CN106795493A - 使用双膦酸盐、抗cd3抗体和il‑2扩增t细胞群体 - Google Patents

使用双膦酸盐、抗cd3抗体和il‑2扩增t细胞群体 Download PDF

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Abstract

本发明提供了通过用二膦酸盐孵育外周血单核细胞，然后用抗CD3抗体和IL‑2孵育来扩增T细胞群体,包括γδT细胞的方法。还提供了包含扩增的T细胞的药物组合物，用于治疗传染病、自身免疫病或恶性疾病。

Description

使用双膦酸盐、抗CD3抗体和IL-2扩增T细胞群体
发明领域
本发明涉及用于扩增T细胞群体，包括γδT细胞的方法。本发明还涉及包含扩增的T细胞的药物组合物，及其用于治疗传染病、自身免疫病和恶性疾病的用途。
发明背景
尽管科学和医学进步，癌症和传染病仍然是全世界，并且主要是发达国家中的主要死因。免疫系统在控制这些疾病中的作用是已知的，且其操作已成为极为可能的治疗策略。
基于细胞的免疫疗法被证明对某些癌症有效。发现对T细胞群体的操作引起疾病退化和肿瘤细胞死亡。例如，自体肿瘤浸润淋巴细胞用于治疗患转移性黑素瘤患者(Rosenberg等人.Science 1986,233:1318–1321)。发现将识别肿瘤细胞上表达的抗原的αβT细胞输注到癌症患者引起白血病肿瘤细胞死亡，导致临床改善和甚至恢复。然而，仅少部分患者受益于αβT细胞疗法，表明需要另外的治疗形式。
近来，γδT细胞在治疗癌症和传染病方面的潜力已被认识到，但是在具有癌症或慢性感染的患者中，γ9δ2 T细胞的数量和功能被抑制。已经表明，自体离体扩增的γ9δ2T细胞的施用引起抗癌作用，偶尔导致转移性疾病的治愈。
美国专利号8,609,410公开了一种用于活化抗原递呈细胞的方法，该方法包括在体外用二膦酸盐和疾病抗原共刺激抗原递呈细胞。
美国专利申请号13/001,581(公布号2012/0107292)公开了一种培养疾病抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和γδT细胞的方法，包括向从血液中分离出的外周血单核细胞的培养物中加入氨基二膦酸盐和疾病抗原，并进行培养程序，直到抗原特异性CTL和γδT细胞增殖并达到对治疗有效的数量。
Itzhaki等人(J Immunothe.34(2):212-220,2011)描述了使用抗CD3抗体和IL-2对肿瘤浸润淋巴细胞的大规模扩增。
Lopez等人(Blood,96(12):3827-3837,2000)公开了，γδ-T细胞对由T细胞有丝分裂原OKT3(抗CD3抗体)和IL-2诱导的细胞凋亡异常敏感。
对于有效的离体T细胞，特别是γδT细胞扩增平台仍然存在未被满足的需求，所述扩增平台可提供极大产量的可用于免疫治疗的存活且有效的细胞。
发明概述
本发明提供了大规模活化和扩增T细胞群体，包括γδT细胞群体的方法。T细胞可来源于需要用所述细胞免疫治疗的受试者或来自另一受试者的外周血单核细胞(PBMC)。扩增方法主要包括两个阶段的扩增，包括第一扩增阶段和第二扩增阶段，第一扩增阶段基于唑来膦酸和任选地白介素-2(IL-2)刺激，第二扩增阶段包括用αCD3和被辐照的饲养细胞PBMC(外周血单核细胞，任选地，同种异体的)和IL-2孵育。
本发明还提供了治疗有其需要的受试者的方法，包括在扩增所述细胞后分别自体或同种异体移植来源于所述受试者或另一受试者的PBMC的γδT细胞，从而使得能够进行实现医学改善或治愈所需的众多移植周期。
因此，如下文所示，顺序施用唑来膦酸刺激与IL-2，然后对γδT细胞群进行阴性(或阳性)选择，且随后用αCD3和IL-2孵育，提供了非常高产量的存活和有能力的γδT细胞。因此，本发明的方法适用于过继性免疫治疗，允许有效和长期的治疗。
