CN103966164B - 一种半合子capri细胞制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种半合子CAPRI细胞制备方法，具体包括如下制备步骤：(1)获取患者和半合子供体外周血，并分离、纯化外周血单个核细胞(PBMC)；(2)从半合子供体血浆制备血清；(3)PBMC激活；(4)CAPRI细胞扩增；(5)CAPRI细胞收获；(6)CAPRI细胞冻存。此外，本发明还增加前期细胞处理步骤以及双抗体装载方法，以提高CAPRI细胞数目以及肿瘤杀伤能力。本发明所提供的半合子CAPRI细胞制备方法不仅解决了现有技术中由于患者自身状况较差等因素导致的CAPRI细胞培养无法进行的问题，而且其所产生的细胞具有广谱杀瘤作用，并且前期细胞处理步骤使PBMC细胞具有更好的细胞增殖和活化能力，双抗体装载模式更提高了CAPRI细胞的肿瘤细胞杀伤作用。本发明充分发挥了CAPRI细胞优势使患者来源的细胞与半合子供体来源细胞充分合作，弥补了现有技术中的空白。再者，本发明中所提供的细胞冻存液极大提高了冻存细胞的复活能力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种半合子CAPRI细胞的制备方法。
背景技术
CAPRI(CascadePrimedImmunecells)细胞又名级联引发的免疫细胞，是一项新型自体T细胞，利用抗原呈递细胞结合CD3单抗及特定细胞因子的链式激活工艺制备，兼具CIK的非特异性和DC的特异性杀伤能力，其效应细胞有两种：以CD4+和CD8+为主的T辅助细胞和T杀伤细胞（细胞毒细胞），约占80%，以CD3+和CD56+为主的NKT细胞、以及NK细胞和树突状细胞（DC），这部分效应细胞约占20%。近年来在肿瘤生物治疗方面非常活跃，具有安全有效、杀瘤谱广、副作用小等传统生物治疗的特点，还具有典型的个体化生物治疗模式的特点。
CAPRI细胞生物治疗的原理为：在肿瘤患者血液循环中含有一些肿瘤抗原，肿瘤有丰富的血供，单核细胞在血液循环中，能接触肿瘤细胞，而且肿瘤发生转移首先是到淋巴结，在这里有单核细胞，能接触到肿瘤抗原。单核细胞在体内大量接触过抗原并吞噬处理，并转化为DC，在第5天时能把处理后的肿瘤抗原递呈出来。CD3单克隆抗体体外活化的Ｔ细胞在特定细胞因子环境下会引起其他细胞，特别是抗原呈递细胞（APC）的激活。APC抗原呈递细胞可提呈外源蛋白，肿瘤蛋白作为变异的非自体抗原也可被其提呈。在APC中，树突状细胞（DC）是抗原提呈效力最高的一种细胞。如果未经活化的T细胞被加入到活化的呈递肿瘤抗原的APC中，Ｔ细胞便接受APC的抗原呈递并被活化，该过程的启动是通过特异性Ｔ细胞受体完成的，被活化的Ｔ细胞于是获得了特异性识别和杀伤肿瘤的能力。这种利用抗原呈递细胞结合抗CD3单克隆抗体及特定细胞因子的两步法链式反应激活的细胞被称为CAPRI细胞。CAPRI细胞结合了CIK的非特异性刺激和DC的特异性刺激。
由于CAPRI细胞在肿瘤治疗上的独特效果，从患者体内获取自身PBMC进行扩增和激活的方法已经十分成熟，较为经典的方法是德国申请WO02/087612A中公开的级联引发刺激过程：（1）起始的CD3激活阶段，将PBMC悬浮于培养基中，加入10%的HyClone胎牛血清，并且沉积到固定化的抗CD3单克隆抗体上；（2）IL2辅助阶段，在2-4小时CD3激活之后，加入IL-2，辅助激活并防止凋亡；（3）引发阶段，在2-3小时的IL-2辅助之后，将APC充分活化用于引发初始PBMC；（4）扩充阶段，将经引发的PBMC技术，重新悬浮在具有IL-2的补充培养基中；（5）72小时扩充后收获CAPRI细胞。然而，上述方法中获取PBMC时对患者身体状况具有严格的要求，在①患者白细胞＜4000个/ml、②化疗后不到6周、③停止升白药物后不到2周、④患者体质差不能承受血细胞分离机采集单个核细胞过程、⑤其他不符合血细胞分离机采集单个核细胞的情况下，PBMC的采集无法实现，严重阻碍了CAPRI细胞治疗方案的实施。
