JP2009520734A - 可溶性ceaに対する抵抗性を有する医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
その間、CEA遺伝子ファミリーに関連する28のその他の遺伝子/偽遺伝子が見出された。CEA遺伝子ファミリーのメンバーに用いる命名を簡略化するために、該ファミリーは最近「CEA関連細胞接着分子」(CEACAM)と改名され、そのメンバーの命名が統一された(Beauchemin, Exp. Cell Res. 252 (1999), 243-249)。例えば、この命名に従って、ヒトCEA(CD66e)はCEACAM5と名付けられる。
(a)ヒトCD3と特異的に結合する第1の結合ドメイン、および
(b)ヒトCEAと特異的に結合する第2の結合ドメイン
を有する二重特異性一本鎖抗体を含み、
前記第2の結合ドメインが少なくともアミノ酸配列「DX1X2X3X4FYFDY」(配列番号65)を含み、「X1」、「X2」、「X3」または「X4」は、任意のアミノ酸残基を表し、該アミノ酸残基「D」はマウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabat位置95に相当し、該アミノ酸残基「FYFDY」は、マウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabatの位置100、100a、100b、101、および102にそれぞれ相当する。一実施形態では、「X1」は、「R」(アルギニン)、「F」(フェニルアラニン)、「M」(メチオニン)、「E」(グルタミン酸)、または「T」(トレオニン)を表し;「X2」は、「G」(グリシン)、「Y」(チロシン)、「A」(アラニン)、「D」(アスパラギン酸)、または「S」(セリン)を表し;「X3」は、「L」(ロイシン)、「F」(フェニルアラニン)、「M」(メチオニン)、「E」(グルタミン酸)、または「T」(トレオニン)を表し;かつ、「X4」は、「R」(アルギニン)、「Y」(チロシン)、「A」(アラニン)、「D」(アスパラギン酸)、または「S」(セリン)を表す。
(a)配列番号60に示されるアミノ酸配列からなるVH領域および配列番号64に示されるアミノ酸配列からなるVL領域;
(b)配列番号146に示されるアミノ酸配列からなるVH領域および配列番号64に示されるアミノ酸配列からなるVL領域;
(c)配列番号58に示されるアミノ酸配列からなるVH領域および配列番号64に示されるアミノ酸配列からなるVL領域;
(d)配列番号62に示されるアミノ酸配列からなるVH領域および配列番号64に示されるアミノ酸配列からなるVL領域;ならびに
(e)配列番号56に示されるアミノ酸配列からなるVH領域および配列番号64に示されるアミノ酸配列からなるVL領域
からなる群より選択される。
(a)配列番号6、8、16、18、24、26、32、34、40、42、126、130、134または143のいずれかに表されるアミノ酸配列;
(b)配列番号5、7、15、17、23、25、31、33、39、41、125、129、133または142に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列;
(c)ストリンジェントな条件下で(b)の相補的な核酸配列とハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列;
(d)(b)の核酸配列に対する遺伝暗号の結果として縮重した核酸配列によりコードされるアミノ酸配列;ならびに
(e)(a)または(b)のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、より好ましくは少なくとも90%同一、最も好ましくは少なくとも95%同一であるアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
(a)配列番号6、8、16、18、24、26、32、34、40、42、126、130、134または143のいずれか1つに表されるアミノ酸配列;
(b)配列番号5、7、15、17、23、25、31、33、39、41、125、129、133または142に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列;
(c)ストリンジェントな条件下で(b)の相補的な核酸配列とハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列;
(d)(b)の核酸配列に対する遺伝暗号の結果として縮重した核酸配列によりコードされるアミノ酸配列;および
(e)(a)または(b)のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、より好ましくは少なくとも90%同一、最も好ましくは少なくとも95%同一であるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、二重特異性一本鎖抗体に関する。