根据一些实施方案，提供了一种用于快速扩增T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供包含T细胞群体的外周血单核细胞；
(ii)在包含至少一种二膦酸盐的第一培养基中孵育所述外周血单核细胞(PBMC)持续第一时间段，从而获得所述T细胞群体的第一阶段扩增；和
(iii)在包含α-CD3抗体和IL-2的第二培养基中孵育所述外周血单核细胞持续第二时间段，从而获得所述T细胞群体的第二阶段扩增，其中所述第二阶段扩增为至少100倍扩增。
应当理解，本文公开的扩增的倍数是指相对于进入某一(第一或第二)扩增阶段的细胞数目，在该特定阶段结束时的细胞数量的变化倍数。T细胞群体经受步骤(ii)后的扩增也被称为“第一阶段扩增”、“I阶段扩增”或“PIE”，其中T细胞群体经受步骤(iii)后的扩增也被称为“第二阶段扩张”、“快速扩增程序”或“REP”。
在一些实施方案中，T细胞群体包含γδT细胞。在一些实施方案中，T细胞群体由γδT细胞组成。
在一些实施方案中，外周血单核细胞从罹患恶性疾病、自身免疫病或传染病的受试者获得。在一些实施方案中，外周血单核细胞从未罹患恶性疾病、传染病或自身免疫病的健康供体获得。
在一些实施方案中，所述第一阶段扩增是相对于在第一阶段扩增之前所述T细胞群体中的初始细胞数，这一群体的至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍或至少500倍扩增。
在一些实施方案中，所述第一阶段扩增是相对于在第一阶段扩增之前所述T细胞群体中的初始细胞数，这一群体的100至1000倍范围内的扩增。
在一些实施方案中，所述T细胞群体由γδT细胞组成，并且所述第一阶段扩增是相对于在第一阶段扩增之前所述γδT细胞群体中的初始细胞数，即相对于步骤(i)中提供的初始PBMC中的γδT细胞的数目，这一群体的100至1000倍范围内的扩增。
在一些实施方案中，所述第二阶段扩增是相对于在第一阶段扩增之后且在第二阶段扩增之前所述T细胞群体中的细胞数，这一群体的至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍或至少500倍扩增。
在一些实施方案中，所述第二阶段扩增是相对于在第一阶段扩增之后和进入第二阶段扩增之前所述T细胞群体中的细胞数，这一群体的100至1000倍范围中的扩增。
在一些实施方案中，所述T细胞群体由γδT细胞组成，并且所述第二阶段扩增是相对于在第一阶段扩增之后和在第二阶段扩增之前所述γδT细胞群体中的细胞数，这一群体的100至1000倍、或500倍至1000倍范围内的扩增。
在一些实施方案中，所述T细胞群体由γδT细胞组成，其中所述γδT细胞在所述第一阶段扩增和所述第二阶段扩增后经历104倍至106倍范围内的总体扩增。在一些实施方案中，所述方法还包括将步骤(iii)中获得的T细胞群体或其一部分移植到所述受试者。
在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(iii)之前从所述外周血单核细胞中选择和分离T细胞，并将分离的T细胞孵育在所述第二培养基中。在一些实施方案中，选择包括阴性选择。在一些实施方案中，选择包括阳性选择。
在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(iii)之后选择和分离γδT细胞。
在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(ii)或(iii)中的任一步骤之后另外的选择步骤，其包括使用免疫磁性柱的阴性选择。
在一些实施方案中，第一培养基还包含IL-2。
在一些实施方案中，步骤(i)中的所述外周血单核细胞具有约0.5X106至1X106细胞/ml的细胞密度。
在一些实施方案中，第二时间段是至少10天。