针对上述问题，本发明提出了半合子CAPRI细胞制备方法。半合子是染色体有一半相同的个体，如子女和父母、父母和子女、兄弟姐妹之间，这三类关系的直系血亲都能做半合子法。在确定亲属半合子关系的前提下（如母女关系是确定的，母子关系也是确定的，但是父子、父女就不一定），是不用配型的。本发明所提出的半合子CAPRI细胞制备方法可有效避免由于①患者白细胞＜4000个/ml、②化疗后不到6周、③停止升白药物后不到2周、④患者体质差不能承受血细胞分离机采集单个核细胞过程、⑤其他不符合血细胞分离机采集单个核细胞所导致的PBMC无法采集的问题，使CAPRI细胞的治疗应用更加广泛；并且本发明培养方法中增加前期细胞处理步骤，以及双抗体装载方法有效提高了制备所获得CAPRI细胞数目以及肿瘤杀伤能力。
发明内容
本发明提供一种半合子CAPRI细胞制备的方法，其适用于部分不适合利用血细胞分离机采集单个核细胞，无法满足CAPRI细胞培养所需单个核细胞数量的肿瘤患者。
此外，本发明还包括对CAPRI细胞制备步骤的改进，增加前期细胞处理步骤以及双抗体装载方法，以提高CAPRI细胞数目以及肿瘤杀伤能力。
本发明提供一种半合子CAPRI细胞制备方法，操作方法如下：(1)取患者和半合子供体外周血，并分离、纯化外周血单个核细胞(PBMC)；(2)从半合子供体血浆制备血清；(3)PBMC激活；(4)CAPRI细胞扩增；(5)CAPRI细胞收获；(6)CAPRI细胞冻存。
其中，从患者和半合子供体采集外周血，分离、纯化PBMC的具体步骤为：抽取患者、半合子供体外周血100-150ml，加入终浓度为1.5×105U/L的肝素钠抗凝处理，并根据所获取的外周血体积分装至50ml离心管中，1600-1800rpm离心20-30min，弃上清，并在离心管中分别加入25ml生理盐水，小心混匀，沿管壁缓慢分装到预先加有5mlFicoll-Hypaque淋巴细胞分离液的15ml离心管中，2000-2500rpm离心20min后，用巴氏吸管吸取从上向下第二层淋巴细胞层，然后继续用生理盐水1600-1800rpm离心5-10min洗涤两次，弃去上清，即获得PBMC。
其中，从半合子供体血浆制备血清的具体步骤为：将从半合子供体获取的血浆分装入50ml离心管中，2000-2500rpm离心20-30min，取上清，弃底部红细胞，56℃水浴30min灭活补体，2000-2500rpm/min离心20-30min，上清即为所需的血清。
其中，PBMC激活步骤为：将浓度为1μg/ml的CD3单克隆抗体包被于75cm2的细胞培养瓶中，4℃过夜处理并在培养PBMC前用PBS缓冲液冲洗2次，然后取5×106个来自患者的PBMC，使其重悬于48ml含10%半合子供体血清的细胞培养液RPMI1640(含L-谷氨酸)中，混匀分装到4个预先包被CD3单克隆抗体的75cm2培养瓶中，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中培养，3小时后加入浓度为1000-1200U/ml重组人白细胞介素-2（rhIL2）、1000-1200U/ml重组人干扰素-γ（rhIFN-γ）、200-300U/ml重组人白细胞介素-18（rhIL-18），继续培养3小时后，将半合子供体来源的10×106个PBMC用无血清培养基72ml重悬，混匀后平均加到以上4个培养瓶中继续培养48小时。
特别地，所述CD3单克隆抗体为OKT3，该抗体可以特异性结合CD3分子非多态性ε链。
特别地，在进行PBMC激活操作之前，对来自患者的PBMC进行前期细胞处理，具体的所述前期细胞处理步骤为：用含有PHA-L、胞壁酰二肽(MDP)和IFN-γ的无血清培养基稀释至2×106个/ml培养24小时，其中所使用的PHA-L的浓度为15μg/ml，MDP的浓度为5μg/ml，IFN-γ的浓度为1000U/ml。
特别地，PBMC激活步骤所使用的单克隆抗体还包括CD133单克隆抗体，即采用双抗体装载方式对PBMC进行激活，具体操作方法为：将浓度为0.5μg/ml的CD3单克隆抗体和浓度为0.5μg/mlCD133单克隆抗体混匀后包被于75cm2的细胞培养瓶中，4℃过夜处理并在培养PBMC前用PBS缓冲液冲洗2次。
其中，CAPRI细胞扩增步骤为：收集培养的细胞到50ml离心管中，贴壁的细胞用细胞刮刀刮下，1600-1800rpm离心5-10min洗涤一次，去上清，用50ml无血清培养液重悬细胞，计数，根据细胞数量用无血清培养液稀释，需要稀释的体积=细胞总数/100万×1ml，然后加入800-1000U/mlrhIL-2、800-1000U/mlrhIFN-γ、100-200U/mlrhIL-18，将细胞悬液分装于75cm2的培养瓶，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中培养72小时。
