CN105330750B - 一种快速中止car-t细胞杀伤作用的分子刹车及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫学和细胞生物学领域，涉及一种快速中止嵌合抗原受体修饰T细胞(T cell engineered with chimeric antigen receptors,CAR‑T)杀伤作用的分子刹车及其用途。具体地，该分子刹车作为一个元件插入CAR内部特定位置，能快速中止CAR‑T细胞对靶细胞的杀伤作用，从而有效提高CAR‑T治疗的安全性。本发明还涉及表达所述CAR的免疫反应细胞，以及所述免疫反应细胞用于制备治疗恶性肿瘤或者病毒感染性疾病的药物中的用途。
Description
技术领域
本发明属于免疫学和细胞生物学领域，涉及一种快速中止CAR-T细胞杀伤作用的分子刹车及其用途。具体地，该分子刹车作为一个元件插入嵌合抗原受体(chimericantigen receptors,CAR)内部特定位置，能快速中止嵌合抗原受体修饰T细胞对靶细胞的杀伤作用。本发明还涉及表达包含该分子刹车的CAR-T细胞用于恶性肿瘤及病毒感染性疾病的药物中的用途。
背景技术
嵌合抗原受体修饰的T细胞(chimeric antigen receptor engineering Tcells,简称CAR-T细胞)在难治性的B细胞恶性肿瘤的治疗中已取得巨大成功，完全缓解率达到90％；在其它实体瘤的治疗中也显示了良好的应用前景。但CAR-T细胞在临床应用中可能产生针对正常组织细胞的误攻击(脱靶效应，on target/off-tumor effect)，或由于大量释放炎性细胞因子引起细胞因子风暴等毒副作用。因而，如何提高CAR-T细胞治疗的安全性是一大棘手问题。
嵌合抗原受体(CAR)由一个单链抗体(scFv，由抗体VL区氨基酸序列和VH区氨基酸序列经Linker连接而成)，通过铰链结构与源于TCR复合体或者IgE高亲和受体的跨膜和胞内信号结构连接构成。表达CAR的T细胞可通过非MHC限制性途径与抗原反应。此外，与常规的TCR只能针对的蛋白抗原相比，CAR并不局限于蛋白抗原，还包括糖类和糖脂类TAA，而这些抗原不像蛋白抗原那么容易突变(Curr Opin Immunol 2009；21:215-23；Blood 2010；116:1035-44；Cancer Res2011；71:3175-81；J Cancer 2011；2:378-82)。自1989年，由Eshhar和其同事首次提出CAR的概念以来，其已经历了三个不同的发展阶段。第一代CAR受体，包含胞外特异识别肿瘤抗原的scFv片段，胞内激活信号由CD3ζ或FcεRIγ的ITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs)信号链来传递。但是第一代CAR受体缺乏T细胞的共刺激信号，导致T细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少。第二代CAR受体在第一代CAR的基础上增加了一个共刺激信号分子的胞内结构域，提供T细胞活化的两种信号，包括如CD28，CD134/OX40，CD137/4-1BB，lymphocyte-specificprotein tyrosine kinase(LCK)，inducible T-cell co-stimulator(ICOS)以及DNAX-activation protein 10(DAP10)等结构域，增强了T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，IL-2、IFN-γ以及GM-CSF增加，从而突破肿瘤微环境的免疫抑制、延长AICD(activationinduced cell death,AICD)。第三代CAR受体，在第二代CAR的基础上，增加了另外一种共刺激信号分子的胞内结构域，如在共刺激结构CD28和ITAM信号链的之间再融合一个二级共刺激分子如4-1BB，产生一个三重信号的CAR受体，第三代CAR受体改造的T细胞具有更好的效应功能和体内存活时间。
可以看到，第一代CAR只提供T细胞活化的第一信号，第二代与第三代的CAR是将T细胞激活所需的两个信号进行了合并，将第二信号CD28或/和4-1BB细胞内信号区域直接连接到CD3z分子，从而绕过了肿瘤细胞通常第二信号如B7等缺乏所引起T细胞不能激活的障碍，第一信号与第二信号合并后，大大提高了对T细胞激活、增殖及杀伤能力，使之疗效大幅度增加。但随之给临床治疗带来了一定风险，因为第二代与第三代CAR修饰后T细胞会针对某些少量表达肿瘤相关抗原的正常组织产生超强的反应，呈“瀑布”式过量增加，造成对正常组织的过激免疫反应。目前已有两个注射CAR修饰后的T细胞而导致死亡的病例报道。其一例应用第三代CAR(针对Her2)，患者由于急性肺水肿而死亡，其原因是CAR+的T细胞误攻击低表达Her2的肺上皮细胞(Mol Ther 2010；18:843-51)；另一例应用第二代CAR(针对CD19)，死亡原因复杂，但伴随着血液中细胞因子水平的增高(Hum Gene Ther2010；21:1039-42；Mol Ther 2010；18:666-8)。在一项临床试验中，11例肾细胞癌患者接受了特异性识别CAIX抗原的第一代CAR-T细胞治疗，其中5例在治疗后出现肝脏毒性，其毒性很可能是因为CAR修饰的T细胞以表达少量CAIX的胆管上皮细胞为目标，从而造成了对肝脏的损害(JClin Oncol.2006；24(13):e20-2)。
为解决这一安全性隐患，目前最常用方法是引入自杀机制，使CAR-T细胞在表达CAR之外，共表达一个自杀基因，例如：
1.代谢型自杀基因：是基于无毒性药物在基因修饰的细胞内转化为具有细胞毒性的化合物。例如磷酸化的核苷类似物人单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)与甘昔洛韦(GCV)相互作用，其产物以三磷酸形式进入DNA作用于DNA聚合酶，导致链终止反应引发细胞凋亡。HSV-TK/GCV也可通过CD95/CD95-L途径，使Fas死亡结构域相关蛋白(FADD)和caspase-8形成死亡诱导信号复合体诱导细胞凋亡(Blood.2007；110(12):3842-52)。TK自杀基因已经在异体淋巴细胞输注的临床试验中得到证实，它能消除急性和慢性抗移植物宿主病。
2.凋亡基因(如：半胱天冬酶)通过诱导凋亡来清除细胞。iCasp9自杀基因包含FKBP12-F36V结构域，可通过柔性Ser-Gly-Gly-Gly-Ser连接半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9，后者不含募集结构域。FKBP12-F36V包含一个FKBP结构域，在第36个氨基酸残基位点上苯丙氨酸替代了缬氨酸。它具有高选择性和亚纳摩尔亲和力，能够结合二聚合成配基，如其他惰性小分子AP1903。AP1903的使用能激活iCasp9蛋白形成二聚体，从而介导T细胞凋亡。iCasp9基因表达载体系统已经在临床前和Ⅰ期临床试验中展现出有效的诱导T细胞自杀效果(NEngl J Med 2011；365:1673-83)。
3.细胞表面分子(如CD20)通过抗体介导的细胞毒作用(ADCC)与补体介导的细胞毒作用(CDC)来清除细胞。将已上市的抗体(如美罗华，Rituxan)所识别的抗原靶标(如CD20)与CAR基因共同导入T细胞,CD20与CAR基因作为两个独立的表达框，分别整合到基因组中。使用美罗华抗体后，可以与外源表达细胞表面CD20分子结合，通过ADCC效应与CDC效应清除CAR-T细胞。这种自杀基因策略已在临床前模型中得到验证(Hum GeneTher.2004Jan；15(1):63-76)。