在一些实施方案中，所述至少一种二膦酸盐选自由以下组成的组：唑来膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、英卡膦酸、依替膦酸、利塞膦酸、替鲁膦酸、其组合、其盐及其水合物。每种可能性是本发明的单独的实施方案。
在一些实施方案中，所述至少一种二膦酸盐是唑来膦酸。
在一些实施方案中，所述第二培养基还包含被辐照的外周血单核细胞。
根据一些实施方案，提供了包含通过以下得到的T细胞群体的药物组合物：
(i)提供包含T细胞群体的外周血单核细胞；
(ii)在包含至少一种二膦酸盐的第一培养基中孵育所述外周血单核细胞持续第一时间段，从而获得所述T细胞群体的第一阶段扩增；和
(iii)在包含α-CD3抗体和IL-2的第二培养基中孵育从所述第一培养基收回的外周血单核细胞持续第二时间段，从而获得所述T细胞群体的第二阶段扩增，其中所述第二阶段扩增为至少100倍扩增。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包含至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含治疗有效量的T细胞。
在一些实施方案中，T细胞群体包含来源于PBMC的γδT细胞。在一些实施方案中，T细胞群体由来源于PBMC的γ9δ2T细胞组成。在一些实施方案中，γδT细胞包含来源于PBMC的同种异体γδT细胞。在一些实施方案中，γδT细胞包含来源于PBMC的自体γδT细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含来源于需要γδT细胞移植的受试者的PBMC的自体γδT细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含来源于需要γδT细胞移植的受试者的PBMC的同种异体γδT细胞。
在一些实施方案中，药物组合物包含在所述第一和第二培养基中孵育自体外周血单核细胞之后从所述外周血单核细胞获得的自体γδT细胞。
在一些实施方案中，药物组合物包含在所述第一和第二培养基中孵育同种异体外周血单核细胞之后从所述外周血单核细胞获得的同种异体γδT细胞。
在一些实施方案中，药物组合物是以细胞悬液形式。
在一些实施方案中，药物组合物用于在有其需要的受试者中治疗传染病、自身免疫病或恶性疾病。
根据一些实施方案，提供治疗传染病、自身免疫病或恶性疾病的方法，包括：
(i)从第一受试者获得包含T细胞群体的外周血单核细胞；
(ii)在包含至少一种二膦酸盐的第一培养基中孵育所述外周血单核细胞持续第一时间段，从而获得所述T细胞群体的第一阶段扩增；
(iii)在包含α-CD3抗体和IL-2的第二培养基中孵育所述外周血单核细胞持续第二时间段，从而获得所述T细胞群体的第二阶段扩增，其中所述第二阶段扩增为至少100倍扩增；和
(iv)向第二受试者施用所述细胞或其一部分。
在一些实施方案中，所述第二受试者和所述第一受试者是同一受试者。在一些实施方案中，所述第二受试者不同于所述第一受试者。在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(iii)之前从所述外周血单核细胞中选择和分离T细胞，并将分离的T细胞孵育在所述第二培养基中。
在一些实施方案中，T细胞群体包含γδT细胞。在一些实施方案中，T细胞群体由γδT细胞组成。
在一些实施方案中，所述方法还包括多重复步骤(iv)至少一次。
在一些实施方案中，所述方法还包括重复步骤(iv)，直到完成所述传染性、自身免疫性或恶性疾病或病症的治疗。
在一些实施方案中，治疗所述传染性、自身免疫性或恶性疾病或病症包括抑制所述传染性、自身免疫性或恶性疾病或病症，减弱所述传染性、自身免疫性或恶性疾病或病症，实现从与所述传染病、自身免疫病或恶性疾病相关的症状中缓解，以及其组合。
在一些实施方案中，提供了用于扩增T细胞的试剂盒，该试剂盒包含：
