CN110072892B - 高度糖基化cea特异性结合的单链抗体及其在检测和治疗上的应用 - Google Patents

高度糖基化cea特异性结合的单链抗体及其在检测和治疗上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种糖基化CEA特异性单链抗体，以及一种靶向糖基化CEA的嵌合抗原受体(CAR)，可用于制备诊断或治疗过表达糖基化CEA的肿瘤的试剂或药物。

Description

高度糖基化CEA特异性结合的单链抗体及其在检测和治疗上 的应用
技术领域
本发明涉及到肿瘤免疫治疗领域，更具体的，本发明涉及糖基化CEA特异性单链抗体，以及对过表达糖基化CEA的肿瘤的转基因修饰的过继T淋巴细胞治疗领域。
背景技术
胃癌的发病率在我国居消化道恶性肿瘤之首，在世界上居第二位，年死亡数约占恶性肿瘤死亡人数的24％，五年生存率仅约为27％。胃癌患者的诊断发现往往已到晚期，因此预后极差。针对胃癌并无有效的靶向治疗药物。CEA(carcinoembryonic antigen)癌胚抗原，是一种膜结合蛋白，一般在胎儿肝肠胰等组织表达。正常分泌入肠道，血清中含量很少。细胞癌变时，血清中水平升高，对胰腺癌、结肠癌早期诊断有辅助意义，对肿瘤的扩散、疗效、复发和预后有一定的参考价值。第四军医大学樊代明教授发现糖基化的CEA对多种消化道癌的敏感性特异性都很高。临床研究表明，糖基化CEA在胃癌组织中的阳性率在80％以上，在结肠癌组织中阳性率在40％以上，在胃癌前病变阳性率在30％以上，在食道癌组织中阳性率在18％以上。同时临床实验结果显示，28例胃癌患者术后血清中糖基化CEA的阳性率比术前明显下，提示糖基化CEA与胃癌发病存在着密切关系(Gadler et al.,Int J Cancer25(1):91-4，1980)。
目前，新兴的具有靶向性过继细胞治疗技术嵌合抗原受体T淋巴细胞(Chimericantigen receptor T cell，CAR-T)在多种恶性肿瘤治疗中均发挥着重要作用，CAR-T是将如单链抗体、特异性受体等针对肿瘤相关抗原(TAA)特异性识别肽段与T细胞激活信号如CD3zeta融合偶联，并通过如慢病毒等方式将该融合蛋白特异性表达于T细胞表面，使修饰过的T细胞可以对肿瘤细胞进行特异性识别并杀伤，且不依赖于主要组织相容性抗原(MHC)，避免了由于MHC缺失导致的肿瘤免疫逃逸。
嵌合抗原受体包括胞外靶向识别抗原区、铰链区、跨膜区及胞内共刺激信号区。抗原识别区多为单链抗体或者特异性受体，保证修饰的T细胞可以特异性的识别靶细胞，并被激活，对靶细胞产生特异性杀伤作用；铰链区一般采用如CD8α、CD28ECD、IgG Fc片段等，保证T细胞与靶细胞接触距离，影响到T细胞作用；胞内信号区域采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，如CD3zeta及共刺激信号如CD28、CD137、CD27、ICOS、OX40、DAP10等(Sadelain etal.,Cancer Discov3(4):388-98，2013)。
尽管在恶性血液病的治疗中，CAR-T展现出了良好的应用价值，但在实体瘤治疗中，CAR-T往往并不能达到预期效果，甚至在临床研究中，CAR-T可能会存在由于脱靶效应而产生的毒性。其重要原因为，在实体瘤中往往没有一个有效的、特异性强的靶点。对于众多肿瘤相关抗原中，往往在正常组织也有一定程度的表达，如HER2为恶性胶质瘤、乳腺癌等恶性肿瘤的重要靶点，在针对HER2靶点的CAR-T临床实验中，患者在回输CAR-T后出现肺部衰竭，并引发“细胞因子风暴”导致患者在短时间内死亡。因此在实体瘤中找到一个高特异性和高灵敏度的靶点是CAR-T治疗方法在实体瘤中应用的关键点(Morgan et al.,Mol Ther18(4):843-51，2010)。
NK细胞是表达CD16和CD56的淋巴细胞并且是天然免疫中重要的组成部分，NK细胞可以杀死MHC缺失的靶细胞，与T细胞相比NK细胞不表达T细胞受体因而不会发生移植物抗宿主反应(GVHD)。NK细胞激活处于激活性受体(KAR，Killer Activation Receptor)和抑制性受体(KIR，Killer Inhibition Receptor)信号的平衡状态，体内主要的KIR配体为MHC，对于错配或缺失KIR配体，会造成NK细胞的激活；CAR-NK技术是利用CAR结构表达在NK细胞或NK细胞系(例如NK92)表面从而用于治疗癌症的新兴技术，其优点为NK细胞不分泌IL6、NK细胞在外周血中循环半衰期很短、NK细胞转染效率高(非病毒载体)、NK细胞系可以大规模培养GMP级别；将CAR结构表达在NK细胞或NK细胞系表面可以使NK细胞获得靶向性，同时在CAR-NK异体移植中，由于KIR受体的错配，因此会增强NK细胞的激活从而达到更好的肿瘤消除效果；NK细胞系在体内的循环时间很短，因此提供了安全性考虑(Han et al.,Sci Rep5:11483,2015)。
发明内容
在第一个方面，本发明提供了嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包括:
i)靶向糖基化CEA的抗原结合结构域；
ii)跨膜结构域，和
iii)细胞内信号传导结构域，其包含共刺激结构域，
其中所述靶向糖基化CEA的抗原结合结构域包含一重链可变区及一轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区及轻链可变区选自以下任一组合：
a.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:1所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:2所示的CDR-H2、或由SEQ ID NO:3所示的CDR-H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:4所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:5所示的CDR-L2、或由SEQ ID NO:6所示的CDR-L3；
b.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:7所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:8所示的CDR-H2、或由SEQ ID NO:9所示的CDR-H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:10所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:11所示的CDR-L2、或由SEQ ID NO:12所示的CDR-L3；