然而，CAR-T细胞脱靶引发的细胞因子“瀑布”效应速度非常快，这些自杀系统未必能及时发挥作用。所以，非常有必要对CAR自身的反应体系上进行改造，提高CAR-T细胞治疗的临床安全性。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，将抗原表位(下文中形象地称为“分子刹车”)插入到嵌合抗原受体基因特定位置，并在此基础上得到了一种新的嵌合抗原受体以及表达该嵌合抗原受体(被编码该嵌合抗原受体基因所修饰)的CAR-T细胞。本发明人惊奇地发现，在加入该抗原表位的活化剂(例如其抗体)之后，能快速中止CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用(下文中形象地称为“急刹车”)。
由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种嵌合抗原受体，依次包含信号肽、单链抗体、胞外铰链区1、跨膜区和胞内信号区，
其中，单链抗体包括轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)以及连接它们的铰链区1(注：将单链抗体中连接VL与VH的铰链区称为铰链区2，是为了与下面的嵌合抗原受体中单链抗体与跨膜区之间的铰链区1相区别)，
其中，所述单链抗体插入和/或连接有抗原表位；优选地，所述抗原表位不被所述单链抗体所特异性识别；
所述抗原表位的插入和/或连接并不降低或者阻断所述单链抗体与其所针对的抗原的特异性结合；但是当所述抗原表位与其特异性抗体结合后，能够降低或者阻断所述单链抗体与其所针对的抗原的特异性结合；
所插入和/或连接的抗原表位为单拷贝或者多拷贝(例如2、3、4或5个拷贝)；
所述抗原表位插入和/或连接的位置为一个或者多个(2、3、4或5个)；当所述位置为多个时，不同位置的抗原表位相同或者不同。
根据本发明任一项所述的嵌合抗原受体，其包括轻链可变区、重链可变区以及连接它们的铰链区2，
其中，所述单链抗体插入和/或连接有抗原表位，插入和/或连接的位置选自如下位置中的任意一个或者两个：
轻链可变区和铰链区2之间和铰链区2和重链可变区之间；
并且优选地，插入和/或连接的位置还包括选自如下位置中的任意一个或者两个：
单链抗体之前以及单链抗体之后；
所插入和/或连接的抗原表位为单拷贝或者多拷贝(例如2、3、4或5个拷贝)；当所述位置为2个、3个或4个时，不同位置的抗原表位相同或者不同；
优选地，所述抗原表位不被所述单链抗体所特异性识别。
根据本发明任一项所述的嵌合抗原受体，其中，单链抗体识别的抗原选自CD19、CD20、CEA、GD2(又称B4GALNT1，beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase 1)、FR(Flavin reductase)、PSMA(Prostate-specific membrane antigen)、gp100(PMELpremelanosome protein)、CA9(carbonic anhydrase IX)、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1(又称melan-A)、ERBB2、NY-ESO-1(又称CTAG1B，cancer/testis antigen 1B)、MAGE(Melanoma-associated antigen E1)家族蛋白、BAGE(B melanoma antigen family)家族蛋白、GAGE(growth hormone releasing factor)家族蛋白、AFP(alpha-fetoprotein)、MUC1(mucin 1,cell surface associated)、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3(又称ST8SIA1，ST8alpha-N-acetyl-neuraminide alpha-2,8-sialyltransferase 1)、PSCA(prostate stem cell antigen)、FSA(又称KIAA1109)、PSA(又称KLK3，kallikrein-related peptidase 3)、HMGA2、fetalacetylcholine receptor、LeY(又称FUT3)、EpCAM、MSLN(mesothelin)、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125(又称MUC16,mucin 16,cell surface associated)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC(又称SERPINB3)、AFU(又称FUCA1)、EBV-VCA、POA(又称VDR，vitamin D(1,25-dihydroxyvitamin D3)receptor)、β2-MG(beta-2-microglobulin)和PROGRP(GRP gastrin-releasing peptide)中的一种或多种；优选为CD19；优选地，所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，铰链区1的氨基酸序列如SEQ ID NO:24或者SEQ IDNO:25所示。
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT(SEQ ID NO:22)
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:23)
GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:24)
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:25)
根据本发明任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗原表位选自CD11a、CD15、CD19、CD20、CD25、CD44、CD47、CD52、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、MSLN(mesothelin)、GPIIb/IIIa、α4整合素、α4β7整合素、VEGF、IL-1、IL-6、IL12、RANKL以及BLyS的抗原表位(例如线性表位或空间表位)中的一种或多种；优选为CD20的抗原表位，例如如SEQ ID NO:26所示，或者如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示。
NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ(SEQ ID NO:26)
ANPS(SEQ ID NO:27)
YCYSI(SEQ ID NO:28)
根据本发明任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗原表位插入在轻链可变区和铰链区1之间，以及任选的选自如下的3个位置中的任意1个、2个或3个：
铰链区1和重链可变区之间、单链抗体之前以及单链抗体之后。
根据本发明任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗原表位与单链抗体直接相连或者通过蛋白linker相连；优选地，所述蛋白linker为至少2个甘氨酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个甘氨酸。
根据本发明任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于如下的(1)至(4)项中的任意一项或者多项：
(1)所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示；