(i)至少一个第一容器，其包含含有至少一种二膦酸盐的第一培养基；
(ii)至少一个第二容器，其包含含有α-CD3抗体和IL-2的第二培养基；和
(iii)使用所述试剂盒扩增T细胞群体的书面说明。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于选择T细胞的装置。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于选择T细胞的一个或更多个柱。在一些实施方案中，T细胞群体包含γδT细胞。在一些实施方案中，T细胞群体由γδT细胞组成。
在一些实施方案中，至少一种容器还包含IL-2。
在一些实施方案中，提供了用于治疗传染病、恶性疾病或自身免疫病的试剂盒，该试剂盒包含：
(i)至少一种第一容器，其在提供长期储存的条件中包含针对γδT细胞被富集的T细胞群体，其中所述T细胞群体通过以下获得：
a.提供包含T细胞群体的外周血单核细胞；
b.在包含至少一种二膦酸盐的第一培养基中孵育所述外周血单核细
胞持续第一时间段，从而获得针对γδT细胞被富集的所述T细胞群体
的第一阶段扩增；和
c.在包含α-CD3抗体和IL-2的第二培养基中孵育所述外周血单核细
胞持续第二时间段，从而获得针对γδT细胞被富集的所述T细胞群体
的至少100倍扩增的第二阶段扩增；和
(ii)在有其需要的受试者中使用所述试剂盒移植所述T细胞群体的书面说明。
在一些实施方案中，至少一个第一容器中的T细胞群体包含治疗有效量的γδT细胞。
从下文提供的详述和附图中，本发明的另外的实施方案、特征、优势和适用性的全部范围将变得明显。然而，应该理解，尽管指出了本发明的优选实施方案，详述仅通过示例的方式提供，因为根据该详述，在本发明的精神和范围内的多种改变和修改对本领域技术人员将变得明显。
附图简述
示例性实施方案在所述及的附图中被阐释。预期本文公开的实施方案和附图将被认为是说明性的而非限制性的。附图如下所列。
图1A显示在健康供体(HD,n＝6)和癌症患者(CP,n＝2)中的第一阶段扩增(PIE)期间的细胞总数。
图1B显示在HD(健康供体)和CP(癌症患者)中接种(第0天)和REP(第14天)后的CD3+γ9+T细胞数(60-99％纯度)。
图1C显示REP后γδT细胞的扩增倍数。
图2A是用针对CD3(Y轴)和γ9(X轴)的单克隆抗体染色的健康供体的PBMC的流式细胞术点图，表明2.64％的细胞是CD3+γ9+T细胞。
图2B是用针对CD3(Y轴)和γ9(X轴)的单克隆抗体染色的用唑来膦酸盐和IL-2培养14天后的健康供体的PBMC的流式细胞术点图，表明79.6％的细胞是CD3+γ9+T细胞。
图3A是图2B中的细胞在被剥离CD4和CD8细胞(通过免疫磁性柱)之后的流式细胞术点图，导致含有97.7％CD3+γ9+T细胞的细胞群。
图3B是图3A中展示的细胞群体内的CD4和CD8细胞群的流式细胞术点图(在CD4和CD8被剥离后)。
图4是图3A中展示的细胞群体在用抗-CD3抗体和IL-2培养后的流式细胞术点图，导致87.1％的CD3+γ9+T细胞。
图5显示了在REP下用(Zol)或无唑来膦酸盐(Med)培养的多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞系的IFNγ分泌。计算与对照组(Med)相比，唑来膦酸盐的P值。
图6A显示用唑来膦酸盐培养的效应γδT细胞(圆圈)；用唑来膦酸盐培养的效应αβT细胞(菱形)；在不存在唑来膦酸盐下培养的效应γδT细胞(方格)；和在不存在唑来膦酸盐下培养的效应αβT(三角形)孵育的T98G多形性胶质母细胞瘤细胞的比细胞毒性(％)。
图6B显示用唑来膦酸盐培养的效应γδT细胞(圆圈)；用唑来膦酸盐培养的效应αβT细胞(菱形)；在不存在唑来膦酸盐下培养的效应γδT细胞(方格)；和在不存在唑来膦酸盐的下培养的效应αβT(三角形)孵育的U251多形性胶质母细胞瘤细胞的比细胞毒性(％)。
