) 서열식별번호 146으로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VH 영역 및 서열식별번호 64로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VL 영역;
(c) 서열식별번호 58로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VH 영역 및 서열식별번호 64로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VL 영역;
(d) 서열식별번호 62로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VH 영역 및 서열식별번호 64로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VL 영역; 및
(e) 서열식별번호 56으로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VH 영역 및 서열식별번호 64로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VL 영역.
가장 바람직하게는, 상기 이중특이적 단일 사슬 항체는 하기로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
(a) 서열식별번호 6, 8, 16, 18, 24, 26, 32, 34, 40, 42, 126, 130, 134 또는 143으로 도시된 아미노산 서열;
(b) 서열식별번호 5, 7, 15, 17, 23, 25, 31, 33, 39, 41, 125, 129, 133 또는 142로 나타낸 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열;
(c) (b)의 상보적인 핵산 서열에 엄격한 조건 하에서(under stringent condition) 하이브리드하는 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열;
(d) (b)의 뉴클레오티드 서열에 대한 유전 코드의 결과로서 축퇴된(degenerate) 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열; 및
(e) (a) 또는 (b)의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일, 더 바람직하게는 적어도 90% 동일, 가장 바람직하게는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열.
본 발명의 약학적 조성물의 또다른 바람직한 구현예에서, 치료될 상기 상피 종양은 위장관 선암종, 유방 선암종 또는 폐 선암종이다. 상기 위장관 선암종은 바람직하게는 결장직장, 췌장, 식도 또는 위 선암종이다.
더 바람직하게는, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 진행성 종양, 말기 종양, 높은 종양 로드/부하를 가진 종양 환자, 전이 종양, 또는 100 ng/ml보다 높은 CEA 혈청 농도를 가진 종양 환자의 치료용이다. 상기 CEA 혈청 농도는 예를 들어, ELISA에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 추가의 바람직한 구현예에서, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 상기 제1 또는 제2 결합 도메인의 적어도 하나는 키메라, 인간화된, CDR-그래프트된, 및/또는 탈면역화되거나 또는 인간이다.
여기에서 사용된 용어 "키메라"는 위에 정의되었다. 용어 "인간" 결합 도메인, 예를 들어, 본 명세서에 정의된 인간 CEA에 특이적으로 결합하는 인간 결합 도메인은, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체가, 앞서 정의된 A5B7-유도 CDR-H3 또는 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧 위치 100, 100a, 100b, 101, 및 102(서열식별번호 112)에 상응하는 아미노산 서열 "FYFDY"를 적어도 가지는 항체 레퍼토리 또는 인간 생식 계열 항체 레퍼토리에 함유된 아미노산 서열(들)을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체는 또한 만일 이것이 체세포성 과변이(somatic hypermutation)의 각인 때문에 단지 그(그들)의 가장 가까운 인간 생식 계열 서열(들)에서 벗어난 것(들)이 기대되는 서열(들)로 구성된 경우 인간으로서 간주될 수 있다. 추가적으로, 많은 비-인간 포유동물, 예를 들어 마우스 및 랫트와 같은 설치류는, 또한 발현된 인간 항체 레퍼토리에 존재하는 것으로 기대할 수 있는 VH CDR 아미노산 서열을 포함한다. 발현된 인간 항체 레퍼토리에 존재하는 것으로 기대될 수 있는 인간 또는 비인간 기원의 임의의 그러한 서열들은 또한 본 발명의 목적을 위해 "인간"으로 간주될 수도 있다.
여기에서 사용된 용어 "인간화된(humanized)", "인간화(humanization)" 또는 "인간형(human-like)"은, 적어도 하나의 결합 도메인에 비인간 항체 또는 그 단편으로부터의 적어도 하나의 상보적인 결정 영역("CDR")을 포함하는 이중특이적 단일 사슬 항체를 의미하는 것으로 교환가능하게 사용된다. 인간화 시도는 예를 들어 WO 91/09968 및 US 6,407,213에 기재되어 있다. 비-제한적인 예로서, 상기 용어는 적어도 하나의 결합 도메인의 가변 영역이 단일 CDR 영역, 예를 들어 다른 비-인간 동물, 예컨대 설치류로부터의 VH의 제3 CDR 영역을 포함하는 케이스, 및 하나 또는 양 가변 영역(들)이 그들 각각의 제1, 제2 및 제3 CDR의 각각에, 상기 비인간 동물로부터의 CDR을 포함하는 케이스를 포함한다. 이중특이적 단일 사슬 항체의 결합 도메인의 모든 CDR이, 예를 들어 설치류로부터의 상응하는 동등물에 의해 치환되는 경우, 통상적으로, "CDR-그래프팅(CDR-grafting)"이라 말할 수 있고, 이러한 용어는 본 명세서에서 사용된 용어 "인간화된" 또는 그의 문법적으로 관련된 변형에 포함되는 것으로 이해될 것이다. 용어 "인간화된" 또는 그 문법적으로 관련된 변형은 또한 제1 및/또는 제2 결합 도메인의 VH 및/또는 VL 내에서 하나 이상의 CDR 영역의 치환에 더하여, 그 위치에 있는 아미노산이, 치환을 위해 사용된 CDR 영역이 유도되는 동물에서 그 위치에 있는 아미노산에 상응하도록, CDR 사이의 골격("FR") 영역 내에서 적어도 하나의 단일 아미노산 잔기의 추가의 변이(예를 들어, 대체)가 영향을 받은 케이스를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 타겟 분자에 대한 CDR-제공자로서 사용된 비인간 항체의 원래의 결합 친화성을 회복하기 위하여, 그러한 개별적인 변이는 종종 CDR-그래프팅에 이은 골격 영역에서 만들어진다. 용어 "인간회된"은 전술한 바와 같이 골격 영역에 있는 아미노산 대체에 더하여, 비인간 동물로부터의 CDR 영역에서, 인간 항체로부터의 상응하는 CDR 영역의 아미노산으로의 아미노산 대체를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "탈면역화된" 또는 "탈면역화"는 원래의 야생 타입 구조물과 비교하여, 상기 야생 타입 구조물에 인간에서 비-면역원성 또는 덜 면역원성을 부여하는 제1 및/또는 제2 결합 도메인의 변형을 나타낸다. 탈면역화 시도는 예를 들어 WO 00/34317, WO 98/52976, WO 02/079415 또는 WO 92/10755에서 볼 수 있다. 용어 "탈면역화된"은 또한 T 세포 에피토프를 생성하는 경향의 감소를 보여주는 구조물에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 용어 "T 세포 에피토프를 생성하는 경향의 감소"는 특이적인 T-세포 활성을 가져오는 T-세포 에피토프의 제거에 관한 것이다. 또한, "T 세포 에피토프를 생성하는 경향의 감소"는 T 세포 에피토프의 형성에 기여하는 아미노산의 대체, 즉 T 세포 에피토프의 형성에 필수적인 아미노산의 대체를 의미한다. 다시 말해, "T 세포 에피토프를 생성하는 경향의 감소"는 면역원성의 감소 또는 T 세포 증식과 무관한 항원을 유발하는 능력의 감소에 관한 것이다. 용어 "T 세포 에피토프"는 T 세포의 활성을 야기하기 위하여, 세포 내의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질의 분해 도중 방출되고, 후속적으로 주조직적합복합체(MHC)의 분자에 의해 제시될 수 있는 짧은 펩티드 서열에 관한 것이며; 특히 WO 02/066514를 참조한다. MHC 클래스 Ⅱ에 의해 제시되는 펩티드에 대하여, 상기 항체를 생성하기 위하여 T 세포의 그러한 활성은 이어서 T 세포의 직접적인 자극에 의해 항체 반응을 일으킬 수 있다. "T 세포 에피토프를 생성하는 경향의 감소" 및/또는 "탈면역화"는 당업계에 공지된 기술에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, 단백질의 탈면역화는 T 세포 증식 분석에 의해 시험관 내에서 테스트할 수 있다. 이러한 분석에서, 세상에서 HLA-DR 대립유전자의 >80%를 나타내는 제공자로부터의 PBMC은 야생 타입 또는 탈면역화된 펩티드 양자에 반응하는 증식에 대하여 스크린된다. 이상적으로 세포 증식은 야생 타입 펩티드와 함께 항원 제시 세포의 로딩시에만 검출된다. 대안적으로, 모든 일배체형(haplotype)을 나타내는 HLA-DR 테트라머를 발현하는 것에 의해 탈면역화를 테스트할 수 있다. 이들 테트라머는 증식 분석에서 항원-제시 세포에 대한 펩티드 치환체로 로드되거나 또는 펩티드 결합에 대해 테스트될 수 있다. 탈면역화된 펩티드가 HLA-DR 일배체형에 존재하는지 여부를 테스트하기 위하여, 예를 들어 PBMC 상 형광-라벨된 펩티드의 결합을 측정할 수 있다. 또한, 탈면역화는 탈면역화된 분자에 대한 항체가 환자에게서 투여 후에 형성되었는지 여부를 측정하는 것에 의해 입증할 수 있다. 바람직하게는, T 세포 에피토프를 유발하는 경향의 감소를 생성하기 위하여, 항체 유도 분자는 골격 영역에서 탈면역화되고, CDR 영역의 대부분은 변형되지 않아서, CDR 영역의 결합 친화성은 영향받지 않는다. 한 T 세포 에피토프의 제거는 또한 면역원성의 저하를 초래한다.
요약하면, 상기 시도들은 상피 종양 환자에게 투여되었을 때, 본 명세서에서 정의된 치료적인 이중특이적 단일 사슬 항체의 면역원성을 저하시키는 것을 돕는다. 예를 들어, 서열식별번호 77로 나타낸 바와 같은 CD3에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인은 탈면역화되며; 또한 WO2005/040220를 참조한다. 바람직하게는, 이러한 CD3-결합 도메인에서 V 영역의 배열은 VH-VL이다.
다른 측면에서, 본 발명은 하기로 구성된 군에서 선택된 아미노산을 포함하는 이중특이적 단일 사슬 항체에 관한 것이다.
(a) 서열식별번호 6, 8, 16, 18, 24, 26, 32, 34, 40, 42, 126, 130, 134 또는 143으로 도시된 아미노산 서열;
(b) 서열식별번호 5, 7, 15, 17, 23, 25, 31, 33, 39, 41, 125, 129, 133 또는 142로 나타낸 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열;
(c) (b)의 상보적인 핵산 서열에 엄격한 조건 하에서(under stringent condition) 하이브리드하는 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열;
(d) (b)의 뉴클레오티드 서열에 대한 유전 코드의 결과로서 축퇴된 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열; 및
(e) (a) 또는 (b)의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일, 더 바람직하게는 적어도 90% 동일, 가장 바람직하게는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열.
한 구현예에서, 본 발명은 위에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는 위에서 정의된 상기 이중특이적 단일 사슬 항체는 인간에서 상피 종양 또는 상피 종양들의 치료를 위한 약학적 조성물로서 사용된다. 상기 상피 종양(들)은 CEA-양성이다. 이들 약학적 조성물의 CEA-양성 상피 종양 세포에 대한 세포독성 활성은 종양 환자의 혈장에 있는 가용성 CEA 항원의 높은 농도에도 내성을 가진다. 게다가 위에서 정의된 상기 이중특이적 단일 사슬 항체 또는 그들로부터 유도된 항-CEA scFvs는, 하기에서 더욱 상세히 설명된 바와 같이 인간에서 상피 종양 또는 상피 종양들의 검출를 위한 진단용 조성물로서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "엄격한 조건 하 하이브리드화"는, 엄격한 하이브리드화 조건 하에서, 서열식별번호 5, 7, 15, 17, 23, 25, 31, 33, 39, 41, 125, 129, 133 또는 142로 나타낸 서열, 또는 그들의 보체(complement)에 하이브리드할 수 있는 핵산 서열을 의미하고, 이는 CEA-양성 종양 세포에 대한 세포독성 활성을 가지는 이중특이적 단일 사슬 항체를 코딩한다. "엄격한 하이브리드화 조건"은, 50% 포름아미드, 5x SSC (750mM NaCl, 75mM 구연산 나트륨), 50mM 소디움 포스페이트 (pH 7.6), 5x 덴하르드트 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20㎍/ml의 축퇴되고, 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에서 42℃에서 하룻밤 인큐베이션한 다음, 약 65℃에서 0.1 x SSC 중에서 필터를 세척하는 것을 의미한다.
특정 핵산 분자 또는 폴리펩티드가 본 명세서에서 정의된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지의 여부는 공지의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 종래의 방법으로 측정할 수 있다. 의문의 서열(본 명세서에서 정의된 서열) 및 대상 서열 간의 최고의 전체 매치를 측정하기 위한 바람직한 방법은, 또한 포괄적 서열 정렬로도 언급되며, Brutlag 등 (Comp. App. Biosci. 6:237-245(1990))의 알고리즘에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정할 수 있다. 서열 정렬에서 의문의 및 대상 서열은 모두 DNA 서열이다. U을 T으로 변환함에 의해, RNA 서열이 비교될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 핵산 서열은 하기에서 더욱 자세히 설명된 바와 같이, 인간에서 상피 종양을 치료하기 위하여, 예를 들어, 유전자 치료 시도를 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 위에서 정의된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 벡터는 위에서 정의된 상기 핵산 서열에 작동적으로 연결된(operably-linked) 조절 서열을 추가로 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 벡터는 발현 벡터이다.
또한, 본 발명의 벡터는 또한 유전자 전달 또는 유전자 타겟팅 벡터일 수 있다. 생체외 또는 생체내 기술에 의한 세포 내로의 치료적 유전자 또는 핵산의 도입에 기초를 둔 유전자 치료는 유전자 전달의 가장 중요한 적용 중 하나이다. 시험관 내 또는 생체 내 유전자 치료를 위한 적절한 벡터, 방법, 또는 유전자-전달 시스템은 문헌에 기술되어 있으며 또한 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있는데; 예를 들면, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodua, Blood 91 (1998), 30-36; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-2251 ; Verma, Nature 389 (1997), 239-242; Anderson, Nature 392 (Supp. 1998), 25-30; Wang, Gene Therapy 4 (1997), 393-400; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957; US 5,580,859; US 5,589,466; US 4,394,448 또는 Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640, 및 상기 문헌들에 인용된 참고문헌을 참조한다. 본 명세서에서 정의된 핵산분자 및 벡터는 세포 내로 직접 도입하거나 또는 리포솜이나 바이러스성 벡터 (예, 아데노바이러스, 레트로바이러스), 전기천공(electroporation), 또는 기타 전달 시스템를 통해 도입하는 것으로 설계될 수 있다. 추가적으로, 본 명세서에서 정의된 핵산 분자에 대한 진핵 발현 시스템으로서 바쿨로바이러스 시스템이 사용될 수 있다. 상기 도입 및 유전자 치료 시도는, 바람직하게는, 본 명세서에서 정의된 기능성 이중특이적 단일 사슬 항체 구조물의 발현을 가져오며, 여기서 상기 발현된 이중특이적 단일 사슬 항체 구조물은 인간에서 상피 종양의 치료, 개선 및/또는 예방에 특히 유용하다.
추가의 측면에서, 본 발명은 위에서 정의된 핵산 또는 벡터로 형질전환된(transformed) 또는 트랜스펙트된(transfected) 숙주를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 면역 작동 세포에 대한 활성화 신호를 제공할 수 있는 단백질성 화합물을 추가로 포함하는, 상기의 본 명세서에서 정의된 약학적 조성물에 관한 것이다.
바람직하게는, 약학적 조성물은 적절한 부형제, 안정제 및/또는 담체의 제형을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 위에서 정의된 약학적 조성물의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 본 명세서에서 정의된 숙주를 배양하고, 상기 배양으로부터 생성된 이중특이적 단일 사슬 항체를 회수하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가의 측면은 인간에서 상피 종양의 예방, 치료 또는 개선을 위한 약학적 조성물의 제조를 위한, 상기에서 정의된 숙주 또는 상기에서 정의된 벡터, 상기에서 정의된 핵산 분자, 또는 상기에서 정의된 또는 상기에서 정의된 방법에 의해 제조된 이중특이적 단일 사슬 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 측면은 인간에서 상피 종양의 예방, 치료 또는 개선 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 위에서 정의된 방법에 따라 제조된 또는 본 발명의 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 기술분야의 당업자, 특히 주치의는 본 발명의 이중특이적 분자/이중특이적 단일 사슬 항체의 투여를 필요로 하는 환자의 성공적인 치료를 평가할 수 있다. 따라서, 투여 스킴 및 투여량과 투여 시간은 기술분야의 당업자에 의해 평가될 수 있고: 평가될 상응하는 "개선" 및/또는 "치료"는 하기에서 정의된다.
본 명세서에서 사용된, 상피 종양의 콘텍스트(context)에서 본 발명의 약학적 조성물의 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은, 1차, 국부적, 또는 전이 종양 조직을 파괴, 변형, 조절 또는 제거하는데 충분한 치료제의 양을 의미한다. 치료적 유효량은 상피 종양(들)의 퍼짐을 지연하거나 또는 최소화하는데 충분한 치료제의 양을 의미할 수 있다. 약학적 유효량은 또한 상피 종양(들)의 치료 또는 관리에 치료적 이익을 제공하는 약학적 제제 또는 치료제의 양을 의미할 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 제제 또는 치료제에 관한 치료적 유효량은, 상피 종양의 치료 또는 관리에 치료적 이익을 제공하는 약학적 제제 또는 치료제 단독, 또는 다른 요법과 조합한 약학적 제제 또는 치료제의 양을 의미한다. 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 양과 관련하여 사용된 상기 용어는, 전체 치료의 향상, 원하지 않은 효과를 감소 또는 회피하거나, 또는 다른 치료제와 함께, (본 명세서에서 정의된) 시너지 또는 치료적 효능을 증대시키는 양을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상피 종양(들)의 치료에서 치료제의 치료적 유효량은, 전체 치료의 향상, 원하지 않은 효과를 감소 또는 회피하거나, 또는 다른 치료제와 함께, 시너지 또는 치료적 효능을 증대시킨다. 예를 들어, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체는, 단일 요법(mono-therapy)으로서 환자에게 투여될 경우 20%의 상피 종양의 직경을 감소시킬 수 있다. 반대로, 제2 치료제, 예를 들어, 하기에서 정의된 바와 같은 항암제는 10%의 종양 감소를 가져올 수 있다. 그러나, 만일 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체 및 상기 제2 치료제 양자가 동시 요법(co-therapy)의 형태로 조합하여 투여될 경우, 50%의 종양 감소를 관찰할 수 있다. 그러한 효과는 본 명세서에서 사용된 시너지 효과로 이해할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "요법"은 상피 종양의 예방, 치료, 또는 개선에 사용될 수 있는 임의의 투여 스킴, 방법 및/또는 제제를 의미한다. 용어 "상피 종양의 예방, 치료 또는 개선"은 하기에서 더욱 자세히 정의된다. 용어 "요법들" 및 "요법"은, 상피 종양의 치료, 예방, 또는 개선, 또는 그들의 하나 이상의 증상에 유용한 생물학적 요법, 지지 요법, 화학 요법, 방사 요법 및/또는 기타 요법들을 의미할 수 있다.
환자에게 요법 또는 요법을 투여하는 콘텍스트에서, 본 명세서에서 사용된 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 상피 종양의 진행, 심각도, 및/또는 지속의 개선 또한 감소를 의미한다. 상기 상피 종양(들)은 예를 들어, CEA의 활동 또는 과발현과 같은 비정상 발현, 및/또는 하나 이상의 요법의 투여(하나 이상의 약학적 제제 또는 치료제의 투여를 포함함)에 기인한 그들의 하나 이상의 증상의 개선과 관련될 수 있다.