(2)所述胞外铰链区1选自CD8的胞外铰链区、CD28的胞外铰链区和CD4的胞外铰链区的任意一种或多种；优选地为CD8的胞外铰链区；优选地，所述CD8的胞外铰链区如SEQ IDNO:30所示；
(3)所述跨膜区选自CD8的跨膜区、CD28的跨膜区和CD4的跨膜区的任意一种或多种；优选地，为CD8跨膜区；优选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；
(4)所述胞内信号区选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS、DAP10、CD3ζ和FcεRIγ任意一种或多种的胞内信号区，优选为4-1BB胞内信号区和CD3ζ胞内信号区，或者CD28胞内信号区和CD3ζ胞内信号区；优选地，所述4-1BB胞内信号区和CD3ζ胞内信号区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33所示；优选地，所述CD28胞内信号区和CD3ζ胞内信号区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:33所示。
MALPVTALLLPLALLLHAARPS(SEQ ID NO:29)
AAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI(SEQ IDNO:30)
YIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:31)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:32)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:33)
PFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:34)
根据本发明任一项所述的嵌合抗原受体，其氨基酸序列选自SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:19。
从本发明的实施例3的实验数据来看，分子刹车单独放在单链抗体之前以及单链抗体之后是没有急刹车功能的，但它们与放在铰链区1与VL和/或铰链区1与VH之间的抗原表位一起，可以增强急刹车功能。
本发明的另一方面涉及一种分离的核苷酸序列，其编码选自如下的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19；优选地，所述分离的核苷酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18和SEQ IDNO:20。
本发明的另一方面涉及一种重组表达载体，其含有上面任一项所述的分离的核苷酸序列。
本发明的另一方面涉及一种细胞，其表达本发明中任一项所述的嵌合抗原受体，或者含有本发明的重组表达载体；优选地，所述细胞为T细胞、单核细胞、NK细胞或中性粒细胞；优选地，所述T细胞选自细胞毒性T淋巴细胞、NKT细胞、辅助T细胞以及抑制/调节性T细胞。
转基因修饰方法包括病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。在本发明的一个实施方案中，所述方法为电穿孔。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含上面任一项所述的细胞，以及任选的药学上可接受的辅料。
本发明的另一方面涉及一种试剂盒，其包含本发明的药物组合物，以及至少一种抗体，所述抗体能够特异性地识别所述抗原表位；优选地，所述抗体为美罗华抗体。
本发明的另一方面涉及本发明中任一项所述的嵌合抗原受体在制备转基因修饰免疫细胞中的用途；优选地，所述免疫细胞选自T细胞、单核细胞、NK细胞或中性粒细胞；优选地，所述T细胞选自细胞毒性T淋巴细胞、NKT细胞、辅助T细胞以及抑制/调节性T细胞。
本发明的另一方面涉及本发明中任一项所述的嵌合抗原受体或者本发明任一项所述的细胞在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗恶性肿瘤或者病毒感染性疾病的药物中的用途；优选地，所述恶性肿瘤选自肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌和前列腺癌中的任意一种或多种；优选地，所述病毒为选自艾滋病病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、EB病毒(Epstein-Barr virus)、乳头瘤病毒(Papillomavirus)、疱疹病毒(Herpesvirus)和巨细胞病毒(cytomegalovirus)中的任意一种或多种。
本发明的再一方面涉及一种预防和/或治疗和/或辅助治疗恶性肿瘤或者病毒感染性疾病的方法，包括给予受试者有效量的本发明中任一项所述的单链抗体或者本发明中任一项所述的嵌合抗原受体或者本发明任一项所述的细胞的步骤。
本发明中，
术语“嵌合抗原受体”是人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。
术语“单链抗体”(single-chain antibody variable region fragment,scFv)是指由抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列和重链可变区(VH区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。
术语“抗原表位”，又称抗原决定簇(antigenic determinant，AD)，指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。一般情况下，一个多肽表位含5～6个氨基酸残基抗原表位，可被特定的抗体所识别。抗原表位的性质、数目和空间构型决定抗原的特异性。而根据抗原表位的氨基酸连续性的不同，可以分为线性表位与空间表位，线性表位是一段序列相邻的氨基酸组成的表位，而空间表位是数个不相邻，但在空间结构上相邻的氨基酸组成的表位。
术语“Linker”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。
术语“CD19”是指人白细胞分化抗原19，它在NCBI GeneBank的ID号为930，有2个异构体(cDNA序列/蛋白序列)，分别为NM_001178098.1/NP_001171569.1，NM_001770.5/NP_001761.3。当提及CD19的氨基酸序列时，其包括，CD19蛋白的全长或者具有CD19功能的CD19的片段；还包括所述全长或片段的融合蛋白。并且，本领域技术人员理解，在CD19的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。并且，当描述CD19的蛋白序列片段时，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。
术语“特异性结合”是指抗体或者抗原结合片段与其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。“特异性识别”具有类似的含义。
术语“CD20”是指人白细胞分化抗原20，它在NCBI GeneBank的官方名称为MS4A1，ID号为931，有2个异构体(cDNA序列/蛋白序列)，分别为NM_021950.3/NP_068769.2,NM_152866.2/NP_690605.1。当提及CD20的氨基酸序列时，其包括，CD20蛋白的全长或者具有CD20功能的CD20的片段；还包括所述全长或片段的融合蛋白。并且，本领域技术人员理解，在CD20的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。并且，当描述CD20的蛋白序列片段时，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。