图6C显示用唑来膦酸盐培养的效应γδT细胞(圆圈)；用唑来膦酸盐培养的效应αβT细胞(菱形)；在不存在唑来膦酸盐下培养的效应γδT细胞(方格)；和在不存在唑来膦酸盐下培养的效应αβT(三角形)孵育的U87多形性胶质母细胞瘤细胞的比细胞毒性(％)。
图6D显示用唑来膦酸盐培养的效应γδT细胞(圆圈)；用唑来膦酸盐培养的效应αβT细胞(菱形)；在不存在唑来膦酸盐下培养的效应γδT细胞(方格)；和在不存在唑来膦酸盐下培养的效应αβT(三角形)孵育的Daudi淋巴瘤细胞的比细胞毒性(％)。
发明详述
本发明提供了用于离体扩增T细胞群体的方法。在培养中扩增存活和功能性免疫细胞的能力提供了潜在的免疫治疗工具。本发明的教导进一步提供了两个细胞扩增步骤，其被发现产生异常高产量的相对罕见的T细胞亚群，γδT细胞。扩增的γδT细胞群可从受试者的PBMC细胞获得，并且根据本发明的方法扩增后，可通过移植用于许多治疗。扩增的γδT细胞群体对于许多植入可能是足够的，每次可将一部分被扩增的群体重新引入受试者用于免疫治疗。
Gamma delta T细胞(γδT细胞)代表在其表面上具有独特T细胞受体(TCR)的T细胞亚群群体。这些细胞在外周血T细胞中相对罕见(1-10％)。大多数T细胞具有αβTCR，其包括α和β糖蛋白链。与之相比，γδT细胞具有由一条γ链和一条δ链组成的TCR。与αβT细胞相反，γδT细胞的活化不依赖于主要组织相容性复合物分子的抗原呈递，而是由病原体来源的抗原和在应激如癌症、自身免疫病和传染病中被上调的自身分子介导。在成人外周血中，大多数γδT细胞表达包括Vδ2和Vγ9基因区段的TCR。
人类γδTCR，特别是表达γ9和δ2基因的那些，表现为识别非蛋白来源的抗原。这些抗原对于多种致病细菌是常见的，并且也以非常低的水平在人类细胞中表达，逃避被循环的γ9+δ2+γδT细胞识别。然而，作为甲羟戊酸途径中的代谢物的这些抗原(最重要的是异戊烯基焦磷酸盐，IPP)，变得被“病态”或“应激”的人类细胞过表达，包括各种各样的癌症和细菌和病毒感染的细胞。IPP水平的提高使γ9δ2T细胞能够区分被感染的或癌性的“应激”的细胞与健康细胞。γ9δ2TCR对这些常见的抗原的识别触发细胞毒性响应，导致癌细胞的杀伤和细胞因子，特别是IFNγ的分泌，这些细胞因子对于增加针对癌症或感染的免疫应答至关重要。区分肿瘤细胞与健康细胞的另一种手段是通过上调自身抗原如热休克蛋白(HSP)和NKG2D受体的配体。
虽然γ9δ2T细胞固有地存在于人体内并且可潜在地杀死癌性细胞，但它们表现为不足以控制已经发展的癌症和/或扩散的癌症。此外，在癌症患者和在患包括结核病和AIDS的慢性感染患者中，这些细胞的数量和功能可能被抑制。然而，幸运的是，根据本发明的方法，从这些患病个体的血液中收集的γ9δ2T细胞可在实验室中被活化并显著扩增。此外，根据本发明的方法，从健康供体的血液中收集的γ9δ2 T细胞可在实验室中被活化并显著扩增。
本文所用的术语“健康受试者”、“健康供体”和“健康个体”是指这样的个体，其捐赠包含T细胞群体的外周血细胞以便按照本发明的方法扩增γ9δ2T细胞，以及用于同种异体移植。健康供体可以，或可不，罹患需要移植γ9δ2T细胞的疾病或病症。在这一背景中，需要γ9δ2T细胞移植的受试者是接受者。在自体移植的情形中，供体和接受者是同一个体。
γδT细胞在培养物中是敏感的，显示出与αCD3和IL-2孵育时的凋亡倾向(Lopez等人，同上)。凋亡通常在培养10-14天后开始。出乎意料的是，本发明的方法能够实现两阶段扩增，这导致γδT细胞的高产量。因此，本发明的方法克服了凋亡引起的扩增障碍。
有利地，通过本发明的方法获得的γδT细胞群体可用于许多免疫治疗周期。