가장 바람직한 투여 모드는 주어진 시간/시간 간격으로의 투여이다. 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체는 단독당으로 투여될 수 있지만, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체로 투여되는 것이다. 적절한 약학적 담체의 예는 당업계에 공지이며, 완충 염수, 물, 리포솜, 다양한 타입의 습윤제, 무균 용액 등을 포함한다. 상기 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 종래의 방법에 의해 제형화될 수 있다. 이들 약학적 조성물은 적절한 투여량으로 대상에게 투여될 수 있다. 투여량 요법은 주치의 및 임상적 요인에 의해 결정될 것이다. 의료 분야에서 공지된 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 의약 기술에서 잘 알려진 바와 같이, 환자 크기, 신체 표면적, 연령, 투여할 특정 화합물, 성별, 투여의 시간 및 경로, 일반적 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함한 많은 요소에 따라 달라진다. 비경구 투여용 제제는 무균 수성 또는 비수성 용액, 및 현탁액을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 및 주사 가능한 유기 에스테르 예를 들어 에틸 올리에이트이다. 수성 담체는 염수 및 완충 매체를 포함하는, 물, 수성 용액, 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 부형제(vehicle)는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산을 가한 링거(lactated Ringer's) 또는 고정유(fixed oil)을 포함한다. 정맥내 부형제는 유체 및 영양 보충물, 전해질 보충물 (예를 들어 링거 덱스트로스 계통) 등을 포함한다. 보존제 및 기타 첨가제는 또한 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제, 및 불활성 기체 등과 같이 존재할 수 있다. 그 외에, 본 발명의 약학적 조성물은 혈청 알부민 또는 면역 글로불린과 같은 단백질성 담체, 바람직하게는 인간 기원인 것을 포함할 수 있다. 약학적 조성물의 의도한 용도에 따라, 동시 요법은 단백질성 이중특이적 단일 사슬 항체 이외에, 생물학적 활성제를 추가로 포함할 수 있는 것으로 고안된다. 이러한 제제는 당업계에 알려진, 위장계에 작용하는 제제, 세포증식 억제제로 작용하는 제제, 고요산혈증(hyperurikemia)을 예방하는 제제, 면역반응을 억제하는 제제(예, 코르티코스테로이드, FK506), 순환계에 작용하는 약물, 및/또는 T-세포 동시-자극성(co-stimulatory) 분자 또는 사이토카인(cytokine)과 같은 제제일 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체는 완충액, 안정화제 및 계면활성제로 제형화된다. 상기 완충액은 포스페이트, 시트레이트, 숙시네이트 또는 아세테이트 완충액일 수 있다. 상기 안정화제는 아미노산(들) 및/또는 당일 수 있다. 상기 계면활성제는 세정제, PEG 등일 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체는 시트레이트, 리신, 트레할로스 및 트윈 80(Tween 80)으로 제형화된다. 본 발명의 약학적 조성물에 대한 희석제로서는, 등장 염수 및 트윈 80이 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 용어 "개선"은 질환, 즉 상피 종양의 심각성의 향상 또는 완화를 의미한다. 예를 들어, 그러한 개선은 본 발명의 약학적 조성물의 투여에 기인하여, 안정적인 질환의 달성 - 또는 더더욱 바람직하게는 - 상피 종양의 감소, 즉, 최소화, 부분적 반응 또는 완전한 반응일 수 있다. "안정적인 질환"은 어떠한 종양 진행/성장 또는 어떠한 유의한 종양 진행/성장도 관찰되지 않거나, 또는 임상적 및/또는 조직학적 진단 방법에 의해 검출되지 않는 질환 상태를 의미한다. 예를 들어, 인덱스 병변의 단면적 합계의 감소의 50%를 넘는 종양의 감소는 부분적인 반응으로 간주될 수 있다. "완전한 반응"은 치료 이후 어떠한 손상(들)도 더 이상 검출되지 않는 상태를 나타낸다. 안정적인 질환 및 부분적인 반응 사이의 종양 감소의 반응은 최소 반응으로서 간주될 수 있다. 예를 들어, 인덱스 병변의 단면적 합계의 20%, 25% 또는 30% 감소는 최소 반응으로서 언급될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "개선"은 또한 상피 종양의 수의 감소를 포함한다. 이는 또한 종양 진행의 예방/둔화를 나타낸다. 또한, 비-치료된 종양 환자 대비 치료된 종양 환자의 전체 생존률의 향상은 본 명세서에서 사용된 "개선"으로 간주될 수 있다. 이는 비-치료된 종양 환자 대비 치료된 종양 환자의 비-진행(progression-free) 생존률 또는 비-재발(relapse-free) 생존률의 향상에 필요한 변경을 가하여 적용한다. 게다가, 용어 "개선"은 또한, 예를 들어 치료되는 종양 환자의 삶의 질의 향상을 가져오는, 상피 종양의 증상의 강도의 감소를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "상피 종양의 예방"은 다음과 같이 이해되어야 한다 : 인간 환자로부터 원발 상피 종양(들)의 수술적 제거 후, 및/또는 원발 상피 종양(들)의 화학요법제 또는 방사선 치료 후, 모든 종양 세포들이 신체로부터 제거될 수 있는 것은 아닐 것이다. 그러나, 이러한 남아있는 종양 세포들은 재발 암, 즉 환자에서 국부적인 재발 및/또는 전이를 일으킬 수 있다. 전이는 암의 빈번한 합병증이지만, 암 세포가 원발 종양으로부터 퍼져서 원격 콜로니를 형성하는 프로세스는 잘 이해되지 않는다. 전이 암은 거의 예외없이 치료불가능하며, 신규의 치료 양식에 대한 필요성을 제기한다. 2차 종양(1차 치료 후 신체에 남아있는 종양 세포로부터 기원함)의 형성을 예방하기 위하여 본 발명의 약학적 조성물이 사용되어 이들 파종성 종양 세포를 죽일 수 있다. 이런 식으로, 약학적 조성물은 종양 환자에게서 국부 재발 및/또는 전이의 형성을 예방하는 것을 돕는다.
항-종양 요법의 성공은 각각의 질환의 존재에 대하여 확립된 표준 방법, 예를 들어, 컴퓨터-보조 단층촬영, X-레이, 핵자기공명 단층촬영(예를 들어, 국립 암 연구-기준 기반의 반응 평가에 대하여 [Cheson (1999), J. Clin. Oncol.; 17(4):1244]), 양전자 방출 단층촬영 스캐닝, 내시경술, 형광 활성화 세포 분류(Fluorescence Activated Cell Sorting), 골수, 흉수 또는 복수 생검, 조직/조직학, 및 다양한 상피 종양 특이적 임상적 화학 파라미터(예를 들어, 혈청 중 가용성 CEA 농도)에 의해 모니터링될 수 있고, 기타 확립된 표준 방법이 사용될 수 있다. 또한, T 세포 활성화를 측정하는 분석도 사용될 수 있으며, 예를 들어, WO99/054440를 참조한다. 비-치료 종양 환자 대비 치료된 종양 환자의 전체 생존률, 비 진행 생존률 또는 비 재발 생존률의 측정에 대한 통계도 사용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 상피 종양은 위장관 선암종, 유방 선암종 또는 폐 선암종이다. 상기 위장관 선암종은 더 바람직하게는 결장직장, 췌장, 식도 또는 위 선암종이다.
더더욱 바람직하게는, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 진행성 종양, 말기 종양, 높은 종양 로드/부하를 가진 종양 환자, 전이 종양, 또는 100 ng/ml(예를 들어, ELISA에 의해 측정됨)보다 높은 CEA 혈청 농도를 가진 종양 환자의 치료용이다.
본 발명의 방법 또는 용도의 다른 바람직한 구현예에서, 본 명세서에서 정의된 상기 약학적 조성물은 추가의 약물과 조합하여, 예를 들어 동시-요법(co-therapy)의 일부로서 투여되기에 적합하다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체 또는 약학적 조성물은 하나 이상의 다른 요법과 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체 또는 약학적 조성물은 하나 이상의 다른 요법과 동시에 환자에게 투여된다. 바람직하게는, 상기 요법은 상피 종양의 치료에 유용한 것이다. 용어 "동시에"는 약학적 조성물 또는 치료제가 정확히 동시에 투여되는 것으로 제한하는 것이 아니며, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체 또는 약학적 조성물과 다른 제제(들)이 순서대로 및 시간 간격 내에 환자에게 투여되어, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체 또는 약학적 조성물이 다른 제제와 함께 작용하여, 이들이 다르게 투여되었을 경우보다 증가된 장점을 제공할 수 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 각각의 치료제는 동시에 또는 다른 시점에서 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있으나, 동시에 투여되지 않을 경우, 원하는 치료 효과를 제공하기 위하여 충분히 가까운 시간 내에 투여되어야 한다.
각각의 치료제는 임의의 적절한 형태로 및 임의의 적당한 경로에 의해 별개로 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체 또는 약학적 조성물은 수술 전, 수술과 동시, 또는 수술 후에 투여된다. 바람직하게는 수술로 국부화된 상피 종양을 완전히 제거하거나 거대한 상피 종양의 크기를 감소시킨다. 수술은 또한 예방적 수단으로서 또는 통증을 구제하기 위하여 행해질 수 있다.
여기에서 제공된 투여의 빈도 및 투여량은 상기에서 정의된 용어 "치료적으로 유효한"에 포함된다. 투여량 및 빈도는 또한 투여될 구체적인 치료제 또는 예방제, 상피 종양의 타입 및 심각성, 투여의 경로 뿐만 아니라 환자의 체중, 반응, 및 과거의 의료 이력에 따라 각각의 환자에 대해 특이적인 인자에 따라 전형적으로 상이할 것이다. 그러한 인자들 및 하기, 예를 들어, 문헌에 보고되고, Physicians' Desk Reference(59th ed., 2005)에서 추천된 투여량을 고려하여, 적절한 요법이 기술 분야의 당업자에 의해 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일사슬 항체 또는 약학적 조성물의 투여에 의한 요법은 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 및/또는 생물학적 요법/면역 요법과 같은 하나 이상의 요법의 투여와 결합될 수 있다. 치료제는 이에 한정되는 것은 아니지만, 단백질성 분자를 포함하고, 단백질성 분자는 이에 한정되는 것은 아니지만, 펩티드, 폴리펩티드, 번역 후 변형된 단백질을 포함하는 단백질, 항체 등을 포함하고; 또는 작은 분자(1000 달톤 미만), 무기 또는 유기 화합물; 또는 이중-가닥 또는 단일-가닥 DNA, 또는 이중-가닥 또는 단일-가닥 RNA 뿐만 아니라 3중 나선 핵산 분자를 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 치료제는 임의의 공지된 생물(이에 한정되는 것은 아니지만, 동물, 식물, 박테리아, 균류, 원생생물, 또는 바이러스를 포함) 또는 합성 분자의 라이브러리로부터 유도될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법 및 용도는, 당업계에 기재된 Gefitinib(Iressa), Erlotinib (Tarceva), 항-EGFR-항체(예를 들어, Cetuximab; Erbitux), 또는 항-Her2/neu-항체(예를 들어, Trastuzumab; Herceptin)와 같은 키나아제의 억제제인 하나 이상의 치료제의 투여와 조합하여, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체 또는 약학적 조성물의 투여를 포함하며; 예를 들어, Hardie and Hanks (1995) (The Protein Kinase Facts Book, I and II, Academic Press, San Diego, California)를 참조한다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명의 방법 및 용도는, 당업계에 기재된 항-VEGF-항체(예를 들어, Bevacizumab; Avastin), 작은 분자 화합물(예를 들어, Vatalanib 또는 Sorafenib) 또는 COX-억제제와 같은 혈관생성 억제제인 하나 이상의 치료제의 투여와 조합하여, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체 또는 약학적 조성물의 투여를 포함한다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명의 방법 및 용도는, 당업계에 기재된 5-Fluorouracil, Leucovorin, Capecitabine, Oxaliplatin, Irinotecan, Gemcitabine, Doxorubicin, Epirubicin, Etoposide, Cisplatin, Carboplatin, Taxanes (예를 들어, Docetaxel, Paclitaxel)와 같은 항암제인 하나 이상의 치료제의 투여와 조합하여, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체 또는 약학적 조성물의 투여를 포함한다.
바람직하게는, 추가의 치료제(들)과 조합하여, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체 또는 약학적 조성물을 사용한, 상피 종양을 가진 환자의 동시 요법은 시너지 효과를 가져온다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "시너지의"는 요법의 조합(예를 들어, 앞서 정의된 바와 같이 추가의 치료제(들) 및 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체의 조합)을 의미하며, 이는 둘 이상의 단일 요법(예를 들어, 하나 이상의 치료제)의 첨가 효과보다 더욱 효과적이다. 예를 들어, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체는 단일 요법으로 환자에게 투여된 경우 상피 종양의 직경의 20%를 감소시킬 수 있다. 대조적으로, 제2의 치료제, 예를 들어, 하기에 정의된 항암제는 10%의 종양을 감소시킬 수 있다. 그러나, 만일 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체 및 상기 제2 치료제 양자가 동시 요법의 형태로 조합되어 투여된 경우, 50%의 종양 감소를 관찰할 수 있다.
조합 치료(예를 들어, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체 및 전술한 추가의 치료제(들)의 조합)의 시너지 효과는, 질환, 예를 들어, 상피 종양을 가진 환자에게 상기 요법의 덜 빈번한 투여 및/또는 하나 이상의 요법(예를 들어, 하나 이상의 치료제)의 더 낮은 투여량의 사용을 가능하게 한다. 상기 요법의 덜 빈번한 투여 및/또는 더 낮은 투여량의 요법(예를 들어, 치료제)을 사용하는 능력은 질환, 예를 들어, 상피 종양의 치료 또는 예방에 있어서 상기 요법의 효능을 감소시키지 않으면서, 대상에게 상기 요법을 투여하는 것과 관련된 독성을 감소시킨다. 또한, 시너지 효과는 (CEA의 활성 또는 비정상 발현(예를 들어, 과발현)과 관련된 것일 수 있는 상피 종양의 예방, 관리, 치료 및/또는 개선에 있어서 요법(예를 들어, 치료제)의 효능의 개선을 가져올 수 있다. 결국, 조합 요법(예를 들어, 치료제)의 시너지 효과는 임의의 단일 요법의사용과 관련된 반대의 또는 원치 않는 부작용을 회피하거나 감소시킬 수 있다.
상기 동시 요법에서, 활성제(active agent)는 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체와 동일한 약학적 조성물에 임의로 포함될 수 있거나, 또는 별개의 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 후자의 케이스에서, 상기 별개의 약학적 조성물은, 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체를 포함하는 상기 약학적 조성물의 투여 전, 동시투여 또는 후속 투여에 적합하다. 추가의 약물 또는 약학적 조성물은 비단백질성 화합물 또는 단백질성 화합물일 수 있다. 추가의 약물이 단백질성 화합물인 경우에, 상기 단백질성 화합물은 면역 작동 세포에 대한 활성화 신호를 제공할 수 있는 것이 유리하다.
바람직하게는, 상기 단백질성 화합물 또는 비단백질성 화합물은, 상기에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체, 상기에서 정의된 핵산 분자, 상기에서 정의된 벡터, 상기에서 정의된 숙주와 동시에 또는 비동시에 투여될 수 있다. 바람직하게는, 치료될 상기 대상은 인간이다.
추가의 구현예에서, 본 명세서에서 정의된 단일 사슬 이중특이적 항체 또는 항-CEA scFvs는 진단 또는 검출용 제제에 컨주게이트될 수 있다. 그러한 진단 및 검출은 항체 또는 scFv를 검출용 물질, 예를 들어 다양한 효소, 예컨대 당근과산화효소, 알칼리성 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린스테라아제; 배합군(prosthetic group), 예컨대 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴; 형광 물질, 예컨대, 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아진일아민 플루오레세인, 단실 클로라이드(dansyl chloride) 또는 피코에리트린(phycoerythrin); 발광 물질, 예컨대, 루미놀(luminol); 생물발광성 물질, 예컨대, 루시페라아제, 루시페린, 및 애큐오린(aequorin); 방사성 물질 및 동위원소, 예컨대 코발트(57Co), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In), 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 또는 이트륨(90Y), 다양한 양전자 방출 단층촬영을 사용한 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온과 결합하여 달성될 수 있다.
항체에 대해 모이어티를 컨주케이트하기 위한 기술은 공지이다. 모이어티는 이에 한정되는 것은 아니지만, 알데히드/시프 결합(Schiff linkage), 술피드릴 결합, 산-불안정(acid-labile) 결합, 시스-아코니틸 결합, 하이드라존 결합, 효소적으로 분해가능한 결합을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 항체에 컨주게이트될 수 있으며; 일반적으로 Garnett, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216를 참조한다. 항체에 모이어티를 컨주게이트하기 위한 추가적인 기술은 공지이며, 예를 들어, Arnon 등의, Monoclonal Antibodies For lmmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 등 (eds.), pp. 243-56(Alan R. Liss, Inc. 1985)을 참조한다. 폴리펩티드 모이어티에 항체를 컨주게이트 또는 융합하기 위한 방법은 당업계에 공지이며, 예를 들어 Ashkenazi 등, 1991 , PNAS 88: 10535-10539를 참조한다. 모이어티에 항체를 융합하는 것은 반드시 직접적으로 필요한 것은 아니지만, 링커 서열을 통해 발생할 수 있다. 그러한 링커 분자들은 당업계에 통상적으로 알려져 있고, Denardo 등, 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90; Peterson 등, 1999, Bioconjug. Chem. 10:553에 기재되어 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 상기에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체, 상기에서 정의된 핵산 분자, 상기에서 정의된 벡터, 또는 상기에서 정의된 숙주를 포함하는 키트에 관한 것이다.
이들 및 기타 구현예들은 본 발명의 상세한 설명 및 실시예들에 기재되고 포함된다. 면역학에서의 재조합 기술 및 방법은 예를 들어 Sambrook 등의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition 2001 ; Lefkovits; Immunology Methods Manual; The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Laboratory Press, 2002 에 기재되어 있다. 본 발명에 따라서 채택된 항체, 방법, 용도, 및 화합물 중 어느 것과 관련된 추가의 문헌은 예를 들어, 전자 장치를 사용하여, 공공 도서관 및 데이터베이스로부터 입수할 수 있다. 예를 들어, 인터넷상으로 가능한, 공공 데이터베이스인 "메드라인(Medline)"이 사용될 수 있으며, 예를 들면 http://www.ncbi.nlm.nih.qov/PubMed/medline.html을 들 수 있다. 추가의 데이터베이스 및 주소, 예컨대 http://www.ncbi.nim.nih.qov/, http://wwwjnfobioaen.fr/, http://www.fmi.ch/bioloqv/researchtools.html, http://www.tiqr.orQ/가 당업자에게 공지되어 있으며, 또한 예를 들어 http://www.lvcos.com를 사용하여 얻을 수 있다. 종양 관련 토픽에 대해서는, 예를 들어 http://www.nih.gov 또는 http://www.dkfz.de를 참고한다.
도 1은 각각 CD3 양성 HPB-AII 세포 및 인간 CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포에 대한, 다양한 인간 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물의 FACS 결합 분석을 나타낸다. CEA에 결합하기 위한 양성 대조군으로서, 모노클로널 항체 Col-1이 사용되었다. 인간 CD3에 결합하는 대조군으로서, WO 99/054440에 기재된 CD19xCD3 이중특이적 단일 사슬 구조물이 사용되었다. 이러한 양성 대조군에서, 진한 선은 항-His 항체 및 검출 항체와 후속적으로 인큐베이션된, 10μg/ml의 정제된 CD19xCD3 이중특이적 단일 사슬 항체와 인큐베이션된 세포를 나타낸다. 가는 막대그래프 선은 음성 대조군 : 항-His 항체 및 검출 항체와 인큐베이션된 세포를 반영한다. 인간(막-부착) CEA 및 인간 CD3에 대한 결합 활성은 CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL, CEAI VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL, CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL, CEAIII VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL 및 CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL에 대하여 탐지가능하 다. 본 발명에 기재된 이중특이적 단일 사슬 항체에 상응하는 각각의 막대그래프에서, 가는 선은 음성 대조군을 나타내고, 밝고 진한 선은 배양 상청액과 인큐베이션된 세포를 나타내는 반면, 어둡고 두꺼운(가장 오른쪽) 선은 10μg/ml의 정제된 이중특이적 단일 사슬 항체와 인큐베이션된 세포를 나타낸다.
도 2는 직접 ELISA에 의해 검출된 가용성 CEA에 대한 항-CEA 항체 Col-1 및 이중특이적 단일 사슬 항-CEA/항-CD3 항체 CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL, CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL 및 CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL의 결합 신호를 나타낸다. CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (mAb A5B7로부터 유도된 항-CEA 결합 도메인), CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (mAb T84.66로부터 유도된 항-CEA 결합 도메인), 및 CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (mAb MFE-23으로부터 유도된 항- CEA 결합 도메인) 이중특이적 단일 사슬 항체 및 마우스 모노클로널 항체 Col-1은 고정된 가용성 인간 CEA에 특이적으로 결합했다. 가용성 CEA 항원의 부재 중에는 어떠한 결합 신호도 관찰되지 않았다(PBS 대조군).
