JP7195253B2

JP7195253B2 - Ｍｇ７、高グリコシル化ｃｅａに特異的に結合する一本鎖抗体並びに検出及び治療におけるその使用

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Publication number: JP7195253B2
Application number: JP2019526356A
Authority: JP
Inventors: ファン、ダイミン; ニエ、ヨンジャン; ウー、カイチュン; カオ、ユエチュオン; ユアン、ジジュン; イー、シュエジュン
Original assignee: ザフォースミリタリーメディカルユニバーシティ; シャンハイジーンケムカンパニー、リミテッド
Priority date: 2016-07-29
Filing date: 2017-07-27
Publication date: 2022-12-23
Anticipated expiration: 2037-07-27
Also published as: AU2017303944C1; AU2017303944B2; US20190167721A1; KR102460843B1; EP3492497B1; CN107663240A; US11266688B2; CN110072892B; KR20190034626A; CN110072892A; JP2019526275A; AU2017303944A1; EP3492497A1; WO2018019275A1; CN107663240B; EP3492497A4

Description

本発明は腫瘍の免疫療法の分野に関し、より具体的には、本発明はグリコシル化ＣＥＡ特異的一本鎖抗体、及びグリコシル化ＣＥＡを過剰発現する腫瘍に対するトランスジェニック改変養子Ｔリンパ球療法の分野に関する。

背景技術
胃癌の発生率は、中国の消化管悪性腫瘍で１位、世界で２位である。年間死亡者数は悪性腫瘍による死亡者数の約２４％を占め、５年生存率はわずか約２７％である。胃癌患者の診断は遅れることが多いので、予後は極めて悪い。胃癌に対する効果的な標的療法はない。ＣＥＡ（癌胎児性抗原）は膜結合タンパク質であり、一般に胎児の肝臓、腸及び膵臓において発現される。通常、それは腸に分泌され、その血清レベルは低い。細胞が癌性である場合、血清のレベルが上昇し、これは膵臓癌及び結腸癌の早期診断にとって補助的な意味を有し、腫瘍の進展、治療効果、再発及び予後についての一定の基準値を有する。第４軍医大学のＦａｎＤａｉｍｉｎｇ教授は、グリコシル化ＣＥＡは非常に感度が高く、様々な消化管癌に特異的であることを発見した。臨床研究は、胃癌の組織におけるグリコシル化ＣＥＡの陽性率が８０％を上回り、結腸癌の組織における陽性率が４０％を上回り、胃の前癌性病変における陽性率が３０％を上回り、食道癌の組織における陽性率が１８％以上であることを示してきた。同時に、臨床試験の結果は、胃癌患者２８人における血清グリコシル化ＣＥＡの陽性率が手術前と比較して有意に減少し、グリコシル化ＣＥＡと胃癌の間に密接な関係があることを示唆した（Ｇａｄｌｅｒｅｔａｌ．，ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ２５（１）：９１－４，１９８０）。

現在、標的養子細胞療法技術を用いた新たなキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）が、様々な悪性腫瘍の治療において重要な役割を果たしている。ＣＡＲ－Ｔは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）特異的認識ペプチド、例えば一本鎖抗体、特異的受容体と、ＣＤ３ゼータなどのＴ細胞活性化シグナルとの融合体で、融合タンパク質は、レンチウイルスなどによりＴ細胞の表面において特異的に発現し、修飾されたＴ細胞に腫瘍細胞を特異的に認識させて死滅させ、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）から独立し、ＭＨＣ欠失による腫瘍免疫回避を回避することを可能にする。

キメラ抗原受容体は、細胞外抗原標的化及び認識領域、ヒンジ領域、膜貫通領域、及び細胞内共刺激シグナル伝達領域を含む。抗原認識領域は、ほとんどが一本鎖抗体又は特異的受容体であり、それは改変したＴ細胞が標的細胞を特異的に認識し、標的細胞を特異的に死滅させるように活性化され得ることを確実にする。ヒンジ領域は一般にＣＤ８α、ＣＤ２８ＥＣＤ、ＩｇＧＦｃ断片などを採用し、それはＴ細胞が標的細胞と接触し、そしてＴ細胞の作用に影響を与えることを確実にする。また、細胞内シグナル領域は免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、例えばＣＤ３ゼータ及び共刺激シグナル、例えばＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０などを採用する（Ｓａｄｅｌａｉｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＤｉｓｃｏｖ３（４）：３８８－９８，２０１３）。

ＣＡＲ－Ｔは血液悪性腫瘍の治療において良好な適用価値を示しているが、ＣＡＲ－Ｔは固形腫瘍の治療において期待される結果を奏さないことが多い。いくつかの臨床試験でさえ、ＣＡＲ－Ｔはオフターゲットの効果により毒性を示すことがある。理由として重要なものは、固形腫瘍には効果的で特異的な標的が存在しない場合が多いということである。多くの腫瘍関連抗原では、正常組織でのある程度の発現が頻繁に見られる。例えばＨＥＲ２は悪性の神経膠腫や乳癌などの悪性腫瘍の重要な標的であるが、ＨＥＲ２が標的のＣＡＲ－Ｔ臨床試験において患者はＣＡＲ－Ｔ再注入後に肺不全を患い、「サイトカインストーム」が起こり、間もなく患者の死の原因となった。したがって、固形腫瘍において非常に特異的且つ高感度の標的を見出すことは、固形腫瘍におけるＣＡＲ－Ｔ治療の適用におけるキーポイントである（Ｍｏｒｇａｎｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ１８（４）：８４３－５１，２０１０）。

ＮＫ細胞はＣＤ１６及びＣＤ５６を発現するリンパ球であり、自然免疫において重要な成分である。ＮＫ細胞はＭＨＣ欠損標的細胞を死滅させることができる。Ｔ細胞との比較において、ＮＫ細胞はＴ細胞受容体を発現しないため移植片対宿主反応（ＧＶＨＤ）を受けない。ＮＫ細胞の活性化は、ＫＡＲ（キラー活性化受容体）及びＫＩＲ（キラー阻害受容体）に対するシグナルの平衡状態にある。インビボでの主なＫＩＲリガンドはＭＨＣである。ＫＩＲリガンドのミスマッチ又は欠失に対しては、それはＮＫ細胞の活性化を引き起こす。ＣＡＲ－ＮＫ技術は、癌の治療のために、ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株（ＮＫ９２など）の表面におけるＣＡＲ構造の発現を使用する新しい技術であり、その利点はＮＫ細胞がＩＬ６を分泌しないこと、ＮＫ細胞が末梢血で非常に短い循環的な半減期を有すること、ＮＫ細胞が高いトランスフェクション効率（非ウイルスベクター）を有していること、及びＮＫ細胞株がＧＭＰレベルで大規模に培養できることである。ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株の表面でＣＡＲ構造が発現すると、ＮＫ細胞にターゲティング能力を付与することができる。同時に、ＣＡＲ－ＮＫ同種移植片において、ＫＩＲ受容体のミスマッチは、ＮＫ細胞の活性化を増強して、より良好な腫瘍の排除を達成し得る。インビボでのＮＫ細胞株の循環時間は非常に短いため、安全性を考慮する必要がある（Ｈａｎｅｔａｌ．，ＳｃｉＲｅｐ５：１１４８３，２０１５）。