术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
发明的有益效果
本发明将一个可被特定抗体识别的抗原表位多肽作为分子刹车插入嵌合抗原受体单链抗体铰链与轻链可变区或/和重链可变区之间。不拘于理论的限制，在加入相应的抗体后，能结合到嵌合抗原受体的分子刹车上，促使嵌合抗原受体的单链抗体区段发生构象改变，无法有效识别嵌合抗原受体所针对的靶标，导致嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)无法有效识别并杀伤特定靶细胞，从而快速中止CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用，提高安全性，故本发明形象地称之为急刹车作用，即及时中止效应。同时，在体内环境下，静脉注射相应的抗体，能结合到相应CAR-T细胞表面，通过ADCC效应或CDC相应，将CAR-T细胞清除。通过这两方面，瞬时或长时效应的结合，能显著提高CAR-T细胞治疗的安全性。
而现有技术使用的CD20刹车是将CD20与CAR基因作为两个独立的表达框插入基因组中，所以它们的功能是完全独立的，即CD20作为分子刹车元件，加入美罗华抗体后通过ADCC与CDC效应清除CAR-T细胞；CAR基因负责介导杀伤作用。两者间不存在功能交叉，换句话说，加入美罗华抗体后，对CAR基因介导的杀伤作用是没有直接影响的，只是将CAR基因所依附的T细胞缓慢清除。所以，只有慢刹车功能，没有急刹车的功能。
除T细胞外，本发明同样适用于其它免疫反应细胞，例如单核细胞、NK细胞、中性粒细胞。
附图说明
图1：含分子刹车的各型CD19特异性CAR(CAR1920-1～CAR1920-10)的模式图。
图2：CAR1920-2表达载体结构图(简称pNB328-CAR1920-2)。
图3：CAR1920-1-T细胞中CAR-T细胞阳性率检测。3A，同型对照；3B，CAR阳性率。同型对照是指与目标流式检测抗体相同种属来源、携带同样荧光标记、但不具备结合特异性的一种流式抗体，可以确定流式检测的基线，高于基线的部分才能作为阳性群体。在具体操作上，只要选取一管相同的细胞，加入同型对照抗体，进行平行试验就可。
图4：CAR1920-T细胞分子刹车体外功能的检测。Rituxan，美罗华抗体；IgG，人IgG对照抗体。图4A，CAR1920-2；图4B，CAR1920-3。
图5：CAR1920-T细胞分子刹车的体内功能检测。
图6：CAR1920-T细胞的抗原竞争检测。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：含CD20分子刹车的CD19特异性CAR的设计与表达载体的构建
根据CD20分子刹车的不同插入位置，设计构建10种类型的CD19特异性CAR(模式图见图1)，拼接成整个融合的氨基酸序列与编码DNA表达框，分别命名为CAR1920-1、CAR1920-2、CAR1920-3CAR1920-4、CAR1920-5、CAR1920-6、CAR1920-7、CAR1920-8、CAR1920-9、CAR1920-10。其中:
CAR1920-1的氨基酸残基序列为：(546aa)
MALPVTALLLPLALLLHAARPS GGGGGGGGGDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:1)。
其中缩小的为信号肽，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位，单下划线的为linker，双下划线的为CD19单链抗体的铰链。
CAR1920-1的核苷酸编码序列为：(1662bp)
GCCACC GGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGATAA(SEQ ID NO:2)
其中加虚线下划线的为信号肽编码序列，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位的编码序列，单下划线的为linker编码序列，双下划线的为CD19单链抗体的铰链编码序列，加方框的分别为EcoRI及SalI酶切位点。
CAR1920-2的氨基酸残基序列为：(537aa)
MALPVTALLLPLALLLHAARPSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:3)。
其中缩小的为信号肽，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位，双下划线的为CD19单链抗体的铰链。
CAR1920-2的核苷酸编码序列为：(1635bp)
GCCACC GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGATAA(SEQ ID NO:4)
其中加虚线下划线的为信号肽编码序列，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位的编码序列，双下划线的为CD19单链抗体的铰链编码序列，加方框的分别为EcoRI及SalI酶切位点。
CAR1920-3的氨基酸残基序列为：(537aa)
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其中缩小的为信号肽，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位，双下划线的为CD19单链抗体的铰链。
CAR1920-3的核苷酸编码序列为：(1635bp)
GCCACC GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGATAA(SEQ ID NO:6)
其中加虚线下划线的为信号肽编码序列，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位的编码序列，双下划线的为CD19单链抗体的铰链编码序列，加方框的分别为EcoRI及SalI酶切位点。
CAR1920-4的氨基酸残基序列为：(546aa)
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其中缩小的为信号肽，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位，单下划线的为linker，双下划线的为CD19单链抗体的铰链。
CAR1920-4的核苷酸编码序列为：(1662bp)
GCCACC GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAGGTGGAGGTGGAGGTG GAGGTGGAGGT TTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGATAA(SEQ ID NO:8)
其中加虚线下划线的为信号肽编码序列，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位的编码序列，单下划线的为linker编码序列，双下划线的为CD19单链抗体的铰链编码序列，加方框的分别为EcoRI及SalI酶切位点。
CAR1920-5的氨基酸残基序列为：(571aa)
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其中缩小的为信号肽，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位，单下划线的为linker，双下划线的为CD19单链抗体的铰链。
CAR1920-5的核苷酸编码序列为：(1737bp)