도 3은 가용성 CEA의 부재 중, 나타낸 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물이 T 세포를 재지시하여, CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포를 용해하는 것을 나타낸다. 자극된 인간 CD8 양성 CTL은 작동 세포(effector cell)로서 사용되었다. 재지시된 세포용해(lysis)의 특이성을 입증하기 위하여, 비-CEA 반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물을 음성 대조군으로서 인큐베이션하였다. 다양한 도메인 배열, 즉 SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VHVL 및 SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VLVH (양자는 항-CD3 결합 도메인과 N-말단에 구성됨) 뿐만 아니라 CEAI VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL 및 CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL(C-말단에 항-CD3 결합 도메인)에 대해 인간 CEA-트랜스펙트된 타겟 세포(CHO-CEA+ 세포)에 대한 세포독성 활성을 관찰할 수 있다. 비-트랜스펙트된 CHO 세포(인간 CEA 결여)는 음성 대조군으로서 사용되었다.
도 4는 가용성 CEA의 부재 중, 나타낸 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물이 T 세포를 재지시하여, CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포를 용해하는 것을 나타낸다. 재지시된 세포용해의 특이성을 입증하기 위하여, 비-트랜스펙트된 CHO 세포가 음성 대조군으로서 포함되었다. 자극된 인간 CD8 양성 CTL은 작동 세포로서 사용되었다. CEA I-HL (CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL), CEA III-LH (CEAIII VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL), CEA III-HL (CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL) 및 CEA II HL(CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL)는 인간 CEA-트랜스펙트된 CHO 세포에 대한 세포독성 활성을 나타냈다. 비-트랜스펙트된 CHO 세포(인간 CEA 결여)는 CEA I-LH (CEAI VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL), CEA III-HL (CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL) 및 CEA II HL (CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL)에 대한 음성 대조군으로서 사용되었다. CEAI은 마우스 mAb A5B7로부터 유도된 가변 영역을 나타내고, CEAII는 마우스 mAb T84.66로부터 유도된 가변 영역이고, CEAIII은 mAb MFE-23으로부터 유도된 가변 영역을 의미한다.
도 5는 가용성 인간 CEA의 존재 중, 나타낸 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물이 T 세포를 재지시하여, CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포를 용해하는 것을 나타낸다. 자극된 인간 CD8 양성 CTL은 작동 세포로서 사용되었다. CEAI VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL 및 CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL에 의해 매개된 세포독성 활성은, 1μg/ml에 이르는 가용성 인간 CEA의 양의 증가에 의해 억제되지 않았다. CEAI은 마우스 mAb A5B7로부터 유도된 가변 영역이다.
도 6은 가용성 인간 CEA의 존재 중, 나타낸 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물이 T 세포를 재지시하여, CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포를 용해하는 것을 나타낸다. 자극된 인간 CD8 양성 CTL은 작동 세포로서 사용되었다. SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VHVL 및 SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VLVH에 의해 매개된 세포독성 활성은, 1μg/ml에 이르는 가용성 인간 CEA의 양의 증가에 의해 억제되지 않았다. CEAI은 마우스 mAb A5B7로부터 유도된 가변 영역이다.
도 7은 가용성 인간 CEA의 존재 중, 나타낸 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물이 T 세포를 재지시하여, CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포를 용해하는 것을 나타낸다. 자극된 인간 CD8 양성 CTL은 작동 세포로서 사용되었다. CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL의 세포독성 활성은, 가용성 인간 CEA의 양의 증가에 의해 억제되지 않았다. CEAII VHVL는 mAb T84.66으로부터 유도된다.
도 8은 가용성 인간 CEA의 존재 중, 나타낸 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물이 T 세포를 재지시하여, CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포를 용해하는 것을 나타낸다. 자극된 인간 CD8 양성 CTL은 작동 세포로서 사용되었다. CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL-매개된 세포독성은 가용성 CEA 항원에 의한 억제에 내성을 갖는 반면, CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL-매개된 세포독성 활성은 가용성 CEA의 훨씬 적은 양에 의해 억제된다. CEAIII VHVL은 mAb MFE-23으로부터 유도되는 반 면, CEAI은 마우스 mAb A5B7로부터 유도된 가변 영역이다.
도 9는 증가하는 양의 가용성 CEA 항원의 존재 중, 나타낸 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물이 T 세포를 재지시하여, Kato III 세포를 용해하는 것을 나타낸다. 본래의 인간 PBMC가 작동 세포로서 사용되었다. CEAII VHVLxSEQ ID NO.77-매개된 세포독성 활성은 가용성 CEA에 대한 내성이 없다. CEAII VHVL는 mAb T84.66으로부터 유도된다.
도 10은 증가하는 양의 가용성 CEA 항원의 존재 중, 나타낸 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물이 T 세포를 재지시하여, Kato III 세포를 용해하는 것을 나타낸다. 자극된 인간 CD8 양성 CTL은 작동 세포로서 사용되었다. CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL-매개된 세포독성은 가용성 CEA에 대한 내성을 갖는다. 반면, CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL-매개된 세포독성 활성은 가용성 CEA의 증가하는 양에 의해 억제된다. CEAII VHVL는 mAb T84.66으로부터 유도되는 반면, CEAI은 마우스 mAb A5B7로부터 유도된 가변 영역이다.
도 11은 증가하는 양의 가용성 CEA 항원의 존재 중, 나타낸 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물이 T 세포를 재지시하여, CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포를 용해하는 것을 나타낸다. 자극된 인간 CD8 양성 CTL은 작동 세포로서 사용되었다. CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL-매개된 세포독성 활성은 가용성 CEA의 증가하는 양에 의해 억제된다. CEAII VHVL는 mAb T84.66으로부터 유도된다.
도 12는 선택된 클론들로부터의 Flag-태그된 scFv 단백질 단편을 포함하는 원형질막주위 제제의 흐름 세포측정 분석이다. 가용성 scFv 단백질 단편의 원형질 막주위 제제는 100,000 내지 200,000의 CEA-트랜스펙트된 CHO 세포에 가해졌다. 검출을 위해서 모노클로널 항-Flag 항체에 이어서 PE-라벨된 폴리클로널 항-마우스 항체를 사용하였다. 세포에 결합하는 ScFvs는 PBS 단독으로 인큐베이션된 세포 대비 형광 강도에서의 증가에 의해 측정되었다. 형광 강도는 X-축에 나타내었고, 경우의 수(number of event)는 Y-축에 나타내었다. 음성 대조군(PBS 및 검출 시약)은 채워진 커브로 도시되었고, 각각의 scFvs는 회색 선으로 도시되었다. 오른쪽으로의 시프트는 세포에 대한 양성 결합을 나타낸다. 모든 scFvs, 즉 A-121 , A-183, A-240, A- 313, A-290, A-315, A4-35, A4-52 및 MP2-A5는 CHO 세포 상의 막-부착 CEA에 결합한다. 실시예 6에서 설명한 바와 같이, 각각의 scFv는 마우스 A5B7 VH 영역 및 인간 VL 영역으로 구성된다.
도 13은 선택된 것들로부터의 Flag-태그된 scFv 단백질 단편을 포함하는 원형질막주위 제제의 흐름 세포측정 분석이다. 가용성 scFv 단백질 단편의 원형질막주위 제제는 100,000 내지 200,000의 CEA-트랜스펙트된 CHO 세포에 가해졌다. 검출은 모노클로널 항-Flag 항체에 이어서 PE-라벨된 폴리클로널 항-마우스 항체에 의해 수행되었다. 세포에 결합하는 ScFvs는 PBS 단독으로 인큐베이션된 세포 대비 형광 강도에서의 증가에 의해 측정되었다. 형광 강도는 X-축에 나타내었고, 경우의 수는 Y-축에 나타내었다. 음성 대조군(PBS 및 검출 시약)은 채워진 커브로 도시되었고, 각각의 scFvs는 회색 선으로 도시되었다. 오른쪽으로의 시프트는 세포에 대한 양성 결합을 나타낸다. 완전한 인간의 scFv 구조물 MP510_3-A5.3, MP510_3-B9.1, 및 MP510_3-D8.1은 CHO 세포 상의 막-부착 CEA에 결합한다. 실시예 7에서 설명한 바와 같이, 각각의 이들 scFv는 인간의 VH 영역 및 인간의 VL 영역 A240으로 구성된다. 240 V람다.3은 마우스 A5B7 VH 영역 및 인간 VL A-240 영역으로 구성된 scFv이다. 이러한 구조물은 또한 CEA-결합 활성을 나타낸다.
도 14는 각각, Kato III 세포 및 HPB-AII 세포에 대한, 다양한 인간 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물의 FACS 결합 분석을 나타낸다. 진한 선은 항-His 항체 및 검출 항체와 인큐베이션된 트랜스펙트된 CHO 세포의 세포 배양 상청액과 인큐베이션된 세포를 나타낸다. 가는 막대그래프 선은 음성 대조군 : 항-His 항체 및 검출 항체와 인큐베이션된 세포를 반영한다. 인간의 이중특이적 단일 사슬 항체 구조물 A5 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL, B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL, 및 D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL은 Kato 세포 상의 인간 CEA에 결합하고, HPB-AII 세포 상의 인간 CD3에 결합한다. mAb A5B7로부터 유도된 CEA 결합 도메인의 VH 영역과 함께 CEAI VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL은 동일한 결합 활성을 나타낸다.
도 15는 가용성 CEA의 부재 중, 나타낸 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물이 CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포로 재지시하는 세포독성 분석을 나타낸다. 자극된 인간 CD8 양성 CTL은 작동 세포로서 사용되었다. 세포독성 활성은 A5 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL, B9 VH-A240 VLx SEQ ID NO.77 VHVL1 D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL 및 CEAI VH- A240 VLx SEQ ID NO.77 VHVL에 대하여 검출될 수 있다. CEAI VH는 mAb A5B7로부터 유도된 VH 영역이다.
도 16은 가용성 CEA의 부재 중, 나타낸 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구 조물이 CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포로 재지시하는 세포독성 분석을 나타낸다. 자극된 인간 CD8 양성 CTL은 작동 세포로서 사용되었다. 이 도면은 A240 VL-A5 VHxSEQ ID NO.77 VHVL, A240 VL- B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL, A240 VL-D8 VHx SEQ ID NO.77 VHVL, 및 A240 VL- CEAI VHx SEQ ID NO.77 VHVL에 대한 세포독성 활성을 입증한다.
도 17은 가용성 CEA의 부재 중, 나타낸 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물이 CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포로 재지시하는 세포독성 분석을 나타낸다. 자극된 인간 CD8 양성 CTL은 작동 세포로서 사용되었다. CEA+ 타겟 세포에 대한 세포독성은 SEQ ID NO.77 VHVLxA5 VH-A240 VL, SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240 VL, SEQ ID NO.77 VHVLxD8 VH-A240 VL, SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VH-A240 VL 및 SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VLVH에 대해 나타난다.
도 18은 가용성 CEA의 부재 중, 나타낸 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물이 CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포로 재지시하는 세포독성 분석을 나타낸다. 자극된 인간 CD8 양성 CTL은 작동 세포로서 사용되었다. 세포독성 활성은 SEQ ID NO.77 VHVLxA240 VL-A5 VH, SEQ ID NO.77 VHVLxA240 VL-B9 VH, SEQ ID NO.77 VHVLxA240 VL-D8 VH, 및 SEQ ID NO.77 VHVLx A240VL-CEAI VH 및 SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VLVH에 대해 나타난다.
도 19는 증가하는 양의 가용성 CEA 항원의 부재 중, 나타낸 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물이 CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포로 재지시하는 세포독성 분석을 나타낸다. 자극된 인간 CD8 양성 CTL은 작동 세포로서 사용되었다. 이 도 면은, 예를 들어 A5 VH-A240 VLx SEQ ID NO.77 VHVL 및 B9 VH-A240 VLx SEQ ID NO.77 VHVL에 대하여, 가용성 CEA 항원에 대한 인간의 이중특이적 단일 사슬 항체 구조물의 세포독성 활성의 내성을 입증한다.
도 20은 증가하는 양의 가용성 CEA 항원의 부재 중, 나타낸 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물이 CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포로 재지시하는 세포독성 분석을 나타낸다. 자극된 인간 CD8 양성 CTL은 작동 세포로서 사용되었다. 인간의 이중특이적 단일 사슬 항체 구조물 D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL 및 CEAI VH-A240 VLx SEQ ID NO.77 VHVL 또한 가용성 CEA 항원에 대한 내성을 나타낸다.
도 21은 가용성 CEA의 부재 중, 나타낸 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물이 T 세포를 재지시하여, CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포를 용해하는 것을 나타낸다. 재지시된 세포용해의 특이성을 입증하기 위하여, 비-트랜스펙트된 CHO 세포가 음성 대조군으로서 포함되었다. 자극된 인간 CD8 양성 CTL은 작동 세포로서 사용되었다. A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL, SEQ ID NO.77 VHVLxA240 VL-B9 VH, SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240 VL, B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL, 및 SEQ ID NO.77 VHVLxCEA I VHVL은 인간 CEA-트랜스펙트된 CHO 세포에 대한 세포독성 활성을 보였다.
도 22는 증가하는 양의 가용성 CEA 항원의 존재 중, 나타낸 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물이 T 세포를 재지시하여, CH0-CEA+ 세포를 용해하는 것을 나타낸다. 자극된 인간 CD8+ T 세포가 작동 세포로서 사용되었다. A240 VL-B9 VHx SEQ ID NO.77 VHVL-매개된 세포독성 활성은 가용성 CEA에 대해 내성을 가진다.
도 23은 이중특이적 단일 사슬 구조물 A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL의 고해상도 양이온 교환 크로마토그램이고, 청색 선(위쪽 곡선)은 단백질의 전체 전하 아이소형(isoform)을 나타낸다. 구조물의 높은 동질성을 나타내는 하나의 단일 피크가 검출되었다.
도 24는 24시간 동안 인간 혈장 중 인큐베이션 후 세포독성의 평가에 기초한 단백질 안정성 분석이다. 가용성 CEA의 부재 중, CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물은 CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포에 대해 재지시하였다. 자극된 인간 CD8 양성 CTL이 작동 세포로서 사용되었다. 이 도면은 인간 혈장 중 이중특이적 단일 사슬 구조물 A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL의 혈장 안정성을 입증한다. 상기 구조물의 세포독성 활성은 생리적 조건 하에서 혈장 단백질에 의해 영향받지 않는다.
도 25는 이중특이적 단일 사슬 구조물 SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240 VL의 고해상도 양이온 교환 크로마토그램이고, 청색 선(위쪽 곡선)은 단백질의 전체 전하 아이소형(isoform)을 나타낸다. 이 도면은 이중특이적 단일 사슬 구조물 SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH- A240 VL의 동질성을 입증한다.
도 26은 24시간 동안 인간 혈장 중 인큐베이션 후 세포독성의 평가에 기초한 단백질 안정성 분석이다. 가용성 CEA의 부재 중, CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물은 CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포에 대해 재지시하였다. 자극된 인간 CD8 양성 CTL이 작동 세포로서 사용되었다. 이 도면은 인간 혈장 중 이중특이적 단일 사슬 구조물 SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240 VL의 혈장 안정성을 입증한다. 상기 구조물의 세포독성 활성은 생리적 조건 하에서 혈장 단백질에 의해 영향받지 않는다.
도 27은 증가하는 양의 가용성 CEA 항원의 존재 중, 나타낸 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물이 T 세포를 재지시하여, CHO-CEA+ 세포를 용해하는 것을 나타낸다. 자극된 인간 CD8+ T 세포가 작동 세포로서 사용되었다. 이중특이적 단일 사슬 구조물 SEQ ID NO.77 VHVLxE 12 VH-A240 VL 매개된 세포독성 활성은 가용성 CEA에 대한 내성을 갖는다.
하기 실시예들로 본 발명을 상세히 설명한다.
실시예 1 : 인간 CEA 로 트랜스펙트된 CHO 세포의 생성( 암종배아 항원-관련 세포 부착 분자 5 ; CEACAM5 )
키트 매뉴얼(Qiagen, RNeasy Mini Kit)의 지시에 따라 분리된 전체 RNA를 얻기 위하여 CEA-양성 Kato III 세포(인간 위암종 세포주; ATCC HTB-103)를 사용하였다. 랜덤-초회감작(random-primed) 역전사에 의해 cDNA 합성을 위해 얻어진 RNA를 사용하였다. CEA 항원의 전체 길이 서열의 클로닝을 위하여, 다음의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다 : 5' CEACAM5 EcoRI GAATTCGCCACCATGGAGTCTCCCTCGGCCCC (서열식별번호 74) 및 3' CEACAM5 Sal I GTCGACCTATATCAGAGCAACCCC (서열식별번호 75). PCR (제1 사이클에 대하여, 93℃에서 5분간 변성(denaturation), 58℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 1분간 연장; 30 사이클에 대하여, 93℃에서 1분간 변성, 58℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 1분간 연장; 72℃에서 5분간 말단 연장(terminal extension))을 사용하여 코딩 서열을 증폭하였다. PCR 생성물을 적절하게 소화된 발현 벡터 pEF- DHFR로 결찰하고, E.coli로 형질전환된(transformed) EcoRI 및 SalI로 후속적으로 소화시켰다. 분리된 플라스미드 DNA를 배열하고, CEACAM5(생물공학 정보를 위한 국립 센터에서 NM_004363, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 확립된 뉴클레오티드 서열과 비교했다. 표준의 프로토콜(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (1989; 2001)에 따라 전술한 과정을 수행하였다. 입증된 뉴클레오티드 서열과의 클론은 상기 구조물의 진핵 발현을 위해 DHFR 결핍 CHO 세포에 트랜스펙트하였다. DHFR 결핍 CHO 세포에서 진핵 단백질 발현은 Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566)에 설명된 바와 같이 수행되었다. 구조물의 유전자 증폭은 20nM MTX에 이르는 최종 농도까지 증가하는 농도의 MTX에 의해 유발되었다. 이어서 상기 트랜스펙트된 세포는 FACS 분석을 사용하여 CEA 항원의 발현에 대해 테스트하였다. 이를 위해, 2.5x105의 트랜스펙트된 세포를 5μg/ml의 마우스 모노클로널 항체 COL-1(No. MS-613-P1ABX, Neomakers; Fremont, CA, USA)과 인큐베이션하였다. 항체의 결합은 2% FCS(Dianova(Hamburg, Germany)로부터 입수)와 함께 50μl PBS에서 1:100으로 희석된, R-피코에리트린-컨주게이트된(R-Phycoerythrin-conjugated) 친화성 정제된 F(ab')2 단편, 염소 항-마우스 IgG, Fc-감마 단편 특이성 항체로 검출하였다. 세포는 FACSCalibur(Becton Dickinson, Heidelberg) 상에서 흐름세포 측정에 의해 분석되었다. 형광 강도의 FACS 염색 및 측정은 Current Protocols in Immunology(Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley- Interscience, 2002)에 기재된 바와 같이 수행되었다. 그 결과, 트랜스펙턴트(transfectant)는 인간 CEA 항원에 대한 명백한 양성 염색을 입증했다.
실시예 2: CEAxCD3 이중특이적 단일 사슬 항체의 생성
일반적으로, 이중특이적 단일 사슬 항체 분자는, 각각 인간 CEA 항원에 대해 결합 특이성을 가진 도메인 및 SEQ ID NO.77에 도시된 인간 CD3 항원에 대해 결합 특이성을 가진 탈면역화된 도메인을 포함하며, 표 1에 정의된 바와 같이 디자인된다. 이러한 CD3 결합 도메인에서 V 영역의 배열은 항상 VH-VL이다. 본 명세서에서 정의된 이중특이적 단일 사슬 항체에서 사용된 이러한 탈면역화된 항-CD3 결합 도메인은, 예를 들어 WO2005/040220에서 이미 기재되어 있다.