其中，CAPRI细胞收获步骤为：收集培养的细胞到50ml离心管中，1600-1800rpm/min离心5-10min洗涤，去上清，用生理盐水重悬细胞，同时取样送质量控制检测。
其中，CAPRI细胞冻存方法为：将生理盐水重悬的细胞1600-1800rpm离心5-10min弃上清并用8ml冷冻液A重悬，充分混匀，置于冰上，缓慢加入8ml预冷的冷冻液B，充分混匀，分装于12支冻存管中，保存于液氮或-80℃低温冰箱中备用。
特别地，冻存液A的组分为：45%PBS+55%人血白蛋白；冻存液B的组分为：80%PBS+12%DMSO+8%右旋糖酐。
上述培养过程中需注意定时镜检，根据细胞生长情况适当扩瓶，并补加800-1000U/mlrhIL-2、800-1000U/mlrhIFN-γ、rh100-200U/mlIL-18。
本发明提供的半合子CAPRI细胞制备的方法，不仅解决了现有技术中由于患者自身状况较差等因素导致的CAPRI细胞培养无法进行的问题，而且其所产生的细胞具有广谱杀瘤作用，并且前期细胞处理步骤使PBMC细胞具有更好的细胞增殖和活化能力，双抗体装载模式更提高了CAPRI细胞的肿瘤细胞杀伤作用。本发明充分发挥了CAPRI细胞优势使患者来源的细胞与半合子供体来源细胞充分合作，弥补了现有技术中的空白。再者，本发明中所提供的细胞冻存液极大提高了冻存细胞的复活能力。
附图说明
图1：患者、半合子供体来源PBMC分离操作图。
图2：患者来源PMBC培养6h后10×20倍镜下图。
图3：加入半合子供体PBMC培养3h后10×20倍镜下图。
图4：CAPRI细胞扩增后24h后10×20倍镜下图。
图5：CAPRI细胞扩增后48h后10×20倍镜下图。
图6：CAPRI细胞扩增后72h后10×20倍镜下图。
具体实施方式
实施例1：患者，60岁，女性，I期乳腺癌改良根治术后，因化疗导致白细胞数目减少，体质差不能承受血细胞分离机采集单个核细胞过程，选择本发明半合子CAPRI细胞制备方法。以下通过实施例对本发明进行具体说明。
抽取患者外周血100ml、半合子供体外周血150ml，加入终浓度为1.5×105U/L的肝素钠抗凝处理，并根据所获取的外周血体积分装至50ml离心管中，1600rpm离心20-30min，弃上清，并在离心管中分别加入25ml生理盐水，小心混匀，沿管壁缓慢分装到预先加有5mlFicoll-Hypaque淋巴细胞分离液的15ml离心管中，2000rpm离心20min后，此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层：血浆层或生理盐水层，第二层：为环状乳白色淋巴细胞层，第三层：为透明分离液层，第四层：为红细胞层（如图1所示）。用巴氏吸管吸取从上向下第二层淋巴细胞层，然后继续用生理盐水1600rpm离心5min洗涤两次，弃去上清，即获得PBMC。同时，从半合子供体血浆制备血清以备后续细胞培养使用，将从半合子供体获取的血浆分装入50ml离心管中，2500rpm离心20min，取上清，弃底部红细胞，56℃水浴30min灭活补体，2000rpm离心20min，上清即为所需的血清。
在进行PBMC激活操作之前，对来自患者的PBMC进行前期细胞处理，具体的所述前期细胞处理步骤为：用含有PHA-L、胞壁酰二肽(MDP)和IFN-γ的无血清培养基稀释至2×106个/ml培养24小时，其中所使用的PHA-L的浓度为15μg/ml，MDP的浓度为5μg/ml，IFN-γ的浓度为1000U/ml。
预先将浓度为1μg/ml的CD3单克隆抗体包被于75cm2的细胞培养瓶中，4℃过夜处理并在培养PBMC前用PBS缓冲液冲洗2次，然后取5×106个来自患者的PBMC，使其重悬于48ml含10%半合子供体血清的细胞培养液RPMI1640(含L-谷氨酸)中，混匀分装到4个预先包被CD3单克隆抗体的75cm2培养瓶中，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中培养，3小时后加入浓度为1000U/ml重组人白细胞介素-2（rhIL2）、1200U/ml重组人干扰素-γ（rhIFN-γ）、200U/ml重组人白细胞介素-18（rhIL-18），继续培养3小时后，将半合子供体来源的10×106个PBMC用无血清培养基72ml重悬，混匀后平均加到以上4个培养瓶中继续培养，并与3h，24h，48h和72h分别在镜下观察细胞生长情况(如图3-6所示)。