発明の要約
第１の側面では、本発明は、ｉ）グリコシル化ＣＥＡを標的とする抗原結合ドメイン、
ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び
ｉｉｉ）共刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、
グリコシル化ＣＥＡを標的とする抗原結合ドメインが重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、以下の、
ａ．重鎖可変領域が、以下に記載される、配列番号１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２に示されるＣＤＲ－Ｈ２、又は配列番号３に示されるＣＤＲ－Ｈ３の１つ以上のＣＤＲを含み、軽鎖可変領域が、以下に記載される、配列番号４に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５に示されるＣＤＲ－Ｌ２、又は配列番号６に示されるＣＤＲ－Ｌ３の１つ以上のＣＤＲを含むということ、
ｂ．重鎖可変領域が、以下に記載される、配列番号７に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８に示されるＣＤＲ－Ｈ２、又は配列番号９に示されるＣＤＲ－Ｈ３の１つ以上のＣＤＲを含み、軽鎖可変領域が、以下に記載される、配列番号１０に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１に示されるＣＤＲ－Ｌ２、又は配列番号１２に示されるＣＤＲ－Ｌ３の１つ以上のＣＤＲを含むということ、
ｃ．重鎖可変領域が、以下に記載される、配列番号１３に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、又は配列番号１５に示されるＣＤＲ－Ｈ３の１つ以上のＣＤＲを含み、軽鎖可変領域が、以下に記載される、配列番号１６に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７に示されるＣＤＲ－Ｌ２、又は配列番号１８に示されるＣＤＲ－Ｌ３の１つ以上のＣＤＲを含むということ、
ｄ．重鎖可変領域が、以下に記載される、配列番号１９に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２０に示されるＣＤＲ－Ｈ２、又は配列番号２１に示されるＣＤＲ－Ｈ３の１つ以上のＣＤＲを含み、軽鎖可変領域が、以下に記載される、配列番号２２に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２３に示されるＣＤＲ－Ｌ２、又は配列番号２４に示されるＣＤＲ－Ｌ３の１つ以上のＣＤＲを含むということ、又は
ｅ．重鎖可変領域が、以下に記載される、配列番号２５に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２６に示されるＣＤＲ－Ｈ２、又は配列番号２７に示されるＣＤＲ－Ｈ３の１つ以上のＣＤＲを含み、軽鎖可変領域が、以下に記載される、配列番号２８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、又は配列番号３０に示されるＣＤＲ－Ｌ３の１つ以上のＣＤＲを含むということ、
の組み合わせのいずれか１つから選択されることを特徴とする、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

具体的な実施態様では、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、以下の、ａ）重鎖可変領域が配列番号３１に示されるポリペプチド断片を含み、軽鎖可変領域が配列番号３２に示されるポリペプチド断片を含むということ、ｂ）重鎖可変領域が配列番号３３に示されるポリペプチド断片を含み、軽鎖可変領域が配列番号３４に示されるポリペプチド断片を含むということ、ｃ）重鎖可変領域が配列番号３５に示されるポリペプチド断片を含み、軽鎖可変領域が配列番号３６に示されるポリペプチド断片を含むということ、ｄ）重鎖可変領域が配列番号３７に示されるポリペプチド断片を含み、軽鎖可変領域が配列番号３８に示されるポリペプチド断片を含むということ、又はｅ）重鎖可変領域が配列番号３９に示されるポリペプチド断片を含み、軽鎖可変領域が配列番号４０に示されるポリペプチド断片を含むということの組み合わせのいずれか１つから選択される。

別の実施態様では、本発明の抗原結合ドメインは、グリコシル化ＣＥＡを特異的に認識する一本鎖抗体であり、一本鎖抗体のアミノ酸配列が配列番号１７１～１８０のいずれか１つに示されており、最も好ましくは、一本鎖抗体のアミノ酸配列が配列番号１７３又は配列番号１７８である。

好ましくは、本発明のキメラ抗原受容体において、膜貫通ドメインはＣＤ８α及び／又はＣＤ２８を含み、細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ２８、ＣＤ１３７、及びＣＤ３ゼータのうちの１つ以上を含み、ＣＤ８αヒンジ領域が配列番号５２に示されている配列によってコードされ、ＣＤ８α膜貫通ドメインが配列番号５４に示されている配列によってコードされ、ＣＤ２８ヒンジ領域が配列番号５３に示されている配列によってコードされ、ＣＤ２８膜貫通領域が配列番号５５に示されている配列によってコードされ、ＣＤ２８共刺激ドメインが配列番号５６に示されている配列によってコードされ、ＣＤ１３７共刺激ドメインが配列番号５７に示されている配列によってコードされ、ＣＤ３ゼータが配列番号５８で示される配列によりコードされる。

他の側面では、本発明は、本発明のキメラ抗原受容体をコードする核酸分子を提供する。

別の側面では、本発明は、本発明のキメラ抗原受容体を発現する細胞を提供し、好ましくは細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞及びＢ細胞からなる群から選択され、より好ましくは細胞はＴ細胞である。

別の側面において、本発明は、キメラ抗原受容体を発現するリンパ球であって、順番に連結されている場合、キメラ抗原受容体が細胞外標的認識抗原配列、ヒンジ領域配列、膜貫通領域配列、及び細胞内シグナル配列を含むリンパ球を提供する。細胞外認識抗原配列は、上記のように定義される、本発明に記載されているようなグリコシル化ＣＥＡを特異的に認識する一本鎖抗体である。ヒンジ領域は、ＣＤ８α、ＣＤ２８ＥＣＤ、及びＩｇＧＦｃ断片からなる群から選択される。細胞内シグナル領域は、ＣＤ３ゼータなどの免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、及びＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０などの共刺激シグナルを使用してもよい。一実施態様では、キメラ抗原受容体のヒンジ領域配列は、それぞれ配列番号５２又は配列番号５３に示される配列によってコードされるＣＤ８α又はＣＤ２８を含み、キメラ抗原受容体の膜貫通領域配列は、それぞれ配列番号５４又は配列番号５５に示される配列によってコードされるＣＤ８α又はＣＤ２８を含み、キメラ抗原受容体の細胞内シグナル配列は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ３ゼータ及びそれらの組み合わせを含み、ＣＤ２８は配列番号５６に示される配列によりコードされ、ＣＤ１３７は配列番号５７に示される配列によりコードされ、ＣＤ３ゼータは、配列番号５８に示される配列によってコードされる。一実施態様において、リンパ球は、Ｔ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞などであってよい。特定の実施態様では、リンパ球はＴ細胞であり、キメラ抗原受容体は以下の
ｓｃＦｖ－ＣＤ８α－ＣＤ１３７－ＣＤ３ゼータ，
ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ２８－ＣＤ１３７－ＣＤ３ゼータ，
ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ
が発現される。

好ましい実施態様では、本発明にて構築されたキメラ抗原受容体は、配列番号６９～１２８に示される配列を有する。

キメラ抗原受容体の抗原結合ドメインがその対応する抗原に結合すると、キメラ抗原受容体を含む細胞は抗腫瘍免疫を示す。

本発明は、グリコシル化ＣＥＡに対する一連の一本鎖抗体を構築する。本発明の一本鎖抗体は、胃癌、結腸直腸癌、及び食道癌などの腫瘍の検出及び治療に使用することができる。これらの一本鎖抗体は、Ｔ細胞やＮＫ細胞などのリンパ球の表面に発現させて、グリコシル化ＣＥＡ発現陽性細胞及び組織を特異的に死滅させるために、グリコシル化ＣＥＡに対するキメラ抗原受容体Ｔ細胞又はキメラ抗原受容体ＮＫ細胞を構築及び形成することができる。

第２の側面において、本発明は、それぞれＦＭ２、ＦＭ３、ＦＭ４、ＦＭ５、ＦＭ６であるグリコシル化ＣＥＡに対する一本鎖抗体を提供し、この場合それらの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のＣＤＲ配列は配列番号１～３０であり、それらのコード化ヌクレオチドは、それぞれ配列番号１２９～１５８であり、配列のリストを参照されたい。

