CN105524880A - 一种免疫细胞库的构建方法 - Google Patents

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CN105524880A CN201610056457.3A CN201610056457A CN105524880A CN 105524880 A CN105524880 A CN 105524880A CN 201610056457 A CN201610056457 A CN 201610056457A CN 105524880 A CN105524880 A CN 105524880A
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Abstract

本发明涉及一种免疫细胞库的构建方法，其包括：采用脐带血、外周血及胎盘组织获得的胎盘血或胎盘组织经处理获得单个核细胞，将所述的单个核细胞进行扩增培养，或先进行冻存后进行扩增培养，并将获得的免疫细胞编码入库。本发明在实现免疫细胞高效扩增的基础上，冻存的免疫细胞仍然保持高活性和高纯度；而且，本发明存储的免疫细胞复苏活力达到85％以上，复苏仅需30-60分钟，存储时间可达15-20年；提升了血液存储、组织存储用于三类医疗技术治疗的应用面，为肿瘤治疗和预防，以及病毒感染产生的免疫系统疾病治疗和预防提供了健康储存新方式。

Description

一种免疫细胞库的构建方法
技术领域
本发明涉及免疫细胞治疗领域，尤其涉及一种免疫细胞库的构建方法。
背景技术
免疫细胞是指与免疫细胞应答有关的所有细胞，主要包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK)、单核细胞等。近年来肿瘤和病毒的免疫治疗技术已经进入到临床应用，T细胞和NK细胞过继免疫疗法已列入我国三类医疗技术目录，主要是通过自体的免疫细胞经体外刺激扩增培养，回输到患者体内提高免疫力。通过直接或间接方式杀伤肿瘤细胞或病毒浸染的细胞，达到缓解或治疗病症的目的。同时通过规模扩增储存，可实现与应用快速结合，提升应用效果。
NK细胞(naturalkillercell，自然杀伤细胞)是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。NK细胞数量较少，在外周血、胎盘约占淋巴细胞总数的3-15％，在脾内约有3％～4％。NK细胞作用机理(英国帝国理工学院)：自然杀伤细胞表面有许多受体感应器，这些受体分为“激活”和“抑制”两种。当它在人体内捕获1个可疑细胞后，2种受体将传回不同的信号，如果是病变细胞，“激活”信号大大增强，免疫细胞的“杀手本能”将被激活，从而杀死病变细胞；反之，如果捕获的是一个健康细胞，“抑制”信号将占主导地位，该细胞将会被释放。目前，主要是肿瘤细胞、病毒感染细胞、较大的病原体(如真菌和寄生虫)、同种异体移植的器官、组织等。
NK细胞过继免疫治疗主要是取自患者自己或半相合供体，由于其不存在体细胞免疫抗原，自体及异体应用高安全性得到了国内外专家广泛认可，国外NK细胞治疗小儿白血病已进入临床III期实验。抗肿瘤、抗病毒药物研发已进入IND阶段。目前肿瘤治疗患者年龄不断提前，患者免疫系统机能已经遭受破坏，通过多种途径规模制备自体或异体自然杀伤细胞，长期存储，不仅是我国三类医疗技术对NK细胞应用控制和预防医疗模式的快速结合，也为NK细胞作为抗肿瘤药物研究和细胞药物制备和临床应用准备了必备条件。所以通过NK细胞存储与不同供体资源结合，可逐步提升免疫细胞预防医疗应用水平，也能为患者临床应用提供创新方法，为免疫细胞药物开发提供了新的方式，所以通过不同时期供体应用资源的NK细胞扩增存储，提升我国免疫细胞存储应用能力，提升我国免疫细胞应用水平具有非常大的意义。
为了有效存储和使用组织和供体资源，目前在世界范围内已经有多种细胞库和组织库建立，比如脐带造血肝细胞库、间充质干细胞库等细胞库。所谓细胞库是在-196℃液氮中存储细胞及搜集相关资料的场所。免疫细胞库不仅可提高现有建库资源的新应用，避免资源浪费，也能为以新药开发为需求的资源专属体系提供技术和应用保障。
目前，要冻存免疫细胞，通常是直接冻存单个核细胞。由于人单核细胞成分复杂，既有免疫细胞也有非免疫细胞，是多种类型细胞组合，导致冻存后的单个核细胞复苏后活率不理想，不适合临床应用。对于免疫细胞尤其是NK细胞的长期冻存及冻存治疗控制并无相关报道。