CEA陽性KatoIII細胞(ヒト胃癌腫細胞株;ATCC HTB−103)を用いて全RNAを得、それをキットマニュアルの説明書(Qiagen、RNeasy Mini Kit)に従って単離した。得られたRNAを、ランダムに開始される逆転写によるcDNA合成に用いた。CEA抗原の全長配列のクローニングのため、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。5’CEACAM5 EcoRI GAATTCGCCACCATGGAGTCTCCCTCGGCCCC(配列番号74)および3’CEACAM5 Sal I GTCGACCTATATCAGAGCAACCCC(配列番号75)。PCR(第1サイクルに関して、93℃にて5分間の変性、58℃にて1分間のアニーリング、72℃にて1分間の伸張;93℃にて1分間の変性、58℃にて1分間のアニーリング、72℃にて1分間の伸張を30サイクル;72℃にて5分間の末端伸張)を用いてコード配列を増幅した。その後、PCR産物をEcoRIおよびSalIで消化し、適切に消化した発現ベクターpEF−DHFRに連結し、大腸菌に形質転換した。単離したプラスミドDNAを配列決定し、確立されたCEACAM5の核酸配列(米国国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for biotechnology information)のNM_004363、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)と比較した。標準的なプロトコールに従って、上述の手順を実行した(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (1989;2001)。確認された核酸配列を含むクローンを、構築物の真核生物における発現のためにDHFR欠損CHO細胞にトランスフェクトした。DHFR欠損CHO細胞における真核生物タンパク質発現を、Kaufmannに記載のとおり行った(Kaufmann R.J., Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566)。構築物の遺伝子増幅を、最大20nM MTXの終濃度までの、漸増濃度のMTXにより誘導した。次に、トランスフェクトした細胞を、FACSアッセイを用いてCEA抗原の発現について試験した。その目的のため、2.5×105のトランスフェクト細胞を、濃度5μg/mlのマウスモノクローナル抗体COL−1(No.MS−613−P1ABX,Neomakers;Fremont,CA,USA)とともにインキュベートした。50μl PBS中2% FCS(Dianova,Hamburg,Germanyより入手)を用いて1:100で希釈した、R−フィコエリトリン結合アフィニティー精製F(ab’)2断片、ヤギ抗マウスIgG、Fc−γ断片特異的抗体を用いて、抗体の結合を検出した。細胞を、FACS−Calibur(Becton Dickinson,Heidelberg)でフローサイトメトリーにより分析した。FACS染色および蛍光強度の測定を、Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 2002)に記載のとおり行った。結果として、形質転換体は、ヒトCEA抗原について明らかな陽性染色を実証した。
一般に、それぞれヒトCEA抗原に対して結合特異性を有するドメインを含む二重特異性一本鎖抗体分子、ならびに配列番号77に示されるヒトCD3抗原に対して結合特異性を持つ脱免疫化されたドメインを、表1に提示されるように設計した。このCD3結合ドメイン中のV領域の配置は常にVH−VLである。本明細書において定義される二重特異性一本鎖抗体において用いられる、この脱免疫化された抗CD3結合ドメインは、例えば、WO 2005/040220号において既に記載されている。
5’CEAI LH:5'AGGTGTACACTCCGACATTGAGCTCACCCAG3’(配列番号137)
3’CEAI VLリンカー:5'GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCTTTGATCTCGAGCTTGG3'(配列番号138)
5’CEAI VHリンカー:5'GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTCAGGTCCAACTGCAGGAG3'(配列番号139)
3’CEAI LH:5’AATCCGGAGGAGACGGTGACCG3'(配列番号140)
二重特異性一本鎖抗体をチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞で発現させた。DHFR欠損CHO細胞における真核生物タンパク質発現を、Kaufmann(前掲)に記載のとおり行った。構築物の遺伝子増幅は漸増濃度のMTXにより20nM MTXまでの終濃度まで誘導した。静置培養の二代継代後、細胞をCHO改変DMEM培地(HiQ(登録商標)、HiClone)を含むローラーボトル中で7日間増殖させた後、回収した。細胞を遠心分離により取り除き、発現タンパク質を含有する上清を−20℃で保存した。
段階1:6カラム容積中バッファーB2 20%;
段階2:6カラム容積中バッファーB2 100%。
膜結合ヒトCEAおよびヒトCD3との結合能に関して構築物の官能性を試験するため、FACS分析を行った。本目的のため、ヒトCEAトランスフェクトCHO細胞とCD3陽性ヒトT細胞白血病細胞株HPB−AII(DSMZ,Braunschweig,ACC483)を使用した。200,000個のCEA陽性CHO細胞または200,000個のHPB−AII細胞を、氷上で30分間、異なる配置のCEAおよびCD3のVHおよびVL領域(上記の通り)を含む二重特異性抗体をそれぞれ発現しているCHO細胞培養の純粋な細胞上清50μlとともにインキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄し、構築物の結合を、構築物のC末端のヒスチジンタグを介して細胞と結合した構築物と特異的に結合する、標識されていないマウスPenta His抗体(2% FCSを含む50μl PBSに1:20で希釈;Qiagen)を用いて検出した。洗浄段階の後に、結合していないマウスPenta His抗体を取り除いた。結合した抗His抗体を、フィコエリトリンと複合体化し、2% FCSを含む50μl PBSに1:100で希釈されたFcγ特異的抗体(Dianova)を用いて検出した。ヒトCEAとの結合の陽性対照として、モノクローナル抗体Col−1(実施例3参照)を用いた。ヒトCD3との結合の対照には、WO 99/054440号に記載のCD19xCD3二重特異性一本鎖構築物を使用した。陰性対照として、培養上清の代わりに新鮮な培地を用いた。