1. 항- CEA 및 항- CD3 특이성을 포함하는 이중특이적 단일 사슬 항체 분자의 형식(표 1)
Figure 112008052174450-pct00001
파지 디스플레이 가이드된 선택(PDGS)에 의해 얻어지거나 또는 모노클로널 항체, 하이브리도마로부터 유도된 인간 CEA 항원에 대해 특이적인 가변 경쇄(variable light-chain)(VL) 및 가변 중쇄(variable heavy-chain)(VH) 영역을 포함하는 전술한 구조물은 유전자 합성 및 후속의 CD3-특이적 VH 및 VL 조합을 포함하는 발현 벡터로의 클로닝에 의해 얻었다. 상기 이중특이적 단일 사슬 구조물의 생성은 또한 예를 들어, Sambrook (loc.cit.)에 기재된 재조합 기술에 따라 수행될 수 있다. 그에 대한 상세한 설명은 예를 들어, WO 99/054440에서 제공된다.
항-CD3 결합 도메인은 인간 CD3 항원에 대한 결합 특이성을 가진 탈면역화된 도메인에 상응한다. 본 명세서에 기재된 이중특이적 단일 사슬 구조물에서 탈면역화된 항-CD3 결합 도메인의 V 영역의 배열은 항상 VH-VL이다. 상기 VH-VL 도메인의 상응하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO.77에 나타내었다. 인간 암종배아 항원에 특이적인 CEAI, CEAII 및 CEAIII은 각각, mAbs A5B7 (Chester, K. A. 등, lnt J Cancer 57 (1994), 67-72), T84.66 (Neumaier, M. 등, Cancer Res 50 (1990), 2128- 34) 및 MFE-23 (Boehm, M. K. Biochem J 2 (2000), 519-28)으로부터 유도된 가변 중쇄 (VH) 영역 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함한다. A5, B9, D8, 및 E12는 인간 CEA에 특이적인 인간 VH 영역인 반면, A240는 동일한 특이성을 가진 인간 VL 영역이다. 인간 A5, B9, D8, E12 및 A240 V 영역의 생성은 실시예 6 및 7에 자세히 설명된다. 본 명세서에 기재된 모든 이중특이적 단일 사슬 항체의 상응하는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 서열 목록에 나타낸다.
다음에 CEA I VLVH x SEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호6) 구조물의 생성을 보다 자세히 설명한다. 전술한 기타 구조물의 생성은 당업자의 범주 내에서 잘 알려진 방법에 대한 변형의 필요한 실행에 따라서 수행될 수 있다. 전술한 CEAI 특이성 및 탈면역화된 항-CD3(SEQ ID NO.77) 특이성을 포함하는 이중특이적 단일 사슬 항체 분자를 생성하기 위하여, 우선적으로 표준 프로토콜에 따른 유전자 합성에 의해 얻어진 CEAI의 가변 영역은 PCR에 의해 변형되어 상응하는 단일 사슬 항체 Fv 단편을 얻어야 한다. 이를 위해 2단계 융합 PCR을 사용하여 가변 영역에 대한 서열 코딩을 증폭한다. 한 세트의 적절한 프라이머는 PCR-기반 클로닝 단계를 수행하도록 디자인되고, 결국 두 가변 도메인을 15개의 아미노산 링커([Gly4Ser]3)와 VL-링커-VH의 순서로 연결하는 단일 사슬 항체를 가져온다.
간단히 하기 프라이머 조합을 사용했다 :
Figure 112008052174450-pct00002
올리고뉴클레오티드 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다 :
5'CEAI LH: 5' AGGTGTACACTCCGACATTGAGCTCACCCAG 3' (서열식별번호 137)
3'CEAI VL 링커: 5' GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCTTTGATCTCGAGCTTGG 3'
(서열식별번호 138)
5'CEAI VH 링커: 5' GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTCAGGTCCAACTGCAGGAG 3'
(서열식별번호 139)
3'CEAI LH: 5' AATCCGGAGGAGACGGTGACCG 3' (서열식별번호140)
단일 사슬 항체를 생성하기 위하여, PCR 단계 1 및 2로 위에서 기재한 각각의 프라이머 조합과 함께 두 PCR을 행했다. 이러한 PCR 중복 도중에 상보적 서열이, 후속의 융합 PCR 도중 15개의 아미노산 링커의 코딩 서열을 형성하도록 결합된 PCR-생성물(각각의 링커 프라이머로부터 유래함)에 도입되었다. 후속적으로, 증폭된 VH 및 VL 도메인은 단지 외부 프라이머 및 양 PCR-생성물이 요구되는 이러한 융합 PCR에서 결합되었다. 결과물인 scFv 항체는 BsrGI에 대한 제한 효소 인식 부위와 함께 5' 말단 및 BspEI에 대한 제한 효소 인식 부위와 함께 3' 말단에서 측면에 위치된다. BsrGI 부위의 첨가는 WO2005/040220에 기재된 바와 같이 마우스 면역글로불린 리더 펩티드의 코딩 서열과 함께 프레임 내 융합을 허용하도록 수행되었다. BspEI 부위는 이중특이적 단일 사슬 항체를 생성하기 위하여 CD3 특이적 단일 사슬 항체를 코딩하는 서열과 함께 프레임 내 융합을 허용하도록 생성되었다. 단일 사슬 Fv 항체의 융합을 달성하고, 진핵 발현을 가능하게 하기 위하여 CEA 특이적 단일 사슬 Fv 항체의 코딩 서열을 BsrGI 및 BspEI를 통해, WO2005/040220에 기재된 바와 같은 탈면역화된 항-CD3 단일 사슬 Fv 항체를 포함하는 pEFDHFR 발현 벡터(pEFDHFR 은 Mack 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025)에 기재됨)로 클론하였고; 본 명세서에서는 SEQ ID NO.77로 언급하였다. 상기 구조물의 단일 클론을 분리하고, 표준 프로토콜(Sambrock, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbour laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (1989))에 따라 발현 벡터에서 측면에 위치하는 영역에 대해 상보적인 프라이머로 배열하였다. 추가의 실험을 위하여, 입증된 뉴클레오티드 서열과 함께 상기 구조물의 클론을 선택하였다.
2. CEAxCD3 이중특이적 단일 사슬 항체의 발현 및 정제
이중특이적 단일 사슬 항체를 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 발현하였다. DHFR 결여 CHO 세포에서의 진핵 단백질 발현은 Kaufmann (loc. cit.)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 구조물의 유전자 증폭은 20nM MTX에 이르는 최종 농도까지 증가하는 농도의 MTX에 의해 유발되었다. 정적인 배양의 두 경로 후, 세포를 수확 전 7일 동안 CHO 변형된 DMEM 배지(HiQ®, HiClone)와 함께 회전 병에서 성장시켰다. 상기 세포를 원심분리에 의해 제거하고, 발현된 단백질을 포함하는 상청액을 -20℃에서 보관하였다.
크로마토그래피를 위하여 Akta® FPLC 시스템(Pharmacia) 및 Unicorn® 소프트웨어를 사용하였다. 모든 화학물질은 연구 등급이며, Sigma (Deisenhofen) 또는 Merck (Darmstadt)로부터 입수하였다. 제조자에 의해 제공된 프로토콜에 따라서 ZnCl2가 로드된 Fractogel® 칼럼(Merck)을 사용하여 고정된 금속 친화성 크로마토그래피("IMAC")를 수행하였다. 상기 칼럼은 완충액 A2(20mM 인산 나트륨 완충액, pH 7.5, 0.4 M NaCl)와 평행이었고, 세포 배양 상청액(500mL)은 3mL/분의 유속으로 칼럼(10mL)에 제공되었다. 상기 칼럼을 완충액 A2로 세척하여 비결합 샘플을 제거하였다. 하기에 따라서 완충액 B2(20mM 인산 나트륨 완충액, pH 7.5, 0.4 M NaCl, 0.5 M 이미다졸)의 2단계 구배(gradient)를 사용하여 결합된 단백질을 용출하였다.
단계 1 : 6 칼럼 부피에서 20% 완충액 B2
단계 2 : 6 칼럼 부피에서 100% 완충액 B2
단계 2로부터의 용출된 단백질 분획을 추가 정제를 위하여 고이게 했다.
PBS (Gibco)와 평행된 Sephadex S200 HiPrep 칼럼(Pharmacia) 상에서 겔 여과 크로마토그래피를 수행하였다. 용출된 단백질 샘플(유속 1ml/분)들을 검출을 위해 표준 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯(Western Blot)을 행하였다. 정제 전, 칼럼을 분자량 측정에 대해 조정하였다(분자량 마커 키트, Sigma MW GF-200). 표준 단백질로서 IgG(Biorad) 및 단백질 분석 염료(MicroBCA, Pierce)를 사용하여, 단백질 농도를 측정하였다.
CEAxCD3 이중특이적 단일 사슬 항체를 IMAC 및 겔 여과의 2 단계 정제 프로세스로 분리하였다. 주요 생성물은 PBS 중 겔 여과에 의해 측정된 바와 같이 본래의 조건 하에서 ca. 52 kDa의 분자량을 가졌다. 이러한 분자량은 이중특이적 단일 사슬 항체에 상응한다. 모든 구조물을 이러한 방법에 따라 정제하였다.
정제된 이중특이적 단일 사슬 항체 단백질을 프리-캐스트(pre-cast) 4-12% Bis Tris 겔(Invitrogen)로 수행된 환원 조건 하에서 SDS PAGE에서 분석하였다. 제조자에 의해 제공된 프로토콜에 따라서 샘플 제조 및 적용을 수행하였다. MultiMark 단백질 표준(Invitrogen)으로 분자량을 측정하였다. 겔을 콜로이드성 쿠마시에(colloidal Coomassie)(Invitrogen 프로토콜)로 염색하였다. SDS-PAGE에 의해 측정된 바와 같이 분리된 단백질의 순도는 >95%였다. 제조자에 의해 제공된 프로토콜에 따라서 Invitrogen Blot Module 및 Optitran® BA-S83 막을 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 사용된 항체는 기질로서 BCIP/NBT(Sigma), 및 알칼리성 포스파타아제(AP)(Sigma)로 라벨된 염소-항-마우스 Ig과 His Tag(Penta His, Qiagen)에 대하여 지시되었다. 이중특이적 단일 사슬 항체는 웨스턴 블롯에 의해 특이적으로 검출될 수 있었다. 정제된 이중특이적 단일 사슬 항체 분자에 상응하는 52 kD에서 단일 밴드가 검출되었다.
3. CEAxCD3 이중특이적 단일 사슬 항체의 흐름 세포측정 결합 분석
막-부착 인간 CEA 및 인간 CD3에 대한 결합 능력에 관하여 구조물의 기능성을 테스트하기 위해서, FACS 분석을 행하였다. 이를 위해, 인간 CEA-트랜스펙트된 CHO 세포 및 CD3 양성 인간 T 세포 백혈병 세포주 HPB-AII (DSMZ, Braunschweig, ACC483)를 사용하였다. 200,000 CEA 양성 CHO 세포 또는 200,000 HPB-AII 세포를 얼음에서 30분간, 각각 CEA 및 CD3 (전술한 바와 같음)의 VH 및 VL 영역의 상이한 배열을 가지는 이중특이적 항체를 발현하는 CHO 세포 배양의 50μl의 순수한 세포 상청액과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, 상기 구조물의 결합을 라벨되지 않은 마우스 Penta His 항체(2% FCS와 함께 50μl PBS 중에서 1:20으로 희석)로 검출하였으며, 이 항체는 상기 구조물의 C-말단 히스티딘 태그를 통해 세포-부착 구조물에 특이적으로 결합한다. 세척 단계에 이어서 결합되지 않은 마우스 Penta His 항체를 제거하였다.
결합된 항-His 항체를, 2% FCS와 함께 50μl PBS 중에서 1:100으로 희석된, 피코에리트린과 컨주게이트된 Fc 감마-특이적 항체(Dianova)로 검출하였다. 인간 CEA에 결합하기 위한 양성 대조군으로서, 모노클로널 항체 Col-1 (실시예 3 참조)을 사용하였다. 인간 CD3에 결합하는 대조군으로서, WO 99/054440에 기재된CD19xCD3 이중특이적 단일 사슬 구조물을 사용하였다. 음성 대조군으로서, 배양 상청액 대신 새로운 배양 배지를 사용하였다.
세포를 흐름 세포측정 (FACS-Calibur; Becton Dickinson, Heidelberg)에 의해 분석하였다. FACS 염색 및 형광강도의 측정을 Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-lnterscience, 2002)의 Current Protocols에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 8), CEAI VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 6), CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 10), CEAIII VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 12) 및 CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL(서열식별번호 14)와 같은 이중특이적 단일 사슬 항체의 몇몇 도메인 배열은 인간 막-부착 CEA 및 인간 CD3에 결합하였다. 음성 대조군으로서, 배양 배지 및 1 및 2 검출 항체를 사용하였다.
실시예 3: 가용성 인간 CEA 에 대한 CEAxCD3 이중특이적 단일 사슬 항체의 결합
가용성 인간 CEA에 대한 특이성을 측정하기 위하여, 다양한 CEAxCD3 이중특이적 단일 사슬 항체를 ELISA에서 테스트하였다.
이를 위해, 가용성 인간 CEA 항원을 첫 번째로 비오티닐화하였다. 비오티닐화(Biotinylation)는 샘플 믹서(Dynal)에서 실온에서 1시간 동안 15배 몰 과량의 EZ-Link Sulfo NHS-LC-LC-Biotin (Pierce)과 함께 5% DMSO (Sigma)를 포함하는 PBS에서 수행하였다. 유리 비오틴(free Biotin) 및 비오티닐화된 CEA 항원의 분리를 위해서, 표준의 프로토콜에 따라서 PBS에 대해 분석물을 과도하게 투석하였다.
비오틴-라벨된 CEA가 가진 생물활성을 ELISA 결합 실험으로 확인하였다. 가용성 인간 CEA에 대한 CEAxCD3 이중특이적 단일 사슬 항체의 특이성을 측정하기 위한 직접 ELISA를 표준의 절차에 따라서 수행하였다. 간단히, 50μl/웰 PBS 또는 가용성 비오티닐화된 인간 CEA(Abeam; 1xPBS 중 5μg/ml)를 약 16시간 동안 4℃에서 인큐베이션함으로서 96-웰 스트렙타비딘-코팅된 ELISA 플레이트(Nunc)에 고정했다. 웰당 200μl의 물로 세척한 후 200μl의 차단 용액(PBS/3 % BSA)을 가했다. 실온에서 1시간 동안 차단 후, 차단 용액을 체거하였다. 모든 후속의 세척(1xPBS/0.05% (v/v) Tween20의 200μl/웰) 및 인큐베이션 단계는 실온에서 수행하였다. 1회 세척 후, CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 8; mAb A5B7로부터 유도된 항-CEA 부분), CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 10; mAb T84.66로부터 유도된 항-CEA 부분), 및 CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 14; mAb MFE-23으로부터 유도된 항-CEA 부분) 이중특이적 단일 사슬 항체, 및 마우스 모노클로널 항체 CEA/CD66 Ab-3 (Col-1 ; Dunn)을 1시간 동안 상이한 농도(1xPBS 중 0.5μg/ml 및 5μg/ml; 50μl/웰)에서 인큐베이션하였다. 비특이적 결합에 대한 대조군으로서 1xPBS (50μl/웰)를 가하였다. 이어서 His-태그된 이중특이적 단일 사슬 항체의 검출을 위해서, 50μl/웰 Penta-His IgG (Qiagen; 1xPBS 중 2μg/ml)을 가하여 3번의 세척 단계를 행했다. 이어서, 상기 웰들을 3회 세척하고, 1시간 동안 50μl의 당근 과산화효소-라벨된 염소 항-마우스 Fc 감마-특이적 항체(Jackson ImmuneResearch; 1xPBS 중 1 : 1000)와 인큐베이션하였다. 3회 세척 후 ABTS 기질 용액(Roche)을 가하여 ELISA를 수행하고, 405nm의 파장에서 흡광도를 측정했다.
도 2는 ELISA에서 검출된 상이한 이중특이적 단일 사슬 항체의 흡광도를 도시한다. CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 8; mAb A5B7로부터 유도된 항-CEA 부분), CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 10; mAb T84.66으로부터 유도된 항-CEA 부분), 및 CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 14; mAb MFE-23으로부터 유도된 항-CEA 부분) 이중특이적 단일 사슬 항체 및 마우스 모노클로널 항체 Col-1은 가용성 인간 CEA에 특이적으로 결합했다. CEA 항원의 부재 중에는 어떠한 결합 신호도 관찰되지 않았다(PBS 대조군). 요약하면, mAbs A5B7, T84.66 및 MFE-23으로부터 유도된 항-CEA 결합 도메인은 가용성 및 막-부착 양자의 CEA에 결합하였다.
실시예 4: CEAxCD3 이중특이적 단일 사슬 항체의 생물활성
작동 세포(effector cell)로서 자극된 인간 CD8 양성 T 세포 또는 본래의 PBMC, 및 타겟 세포로서 인간 위암종 세포주 Kato III 또는 인간 CEA-트랜스펙트된 CHO 세포를 각각 사용하여, 시험관 내 크롬 방출 세포독성 분석에 의해, 생성된 CEAxCD3 이중특이적 단일 사슬 항체의 생물활성을 분석하였다.
자극된 인간 CD8+ T 세포의 생성은 다음과 같이 수행하였다. 페트리 접시(145mm 직경, greiner bio-one)를 37℃에서 1시간 동안 항-CD3 항체(OKT3 Janssen-Cilag GmbH, Orthoclone 1mg/ml; 최종 농도 1μg/ml) 및 항-CD28 항체(BD, 1mg/ml; 최종 농도 1μg/ml)로 프리코트하였다. 인큐베이션 기간 이후, 결합되지 않은 단백질은 PBS와의 하나의 세척 단계에 의해 제거하였다. 표준 프로토콜에 따라서 피콜(Ficoll) 구배 원심분리에 의해 말초 혈액(30 - 50mL)으로부터 새로운 PBMC를 분리하였다. 3 - 5 x 107 PBMC를 150mL의 RPMI 1640 / 10% FCS / IL-2 20 U/ml (Proleukin, Chiron)에서 프리코트된 페트리 접시에 가하고, 2일 동안 자극하였다. 3일째, 세포를 수집하고, RPMI 1640으로 1회 세척하고, 큰 T-플라스크에 옮겼다. 20 U/ml의 최종 농도까지 IL-2를 가하고, 하루 동안 다시 배양하였다. 매뉴얼의 지시에 따라서 CD8 음성 분리 키트(Dynal Biotech)의 도움으로 CD8+ CTL을 분리하였다. 자극 절차 없이 피콜 구배 원심분리 후 본래의 PBMC를 직접 사용하였다. 타겟 세포를 PBS로 2회 세척하고, 37℃에서 45분간 50% FCS와 함께 100μl RPMI의 최종 부피로 11.1 MBq 51Cr로 라벨하였다. 후속하여 라벨된 타겟 세포를 5ml RPMI으로 3회 세척하고, 이어서 세포독성 분석에 사용하였다. 상기 분석을 96 둥근 바닥 플레이트에서 웰당 5000 타겟 세포 및 50000 작동 세포에 상응하는 10:1의 E:T 비율을 가진 전체 부피 250μl의 보충된 RPMI(상기와 같음)에서 수행하였다. 상기 구조물의 평가를 위하여, 분석 부피 중 이중특이적 단일 사슬 분자의 1μg/ml의 초기 농도 및 그 12번의 3배(threefold) 희석을 적용하였다. 분석 시간은 18시간이었고, 세포독성은 최대 세포용해(Triton-X의 첨가) 및 자발적인 세포용해(작동 세포 없이)의 차이와 관련된 상청액 중 방출된 크롬의 상대적인 부피로서 측정되었다. 모든 측정은 3회 실시하였다. 상청액 중 크롬 활성의 측정은 Wizard 3 감마카운터(Perkin Elmer Life Sciences GmbH, KoIn, Germany)로 수행하였다. 실험 데이터의 분석은 윈도우용 Prism 4로 수행하였다(version 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, USA). 구불창자 투여량 반응 곡선은 상기 소프트웨어에 의해 측정된 바와 같이 전형적으로 R2 값 > 0.90을 갖는다. 상기 분석 프로그램에 의해 계산된 EC50 값은 생물활성의 비교용으로 사용되었다.