CN102758259A公开了一种人外周血免疫细胞库的构建方法，其采集人外周血，分离自体血浆，分离外周血单个核细胞，由外周血单个核细胞分离单核细胞并冻存，由外周血单个核细胞分离T淋巴细胞并冻存，由外周血单个核细胞分离B淋巴细胞并冻存，由外周血单个核细胞分离NK细胞并冻存，编码入库。尽管该方法是采用将免疫细胞分离出并分别单独冻存，编码入库，然而，这些免疫细胞进行冻存后，其活性大大降低，当再次将这些免疫细胞进行复苏时，细胞的存活率大大下降，无法实现长期储存和即时应用，更不能作为种子细胞循环扩增使用。
因此，寻找一种能够长期储存、并且保持免疫细胞复苏后高存活率即时应用，同时可以以库存细胞为种子高效扩增循环应用的细胞库构建方法是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种免疫细胞库的构建方法，特别是一种利用人外周血、胎盘组织血、胎盘组织以及脐带血等供体资源制备的适合临床应用免疫细胞库的构建方法。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种免疫细胞库的构建方法，其包括：
(1)从供体资源分离单个核细胞；任选地，冻存单个核细胞；
(2)扩增培养，获得免疫细胞；
(3)将免疫细胞冻存，编码入库。
本发明在构建免疫细胞库的过程中，不仅对单个核细胞进行了冻存，最重要的是对分离得到的单个核细胞或冻存后的单个核细胞进行了扩增培养，采用该步骤后，使得免疫细胞的扩增倍数达到10000倍以上，保持了免疫细胞的高活性，当采用该免疫细胞用于冻存复苏时，复苏后的免疫细胞存活率达到85％以上，存储时间可达15-20年。
本发明中，步骤(1)所述供体资源为脐带血、外周血、胎盘组织血或胎盘组织中的任意一种或至少两种的组合，优选但不限于此。
优选地，所述分离包括：采用脐带血、外周血或胎盘组织血分离自体血浆，分离得到单个核细胞，或者采用胎盘组织分离单个核细胞。
优选地，所述脐带血、外周血或胎盘组织血分离自体血浆包括：将采集的脐带血、外周血或胎盘组织血离心，取上清液灭活，获得用于冻存和培养用自体血浆，其具体步骤为：将采集的脐带血、外周血或胎盘组织血放入50mL离心管，以600-900G离心力离心10-20分钟，取上清液40-56℃灭活30-40分钟，获得可用于冻存和培养用血浆，可于-20℃存储或4℃暂存。
本发明中，所述脐带血、外周血或胎盘组织血分离单个核细胞的具体步骤为：将采集的脐带血、外周血或胎盘组织血离心，将去除自体血浆后的沉淀物按体积量用生理盐水或PBS稀释0.5-1倍，混匀后，加入到与淋巴细胞分离液中，400-900G离心15-60分钟，离心后，取中间层细胞即得到单个核细胞。
优选地，所述胎盘组织分离单个核细胞包括：胎盘组织捣碎后，经酶消化，过滤，加入淋巴细胞分离液，离心后，取中间层细胞即得到胎盘组织单个核细胞，其具体步骤为：胎盘组织捣碎后，绞碎处理组织直径小于0.1cm，经0.125-0.25M胰蛋白酶37℃，消化25-60min，再经过滤，加入2:1-1:1淋巴细胞分离液上，400-600g离心15-60分钟，离心后，取中间层细胞即得到胎盘组织单个核细胞。
本发明中，步骤(1)所述冻存单个核细胞包括：将单个核细胞与冻存液混合并液氮保存。
优选地，所述单个核细胞的密度为0.1-1.5×108/mL，例如可以是：0.1×108/mL、0.3×108/mL、0.5×108/mL、0.8×108/mL、1×108/mL、1.1×108/mL、1.2×108/mL、1.3×108/mL、1.4×108/mL、1.5×108/mL，优选为1×108/mL。
优选地，所述冻存液按体积百分含量包括：10-90％的胎牛血清或自体血浆；10-90％的基础培养基；进一步优选地，所述基础培养基为RPMI-1640或淋巴细胞无血清培养基，其中冻存液各组分的体积百分含量之和为100％，所述胎牛血清或自体血浆的含量可以是：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，所述基础培养基的含量可以是：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。
本发明中，步骤(2)所述扩增培养包括：将单个核细胞进行接种并加入培养液进行培养。
优选地，所述单个核细胞的密度为0.5-2.5×106/mL，例如可以是0.5×106/mL、0.8×106/mL、1×106/mL、1.2×106/mL、1.5×106/mL、1.8×106/mL、2×106/mL、2.5×106/mL，优选为2×106/mL。