可溶性ヒトCEAに対する特異性を決定するため、様々なCEAxCD3二重特異性一本鎖抗体をELISAで試験した。
作製したCEAxCD3二重特異性一本鎖抗体の生物活性を、標的細胞としてヒト胃癌細胞株KatoIIIまたはヒトCEAトランスフェクトCHO細胞、およびエフェクター細胞として刺激を受けたヒトCD8陽性T細胞または未変性のPBMCをそれぞれ用いるインビトロクロム放出細胞障害性アッセイにより分析した。
ペトリ皿(直径145mm、greiner bio−one)を抗CD3抗体(OKT3 Janssen−Cilag GmbH,Orthoclone1mg/ml;終濃度1μg/ml)および抗CD28抗体(BD、1mg/ml;終濃度1μg/ml)で37℃にて1時間プレコートした。インキュベーション時間の後、結合しなかったタンパク質をPBSでの1回の洗浄段階により除去した。新鮮なPBMCを、標準的なプロトコールに従ってフィコール勾配遠心分離により末梢血(30〜50ml)から単離した。3〜5×107PBMCを、150ml RPMI1640/10% FCS/IL−2 20U/ml(Proleukin,Chiron)中のプレコートしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄し、大きなTフラスコに移した。IL−2を20U/mlの終濃度に添加し、再び1日間培養した。マニュアルの指示に従ってCD8陰性単離キット(Dynal Biotech)を使用してCD8+CTLを単離した。未変性のPBMCは、フィコール勾配遠心分離の後に刺激手順を踏まずに直接用いた。標的細胞をPBSで2回洗浄し、50%FCSを含む最終容量100μlのRPMI中で37℃にて45分間、11.1MBq51Crで標識した。その後、標識した標的細胞を5mlのRPMIで3回洗浄し、次に細胞障害性アッセイで使用した。アッセイは、E:T比が10:1(1ウェルあたり5000個の標的細胞および50000個のエフェクター細胞に相当)のRPMI(上記の通り)を補給した96丸底プレートにおいて総量250μlで行った。構築物の評価のため、アッセイ容量中出発濃度1μg/mlの二重特異性一本鎖分子および12個のその三倍希釈液を用いた。アッセイ時間は18時間であり、細胞障害性は、最大溶解(Triton−Xの添加)および自発的溶解(エフェクター細胞なし)の差に関連した、上清中に放出されたクロムの相対値として測定された。全ての測定は三つ組みで行われた。上清中のクロム活性の測定は、Wizard3ガンマカウンター(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,Koln,Germany)で行った。実験データの分析は、Prism4 for Windows(登録商標)(バージョン4.02、GraphPad Software Inc.,San Diego,California,USA)を用いて行った。シグモイド型用量応答曲線は、一般に、ソフトウェアで測定してR2値が>0.90である。分析プログラムにより計算されるEC50値を生物活性の比較に用いた。
競合アッセイを、次の例外:CEAxCD3二重特異性一本鎖抗体の生物活性を様々な濃度の可溶性ヒトCEA抗原の存在下で試験する、を除いて実施例4に記載のとおり行う。使用した可溶性ヒトCEA抗原(AbCAM Ltd.Cambridge UK)を単独の患者の肝臓からの転移性結腸癌から単離した。細胞を添加する前に、所定量の二重特異性一本鎖抗体を漸増量の可溶性ヒトCEA抗原(0μg/ml;0.1μg/ml;1μg/ml、または0μg/ml;0.004μg/ml;0.02μg/ml;0.1μg/ml;0.5μg/ml;1μg/mlのいずれか)で37℃にて30分間プレインキュベーションすることにより実験的に競合アッセイを行った。残りのアッセイは、実施例4に記載されるとおり行った。これらの競合実験の結果を図5〜11に示す。
癌患者に投与される際に免疫原性の低下した医薬組成物を提供するため、可溶性CEA抗原に対する抵抗性を有するヒト二重特異性一本鎖抗体を作製した。第1段階で、可溶性CEAに対する抵抗性を有するヒトVL領域が単離された。従って、この実験の目的は、モノクローナル抗体(mAb)A5B7の母親由来のマウスVHと対となり得るヒトVL領域の選択である。
ファージライブラリー選択のため、可溶性CEA抗原をビオチン化した。ビオチン化は、5% DMSO(Sigma)を含有するPBS中で、サンプルミキサー(Dynal)中で室温にて1時間15倍モル過剰のEZ−Link Sulfo NHS−LC−LC−ビオチン(Pierce)を用いて達成した。遊離ビオチンとビオチン化CEA抗原の分離のため、標準的なプロトコールに従って、アッセイをPBSに対して過剰に透析した。ビオチン標識したCEAの保持された生物活性をELISA結合アッセイで確認した。
100mLの血液を5名の健康なヒトドナーから採取した。末梢血単核細胞(PBMC)を標準的な方法に従ってフィコール勾配により単離した。RNeasy(登録商標)Midi Kit(QIAGEN)を製造業者の説明書に従って用いて、全RNAを単離細胞から単離した。標準的な方法に従ってcDNAを合成した(Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 2001)。