本発明は、それぞれＦＭ２、ＦＭ３、ＦＭ４、ＦＭ５、ＦＭ６であるグリコシル化ＣＥＡに対する一本鎖抗体を提供し、それらの重鎖可変領域は配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７又は配列番号３９であり、それらの軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８又は配列番号４０である。一実施態様では、本発明は、グリコシル化ＣＥＡに対する一本鎖抗体であって、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨの形態で配置され、ＶＨが上記の重鎖可変領域配列から選択され、ＶＬが上記の軽鎖可変領域配列から選択される一本鎖抗体を提供する。好ましい実施態様では、リンカー、すなわちリンカーペプチドは、配列番号４１に示される配列である。

本発明は、本発明の一本鎖抗体をコードする単離された核酸分子を提供する。一実施態様では、一本鎖抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８又は配列番号５０である。一実施態様では、一本鎖抗体の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９又は配列番号５１である。

本発明はまた、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むベクターを提供する。特定の実施態様では、ベクターは、ｐＧＣ－ＥＩＦ１α－ＭＣＳ（ＣＶ１８５、Ｇｅｎｅｃｈｅｍ）、及びｐＧＣ－ＥＩＦ１α－ＭＣＳ－２Ａ－ＥＧＦＰ（ＣＶ１７８、Ｇｅｎｅｃｈｅｍ）である。

腫瘍診断用の試薬又は腫瘍治療薬の製造における、本発明によるキメラ抗原受容体及び前記一本鎖抗体の使用であって、好ましくは、前記腫瘍が消化管の腫瘍であり、より好ましくは、胃癌、結腸直腸癌、及び食道癌からなる群から選択される使用である。

本発明はまた、哺乳動物に抗腫瘍免疫を付与する方法を提供する。一実施態様では、この方法は、有効量の本発明のキメラ抗原受容体Ｔ細胞を哺乳動物に投与し、それによって哺乳動物に抗腫瘍免疫を付与することを含む。

本発明はまた、腫瘍抗原発現の上昇に関連する疾患、障害又は状態を有する哺乳動物の治療方法、例えばＣＥＡの高い発現を伴う胃腸の腫瘍を治療する方法を含む。一実施態様では、この方法は、有効量の本発明のキメラ抗原受容体Ｔ細胞を哺乳動物に投与し、それによって哺乳動物の腫瘍を治療することを含む。

本発明はまた、腫瘍抗原発現の上昇に関連する疾患、障害、又は状態を診断する方法、例えば、高いＣＥＡ発現を伴う消化管の腫瘍を診断する方法も含む。一実施態様では、この方法は、腫瘍及び腫瘍の周辺組織を検出するための、ある量のグリコシル化ＣＥＡの発現を含む。

フローサイトメトリーによるＳＷ６２０－ＣＥＡのＣＥＡ発現の検出。ＦＭ２_{（ＶＬ→ＶＨ）}、ＦＭ４_{（ＶＬ→ＶＨ）}、ＦＭ５_{（ＶＬ→ＶＨ）}、ＦＭ６_{（ＶＬ→ＶＨ）}を、構造ｓｃＦｖ－ＣＤ８α－ＣＤ１３７－ＣＤ３ゼータ及び感染したヒトＴ細胞に従ってレンチウイルスとして設計し、１０日目まで培養し、図面の標的細胞（ＳＷ６２０－ＣＥＡ、ＬＯＶＯ、ＫＡＴＯ３）とともに１６時間インキュベートし、ＩＬ２の放出を測定した。ＦＭ２_{（ＶＬ→ＶＨ）}、ＦＭ４_{（ＶＬ→ＶＨ）}、ＦＭ５_{（ＶＬ→ＶＨ）}、ＦＭ６_{（ＶＬ→ＶＨ）}を、構造ｓｃＦｖ－ＣＤ８α－ＣＤ１３７－ＣＤ３ゼータ及び感染したヒトＴ細胞に従ってレンチウイルスとして設計し、１０日目まで培養し、図面の標的細胞（ＳＷ６２０－ＣＥＡ、ＬＯＶＯ、ＫＡＴＯ３）とともに１６時間インキュベートし、ＴＮＦαの放出を測定した。ＦＭ２_{（ＶＬ→ＶＨ）}、ＦＭ４_{（ＶＬ→ＶＨ）}、ＦＭ５_{（ＶＬ→ＶＨ）}、ＦＭ６_{（ＶＬ→ＶＨ）}を、構造ｓｃＦｖ－ＣＤ８α－ＣＤ１３７－ＣＤ３ゼータ及び感染したヒトＴ細胞にレンチウイルスとして設計し、１０日目まで培養し、図面の標的細胞（ＳＷ６２０－ＣＥＡ、ＬＯＶＯ、ＫＡＴＯ３）とともに１６時間インキュベートし、ＩＮＦγの放出を測定した。ＦＭ２_{（ＶＬ→ＶＨ）}、ＦＭ４_{（ＶＬ→ＶＨ）}を、構造ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ及び感染したヒトＴ細胞にレンチウイルスとして設計し、１０日目まで培養し、図面の標的細胞（ＳＷ６２０、ＳＷ６２０－ＣＥＡ、ＬＯＶＯ、ＫＡＴＯ３、クリプト）とともに１６時間インキュベートし、ＩＬ２の放出を測定した。ＦＭ２_{（ＶＬ→ＶＨ）}、ＦＭ４_{（ＶＬ→ＶＨ）}を、構造ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ及び感染したヒトＴ細胞にレンチウイルスとして設計し、１０日目まで培養し、図面の標的細胞（ＳＷ６２０、ＳＷ６２０－ＣＥＡ、ＬＯＶＯ、ＫＡＴＯ３、クリプト）とともに１６時間インキュベートし、ＴＮＦαの放出を測定した。ＦＭ２_{（ＶＬ→ＶＨ）}、ＦＭ４_{（ＶＬ→ＶＨ）}を、構造ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ及び感染したヒトＴ細胞にレンチウイルスとして設計し、１０日目まで培養し、図面の標的細胞（ＳＷ６２０、ＳＷ６２０－ＣＥＡ、ＬＯＶＯ、ＫＡＴＯ３、クリプト）とともに１６時間インキュベートし、ＩＮＦγの放出を測定した。ＦＭ２_{（ＶＬ→ＶＨ）}－ＢＢｚをＥ：Ｔ比で４時間標的細胞と混合し、上清のＬＤＨ放出を測定してＦＭ２_{（ＶＬ→ＶＨ）}－ＢＢｚによる標的細胞の死滅を判定した。ＦＭ４_{（ＶＬ→ＶＨ）}－ＢＢｚをＥ：Ｔ比で４時間標的細胞と混合し、上清のＬＤＨ放出を測定してＦＭ４_{（ＶＬ→ＶＨ）}－ＢＢｚによる標的細胞の死滅を判定した。ＰＤＸモデルマウスの末梢血（peripheral blood）でのＩＦＮγ放出の検出。ＰＤＸモデルの腫瘍増殖曲線。ＦＭ４_{（ＶＬ→ＶＨ）}－ＢＢｚ－ＮＫ９２サイトカイン分泌アッセイ。ＦＭ４_{（ＶＬ→ＶＨ）}－ＢＢｚ－ＮＫ９２細胞死滅アッセイ。腫瘍モデルのマウスにおけるＩＮＦγ放出の検出。腫瘍モデルのマウスにおける腫瘍殺傷効果。

本発明を実施するための具体的な形態
まず本発明をより容易に理解できるようにいくつかの用語について定義を行う。他に示さない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるところ、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書に引用されたすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾がある場合には、本明細書（定義を含む）が優先するものとする。さらに、材料、方法、及び例は例示的なものにすぎず、限定的なものではない。