本文使用的术语“γδT细胞”和“γ9δ2T细胞”是可互换的。不受任何理论或机制的束缚，二膦酸盐和任选地IL-2刺激的组合，随后在α-CD3和IL-2以及任选地被辐照的外周血单核细胞(以下也称为“饲养细胞”)的存在下培养，使得能够显著扩增，同时保持细胞的活力和效力。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于快速扩增T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供包含T细胞群体的外周血单核细胞；
(ii)在包含至少一种二膦酸盐和IL-2的第一培养基中孵育所述外周血单核细胞持续第一时间段；和
(iii)在包含α-CD3抗体和IL-2以及同种异体的被辐照的单核细胞的第二培养基中孵育所述外周血单核细胞持续第二时间段，从而获得所述T细胞群体的至少100倍扩增。
本文所用的术语“细胞扩增”是指相对于初始群体中的细胞数目，扩大细胞群体导致更大细胞数量的过程。通常，并如本文所教导的，细胞扩增离体进行，例如在培养皿中进行。从组织或从外周血系统取出细胞，并暴露于扩增细胞群体的增殖剂。细胞扩增也可指与正常增殖速率相比导致细胞数量增加更快的操作。在一些实施方案中，根据本发明的扩增阶段的扩增速率为每两周至少100倍。在其他实施方案中，根据本发明的扩增阶段的扩增速率为每两周至少300倍。细胞扩增可以与“富集”互换，是指T细胞群体对γδT细胞的富集。根据本文公开的方法，γδT细胞的富集可以是至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％和至少90％的富集。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
PBMC是获得免疫细胞诸如淋巴细胞的良好来源。在一些实施方案中，PBMC来源于罹患癌症、自身免疫病或传染病的受试者的血液。在一些实施方案中，PBMC来源于健康受试者的血液。感兴趣的细胞可被进一步分离并离体扩增，随后作为免疫治疗剂再引入患者系统。
术语“再引入”、“移植”、“植入”和“注入”是可互换的，并是指将本发明的扩增的T细胞施用于罹患需要使用所述细胞治疗的疾病或病症的受试者。因此，施用还包括植入根据本发明的扩增的细胞。在一些实施方案中，植入是自体植入。
在一些实施方案中，初始PBMC分离程序可包括使用ficoll，ficoll是一种分离血液层的高度支化亲水性多糖。Ficoll可用于将PBMC与血浆、多形核细胞和红细胞分离。
在一些实施方案中，扩增的第一步骤包括使用一种或更多种二膦酸盐。二膦酸盐是通常用于防止骨量损失的药物。这些剂还用于治疗与骨损失和/或变形相关的疾病，诸如骨质疏松症、变形性骨炎，骨转移(伴随或不伴随高钙血症)和多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，所述二膦酸盐选自由以下组成的组：唑来膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、英卡膦酸、依替膦酸、利塞膦酸、替鲁膦酸、其组合、其盐及其水合物。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在另一个实施方案中，二膦酸盐是唑来膦酸或唑来膦酸盐。
在一些实施方案中，二膦酸盐浓度是从0.1至10μM。在一些实施方案中，二膦酸盐浓度是从0.5至6μM。在一些实施方案中，二膦酸盐浓度是从1至3μM。在一些实施方案中，二膦酸盐浓度是约2μM。
本文所用的术语“约”是指大约、大致、周围或在该区域中。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过将所述数值的上方和下方的边界延伸来修改该范围。通常，术语“约”在本文中用于通过向上或向下(更高或更低)20％，任选地10％的变化将数值修改为高于和低于所述的值。