軽鎖V領域DNAの単離のため、RT−PCRを、V−κ−(5’−hu−VK1−SacI−2001(5’−GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CCAGATGACC CAGTCTCC−3’)(配列番号78)、5’−hu−VK2/4−SacI−2001(5’−GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATGACY CAGTCTCC−3’)(配列番号79)、5’−hu−VK3−SacI−2001(5’−GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGWTGACR CAGTCTCC−3’)(配列番号80)、5’−hu−VK5−SacI−2001(5’−GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CACACTCACG CAGTCTCC−3’)(配列番号81)、5’−hu−VK6−SacI−2001(5’−GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGCTGACT CAGTCTCC−3’)(配列番号82)、3’−hu−Vk−J1−SpeI−BsiWI(5’−GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATTTCCACC TTGGTCC−3’)(配列番号83)、3’−hu−Vk−J2/4−SpeI−BsiWI(5’−GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATCTCCASC TTGGTCC−3’)(配列番号84)、3’−hu−Vk−J3−SpeI−BsiWI(5’−GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATATCCACT TTGGTCC−3’)(配列番号85)、3’−hu−Vk−J5−SpeI−BsiWI(5’−GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT AATCTCCAGT CGTGTCC−3’)(配列番号86))およびVλ(5’−huVL1a−SacI−2001(GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG TTG ACG CAG CCG CCC TC)(配列番号87)、5’−huVL1b−SacI−2001(GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG CTG ACT CAG CCA CCC TC)(配列番号88)、5’−huVL2−SacI−2001(GAG CCG CAG GAG CCC GAG CTC GCC CTG ACT CAG CCT SCC TCC GT)(配列番号89)、5’−huVL4−SacI−2001(ACC TGC GAG CTC GTG CTG ACT CAR YCM YCC TCT GC)(配列番号90)、5’−huVL5−SacI−2001(ACC TGC GAG CTC GTG CTG ACT CAG CCR SCT TCC)(配列番号91)、5’−huVL6−SacI−2001(ACC TGC GAG CTC ATG CTG ACT CAG CCC CAC TC)(配列番号92)、5’−huVL3/9−SacI−2001(GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GWG CTG ACT CAG CCA CCY TC)(配列番号93)、5’−huVL7/8−SacI−2001(GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG GTG ACY CAG GAG CCM TC)(配列番号94)、3’−hu−Vlam−BlnI−SpeI−2001(CGT GGG ACT AGT CTT GGG CTG ACC TAG GAC GGT)(配列番号95)、3’−hu−Vlam2−BlnI−SpeI−2002:CGT GGG ACT AGT CTT GGG CTG ACC GAG GAC GGT)(配列番号96)プライマーセットを用いて行った。
ファージディスプレイライブラリーは、概して、例えば「Phage Display: A Laboratory Manual」; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に開示されるような標準的な手順に基づいて構築された。
κ1:2×108
κ2:6×107
λ1:9×107
λ2:6×107
の独立したクローンからなるライブラリーサイズを得た。
PCRを行ってmAb A5B7の母親由来のVHを前記母親由来のVHを含有するベクターから増幅した。増幅のために、5’−プライマー5’−AVH−Xho I(5’−GTC ACA CTC GAG TCA GGA GGA GGC TTG GTA C−3’)(配列番号97)および3’−プライマー3’−AVH−BstEII(5’−GTC ACA GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G−3’(配列番号98)を用いて標準的手順に従うPCRプロトコールに従った。分析用アガロースゲルからの約350bp増幅産物の精製後、DNA断片を制限酵素BstEIIおよびXho Iで切り出した。ファージミドpComb3H5BHis(このベクターはRalf Lutterbuese博士の論文に記載されている。)をしかるべく消化させ、大きな断片を上述の断片と連結させた。大腸菌XL1 blueへの形質転換後、単一のクローンを100mL SB培地(50μg/ml カルベニシリン含有)で培養し、プラスミドを標準的なプロトコールに従って調製した。挿入物を配列決定することにより首尾よいクローニングを確認した(Sequiserve,Munich)。