c.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:13所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:14所示的CDR-H2、或由SEQ ID NO:15所示的CDR-H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:16所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:17所示的CDR-L2、或由SEQ ID NO:18所示的CDR-L3；
d.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:19所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:20所示的CDR-H2、或由SEQ ID NO:21所示的CDR-H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:22所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:23所示的CDR-L2、或由SEQ ID NO:24所示的CDR-L3；或
e.所述重链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:25所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:26所示的CDR-H2、或由SEQ ID NO:27所示的CDR-H3；同时所述轻链可变区包含一个或多个如下所述的CDR：由SEQ ID NO:28所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:29所示的CDR-L2、或由SEQ ID NO:30所示的CDR-L3。
在一个具体实施方式中，所述重链可变区及轻链可变区选自以下任一组合：a)所述重链可变区包含由SEQ ID NO:31所示的多肽片段，同时所述的轻链可变区包含由SEQ IDNO:32所示的多肽片段；b)所述重链可变区包含由SEQ ID NO:33所示的多肽片段，同时所述的轻链可变区包含由SEQ ID NO:34所示的多肽片段；c)所述重链可变区包含由SEQ ID NO:35所示的多肽片段，同时所述的轻链可变区包含由SEQ ID NO:36所示的多肽片段；d)所述重链可变区包含由SEQ ID NO:37所示的多肽片段，同时所述的轻链可变区包含由SEQ IDNO:38所示的多肽片段；或e)所述重链可变区包含由SEQ ID NO:39所示的多肽片段，同时所述的轻链可变区包含由SEQ ID NO:40所示的多肽片段。
在另一个具体实施方式中，本发明所述抗原结合结构域是特异性识别糖基化CEA的单链抗体，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:171-180任一项所示，最优选地，所述单链抗体的氨基酸序列是SEQ ID NO:173或SEQ ID NO:178。
优选地，在本发明的嵌合抗原受体中，跨膜结构域包括CD8α和/或CD28，所述细胞内信号传导结构域包含CD28，CD137，和CD3zeta中的一种或多种，其中优选地，CD8α铰链区由SEQ ID NO:52所示序列编码，CD8α跨膜区由SEQ ID NO:54所示序列编码，CD28铰链区由SEQ ID NO:53所示序列编码，CD28跨膜区由SEQ ID NO:55所示序列编码，CD28共刺激结构域由SEQ ID NO:56所示序列编码，CD137共刺激结构域由SEQ ID NO:57所示序列编码，CD3zeta由SEQ ID NO:58所示序列编码。
在另一个方面，本发明提供了编码本发明所述的嵌合抗原受体的核酸分子。
在另一个方面，本发明提供了表达本发明所述的嵌合抗原受体的细胞，优选地，所述细胞选自T细胞、NK细胞和B细胞，更优选地，所述细胞为T细胞。
在另一个方面，本发明提供了一种表达嵌合抗原受体的淋巴细胞，所述嵌合抗原受体包括胞外靶向识别抗原序列、铰链区序列、跨膜区序列及胞内信号序列，按顺序连接。其中胞外识别抗原序列为本发明所述的特异性识别糖基化CEA的单链抗体，如上文所定义。铰链区选自CD8α、CD28ECD、IgG Fc片段。胞内信号区域可采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，如CD3zeta及共刺激信号如CD28、CD137、CD27、ICOS、OX40、DAP10。在一个实施方式中，嵌合抗原受体中的所述的铰链区序列包括CD8α或CD28，分别由SEQ ID NO:52或SEQ IDNO:53所示序列编码；嵌合抗原受体中的所述的跨膜区序列包括CD8α或CD28，分别由SEQ IDNO:54或SEQ ID NO:55所示序列编码；嵌合抗原受体中的所述的胞内信号序列包括CD28、CD137、CD3zeta及其组合，CD28由SEQ ID NO:56所示序列编码，CD137由SEQ ID NO:57所示序列编码，CD3zeta由SEQ ID NO:58所示序列编码。在一个实施方式中，所述淋巴细胞可以为T细胞，B细胞或NK细胞等。在一个具体实施方式中，所述淋巴细胞是T细胞，所述表达嵌合抗原受体构建为如下结构：
scFv-CD8α-CD137-CD3zeta、
scFv-CD28-CD28-CD137-CD3zeta、
scFv-CD28-CD28-CD3zeta。
在优选的实施方式中，本发明构建的嵌合抗原受体的序列如SEQ ID NO:69-128所示。
当嵌合抗原受体的抗原结合结构域结合它相应的抗原时，包括嵌合抗原受体的细胞显示了抗肿瘤免疫。
本发明构建了一系列针对糖基化CEA的单链抗体。本发明的单链抗体可以用于胃癌，结直肠癌，食道癌等肿瘤的检测和治疗。这些单链抗体可以通过表达于淋巴细胞例如T细胞、NK细胞表面，构建形成针对糖基化CEA的嵌合抗原受体T细胞、嵌合抗原受体NK细胞，针对糖基化CEA表达阳性细胞及组织进行特异性杀伤。
在第二方面，本发明提供了针对糖基化CEA的单链抗体，分别为FM2、FM3、FM4、FM5、FM6，其重链可变区和轻链可变区的CDR序列为SEQ ID NO:1～30，它们的编码核苷酸分别为SEQ ID NO:129～158，见序列表。
本发明提供了针对糖基化CEA的单链抗体，分别为FM2、FM3、FM4、FM5、FM6，其重链可变区分别为SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:39；轻链可变区分别为SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38或SEQID NO:40。在一个实施方式中，本发明提供了针对糖基化CEA的单链抗体，其按照VH-Linker-VL或VL-Linker-VH的形式排列，其中VH选自上文所述的重链可变区序列，VL选自上文所述的轻链可变区序列。在一个优选实例中，Linker即连接肽为SEQ ID NO:41所示的序列。