GCCACC GGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGATAA(SEQ ID NO:10)
其中加虚线下划线的为信号肽编码序列，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位的编码序列，单下划线的为linker编码序列，双下划线的为CD19单链抗体的铰链编码序列，加方框的分别为EcoRI及SalI酶切位点。
CAR1920-6的氨基酸残基序列为：(562aa)
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其中缩小的为信号肽，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位，双下划线的为CD19单链抗体的铰链。
CAR1920-6的核苷酸编码序列为：(1710bp)
GCCACC GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGATAA(SEQ ID NO:12)
其中加虚线下划线的为信号肽编码序列，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位的编码序列，双下划线的为CD19单链抗体的铰链编码序列，加方框的分别为EcoRI及SalI酶切位点。
CAR1920-7的氨基酸残基序列为：(596aa)
MALPVTALLLPLALLLHAARPS GGGGGGGGGDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:13)。
其中缩小的为信号肽，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位，单下划线的为linker，双下划线的为CD19单链抗体的铰链。
CAR1920-7的核苷酸编码序列为：(1812bp)
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其中加虚线下划线的为信号肽编码序列，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位的编码序列，单下划线的为linker编码序列，双下划线的为CD19单链抗体的铰链编码序列，加方框的分别为EcoRI及SalI酶切位点。
CAR1920-8的氨基酸残基序列为：(523aa)
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其中缩小的为信号肽，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位，单下划线的为linker，双下划线的为CD19单链抗体的铰链。
CAR1920-8的核苷酸编码序列为：(1593bp)
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其中加虚线下划线的为信号肽编码序列，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位的编码序列，单下划线的为linker编码序列，双下划线的为CD19单链抗体的铰链编码序列，加方框的分别为EcoRI及SalI酶切位点。
CAR1920-9的氨基酸残基序列为：(523aa)
MALPVTALLLPLALLLHAARPSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:17)
其中缩小的为信号肽，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位，单下划线的为linker，双下划线的为CD19单链抗体的铰链。
CAR1920-9的核苷酸编码序列为：(1593bp)
GCCACC GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGTGGA GGTGGAGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGATAA(SEQ ID NO:18)
其中加虚线下划线的为信号肽编码序列，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位的编码序列，单下划线的为linker编码序列，双下划线的为CD19单链抗体的铰链编码序列，加方框的分别为EcoRI及SalI酶切位点。
CAR1920-10的氨基酸残基序列为：(557aa)
MALPVTALLLPLALLLHAARPS GGGGGGGGGDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:19)
其中缩小的为信号肽，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位，单下划线的为linker，双下划线的为CD19单链抗体的铰链。
CAR1920-10的核苷酸编码序列为：(1695bp)
GCCACC GGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGTGGAGGC GGTGGAGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGATAA(SEQ ID NO:20)
其中加虚线下划线的为信号肽编码序列，加粗的为CD20商品化抗体美罗华识别的CD20抗原表位的编码序列，单下划线的为linker编码序列，双下划线的为CD19单链抗体的铰链编码序列，加方框的分别为EcoRI及SalI酶切位点。
分别按SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20的DNA编码序列，委托上海杰瑞生物科技有限公司全基因合成，插入pNB328载体。EcoRI-SalI位点，转化到E.coli(Top10,购自invitrogen公司)，经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得各重组表达载体的高品质质粒，即pNB328-CAR1920-1，pNB328-CAR1920-2(载体图谱见图2)，pNB328-CAR1920-3，pNB328-CAR1920-4，pNB328-CAR1920-5，pNB328-CAR1920-6，pNB328-CAR1920-7，pNB328-CAR1920-8，pNB328-CAR1920-9，pNB328-CAR1920-10。
其中，pNB328载体按如下序列委托上海杰瑞生物科技有限公司全基因合成:
GTAGTACATCACCATCTGGGGCTTGCCGGTGCTCTCGTTGATGCTGGCGTCCTCGTCGCAGCTGCTCAGCAGGTACACCATCTTGGCGGGCTTGGGCTTGTAGCTCACCAGGGTCAGGGGGCCGTCGAAGCAGAACATGCTGGTGCCCACGGGGCGGCTGCGGCTGTTCTTCAGCACCTCGGGGATCTCGCGCTTGTTGCTGCGCACGGTGCCCACGATGGTCAGCTTGTAGGGCTCCTGCAGCAGGTTCTTGGCCAGGGGGATGCTGGTGAACCAGTTGTCGCAGGTGATGTTGCGGCAGCTGCCGTGCACGGGCTTGCTCAGCTCCTTCACGTAGTACTCGCCCAGGGGCACGCCGTTGGTCTGGGTGCCGCGGCCCAGGTAGGGCATGCCGTTGATCATGTACTTGGTGCCGCTGTCGCACATCATCAGGATCTTGATGCCGTACTTGCTGGGCTTGTTGGGGATGTACACGCGGAAGGGGCAGCGGCCGCGGAAGCCCAGCAGCTGCTCGTCGATGGTCAGGTGGGCGCCGGGGGTGTAGTTCTGGATGCACTGGTGGATGAACAGGTCCCAGATCTTGCGCACGGGGGTGAACACGTCGTTCTCGCGCAGGGTGGGGCGGATGCTCTTGTCGTCCATGCGCAGGCAGCGGATCAGGAAGTCGAAGCGGTCGCGGCTCATCACGCTCACGTACACCATGCTCAGGCTGCGGTCGAACAGGTCGTCGGTGCTCATGTGGTTGTCCTTGCGCACGGCGGTCATCACCAGGATGCCGAAGAAGGCGTAGATCTCGTCCTCGTTGGTGTCGCGGAAGGTGGCGCTGGTCATGCTCTCGCGGCGCTTCAGGCTGATCTCGGCGTTGGTCCACTTCACGATCTCGCTGATGATCTCGTCGGTGAAGAACAGCTTGAAGCACAGCAGGGGGTCGTAGATGTTGCGGCACATGCGGGTGGTGCCGCGCTGGCTGCGCACGATGTTCAGGGCGCTCACGCGGCTGCGGCGGGTGGGCTTGCTGGTGCTCCAGCAGTGCTTGTTCTTGCCGCGGATGGTGCGCTGGGGCAGGGTCAGGATGCGGTTGCTGGCCAGGCTGCTGCCGGGCTGCTCGATCACGTTCTGCTCGTCCAGGATCTCGCTGCCGCTGCTGGTGGGCTGCACCTCGTGCACCTCGTCGATGAAGGCCTCCTCGGTGTCGCTCTGCACGTCGTCCTCGCTCACGTGGTCGCTCACCTCGCTGTCGCTGTCCTCGCCCACCAGCTCGTCGTCGCTCTGCAGCAGGGCGCTCAGGATGTGCTCGTCGTCCAGGCTGCTGCCGTCCAACTTGACCCTCTTGGCAGCAGGGCCCATGGTGGCAAGCTTGATCTGCGTTCTACGGTGGTCAGACCGAAGACTGCGACGGTACCGACGCTGGTCGCGCCTCTTATACCCACGTAGAACGCAGCTCAGCCAATAGAATGAGTGCCAATATGGAATTTCCAGGGGAAAACCGGGGCGGTGTTACGTTTTGGCTGCCCTTACACTTCCCATTGACGTGTATTGGCTCGAGAACGGTACTTTCCCATTAATCAGCTATGGGAAAGTACCGTTTAAAGGTCACGTTGCATTAGTTTCAATAGCCCATTGACGTCAATGGTGGGAAAGTACATGGCGTTTTAATTTAATGGCTGGAAAAACCCAATGACTCACCCCTATTGACCTTATGTACGTGCCAATAATGGGAAAAACCCATTGACTCACCCCCTATTGACCTTTTGTACTGGGCAAAACCCAATGGAAAGTCCCTATTGACTCAGTGTACTTGGCTCCAATGGGACTTTCCTGTTGATTCACCCCTATTGACCTTATGTACTGGGCAAAACCCATTGGAAAGTCCCTAATGACTCAGTATATTTAATTAAGAGGGGGAGACCAAAGGGCGAGACGTTAAGGCCTCACGTGACATGTGAGCAAAAGGCCAGCGAAAGGCCAGGAACCGTAGAAAGCCCCGCGTTGCTGCCGTTTTTCCATAGGTTCCGCCGCCCTGACGAGCATCACAAGAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCCAAACCCGACAGGACTATGAAGATACAAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCTGCTTACGGGATACCTGTCCGCCTTTCACCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTATTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGCCGTCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCTCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCTCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAAGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGTACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCTTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAGAAGAACCGTGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTCGTCTCGTCGCGGTCTCCTCCCATGCATGGGCGCGCCTTAACCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGCGTAAGATTGACGCATCTCTAGAAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGTGGAGGCGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTGTTCCCGAGGGTGGTGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGATCACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGGGACCGGCGCCTACGAATTCTGAGCTAGCGATGGATCCTGCACTAGTGCTGTCGACCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAATAAATGCTTTATTTGTGAAATATGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCTTATTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTCTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAGCATGCGTCAATCTTACGCAGACTATCTATCTAGGGTTAAATCGATTTAGAAGCAGCTCTGGCACATGTCGATGTTGTGCTCGCGGCAGATCACCTTCTTGCACTTCTTGCAGCTGGCGCTGGCCTTGCGGCGGATCTTGCTGCGGCAGTAGGTGCAGTAGGTGCGCTTCTTCATCACGGGCTCCTCGGTGCTGTCGTCGCTGGTGCCGGGCACCTCCTTCGGCAGGATGTTGCTGATGTTGTCGCGCAGGTAGCGCTTCAGGGTGGGTGCCTCCAGGCGCTTGCGCATGAAGCTGCTGGTCAGGCCCATGTACAGGTTGCGCATGAACTTCTTGCGGCTCTGCACCTTCTCGCCCTTGCTGCTCACGTTGTGGCTGTAGATGATGAAGCTGTTGATGCAGGCGATGTTGATCATGCCGTACAGCAGGGCCATGGGCCAGCGGTTGGTCTTGCGGCTGCAGGTCATCACGCTGCACATCTGGTCCAGGGTGTCCACGCCGCCCTTGGTCTGGTT(SEQID NO:35)
实施例2：T细胞的遗传修饰