scFv−レパートリーを有するファージ粒子をPEG8000/NaCl沈殿および遠心分離により培養上清から回収した。次に、約1×1011〜1×1012scFvファージ粒子を0.5mLのTBS/1% BSAに再懸濁し、ストレプトアビジンコートされたELISAプレート(Nunc)のウェル中で1時間固定されたビオチン化可溶性CEAとともにインキュベートした。抗原10μg/mlのPBS溶液(50μl)をストレプトアビジンコートされたウェル中で4℃にて一晩インキュベートし、水で1回洗浄し、それに続いてTBS中200μlの3% BSAで37℃にて1時間ブロッキングし、それをインキュベーション後に取り除いた。
以下の実験の目的は、実施例6に記載されるように選択される、scFv A−240のヒトVL領域と対となる可溶性CEA抗原に対して抵抗性のある一連のヒトVH領域の選択である。前記ヒトVL領域は、配列番号63(核酸配列)および配列番号64(アミノ酸配列)に示される。
100mLの血液を5名の健康なヒトドナーから採取した。末梢血単核細胞(PBMC)を、標準的な方法に従ってフィコール勾配により単離した。全RNAを、RNeasy(登録商標)Midi Kit(QIAGEN)を製造業者の説明書に従って用いてPBMCから単離した。cDNAを標準的な方法に従って合成した(Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 2001)。
VHライブラリーを構築し、Lib 134−VHと名付けた。このVH−ライブラリーは、その後にヒトFR4生殖系列配列が続く母親由来の抗体のVHCDR3と作動可能なように連結された、PCR増幅された上記のPBMCプールのVH領域由来のFR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3のヒトレパートリーで構成される。
a)5’−huVH1,3,5−Xho I−2001 × 3’−A134−VH1A
b)5’−huVH1,3,5−Xho I−2001 × 3’−A134−VH1B
c)5’−huVH1,3,5−Xho I−2001 × 3’−A134−VH3A
d)5’−huVH1,3,5−Xho I−2001 × 3’−A134−VH3B
e)5’−huVH4−Xho I−2001 × 3’−A134−VH4
f)5’−huVH4B−Xho I−2001 × 3’−A134−VH4
94℃にて15秒間の変性、52℃にて50秒間のプライマーアニーリングおよび72℃にて60秒間のプライマー伸張を40サイクル以上行い、それに続いて72℃にて10分間の最終伸張、を増幅に用いた。DNA V断片を標準的なプロトコールに従って単離した。
前述の方法の第2ラウンドでは、1回目の前の選択(実施例6参照)で同定されたscFv A−240のヒトVLを選択し、それに続いてヒトscFvを作製する目的でヒトVH断片のライブラリーと合成した。ファージディスプレイライブラリーは、概して、例えば「Phage Display: A Laboratory Manual」;Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に開示されるような標準的な手順に基づいて構築された。
a:b:c:d:e:f=3:1:3:1:1:1、ここでa〜fは次の意味:
a)5’−huVH1,3,5−Xho I−2001 × 3’−A134−VH1A
b)5’−huVH1,3,5−Xho I−2001 × 3’−A134−VH1B
c)5’−huVH1,3,5−Xho I−2001 × 3’−A134−VH3A
d)5’−huVH1,3,5−Xho I−2001 × 3’−A134−VH3B
e)5’−huVH4−Xho I−2001 × 3’−A134−VH4
f)5’−huVH4B−Xho I−2001 × 3’−A134−VH4
を有する。
ヒトscFv−レパートリーを有するファージ粒子をPEG8000/NaCl沈殿および遠心分離により培養上清から回収した。次に、約1×1011〜1×1012scFvファージ粒子を0.5mLのTBS/1% BSAに再懸濁し、ストレプトアビジンコートされたELISAプレート(Nunc)のウェル中で1時間固定されたビオチン化可溶性CEAとともにインキュベートした。抗原10μg/mlのPBS溶液(50μl)をストレプトアビジンコートされたウェル中で4℃にて一晩インキュベートし、水で1回洗浄し、それに続いてTBS中200μlの3% BSAで37℃にて1時間ブロッキングし、それをインキュベーション後に取り除いた。
1.配置
次の段階では、ヒト二重特異性一本鎖抗体分子の様々なドメイン配置が作製された。これらの分子はヒト抗CEA結合ドメイン(その作製は上記実施例7に記載されている)を含み、配列番号77VHVLに示されるヒトCD3抗原に対して特異性を有する脱免疫化結合ドメインは表1に示されるように設計された;上記実施例2も参照。本明細書に記載されるヒト抗CEA結合ドメインを含む二重特異性一本鎖抗体構築物はELISAプレート上に固定化された可溶性CEA抗原で4ラウンドのファージディスプレイ選択後に単離されているので、それらはすべて(明白に)可溶性ヒトCEA抗原と結合する。
(a)N末端に位置するヒト抗CEA部分:
(i)VH−VL配向の抗CEA:
A5VH−A240VLx配列番号77VHVL(配列番号24)、
A5VH−A240VL#x配列番号77VHVL(配列番号126)、