本发明提供了编码本发明所述的单链抗体的分离的核酸分子。在一个实施方式中，编码所述单链抗体的重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:50。在一个实施方式中，编码所述单链抗体的轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49或SEQ IDNO:51。
本发明还提供了包括编码嵌合抗原受体的核酸序列的载体，在具体的实施方式中，所述载体为pGC-EIF1α-MCS(CV185，吉凯基因)及pGC-EIF1α-MCS-2A-EGFP(CV178，吉凯基因)。
如本发明所述的嵌合抗原受体和单链抗体在制备用于诊断肿瘤的试剂或治疗肿瘤的药物中的用途，优选地，其中所述肿瘤为消化道肿瘤，更优选地，选自胃癌，结直肠癌，食道癌。
本发明还提供了提供哺乳动物中抗肿瘤免疫的方法。在一个实施方式中，该方法包括给哺乳动物施用有效量的本发明的嵌合抗原受体T细胞，由此提供哺乳动物中的抗肿瘤免疫。
本发明也包括治疗具有与升高的肿瘤抗原表达相关的疾病、紊乱或病症的哺乳动物的方法，例如CEA高表达的消化道肿瘤的治疗。在一个实施方式中，该方法包括给哺乳动物施用有效量的本发明的嵌合抗原受体T细胞，由此治疗哺乳动物中的肿瘤。
本发明也包括诊断具有与升高的肿瘤抗原表达相关的疾病、紊乱或病症的方法，例如诊断具有CEA高表达的消化道肿瘤。在一个实施方式中，该方法包括用于检测肿瘤及肿瘤周边组织的糖基化CEA的表达量。
附图说明
图1.用流式细胞仪对SW620-CEA进行CEA表达的检测。
图2.将FM2(VL→VH)，FM4(VL→VH)，FM5(VL→VH)，FM6(VL→VH)按照scFv-CD8α-CD137-CD3zeta结构设计成慢病毒感染人类T细胞，培养至第10天，与图中所示靶细胞(SW620-CEA、LOVO、KATO3)孵育16小时，测定IL2释放。
图3.将FM2(VL→VH)，FM4(VL→VH)，FM5(VL→VH)，FM6(VL→VH)按照scFv-CD8α-CD137-CD3zeta结构设计成慢病毒感染人类T细胞，培养至第10天，与图中所示靶细胞(SW620-CEA、LOVO、KATO3)孵育16小时，测定TNFα释放。
图4.将FM2(VL→VH)，FM4(VL→VH)，FM5(VL→VH)，FM6(VL→VH)按照scFv-CD8α-CD137-CD3zeta结构设计成慢病毒感染人类T细胞，培养至第10天，与图中所示靶细胞(SW620-CEA、LOVO、KATO3)孵育16小时，测定INFγ释放。
图5.将FM2(VL→VH)，FM4(VL→VH)按照scFv-CD28-CD28-CD3zeta结构设计成慢病毒感染人类T细胞，培养至第10天，与图中所示靶细胞(SW620、SW620-CEA、LOVO、KATO3、CRYPT)孵育16小时，测定IL2释放。
图6.将FM2(VL→VH)，FM4(VL→VH)按照scFv-CD28-CD28-CD3zeta结构设计成慢病毒感染人类T细胞，培养至第10天，与图中所示靶细胞(SW620、SW620-CEA、LOVO、KATO3、CRYPT)孵育16小时，测定TNFα释放。
图7.将FM2(VL→VH)，FM4(VL→VH)按照scFv-CD28-CD28-CD3zeta结构设计成慢病毒感染人类T细胞，培养至第10天，与图中所示靶细胞(SW620、SW620-CEA、LOVO、KATO3、CRYPT)孵育16小时，测定INFγ释放。
图8.将FM2(VL→VH)-BBz按照E：T比例与靶细胞混合培养4小时，测定上清中LDH释放以判断FM2(VL→VH)-BBz对靶细胞的杀伤。
图9.将FM4(VL→VH)-BBz按照E：T比例与靶细胞混合培养4小时，测定上清中LDH释放以判断FM4(VL→VH)-BBz对靶细胞的杀伤。
图10.PDX模型小鼠外周血INFγ释放检测。
图11.PDX模型瘤体生长曲线。
图12.FM4(VL→VH)-BBz-NK92细胞因子分泌检测。
图13.FM4(VL→VH)-BBz-NK92细胞杀伤实验。
图14.小鼠肿瘤模型INFγ释放检测。
图15.小鼠肿瘤模型杀伤肿瘤效应。
具体实施方式
首先定义某些术语，这样可使本发明更容易被理解。除非另外指出，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的技术人员通常理解的意义相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或试验中，但下面描述了适当的方法和材料。本文中提及的所有公开物、专利申请、专利和其他参考资料以它们的全文通过引用合并入本文。在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例只是举例说明性的而非限定性的。
单链抗体
如本文所用，所述的“单链抗体(Single chain Fv，scFv)”是由免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽连接而成的重组蛋白，它是具有完全抗原结合位点的最小抗体片段。人类免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)包括IgA，IgD，IgM，IgE，IgG五种亚型，其中IgG占人类免疫球蛋白比例为75％；IgG由两条重链IgH和两条轻链IgL通过链间二硫键形成“Y”型抗体结构；其中IgH包含重链可变区(VH)和恒定区(ConstantRegion)；IgL包含轻链可变区(VL)和恒定区(Constant Region)。VH和VL多样性是免疫球蛋白与抗原结合的基础，VH和VL由框架区(Frame Region，FR)以及抗原互补决定区(Complementary Determining Region,CDR)构成，CDR区域高度可变，决定了抗原抗体的特异性结合；其中VH包含三段CDR区域，记为CDRH1，CDRH2，CDRH3；VL包含三段CDR区域，记为CDRL1，CDRL2，CDRL3。
本发明也包括所述的单链抗体的变异体、衍生物和类似物。如本文所用，术语“变异体”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的单链抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽变异体、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或多肽原序列，或融合多肽)。根据本文的定义这些变异体、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明的“单链抗体”指特异性结合糖基化CEA的多肽。该术语还包括具有特异性结合糖基化CEA的多肽序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或减少一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