优选地，所述培养液按体积百分含量包括：1％-15％的自体血清或胎牛血清；85-99％的淋巴细胞无血清培养液或RPMI-1640培养液；200-500U/mL的重组人IL-2，各组分含量之和为100％。
优选地，所述免疫细胞为T细胞、NK细胞或NKT细胞中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，步骤(3)所述免疫细胞冻存包括：将免疫细胞与冻存液混合。
优选地，所述冻存液按体积百分含量包括：5-10％的二甲基亚砜；10-90％的自体血清或胎牛血清；0-5％的人血白蛋白和5-75％的基础培养液，各组分含量之和为100％。
优选地，所述基础培养液为淋巴细胞无血清培养液或RPMI-1640培养液。
优选地，所述免疫细胞的密度为2-10×107个/mL，例如可以是2×107个/mL、3×107个/mL、4×107个/mL、5×107个/mL、6×107个/mL、7×107个/mL、8×107个/mL、9×107个/mL、10×107个/mL，优选为5×107个/mL。
作为本发明优选的方案，所述方法包括以下步骤：
(1)从脐带血、外周血、胎盘组织血或胎盘组织中分离单个核细胞；
(2)将得到的单个核细胞按照0.1-1.5×108/mL的密度，混合在按体积百分含量包括1％-15％的自体血清或胎牛血清；85-99％的淋巴细胞无血清培养液或RPMI-1640培养液；200-500U/mL的重组人IL-2的培养液中，放入二氧化碳培养箱中培养；
(3)将获得的免疫细胞按照2-10×107个/mL的密度，混合在按体积百分含量包括5-10％的二甲基亚砜；10-90％的自体血清或胎牛血清；0-5％的人血白蛋白和5-75％的基础培养液的冻存液中，并将其编码入库；
任选地，在步骤(2)之前进行步骤(1，)：按照0.1-1.5×108/mL的密度，混合在按体积百分含量包括10-90％的胎牛血清或自体血浆；10-90％的基础培养基的冻存液中进行单个核细胞的冻存。
对于上述步骤(2)，其还包括以下处理：在接种第1天加入辐照后的IL-21(K562)细胞0.5-2.0×106/mL；接种第4天300-500G离心10-15min，获得的细胞以0.5-1.5×106/mL细胞接种于培养瓶中，使用所述的培养液换液培养；待细胞数量达到5-10×107个时，加入辐照后的K562细胞0.2-1×106/mL，使免疫细胞数量控制在0.8-1.5×106/mL，收获免疫细胞。
作为本发明进一步优选的方案，所述方法具体包括以下步骤：
(1)从脐带血、外周血、胎盘组织血分离自体血浆，分离得到单个核细胞，或者采用胎盘组织分离单个核细胞；
(2)将得到的单个核细胞按照0.1-1.5×108/mL的密度，混合在按体积百分含量包括1％-15％的自体血清或胎牛血清；85-99％的淋巴细胞无血清培养液或RPMI-1640培养液；200-500U/mL的重组人IL-2的培养液中，放入二氧化碳培养箱中培养，在接种第1天加入辐照后的K562细胞0.5-2.0×106/mL；接种第4天300-500G离心10-15min，获得的NK细胞以0.5-1.5×106/mL细胞接种于培养瓶中，使用所述的培养液换液培养；待NK细胞数量达到5-10×107个时，加入辐照后的IL-21(K562)细胞0.2-1×106/mL，使免疫细胞数量控制在0.8-1.5×106/mL，300-500G离心10-15min，收获NK细胞；
(3)将获得的NK细胞按照2-10×107个/mL的密度，混合在按体积百分含量包括5-10％的二甲基亚砜；10-90％的自体血清或胎牛血清；0-5％的人血白蛋白和5-75％的基础培养液的冻存液中，并将其编码入库。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明在实现免疫细胞高效扩增的基础上，所冻存的免疫细胞仍能保持高活性和高纯度；本发明存储的免疫细胞复苏活力达到85％以上，复苏仅需30-60分钟，存储时间可达15-20年；
(2)本发明提供了一种可长期储存免疫细胞的方法，提升了血液存储、组织存储用于三类医疗技术治疗的应用面，为血液存储、组织存储为基础的功能库实现的免疫细胞存储功能和应用能力扩容；
(3)本发明可有效利用现有资源库供体资源，提升资源利用水平，实现库储存资源应用的扩容，避免资源浪费；适合作为药物批量制备和存储，为临床应用和科研提供大量的高质量细胞资源。
(4)本发明存储的NK或NKT细胞可以在长期储存后作为种子细胞，结合实际需求应用，再通过高效扩增实现循环长期应用。