B9VH−A240VLx配列番号77VHVL(配列番号32)、
B9VH−A240VL#x配列番号77VHVL(配列番号130)、
D8VH−A240VLx配列番号77VHVL(配列番号40)
D8VH−A240VL#x配列番号77VHVL(配列番号134)、および
CEAI VH−A240VLx配列番号77VHVL(配列番号16)。
(ii)VL−VH配向の抗CEA:
A240VL−A5VHx配列番号77VHVL(配列番号26)、
A240VL−B9VHx配列番号77VHVL(配列番号34)、
A240VL−D8VHx配列番号77VHVL(配列番号42)、
およびA240VL−CEAI VHx配列番号77VHVL(配列番号18)。
(i)VH−VL配向の抗CEA:
配列番号77VHVLxA5VH−A240VL(配列番号30)、
配列番号77VHVLxA5VH−A240VL#(配列番号128)、
配列番号77VHVLxB9VH−A240VL(配列番号36)、
配列番号77VHVLxE12VH−A240VL(配列番号143)、
配列番号77VHVLxB9VH−A240VL#(配列番号132)、配列番号77VHVLxD8VH−A240VL(配列番号44)、
配列番号77VHVLxD8VH−A240VL#(配列番号136)、
および配列番号77VHVLxCEAI VH−A240VL(配列番号20)。
(ii)VL−VH配向の抗CEA:
配列番号77VHVLxA240VL−A5VH(配列番号28)、
配列番号77VHVLxA240VL−B9VH(配列番号38)、
配列番号77VHVLxA240VL−D8VH(配列番号46)、および
配列番号77VHVLxA240VL−CEAI VH(配列番号22)。
これらのヒトCEAxCD3二重特異性一本鎖抗体の発現、精製およびフローサイトメトリー分析は、上記実施例2に記載される方法により実行された。
図14に例示されるように、ヒト二重特異性一本鎖抗体構築物A5VH−A240VLx配列番号77VHVL(配列番号24)、B9VH−A240VLx配列番号77VHVL(配列番号32)、D8VH−A240VLx配列番号77VHVL(配列番号40)およびCEAI VH−A240VLx配列番号77VHVL(配列番号16)は、CEA陽性ヒトKatoIII細胞と結合し、かつCD3陽性HPB−ALL細胞と結合する。
CHO−CEA+標的細胞に対する細胞障害活性を、ヒト二重特異性一本鎖抗体の次のドメイン配置について実証した。
可溶性ヒトCEA抗原の存在下、ヒト二重特異性一本鎖抗体についての競合アッセイを上記実施例5に示すように行った。図19および20は、構築物A5VH−A240VLx配列番号77VHVL(配列番号24)、B9VH−A240VLx配列番号77VHVL(配列番号32)、D8VH−A240VLx配列番号77VHVL(配列番号40)およびCEAI VH−A240VLx配列番号77VHVL(配列番号16)に例示されるように、ヒト構築物についても、細胞障害活性の可溶性CEA抗原に対する抵抗性を実証する;マウス由来二重特異性一本鎖抗体の可溶性CEAに対する抵抗性については、実施例5参照。さらに、図22は、CEA反応性の二重特異性一本鎖構築物A240VL−B9VHx配列番号77VHVL(配列番号34)が、漸増量の可溶性CEA抗原の存在下でT細胞を再指向してCHO−CEA+細胞を溶解させたことを示す。この実験は、A240VL−B9VHx配列番号77VHVLに媒介される細胞障害活性も可溶性CEAに対して抵抗性であることを実証する。最後に、図27から導かれるように、二重特異性一本鎖構築物である配列番号77VHVLxE12VH−A240VL(配列番号143)に媒介される細胞障害活性は、可溶性CEAに対して抵抗性である。
精製されたA240VL−B9VHx配列番号77VHVL(配列番号34)構築物の同質性をさらに特性決定するため、単離モノマー画分を高分解能陽イオン交換クロマトグラフィーに付した。クロマトグラフィーは、20mM MESバッファーpH5.5で平衡化したMiniSカラム(Mini S PE 4.6/50 CatX 0.8ml;GE Healthcare 17−5005−01)で行われた。カラムに充填する前にサンプルを同じバッファーで1:3希釈した。結合したタンパク質を、60カラム量中に1M NaClを0〜30%含有する平衡バッファー勾配を用いて溶出させた。残りのタンパク質を3カラム量の1M NaClで溶出した。結果として得られるクロマトグラムは図23に示され、単一の主ピークを有する同質のタンパク質画分を提示する。
A240VL−B9VHx配列番号77VHVL(配列番号34)構築物の血漿安定性を、様々なインキュベーション条件下で、続いて実施例4に記載の標準的な51クロム放出に基づく細胞障害性アッセイにより試験した。
この実験は、配列番号77VHVLxE12VH−A240VL(配列番号143)を分析することを除いて実施例9と同様に行った。結果として得られるクロマトグラムは図25に示され、単一の主ピークを有する同質のタンパク質画分を提示する。
この実験は、配列番号77VHVLxE12VH−A240VL(配列番号143)を分析することを除いて実施例10と同様に行った。図26に示されるように、CEA反応性の二重特異性一本鎖構築物である配列番号77VHVLxE12VH−A240VL(配列番号143)は極めて安定性であることが実証された;37℃にて24時間ヒト血漿中でのインキュベーションの後、細胞障害活性の損失は検出することができなかった。
Claims (41)
- ヒトにおける上皮性腫瘍の治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、
(a)ヒトCD3と特異的に結合する第1の結合ドメイン、および