一本鎖抗体
本明細書で使用する場合、「一本鎖抗体（一本鎖Ｆｖ、ｓｃＦｖ）」は、連結ペプチドを介して免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を連結することによって形成される組換えタンパク質である。これは完全な抗原結合部位を有する最小の抗体断片である。ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＧの５つのサブタイプを含み、そのうちＩｇＧがヒト免疫グロブリンの７５％を占める。ＩｇＧは、鎖間のジスルフィド結合を介して２つの重鎖ＩｇＨ及び２つの軽鎖ＩｇＬによって形成される「Ｙ」型の抗体の構造物である。ＩｇＨは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び定常の領域（定常領域）を含む。ＩｇＬは、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び定常の領域（定常領域）を含む。ＶＨ及びＶＬの多様性は、免疫グロブリンの抗原への結合の基礎である。ＶＨ及びＶＬは、フレーム領域（ＦＲ）及び相補性決定定領域（ＣＤＲ）から構成され、ＣＤＲ領域は非常に可変性があり、抗原及び抗体の特異的結合を判定する。ここで、ＶＨは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と称される３つのＣＤＲ領域を含む。ＶＬは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と称される３つのＣＤＲ領域を含む。

本発明はまた、一本鎖抗体の変異体、誘導体及び類似体も含む。本文で使用される「変異体」、「誘導体」及び「類似体」という用語は、本発明の一本鎖抗体の同じ生物学的機能又は活性を実質的に保持するポリペプチドを示す。本発明のポリペプチド変異体、誘導体又は類似体は、（ｉ）１つ以上の保存的又は非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）が置換されているポリペプチド、かような置換アミノ酸残基は遺伝子コードによってコードされてもされなくてもよい、又は（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を有するポリペプチド、又は（ｉｉｉ）追加のアミノ酸配列をポリペプチド配列に融合することによって形成されるポリペプチド（リーダー配列若しくは分泌配列、又は、ポリペプチド若しくは融合ポリペプチドを精製するために使用される配列若しくはポリペプチド配列など）であってよい。これらの変異体、誘導体及び類似体は当業者の知識の範囲内にあり、本明細書の定義に従う。

本発明の「一本鎖抗体」は、グリコシル化ＣＥＡに特異的に結合するポリペプチドを示す。この用語はまた、グリコシル化ＣＥＡに特異的に結合することができるポリペプチド配列を有する変異体も含む。これらの変異体は、いくつかの（通常１～５０、好ましくは１～３０、より好ましくは１～２０、最も好ましくは１～１０、さらにより好ましくは１～８又は１～５の）アミノ酸の欠失、挿入及び／又は置換、並びにＣ末端及び／又はＮ末端に１つ以上（通常２０以内、好ましくは１０以内、より好ましくは５つ以内）のアミノ酸の付加又は欠失を含む（しかしこれらに限定されない）。例えば、当技術分野において、近似又は類似の性質のアミノ酸による置換は通常タンパク質の機能を変えない。別の例として、Ｃ末端及び／又はＮ末端での１つ以上のアミノ酸の付加又は欠失は、一般にタンパク質の機能も同様に変えない。

本発明はまた、一本鎖抗体の類似体も提供する。これらの類似体と天然の一本鎖抗体との間の相違は、アミノ酸の配列における相違、配列に影響を及ぼさない修飾形態における相違、又はそれらの組み合わせであってよい。これらのポリペプチドは天然の又は誘導された遺伝的変異体を含む。誘導変異体は、照射によるランダムな突然変異誘発若しくは突然変異誘発物質への曝露、又は部位特異的突然変異誘発若しくは分子生物学の他の公知の技術などの様々な技術によって得ることができる。類似体はまた、天然のＬ－アミノ酸以外の残基（例えば、Ｄ－アミノ酸）を有する類似体、並びに非自然発生のアミノ酸又は合成アミノ酸（例えば、β－アミノ酸、γ－アミノ酸）を有する類似体も含む。本発明のポリペプチドは上に例示した代表的なポリペプチドに限定されないことを理解すべきである。

さらに、本発明の一本鎖抗体の活性、発現量及び安定性に実質的に影響を及ぼさない他のアミノ酸配列を、一本鎖抗体のアミノ末端又はカルボキシ末端に付加することができる。好ましくは、これらの付加されたアミノ酸配列は発現を促進し（例えばシグナルペプチド）、精製を促進し（例えば６×Ｈｉｓ配列）、又は一本鎖抗体の活性、発現若しくは安定性を促進する他の配列である。

本発明はまた、本発明の一本鎖抗体又はその変異体、誘導体をコードするＤＮＡ分子も含む。ＤＮＡ分子はすべて人工的に合成することができるか、ＰＣＲ増幅によって得ることができる。

宿主細胞の発現レベルをさらに増加させるために、本発明の一本鎖抗体のコード配列は、例えば、宿主細胞に好ましいコドンを用いて遺伝子の転写及び翻訳に寄与しない配列を排除するように操作することができる。

一本鎖抗体の発現
本発明の新規一本鎖抗体又はその変異体若しくは誘導体をコードするＤＮＡ配列を得た後、それを適切な発現ベクターにクローニングし、適切な宿主細胞に移入する。最終的に、形質転換宿主細胞を培養し、単離精製することにより本発明の新規の一本鎖抗体を得る。

本明細書で使用する「ベクター」という用語は、プラスミド、コスミド、発現ベクター、クローニングベクター、ウイルスベクターなどを含む。

本発明においては、当技術分野で公知の種々のベクターを使用し得る。例えば、市販のベクターを選択した後、本発明の新規の一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現調節配列に作動可能に連結して発現ベクターを形成する。

本発明において、「宿主細胞」という用語は原核細胞及び真核細胞を含む。一般的に使用される原核生物の宿主細胞の例には、大腸菌、枯草菌などが含まれる。一本鎖抗体を発現するための宿主細胞には、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞などが含まれる。好ましくは、宿主細胞は原核細胞、より好ましくは大腸菌細胞である。

形質転換宿主細胞を得た後、細胞を本発明の一本鎖抗体の発現に適した条件下で培養して一本鎖抗体を発現させることができる。そして発現された一本鎖抗体を単離することができる。

リンカーペプチド
本明細書で使用する場合、「リンカーペプチド」（リンカー）という用語は、抗体（又はその変異体）の重鎖可変領域と抗体（又はその変異体）の軽鎖可変領域との間の短いペプチドを示す。それはリンカーとして作用して重鎖及び軽鎖可変領域が自由に折り畳まれることを可能にし、分子動力学を変化させることなく抗原結合部位を適切な配置に残す。一般に、リンカーペプチドは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列の正しい折り畳み及び空間的立体配座の形成に影響を及ぼさない、又は著しくは影響を及ぼさない。あるいは、リンカーペプチドは、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）との間の柔軟な連結を構成し、これはそれらの通常の折り畳みを容易にする。リンカーペプチドの長さは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が自由に折り畳まれ、抗原結合部位が分子動力学に変化を引き起こさずに適切な配置になることができる限り、特に限定されない。例えば、リンカーペプチドの長さはまた４～３０アミノ酸であってよい。好ましくは、本発明のリンカーペプチドの配列は配列番号１に記載されている。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明の一本鎖抗体は、胃癌、結腸直腸癌、食道癌などの腫瘍の検出及び治療に用いることができる。本発明の一本鎖抗体をＴ細胞の表面に特異的に発現させることにより、グリコシル化ＣＥＡに対するキメラ抗原受容体Ｔ細胞を構築し、特異的にグリコシル化ＣＥＡ発現陽性細胞及び組織を死滅させることができる。本発明の一本鎖抗体のそれぞれについて、３つの構造のＣＡＲ－Ｔを別々に構築し、各抗体の下の３つの構造の機能的差異を比較し、適切なＣＡＲ－Ｔ構造を適切な標的細胞に採用する。３つの構造のＣＡＲ－Ｔはそれぞれ
ｓｃＦｖ－ＣＤ８α－ＣＤ１３７－ＣＤ３ゼータ、
ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ２８－ＣＤ１３７－ＣＤ３ゼータ、
ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ
である。

本発明のキメラ抗原受容体構造において：
ヒンジ領域は、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ、ヒトＩｇＧ４Ｆｃ、ＤＡＰ１０などからなる群から選択される細胞外領域であってよい。