附图说明
图1是实施例1的NK免疫细胞库的构建流程图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1脐带血NK免疫细胞库的构建方法
图1是本实施例的NK免疫细胞库的构建流程图，其具体操作为：
(1)对胎盘母体体检，应不存在传染性疾病，脐带血采集后进行进一步病原检查，符合脐带血存储质量要求，方能作为存储制备供体原料，对供体的质量标准要求如表1-2所示，其中，表1是人脐带血、外周血、胎盘组织血质量标准，表2是胎盘组织质量标准。
表1
项目 方法 质控标准
单核细胞数量 分离计数法 大于1.0×10^6/mL
无菌检测 培养法 (-)
支原体 PCR法 (-)
HBV ELISA (-)
HCV ELISA (-)
HIV ELISA (-)
表2
项目 方法 质控标准
胎盘组织成熟度 病例符合确认 大于II级
无菌检测 培养法 (-)
支原体 PCR法 (-)
HBV ELISA (-)
HCV ELISA (-)
HIV ELISA (-)
母体健康情况确认 病例符合确认 无家族遗传性血液疾病
(2)分离自体血浆：将采集的血放入50mL离心管，以900G离心力离心15分钟，取上清液56℃灭活30分钟，获得可用于冻存和培养用血浆，-20℃存储备用。
(3)脐带血单个核细胞的分离：将步骤(2)中去除自体血浆后的沉淀物按体积量用生理盐水稀释0.5倍，混匀后，加入淋巴细胞分离液(密度1.077)中，两者的体积比为1:1，600G离心40分钟，离心后，取中间层细胞即得到脐带血单个核细胞，通过流式细胞仪检测CD16(+)和CD56(+)，对于获得的单个核细胞的质量标准如表3所示。
表3
(4)单个核细胞的冻存：将得到的脐带血单个核细胞按照1×108/mL的密度，混匀在组分为90％自体血浆和10％淋巴细胞培养基(TBD)中，放入5mL冻存管或冻存专用血袋中冻存，放液氮中保存。
(5)扩增培养NK细胞：冻存后的脐带血单个核细胞，经37℃水浴复苏1分钟，400G离心，吸取上清，用淋巴细胞培养基重悬，400G离心，吸取上清，第二次用10％自体血浆与90％淋巴细胞培养基配制的NK培养基重悬，按照单核细胞1.5×106/mL接种于T175培养瓶中，使用体积比10％的自体血清+90％淋巴细胞培养基(TBD)+IL-2(200U/mL)，作为NK细胞培养液培养，放入37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。在接种第1天加入辐照后的K562(IL-21)(上海泽平生物技术有限公司)细胞1.5×106/mL；接种第4天500G离心15min，获得的细胞以1.5×106/mL细胞接种于新T175的培养瓶中，使用前述NK细胞培养液培养；培养第8天加入，加入辐照后的IL-21(K562)滋养细胞1×106/mL；培养第9天转入细胞培养袋(TBD)控制细胞密度在1.0×106/mL，根据颜色及细胞数量变化情况及时补充NK细胞培养液，第13天进行支原体、无菌快速检测，第14天NK细胞数量计数总量为1.0×1010个。结合培养情况和目的应用收获量，500G离心15min，收获下层离心沉淀的NK细胞，进行流式、病毒病原检测，确认第13天结果符合要求，收获NK细胞即进入冻存程序。表4示出了制备获得的NK细胞质量标准。
表4
(6)NK免疫细胞冻存：获得的NK细胞按照5×107个/mL，与10％DMSO、85％胎牛血清、2％的人血白蛋白和3％淋巴细胞培养基(TBD)装入5mL冻存管依次放入4℃30min，-20℃2h，-70℃大于12h，确认检测达到NK细胞储存要求，作标识编码，进入液氮储存系统，表5是将NK细胞5年冻存复苏后的质量标准。
表5
项目 检测方法 标准
细胞数量 细胞计数法 大于4×10^9个/批
活细胞数量％ 台盼蓝染色-细胞计数仪 大于80％
NK细胞标记物鉴定 流式细胞仪 CD3(-)、CD16(+)、CD56(+)
NK细胞含量 流式细胞仪 CD16+CD56大于80％
支原体检测 PCR (-)
无菌检测 培养法 (-)
HBV ELISA (-)
HIV ELISA (-)
HCV ELISA (-)
细菌内毒素 细菌内毒素限度法 小于0.125EU/ml
体外杀伤(毒性)实验 K562(4h)8:1 存活≤20％或杀伤力大于80％
(7)编码入库：对冻存的细胞按照编码规则建立唯一系统识别编码，将对应信息录入计算机，用于管理监控和检索。