收集培养的细胞到50ml离心管中，贴壁的细胞用细胞刮刀刮下，用生理盐水冲洗后也收集到50ml离心管中，1600rpm离心5min洗涤一次，去上清，用50ml无血清培养液重悬细胞，计数5.1×108，根据细胞数量用无血清培养液稀释，需要稀释的体积=5.1×108/100万×1ml=510ml，然后加入800U/mlrhIL-2、800U/mlrhIFN-γ、200U/mlrhIL-18，将细胞悬液分装于4个75cm2的培养瓶，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中继续培养，当培养到48h时，倒置显微镜下观察，细胞密度过大，补加240ml培养液，由4瓶扩增为6瓶继续培养。
因为患者与半合子供体细胞之间存在杀灭的现象，细胞数量有小幅度减少。但由于培养中使用来自半合子供体的血清作为培养液组分可有效缓减上述现象。当培养到72h时CAPRI细胞收获（图6），收集培养的细胞到50ml离心管中，1600rpm离心5min洗涤，去上清，用生理盐水重悬细胞，细胞计数板计数为3.7×109，同时取样送质量控制检测。1600rpm离心5min弃上清并用8ml冷冻液A重悬，充分混匀，置于冰上，缓慢加入8ml预冷的冷冻液B，充分混匀，分装于12支冻存管中，保存于液氮或-80℃低温冰箱中备用。本实施例冻存液配方如下冻存液A的组分为：45%PBS+55%人血白蛋白；冻存液B的组分为：80%PBS+12%DMSO+8%右旋糖酐。
实施例2：患者，男，54岁，肺鳞状细胞癌伴骨转移，放疗+化疗治疗术后白细胞＜4000个/ml，不适合用血细胞分离机采集单个核细胞，选择本发明半合子CAPRI细胞制备方法。以下通过实施例对本发明进行具体说明。
抽取患者外周血120ml、半合子供体外周血150ml，加入终浓度为1.5×105U/L的肝素钠抗凝处理，并根据所获取的外周血体积分装至50ml离心管中，1800rpm离心20-30min，弃上清，并在离心管中分别加入25ml生理盐水，小心混匀，沿管壁缓慢分装到预先加有5mlFicoll-Hypaque淋巴细胞分离液的15ml离心管中，2000rpm离心20min后，此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层：血浆层或生理盐水层，第二层：为环状乳白色淋巴细胞层，第三层：为透明分离液层，第四层：为红细胞层。用巴氏吸管吸取从上向下第二层淋巴细胞层，然后继续用生理盐水1800rpm离心5min洗涤两次，弃去上清，即获得PBMC。同时，从半合子供体血浆制备血清以备后续细胞培养使用，将从半合子供体获取的血浆分装入50ml离心管中，2500rpm离心20min，取上清，弃底部红细胞，56℃水浴30min灭活补体，2000rpm离心20min，上清即为所需的血清。
在进行PBMC激活操作之前，对来自患者的PBMC进行前期细胞处理，具体的所述前期细胞处理步骤为：用含有PHA-L、胞壁酰二肽(MDP)和IFN-γ的无血清培养基稀释至2×106个/ml培养24小时，其中所使用的PHA-L的浓度为15μg/ml，MDP的浓度为5μg/ml，IFN-γ的浓度为1000U/ml。
预先将浓度为0.5μg/ml的CD3单克隆抗体和浓度为0.5μg/mlCD133单克隆抗体混匀后包被于75cm2的细胞培养瓶中，4℃过夜处理并在培养PBMC前用PBS缓冲液冲洗2次，然后取5×106个来自患者的PBMC，使其重悬于48ml含10%半合子供体血清的细胞培养液RPMI1640(含L-谷氨酸)中，混匀分装到4个预先包被CD3单克隆抗体的75cm2培养瓶中，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中培养，3小时后加入浓度为1200U/ml重组人白细胞介素-2（rhIL2）、1000U/ml重组人干扰素-γ（rhIFN-γ）、300U/ml重组人白细胞介素-18（rhIL-18），继续培养3小时后，将半合子供体来源的10×106个PBMC用无血清培养基72ml重悬，混匀后平均加到以上4个培养瓶中继续培养，并与3h，24h，48h和72h分别在镜下观察细胞生长情况。