膜貫通領域は、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＤＡＰ１０などからなる群から選択される膜貫通領域であってよい。

共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０などからなる群から選択される細胞内領域であってよい。

必須シグナルドメインはＣＤ３ゼータから選択してよい。

例
本発明をについて具体的な例及び添付の図面と併せて以下にさらに説明する。それらは本発明を限定することを意図しない。具体的には条件が記載されていない以下の例の実験方法は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＧｕｉｄｅ，ＳｃｉｅｎｃｅＰｒｅｓｓ，２００２に記載されているものなどの従来の条件、又は製造業者の推奨する条件に従って行われる。百分率及び部は重量によるものであり、他の記載がある場合はその限りではない。

例１：一本鎖抗体の構築
表１

一本鎖抗体の発現方法
各合成したヌクレオチド配列ＦＭ２、３、４、５、６の３’末端に８Ｈｉｓ（ＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴ）を付加し、増幅させた断片の両端にｓｆｉＩ、ＮｏｔＩ制限部位を付加し、その後ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅベクター（ＧＥＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）に挿入した。構築したｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（ＧＥ）ベクターを大腸菌ＨＢ２１５１株に形質転換し、ＩＰＴＧにより誘導して一晩発現させた。細胞をＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、氷で１０分間超音波処理した。遠心分離後、上清をＨｉｓＴｒａｐＣｏｌｕｍｎ（ＧＥ）で精製し、２０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ緩衝液で５～１０カラム容量で洗浄し、次いで５００ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳで溶出した。続いてイミダゾールをＤｅｓａｌｔｉｎｇＧ２５カラム（ＧＥ）で脱塩し、ＰＢＳに溶解した一本鎖抗体を得た。

例２：ＣＡＲ組換えレンチウイルスベクターの構築
本発明において構築されたウイルスを表２に示す。
表２：

１．レンチウイルスプラスミドベクターの構築
１）遺伝子配列の全遺伝子合成
表２のレンチウイルスを構築するために、必須の遺伝子配列を、表２に示す構造に従って、遺伝子全体の合成に供した。

２）核酸断片の増幅
配列番号６９～７８、８９～９８、１０９～１１８として番号付けされた合成遺伝子産物を上流プライマー（配列番号１５９～１６８）及び下流プライマー（配列番号１６９）を用いて増幅した。ＰＣＲ増幅条件は次の通りであった：前変性：９５℃で５分間；変性：９５℃で３０秒間；アニーリング：５５℃で３０秒間；伸長：７２℃で１分間、３５サイクル；最後の伸長：７２℃で１０分間。

配列番号７９～８８、９９～１０８、１１９～１２８として番号付けされた合成遺伝子産物を上流プライマー（配列番号１５９～１６８）及び下流プライマー（配列番号１７０）で増幅した。ＰＣＲ増幅条件は上記と同じであった。

３）ウイルスプラスミドベクターの構築
ａ）配列番号７９～８８、９９～１０８、１１９～１２８の増幅断片を制限エンドヌクレアーゼの消化に供した。使用した制限酵素はＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩであり、消化システムは次の通りであった：０．５μｌのＢａｍＨＩ、０．５μｌのＥｃｏＲＩ、２μｌの緩衝液、２μｌのＢＳＡ、２μｇの増幅断片で、２０μｌまで滅菌水を補充した。３７℃で２時間インキュベートした後、酵素消化システムをＤＮＡ洗浄及び回収に供した。回収方法は以下の通りであった：８０μｌの緩衝液ＰＣＲ－Ａを消化システムに添加した後、混合物を調製用の管に移し、調製用の管を２ｍｌの遠心分離用の管に入れ、１２，０００×ｇで１分間遠心分離し、濾液を捨てた。調製用の管を２ｍｌの遠心分離用の管に戻し、７００μｌの緩衝液Ｗ２を加え、１２，０００×ｇで１分間遠心分離し、濾液を捨てた。調製用の管を清潔な１．５ｍｌの遠心分離用の管に入れ、２５～３０μｌの溶出液又は脱イオン水を調製用の管の膜の中心に添加し、室温で１分間放置した。ＤＮＡを１２，０００×ｇで１分間の遠心分離により溶出した。

配列番号６９～７８、８９～９８、１０９～１１８の増幅断片を制限エンドヌクレアーゼの消化に供した。使用した制限エンドヌクレアーゼはＢａｍＨＩであった。消化システムは次の通りであった：０．５μｌのＢａｍＨＩ、０．５μｌのＥｃｏＲＩ、２μｌの緩衝液、２μｌのＢＳＡ、２μｇの増幅断片で、２０μｌまで滅菌水を補充した。３７℃で２時間インキュベートした後、酵素消化システムをＤＮＡの洗浄及び回収に供した。リサイクルの方法は上記と同じである。

ｂ）ベクター断片を制限エンドヌクレアーゼの消化に供し、酵素消化システム及び方法は上記のものと同じであった。消化後、システムをＤＮＡアガロースゲル電気泳動に供し、ベクター断片（約８Ｋｂ）をゲルにより回収した。回収システムは以下の通りであった：目的のＤＮＡ断片をアガロース電気泳動により他のＤＮＡバンドから分離し、次いで回収すべきＤＮＡを含有するアガロースゲルブロックを清浄なメスで切断し、予め番号を付していた１．５ｍｌのＥＰ管に入れた。アガロースゲルブロックはできるだけ薄く切るべきであり、紫外線照射の時間はできるだけ短くするべきである。５００μｌのゲル溶液を各々の管に加え、６５℃の温かい槽の中で５～１０分間インキュベートし、その間に混合物を２分毎に反転させてゲルを完全に融解させた。溶解したゲルを水の槽から取り出し、室温に冷却されるまで室温で２分間放置した。ＵＮＩＱ－１０回収カラムに５００μｌの平衡化溶液を加え、１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、収集溶液を捨て、除外した。液体をＵＮＩＱ－１０カラムに移し、室温で１分間静置し、８，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。ＵＮＩＱ－１０カラムを降ろして収集用の管内の廃液を捨て（標的の一片が非常に軽い場合、収集用の管の液体は再びＵＮＩＱ－１０カラムを通ることができる）、ＵＮＩＱ－１０カラムを同じ収集用の管に入れて、７００μｌの洗浄用緩衝液を加え、１０，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離して、もう一度繰り返した。ＵＮＩＱ－１０カラムを降ろし、収集用の管内の廃液を捨て、ＵＮＩＱ－１０カラムを同じ収集用の管に入れ、１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。ＵＮＩＱ－１０カラムを新しい１．５ｍｌのＥＰ用の管に入れ、ＵＮＩＱ－１０カラムの蓋を開け、６５℃の乾燥機に１０分間入れてエタノールを十分に蒸発させた。４０μｌの溶出緩衝液をカラムのメンブレンの中心に添加し（注：汚染を避けるために先端部を交換しなければならない）、ＵＮＩＱ－１０カラムの蓋を閉め、６５℃のオーブンに２分間入れた。目的のＤＮＡを１２，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離により回収した。

ＥＧＦＰ発現ベクターを制限エンドヌクレアーゼの消化に供した。使用した制限酵素はＢａｍＨＩであり、酵素消化システム及びゲルの回収方法は上記と同じであった。

ｃ）プラスミドベクターと目的の断片の連結
配列番号７９～８８、９９～１０８、１１９～１２８の消化産物をＥＧＦＰの発現がないベクター（ＣＶ１８５、Ｇｅｎｅｃｈｅｍ）に連結し、配列番号６９～７８、８９～９８、１０９～１１８の増幅させた消化産物をＥＧＦＰ発現ベクター（ＣＶ１７８、Ｇｅｎｅｃｈｅｍ）に連結した。