根据一些实施方案，可向第一扩增步骤中加入另外的增殖剂。在一些实施方案中，将白介素2(IL-2)加入到第一培养基中。在一些实施方案中，IL-2是重组人IL-2。在一些实施方案中，每3天更换具有IL-2的新鲜培养基。在一些实施方案中，IL-2浓度是从20至400国际单位(IU)/ml。在一些实施方案中，IL-2浓度是从50至200国际单位(IU)/ml。在一些实施方案中，IL-2浓度是约100国际单位(IU)/ml。
第一步骤扩增的时间，也称为“第一时间段”，是约两周。在一些实施方案中，第一时间段是从7至20天。在一些实施方案中，第一时间段是从12至16天。在一些实施方案中，第一时间段是约14天。
在一些实施方案中，第二时间段是至少7天、至少10天、或约14天。
在一些实施方案中，第二时间段包括用抗CD3(α-CD3)抗体和IL-2孵育包含γδT细胞的PBMC细胞。
在一些实施方案中，第二时间段还包括用被辐照的PBMC细胞孵育所述细胞。
在一些实施方案中，所述α-CD3抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述α-CD3抗体是OKT3。
抗CD3包括OKT3，OKT3是一种靶向T细胞表面的CD3受体的单克隆抗体。OKT3被FDA批准用于减少患者器官移植后的急性排斥反应。
在一些实施方案中，第二培养基包含浓度为从约0.05ng/ml至1μg/ml的α-CD3抗体。在一些实施方案中，所述第二培养基中的α-CD3抗体浓度为约0.1ng/ml至0.5μg/ml。在一些实施方案中，α-CD3抗体浓度为约2ng/ml至100ng/ml。在一些实施方案中，所述第二培养基中的α-CD3抗体浓度为约20ng/ml至40ng/ml。在一些实施方案中，所述第二培养基中的α-CD3抗体浓度为约30ng/ml。
在第一和/或第二步骤的扩增之后，细胞可还经历选择步骤。选择步骤旨在提高扩增方法的特异性，即，将方法集中于特定细胞的扩增。在一些实施方案中，选择步骤是使用免疫磁性柱的阴性选择。在一些实施方案中，选择步骤是阳性选择。例如，阳性选择可包括用针对Vγ9表位的鼠单克隆抗体染色PBMC，并在免疫磁性抗鼠柱上传代细胞。与柱结合的细胞是进一步处理所需的富集细胞。
在一些实施方案中，本发明的方法还包括在步骤(iii)之前从外周血单核细胞中选择和分离T细胞，并将分离的T细胞孵育在所述第二培养基中。
在一些实施方案中，本发明的方法还包括在步骤(iii)之前从外周血单核细胞中选择和分离γδT细胞，并将分离的γδT细胞孵育在所述第二培养基中。
在一些实施方案中，使用施加特异性单克隆抗体(mAb)免疫剥离CD4和CD8细胞来选择和分离(纯化)γδT细胞。在与mAb结合后，将细胞与IgG微珠结合并通过MACS柱。在一些实施方案中，对于γδT细胞的选择使用抗TCR单克隆抗体。
经历根据本发明的扩增的细胞可用于通过自体或同种异体移植治疗癌症、自身免疫病和传染病的免疫疗法。
在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(iii)之后选择和分离γδT细胞。
在一些实施方案中，第一培养基还包含白介素-2。
在一些实施方案中，外周血单核细胞以约0.5X106至1X106细胞/ml的细胞密度提供。
在一些实施方案中，所述第二培养基还包含被辐照的外周血单核细胞。
本发明的方法可用作治疗恶性疾病、自身免疫病或传染病的免疫疗法。发现人γδT细胞在体外杀死各种各样的肿瘤细胞，包括白血病、淋巴瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和多种类型的癌。