(b)ヒトCEAと特異的に結合する第2の結合ドメインを有する二重特異性一本鎖抗体を含み、
前記第2の結合ドメインが少なくともアミノ酸配列「DX1X2X3X4FYFDY」(配列番号65)を含み、「X1」、「X2」、「X3」または「X4」は任意のアミノ酸残基を表し、アミノ酸残基「D」はマウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabat位置95に相当し、アミノ酸残基「FYFDY」は、マウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabatの位置100、100a、100b、101、および102にそれぞれ相当する、医薬組成物。 - 「X1」が、「R」(アルギニン)、「F」(フェニルアラニン)、「M」(メチオニン)、「E」(グルタミン酸)、または「T」(トレオニン)を表し;
「X2」が、「G」(グリシン)、「Y」(チロシン)、「A」(アラニン)、「D」(アスパラギン酸)、または「S」(セリン)を表し;
「X3」が、「L」(ロイシン)、「F」(フェニルアラニン)、「M」(メチオニン)、「E」(グルタミン酸)、または「T」(トレオニン)を表し;かつ
「X4」が、「R」(アルギニン)、「Y」(チロシン)、「A」(アラニン)、「D」(アスパラギン酸)、または「S」(セリン)を表す、
請求項1に記載の医薬組成物。 - ヒトCEAに特異的な前記第2の結合ドメインが、マウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabatの位置95〜102に相当するアミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号66)を少なくとも含む、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- CD3に特異的な前記第1の結合ドメインがC末端に位置している、請求項1から3のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記結合ドメインが、VHCEA−VLCEA−VHCD3−VLCD3またはVLCEA−VHCEA−VHCD3−VLCD3の順序で配置されている、請求項1から4のいずれかに記載の医薬組成物。
- ヒトCEAに特異的な前記第2の結合ドメインが、アミノ酸配列「SYWMH」(配列番号68)を有するCDR−H1および/またはアミノ酸配列「FIRNKANGGTTEYAASVKG」(配列番号67)もしくは「FILNKANGGTTEYAASVKG」(配列番号145)を有するCDR−H2を含む、請求項1から5のいずれかに記載の医薬組成物。
- ヒトCEAに特異的な前記第2の結合ドメインが、アミノ酸配列「TYAMH」(配列番号70)を有するCDR−H1および/またはアミノ酸配列「LISNDGSNKYYADSVKG」(配列番号69)を有するCDR−H2を含む、請求項1から5のいずれかに記載の医薬組成物。
- ヒトCEAに特異的な前記第2の結合ドメインが、アミノ酸配列「TLRRGINVGAYSIY」(配列番号73)を有するCDR−L1および/またはアミノ酸配列「YKSDSDKQQGS」(配列番号72)を有するCDR−L2および/またはアミノ酸配列「MIWHSGASAV」(配列番号71)を有するCDR−L3を含む、請求項1から7のいずれかに記載の医薬組成物。
- ヒトCEAに特異的な第2の結合ドメインのVH領域のアミノ酸配列が、配列番号60または146である、請求項6に記載の医薬組成物。
- ヒトCEAに特異的な第2の結合ドメインのVH領域のアミノ酸配列が配列番号58または配列番号62である、請求項7に記載の医薬組成物。
- ヒトCEAに特異的な第2の結合ドメインのVL領域のアミノ酸配列が、配列番号64である、請求項8に記載の医薬組成物。
- CEAに特異的な第2の結合ドメインのV領域が、以下、
(a)配列番号60に示されるアミノ酸配列からなるVH領域および配列番号64に示されるアミノ酸配列からなるVL領域;
(b)配列番号146に示されるアミノ酸配列からなるVH領域および配列番号64に示されるアミノ酸配列からなるVL領域;
(c)配列番号58に示されるアミノ酸配列からなるVH領域および配列番号64に示されるアミノ酸配列からなるVL領域;
(d)配列番号62に示されるアミノ酸配列からなるVH領域および配列番号64に示されるアミノ酸配列からなるVL領域;ならびに
(e)配列番号56に示されるアミノ酸配列からなるVH領域および配列番号64に示されるアミノ酸配列からなるVL領域
からなる群より選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 前記二重特異性一本鎖抗体が、
(a)配列番号6、8、16、18、24、26、32、34、40、42、126、130、134または143のいずれか1つに表されるアミノ酸配列;
(b)配列番号5、7、15、17、23、25、31、33、39、41、125、129、133または142に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列;
(c)ストリンジェントな条件下で(b)の相補的な核酸配列とハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列;
(d)(b)の核酸配列に対する遺伝暗号の結果として縮重した核酸配列によりコードされるアミノ酸配列;および