本发明还提供单链抗体的类似物。这些类似物与天然单链抗体的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
此外，在所述的单链抗体的氨基端或羧基端还可添加其它基本上不影响本发明所述的单链抗体的活性、表达量和稳定性的氨基酸序列。较佳地，这些添加的氨基酸序列有利于表达(如信号肽)，有利于纯化(如6×His序列)，或其它可促进所述的单链抗体的活性、表达量或稳定性的序列。
本发明还包括编码本发明的单链抗体或其变异体、衍生物的DNA分子。所述的DNA分子可以全部人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。
为了进一步提高宿主细胞的表达量，可以对本发明的单链抗体的编码序列进行改造，例如采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于基因转录及翻译的序列。
单链抗体的表达
在获得了编码本发明的新单链抗体或其变异体、衍生物的DNA序列之后，将其克隆入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的单链抗体。
如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新单链抗体的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成表达载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。用于表达单链抗体的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、COS细胞、CHO细胞等。较佳地，该宿主细胞是原核细胞，更佳地是大肠杆菌细胞。
在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明单链抗体的条件下培养该细胞，从而表达出单链抗体；然后再分离出表达的单链抗体。
连接肽
如本文所用，术语“连接肽”(linker)指位于抗体的重链可变区(或其变异体)与抗体的轻链可变区(或其变异体)之间的、起连接作用的短肽，其能使重、轻链可变区自由折叠，使抗原结合位点处于适当的构型，并不引起分子动力学改变。通常，连接肽不影响或不显著影响重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象；或者，连接肽构成了重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)之间的柔性连接而有利于它们的正常折叠。连接肽的长度没有特别限制，只要其能使重、轻链可变区自由折叠，使抗原结合位点处于适当的构型，并不引起分子动力学改变。例如，连接肽的长度也可为4-30aa。优选地，本发明的连接肽的序列如SEQ ID NO:41所示。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明的单链抗体可以用于胃癌，结直肠癌，食道癌等肿瘤的检测和治疗。本发明的单链抗体可以通过表达于T细胞表面，构建成针对糖基化CEA的嵌合抗原受体T细胞，针对糖基化CEA表达阳性细胞及组织进行特异性杀伤。针对本发明的每种单链抗体，分别构建三种结构的CAR-T并比较了三种结构在每种抗体下的功能上的差异，针对合适靶细胞及采用合适CAR-T结构。所述的三种结构的CAR-T分别为：
scFv-CD8α-CD137-CD3zeta、
scFv-CD28-CD28-CD137-CD3zeta、
scFv-CD28-CD28-CD3zeta。
在本发明的嵌合抗原受体结构中：
铰链区可以选择：CD8α，CD28，human IgG1 Fc，human IgG4 Fc，DAP10等胞外区。
跨膜区可以选择：CD8α，CD28，DAP10等跨膜区。
共刺激结构域可以选择：CD28，CD134(OX40)，CD137(4-1BB)，ICOS，DAP10等胞内区。
必要信号结构域可以选择：CD3zeta。
实施例
下面结合具体实施例与附图，对本发明进一步加以描述，但这些描述并不构成对本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：单链抗体的构建
单链抗体 Seq ID VH Seq ID VL Seq ID
FM2(VH→VL) SEQ ID NO:59 SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:32
FM2(VL→VH) SEQ ID NO:64 SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:32
FM3(VH→VL) SEQ ID NO:60 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34
FM3(VL→VH) SEQ ID NO:65 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34
FM4(VH→VL) SEQ ID NO:61 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36
FM4(VL→VH) SEQ ID NO:66 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36
FM5(VH→VL) SEQ ID NO:62 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:38
FM5(VL→VH) SEQ ID NO:67 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:38
FM6(VH→VL) SEQ ID NO:63 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:40
FM6(VL→VH) SEQ ID NO:68 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:40
表一
单链抗体的表达方法
将合成的FM2、3、4、5、6核苷酸序列3’末端添加8His(CACCATCACCATCACCATCACCAT)将扩增片段两端添加sfiI和NotI酶切位点插入pCANTAB5E载体(GE HealthCare)中。将构建好的pCANTAB5E(GE)载体转化E.Coli-HB2151菌株，经过IPTG诱导过夜表达。菌体用PBS缓冲液重悬后，冰上超声破碎10min，离心后上清利用His Trap Column(GE)纯化，用含20mM咪唑的PBS缓冲液洗5-10个柱体积后，用含500mM咪唑的PBS洗脱；随后的咪唑用Desalting G25column(GE)脱盐，得到溶解在PBS里的单链抗体。