도 3은 예를 들어 SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VHVL (서열식별번호 4) 및 SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VLVH (서열식별번호 2) (양자의 구조물은 N-말단에 항-CD3 부분을 구비함) 뿐만 아니라, CEAI VLVHx SEQ ID NO.77VHVL (서열식별번호 6) 및 CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 8)(C-말단에 항-CD3)와 같은 다양한 도메인 배열에 대해서 인간 CEA-트랜스펙트된 타겟 세포(CHO- CEA+ 세포)에 대한 세포독성 활성을 나타낸다. 비-트랜스펙트된 CHO 세포(인간 CEA 결여)가 음성 대조군으로서 사용되었다.
도 4에서는, CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 8), CEAIII VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 12), CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 14), 및 CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 10)이 인간 CEA-트랜스펙트된 CHO 세포에 대한 세포독성 활성을 보였다. 비-트랜스펙트된 CHO 세포(인간 CEA 결여)가 음성 대조군으로서 사용되었다. 앞서 정의한 바와 같이, CEAI은 마우스 mAb A5B7로부터 유도된 가변 영역을 나타내고, CEAII는 마우스 mAb T84.66으로부터 유도된 가변 영역을 나타내고, CEAIII은 마우스 mAb MFE-23으로부터의 가변 영역을 의미한다.
요약하면, 모든 테스트된 구조물은 가용성 인간 CEA의 부재 중, (인간) CEA 발현 Kato III 및 인간 CEA-트랜스펙트된 CHO 세포에 대한 세포독성 활성을 보였다.
실시예 5: 가용성 CEA 항원의 존재 중 특이적인 CEAxCD3 이중특이적 단일 사슬 항체의 생물활성
경쟁 분석은 하기의 점을 제외하고는, 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다 : CEAxCD3 이중특이적 단일 사슬 항체의 생물활성은 다양한 농도의 가용성 인간 CEA 항원의 존재 중에 테스트하였다. 사용된 가용성 인간 CEA 항원(AbCAM Ltd. Cambridge UK)은 단일 환자의 간으로부터의 전이 결장 암종으로부터 분리하였다. 실험적으로, 상기 세포의 추가 전에 37℃에서 30분간, 증가하는 양의 가용성 인간 CEA 항원(각각 0μg/ml; 0.1μg/ml; 1μg/ml, 또는 0μg/ml; 0.004μg/ml; 0.02μg/m; 0.1μg/ml; 0.5μg/ml; 1μg/ml)과 함께 주어진 양의 이중특이적 단일 사슬 항체의 프리-인큐베이션(pre-incubation)에 의해 경쟁 분석을 수행하였다. 분석의 나머지는 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 이들 경쟁적 실험의 결과는 도 5 내지 도 11에서 볼 수 있다.
인간 CEA-양성 타겟 세포에 대한, 이중특이적 단일 사슬 항체들인, mAb T84.66으로부터 유도된 항-CEA 부분과 함께 CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 10; 도 7 및 도 9 내지 도 11 참조), 및 mAb MFE-23으로부터 유도된 항-CEA 영역과 함께 CEAIII VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 12; 도 8 참조)의 세포독성 활성은, 가용성 인간 CEA 항원의 증가에 의해 철저하게 억제되었다. 앞서 정의한 바와 같이, 상기 구조물은 막-부착 및 가용성 인간 CEA 항원 모두에 결합하며; 예를 들어, 실시예 2 및 실시예 3과 도 1 및 도 2를 참조한다. 따라서, 거의 확실히, 가용성 인간 CEA는 상기 이중특이적 단일 사슬 항체의 항-CEA 부분이 타겟 세포, 예를 들어 CHO-CEA+ 또는 Kato III 종양 세포 상에서 막-부착 인간 CEA에 결합하는 것을 방해하고, 그에 의해 상기 항체 구조물에 의해 매개된 세포독성 활성을 억제한다.
대조적으로, 놀랍게도 mAb A5B7로부터 유도된 항-CEA 부분과 함께 이중특이적 단일 사슬 항체가 가용성 인간 CEA에 대한 내성을 가진다는 것이 발견되었다. 예를 들면, CEAI VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 6; 도 5 참조), CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 8; 도 5, 8 및 10 참조), SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VHVL (서열식별번호 4; 도 6 참조) 및 SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VLVH (서열식별번호 2; 도 6 참조)에 의해 매개된 세포독성 활성은 가용성 인간 CEA의 양의 증가에 의해서, 심지어 높은 농도(1μg/ml)에 의해서도 억제되지 않는다. 이것은 상기 이중특이적 단일 사슬 항체의 항-CEA 부분이 가용성 인간 CEA에 결합한다는 사실의 관점에서 예측될 수 없었다(도 2). 오히려, T84.66- 및 MFE-23-유도된 구조물에 대한 케이스와 같이, 가용성 인간 CEA의 증가하는 양에 의해서, CEA-양성 타겟 세포에 대한 세포독성 활성의 억제를 예측할 수 있었으며 ; 상기를 참조한다.
따라서, 본 발명은 심지어 높은 수준의 가용성 CEA 항원의 존재 중 세포독성 항-종양 활성을 가진 약학적 조성물을 제공한다. 따라서, 이들 약학적 조성물은 혈장 중 높은 가용성 CEA 항원 농도를 가진 종양 환자, 예컨대 진행성 상피 종양, 전이 상피 종양, 높은 종양 로드/부하, 말기 상피 종양을 가진 환자 또는 ELISA에 의해 측정된, 100 ng/ml보다 높은 CEA 혈청 농도를 가진 종양 환자의 의 치료용으로 특히 적합하다.
실시예 6: 인간 VL 영역의 선택
암 환자에게 투여되었을 때 감소된 면역원성을 가지는 약학적 조성물을 제공하기 위하여, 가용성 CEA 항원에 대한 내성을 가지는 인간 이중특이적 단일 사슬 항체를 생성하였다. 제1 단계에서, 가용성 CEA에 대한 내성을 가지는 인간 VL 영역을 분리하였다. 따라서, 본 실험의 목적은 모체, 모노클로널 항체 (mAb) A5B7의 마우스 VH와 짝지을 수 있는 인간 VL 영역의 선택이다.
1. 가용성 인간 CEA 항원의 비오티닐화
파지 라이브러리 선택을 위하여, 가용성 CEA 항원을 비오티닐화했다. 비오티닐화는 샘플 믹서(Dynal)에서 실온에서 1시간 동안 15배 몰 과량의 EZ-Link Sulfo NHS-LC-LC-Biotin(Pierce)과 함께 5% DMSO (Sigma)를 포함하는 PBS에서 수행하였다. 유리 비오틴 및 비오티닐화된 CEA 항원의 분리를 위해서, 표준의 프로토콜에 따라서 PBS에 대해 분석물을 과도하게 투석하였다. 비오틴-라벨된 CEA가 가진 생물활성을 ELISA 결합 실험으로 확인하였다.
2. 인간 B-세포로부터 RNA 의 분리
5명의 건강한 인간 제공자로부터 100mL의 혈액을 얻었다. 표준의 방법에 따라 피콜-구배(ficoll-gradient)에 의해 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 분리하였다. 제조자의 지시에 따라 RNeasy® Midi Kit(QIAGEN)를 사용하여 분리된 세포로부터 전체 RNA를 분리하였다. 표준의 방법에 따라 cDNA를 합성하였다(Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 2001).
3. 가변 경쇄 영역( VL -영역)의 PCR -증폭
경쇄 V-영역 DNA의 분리를 위하여, V-카파-(5'-huVK1-Sacl-2001(5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CCAGATGACC CAGTCTCC-3") (서열식별번호 78), 5'-huVK2/4-Sacl-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATGACY CAGTCTCC-3') (서열식별번호 79), 5'-huVK3-Sacl-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGWTGACR CAGTCTCC-3') (서열식별번호 80), 5'-huVK5-Sacl-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CACACTCACG CAGTCTCC-3') (서열식별번호 81), 5'-huVK6-Sacl-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGCTGACT CAGTCTCC-3') (서열식별번호 82), 3'-hu-Vk-J1-Spel-BsiWI (5'-GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATTTCCACC TTGGTCC-3') (서열식별번호 83), 3'-hu-Vk-J2/4-Spel-BsiWI (5'-GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATCTCCASC TTGGTCC-3') (서열식별번호 84), 3'-hu-Vk-J3-Spel-BsiWI (5'-GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATATCCACT TTGGTCC-3') (서열식별번호 85), 3'-hu-Vk-J5-Spel-BsiWI (5'-GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT AATCTCCAGT CGTGTCC-3') (서열식별번호 86) 및 V 람다 (5'-huVL1a-Sacl-2001 (GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG TTG ACG CAG CCG CCC TC) (서열식별번호 87), 5'-huVL1b-Sacl- 2001 (GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG CTG ACT CAG CCA CCC TC) (서열식별번호 88), 5'-huVL2-Sacl-2001 (GAG CCG CAG GAG CCC GAG CTC GCC CTG ACT CAG CCT SCC TCC GT) (서열식별번호 89), 5'-huVL4-Sacl-2001 (ACC TGC GAG CTC GTG CTG ACT CAR YCM YCC TCT GC) (서열식별번호 90), 5'- huVL5-Sacl-2001 (ACC TGC GAG CTC GTG CTG ACT CAG CCR SCT TCC) (서열식별번호 91), 5'-huVL6-Sacl-2001 (ACC TGC GAG CTC ATG CTG ACT CAG CCC CAC TC) (서열식별번호 92), 5'-huVL3/9-Sacl-2001 (GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GWG CTG ACT CAG CCA CCY TC) (서열식별번호 93), 5'-huVL7/8-Sacl-2001 (GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTCTC GTG GTG ACY CAG GAG CCM TC) (서열식별번호 94), 3'-hu-Vlam-Blnl-Spel-202001 (CGT GGG ACT AGT CTT GGG CTG ACC TAG GAC GGT) (서열식별번호 95), 3'-hu-Vlam2-Blnl-Spel-2002: CGT GGG ACT AGT CTT GGG CTG ACC GAG GAC GGT) (서열식별번호 96) 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 인간 B-세포로부터의 RNA를 cDNA(전술한 바와 같음)로 전사하고, PCR 반응에서의 주형 DNA로서 사용하였다. PCR 반응 당, 하나의 5'-프라이머를 하나의 3'-프라이머와 결합하였다. 상이한 PCR 반응의 수는 5' 및 3'-프라이머의 가능한 조합의 수에 의해 결정되었다. 증폭을 위해 하기 PCR-프로그램을 사용하였다: 94℃에서 15초간 변성, 52℃에서 50초간 프라이머 어닐링 및 72℃에서 90초간 프라이머 신장을 40 사이클에 걸쳐 수행하고, 이어서 72℃에서 10분간 최종 신장하였다. 이어서 경쇄 DNA V-단편을 표준의 프로토콜에 따라 분리하였다.
4. 라이브러리 구조 - 인간 VL 풀의 클로닝
예를 들어 "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001에 기재된 바와 같이, 표준의 절차에 기초하여 파지 디스플레이 라이브러리(phage display library)를 일반적으로 구성하였다.
PCR 증폭을 위해 선택된 프라이머들은 경쇄 V-단편에 대한 5'-Sacl 및 3'-Spel 인식 부위를 제공한다. 4개의 결찰 반응을 셋업하였는데, 각각은 400ng의 경쇄 단편(Sacl-Spel 소화됨, 2 x 카파 및 2 x 람다) 및 1400ng의 파지미드(phagemid) pComb3H5BHis (Sacl-Spel 소화됨; 큰 단편; 이 벡터는 Dr. RaIf Lutterbuse의 박사 논문에 상세히 설명됨)로 구성된다. 이어서 상기 4개의 결과물인 항체 V-경쇄 풀은 전기천공(2.5 kV, 0.2cm 갭 큐벳, 25 mF, 200 Ohm, Biorad gene-pulser)에 의해 300μL의 전기적으로 내성인 Escherichia coli XL1 Blue로 각각 형질전환되어, 하기 독립적인 클론의 라이브러리 크기를 가져왔다.
카파1 : 2 x 108
카파2 : 6 x 107
람다l : 9 x 107
람다2 : 6 x 107
상이한 PCR 증폭으로부터의 카파(경쇄) DNA-단편은 하기와 같이 각각의 결찰에 대하여 중량을 구하였다 : 각각의 5'-프라이머는 특이적 그룹을 정의한다. 이들 그룹 내에서, 3'-프라이머는 서브그룹을 정의한다. 카파 서브그룹은 프라이머 3'-hu-Vk-J1-Spel-BsiWI : 3'-hu-Vk- J2/4-Spel-BsiWI : 3'-hu-Vk-J3-Spel-BsiWI : 3'-hu-Vk-J5-Spel-BsiWI에 상응하여 1:2:1:1의 중량을 가졌다. 프라이머 5'-huVK1-Sac-2001 : 5'-huVK3-Sac-2001 : 5'-huVK2/4-Sac-2001 : 5'-huVK5-Sac-2001 : 5'-huVK6-Sac-2001에 상응하여 그들의 생식 계열 분포 1:1:1:0.2:0.2에 따라 상기 그룹의 중량을 구하였다.
상이한 PCR 증폭으로부터 람다(경쇄) DNA-단편은 하기와 같이 각각의 결찰에 대하여 중량을 구하였다 : 각각의 5'-프라이머는 특이적 그룹을 정의한다. 이들 그룹 내에서, 3'-프라이머는 서브그룹을 정의한다. 람다 서브그룹은 프라이머 3'-hu-Vlam-Blnl-Spel-2001 : 3'-hu-Vlam2- Blnl-Spel-2002에 상응하여 3:1의 중량을 가졌다.
프라이머 5'-huVL1a-Sacl-2001 : 5'-huVL1b-Sacl-2001 : 5'- huVL2-Sacl-2001 : 5'-huVL4-Sacl-2001 + 5'-huVL5-Sacl-2001 : 5'-huVL6-Sacl-2001 + 5'-huVL7/8-Sacl-2001 : 5'-huVL3/9-Sacl-2001에 상응하여 그들의 생식 계열 분포 1:1:2:2:2:3에 따라 상기 그룹의 중량을 구하였다. 상기 그룹의 중량을 구하였다.
전기천공 후 표현형 발현에 대하여 각각의 반응을 SOC 액체배지(Fluka)에서 인큐베이션하였다. 상기 두 개의 카파 배양 뿐 아니라 람다 배양을 결합하였다. 이어서 결과물인 카파 배양 및 결과물인 람다 배양을 각각, 밤새 50μg/mL 카르베니실린 및 2 % w/v 글루코오스를 함유하는 SB 선택 배지 500mL 중에서 인큐베이션하였다. 다음날, 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 상업적으로 이용가능한 플라스미드 제조 키트(Qiagen)를 사용하여 프라스미드 제조를 행하였다.
5. 항체 라이브러리 - 인간 VL - 모체 VH 의 구성
mAb A5B7의 모체 VH를 포함하는 벡터로부터 상기 모체 VH를 증폭하기 위하여 PCR을 수행하였다. 증폭을 위하여, 5'-프라이머 5'-AVH-Xhol (5'-GTC ACA CTC GAG TCA GGA GGA GGC TTG GTA C-3') (서열식별번호 97) 및 3'-프라이머 3'-AVH- BstEII (5'-GTC ACA GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G-3' (서열식별번호 98)를 사용하여 표준의 절차에 따른 PCR 프로토콜을 행했다. 분석용 아가로스 겔로부터 대략 350 bp의 증폭 생성물의 정제 후, 제한 효소 BstEII 및 Xhol로 DNA 단편을 절단하였다. 파지미드 pComb3H5BHis (이 벡터는 Dr. RaIf Lutterbuse의 박사 논문에 상세히 설명됨)를 그에 따라 소화시키고, 큰 단편을 상기에서 언급한 단편과 결찰하였다. E. coli XL1 blue로의 형질전환 후에, 단일 클론을 100mL SB 배지(50μg/mL 카르베니실린 함유)에서 배양하고, 표준의 프로토콜에 따라서 플라스미드를 제조하였다. 성공적인 클로닝을 삽입(Sequiserve, Munich)의 시퀀싱(Sequiserve, Munich)에 의해 확인하였다. 이 벡터 pComb3H5BHis/mAb A5B7의 모체VH를 제한 효소 Sacl 및 Spel로 제한하였다. 큰 벡터 단편을 분리하였다. V카파- 및 V람다 라이브러리를 포함하는 플라스미드-DNA를 제한 효소 Sacl 및 Spel로 제한하였다. 작은 V카파- 및 각각의 V람다 단편(각각은 대략 350 bp)은 표준의 프로토콜에 따라서 분리하였다. 1200ng의 벡터 단편을 V카파 및 각각의 V람다 단편 양자의 각각 200ng의 혼합물과 함께 결찰하였다. 결찰 반응은 전기천공(2.5 kV, 0.2cm 갭 큐벳, 25 mF, 200 Ohm, Biorad gene-pulser)에 의해 300μL의 전기적으로 내성인 E. coli XL1 Blue로 형질전환되어, 1.2 x 108 독립적인 클론의 전체 scFv 라이브러리 크기를 가져왔다.
표현형 발현 및 카르베니실린에 대한 느린 적응 후에, 항체 라이브러리를 SB-Carbenicillin (50μg/mL) 선택 배지로 형질전환하였다. 이어서 상기 항체 라이브러리를, 필라멘트형 M13 파지의 생산 및 분비를 초래하는 헬퍼 파지 VCSM 13의 1 x 1012 입자의 감염적 투여량으로 감염시켰으며, 여기서 각각의 파지 입자는 반-인간 scFv-단편을 코딩하는 단일 가닥 pComb3H5BHis-DNA를 포함하고, 파지 코트 단백질 III에 대한 번역 융합으로서 상응하는 scFv-단백질을 디스플레이한다.
6. 인간 VL 의 파지 디스플레이 선택
scFv-레퍼토리를 운반하는 파지 입자를 PEG8000/NaCl 침전 및 원심분리에 의해 배양 상청액으로부터 수확하였다. 이어서 대략 1 x 1011 내지 1 x 1012 scFv 파지 입자를 0.5mL의 TBS/1% BSA에 재현탁하고, ELISA 플레이트(Nunc)의 스트렙타비딘 코팅된 웰에 고정된, 비오티닐화된 가용성 CEA와 1시간 동안 배양하였다. 10μg 항원/ml PBS 용액(50μl)을 스트렙타비딘 코팅된 웰 중 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 물로 1회 세척하고, 이어서 인큐베이션 후 제거된 TBS 중 3% BSA의 200μl와 37℃에서 1 시간 동안 차단하였다. 타겟 항원에 특이적으로 결합하지 않는 scFv 파지는 TBS/0.05 % Tween으로의 세척 단계에 의해 제거되었다. 이러한 세척 절차는 추가의 라운드에서 10회까지 반복하였다.
세척 후, 결합물들을 HCl-글리신, pH 2.2를 사용하여 용출하였다. 2M Tris, pH 12로 중화 후, 새로운 비감염 E. coli XL1 Blue 배양의 감염을 위해 상기 용출물을 사용하였다.
남아있는 높은 결합물들을 용출하기 위하여, 새로운 비감염 E. coli XL1 blue 배양(OD600 > 0.5) 50μL를 웰에 가하고 15분간 인큐베이션하였다. 이어서 양자의 배양을 혼합하고, 인간 scFv-단편을 코딩하는, 파지미드 카피가 성공적으로 도입된 세포를, 카르베니실린 내성에 대해 다시 선택하고, 후속적으로 VCMS13 헬퍼 파지로 감염시켜서 시험관 내 선택 및 항체 디스클레이의 제2 라운드를 개시하였다.
4라운드의 패닝(panning)에 상응하는 플라스미드 DNA를 E. coli 배양으로부터 분리하였다. 가용성 scFv-단백질의 제조를 위하여, VH-VL-DNA 단편을 플라스미드(Xhol-Spel)로부터 삭제하고, 발현 구조물(예를 들어, scFv)이 scFv 및 His6-태그 간 Flag-태그(TGDYKDDDDK)(서열식별번호 99)를 포함하고, 추가의 파지 단백질이 검출되는, 플라스미드 pComb3H5BFlag/His에서 동일한 제한 부위를 통해 클론하였다.