連結システムは以下の通りであった：２５ｎｇの挿入断片、１００ｎｇのベクター断片、２μｌのＴ４リガーゼ緩衝液、１μｌのＴ４リガーゼを、２０μｌまで滅菌水を補って、２２℃で１時間連結させた。

２．レンチウイルスのパッケージング
第３世代のレンチウイルスパッケージングシステムを使用した：トランスファープラスミド：ＣＶ１７８又はＣＶ１８５（Ｇｅｎｅｃｈｅｍ）、エンベローププラスミド：Ｈ１（Ｇｅｎｅｃｈｅｍ）、パッケージングプラスミド：Ｈ２（Ｇｅｎｅｃｈｅｍ）Ｚｕｆｆｅｒｅｙｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ７２（１２）：９８７３－８０，１９９８）。

ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を２４時間の継代期間に従って補充し、培地をトランスフェクション前に交換した。細胞の各プレートを、電気ピペットを用いて２％ＦＢＳを含有する５ｍｌのＤＭＥＭ培地と交換した。ＨＢＷ、Ｈ１（１２μｇ／プレート、プレートとは１０ｃｍの細胞培養皿を指し、以下同様）、組換えＨ２（１０μｇ／プレート）、ベクター（２４μｇ／プレート）、ＣａＣｌ_２（５０μｌ／プレート）を順に加え、最後に２×ＨＢＳ（５００μｌ／ディスク）を滴下してボルテックス発振器で振動させた。トランスフェクションシステムは１ｍｌ／プレートであった。その中でも、ベクターはステップ１で構築されたベクターであった。トランスフェクションシステムを注意深くピペッティングし、混合物１０００μｌを取り、混合後２９３Ｔ細胞に滴下して加え、操作を安定した状態に保ち、トランスフェクションシステムを１０ｃｍのプレートに均一に分配した。プレートを水平に保ち、プレート内の液体を前後左右の各方向に１０回振った。混合プロセスは十分なはずであるが、液体がプレートの外側にこぼれたり流れたりした可能性はなかった。その後、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータに入れる。トランスフェクションの８時間後、上清を捨て、ＤＭＥＭ培地を電気ピペットと交換した。トランスフェクションの終了後２８～３０時間の間に、上清を初めて回収し、１０ｍｌのＤＭＥＭ培地を補うために添加した。トランスフェクションの終了後４８～５０時間の間に、上清を２回目のために集めた。超遠心分離後、後に使用するためにそれを１００μｌのＤＭＥＭに再懸濁した。

例３：組換えレンチウイルスによるＴリンパ球の感染
感染実験は、当業者に公知の通例の方法に従って行われた。感染ステップを以下のように簡潔に説明する：

１．末梢血単核球リンパ球（Peripheral blood mononuclear lymphocytes）（ＰＢＭＣ）を得て、血液アフェレーシスシステムにより＞１×１０^７の細胞が得られた。

２．細胞培養皿の実験的な抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８抗体の処理。
抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ３クローン、ＭＡＣＳ）及び抗ヒトＣＤ２８抗体（１５Ｅ８クローン、ＭＡＣＳ）を、ＰＢＳで最終的な濃度を１μｇ／ｍｌに希釈し、希釈した抗体混合物を細胞培養皿に加え、皿に培養物が広がるようにした。室温で２時間インキュベートした後、皿をＰＢＳで１回洗浄し、除外した。

３．Ｔリンパ球の活性化
単離したＰＢＭＣを、Ｔリンパ球培養培地（ＴｅｘＭＡＣＳ培地＋１０％ＦＢＳ＋３０ＩＵ／組換えヒトＩＬ－２）に、最終的な濃度が１×１０^６細胞／ｍｌになるように再懸濁し、ステップ２で処理した皿に入れて培養した。培養条件は３７℃＋５％ＣＯ_２、培養時間は２４時間であった。

４．活性化Ｔリンパ球の感染
１）感染試薬の調製
一定量のＴ細胞培養培地を取り、１ｍｇ／ｍｌという最終的な濃度に達するようにＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃＦ１０８を添加し、十分に混合し、水に浸して３７℃に加熱して除外した。

２）培養プレートの処理
１ｍｇ／ｍｌのＣＤ３及び０．５ｍｇ／ｍｌのＣＤ２８抗体を採取し、１：１０００の体積比で適切な量のＰＢＳ緩衝液に希釈し、レトロネクチン試薬（タカラ、カタログ番号Ｔ１００Ａ）を取得してＰＢＳ緩衝液に１：４０の体積比で希釈した。よく混合した後、緩衝液を細胞皿に均一に広げ、室温で２時間インキュベートした。２時間後、皿をＰＢＳで洗浄して除外した。

３）レンチウイルスによるＴリンパ球の感染及びＴリンパ球の維持
１）で調製した感染試薬を用いて活性化Ｔリンパ球を希釈し、レンチウイルスをＭＯＩ＝３に従って添加し、混合した。混合物を２）で処理したように皿に均等に広げた。

細胞の密度を感染後にモニターして、細胞を１×１０^６細胞／ｍｌに維持した。典型的には、１４日後に細胞を３０～１００倍に増幅した。

例４：消化管供給源の癌細胞株におけるグリコシル化ＣＥＡ発現の検出
フローサイトメトリーを用いて、様々な標的細胞におけるグリコシル化ＣＥＡの発現レベルを検出した。具体的な検出方法は以下の通りであった：
１．表３に示すように６×１０^５細胞／群を採取し、２００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。
２．２００μｌのＰＢＳに再懸濁した後、再懸濁した細胞を２群に分け、そのうちの１つに本発明のグリコシル化ＣＥＡに対する一本鎖抗体１μｇを加え、４℃で２時間インキュベートした。
３．１ｍｌのＰＢＳを各群に添加し、混合し、２００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を１００μｌのＰＢＳで再懸濁した後、５μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ１ＦＩＴＣ標識二次抗体を細胞懸濁液に添加し、４℃で１時間インキュベートした。
４．細胞をＰＢＳで３回洗浄し、フローサイトメトリーで測定及び分析した。

結果を表３に示す。グリコシル化ＣＥＡ抗原の発現はＳＷ６２０では検出されなかったが、異なる程度のグリコシル化ＣＥＡ発現はＫＡＴＯ３、クリプト、並びにＣＥＡを過剰発現するＳＷ６２０－ＣＥＡ及びＬＯＶＯ細胞株で検出された。

ＳＷ６２０－ＣＥＡ細胞系の構築方法：ＳＷ６２０細胞を、１０％ＦＢＳを添加した１６４０培地で維持し培養した。全長のＣＥＡ遺伝子（ＣＥＡＣＡＭ５、ＮＭ－００４３６３）は、全遺伝子合成によって得られた。ＧＶ３４８ベクター（Ｇｅｎｅｃｈｅｍ）にクローニングした後、２つのヘルパープラスミドを有する遺伝子をリン酸カルシウムで２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、パッケージングしてレンチウイルスを形成した。ＳＷ６２０細胞を２４ウェルプレート（１０^５／ウェル）に接種し、一晩培養した。ＳＷ６２０をＭＯＩ＝３に従ってＣＥＡ発現レンチウイルスに感染させ、感染の２４時間後にピューロマイシンを添加して１μｇ／ｍｌの最終濃度にした。細胞をピューロマイシンでスクリーニングしてモノクローンを得た。ＣＥＡの発現がＦＡＣＳにより検出された。結果を図１に示す。
表３：

例４ａ：ＦＭ４一本鎖抗体及びＣＥＡ抗体を用いた腫瘍試料でのＣＥＡ発現の検出
患者の胃癌腫瘍組織の試料を流動パラフィンに包埋して凍結し、切片をスライドガラスに固定した。キシレンで脱蝋した後、クエン酸緩衝液を用いて抗原の回収を行った。修復した試料をＰＢＳ緩衝液に入れた５％ＦＢＳで３０分間ブロックし、本発明のＦＭ４一本鎖抗体又はＣＥＡ抗体（クローンＣＢ３０）（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１４－０６６９－８２）２μｇ／ｍｌを４℃の冷蔵庫に一晩加えた。組織のスライドをＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体を加えて発色させた。