准备1×107新鲜分离获得的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclearcell,PBMC)，通过Lonza 2b-Nucleofector仪器，分别将6μg的实施例1中制得的pNB328-CAR1920-1，pNB328-CAR1920-2，pNB328-CAR1920-3，pNB328-CAR1920-4质粒转染到细胞核中，置37℃、5％CO2孵箱培养；6小时后转移到含30ng/mL抗CD3抗体、3000IU/mL IL-2(购自Novoprotein公司)的6孔板中，置37℃、5％CO2孵箱培养。待细胞长满后，按1:5的比例传代培养。3代后，应用流式细胞仪检测CAR阳性的细胞比例(使用山羊抗小鼠Fab2’抗体，购自美国Jackson公司)。
结果显示，各类型包含CD20分子刹车的CAR-T细胞(即CAR1920-1-T，CAR1920-2-T，CAR1920-3-T，CAR1920-4-T)的比例分别为42.9％(见图3A，3B)、45.7％、39.5％、47.2％。表明含有CD20分子刹车的各型CD19特异性CAR-T细胞已成功获得。作为下面的实施例3-5中的效应细胞。
实施例3：含CD20分子刹车的CAR19-T细胞的体外刹车功能检测
1.稳定表达CD19基因的HEK293细胞(靶细胞)的构建
1)按CD19胞外区及跨膜区的DNA编码序列，委托上海杰瑞生物科技有限公司全基因合成，插入pNB328载体，构建获得的载体命名为pNB328-CD19。
CD19胞外区及跨膜区的编码序列如下：(960bp)
ATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATAACGCTGTGCTGCAGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTGCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCCTGGCCATCTGGCTTTTCATCTTCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCAGGACCTCACCATGGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGAGACGGGTCTGTTGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTATTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCAGTACTATGGCACTGGCTGCTGAGGACTGGTGGCTGGAAGGTCTCAGCTGTGACTTTGGCTTATCTGATCTTCTGCCTGTGTTCCCTTGTGGGCATTCTTCATCTTCAAAGAGCCCTGGTCCTGAGG(SEQ ID NO:22)。
2)准备5×106HEK293细胞(购自美国标准生物品收藏中心，ATCC)，通过Lonza 2b-Nucleofector仪器，分别将6μg的pNB328-CD19质粒转染到细胞核中，置37℃、5％CO2孵箱培养。待细胞长满后，按1:5的比例连续传代培养，5代后，应用有限稀释法进行单克隆筛选。待单克隆细胞长至一定数量后，通过流式细胞仪进行筛选(应用小鼠抗人CD19抗体，购自BD公司)，表达量高且纯度高的细胞克隆，即为稳定表达CD19的293细胞(原始HEK293细胞CD19表达阴性)，命名为293-CD19，作为本实施例的下面实验中的靶细胞。
2.分子刹车功能的体外验证
在RTCA细胞增殖板(购自美国ACEA Biosciences公司)上按10000个/孔的比例铺293-CD19细胞，置于xCELLigence RTCA DP多功能实时无标记细胞分析仪上，实时记录细胞的生长情况。24小时后，对4种效应细胞CAR1920-1-T，CAR1920-2-T，CAR1920-3-T，CAR1920-4-T而言，每种效应细胞分别按4:1、2:1、1:1、0:1的效靶比(效应细胞与靶细胞的数量之比)加入，试验组中加入50μg/ml的美罗华抗体(购自Roche公司)，对照组中加入50μg/ml的人IgG抗体(购自上海翊圣生物科技有限公司)，重新置于xCELLigence RTCA DP多功能实时无标记细胞分析仪上进行细胞生长情况检测。
结果表明，对于CAR1920-2-T效应细胞，0:1条件下(即不加效应细胞)，293-CD19细胞持续生长，细胞指数(由xCELLigence RTCA DP多功能实时无标记细胞分析仪测得的参数，数值越高表明细胞状态越佳)持续升高；在加入相应比例的效应细胞后，细胞指数相对于0:1组，显著降低。而在2:1及1:1条件下，美罗华组细胞指数显著高于人IgG抗体组，表明在加入CD20分子刹车的活化剂----美罗华抗体后，CAR19-T细胞对靶细胞的杀伤活性被明显抑制(图4A)。而CAR1920-3，有一定急刹车功能，但没有CAR1920-2强，在2:1及1:1条件下，美罗华组细胞指数显著高于人IgG抗体组(图4B)。这一结果表明，CAR1920-2-T、CAR1920-3-T能快速中止CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用。但是对于其它2种类型的CAR19-T细胞(CAR1920-1-T、CAR1920-4-T)，加入美罗华抗体后，CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用未能被有效削弱。
另外，将抗体与CAR-T细胞共孵育，就能大幅削弱CAR-T细胞对靶细胞的杀伤能力，这表明加入美罗华抗体后，能即时阻断CAR基因中单链抗体与特定靶标的结合，从而快速中止CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用。由于在这个过程中没有NK、巨噬细胞、补体等的参与，所以没有ADCC、CDC效应在起作用，这一功能相当于急刹车，这是现有技术所不具备的。
此外，本实施例也显示了插入抗原表位不影响单链抗体对特定靶标的识别。
实施例4：含CD20分子刹车的CAR19-T细胞的体内刹车功能检测
在BABL/c裸鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)尾静脉注射CAR1920-2细胞(注射剂量5×106)，3天后静脉注射100μg的美罗华抗体或人IgG对照抗体。12个小时后，采集血液及骨髓样品，用流式细胞仪检测CAR19阳性细胞的比例。
结果如图5所示。
结果表明，相对于注射人IgG抗体的对照组，在注射美罗华抗体后，输注的CAR-T细胞在血液与骨髓中的比例显著降低，表明CD20分子刹车在体内也能发挥作用，可以通过ADCC及CDC效应将含有CD20表位的CAR-T细胞清除。
此外，在体内环境下，除快速中止功能外，也可像现有技术一样，通过ADCC、CDC效应，将相应的CAR-T细胞在相对较长的时间内清除，相当于慢刹车的功能。
实施例5：CD20分子刹车的竞争试验
按实施实例2中所示的T细胞遗传修饰方法，将CAR1920-2-T、pNB328-CAR1920-5，pNB328-CAR1920-6，pNB328-CAR1920-7，pNB328-CAR1920-8，pNB328-CAR1920-9，pNB328-CAR1920-10导入原代T细胞，获得CAR1920-2-T、CAR1920-5-T、CAR1920-6-T、CAR1920-7-T、CAR1920-8-T、CAR1920-9-T、CAR1920-10-T等包含7种不同类型设计分子刹车的CD19特异性CAR-T细胞。按100μg/ml的量加入美罗华抗体或人IgG对照抗体，4度孵育30min，PBS洗涤2次；然后分别加入2.5μg CD19-6His蛋白(购自Sinobiological公司)，4度孵育30min，PBS洗涤2次去除游离CD19-6His蛋白；最后分别加入5μL anti-6His-APC抗体(购自R&D公司)，4度孵育30min，PBS洗涤三次后，通过流式细胞仪检测APC阳性细胞的比例。结果显示，相对于对照抗体，预先处理了美罗华抗体的CAR-T细胞，APC的信号显著下降(见图6)，其中CAR1920-2、CAR1920-5、CAR1920-8、CAR1920-10下降比例相对较大。表明，加入美罗华抗体后，能有效结合到包含CD20分子刹车的CAR-T细胞表面，阻碍CAR-T细胞与其CD19靶标分子的结合。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (29)