实施例2：构建CAR重组慢病毒载体本发明中所构建的病毒如表二所示：
表二
1.慢病毒质粒载体构建
1)全基因合成基因序列
为构建表二慢病毒，按照表二中所示结构对必须基因序列进行全基因合成。
2)核酸片段扩增
用上游引物(SEQ ID NO.159-168)及下游引物(SEQ ID NO.169)扩增序列编号为SEQ ID NO.69～78,89～98,109～118所合成的基因产物。PCR扩增条件为预变性：95℃5分钟；变性：95℃30秒；退火：55℃30秒；延伸72℃1分钟，35个循环，终延伸：72℃10分钟。
用上游引物(SEQ ID NO.159-168)及下游引物(SEQ ID NO.170)扩增序列编号为SEQ ID NO.79～88,99～108,119～128所合成的基因产物。PCR扩增条件如上相同。
3)病毒质粒载体构建
a)对序列SEQ ID NO.79～88,99～108,119～128扩增片段进行限制性内切酶酶切。所用限制性内切酶为BamHI及EcoRI，酶切体系如下：BamHI 0.5ul，EcoRI 0.5ul，Buffer2ul，BSA 2ul，扩增片段2ug,用无菌水补至20ul。37℃孵育2小时。对酶切体系进行DNA清洁回收。回收方法如下：向酶切体系中加80ulBuffer PCR-A混匀后，转移到制备管中，将制备管置于2ml离心管中，12,000×g离心1min，弃滤液。将制备管置回2ml离心管，加700μlBuffer W2，12,000×g离心1min，弃滤液。将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加25-30μl Eluent或去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。
对SEQ ID NO.69～78,89～98,109～118扩增片段进行限制性内切酶酶切。所用限制性内切酶为BamHI。酶切体系如下：BamHI 0.5ul，EcoRI 0.5ul，Buffer 2ul，BSA 2ul，扩增片段2ug,用无菌水补至20ul。37℃孵育2小时。对酶切体系进行DNA清洁回收。回收方式如前所述。
b)对载体片段进行限制性内切酶酶切，酶切体系及方法如前所示，酶切后对体系进行DNA琼脂糖凝胶电泳，并对载体片段(约8Kb)进行胶回收。回收体系如下：通过琼脂糖电泳将目的DNA片段和其它DNA条带尽可能分开，然后用干净的手术刀割下含有需要回收DNA的琼脂糖块，放入已预先写好编号的1.5ml EP管中。胶块要尽量切割的薄一些，在紫外光照射的时间要尽可能短。每管加入500ul溶胶液，65℃温浴5到10分钟，期间每2分钟颠倒混匀一次，使凝胶完全融化。把溶好的胶从水浴锅中取出，室温放置2min，至冷却到室温。在UNIQ-10回收柱中加入500ul平衡液，12000rpm离心1min，弃去收集液备用。将液体转移至UNIQ-10柱中室温放置1分钟，8,000rpm离心1min。
取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液(如果目的条带很淡，可以将收集管中的液体，再过一遍UNIQ-10柱)，将UNIQ-10柱放入同一个收集管，加700ul Wash buffer，10,000rpm离心30秒。重复一次。取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管，12,000rpm离心2min。将UNIQ-10柱放入新的1.5ml EP管中，打开UNIQ-10柱的盖子在65℃烘箱中放置10min，使乙醇充分挥发掉。在柱膜中央加入40ul Elution Buffer(注意要换枪头，避免污染)，盖上UNIQ-10柱的盖子，放于65℃烘箱中保温2分钟。用12,000rpm离心1分钟，回收目的DNA。
对EGFP表达载体进行限制性内切酶酶切，所用限制性内切酶为BamHI，酶切体系及胶回收方法如前所述。
c)对质粒载体及目的片段进行连接
对序列SEQ ID NO.79～88,99～108,119～128酶切产物与无EGFP表达载体(CV185,吉凯基因)进行连接；对SEQ ID NO.69～78,89～98,109～118扩增酶切产物与EGFP表达载体(CV178，吉凯基因)进行连接。
连接体系如下：插入片段25ng，载体片段100ng，T4连接酶buffer2ul，T4连接酶1ul，用无菌水补至20ul，22℃连接1小时。
2.慢病毒包装
采用第三代慢病毒包装体系：Transfer质粒：CV178或CV185(吉凯基因),Envelop质粒：H1(吉凯基因),Packaging质粒：H2(吉凯基因)(Zufferey et al.,J Virol 72(12):9873-80,1998)。
按照24h传代周期供应HEK-293T细胞，转染前换液，每盘细胞用电动移液器更换5ml含2％ FBS的DMEM培养基。依次加入HBW、H1(12μg/盘，盘指10cm细胞培养皿下同)、重组H2(10μg/盘)、Vector(24μg/盘)、CaCl2(50μl/盘)，最后在旋涡震荡器上边震荡边逐滴加入2×HBS(500μl/盘)，转染体系为1ml/盘。其中，Vector步骤1中所述构建载体。小心吹打转染体系，混匀后取1000μl逐滴加入293T细胞，操作保持稳定使转染体系均匀分布于10cm平皿。保持平皿水平，并使平皿内液体前后左右分别各晃动十次，混匀过程要充分，但不能有液体溅出或流到平皿壁外，然后置于37℃，5％ CO2培养箱中培养。转染后8小时，弃去上清液，用电动移液器更换含DMEM培养基。转染结束后28～30小时之间开始第一次收集上清，补齐10ml DMEM培养基。在转染结束后48～50小时开始第二次收集上清。超速离心，重悬于100ulDMEM以备后用。
实施例3重组慢病毒感染T淋巴细胞
感染实验按照本领域技术人员已知的常规方法进行。简述感染步骤如下：
1.外周血单核淋巴细胞(PBMC)的获得，通过血液单采系统获得>1x107的细胞。
2.实验抗人CD3/CD28抗体处理细胞培养皿。
用PBS稀释抗人CD3抗体(OKT3克隆,MACS)及抗人CD28抗体(15E8克隆，MACS)，终浓度为1ug/ml，向细胞培养皿中加入稀释后的抗体混合液，使其铺满培养皿，室温孵育2小时。2小时后用PBS洗一次，备用。
3.对T淋巴细胞进行激活处理
将分离的PBMC用T淋巴细胞培养液(TexMACS培养基+10％FBS+30IU/重组人IL-2)进行重悬，使终浓度为1*106个细胞/ml，并放入步骤2中处理过的培养皿中培养，培养条件为37℃+5％CO2，培养时间为24小时。
4.对激活的T淋巴细胞进行感染
1)感染试剂配制。
取一定量的T细胞培养液，加入终浓度为1mg/ml的synperonic F108，混匀，水浴锅加热至37℃待用。
2)培养板处理。
