CN107557335A - 一种针对小细胞肺癌的Car‑NK细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种针对小细胞肺癌的Car‑NK细胞的制备方法，该方法包括如下步骤：采集患者外周血并通过Ficoll法分离NK细胞；将人外周血单个核细胞置于NK培养基中，调整细胞浓度后置于培养箱中连续培养48‑72h，收集贴壁细胞；将细胞加入至NK培养基中，继续培养12‑15d，每3d补充一次培养液；将慢病毒对NK细胞进行转染并扩增培养，获得CAR‑NK细胞；制备小细胞肺癌细胞制剂。

Description

一种针对小细胞肺癌的Car-NK细胞的制备方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，特别是涉及一种针对小细胞肺癌的Car-NK细胞的制备方法。
背景技术
小细胞肺癌是肺癌的基本类型之一，属于未分化癌，其病理类型包括燕麦细胞型、中间细胞型和复合燕麦细胞型。三分之一的肺癌患者属于这种类型。小细胞肺癌是一种恶性程度较高的肿瘤，生物学行为恶劣，预后凶险。以同样播散范围比较，小细胞肺癌较其他类型肺癌诊断前的症状期短，确诊后的生存期亦短。
对于小细胞肺癌患者的生存周期，医学界一直没能有一个确切的结论。首先小细胞肺癌本身也是一个系统的概念，没有完全雷同的病例出现过，故无法进行横向类比。其次小细胞肺癌的患者本身情况是其生存周期的决定性因素，患者的个体性差异，决定了小细胞肺癌的生存周期不尽相同。患者身体机能的改善是决定小细胞肺癌晚期的生存期的重要因素，患者身体机能优秀，免疫系统功能强大，就足以抵抗肿瘤的扩展或者持续转移。最后小细胞肺癌的治疗进展状况，也是决定患者生存周期的重要因素。而治疗的根本，其实也取决于患者的自身免疫能力，免疫能力强的患者，也能更好的耐受各种化学药剂的治疗。所以小细胞肺癌患者的治疗关键，在于如何增强机体免疫力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对小细胞肺癌的Car-NK细胞的制备方法，该方法由患者外周血取材，材料来源充足方便，提高治疗效果的同时有效降低小细胞肺癌患者的病症的复发。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种针对小细胞肺癌的Car-NK细胞的制备方法，该方法包括如下步骤：
S1、采集患者外周血并通过Ficoll法分离NK细胞；
S2、将S1中处理后人外周血单个核细胞置于NK培养基中，调整细胞浓度为3-5x105，置于37℃，5％CO2培养箱中连续培养48-72h，收集贴壁细胞；
S3、将S2中收集的细胞加入至NK培养基中，调整细胞浓度为1-2x105，继续培养12-15d，每3d补充一次培养液；
S5、将慢病毒对S4中的NK细胞进行转染并扩增培养，获得CAR-NK细胞；
S6、制备小细胞肺癌细胞制剂。
进一步地，所述S1中的具体步骤为，采集患者外周血100mL至管壁覆盖有抗凝剂的采血管中，加入100mL生理盐水稀释；将稀释后的外周血缓慢加入至Ficoll淋巴细胞分离液中，体积比为1：2，震荡均匀后1500-2000r/min离心20min，分离后的细胞用5mmol/L PME室温处理40min备用。
进一步地，所述NK培养基中加入细胞因子AIMV、1000U/mL IL-2、10ng/mLIL-12、10％人AB血清。进一步地，所述S6中的具体步骤为，将人血白蛋白与胰蛋白酶以2:1比例混合后，加入至CAR-NK细胞，加入生理盐水稀释，制备成小细胞肺癌细胞制剂。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种由小细胞肺癌制备Car-NK细胞的制备方法，该方法通过采集患者外周血并通过Ficoll法分离得到NK细胞，并将NK细胞体外培养扩增由慢病毒转染得到Car-NK细胞，该方法由患者外周血取材，材料来源充足方便，提高治疗效果的同时有效降低小细胞肺癌患者的病症的复发。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明为一种针对小细胞肺癌的Car-NK细胞的制备方法，该方法具体步骤如下：
实施例1
S1、采集患者外周血100mL至管壁覆盖有抗凝剂的采血管中，加入100mL生理盐水稀释；
S2、将稀释后的外周血缓慢加入至Ficoll淋巴细胞分离液中，体积比为1：2，震荡均匀后1500r/min离心20min，分离后的细胞用5mmol/L PME室温处理40min备用；