1.一种嵌合抗原受体，依次包含信号肽、单链抗体、胞外铰链区1、跨膜区和胞内信号区，
其中，所述单链抗体包括轻链可变区、重链可变区以及连接它们的铰链区2，
其中，所述单链抗体插入和/或连接有抗原表位；
所述抗原表位的插入和/或连接并不降低或者阻断所述单链抗体与其所针对的抗原的特异性结合；但是当所述抗原表位与其特异性抗体结合后，能够降低或者阻断所述单链抗体与其所针对的抗原的特异性结合；
所插入和/或连接的抗原表位为单拷贝、2拷贝或3拷贝；
所述抗原表位插入和/或连接的位置为一个或者多个；当所述位置为多个时，不同位置的抗原表位相同或者不同；
其中，抗原表位插入和/或连接的位置为：
轻链可变区和铰链区2之间；
轻链可变区和铰链区2之间和铰链区2和重链可变区之间；
轻链可变区和铰链区2之间和单链抗体之前；
或者，
轻链可变区和铰链区2之间、铰链区2和重链可变区之间和单链抗体之前；
其中，
所述的单链抗体，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，铰链区2的氨基酸序列为SEQ ID NO:24或者SEQ ID NO:25所示；
所述抗原表位为CD20的抗原表位，并且所述CD20的抗原表位的氨基酸序列如SEQ IDNO:26所示，或者如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原表位与单链抗体直接相连或者通过蛋白linker相连。
3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其中，所述蛋白linker为至少2个甘氨酸。
4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其中，所述蛋白linker为2、3、4、5、6、7、8、9或10个甘氨酸。
5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其包含如下的(1)至(4)项中的任意一项或者多项：
(1)所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示；
(2)所述胞外铰链区1选自CD8的胞外铰链区、CD28的胞外铰链区和CD4的胞外铰链区的任意一种或多种；
(3)所述跨膜区选自CD8的跨膜区、CD28的跨膜区和CD4的跨膜区的任意一种或多种；
(4)所述胞内信号区选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS、DAP10、CD3ζ和FcεRIγ任意一种或多种的胞内信号区。
6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中，第(2)项中，所述胞外铰链区1为CD8的胞外铰链区。
7.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中，第(2)项中，所述CD8的胞外铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示。
8.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中，第(3)项中，所述跨膜区为CD8跨膜区。
9.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中，第(3)项中，所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示。
10.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中，第(4)项中，所述胞内信号区为4-1BB胞内信号区和CD3ζ胞内信号区，或者为CD28胞内信号区和CD3ζ胞内信号区。
11.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体，其中，所述4-1BB胞内信号区和CD3ζ胞内信号区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33所示。
12.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体，其中，所述CD28胞内信号区和CD3ζ胞内信号区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:33所示。
13.一种嵌合抗原受体，其氨基酸序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19。
14.一种分离的核苷酸序列，其编码选自如下的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19。
15.根据权利要求14所述的分离的核苷酸序列，其选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20。
16.一种重组表达载体，其含有权利要求14或15所述的分离的核苷酸序列。
17.一种细胞，其表达权利要求1至13中任一权利要求所述的嵌合抗原受体，或者含有权利要求16所述的重组表达载体。
18.根据权利要求17所述的细胞，其为T细胞、单核细胞、NK细胞或中性粒细胞。
19.根据权利要求18所述的细胞，其中，所述T细胞选自细胞毒性T淋巴细胞、NKT细胞、辅助T细胞以及抑制/调节性T细胞。
20.一种药物组合物，其包含权利要求17至19中任一权利要求所述的细胞，以及任选的药学上可接受的辅料。
21.一种试剂盒，其包含权利要求20所述的药物组合物，以及至少一种抗体，所述抗体能够特异性地识别所述抗原表位。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中，所述抗体为美罗华抗体。
23.权利要求1至13中任一权利要求所述的嵌合抗原受体或者权利要求16所述的重组表达载体在制备转基因修饰的免疫细胞中的用途。
24.根据权利要求23所述的用途，其中，所述免疫细胞选自T细胞、单核细胞、NK细胞或中性粒细胞。
25.根据权利要求24所述的用途，其中，所述T细胞选自细胞毒性T淋巴细胞、NKT细胞、辅助T细胞以及抑制/调节性T细胞。
26.权利要求17至19中任一权利要求所述的细胞在制备预防和/或治疗恶性肿瘤或者病毒感染性疾病的药物中的用途。
27.根据权利要求26所述的用途，其中，所述恶性肿瘤选自肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌和前列腺癌中的任意一种或多种。
28.根据权利要求26所述的用途，其中，所述病毒为选自艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、EB病毒、乳头瘤病毒、疱疹病毒和巨细胞病毒中的任意一种或多种。
29.根据权利要求26至28中任一权利要求所述的用途，其中，所述治疗为辅助治疗。
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