取1mg/ml CD3及0.5mg/ml的CD28抗体按1:1000体积比稀释至适量的PBS缓冲液中，并取retronectin试剂(takara,货号T100A)，按1:40体积比稀释至该PBS缓冲液中，混匀后均匀铺至细胞皿，室温孵育2小时。2小时后用PBS进行洗涤并待用。
3)慢病毒感染T淋巴细胞及T淋巴细胞维持
用1)中所配感染试剂稀释已激活的T淋巴细胞，并按MOI＝3加入慢病毒，并混匀。均匀铺在2)中所处理的培养皿中。
感染后监测细胞密度，使细胞维持在1*106个细胞/ml，一般14天，可扩增30-100倍。
实施例4检测糖基化CEA在各消化道来源癌种细胞株表达
使用流式细胞法检测多种靶细胞糖基化CEA表达水平。本具体检测方法如下：
1.取表三种各组细胞6*105个，200g离心5分钟，弃上清；
2.用200ulPBS重悬，将重悬细胞均分两组，其中一组加入1ug本发明的针对糖基化CEA的单链抗体，4℃孵育2小时。
3.各组中加入1ml PBS，混匀后200g离心5min，弃上清，用100ul PBS重悬细胞，向细胞悬液中加入5ul羊抗小鼠IgG1 FITC标记二抗，4℃孵育1小时；
4.用PBS洗三次细胞，用流式细胞仪进行检测并分析。
结果如表三，SW620检测不到糖基化CEA抗原表达，KATO3、CRYPT及外源过表达CEA的SW620-CEA及LOVO细胞株均可检测到不同程度糖基化CEA表达。
SW620-CEA细胞系的构建方法：SW620细胞维持培养在1640培养基添加10％FBS；CEA基因(CEACAM5，NM-004363)通过全基因合成获得全长；克隆至GV348(吉凯基因)载体后，与两种helper质粒通过磷酸钙转染293T细胞包装为慢病毒。SW620细胞按照105/孔接种至24孔板培养过夜；将表达CEA慢病毒按照MOI＝3感染SW620，感染后24小时培养基中加入puromycin至终浓度1ug/ml；细胞通过puromycin筛选后获得单克隆。通过FACS检测CEA表达，结果见图1。
表三
实施例4a利用FM4单链抗体和CEA抗体检测肿瘤样本CEA表达
取自病人胃癌肿瘤组织样本用液态石蜡包埋后进行冷冻切片固定于载玻片上；利用二甲苯脱蜡后利用柠檬酸缓冲液进行抗原修复；修复的样本用含5％FBS的PBS缓冲液进行封闭半小时后，加入2ug/ml本发明的FM4单链抗体或CEA抗体(克隆CB30)(ebioscience,货号14-0669-82)后4度冰箱过夜；将组织玻片用PBS洗3次加入二抗后显色。
FM4单链抗体显示出更高的灵敏性和组织特异性(如表四所示)。
抗体 胃癌 癌旁
FM4 73％ 24％
CEA抗体 51％ 20％
表四
实施例5 CAR-T对糖基化CEA阳性细胞特异性功能研究
为研究抗CAR-T是否对糖基化CEA阳性细胞(LoVo、KATO3、CRYPT以及抗原低水平表达的SW620-CEA)特异性识别并产生特异性功能，本实验室在相近的感染效率下，以未感染CAR病毒的T淋巴细胞作为对照，检测所构建的四种二代CAR-T,FM2(VL→VH)-BBz、FM4(VL→VH)-BBz、FM5(VL→VH)-BBz、FM6(VL→VH)-BBz(SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ IDNO.88)与靶细胞共培养后细胞因子特异性释放及对靶细胞特异性杀伤研究。
1.CAR-T感染效率流式检测
由于EGFP蛋白与CAR蛋白在CAR-T细胞内共表达，因此通过流式细胞计数检测EGFP阳性细胞百分比即可代表CAR表达阳性细胞。以未感染CAR病毒的T细胞作为对照，检测结果如下表(表五)所示：
表五
2.CAR-T与靶细胞作用后细胞因子分泌水平
靶细胞为SW620、SW620-CEA、LoVo、KATO3四株细胞，效应细胞为表五中提及的五种细胞，在CAR病毒感染后10天进行细胞因子分泌检测。
方法为：分别取1*105个靶细胞与效应细胞进行1:1混合，混合于100ul RPMI 1640+2％ FBS培养基中，在37℃5％CO2培养箱中共孵育约16小时。16小时后200g离心5分钟，取上清液，检测上清液中细胞因子分泌水平。检测细胞因子含量用BD公司生产的HU TH1-TH2CBA KIT，其原理为，反应液中细胞因子可以与其对应Beads上的抗体结合，每种细胞因子所对应的Beads均带有不同强度的APC荧光标签，细胞因子与beads结合后，再用另一种PE荧光标记的抗体对结合于beads上的细胞因子进行标记，通过检测PE荧光强度来判断细胞因子含量，而通过区分APC荧光强度来区分不同细胞因子种类。本研究中检测IL-2、IFN-γ、TNF-α三种细胞因子分泌水平。具体检测方法参加该试剂盒说明书。检测结果通过FCAP Arrayv3软件进行分析，得到结果如图2、3、4所示。
结果表明，FM2(VL→VH)-BBz和FM4(VL→VH)-BBz与靶细胞作用后，IL-2、TNF-alpha、IFN-gamma等细胞因子均有很明显上升。
3.CAR-T与靶细胞作用后对靶细胞体外杀伤毒性
为验证CAR-T对糖基化CEA阳性靶细胞杀伤作用，本研究采用抗原表达阳性细胞LoVo、KATO3、CRYPT以及抗原低水平表达的SW620-CEA。试剂盒采用Cytotox96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega)，该方法原理为，用细胞内稳定表达且不分泌的乳酸脱氢酶(LDH)，代替传统的放射性元素，当细胞发生凋亡时，LDH会释放到胞外，通过检测被LDH氧化的formazan含量来判断上清中酶含量，从而说明细胞凋亡水平。效应细胞采用FM4(VL→VH)-BBz，效靶比分别采用1:2、1:5、1:10、1:20、1:30。靶细胞数量为10000个/孔，各组设置2个附孔，检测时间为作用后4小时。
其中，各实验组及对照组设置如下：
实验组：不同效靶比的CAR-T细胞及不同种靶细胞；
对照组一：各靶细胞LDH最大释放组；
对照组二：各靶细胞LDH自发释放组；
对照组三：效应细胞自发释放组；
具体实验方法参加试剂盒说明书。细胞毒性计算公式为：
特异性裂解＝(实验组-对照组2-对照组3)/(对照组1-对照组2)。
结果显示，FM4(VL→VH)-BBz对LoVo、KATO3、CRYPT三株细胞有较强的杀伤效果，而对SW620-CEA几乎无杀伤，相关结果如图9所示。
本研究可以说明，FM4(VL→VH)-BBz可以特异性识别糖基化CEA抗原，而对糖基化程度低的CEA抗原识别性较弱。
实施例6CAR-T对糖基化CEA阳性PDX肿瘤模型作用
对NCG小鼠(购于南京大学模式生物所)进行皮下注射糖基化CEA抗原阳性病人源性肿瘤细胞。病人肿瘤组织切除后，将表面的结缔组织、血管去除干净；沿中线剪开瘤块，将坏死组织，大钙化点及分泌物剔除干净，仔细清洗后将有一定硬度和韧性的质量好的肿瘤组织转入新鲜的冰冷的RPMI-1640培养基中。将肿瘤组织切割成约3x3 mm2的小肿瘤块，单侧皮下移植到NSG小鼠，待平均瘤体积达到160-180mm3时，对模式动物进行瘤内注射效应细胞。