결찰 후, 플라스미드 DNA의 각각의 풀(패닝의 상이한 라운드)을, 100μL의 열 쇼크 내성 E. coli TG 1로 형질전환하고, 카르베니실린 LB-아가상 평판배양하였다. 단일 콜로니를 채집하여 96-웰 플레이트(Greiner)에서 120μL의 LB 카브(LB carb)(50μg/ml) 1% 글루코오스로 접종하였다. 상기 웰들을 반투과성 막(Greiner)으로 시일하고, 상기 플레이트를 진탕 인큐베이터(마스터 플레이트)에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서 10μL의 마스터 플레이트 배양물을 웰당 90μL LB 카브(50μg/ml) 0.1 % 글루코오스를 포함하는 제2 96웰 플레이트(워킹 플레이트)로 옮겼다. 37℃ 진탕 인큐베이터에서 4시간 동안 인큐베이션 후, 각각의 웰에 20μL LB 카브 6mM IPTG를 가하여 scFv 생성을 유발하였다. 진탕과 함께 30℃에서 밤새 또다른 인큐베이션 단계 후에, 40μL 세포용해 완충액(400mM 붕산, 320mM NaCl, 4mM EDTA pH 8, 2.5 mg/mL 리소자임)과 함께, 실온에서 1시간 인큐베이션으로 세포를 용해하였다. 잔류 세포 및 세포 파편을 1,900 x g(Hettich)에서 12분간 원심분리에 의해 분리하였다.
이어서 scFv 분자를 함유하는 상청액을 흐름 세포측정 결합 분석 중 결합에 대해 테스트하였다. CEA-양성 세포주로서 인간 CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포를 사용했다. 세포 결합 분석은 처음에 인간 scFv 또는 상응하는 대조군을 포함하는 원형질막주위 제제와 함께 100,000 내지 200,000개의 세포를 인큐베이션함으로서 수행하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 PBS/1 % FCS(소태아혈청)로 세척하고, 이어서 5-10μg/ml 항-FLAG M2 항체(Sigma)와 함께 추가로 인큐베이션하였다. 상기 세포를 다시 세척한 후, 이들을 폴리클로널, PE-라벨된 항-마우스 항체(Dianova)와 인큐베이션하고, 후속적으로 흐름 세포측정에 의해 분석하였다. CEA-양성 CHO 세포상 결합 신호에 대하여 대략 600 클론을 테스트하였다. 27 양성 클론을 얻었다. 각각의 scFv DNA의 시퀀싱 후, 전체 9개의 상이한 서열을 얻었다.
도 12는 흐름 세포측정 분석에 의해 측정된 다양한 세포주에 대한 9개의 상이한 반-인간 scFv(즉 마우스 A5B7 VH-인간 VL) 구조물의 결합을 나타낸다. 이 도면은 복합적인 다이어그램, 테스트된 각각의 구조물에 대하여 하나를 포함한다. 어떤 임의의 다이어그램에서, 검은색 분포는 scFvs의 검출을 위하여 사용된 모든 적절한 검출제와 함께, 임의의 구조물의 부재 중 PBS 단독으로만 인큐베이션된 세포에 대한 형광 강도를 나타낸다. 이런 식으로 관찰된 모든 형광 시프트는 검출제 또는 완충액보다 scFv 구조물에 명확하게 기인할 수 있다. 각각의 세포주에 결합하는 구조물의 징후인 형광의 시프트는 각각의 다이어그램에서 회색 선으로 나타낸다. 일반적으로, 예를 들어 (검은) 대조군보다 더 멀리 떨어진, 더 높은 크기의 시프트는 더 강한 결합을 나타내는 반면, 예를 들어 (검은) 대조군과 더 가깝게 떨어진, 더 작은 크기의 시프트는 더 약한 결합을 나타낸다.
구조물 A-121, A-183, A-240, A-313, A-290, A-315, A4-35, A4-52, MP2-A5가, 각각의 대조군과 비교시 형광 강도에서의 현저히 식별가능한 시프트를 나타내는 것을 도 12에서 볼 수 있고, 이는 CHO 타겟 세포상에서 막-부착 CEA에 대한 scFv의 결합을 표시한다. 하기에서, scFv A-240 (서열식별번호 48)의 인간 VL 영역이 선택되어 인간 VH 영역의 분리를 위해 사용되었다. 상기 인간 VL 영역은 서열식별번호 63 (뉴클레오티드 서열) 및 서열식별번호 64 (아미노산 서열)로 나타낸다.
실시예 7: 가용성 CEA 항원에 내성을 가지는 인간 VH 영역의 파지 디스플레이 선택 및 항체 라이브러리의 구성
하기 실험의 목적은 실시예 6에 기재된 바와 같이 선택된, scFv A-240의 인간 VL 영역과 짝을 이루는 가용성 CEA 항원에 대한 내성을 가지는 한 세트의 인간 VH 영역을 선택하는 것이다. 상기 인간 VL 영역은 서열식별번호 63 (뉴클레오티드 서열) 및 서열식별번호 64 (아미노산 서열)로 나타낸다.
1. 말초 혈액 단핵세포(PBMC)로부터 RNA 의 분리
5명의 건강한 인간 제공자로부터 100mL의 혈액을 얻었다. 표준의 방법에 따라 피콜-구배에 의해 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 분리하였다. 제조자의 지시에 따라 RNeasy? Midi Kit(QIAGEN)를 사용하여 PBMC로부터 전체 RNA를 분리하였다. 표준의 방법에 따라 cDNA를 합성하였다(Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 2001).
2. 가변 중쇄 영역( VH -영역)의 PCR -증폭
VH 라이브러리를 구성하고, Lib 134-VH로 명명하였다. 이러한 VH-라이브러리는 인간 FR4 생식 계열 서열이 뒤따르는 모체 항체의 VH CDR3에 작동적으로 연결된, 전술한 PBMC 풀의 PCR 증폭된 VH-영역으로부터의 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3의 인간 레퍼토리로 구성된다.
인간 주형 VH-영역의 분리를 위하여, 5'- VH-특이적 프라이머 세트 (5'-huVH1,3,5-Xhol-2001 (5'-AGG TGC AGC TGC TCG AGT CTG G-3') (서열식별번호 100), 5'-huVH4-Xhol-2001 (5'-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3') (서열식별번호 101), 5'-huVH4B-Xhol-2001 (5'-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TGG GG-3') (서열식별번호 102)) 및 두 개의 3'-VH-특이적 프라이머 (3'-hu-VH-BstEII-2001 (5'-CTG AGG AGA CGG TGA CC-3') (서열식별번호 103), 3'- hu-VH-J3-BstEII-2001 (5'-CTG AAG AGA CGG TGA CC-3') (서열식별번호 104))의 세트를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. PCR 반응당, 하나의 5'-프라이머를 하나의 3'-프라이머와 결합하였고; 상이한 PCR 반응의 수는 5'- 및 3'-프라이머의 가능한 조합의 수에 의해 결정하였다. 5명의 제공자의 PBMC cDNA는 VH-유전자의 소스로서 사용하였다. 증폭을 위해 하기 PCR-프로그램을 사용하였다: 94℃에서 15초간 변성, 52℃에서 50초간 프라이머 어닐링 및 72℃에서 60초간 프라이머 신장을 40 사이클에 걸쳐 수행하고, 이어서 72℃에서 10분간 최종 신장하였다. 대략적으로 350bp의 크기를 가진 증폭 생성물을 표준의 방법에 따라 분리하였다.
Lib 134-VH-영역의 분리를 위하여, RT-PCR을 2 단계로 수행하였다. 첫 번째로, 전술한 바와 동일한 5'-VH-특이적 프라이머(5'-huVH1,3,5-Xhol-2001, 5'-huVH4-Xhol-2001, 5'-huVH4B-Xhol-2001 ; 서열식별번호 100-102) 및 3'-특이적 프라이머 세트(3'-A134- VH1A (5'-GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT YGC ACA GTA ATA CAC GGC -3') (서열식별번호 105), 3'-A134- VH1B (5'-GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT YGC ACA GTA ATA CAY RGC -3') (서열식별번호 106), 3'-A134-VH3A (5'-GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT TGY ACA GTA ATA CAC RGC -3') (서열식별번호 107), 여기서 지시된 "T"는 또한 "A", "C" 또는 "G"에 의해 대체될 수 있으며, 3'-A134- VH3B (5'-GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT TGC ACA GTA ATA CAA RGC -3') (서열식별번호 108), 여기서 지시된 "T"는 또한 "A", "C" 또는 "G"에 의해 또한 대체될 수 있으며, FR3의 가장 말단 영역에 매치되는 인간 VH 아군 1, 3 및 4에 대하여 3'-A134- VH4 (5'- GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT SGC ACA GTA ATA CAC RGC -3') (서열식별번호 109))를 사용하여 분리된 주형 VH 단편으로부터 인간 중쇄 VH-분절(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3)을 PCR-증폭하였다.
하기 프라이머 조합을 사용하였다 :
a) 5'-huVH1,3,5-Xhol-2001 x 3'-A134- VH1A
b) 5'-huVH1,3,5-Xhol-2001 x 3'-A134- VH1B
c) 5'-huVH1,3,5-Xhol-2001 x 3'-A134- VH3A
d) 5'-huVH1,3,5-Xhol-2001 x 3'-A134- VH3B
e) 5'-huVH4-Xhol-2001 x 3'-A134- VH4
f) 5'-huVH4B-Xhol-2001 x 3'-A134- VH4
PCR 반응당, 하나의 5'-프라이머를 3'-프라이머와 결합하였고; 상이한 PCR 반응의 수는 5'- 및 3'-프라이머의 가능한 조합의 수에 의해 결정하였다. 증폭을 위해 하기 PCR-프로그램을 사용하였다: 94℃에서 15초간 변성, 52℃에서 50초간 프라이머 어닐링 및 72℃에서 90초간 프라이머 신장을 40 사이클에 걸쳐 수행하고, 이어서 72℃에서 10분간 최종 신장하였다. 이러한 PCR 단계 및 각각의 3'-프라이머 서열을 통해, 인간 VH 분절은 모체 VH CDR3의 일부에 대해 연장되고, 이는 이어서 차례로 제2 단계 PCR 3'-프라이머에 대한 프라이밍 부위가 된다.
이어서 증폭된 DNA-단편(3' A134- JH6 - BstEII. 5'- CGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CC -3") (서열식별번호 110)의 유니버셜 3'-말단에 매치되는 유니버셜 3' 프라이머 및 각각의 5'VH-특이적 프라이머를 다시 사용하여, 제2 PCR 반응의 주형으로서 이들 VH-(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3) DNA-단편을 사용했다.
증폭을 위해 하기 PCR-프로그램을 사용하였다: 94℃에서 15초간 변성, 52℃에서 50초간 프라이머 어닐링 및 72℃에서 60초간 프라이머 신장을 40 사이클에 걸쳐 수행하고, 이어서 72℃에서 10분간 최종 신장하였다. 표준의 프로토콜에 따라서 DNA V-단편을 분리하였다.
3. 라이브러리 구조 - 인간 VH 풀의 클로닝
전술한 방법의 제2 라운드에서, 제1의 이전의 선택(실시예 6 참조)에서 동정된 scFv A-240의 인간 VL을 선택하고, 후속적으로 인간 scFv를 생성할 목적으로 인간 VH 단편의 라이브러리와 결합하였다. 예를 들어 "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001에 기재된 바와 같이, 표준의 절차에 기초하여 파지 디스플레이 라이브러리를 일반적으로 구성하였다.
상이한 PCR 증폭으로부터의 중쇄 DNA-단편을 하가와 같이 각각의 결찰에 대하여 중량을 구했다:
a:b:c:d:e:f = 3:1:3:1:1:1, 여기서 a-f는 하기의 의미를 갖는다:
a) 5'-huVH1,3,5-Xhol-2001 x 3'-A134- VH1A
b) 5'-huVH1,3,5-Xhol-2001 x 3'-A134- VH1B
c) 5'-huVH1,3,5-Xhol-2001 x 3'-A134- VH3A
d) 5'-huVH1,3,5-Xhol-2001 x 3'-A134- VH3B
e) 5'-huVH4-Xhol-2001 x 3'-A134- VH4
f) 5'-huVH4B-Xhol-2001 x 3'-A134- VH4
1개의 결찰 반응을 셋업하였는데, 인간 Lib 134-VH 단편 풀(Xhol-BstEII 소화됨) 및 1200 ng의 플라스미드 pComb3H5BHis/A-240 VL로 구성된다(scFv A-240의 VL 영역을 코딩하는 DNA는 표준의 절차에 따라서 제한 부위 Sad 및 Spel을 통해 pComb3H5BHis로 클론되었다). 이어서 결과물인 항체 인간 VH 풀은 전기천공(2.5 kV, 0.2cm 갭 큐벳, 25 mF, 200 Ohm, Biorad gene-pulser)에 의해 300μL의 전기적으로 내성인 Escherichia coli XL1 Blue로 형질전환되어, 전체적으로 0.8 x 108의 독립적인 클론의 라이브러리 크기를 가져왔다.
전기천공 후 표현형 발현에 대하여 상기 분석물을 SOC 액체배지(Fluka)에서 인큐베이션하였다. 이어서 상기 배양을 밤새 50μg/mL 카르베니실린 및 2 % v/v 글루코오스를 함유하는 500mL의 SB 선택 배지에서 각각 인큐베이션하였다. 다음날, 배양 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 상업적으로 이용가능한 플라스미드 제조 키트(Qiagen)를 사용하여 프라스미드 제조를 행하여 DNA 라이브러리를 보존하였다.
이어서 각각의 scFv 풀을 코딩하는 1.5μg의 이 플라스미드 풀을 E. coli XL1 blue로 전기천공하고(2.5 kV, 0.2cm 갭 큐벳, 25 mF, 200 Ohm, Biorad gene-pulser), 전체적으로 2.4 x 109의 독립적인 클론의 라이브러리 크기를 가져왔다. 표현형 발현 및 카르베니실린에 대한 느린 적응 후에, 항체 라이브러리를 SB-Carbenicillin (50μg/mL) 선택 배지로 옮겼다. 이어서 상기 항체 라이브러리를, 필라멘트형 M13 파지의 생산 및 분비를 초래하는 헬퍼 파지 VCSM 13의 1 x 1012 입자의 감염적 투여량으로 감염시켰으며, 여기서 각각의 파지 입자는 인간 scFv-단편을 코딩하는 단일 가닥 pComb3H5BHis-DNA를 포함하고, 파지 코트 단백질 III에 대한 번역 융합으로서 상응하는 scFv-단백질을 디스플레이한다.
4. 인간 VH 의 파지 디스플레이 선택
인간 scFv-레퍼토리를 운반하는 파지 입자를 PEG8000/NaCl 침전 및 원심분리에 의해 배양 상청액으로부터 수확하였다. 이어서 대략 1 x 1011 내지 1 x 1012 scFv 파지 입자를 0.5mL의 TBS/1% BSA에 재현탁하고, ELISA 플레이트(Nunc)의 스트렙타비딘 코팅된 웰에 고정된, 비오티닐화된 가용성 CEA와 1시간 동안 인큐베이션하였다. 10μg 항원/ml PBS 용액(50μl)을 스트렙타비딘 코팅된 웰 중 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 물로 1회 세척하고, 이어서 인큐베이션 후 제거된 TBS 중 3% BSA의 200μl와 37℃에서 1 시간 동안 차단하였다.
타겟 항원에 특이적으로 결합하지 않는 scFv 파지는 TBS/0.05 % Tween으로의 세척 단계에 의해 제거되었다. 이러한 세척 절차는 추가의 라운드에서 10회까지 반복하였다.
세척 후, 결합물들을 HCl-글리신, pH 2.2를 사용하여 용출하였다. 2M Tris, pH 12로 중화 후, 새로운 비감염 E. coli XL1 Blue 배양의 감염을 위해 상기 용출물을 사용하였다.
남아있는 높은 결합물들을 용출하기 위하여, 새로운 E. coli XL1 blue 배양(OD600 > 0.5) 50μL를 웰에 가하고 15분간 인큐베이션하였다. 이어서 양자의 배양을 혼합하고, 인간 scFv-단편을 코딩하는, 파지미드 카피가 성공적으로 도입된 세포를, 카르베니실린 내성에 대해 다시 선택하고, 후속적으로 VCMS13 헬퍼 파지로 감염시켜서 시험관 내 선택 및 항체 디스클레이의 제2 라운드를 개시하였다.
4라운드의 패닝에 상응하는 플라스미드 DNA를 E. coli 배양으로부터 분리하였다. 가용성 scFv-단백질의 제조를 위하여, VH-VL-DNA 단편을 플라스미드(Xhol-Spel)로부터 삭제하고, 발현 구조물(예를 들어, scFv)이 scFv 및 His6-태그 간 Flag-태그(TGDYKDDDDK)(서열식별번호 99)를 포함하고, 추가의 파지 단백질이 검출되는, 플라스미드 pComb3H5BFlag/His에서 동일한 제한 부위를 통해 클론하였다.
결찰 후, 플라스미드 DNA의 각각의 풀(패닝의 상이한 라운드)을, 100μL의 열 쇼크 내성 E. coli TG 1로 형질전환하고, 카르베니실린 LB-아가상 평판배양하였다. 단일 콜로니를 채집하여 96-웰 플레이트(Greiner)에서 120μL의 LB 카브(LB carb)(50μg/ml) 1% 글루코오스로 접종하였다. 상기 웰들을 반투과성 막(Greiner)으로 시일하고, 상기 플레이트를 진탕 인큐베이터(마스터 플레이트)에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서 10μL의 마스터 플레이트 배양물을 웰당 90μL LB 카브(50μg/ml) 0.1 % 글루코오스를 포함하는 제2 96웰 플레이트(워킹 플레이트)로 옮겼다. 37℃ 진탕 인큐베이터에서 4시간 동안 인큐베이션 후, 각각의 웰에 20μL LB 카브 6mM IPTG를 가하여 scFv 생성을 유발하였다. 진탕과 함께 30℃에서 밤새 또다른 인큐베이션 단계 후에, 40μL 세포용해 완충액(400mM 붕산, 320mM NaCl, 4mM EDTA pH 8, 2.5 mg/mL 리소자임)과 함께, 실온에서 1시간 인큐베이션으로 세포를 용해하였다. 잔류 세포 및 세포 파편을 1,900 x g(Hettich)에서 12분간 원심분리에 의해 분리하였다.
이어서 scFv 분자를 함유하는 상청액을 흐름 세포측정 결합 분석 중 결합에 대해 테스트하였다.
CEA-양성 세포주로서 인간 CEA로 트랜스펙트된 CHO 세포를 사용했다. 세포 결합 분석은 처음에 인간 scFv 또는 상응하는 대조군을 포함하는 원형질막주위 제제와 함께 100,000 내지 200,000개의 세포를 인큐베이션함으로서 수행하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 PBS/1 % FCS(소태아혈청)로 세척하고, 5-10μg/ml 항-FLAG M2 항체와 함께 추가로 인큐베이션하였다. 상기 세포를 다시 세척한 후, 이들을 폴리클로널, PE-라벨된 항-마우스 항체(Dianova)와 인큐베이션하고, 후속적으로 흐름 세포측정에 의해 분석하였다. CEA-양성 CHO 세포상 결합 신호에 대하여 46 클론을 테스트하였다. 그들 모두는 양성 신호를 나타냈다. 각각의 scFv DNA의 시퀀싱 후, 전체 9개의 상이한 서열을 얻었고, 그들 중 8개는 높은 정도의 상동성을 나타냈다. 인간 구조물 MP510_3-A5.3 (MP510-A5; 서열식별번호 50), MP510_3-B9.1 (MP511-B9; 서열식별번호 52), MP510_3-D8.1 (MP511-D8; 서열식별번호 54)이 추가의 특성화(characterization)를 위해 선택되었다. 상응하는 아미노산 서열은 서열 목록에 나타내었다.