实施例1中，所述的单个核细胞在体外14天扩增培养NK细胞增殖倍数可达到10000倍以上，制备获得的NK细胞活性可达到85％以上，流式细胞仪检测CD16(+)和CD56(+)大于80％；另外，实施例1中制备的NK细胞活性强，可长期储存，5年存储细胞存活率大于95％。
实施例2胎盘组织NK免疫细胞库构建方法
(1)对胎盘母体体检，应不存在传染性疾病，胎盘采集运输到实验室后进行进一步病原检查，符合脐带血存储质量要求，方能作为存储制备供体原料。
(2)胎盘组织单核细胞的分离：胎盘组织捣碎后，绞碎处理组织直径小于0.1cm，经0.25M胰蛋白酶37℃，消化30min，再经过滤，加入1:1淋巴细胞分离液(密度1.077)上，600G离心30分钟，离心后，取中间层细胞即得到胎盘组织单个核细胞。
(3)单个核细胞的冻存：将得到的脐带血单个核细胞按照1.5×108/mL的密度，混匀在组分为80％自体血浆和20％淋巴细胞培养基(TBD)中，放入5mL冻存管或冻存专用血袋中冻存，放液氮中保存。
(4)扩增培养NK细胞：冻存后或新鲜的胎盘组织单核细胞，用RPMI-1640培养基重悬，400G离心，吸取上清，第二次用10％胎牛血清与90％RPMI-1640培养基配置的NK培养基重悬，按照单核细胞2.5×106/mL接种于T75培养瓶中，使用体积比10％的胎牛血清+90％1640培养基IL-2(300U/mL)，作为NK细胞培养液培养，放入37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。在接种第1天加入辐照后的IL-21(K562)(上海泽平生物技术有限公司)细胞0.5×106/mL；接种第4天500G离心15min，获得的细胞以1.0×106/mL细胞接种于新T175的培养瓶中，使用前述NK细胞培养液培养；培养第8天加入，加入辐照后的K562(IL-21)滋养细胞0.8×106/mL，培养第9天转入细胞培养袋(TBD)，控制细胞密度在1.0×106/mL，根据颜色及细胞数量变化情况及时补充NK细胞培养液，第13天进行支原体、无菌快速检测，第14天NK细胞数量计数总量为5.0×1019个。结合培养情况和目的应用收获量，500G离心15min，收获下层离心沉淀的NK细胞,进行流式、病毒病原检测。确认第13天结果符合要求，收获NK细胞即进入冻存程序。
实施例3脐带血T免疫细胞库的构建方法
(1)对胎盘母体体检，应不存在传染性疾病，脐带血采集后进行进一步病原检查，符合脐带血存储质量要求，方能作为存储制备供体原料。
(2)分离自体血浆：将采集的血放入50mL离心管，以900G离心力离心15分钟，取上清液56℃灭活30分钟，获得可用于冻存和培养用血浆，-20℃存储备用。
(3)脐带血单个核细胞的分离：将步骤(2)中去除自体血浆后的沉淀物按体积量用生理盐水稀释0.5倍，混匀后，加入淋巴细胞分离液(密度1.077)中，两者的体积比为1:1，600G离心40分钟，离心后，取中间层细胞即得到脐带血单个核细胞。
(4)单个核细胞的冻存：将得到的脐带血单个核细胞按照1×108/mL的密度，混匀在组分为90％自体血浆和10％淋巴细胞培养基(TBD)中，放入5mL冻存管或冻存专用血袋中冻存，放液氮中保存。
(5)扩增培养T细胞：冻存后的脐带血单个核细胞，经37℃水浴复苏1分钟，400G离心，吸取上清，用T551培养基重悬，400G离心，吸取上清，第二次用10％自体血浆与90％淋巴细胞培养基(TBD)配制的T培养基重悬，按照单核细胞1.5×106/mL接种于T175培养瓶中，使用体积比10％的自体血清+90％淋巴细胞培养基(TBD)+IL-2(200U/mL)，作为T细胞培养液培养，放入37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。在接种第1天加入辐照后的IL-21(K562)(上海泽平生物技术有限公司)细胞1.5×106/mL；接种第4天500G离心15min，获得的细胞以1.5×106/mL细胞接种于新T175的培养瓶中，使用前述T细胞培养液培养；培养第8天加入，加入辐照后的IL-21(K562)滋养细胞1×106/mL；培养第9天转入细胞培养袋(TBD)控制细胞密度在1.0×106/mL，根据颜色及细胞数量变化情况及时补充T细胞培养液，第13天进行支原体、无菌快速检测，第14天T细胞数量计数总量为1.0×1010个。结合培养情况和目的应用收获量，500G离心15min，收获下层离心沉淀的T细胞，进行流式、病毒病原检测。确认第13天结果符合要求，收获T细胞即进入冻存程序。