本研究所用效应细胞为FM4(VL→VH)-BBz，对照组为未转染CAR的T细胞及等量PBS。注射前，将效应细胞用PBS洗两次，用PBS重悬至3E7/ml及1E8/ml两种浓度，分别记为低剂量组及高剂量组。每只小鼠瘤内注射30ul效应细胞/PBS。
本研究检测内容包括：
小鼠体重及瘤体积/3天/次；
小鼠外周血细胞因子检测/7天/次；
小鼠外周血CAR拷贝数/7天/次。
瘤体积结果如图11所示，从注射CAR-T第四天起，FM4(VL→VH)-BBz高剂量组瘤体积开始有下降趋势，而空T细胞组及PBS组无瘤体积无下降趋势。这说明CAR-T对糖基化CEA阳性肿瘤具有明显抑制作用。而注射CAR-T后，相对于空T细胞组及PBS对照组，注射CAR-T小鼠体重并无明显差异。
外周血中细胞因子分泌趋势如图10所示，CAR-T注射组可以在外周血中明显检测到多种人源细胞因子分泌(IL-2、TNF-α、IFN-γ)，随着肿瘤体积减少，细胞因子分泌量也逐渐降低，证明CAR-T对肿瘤细胞产生明显激活反应。
实施例6a.小鼠肿瘤模型
NSG小鼠(NOD scid IL2Rγnull)经右侧皮下接种1E7/只Lovo细胞(CCL229，ATCC)成瘤至200mm3-300mm3，肿瘤内注射对照PBMC及FM4(VL→VH)-BBz，具体分组如下：
回输PBMC或FM4BBz T细胞的NSG小鼠经尾静脉采血40ul(第三天及第七天)，用等体积PBS重悬后离心取上清用于细胞因子释放的检测(BD Cytometric Bead Array)，结果见图14。
如图14所示，回输FM4BBz无论高剂量或低剂量组均在外周血检测到IFNγ释放，提示FM4BBz与肿瘤细胞接触并释放细胞因子而对照组PBMC并无细胞因子释放(FM4BBzH/L组vs PBMC组，p值<0.001)。经每周测量肿瘤体积两次，35天测量，肿瘤生长曲线见图15。
如图15所示，FM4BBz高低剂量组均可以显著抑制肿瘤生长，提示了FM4BBz杀伤肿瘤效应。
实施例7：FM4(VL→VH)-BBz慢病毒感染NK92细胞
NK92细胞培养在含20％FBS，150IU/ml hIL-2的1640培养基中，按照实施例3中的方法用FM4(VL→VH)-BBz CAR病毒感染NK92细胞系，继续培养10天后，FM4(VL→VH)-BBz-NK92细胞用于杀伤实验和细胞因子释放实验检测，检测结果如图12和图13所示。
实施例8:抗体-细胞结合实验
将抗体FM2、FM4、FM5、FM6用含1％BSA的PBS缓冲液梯度稀释后与SW620-CEA或CRYPT细胞孵育(终浓度：50ug/ml，5ug/ml，0.5ug/ml，0.05ug/ml，0.005ug/ml，0.0005ug/ml)，室温1小时；用含1％BSA的PBS缓冲液将细胞洗2次后，加入Goat Anti Mouse IgG-APC孵育1小时；用含1％BSA的PBS缓冲液将细胞清洗2次后用PBS缓冲液重悬；使用BD AccuriC6 FACS读取细胞的APC荧光值。
将细胞荧光中位值(MFI)作为纵坐标，抗体浓度(ug/ml)作为横坐标，利用logistic equation拟合S型曲线，计算抗体结合EC50,如下表：
表六
结论：
SW620-CEA为在SW620细胞系中过表达的CEA(CEACAM5)，其表面的CEA为非糖基化状态；CRYPT为表达糖基化CEA的肿瘤细胞系。
从抗体细胞结合实验计算抗体的EC50来判断，抗体FM4可以特异性结合糖基化的CEA，且特异性强(选择性>100倍)。

Claims (6)

1.嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包括:
i)靶向糖基化CEA的抗原结合结构域；
ii)跨膜结构域，和
iii)细胞内信号传导结构域，其包含共刺激结构域，
其中所述靶向糖基化CEA的抗原结合结构域包含一重链可变区及一轻链可变区，其特征在于，
所述重链可变区包含：由SEQ ID NO:13所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:14所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:15所示的CDR-H3；同时所述轻链可变区包含：由SEQ ID NO:16所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:17所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:18所示的CDR-L3。
2.编码权利要求1所述的嵌合抗原受体的核酸分子。
3.表达权利要求1所述的嵌合抗原受体的细胞，其中所述细胞选自T细胞、NK细胞和B细胞。
4.特异性结合人糖基化CEA的单链抗体，所述单链抗体包含一重链可变区及一轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区包含：由SEQ ID NO:13所示的CDR-H1、由SEQ ID NO:14所示的CDR-H2和由SEQ ID NO:15所示的CDR-H3；同时所述轻链可变区包含：由SEQ ID NO:16所示的CDR-L1、由SEQ ID NO:17所示的CDR-L2和由SEQ ID NO:18所示的CDR-L3。
5.权利要求1所述的嵌合抗原受体或权利要求3所述的细胞或权利要求4所述的单链抗体在制备用于诊断肿瘤的试剂或治疗肿瘤的药物中的用途，其中所述肿瘤为消化道肿瘤。
6.权利要求5所述的用途，其中所述肿瘤选自胃癌、结直肠癌或食道癌。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019067425A1 (en) 2017-09-26 2019-04-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING CARDIAC DISEASE BY REDIRECTED T-CELL IMMUNOTHERAPIES
CN109517798B (zh) * 2018-11-28 2022-05-10 北京康爱瑞浩生物科技股份有限公司 一种嵌合cea抗原受体的nk细胞及其制备方法与应用
CN114746438A (zh) * 2019-09-23 2022-07-12 宾夕法尼亚大学董事会 通过靶向成纤维细胞激活蛋白(fap)使肿瘤组织破裂
CN114761036A (zh) * 2019-09-23 2022-07-15 宾夕法尼亚大学董事会 与小鼠和人成纤维细胞激活蛋白(fap)交叉反应的抗犬成纤维细胞激活蛋白单克隆抗体
JP7392200B2 (ja) * 2020-08-21 2023-12-05 シャンハイ、ケンパーソー、バイオテクノロジー、カンパニー、リミテッド グリコシル化ｃｅａｃａｍ５に特異的に結合した抗体
TWI804099B (zh) * 2021-12-10 2023-06-01 大陸商上海吉倍生物技術有限公司 特異性結合糖基化ｃｅａｃａｍ５的抗體及其製備方法
