CN107267455A - 一种嵌合抗原受体nk细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，该方法包括如下步骤：采集患者外周富集血，加入肝素抗凝，将外周血与Ficoll‑Paque PLUS单核细胞分离液混合；混合液离心后，取沉淀加入PBS重悬；将S1中得到的核细胞加入PBS洗涤两次后装入离心管中，离心管中加入8％灭活血清和1000U/mL IFN‑γ，培养24‑28h；于S3的离心管中补加IL‑1100U/mL及抗CD3单抗350ng/mL，继续培养10‑12d，得到NK细胞。本发明公开了一种NK细胞的体外培养方法，从患者体内采集外周血后通过Ficoll法分离单个核细胞，体外培养得到NK细胞，通过加入生长因子IL‑1和抗CD3单抗，避免细胞增殖不稳定，为病毒感染细胞提供有利环境。

Description

一种嵌合抗原受体NK细胞的制备方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，特别是涉及一种嵌合抗原受体NK细胞的制备方法。
背景技术
NK细胞确切的来源还不十分清楚，一般认为直接从骨髓中衍生，其发育成熟依赖于骨髓的微环境。小鼠和人的体外实验表明，胸腺细胞在体外IL-2等细胞因子存在条件下培养也可诱导出NK细胞。小鼠脾脏在体内IL-3诱导下可促进NK细胞的分化。NK细胞主要分布于外周血中，占PBMC 5-10％，淋巴结和骨髓中也有NK活性，但水平较外周血低。
由于NK细胞具有部分T细胞分化抗原，如80～90％NK细胞CD2+，20-30％NK细胞CD3+(表达CD3ζ链)，30％NK细胞CD8+(α/α)和75-90％NK细胞CD38+，而且NK细胞具有IL-2中亲和性受体，在IL-2刺激下可发生增殖反应，活化NK细胞可产生IFN-γ，因此一般认为NK细胞与T细胞在发育上关系更为密切。
发明内容
本发明的目的在于提供一种嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，避免细胞增殖不稳定，为病毒感染细胞提供有利环境。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，该方法包括如下步骤：
S1、采集患者外周富集血，加入肝素抗凝，将外周血与Ficoll-Paque PLUS单核细胞分离液混合；
S2、混合液离心后，取沉淀加入PBS重悬；
S3、将S1中得到的核细胞加入PBS洗涤两次后装入离心管中，离心管中加入8％灭活血清和1000U/mL IFN-γ，培养24-28h；
S4、于S3的离心管中补加IL-1100U/mL及抗CD3单抗350ng/mL，继续培养10-12d，每隔3d更换培养基，并调整细胞数为1-2.5x106mL-1，得到NK细胞。
进一步地，所述S1的具体步骤为，将采集的患者外周血中加入肝素抗凝液，沿管壁缓慢倒入加入有Ficoll-Paque PLUS单核细胞分离液的离心管中；将外周血与Ficoll-Paque PLUS单核细胞分离液混合，混合比例2：1。
进一步地，S3中所述灭活血清为S2中的混合液离心后，上层血清52-55℃灭活10min得到。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种NK细胞的体外培养方法，从患者体内采集外周血后通过Ficoll法分离单个核细胞，体外培养得到NK细胞，通过加入生长因子IL-1和抗CD3单抗，避免细胞增殖不稳定，为病毒感染细胞提供有利环境。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明为一种嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，该方法具体步骤如下：
实施例1
S1、采集患者外周富集血，加入肝素抗凝，将外周血与Ficoll-Paque PLUS单核细胞分离液混合，混合比例2：1；
较优的，将采集的患者外周血中加入肝素抗凝液，沿管壁缓慢倒入加入有Ficoll-Paque PLUS单核细胞分离液的离心管中；
S2、混合液1000r/min离心10min，上层血清52℃灭活10min，备用，取沉淀加入PBS重悬；
S3、将S1中得到的核细胞加入PBS洗涤两次后装入离心管中，离心管中加入S2中得到的灭活血清8％和1000U/mL IFN-γ，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养24-28h；
S4、于S3的离心管中补加IL-1100U/mL及抗CD3单抗350ng/mL，继续培养10d，每隔3d更换培养基，并调整细胞数为1x106mL-1，得到NK细胞。
实施例2
S1、采集患者外周富集血，加入肝素抗凝，将外周血与Ficoll-Paque PLUS单核细胞分离液混合，混合比例2：1；
较优的，将采集的患者外周血中加入肝素抗凝液，沿管壁缓慢倒入加入有Ficoll-Paque PLUS单核细胞分离液的离心管中；
S2、混合液1500r/min离心10min，上层血清55℃灭活10min，备用，取沉淀加入PBS重悬；
S3、将S1中得到的核细胞加入PBS洗涤两次后装入离心管中，离心管中加入S2中得到的灭活血清8％和1000U/mL IFN-γ，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养28h；
S4、于S3的离心管中补加IL-1100U/mL及抗CD3单抗350ng/mL，继续培养12d，每隔3d更换培养基，并调整细胞数为2.5x106mL-1，得到NK细胞。
实施例3
S1、采集患者外周富集血，加入肝素抗凝，将外周血与Ficoll-Paque PLUS单核细胞分离液混合，混合比例2：1；
较优的，将采集的患者外周血中加入肝素抗凝液，沿管壁缓慢倒入加入有Ficoll-Paque PLUS单核细胞分离液的离心管中；
S2、混合液1200r/min离心10min，上层血清54℃灭活10min，备用，取沉淀加入PBS重悬；
S3、将S1中得到的核细胞加入PBS洗涤两次后装入离心管中，离心管中加入S2中得到的灭活血清8％和1000U/mL IFN-γ，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养26h；
S4、于S3的离心管中补加IL-1100U/mL及抗CD3单抗350ng/mL，继续培养11d，每隔3d更换培养基，并调整细胞数为2x106mL-1，得到NK细胞。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
S1、采集患者外周富集血，加入肝素抗凝，将外周血与Ficoll-Paque PLUS单核细胞分离液混合；
S2、混合液离心后，取沉淀加入PBS重悬；
S3、将S1中得到的核细胞加入PBS洗涤两次后装入离心管中，离心管中加入8％灭活血清和1000U/mL IFN-γ，培养24-28h；
S4、于S3的离心管中补加IL-1100U/mL及抗CD3单抗350ng/mL，继续培养10-12d，每隔3d更换培养基，并调整细胞数为1-2.5x106mL-1，得到NK细胞。
2.根据权利要求1所述的一种嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其特征在于：所述S1的具体步骤为，将采集的患者外周血中加入肝素抗凝液，沿管壁缓慢倒入加入有Ficoll-Paque PLUS单核细胞分离液的离心管中；将外周血与Ficoll-Paque PLUS单核细胞分离液混合，混合比例2：1。
3.根据权利要求1所述的一种嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其特征在于：S3中所述灭活血清为S2中的混合液离心后，上层血清52-55℃灭活10min得到。
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