收集培养的细胞到50ml离心管中，贴壁的细胞用细胞刮刀刮下，用生理盐水冲洗后也收集到50ml离心管中，1800rpm离心5min洗涤一次，去上清，用50ml无血清培养液重悬细胞，计数5.8×108，根据细胞数量用无血清培养液稀释，需要稀释的体积=5.8×108/100万×1ml=580ml，然后加入1000U/mlrhIL-2、1000U/mlrhIFN-γ、100U/mlrhIL-18，将细胞悬液分装于4个75cm2的培养瓶，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中继续培养，当培养到48h时，倒置显微镜下观察，细胞密度过大，补加240ml培养液，由4瓶扩增为6瓶继续培养。
因为患者与半合子供体细胞之间存在杀灭的现象，细胞数量有小幅度减少。但由于培养中使用来自半合子供体的血清作为培养液组分可有效缓减上述现象。当培养到72h时CAPRI细胞收获（图6），收集培养的细胞到50ml离心管中，1600rpm离心5min洗涤，去上清，用生理盐水重悬细胞，细胞计数板计数为4.9×109，同时取样送质量控制检测。1800rpm离心5min弃上清并用8ml冷冻液A重悬，充分混匀，置于冰上，缓慢加入8ml预冷的冷冻液B，充分混匀，分装于12支冻存管中，保存于液氮或-80℃低温冰箱中备用。本实施例冻存液配方如下冻存液A的组分为：45%PBS+55%人血白蛋白；冻存液B的组分为：80%PBS+12%DMSO+8%右旋糖酐。
实施例3：CAPRI细胞体外毒性试验。
本发明还对获得的半合子CAPRI的体外细胞毒性进行检测，将CD3mAb单独刺激产生的CAPRI细胞（CD3mAb-CAPRI）与CD3mAb和CD133mAb协同刺激产生的CAPRI细胞（CD3/CD133mAb-CAPRI）的体外细胞毒性进行比较，具体实验步骤为：将收获的两种不同刺激方式产生的CAPRI细胞作为效应细胞，将对数生长期的人肺鳞状细胞癌NCI-H520细胞株用0.4%台盼兰染色并计数作为靶细胞，以不同效靶比2.5:1，5:1，10:1，20:1将效应细胞和靶细胞用无血清1640培养基调节细胞浓度为1×106/ml，加入96孔板，100μl/孔，另外设置空白对照孔，样品对照孔，样品最大酶活性对照孔，每孔设3个复孔，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中培养24h，用LDH释放法检测杀伤活性。收集实验数据并经SPSS17.0统计软件处理，计量资料用均数标准差`x±s表示，组间比较采用两样本t检验，P<0.05具有统计学意义。实验结果如表1所示，从结果可知CD3mAb-CAPRI和CD3/CD133mAb-CAPRI均对NCI-H520细胞均有显著的杀伤活性，而且CD3/CD133mAb-CAPRI对癌细胞的杀伤活性均明显高于CD3mAb-CAPRI(P<0.05)，在2.5:1～20:1的效靶比范围内，其杀伤作用与效靶比呈正相关。
表1不同刺激源产生CAPRI细胞的体外细胞毒性试验比较
此外，本发明还采用相同的细胞毒性体外实验方法，比较采用本发明冻存液配方冻存复苏CAPRI细胞和采用普通冻存液冻存复苏CAPRI细胞体外细胞毒性的差异，获得的结果如表2所示，从结果可知两种冻存液冻存复苏后CAPRI细胞均对NCI-H520细胞均有显著的杀伤活性，而且采用本发明冻存液配方冻存复苏CAPRI细胞对癌细胞的杀伤活性均明显高于采用普通冻存液冻存复苏CAPRI细胞(P<0.05)。
表2不同冻存液冻存复苏后细胞毒活性比较
所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (7)
1.一种半合子CAPRI细胞制备方法，具体制备方法如下：(1)获取患者和半合子供体外周血，并分离、纯化外周血单个核细胞(PBMC)；(2)从半合子供体血浆制备血清；(3)PBMC激活；(4)CAPRI细胞扩增；(5)CAPRI细胞收获；(6)CAPRI细胞冻存；其中，