(6)T免疫细胞冻存：获得的T细胞按照5×107个/mL，与10％DMSO、85％胎牛血清、2％的人血白蛋白和3％90％淋巴细胞培养基(TBD)装入5mL冻存管依次放入4℃30min，-20℃2h，-70℃大于12h，确认检测达到T细胞储存要求，作标识编码，进入液氮储存系统。
(7)编码入库：对冻存的细胞按照编码规则建立唯一系统识别编码，将对应信息录入计算机，用于管理监控和检索。
实施例4胎盘组织T免疫细胞库构建方法
(1)对胎盘母体体检，应不存在传染性疾病，胎盘采集运输到实验室后进行进一步病原检查，符合脐带血存储质量要求，方能作为存储制备供体原料。
(2)胎盘组织单核细胞的分离：胎盘组织捣碎后，绞碎处理组织直径小于0.1cm，经0.25M胰蛋白酶37℃，消化30min，再经过滤，加入1:1淋巴细胞分离液(密度1.077)上，600G离心30分钟，离心后，取中间层细胞即得到胎盘组织单个核细胞。
(3)单个核细胞的冻存：将得到的脐带血单个核细胞按照1.5×108/mL的密度，混匀在组分为80％自体血浆和20％淋巴细胞培养基(TBD)中，放入5mL冻存管或冻存专用血袋中冻存，放液氮中保存。
(4)扩增培养T细胞：冻存后或新鲜的胎盘组织单核细胞，用RPMI-1640培养基重悬，400G离心，吸取上清，第二次用10％胎牛血清与90％RPMI-1640培养基配置的T培养基重悬，按照单核细胞2.5×106/mL接种于T75培养瓶中，使用体积比10％的胎牛血清+90％1640培养基IL-2(300U/mL)，作为T细胞培养液培养，放入37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。在接种第1天加入辐照后的IL-21(K562)(上海泽平生物技术有限公司)细胞0.5×106/mL；接种第4天500G离心15min，获得的细胞以1.0×106/mL细胞接种于新T175的培养瓶中，使用前述T细胞培养液培养；培养第8天加入，加入辐照后的K562(IL-21)滋养细胞0.8×106/mL，培养第9天转入细胞培养袋(TBD)，控制细胞密度在1.0×106/mL，根据颜色及细胞数量变化情况及时补充T细胞培养液，第13天进行支原体、无菌快速检测，第14天T细胞数量计数总量为5.0×109个。结合培养情况和目的应用收获量，500G离心15min，收获下层离心沉淀的T细胞，进行流式、病毒病原检测。确认第13天结果符合要求，收获T细胞即进入冻存程序。
实施例5脐带血NKT免疫细胞库的构建方法
(1)对胎盘母体体检，应不存在传染性疾病，脐带血采集后进行进一步病原检查，符合脐带血存储质量要求，方能作为存储制备供体原料。
(2)分离自体血浆：将采集的血放入50mL离心管，以900G离心力离心15分钟，取上清液56℃灭活30分钟，获得可用于冻存和培养用血浆，-20℃存储备用。
(3)脐带血单个核细胞的分离：将步骤(2)中去除自体血浆后的沉淀物按体积量用生理盐水稀释0.5倍，混匀后，加入淋巴细胞分离液(密度1.077)中，两者的体积比为1:1，600G离心40分钟，离心后，取中间层细胞即得到脐带血单个核细胞。
(4)单个核细胞的冻存：将得到的脐带血单个核细胞按照1×108/mL的密度，混匀在组分为90％自体血浆和10％淋巴细胞培养基(TBD)中，放入5mL冻存管或冻存专用血袋中冻存，放液氮中保存。
(5)扩增培养NKT细胞：冻存后的脐带血单个核细胞，经37℃水浴复苏1分钟，400G离心，吸取上清，用淋巴细胞培养基(TBD)重悬，400G离心，吸取上清，第二次用10％自体血浆与90％淋巴细胞培养基(TBD)配制的NKT培养基重悬，按照单核细胞1.5×106/mL接种于T175培养瓶中，使用体积比10％的自体血清+90％淋巴细胞培养基(TBD)+IL-2(200U/mL)，作为NKT细胞培养液培养，放入37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。在接种第1天加入辐照后的IL-21(K562)(上海泽平生物技术有限公司)细胞1.5×106/mL；接种第4天500G离心15min，获得的细胞以1.5×106/mL细胞接种于新T175的培养瓶中，使用前述NKT细胞培养液培养；培养第8天加入，加入辐照后的IL-21(K562)滋养细胞1×106/mL；培养第9天转入细胞培养袋(TBD)控制细胞密度在1.0×106/mL，根据颜色及细胞数量变化情况及时补充NKT细胞培养液，第13天进行支原体、无菌快速检测，第14天NKT细胞数量计数总量为1.0×1010个。结合培养情况和目的应用收获量，500G离心15min，收获下层离心沉淀的NKT细胞，进行流式、病毒病原检测。确认第13天结果符合要求，收获NKT细胞即进入冻存程序。