S3、将S2中处理后人外周血单个核细胞置于NK培养基中，其中，NK培养基中加入细胞因子AIMV、1000U/mL IL-2、10ng/mL IL-12、10％人AB血清，调整细胞浓度为3x105，置于37℃，5％CO2培养箱中连续培养48h，收集贴壁细胞；
S4、将S3中收集的细胞加入至NK培养基中，调整细胞浓度为1x105，继续培养12d，每3d补充一次培养液；
S5、将慢病毒对S4中的NK细胞进行转染并扩增培养，获得CAR-NK细胞；
S6、将人血白蛋白与胰蛋白酶以2:1比例混合后，加入至CAR-NK细胞，加入生理盐水稀释，制备成小细胞肺癌细胞制剂。
实施例2
S1、采集患者外周血100mL至管壁覆盖有抗凝剂的采血管中，加入100mL生理盐水稀释；
S2、将稀释后的外周血缓慢加入至Ficoll淋巴细胞分离液中，体积比为1：2，震荡均匀后2000r/min离心20min，分离后的细胞用5mmol/L PME室温处理40min备用；
S3、将S2中处理后人外周血单个核细胞置于NK培养基中，其中，NK培养基中加入细胞因子AIMV、1000U/mL IL-2、10ng/mL IL-12、10％人AB血清，调整细胞浓度为5x105，置于37℃，5％CO2培养箱中连续培养72h，收集贴壁细胞；
S4、将S3中收集的细胞加入至NK培养基中，调整细胞浓度为2x105，继续培养15d，每3d补充一次培养液；
S5、将慢病毒对S4中的NK细胞进行转染并扩增培养，获得CAR-NK细胞；
S6、将人血白蛋白与胰蛋白酶以2:1比例混合后，加入至CAR-NK细胞，加入生理盐水稀释，制备成小细胞肺癌细胞制剂。
实施例3
S1、采集患者外周血100mL至管壁覆盖有抗凝剂的采血管中，加入100mL生理盐水稀释；
S2、将稀释后的外周血缓慢加入至Ficoll淋巴细胞分离液中，体积比为1：2，震荡均匀后1800r/min离心20min，分离后的细胞用5mmol/L PME室温处理40min备用；
S3、将S2中处理后人外周血单个核细胞置于NK培养基中，其中，NK培养基中加入细胞因子AIMV、1000U/mL IL-2、10ng/mL IL-12、10％人AB血清，调整细胞浓度为4x105，置于37℃，5％CO2培养箱中连续培养60h，收集贴壁细胞；
S4、将S3中收集的细胞加入至NK培养基中，调整细胞浓度为1.5x105，继续培养14d，每3d补充一次培养液；
S5、将慢病毒对S4中的NK细胞进行转染并扩增培养，获得CAR-NK细胞；
S6、将人血白蛋白与胰蛋白酶以2:1比例混合后，加入至CAR-NK细胞，加入生理盐水稀释，制备成小细胞肺癌细胞制剂。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种针对小细胞肺癌的Car-NK细胞的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
S1、采集患者外周血并通过Ficoll法分离NK细胞；
S2、将S1中处理后人外周血单个核细胞置于NK培养基中，调整细胞浓度为3-5x105，置于37℃，5％CO2培养箱中连续培养48-72h，收集贴壁细胞；
S3、将S2中收集的细胞加入至NK培养基中，调整细胞浓度为1-2x105，继续培养12-15d，每3d补充一次培养液；
S5、将慢病毒对S4中的NK细胞进行转染并扩增培养，获得CAR-NK细胞；
S6、制备小细胞肺癌细胞制剂。
2.根据权利要求1所述的一种针对小细胞肺癌的Car-NK细胞的制备方法，其特征在于：所述S1中的具体步骤为，采集患者外周血100mL至管壁覆盖有抗凝剂的采血管中，加入100mL生理盐水稀释；将稀释后的外周血缓慢加入至Ficoll淋巴细胞分离液中，体积比为1：2，震荡均匀后1500-2000r/min离心20min，分离后的细胞用5mmol/L PME室温处理40min备用。
3.根据权利要求1所述的一种针对小细胞肺癌的Car-NK细胞的制备方法，其特征在于：所述NK培养基中加入细胞因子AIMV、1000U/mL IL-2、10ng/mLIL-12、10％人AB血清。
4.根据权利要求1所述的一种针对小细胞肺癌的Car-NK细胞的制备方法,其特征在于：所述S6中的具体步骤为，将人血白蛋白与胰蛋白酶以2:1比例混合后，加入至CAR-NK细胞，加入生理盐水稀释，制备成小细胞肺癌细胞制剂。
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