(e)(a)または(b)のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、より好ましくは少なくとも90%同一、最も好ましくは少なくとも95%同一であるアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 前記上皮性腫瘍が、胃腸腺癌、乳腺癌または肺腺癌である、請求項1〜13のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記胃腸腺癌が結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である、請求項14に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍量の多い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはCEA血清中濃度が100ng/mlより高い腫瘍患者の治療のためのものである、請求項1から15のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記第1または第2の結合ドメインの少なくとも1つが、キメラ、ヒト化、CDR移植、および/または脱免疫化またはヒトである、請求項1〜16のいずれかに記載の医薬組成物。
- 請求項1から17のいずれかに記載の二重特異性一本鎖抗体をコードする核酸配列を含む、医薬組成物。
- 請求項18に記載の核酸配列を含むベクターを含む、医薬組成物。
- 前記ベクターが、請求項18に記載の前記核酸配列と作動可能なように連結されている調節配列をさらに含む、請求項19に記載の医薬組成物。
- 前記ベクターが発現ベクターである、請求項19または20に記載の医薬組成物。
- 請求項18に記載の核酸または請求項19から21のいずれかに記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主を含む、医薬組成物。
- 免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供することのできるタンパク質性化合物をさらに含む、請求項1から22のいずれかに記載の医薬組成物。
- 請求項1から23のいずれかに記載の医薬組成物の製造のためのプロセスであって、前記プロセスが、請求項22に記載の宿主を請求項1から17のいずれかに記載の二重特異性一本鎖抗体の発現を可能にする条件下で培養する段階と、産生された二重特異性一本鎖抗体を培養物から回収する段階とを含む、プロセス。
- 担体、安定剤および/または賦形剤の適した製剤をさらに含む、請求項1から24のいずれかに記載の医薬組成物。
- 請求項1から17のいずれかに記載の二重特異性一本鎖抗体、請求項18に記載の核酸分子、請求項19から21のいずれかに記載のベクター、または請求項22に記載の宿主の、ヒトにおける上皮腫瘍の予防、治療または寛解のための医薬組成物の調製のための使用。
- 前記上皮腫瘍が、胃腸腺癌、乳腺腺癌または肺腺癌である、請求項26に記載の使用。
- 前記胃腸腺癌が、結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である、請求項27に記載の使用。
- 医薬組成物が、進行性腫瘍、後期腫瘍、高腫瘍量の腫瘍患者、転移性腫瘍、またはCEA血清濃度が100ng/mlよりも高い腫瘍患者の治療のための、請求項1から28のいずれかに記載の使用。
- 前記医薬組成物が、さらなる薬剤と組み合わせて投与されることに適している、請求項1から29のいずれかに記載の使用。
- 上皮性腫瘍の予防、治療または寛解を必要とする被験体における、上皮性腫瘍の予防、治療または寛解のための方法であって、前記方法が、請求項1から17のいずれか一項に記載の医薬組成物または請求項24に記載のプロセスに従って製造された医薬組成物の有効量を十分な時間をかけて投与する段階を含む、方法。
- 前記上皮性腫瘍が、胃腸腺癌、乳腺癌または肺腺癌である、請求項31に記載の方法。
- 前記胃腸腺癌が、結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である、請求項32に記載の方法。
- 医薬組成物が、進行性腫瘍、後期腫瘍、高腫瘍量の腫瘍患者、転移性腫瘍、またはCEA血清濃度が100ng/mlよりも高い腫瘍患者の治療のためのものである、請求項31から33のいずれかに記載の方法。
- 前記医薬組成物が、さらなる薬剤と組み合わせて投与される、請求項31から34のいずれかに記載の方法。
- 前記薬剤が、非タンパク質性化合物またはタンパク質性化合物である、請求項35に記載の方法。
- 免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供することのできるタンパク質性化合物の投与を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記タンパク質性化合物または非タンパク質性化合物が、請求項1から17のいずれかに記載の二重特異性一本鎖抗体、請求項18に記載の核酸分子、請求項19から21のいずれかに記載のベクター、または請求項22に記載の宿主と同時または非同時に投与される、請求項36または37に記載の方法。
- 前記被験体がヒトである、請求項31から38のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から17のいずれかに記載の二重特異性一本鎖抗体、請求項18に記載の核酸分子、請求項19から21のいずれかに記載のベクター、または請求項22に記載の宿主を含む、キット。
- 前記CEA血清中濃度がELISAにより測定される、請求項16に記載の医薬組成物、請求項29に記載の使用、または請求項34に記載の方法。
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