ＦＭ４一本鎖抗体は（表４に示すように）相対的に高い感度及び組織特異性を示した。
表４：

例５：グリコシル化ＣＥＡ陽性細胞に対するＣＡＲ－Ｔの特異性に関する研究
ＣＡＲ－Ｔがグリコシル化ＣＥＡ陽性細胞（低レベルの抗原の発現を伴うＬｏＶｏ、ＫＡＴＯ３、クリプト、及びＳＷ６２０－ＣＥＡ）における特異的な機能を特異的に認識し産生するかどうかを調べるために、本研究室は、標的細胞と共に同時培養をした後、同様の感染効率で、対照としてＣＡＲウイルスに感染していないＴリンパ球を用いて、４つの構築されたＣＡＲ－Ｔ、すなわちＦＭ２_{（ＶＬ→ＶＨ）}－ＢＢｚ、ＦＭ４_{（ＶＬ→ＶＨ）}－ＢＢｚ、ＦＭ５_{（ＶＬ→ＶＨ）}－ＢＢｚ、及びＦＭ６_{（ＶＬ→ＶＨ）}－ＢＢｚ（配列番号８０、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８）の特異的なサイトカインの放出及び標的の細胞特異的な死滅を検出した。

１．ＣＡＲ－Ｔ感染効率のフローの検出
ＥＧＦＰタンパク質とＣＡＲタンパク質がＣＡＲ－Ｔ細胞において同時発現されたので、フローサイトメトリーによって検出されたＥＧＦＰ陽性細胞の割合で、ＣＡＲ陽性細胞を表すことができる。ＣＡＲウイルスに感染していないＴ細胞を対照として使用し、試験結果を以下の表に示した（表５）。
表５：

２．ＣＡＲ－Ｔと標的細胞との相互作用後のサイトカイン分泌レベル
標的細胞は、ＳＷ６２０、ＳＷ６２０－ＣＥＡ、ＬｏＶｏ、及びＫＡＴＯ３細胞であった。エフェクター細胞は表５に記載の５つの細胞であり、サイトカインの分泌はＣＡＲウイルスの感染の１０日後に検出された。

方法は以下の通りであった：１×１０^５の標的細胞を１００μｌのＲＰＭＩ１６４０＋２％ＦＢＳ培地で１：１の比でエフェクター細胞と別々に混合し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータで約１６時間インキュベートした。１６時間後、２００ｇで５分間遠心分離を行い、上清を採取して上清のサイトカインの分泌レベルを測定した。サイトカインの含有量は、ＢＤ社製のＨＵＴＨ１－ＴＨ２ＣＢＡＫＩＴにより測定した。測定のメカニズムは、反応溶液の中のサイトカインが、対応するビーズの抗体に結合することができ、各サイトカインに対応するビーズが、異なる強度のＡＰＣ蛍光標識を有するというものであった。サイトカインがビーズに結合した後、ビーズに結合したサイトカインを別のＰＥ蛍光標識抗体でさらに標識し、サイトカインの含有量を、ＰＥの蛍光強度を測定することによって判定し、異なるサイトカインの種をＡＰＣの蛍光の強度の差により識別した。本研究では、３つのサイトカイン、すなわちＩＬ－２、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの分泌レベルが検出された。具体的な試験方法はキットの説明書を参照した。検査結果はＦＣＡＰＡｒｒａｙｖ３ソフトウェアで分析し、その結果を図２、図３、図４、図５、図６、及び図７に示している。

結果は、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及び他のサイトカインが、ＦＭ２_{（ＶＨ→ＶＬ）}－ＢＢｚ及びＦＭ４_{（ＶＨ→ＶＬ）}－ＢＢｚが標的細胞と相互作用した後に顕著に増加することを示した。

３．標的細胞とＣＡＲ－Ｔの相互作用後の標的細胞に対するインビトロの死滅毒性
グリコシル化ＣＥＡ陽性標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔの死滅作用を検証するために、低レベルの抗原の発現を伴う抗原発現陽性細胞ＬｏＶｏ、ＫＡＴＯ３及びクリプト、並びにＳＷ６２０－ＣＥＡを、本研究で使用した。使用したキットは、Ｃｙｔｏｔｏｘ９６非放射性細胞毒性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）であった。この方法のメカニズムは、従来型の放射性元素が、細胞において安定して発現されて分泌されない乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）で置き換えられ、細胞のアポトーシスが起こると、ＬＤＨは細胞外に放出され、ＬＤＨにより酸化されたホルマザンの含有量を検出して、上清の酵素のレベルを判定し、それによってアポトーシスのレベルを判定するというものであった。エフェクター細胞はＦＭ４_{（ＶＨ→ＶＬ）}－２８ｚであり、標的細胞に対するエフェクター細胞の比はそれぞれ１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：３０であった。標的細胞の数は１０，０００細胞／ウェルであり、各群に２つの補助的なウェルを設置しており、検出した時間は相互作用の４時間後であった。

これらのうち、実験群及び対照群をそれぞれ以下のように設定した。
実験群：標的細胞及び異なる標的細胞に対して異なる比率のエフェクター細胞を伴うＣＡＲ－Ｔ細胞。
対照群１：標的細胞の中で最大のＬＤＨ放出をする群。
対照群２：標的細胞の中でＬＤＨを自発的に放出する群。
対照群３：エフェクター細胞の中で自発的な放出をする群。

具体的な実験方法はキットの説明書を参照した。細胞傷害性は以下の式によって計算した。
特異的溶解＝（実験群－対照群２－対照群３）／（対照群１－対照群２）。

結果は、ＦＭ４_{（ＶＨ→ＶＬ）}‐２８ｚがＬｏＶｏ、ＫＡＴＯ３及びクリプト細胞に対して強い死滅作用を有するが、ＳＷ６２０－ＣＥＡにはほとんど死滅作用を与えないことを示した。関連する結果を図８及び図９に示す。

本研究は、ＦＭ４_{（ＶＨ→ＶＬ）}－２８ｚがグリコシル化ＣＥＡ抗原を特異的に認識し、グリコシル化度がより低いＣＥＡ抗原に対する感受性が低いことを実証する。

例６：グリコシル化ＣＥＡ陽性ＰＤＸ腫瘍モデルに対するＣＡＲ－Ｔの効果
ＮＣＧマウス（南京大学のモデル生物学研究所から購入）に、グリコシル化ＣＥＡ抗原陽性の患者由来の腫瘍細胞を皮下注射した。患者の腫瘍組織を摘出した後、表面の結合組織と血管を除去した。腫瘍の塊を正中線に沿って切断し、壊死した組織、石灰化した大きな箇所、及び分泌物を除去し、慎重に洗浄した後、質と強靭性が良好な腫瘍組織を、新鮮な氷冷ＲＰＭＩ－１６４０培地に移した。腫瘍組織を約３×３ｍｍ^２の小さな腫瘍の塊に切断し、ＮＳＧマウスの片側に移植した。腫瘍の体積の平均が１６０～１８０ｍｍ^３に達したとき、モデルの動物にエフェクター細胞を腫瘍内注射した。

本研究で使用されたエフェクター細胞はＦＭ４_{（ＶＨ→ＶＬ）}－ＢＢｚであり、対照群はＣＡＲ及び等量のＰＢＳでトランスフェクトされていないＴ細胞であった。注射の前に、エフェクター細胞をＰＢＳで２回洗浄し、それぞれ３Ｅ７／ｍｌ及び１Ｅ８／ｍｌに達するようにＰＢＳにおいて再懸濁し、それぞれ低用量群及び高用量群として記録した。各マウスに３０μｌのエフェクター細胞／ＰＢＳを腫瘍内注射した。