(6)NKT免疫细胞冻存：获得的NKT细胞按照5×107个/mL，与10％DMSO、85％胎牛血清、2％的人血白蛋白和3％淋巴细胞培养基(TBD)装入5mL冻存管依次放入4℃30min，-20℃2h，-70℃大于12h，确认检测达到NKT细胞储存要求，作标识编码，进入液氮储存系统。
(7)编码入库：对冻存的细胞按照编码规则建立唯一系统识别编码，将对应信息录入计算机，用于管理监控和检索。
实施例6胎盘组织NKT免疫细胞库构建方法
(1)对胎盘母体体检，应不存在传染性疾病，胎盘采集运输到实验室后进行进一步病原检查，符合脐带血存储质量要求，方能作为存储制备供体原料。
(2)胎盘组织单核细胞的分离：胎盘组织捣碎后，绞碎处理组织直径小于0.1cm，经0.25M胰蛋白酶37℃，消化30min，再经过滤，加入1:1淋巴细胞分离液(密度1.077)上，600G离心30分钟，离心后，取中间层细胞即得到胎盘组织单个核细胞。
(3)单个核细胞的冻存：将得到的脐带血单个核细胞按照1.5×108/mL的密度，混匀在组分为80％自体血浆和20％淋巴细胞培养基(TBD)中，放入5mL冻存管或冻存专用血袋中冻存，放液氮中保存。
(4)扩增培养T细胞：冻存后或新鲜的胎盘组织单核细胞，用RPMI-1640培养基重悬，400G离心，吸取上清，第二次用10％胎牛血清与90％RPMI-1640培养基配置的T培养基重悬，按照单核细胞2.5×106/mL接种于T75培养瓶中，使用体积比10％的胎牛血清+90％1640培养基IL-2(300U/mL)，作为T细胞培养液培养，放入37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。在接种第1天加入辐照后的IL-21(K562)(上海泽平生物技术有限公司)细胞0.5×106/mL；接种第4天500G离心15min，获得的细胞以1.0×106/mL细胞接种于新T175的培养瓶中，使用前述T细胞培养液培养；培养第8天加入，加入辐照后的IL-21(K562)滋养细胞0.8×106/mL，培养第9天转入细胞培养袋(TBD)，控制细胞密度在1.0×106/mL，根据颜色及细胞数量变化情况及时补充T细胞培养液，第13天进行支原体、无菌快速检测，第14天T细胞数量计数总量为5.0×1019个。结合培养情况和目的应用收获量，500G离心15min，收获下层离心沉淀的T细胞，进行流式、病毒病原检测。确认第13天结果符合要求，收获T细胞即进入冻存程序。
通过上述实施例可以看出，本发明以脐带血、胎盘组织血、外周血以及胎盘组织制备获得单个核细胞，通过创新制备技术接种单个核细胞在体外14天扩增培养免疫细胞增值倍数可达到10000倍以上，制备获得的免疫细胞活性可达到85％以上，流式细胞仪检测CD3(-)CD16(+)和CD56(+)大于80％，优于已有的NK制备技术；另外，本发明制备的NK细胞活性强，可长期储存，5年存储细胞存活率大于95％，20年储存细胞存活率大于85％。细胞长期储存，质量可达到细胞药物质量标准。本发明充分利用现有资源库供体资源，提升了资源利用水平，实现了库储存资源应用的扩容，避免了资源浪费，具有重要的医学价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (8)

1.一种免疫细胞库的构建方法，其特征在于，其包括：
(1)从供体资源分离单个核细胞；任选地，冻存单个核细胞；
(2)扩增培养，获得免疫细胞；
(3)将免疫细胞冻存，编码入库。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述供体资源为脐带血、外周血、胎盘组织血或胎盘组织中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述分离包括：采用脐带血、外周血或胎盘组织血分离自体血浆，分离得到单个核细胞，或者采用胎盘组织分离单个核细胞；
优选地，所述脐带血、外周血或胎盘组织血分离自体血浆包括：将采集的脐带血、外周血或胎盘组织血离心，取上清液灭活，获得用于冻存和培养用自体血浆；
优选地，所述胎盘组织分离单个核细胞包括：胎盘组织捣碎后，经酶消化，过滤，加入淋巴细胞分离液，离心后，取中间层细胞即得到胎盘组织单个核细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述冻存单个核细胞包括：将单个核细胞与冻存液混合并液氮保存；