상기 인간 구조물 MP510-A5, MP511-B9, MP511-D8 뿐 아니라 반 인간 구조물 A-240 V람다.3 (마우스 VH A5B7/인간 VL A240; 서열식별번호 48)의 원형질막주위 추출물을 CEA-양성 및 -음성 세포주와 함께 흐름 세포측정 실험으로 추가로 분석하였다. 인간 구조물 MP510-A5 (서열식별번호 50), MP511-B9 (서열식별번호 52), MP511-D8 (서열식별번호 54)이, 각각의 반-인간 대조군 A-240 V람다.3 (마우스 VH A5B7/인간 VL A240; 서열식별번호 48)과 비교시 형광 강도에서의 현저히 식별가능한 시프트를 나타내는 것을 도 13에서 볼 수 있다. 따라서, 인간 scFv 구조물은 반 인간 구조물 A-240 V람다.3보다 막-부착 인간 CEA에 대한 더 강한 결합 활성을 나타낸다. 또한, 인간 구조물 모두는 CEA-양성 인간 KATO III 세포(인간 위암 세포주)에 대한 현저한 결합을 나타낸 반면, 그들 중 어느 것도 CEA-음성, 비트랜스펙트된 CHO 세포 및 CEA-음성 인간 NALM 6 세포(인간 B 세포주)에 대한 결합을 나타내지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 8: 인간 CEAxCD3 이중특이적 단일 사슬 항체의 생성 및 세포독성 활성
1. 배열
다음 단계에서, 인간 이중특이적 단일 사슬 항체 분자의 다양한 도메인 배열을 생성하였다. 이들 분자는 인간 항-CEA 결합 도메인(이것의 생성은 위의 실시예 7에서 상세히 설명됨)을 포함하였고, SEQ ID NO.77 VHVL에 나타낸 인간 CD3 항원에 대한 특이성을 가진 탈 면역화된 결합 도메인은 표 1에 기재된 바와 같이 설계되었으며; 위의 실시예 2를 또한 참조한다. 여기에 기재된 인간 항- CEA 결합 도메인을 가진 모든 이중특이적 단일 사슬 항체 구조물은 가용성 인간 CEA 항원에 (명확하게) 결합하는데, 그 이유는 그들이 ELISA 플레이트 상에 고정된 가용성 CEA 항원 상에서 파지 디스플레이 선택의 4 라운드 이후에 분리되었기 때문이다.
특히, 하기 배열이 생성되었다:
(a) N-말단에 위치된 인간 항-CEA 부분:
(i) 항-CEA의 VH-VL 방위:
A5 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 24),
A5 VH-A240 VL# x SEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 126),
B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 32),
B9 VH-A240 VL# x SEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 130),
D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 40)
D8 VH-A240 VL# x SEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 134), 및
CEAI VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 16).
(ii) 항-CEA의 VL-VH 방위:
A240 VL-A5 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 26),
A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 34),
A240 VL-D8 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 42),
및 A240 VL-CEAI VHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 18).
(b) C-말단에 위치된 인간 항-CEA 부분:
(i) 항-CEA의 VH-VL 방위:
SEQ ID NO.77 VHVLxA5 VH-A240VL (서열식별번호 30),
SEQ ID NO.77 VHVLxA5 VH-A240VL# (서열식별번호 128),
SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240VL (서열식별번호 36),
SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240VL (서열식별번호 143),
SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240VL# (서열식별번호 132),
SEQ ID NO.77 VHVLxD8 VH-A240VL (서열식별번호 44),
SEQ ID NO.77 VHVLxD8 VH-A240VL# (서열식별번호 136), 및
SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VH-A240VL (서열식별번호 20).
(ii) 항-CEA의 VL-VH 방위:
SEQ ID NO.77 VHVLxA240VL-A5 VH (서열식별번호 28),
SEQ ID NO.77 VHVLxA240VL-B9VH (서열식별번호 38),
SEQ ID NO.77 VHVLxA240VL-D8VH (서열식별번호 46), 및
SEQ ID NO.77 VHVLxA240VL-CEAI VH (서열식별번호 22).
CEAI VH (서열식별번호 56)는 마우스 mAb A5B7로부터 유도된 VH 영역을 나타내는 반면, CEAI VHVL 또는 CEAI VLVH는 각각, 인간 VL 영역(서열식별번호 64 및 실시예 7 참조)에 상응하는 mAb A5B7. A240으로부터 유도된 VH-VL 도메인 및 VL-VH 도메인을 의미한다. 따라서, 예를 들어, CEAI VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호16)은, mAb7로부터의 마우스 VH 영역 및 인간 VL 영역 A240을 가진 반-인간 CEA-결합 도메인을 구비한 이중특이적 구조물에 상응한다. 인간 항체 라이브러리의 클로닝을 위해서, A240 VL 영역의 원래의 N-말단을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제한 부위로 변환해야만 한다. A5 VH-A240 VL# x SEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 126), SEQ ID NO.77 VHVLxA5 VH-A240VL# (서열식별번호 128), B9 VH-A240 VL# x SEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 130), SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240VL# (서열식별번호 132), D8 VH-A240 VL# x SEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 134), 및 SEQ ID NO.77 VHVLxD8 VH-A240VL# (서열식별번호 136)에서, 원래의 N-말단이 재도입되었다. 이중특이적 단일 사슬 항체 구조물인 SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240VL (서열식별번호 143)은 SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240VL (서열식별번호 36) 구조물과 단지 하나의 아미노산 잔기에서 상이하다 : E12 VH에서 CDR-H2 서열은 "FILNKANGGTTEYAASVKG" (서열식별번호 145)인 반면, B9 VH에서는 "FIRNKANGGTTEYAASVKG" (서열식별번호 67)이다. 인간 E12 VH 영역은 실시예 7에 기재된 바와 같이 분리하였다.
2. 발현, 정제 및 흐름 세포측정 분석
이들 인간 CEAxCD3 이중특이적 단일 사슬 항체의 발현, 정제 및 흐름 세포측정 분석을 위의 실시예 2에 상세히 설명된 방법에 의해 수행하였다.
3. 결합 활성
도 14에 예시한 바와 같이, 인간 이중특이적 단일 사슬 항체 구조물 A5 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 24), B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 32), D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 40) 및 CEAI VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 16)은 CEA-양성 인간 Kato III 세포 및 CD3-양성 HPB- ALL 세포에 결합한다.
4. 가용성 CEA 항원의 부재 중 세포독성 활성
CHO-CEA+ 타겟 세포에 대한 세포독성 활성을 인간 이중특이적 단일 사슬 항체의 하기 도메인 배열에 대하여 입증하였다:
항-CEA 부분의 VH-VL 방위 및 N-말단에 위치된 항-CEA 부분을 구비한 구조물에 대하여, 도 15는 A5 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 24), B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 32), D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 40) 및 CEAI VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 16)에 대한 세포독성 활성을 나타낸다. 도 16은 A240 VL- A5 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 26), A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 34), A240 VL-D8 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 42), 및 A240 VL-CEAI VHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 18)에 대한, (N-말단에 위치된) 항-CEA 도메인의 VL-VH 방위에 대한 세포독성 활성을 입증한다.
항-CEA 부분의 VH-VL 방위 및 C-말단에 위치된 항-CEA 부분을 구비한 구조물에 대하여, 도 17은 SEQ ID NO.77 VHVLxA5 VH-A240VL (서열식별번호 30), SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH- A240VL (서열식별번호 36), SEQ ID NO.77 VHVLxD8 VH-A240VL (서열식별번호 44), 및 SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VH-A240VL (서열식별번호 20)에 대하여 CEA+ 타겟 세포에 대한 세포독성을 나타낸다. SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI LH를 양성 대조군으로서 사용하였다. 도 18은 SEQ ID NO.77 VHVLxA240VL-A5 VH (서열식별번호 28), SEQ ID NO.77 VHVLxA240VL-B9VH (서열식별번호 38), SEQ ID NO.77 VHVLxA240VL-D8VH (서열식별번호 46), 및 SEQ ID NO.77 VHVLx A240VL-CEAIVH (서열식별번호 22)에 대한, (C-말단에 위치된) 항-CEA 도메인의 VL-VH 방위를 가진 구조물의 세포독성 활성을 나타낸다. SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI LH(서열식별번호 2)를 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 21은 상이한 배열로 인간 B9 VH 영역 및 인간 A240 VL 영역을 포함하는 이중특이적 단일 사슬 항체 구조물의 세포독성 활성을 나타낸다: A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 34), SEQ ID NO.77 VHVLxA240 VL-B9 VH (서열식별번호 38), SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240 VL (서열식별번호 36), 및 B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 32)은 인간 CEA-트랜스펙트된 CHO 세포에 대한 세포독성 활성을 보였다.
5. 가용성 CEA 항원에 대한 인간 CEAxCD3 이중특이적 단일 사슬 항체의 내성
인간 이중특이적 단일 사슬 항체에 대한 가용성 인간 CEA 항원의 존재 중 경쟁 분석을 위의 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 19 및 도 20은, 구조물 A5 VH- A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 24), B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 32), D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 40) 및 CEAI VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL(서열식별번호 16)에 대하여 예시한 바와 같이, 또한 인간 구조물에 대한 세포독성 활성의 가용성 CEA 항원에 대한 내성을 입증하고; 마우스-유도 이중특이적 단일 사슬 항체의 가용성 CEA에 대한 내성에 대해서는 실시예 5를 참조한다. 또한, 도 22는 CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물 A240 VL-B9 VHx SEQ ID NO.77 VHVL(서열식별번호 34)이 T 세포를 재지시하여 증가하는 양의 가용성 CEA 항원의 존재 중 CHO-CEA+ 세포를 용해하는 것을 나타낸다. 이 실험은 또한 A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL-매개된 세포독성 활성이 가용성 CEA에 대한 내성을 가지는 것을 입증한다. 결국, 도 27로부터 유도될 수 있는 바와 같이, 이중특이적 단일 사슬 구조물 SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240 VL (서열식별번호 143)-매개된 세포독성 활성은 가용성 CEA에 대한 내성을 갖는다.
따라서, 본 발명은 심지어 높은 수준의 가용성 CEA 항원의 존재 중 세포독성 항-종양 활성을 가진 약학적 조성물을 제공한다. 전술한 바와 같이, 상피 종양을 가진 환자에서 높은 혈청 CEA 농도는 항-CEA 항체 기반 치료의 성공을 저하시킨다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 환자의 혈청/혈장 중에 높은 가용성 CEA 항원을 특징으로 하는 진행성 상피 종양(예를 들어, 원발 종양(들)의 수술적 제거 후 2차, 전이 종양), 악성 상피 종양, 높은 (상피) 종양 로드 및 말기 상피 종양을 가진 환자의 치료에 특히 적합하다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 또한 낮은 투여용량으로 투여되는 것이 기대된다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물에서 이중특이적 단일 사슬 항체의 탈 면역화된 항-CD3 부분 및 항-CEA 부분의 인간 기원 덕분에, 상기 약학적 조성물은 환자에게 투여되었을 때 면역원성이 될 가능성이 낮다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 이중특이적 단일 사슬 구조물의 작은 크기 및 낮은 분자량 덕분에 높은 종양 투과를 제공할 것으로 기대된다. 또한, 상기 분자의 높은 세포독성 활성 때문에 종양 치료에 대하여 소량의 이중특이적 단일 사슬 항체가 사용될 것이다. 환자에게 소량이 투여될 것으로 예측되기 때문에, 환자에 대한 역효과 또한 감소될 것으로 예측된다. 결국, 전술한 바와 같이, 낮은 농도로 투여될 것이기 때문에, 가용성 CEA에 대한 내성이 없는 이중특이적 단일 사슬 항체는 종양 환자의 혈장에서 가용성 CEA 항원의 낮은 농도에라도 매우 민감하게 될 것이다. 이러한 문제점은 또한 본 발명의 약학적 조성물에 의해 회피된다.
실시예 9: 고해상 양이온 교환 크로마토그래피에 의한, A240 VL - B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 34)의 정제된 모노머의 단백질 동질성 평가
정제된 A240 VL - B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 34) 구조물의 동질성을 추가로 특성화하기 위하여, 분리된 모노머 분획을 고해상 양이온 교환 크로마토그래피를 행하였다. 크로마토그래피는 pH 5.5 2OmM MES 완충액으로 평형된 MiniS 칼럼 (Mini S PE 4.6/50 CatX 0.8mL; GE Healthcare 17-5005-01) 상에서 수행되었다. 칼럼에 로딩하기 전에, 동일한 완충액으로 샘플을 1:3으로 희석하였다. 60 칼럼 부피 중 1 M NaCl: 0-30%를 함유하는 평형 완충액의 구배로 결합된 단백질을 용출하였다. 남아있는 단백질을 1M NaCl의 3 칼럼 부피에서 용출하였다. 결과물인 크로마토그램은 도 23에 도시되며, 단일의 주 피크로 된 균질한 단백질 분획을 나타낸다.
실시예 10: A240 VL -B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 34)의 혈장 안정성
A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 34) 구조물의 혈장 안정성을, 상이한 인큐베이션 조건 하에서 실시예 4에 기재된 바와 같은 표준 51-크롬 방출 기반 세포독성 분석에 따라 테스트하였다.
5명의 건강한 제공자의 혈액으로 된 인간 혈장 풀을 EDTA-코팅된 주사기에서 혈액을 수집하여 생성하였다. 세포질 성분을 원심분리에 의해 제거하고, 더 윗부분의 혈장 상을 수집하고, 후속적으로 풀을 생성했다. A240 VL - B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 34) 구조물도 혈장의 존재 또는 부재 중에 37℃ 또는 4℃에서 인큐베이션하였다. 대조군으로서, 상기 구조물을 각각 RPMI 1640 배지 또는 혈장에서 세포독성 분석 바로 전에 희석하였다. CHO-CEA+ 는 타겟 세포로서 기능하였고; 자극된 CD8+ T 세포는 작동 세포로서 사용되었다. 작동 : 타겟(E:T) 비율은 10:1이었다. 분석을 18시간 동안 지속하였다.
도 24에 도시된 바와 같이, CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물 A240 VL - B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (서열식별번호 34)은 매우 안정한 것으로 입증되었고, 37℃에서 24시간 동안 인간 혈장에서의 인큐베이션 후 세포독성 활성의 어떠한 손실도 검출할 수 없었다.
실시예 11 : 고해상 양이온 교환 크로마토그래피에 의한, SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH -A240 VL (서열식별번호 143)의 정제된 모노머의 단백질 동질성 평가
SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240 VL (서열식별번호 143)을 분석한 것을 제외하고는, 실시예 9와 동일하게 실험을 행하였다. 결과물인 크로마토그램은 도 25에 도시되며, 단일의 주 피크로 된 균질한 단백질 분획을 나타낸다.
실시예 12: SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH -A240 VL (서열식별번호 143)의 혈장 안정성
SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240 VL (서열식별번호 143)을 분석한 것을 제외하고는, 실시예 10과 동일하게 실험을 행하였다. 도 26에 도시된 바와 같이, CEA-반응성 이중특이적 단일 사슬 구조물인 SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240 VL (서열식별번호 143)은 매우 안정한 것으로 입증되었고; 37℃에서 24시간 동안 인간 혈장에서의 인큐베이션 후 세포독성 활성의 어떠한 손실도 검출할 수 없었다.