本研究の調査内容は次の通りである。
マウスの体重及び腫瘍の体積／３日／時間、
マウスの末梢血のサイトカインの検出／７日／時間、
マウスの末梢血のＣＡＲコピー数／７日／時間。

腫瘍の体積の結果を図１０に示す。ＣＡＲ－Ｔの注射後４日目から、ＦＭ４_{（ＶＨ→ＶＬ）}－ＢＢｚ高用量群の腫瘍の体積は減少し始めたが、空のＴ細胞群及びＰＢＳ群は減少傾向を示さなかった。これは、ＣＡＲ－Ｔが、グリコシル化ＣＥＡ陽性の腫瘍に対して有意な抑制効果を有することを示している。ＣＡＲ－Ｔの注射後、空のＴ細胞群及びＰＢＳ対照群と比較して、ＣＡＲ－Ｔを注射したマウスの体重に有意差はなかった。

末梢血のサイトカインの分泌傾向を図１１に示す。ＣＡＲ－Ｔ注射群では、末梢血で様々なヒトサイトカイン（ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ）の分泌が検出され、腫瘍の体積の減少とともに、サイトカインの分泌量は徐々に減少した。これは、ＣＡＲ－Ｔが腫瘍細胞に対して有意な活性化応答を生じることを証明した。

例６ａ：マウスの腫瘍モデル
ＮＳＧマウス（ＮＯＤｓｃｉｄＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ）に、１Ｅ７／マウスのＬｏｖｏ細胞（ＣＣＬ２２９、ＡＴＣＣ）を皮下接種して、２００ｍｍ^３～３００ｍｍ^３の体積の腫瘍を形成した。腫瘍に対照としてのＰＢＭＣ及びＦＭ４_{（ＶＨ→ＶＬ）}－ＢＢｚを注射した。具体的な群は以下の通りである。

ＰＢＭＣ又はＦＭ４ＢＢｚのＴ細胞を輸血したＮＳＧマウスを、尾静脈から４０μｌ（３日目及び７日目）採血し、試料を等量のＰＢＳに再懸濁し、遠心分離し、上清をサイトカイン放出アッセイ（ＢＤＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃＢｅａｄＡｒｒａｙ）用に使用した。結果を図１４に示す。

図１４に示すように、ＩＦＮγは、高用量又は低用量のＦＭ４ＢＢｚ輸血群両方において、末梢血で検出され、ＦＭ４ＢＢｚは腫瘍細胞と接触してサイトカインの放出を引き起こしたが、対照群においてはＰＢＭＣはサイトカインの放出を誘導しなかった（ＦＭ４ＢＢｚＨ／Ｌ対ＰＢＭＣ群、ｐ値＜０．００１）。腫瘍の体積を週に２回、３５日間測定した。腫瘍増殖曲線を図１５に示す。

図１５に示すように、高用量及び低用量のＦＭ４ＢＢｚ群の両方が腫瘍の増殖に対して有意な阻害を示しており、これはＦＭ４ＢＢｚが腫瘍を死滅させる効果を有することを示唆している。

例７：ＦＭ４_{（ＶＨ→ＶＬ）}－ＢＢｚレンチウイルスによるＮＫ９２細胞の感染
ＮＫ９２細胞を、２０％ＦＢＳ、１５０ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ－２を含有する１６４０培地で培養した。例３の方法に従って、ＮＫ９２細胞株にＦＭ４_{（ＶＨ→ＶＬ）}－ＢＢｚＣＡＲウイルスを感染させ、１０日間継続して培養した。ＦＭ４_{（ＶＨ→ＶＬ）}－ＢＢｚ－ＮＫ９２細胞を、死滅実験及びサイトカイン放出アッセイに使用した。結果を図１２及び図１３に示す。

例８：抗体－細胞結合アッセイ
抗体ＦＭ２、ＦＭ４、ＦＭ５、及びＦＭ６を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液で希釈し、ＳＷ６２０－ＣＥＡ又はクリプト細胞（最終的な濃度：５０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．００５μｇ／ｍｌ、０．０００５μｇ／ｍｌ）を室温で１時間インキュベートした。細胞を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、次いでヤギ抗マウスＩｇＧ－ＡＰＣと共に１時間インキュベートした。細胞を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液中に再懸濁した。細胞のＡＰＣ蛍光値はＢＤＡｃｃｕｒｉＣ６ＦＡＣＳを用いて読み取った。

縦の座標として蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を、横の座標として抗体の濃度（μｇ／ｍｌ）を用いて、抗体結合ＥＣ５０を計算するために、ロジスティック方程式を用いてＳ曲線を適合させた。結果を以下の表に示す。
表６：

結論：
ＳＷ６２０－ＣＥＡは、ＳＷ６２０細胞株（ＣＥＡＣＡＭ５）において過剰発現されるＣＥＡであり、そのＣＥＡの表面は非グリコシル化状態にある。クリプトはグリコシル化ＣＥＡを発現する腫瘍細胞株である。

抗体－細胞結合アッセイに従って計算された抗体のＥＣ５０値から、抗体ＦＭ４はグリコシル化ＣＥＡに特異的に結合し、高い特異性（選択性＞１００倍）を有すると結論付けることができる。

配列表１～１８０＜２２３＞合成

Claims

ｉ）グリコシル化ＣＥＡを標的とする抗原結合ドメイン、
ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び
ｉｉｉ）共刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
前記グリコシル化ＣＥＡを標的とする前記抗原結合ドメインが重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、以下を特徴とするキメラ抗原受容体：
前記重鎖可変領域が、配列番号３５に示されるポリペプチド断片を含み；前記軽鎖可変領域が、配列番号３６に示されるポリペプチド断片を含む。
抗原結合ドメインが、ヒトグリコシル化ＣＥＡを特異的に認識する一本鎖抗体であり、前記一本鎖抗体のアミノ酸配列が配列番号１７３又は配列番号１７８である、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
ヒンジ領域をさらに含み、膜貫通ドメインが、ＣＤ８α及び／又はＣＤ２８の全長からの一部である膜貫通ドメインであるか、又はＣＤ８α及び／又はＣＤ２８の全長からの一部である膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ２８、ＣＤ１３７、及びＣＤ３ゼータの全長からの一部である細胞内シグナル伝達ドメインのうちの１つ以上を含む、請求項１又は２に記載のキメラ抗原受容体。
請求項３に記載のキメラ抗原受容体であって、
ヒンジ領域が配列番号５２又は配列番号５３に示される配列によってコードされ、
膜貫通領域配列が配列番号５４又は配列番号５５に示される配列によってコードされ、
細胞内シグナル配列が配列番号５６に示される配列、配列番号５７に示される配列、又は配列番号５８に示される配列によってコードされるキメラ抗原受容体。
請求項１～４のいずれかに記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸分子。
請求項１～４のいずれかに記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞であって、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＢ細胞からなる群から選択される、細胞。
ヒトグリコシル化ＣＥＡに特異的に結合する一本鎖抗体であって、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域は、以下を特徴とする、一本鎖抗体：
前記重鎖可変領域が、配列番号３５に示されるポリペプチド断片を含み；前記軽鎖可変領域が、配列番号３６に示されるポリペプチド断片を含む。
請求項７に記載の一本鎖抗体であって、前記一本鎖抗体のアミノ酸配列が配列番号１７３又は配列番号１７８である一本鎖抗体。
腫瘍治療薬の製造における、請求項１～４のいずれかに記載のキメラ抗原受容体、又は請求項６の細胞、又は請求項７もしくは８の一本鎖抗体の使用であって、腫瘍が胃癌、結腸直腸癌、及び食道癌からなる群から選択される使用。