WO2024149381A1 (en) * 2023-01-13 2024-07-18 Shanghai Kaijin Biotechnology, Ltd Multi-specific polypeptide complexes
CN117088981B (zh) * 2023-08-15 2024-09-10 福建医科大学附属协和医院 抗b7-h3的单链抗体
CN118005795B (zh) * 2024-04-09 2024-06-28 天津旷博同生生物技术有限公司 一种抗人cd64抗体及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2280997A2 (en) * 2008-04-18 2011-02-09 Xencor, Inc. Human equivalent monoclonal antibodies engineered from nonhuman variable regions
CN104910279A (zh) * 2015-06-05 2015-09-16 重庆倍思益生物科技有限公司 靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其制备方法和应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3949712B2 (ja) * 1991-12-02 2007-07-25 メディカル リサーチ カウンシル 抗体セグメントレパートリー由来でファージに表示される抗自己抗体の産生
US5872215A (en) 1991-12-02 1999-02-16 Medical Research Council Specific binding members, materials and methods
CU23228A1 (en) * 2002-04-29 2007-09-26 Ct Ingenieria Genetica Biotech FRAGMENTS OF SPECIFIC ANTIBODIES FOR THE HUMAN CARCINOEMBRIONARY ANTIGEN (CEA) SEQUENCES OF ITS VARIABLE REGIONS AND VECTORS FOR THE MICROBIAL EXPRESSION OF THE SAME
EP1558284B1 (en) * 2002-10-08 2013-09-11 Immunomedics, Inc. Combination therapy with naked class iii anti-cea monoclonal antibodies and therapeutic agents
WO2007071426A1 (en) * 2005-12-21 2007-06-28 Micromet Ag Pharmaceutical compositions with resistance to soluble cea
JP5463036B2 (ja) * 2005-12-21 2014-04-09 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー 可溶性ｃｅａに対する抵抗性を有する医薬抗体組成物
CA2652703C (en) * 2006-06-07 2018-08-28 Bioalliance C.V. Antibodies recognizing a carbohydrate containing epitope on cd-43 and cea expressed on cancer cells and methods using same
KR101528013B1 (ko) * 2009-08-31 2015-06-16 로슈 글리카트 아게 친화성-성숙된 인간화된 항-ｃｅａ 단일클론 항체
US20130189268A1 (en) 2010-06-22 2013-07-25 Precision Biologics, Inc. Colon and pancreas cancer specific antigens and antibodies
CN104371019B (zh) * 2013-08-13 2019-09-10 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与glp-1r特异性结合的抗体及其与glp-1的融合蛋白质
JP6588922B2 (ja) * 2014-03-31 2019-10-09 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム ヒト化百日咳抗体及びその使用
EP3134437A1 (en) 2014-04-23 2017-03-01 Board of Regents, The University of Texas System Chimeric antigen receptors (car) for use in therapy and methods for making the same
CN104628859A (zh) * 2015-01-26 2015-05-20 佳德资本投资管理（Bvi）有限公司 抗人癌胚抗原抗体及其编码基因和应用
CN104829733B (zh) 2015-05-25 2018-06-05 广州百暨基因科技有限公司 抗原结合单元稳定的嵌合抗原受体及制备方法与应用
CN105331585A (zh) * 2015-11-13 2016-02-17 科济生物医药（上海）有限公司 携带pd-l1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞
CN105330750B (zh) 2015-11-20 2019-02-01 上海细胞治疗研究院 一种快速中止car-t细胞杀伤作用的分子刹车及其用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2280997A2 (en) * 2008-04-18 2011-02-09 Xencor, Inc. Human equivalent monoclonal antibodies engineered from nonhuman variable regions
CN104910279A (zh) * 2015-06-05 2015-09-16 重庆倍思益生物科技有限公司 靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
表达靶向癌胚抗原的嵌合受体的慢病毒载体构建及初步应用;余晓玲等;《第三军医大学学报》;20150615(第11期);第1096-1101页 *

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