所述PBMC激活步骤为：将浓度为0.5μg/ml的CD3单克隆抗体和浓度为0.5μg/mlCD133单克隆抗体混匀后包被于75cm2的细胞培养瓶中，4℃过夜处理并在培养PBMC前用PBS缓冲液冲洗2次，然后取5×106个来自患者的PBMC，使其重悬于48ml含10%半合子供体血清的含L-谷氨酸的细胞培养液RPMI1640中，混匀分装到4个预先包被CD3单克隆抗体的75cm2培养瓶中，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中培养，3小时后加入浓度为1200U/ml重组人白细胞介素-2（rhIL2）、1000U/ml重组人干扰素-γ（rhIFN-γ）、300U/ml重组人白细胞介素-18（rhIL-18），继续培养3小时后，将半合子供体来源的10×106个PBMC用无血清培养基72ml重悬，混匀后平均加到以上4个培养瓶中继续培养48小时；并且，
在进行PBMC激活操作之前，对来自患者的PBMC进行前期细胞处理，具体的所述前期细胞处理步骤为：用含有PHA-L、胞壁酰二肽(MDP)和IFN-γ的无血清培养基稀释至2×106个/ml培养24小时，其中所使用的PHA-L的浓度为15μg/ml，MDP的浓度为5μg/ml，IFN-γ的浓度为1000U/ml。
2.如权利要求1所述的半合子CAPRI细胞制备方法，其特征在于：所述获取患者和半合子供体外周血，并分离、纯化PBMC的步骤为：抽取患者、半合子供体外周血100-150ml，加入终浓度为1.5×105U/L的肝素钠抗凝处理，并根据所获取的外周血体积分装至50ml离心管中，1600-1800rpm离心20-30min，弃上清，并在离心管中分别加入25ml生理盐水，小心混匀，沿管壁缓慢分装到预先加有5mlFicoll-Hypaque淋巴细胞分离液的15ml离心管中，2000-2500rpm离心20min后，用巴氏吸管吸取从上向下第二层淋巴细胞层，然后继续用生理盐水1600-1800rpm离心5-10min洗涤两次，弃去上清，即获得PBMC。
3.如权利要求2所述的半合子CAPRI细胞制备方法，其特征在于：所述半合子供体血浆制备血清的步骤为：将从半合子供体获取的血浆分装入50ml离心管中，2000-2500rpm离心20-30min，取上清，弃底部红细胞，56℃水浴30min灭活补体，2000-2500rpm/min离心20-30min，上清即为所需的血清。
4.如权利要求3所述的半合子CAPRI细胞制备方法，其特征在于：所述CD3单克隆抗体为OKT3，该抗体可以特异性结合CD3分子非多态性ε链。
5.如权利要求4所述的半合子CAPRI细胞制备方法，其特征在于：所述CAPRI细胞扩增步骤为：收集培养的细胞到50ml离心管中，贴壁的细胞用细胞刮刀刮下，1600-1800rpm离心5-10min洗涤一次，去上清，用50ml无血清培养液重悬细胞，计数，根据细胞数量用无血清培养液稀释，需要稀释的体积=细胞总数/100万×1ml，然后加入800-1000U/mlrhIL-2、800-1000U/mlrhIFN-γ、100-200U/mlrhIL-18，将细胞悬液分装于75cm2的培养瓶，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中培养72小时。
6.如权利要求5所述的半合子CAPRI细胞制备方法，其特征在于：所述CAPRI细胞收获步骤为：收集培养的细胞到50ml离心管中，1600-1800rpm/min离心5-10min洗涤，去上清，用生理盐水重悬细胞，同时取样送质量控制检测。
7.如权利要求6所述的半合子CAPRI细胞制备方法，其特征在于：所述CAPRI细胞冻存方法为：将生理盐水重悬的细胞1600-1800rpm离心5-10min弃上清并用8ml冷冻液A重悬，充分混匀，置于冰上，缓慢加入8ml预冷的冷冻液B，充分混匀，分装于12支冻存管中，保存于液氮或-80℃低温冰箱中备用，其中冻存液A的组分为：45%PBS+55%人血白蛋白；冻存液B的组分为：80%PBS+12%DMSO+8%右旋糖酐。
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