SEQUENCE LISTING <110> Micromet AG <120> Pharmaceutical compositions with resistance to soluble CEA <130> L1652 PCT S3 <150> EP 05 02 8064.3 <151> 2005-12-21 <150> US 60/751,963 <151> 2005-12-21 <150> US 60/780,861 <151> 2006-10-03 <160> 147 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1476 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SEQ ID NO: 77 VHVL x CEA I VLVH ; Bispecific single chain antibody <400> 1 gacgtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 gcagacagcg tcaagggccg cttcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240 atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcaacct attactgtgc aagatattat 300 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctcaggc 360 gaaggtacta gtactggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagcaga cgacattgta 420 ctgacccagt ctccagcaac tctgtctctg tctccagggg agcgtgccac cctgagctgc 480 agagccagtc aaagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagccggg caaggcaccc 540 aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 600 agtgggtctg ggaccgacta ctctctcaca atcaacagct tggaggctga agatgctgcc 660 acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtggcgg gaccaaggtg 720 gagatcaaat ccggaggtgg tggatccgac attgagctca cccagtctcc agcaatcctg 780 tctgcatctc caggggagaa ggtcacaatg acttgcaggg ccagctcaag tgtaacttac 840 attcactggt accagcagaa gccaggatcc tcccccaaat cctggattta tgccacatcc 900 aacctggctt ctggagtccc tgctcgcttc agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct 960 ctcacaatca gcagagtgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca acattggagt 1020 agtaaaccac cgacgttcgg tggagggacc aagctcgaga tcaaaggtgg tggtggttct 1080 ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct caggtccaac tgcaggagtc aggaggaggc 1140 ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc tcctgtgcaa cttctgggtt caccttcact 1200 gattactaca tgaactgggt ccgccagcct ccaggaaagg cacttgagtg gttgggtttt 1260 attggaaaca aagctaatgg ttacacaaca gagtacagtg catctgtgaa gggtcggttc 1320 accatctcca gagataaatc ccaaagcatc ctctatcttc aaatgaacac cctgagagct 1380 gaggacagtg ccacttatta ctgtaccaga gatagggggc tacggttcta ctttgactac 1440 tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tcctag 1476 <210> 2 <211> 491 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> SEQ ID NO: 77 VHVL x CEA I VLVH ; Bispecific single chain antibody <400> 2 Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205 Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240 Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser 245 250 255 Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys 260 265 270 Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 275 280 285 Gly Ser Ser Pro Lys Ser Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 290 295 300 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser 305 310 315 320 Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 325 330 335 Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 340 345 350 Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 355 360 365 Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 370 375 380 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr 385 390 395 400 Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 405 410 415 Trp Leu Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr 420 425 430 Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Gln 435 440 445 Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala 450 455 460 Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr 465 470 475 480 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 485 490 <210> 3 <211> 1476 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SEQ ID NO: 77 VHVL x CEA I VHVL ; 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VH region <400> 55 gaggtgcagc tggtcgagtc aggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 60 tcctgtgcaa cttctgggtt caccttcact gattactaca tgaactgggt ccgccagcct 120 ccaggaaagg cacttgagtg gttgggtttt attggaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagtacagtg catctgtgaa gggtcggttc accatctcca gagataaatc ccaaagcatc 240 ctctatcttc aaatgaacac cctgagagct gaggacagtg ccacttatta ctgtaccaga 300 gatagggggc tacggttcta ctttgactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 56 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> A5B7 VH ; VH region <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 57 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> A5 VH ; VH region <400> 57 gaggtgcagc tggtcgagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccctcagt acctatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatcaaatg atggaagcaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatagg 300 gggctacggt tctactttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 58 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> A5 VH ; VH region <400> 58 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 59 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> B9 VH ; VH region <400> 59 gaggtgcagc tggtcgagtc tgggggaggc ttggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccgtcagt agctactgga tgcactgggt ccgccaagct 120 ccagggaagg ggctggaatg ggtaggtttc attagaaaca aagctaatgg tgggacaaca 180 gaatacgccg cgtctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc caagaacacg 240 ctgtatcttc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcaaga 300 gatagggggc tacggttcta ctttgactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 60 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> B9 VH ; VH region <400> 60 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 61 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> D8 VH ; VH region <400> 61 gaggtgcagc tggtcgagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccctcagt acctatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatcaaatg atggaagcaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtac tagagatagg 300 gggctacggt tctactttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 62 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> D8 VH ; VH region <400> 62 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 63 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> A240 VL ; VL region <400> 63 caggccgtgc tgactcagcc ggcttccctc tctgcatctc ctggagcatc agccagtctc 60 acctgcacct tgcgcagggg catcaatgtt ggtgcctaca gtatatactg gtaccagcag 120 aagccaggga gtcctcccca gtatctcctg aggtacaaat cagactcaga taagcagcag 180 ggctctggag tctccagccg cttctctgca tccaaagatg cttcggccaa tgcagggatt 240 ttactcatct ctgggctcca gtctgaggat gaggctgact attactgtat gatttggcac 300 agcggcgctt ctgcggtgtt cggcggaggg accaagttga ccgtccta 348 <210> 64 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> A240VL ; VL region <400> 64 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala 20 25 30 Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr 35 40 45 Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60 Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile 65 70 75 80 Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100 105 110 Leu Thr Val Leu 115 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> CDR-H3* A5B7 Shorter CDR-3 of VH of A5B7 with D corresponding to Kabat position 95; Kabat positions 100, 100a, 100b, 101, 102 correspond to FYFDY, respectively <220> <221> MISC_FEATURE <223> with "X1", "X2", "X3" and "X4" corresponding to Kabat positions 96 ("X1"), 97 ("X2"), 98 ("X3") and 99 ("X4"), respectively, of CDR-H3 of murine monoclonal antibody A5B7 and wherein "X" represents any amino acid residue. "X1" is preferably "R" <220> <221> misc_feature <222> (2)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 65 Asp Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> CDR-H3 A5B7 CDR-3 of VH of A5B7 corresponding to Kabat positions 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100a, 100b, 101, 102 <400> 66 Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 67 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CDR-H2 B9 ; CDR-2 of VH B9 <400> 67 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 68 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CDR-H1 B9 ; CDR1 of VH B9 <400> 68 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 69 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CDR-H2 A5/D8 ; CDR-2 of VH A5/D8 <400> 69 Leu Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CDR-H1 A5/D8 ; CDR-1 of VH A5/D8 <400> 70 Thr Tyr Ala Met His 1 5 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CDR-L3 A240 ; CDR-3 of VL A240 <400> 71 Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val 1 5 10 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CDR-L2 A240 ; CDR-2 of VL A240 <400> 72 Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser 1 5 10 <210> 73 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CDR-L1 A240 ; CDR-1 of VL A240 <400> 73 Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr 1 5 10 <210> 74 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5' CEACAM5 EcoRI ; oligonucleotide <400> 74 gaattcgcca ccatggagtc tccctcggcc cc 32 <210> 75 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 3' CEACAM5 SaII ; oligonucleotide <400> 75 gtcgacctat atcagagcaa cccc 24 <210> 76 <211> 702 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CEACAM5 (NM_004363) ; protein <400> 76 Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln 1 5 10 15 Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr 20 25 30 Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly 35 40 45 Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly 50 55 60 Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile 65 70 75 80 Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser 85 90 95 Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile 100 105 110 Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp 115 120 125 Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu 130 135 140 Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys 145 150 155 160 Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr 165 170 175 Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln 180 185 190 Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn 195 200 205 Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg 210 215 220 Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro 225 230 235 240 Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn 245 250 255 Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe 260 265 270 Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn 275 280 285 Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser 290 295 300 Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu 325 330 335 Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr 340 345 350 Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg 355 360 365 Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr 370 375 380 Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser 385 390 395 400 Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp 405 410 415 Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn 420 425 430 Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser 435 440 445 Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile 450 455 460 Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn 465 470 475 480 Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val 485 490 495 Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro 500 505 510 Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln 515 520 525 Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser 530 535 540 Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn 545 550 555 560 Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser 565 570 575 Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly 580 585 590 Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly 595 600 605 Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln 610 615 620 Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu 625 630 635 640 Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe 645 650 655 Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile 660 665 670 Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr 675 680 685 Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile 690 695 700 <210> 77 <211> 243 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> De-immunized anti-CD3 VHVL single chain Fv as described in WO2005/040220 <400> 77 Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205 Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240 Glu Ile Lys <210> 78 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5'-huVK1-SacI-2001 ; oligonucleotide <400> 78 gagccgcacg agcccgagct ccagatgacc cagtctcc 38 <210> 79 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5'-huVK2/4-SacI-2001 ; oligonucleotide <400> 79 gagccgcacg agcccgagct cgtgatgacy cagtctcc 38 <210> 80 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5'-huVK3-SacI-2001 ; oligonucleotide <400> 80 gagccgcacg agcccgagct cgtgwtgacr cagtctcc 38 <210> 81 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5'-huVK5-SacI-2001 ; oligonucleotide <400> 81 gagccgcacg agcccgagct cacactcacg cagtctcc 38 <210> 82 <211> 38 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> 5'-huVK6-SacI-2001 ; oligonucleotide <400> 82 gagccgcacg agcccgagct cgtgctgact cagtctcc 38 <210> 83 <211> 47 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 3'-hu-Vk-J1-SpeI-BsiWI ; oligonucleotide <400> 83 gacgacacta gttgcagcca ccgtacgttt gatttccacc ttggtcc 47 <210> 84 <211> 47 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 3'-hu-Vk-J2/4-SpeI-Bsi/WI ; oligonucleotide <400> 84 gacgacacta gttgcagcca ccgtacgttt gatctccasc ttggtcc 47 <210> 85 <211> 47 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 3'-hu-Vk-J3-SpeI-BsiWI ; oligonucleotide <400> 85 gacgacacta gttgcagcca ccgtacgttt gatatccact ttggtcc 47 <210> 86 <211> 47 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 3'-hu-Vk-J5-SpeI-BsiWI ; oligonucleotide <400> 86 gacgacacta gttgcagcca ccgtacgttt aatctccagt cgtgtcc 47 <210> 87 <211> 41 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5'-huVL1a-SacI-2001 ; oligonucleotide <400> 87 gagccgcacg agcccgagct cgtgttgacg cagccgccct c 41 <210> 88 <211> 41 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5'-huVL1b-SacI-2001 ; oligonucleotide <400> 88 gagccgcacg agcccgagct cgtgctgact cagccaccct c 41 <210> 89 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5'-huVL2-SacI-2001 ; oligonucleotide <400> 89 gagccgcagg agcccgagct cgccctgact cagcctscct ccgt 44 <210> 90 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5'-huVL4-SacI-2001 ; oligonucleotide <400> 90 acctgcgagc tcgtgctgac tcarycmycc tctgc 35 <210> 91 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5'-huVL5-SacI-2001 ; oligonucleotide <400> 91 acctgcgagc tcgtgctgac tcagccrsct tcc 33 <210> 92 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5'-huVL6-SacI-2001 ; oligonucleotide <400> 92 acctgcgagc tcatgctgac tcagccccac tc 32 <210> 93 <211> 41 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5'-huVL3/9-SacI-2001 ; oligonucleotide <400> 93 gagccgcacg agcccgagct cgwgctgact cagccaccyt c 41 <210> 94 <211> 41 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5'-huVL7/8-SacI-2001 ; oligonucleotide <400> 94 gagccgcacg agcccgagct cgtggtgacy caggagccmt c 41 <210> 95 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 3'-hu-VIam-BInI-SpeI-2001 ; oligonucleotide <400> 95 cgtgggacta gtcttgggct gacctaggac ggt 33 <210> 96 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 3'-hu-Vlam2-BInI-SpeI-2002 ; oligonucleotide <400> 96 cgtgggacta gtcttgggct gaccgaggac ggt 33 <210> 97 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5'-primer 5'-AVH-XhoI ; oligonucleotide <400> 97 gtcacactcg agtcaggagg aggcttggta c 31 <210> 98 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 3'-primer 3'-AVH-BstEII ; oligonucleotide <400> 98 gtcacaggtg accgtggtcc cttggcccca g 31 <210> 99 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Flag tag <400> 99 Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 10 <210> 100 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5'-huVH1,3,5-XhoI-2001 ; oligonucleotide <400> 100 aggtgcagct gctcgagtct gg 22 <210> 101 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5'-huVH4-XhoI-2001 ; oligonucleotide <400> 101 caggtgcagc tgctcgagtc ggg 23 <210> 102 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5'-huVH4B-XhoI-2001 ; oligonucleotide <400> 102 caggtgcagc tactcgagtg ggg 23 <210> 103 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 3'-hu-VH-BstEII-2001 ; oligonucleotide <400> 103 ctgaggagac ggtgacc 17 <210> 104 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 3'-hu-VH-J3-BstEII-2001 ; oligonucleotide <400> 104 ctgaagagac ggtgacc 17 <210> 105 <211> 51 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 3'-A134-VH1A ; oligonucleotide <400> 105 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Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu 130 135 140 Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg 145 150 155 160 Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys 180 185 190 Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala 195 200 205 Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp 210 215 220 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val 225 230 235 240 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 260 265 270 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 275 280 285 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 290 295 300 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 305 310 315 320 Lys Gly 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ccaggctcca ggcaaggggc tggagtgggt ggcacttata 900 tcaaatgatg gaagcaataa atactatgca gactccgtga agggccgatt caccatctcc 960 agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg 1020 gctgtgtatt actgtactag agataggggg ctacggttct actttgacta ctggggccaa 1080 gggaccacgg tcaccgtctc ctcaggtggt ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt 1140 ggtggttctc aggccgtgct gactcagccg gcttccctct ctgcatctcc tggagcatca 1200 gccagtctca cctgcacctt gcgcaggggc atcaatgttg gtgcctacag tatatactgg 1260 taccagcaga agccagggag tcctccccag tatctcctga ggtacaaatc agactcagat 1320 aagcagcagg gctctggagt ctccagccgc ttctctgcat ccaaagatgc ttcggccaat 1380 gcagggattt tactcatctc tgggctccag tctgaggatg aggctgacta ttactgtatg 1440 atttggcaca gcggcgcttc tgcggtgttc ggcggaggga ccaagttgac cgtcctatag 1500 <210> 136 <211> 499 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> SEQ ID NO: 77 VHVL x D8 VH - A240 VL# ; Bispecific single chain antibody <400> 136 Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val 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Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser 435 440 445 Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu 450 455 460 Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met 465 470 475 480 Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 485 490 495 Thr Val Leu <210> 137 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5'CEAI LH ; oligonucleotide <400> 137 aggtgtacac tccgacattg agctcaccca g 31 <210> 138 <211> 47 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 3'CEAI VL Linker ; oligonucleotide <400> 138 ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc tttgatctcg agcttgg 47 <210> 139 <211> 48 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5'CEAI VH Linker ; oligonucleotide <400> 139 ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct caggtccaac tgcaggag 48 <210> 140 <211> 22 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> 3'CEAI LH ; oligonucleotide <400> 140 aatccggagg agacggtgac cg 22 <210> 141 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> De-immunized polypeptide linker <400> 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gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtggcgg gaccaaggtg 720 gagatcaaat ccggaggtgg tggatccgag gtgcagctgg tcgagtctgg gggaggcttg 780 gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtgcagcgt ctggattcac cgtcagtagc 840 tactggatgt actgggtccg ccaagctcca gggaaggggc tggaatgggt aggtttcatt 900 ctcaacaaag ctaatggtgg aacaacagaa tacgccgcgt ctgtgaaagg cagattcacc 960 atctcaagag atgattccaa gaacacgctg tatcttcaaa tgaacagcct gagagccgag 1020 gacacggccg tgtattactg tgcaagagat agggggctac ggttctactt tgactactgg 1080 ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc 1140 ggtggtggtg gttctgagct cgtgctgact cagccggctt ccctctctgc atctcctgga 1200 gcatcagcca gtctcacctg caccttgcgc aggggcatca atgttggtgc ctacagtata 1260 tactggtacc agcagaagcc agggagtcct ccccagtatc tcctgaggta caaatcagac 1320 tcagataagc agcagggctc tggagtctcc agccgcttct ctgcatccaa agatgcttcg 1380 gccaatgcag ggattttact catctctggg ctccagtctg aggatgaggc tgactattac 1440 tgtatgattt ggcacagcgg cgcttctgcg gtgttcggcg gagggaccaa gttgaccgtc 1500 ctacatcatc accatcatca 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E12 VH ; VH region <400> 146 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Leu Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 147 <211> 252 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <220> <221> MISC_FEATURE <223> E12 VH - A240 VL ; Single chain Fv <400> 147 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Leu Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 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Claims (41)

  1. 이중특이적 단일 사슬 항체로서, 상기 항체가
    (a) 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인, 및
    (b) 인간 CEA에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 가지며,
    여기서 상기 제2 결합 도메인은 적어도 아미노산 서열 "DX1X2X3X4FYFDY"(서열식별번호 65)을 포함하고, 여기서 "X1", "X2", "X3" 또는 "X4" 는 임의의 아미노산 잔기를 나타내고, 상기 아미노산 잔기 "D"는 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧(Kabat) 위치 95에 대응하고, 상기 아미노산 잔기 "FYFDY"는 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧 위치 100, 100a, 100b, 101, 및 102에 각각 대응하는 것인 항체.
  2. 청구항 1에 있어서,
    "X1"은 "R" (아르기닌), "F" (페닐알라닌), "M" (메치오닌), "E" (글루탐산), 또는 "T"(트레오닌)을 나타내고;
    "X2"는 "G" (글리신), "Y" (티로신), "A" (알라닌), "D" (아스파르트산), 또는 "S" (세린)을 나타내고;
    "X3" 은 "L" (류신), "F" (페닐알라닌), "M" (메치오닌), "E" (글루탐산), 또는 "T" (트레오닌)를 나타내고; 및
    "X4"는 "R" (아르기닌), "Y" (티로신), "A" (알라닌), "D" (아스파르트산), 또는 "S" (세린)을 나타내는 것인 항체.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 인간 CEA에 특이적인 상기 제2 결합 도메인은, 마우스 모노클로널 항체 A5B7의 CDR-H3의 카밧 위치 95-102에 대응하는 아미노산 서열 "DRGLRFYFDY" (서열식별번호 66)를 적어도 포함하는 것인 항체.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, CD3에 특이적인 상기 제1 결합 도메인은 C-말단에 위치되는 것인 항체.
  5. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 결합 도메인이 VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3 또는 VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3 순서로 배열되는 것인 항체.
  6. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 인간 CEA에 특이적인 상기 제2 결합 도메인은, 아미노산 서열 "SYWMH" (서열식별번호 68)을 갖는 CDR-H1, 및/또는 아미노산 서열 "FIRNKANGGTTEYAASVKG" (서열식별번호 67) 또는 "FILNKANGGTTEYAASVKG" (서열식별번호 145)를 갖는 CDR-H2를 포함하는 것인 항체.
  7. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 인간 CEA에 특이적인 상기 제2 결합 도메인은, 아미노산 서열 "TYAMH" (서열식별번호 70)을 갖는 CDR-H1, 및/또는 아미노산 서열 "LISNDGSNKYYADSVKG" (서열식별번호 69)를 갖는 CDR-H2를 포함하는 것인 항체.
  8. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 인간 CEA에 특이적인 상기 제2 결합 도메인은, 아미노산 서열 "TLRRGINVGAYSIY" (서열식별번호 73)를 갖는 CDR-L1 및/또는 아미노산 서열 "YKSDSDKQQGS" (서열식별번호 72)를 갖는 CDR-L2 및/또는 아미노산 서열 "MIWHSGASAV" (서열식별번호 71)를 갖는 CDR-L3을 포함하는 것인 항체.
  9. 청구항 6에 있어서, 인간 CEA에 특이적인 상기 제2 결합 도메인의 VH 영역의 아미노산 서열이 서열식별번호 60 또는 서열식별번호 146인 것인 항체.
  10. 청구항 7에 있어서, 인간 CEA에 특이적인 상기 제2 결합 도메인의 VH 영역의 아미노산 서열이 서열식별번호 58 또는 서열식별번호 62인 것인 항체.
  11. 청구항 8에 있어서, 인간 CEA에 특이적인 상기 제2 결합 도메인의 VL 영역의 아미노산 서열이 서열식별번호 64인 것인 항체.
  12. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, CEA에 특이적인 상기 제2 결합 도메인의 V 영역은:
    (a) 서열식별번호 60으로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VH 영역 및 서열식별번호 64로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VL 영역;
    (b) 서열식별번호 146으로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VH 영역 및 서열식별번호 64로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VL 영역;
    (c) 서열식별번호 58로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VH 영역 및 서열식별번호 64로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VL 영역;
    (d) 서열식별번호 62로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VH 영역 및 서열식별번호 64로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VL 영역; 및
    (e) 서열식별번호 56으로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VH 영역 및 서열식별번호 64로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 VL 영역
    으로 구성된 군에서 선택된 것인 항체.
  13. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 이중특이적 단일 사슬 항체는:
    (a) 서열식별번호 6, 8, 16, 18, 24, 26, 32, 34, 40, 42, 126, 130, 134 또는 143 중 임의의 것으로 도시된 아미노산 서열;
    (b) 서열식별번호 5, 7, 15, 17, 23, 25, 31, 33, 39, 41, 125, 129, 133 또는 142에 나타낸 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열;
    (c) 상기 (b)의 상보적인 핵산 서열에 엄격한 조건 하에서(under stringent condition) 하이브리드하는 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열;
    (d) 상기 (b)의 뉴클레오티드 서열에 대한 유전 코드의 결과로서 축퇴된(degenerate) 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열; 및
    (e) 상기 (a) 또는 상기 (b)의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일, 더 바람직하게는 적어도 90% 동일, 가장 바람직하게는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열
    로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  14. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 제1 또는 제2 결합 도메인의 적어도 하나는, 키메라, 인간화, CDR-그래프트, 및/또는 탈면역화되거나 또는 인간인 것인 항체.
  15. 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 이중특이적 단일 사슬 항체를 코딩하는 핵산 서열.
  16. 청구항 15에 기재된 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 벡터가 상기 핵산 서열에 작동적으로 연결된(operably linked) 조절 서열을 추가로 포함하는 것인 벡터.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 벡터가 발현 벡터인 것인 벡터.
  19. 청구항 15에 기재된 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된(transformed) 또는 트랜스펙트된(transfected) 숙주 세포.
  20. 청구항 15에 기재된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 또는 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물로서, 담체(carrier), 안정화제(stabilizer) 및/또는 부형제(excipient)의 적절한 제형을 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  21. 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 이중특이적 단일 사슬 항체를 포함하는 약학적 조성물로서, 담체, 안정화제 및/또는 부형제의 적절한 제형을 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  22. 청구항 21에 있어서, 면역 작동 세포(immune effector cell)에 대한 활성화 신호를 제공할 수 있는 단백질성 화합물을 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  23. 이중특이적 단일 사슬 항체의 제조 방법으로서, 상기 방법이
    상기 이중특이적 단일 사슬 항체의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 청구항 19에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 배양으로부터 생성된 이중특이적 단일 사슬 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는 것인, 이중특이적 단일 사슬 항체의 제조 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 회수된 이중특이적 단일 사슬 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제조하기 위하여, 회수된 이중특이적 단일 사슬 항체를 담체, 안정화제 및/또는 부형제의 적절한 제형과 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 이중특이적 단일 사슬 항체의 제조 방법.
  25. 이중특이적 단일 사슬 항체를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법으로서, 상기 방법이
    상기 항체의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 청구항 19에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계,
    상기 배양으로부터 생성된 항체를 회수하는 단계, 및
    약학적 조성물을 제조하기 위하여, 상기 항체를 적절한 약학적 담체와 함께 제형화하는 단계
    를 포함하는 것인 약학적 조성물의 제조 방법.
  26. 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 이중특이적 단일 사슬 항체를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법으로서, 상기 방법이 약학적 조성물을 제조하기 위하여, 상기 항체를 적절한 약학적 담체와 함께 제형화하는 단계를 포함하는 것인 약학적 조성물의 제조 방법.
  27. 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 이중특이적 단일 사슬 항체를 포함하는, 상피 종양의 예방, 치료 또는 개선을 위한 약학적 조성물.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 상피 종양은 위장관 선암종, 유방 선암종 또는 폐 선암종인 것인 약학적 조성물.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 위장관 선암종은 결장직장, 췌장, 식도 또는 위 선암종인 것인 약학적 조성물.
  30. 청구항 27에 있어서, 상기 약학적 조성물이 진행성 종양, 말기 종양, 높은 종양 로드/부하를 가진 종양 환자, 전이 종양, 또는 100 ng/ml보다 높은 CEA 혈청 농도를 가진 종양 환자의 치료용인 것인 약학적 조성물.
  31. 청구항 27에 있어서, 상기 약학적 조성물이 추가의 약물과 조합된 투여를 위한 것인 약학적 조성물.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 약물이 비-단백질성 화합물 또는 단백질성 화합물인 것인 약학적 조성물.
  33. 청구항 32에 있어서, 면역 작동 세포에 대한 활성화 신호를 제공할 수 있는 단백질성 화합물의 투여를 포함하는 약학적 조성물.
  34. 청구항 32에 있어서, 상기 단백질성 화합물 또는 비-단백질성 화합물은, 상기 이중특이적 단일 사슬 항체와 동시 또는 비-동시 투여를 위한 것인 약학적 조성물.
  35. 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 이중특이적 단일 사슬 항체, 상기 이중특이적 단일 사슬 항체를 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터, 또는 상기 핵산 서열 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 키트.
  36. 청구항 30에 있어서, 상기 CEA 혈청 농도는 ELISA에 의해 측정되는 것인 약학적 조성물.
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