优选地，所述单个核细胞的密度为0.1-1.5×108/mL，优选为1×108/mL；
优选地，所述冻存液按体积百分含量包括：10-90％的胎牛血清或自体血浆；10-90％的基础培养基；进一步优选地，所述基础培养基为RPMI-1640或淋巴细胞无血清培养基。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述扩增培养包括：将单个核细胞进行接种并加入培养液进行培养；
优选地，所述单个核细胞的密度为0.5-2.5×106/mL，优选为2×106/mL；
优选地，所述培养液按体积百分含量包括：1％-15％的自体血清或胎牛血清；85-99％的淋巴细胞无血清培养液或RPMI-1640培养液；200-500U/mL的重组人IL-2；
优选地，所述免疫细胞为T细胞、NK细胞或NKT细胞中的任意一种或至少两种的组合。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述免疫细胞冻存包括：将免疫细胞与冻存液混合；
优选地，所述冻存液按体积百分含量包括：5-10％的二甲基亚砜；10-90％的自体血清或胎牛血清；0-5％的人血白蛋白和5-75％的基础培养液；
优选地，所述基础培养液为淋巴细胞无血清培养液或RPMI-1640培养液；
优选地，所述免疫细胞的密度为2-10×107个/mL，优选为5×107个/mL。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)从脐带血、外周血、胎盘组织血或胎盘组织中分离单个核细胞；
(2)将得到的单个核细胞按照0.1-1.5×108/mL的密度，混合在按体积百分含量包括1％-15％的自体血清或胎牛血清；85-99％的淋巴细胞无血清培养液或RPMI-1640培养液；200-500U/mL的重组人IL-2的培养液中，放入二氧化碳培养箱中培养；
(3)将获得的免疫细胞按照2-10×107个/mL的密度，混合在按体积百分含量包括5-10％的二甲基亚砜；10-90％的自体血清或胎牛血清；0-5％的人血白蛋白和5-75％的基础培养液的冻存液中，并将其编码入库；
任选地，在步骤(2)之前进行步骤(1，)：按照0.1-1.5×108/mL的密度，混合在按体积百分含量包括10-90％的胎牛血清或自体血浆；10-90％的基础培养基的冻存液中进行单个核细胞的冻存。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)还包括：在接种第1天加入辐照后的IL-21(K562)细胞0.5-2.0×106/mL；接种第4天300-500G离心10-15min，获得的细胞以0.5-1.5×106/mL细胞接种于培养瓶中，使用所述的培养液换液培养；待细胞数量达到5-10×107个时，加入辐照后的K562细胞0.2-1×106/mL，使免疫细胞数量控制在0.8-1.5×106/mL，收获免疫细胞。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
(1)从脐带血、外周血、胎盘组织血分离自体血浆，分离得到单个核细胞，或者采用胎盘组织分离单个核细胞；
(2)将得到的单个核细胞按照0.1-1.5×108/mL的密度，混合在按体积百分含量包括1％-15％的自体血清或胎牛血清；85-99％的淋巴细胞无血清培养液或RPMI-1640培养液；200-500U/mL的重组人IL-2的培养液中，放入二氧化碳培养箱中培养，在接种第1天加入辐照后的K562细胞0.5-2.0×106/mL；接种第4天300-500G离心10-15min，获得的NK细胞以0.5-1.5×106/mL细胞接种于培养瓶中，使用所述的培养液换液培养；待NK细胞数量达到5-10×107个时，加入辐照后的IL-2(K562)细胞0.2-1×106/mL，使免疫细胞数量控制在0.8-1.5×106/mL，300-500G离心10-15min，收获NK细胞；
(3)将获得的NK细胞按照2-10×107个/mL的密度，混合在按体积百分含量包括5-10％的二甲基亚砜；10-90％的自体血清或胎牛血清；0-5％的人血白蛋白和5-75％的基础培养液的冻存液中，并将其编码入库。
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