术语“恶性”在本文中以其最广泛的含义使用，并且是指以不受控制的细胞生长为特征的疾病家族。它包括但不限于肾上腺皮质癌、肛门癌、膀胱癌、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、松果体肿瘤、下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌、类癌瘤、癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、肝外胆管癌、尤因氏肿瘤家族(pnet)、颅外生殖细胞肿瘤、眼癌、眼内黑素瘤、胆囊癌、胃癌、生殖细胞肿瘤、性腺外、妊娠性滋养层细胞瘤、头颈癌、下咽癌、胰岛细胞癌、喉癌、白血病、急性成淋巴细胞白血病、口腔癌、肝癌、肺癌、小细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金病、恶性间皮瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、转移性鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、蕈状真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性病症、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤(ovarian low malignant potentialtumor)、胰腺癌、外分泌胰腺癌、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤癌、垂体癌、浆细胞肿瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾细胞癌、唾液腺癌、塞扎里综合征、卡波西肉瘤、小肠癌、软组织肉瘤、胸腺瘤、恶性甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、肉瘤、儿童不常见的癌症(unusualcancer of childho od)、阴道癌、外阴癌或维尔姆斯肿瘤、与化疗治疗有关的良性病况，诸如狼疮、类风湿关节炎和皮肤疾病。每种可能性代表本发明的另一实施方案。
在一些实施方案中，恶性疾病选自由肾细胞癌、脑癌和肺癌组成的组。每种可能性代表本发明的另一实施方案。
本文使用的术语“传染病”没有限制，并且可以是任何致病因子的结果。传染病可以是例如病毒感染诸如艾滋病、乙型和丙型肝炎，细胞感染，细菌感染，寄生虫和真菌的结果。
本文所用的术语“自身免疫病”是指由身体针对其自身组织的免疫应答引起的疾病和病症，引起长时间的炎症和随后的组织破坏。自身免疫性疾病和病症的非限制性实例包括尤其是，斑秃、1型糖尿病、吉兰-巴雷综合征、多发性硬化症、类风湿性关节炎、硬皮病、多肌炎、白癜风和系统性红斑狼疮。
在一些实施方案中，本发明提供包含通过本发明方法获得的T细胞群体的药物组合物。在一些实施方案中，T细胞群体包含来源于PBMC的γδT细胞。在一些实施方案中，T细胞群体由来源于PBMC的γ9δ2T细胞组成。
在一些实施方案中，药物组合物包含在第一培养基中孵育所述外周血单核细胞第一时间段，然后在第二培养基中孵育第二时间段后从外周血单核细胞获得的γδT细胞，其中所述第一培养基包含至少一种二膦酸盐，和任选地IL-2，所述第二培养基包含α-CD3抗体和IL-2，以及任选地被辐照的外周血单核细胞。在一些实施方案中，所述外周血单核细胞可来源于同种异体来源。在一些实施方案中，所述外周血单核细胞可来源于自体来源。
如本文所用的，“药物组合物”是指包含适合施用于患者的根据本发明的T细胞的组合物的制剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包含至少一种药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物可还包含一种或更多种稳定剂。
本发明还提供一种在有其需要的受试者中治疗传染性、自身免疫性或恶性疾病或病症的方法，包括：
(i)从第一受试者获得包含T细胞群体的外周血单核细胞(PBMC)；
(ii)在包含至少一种二膦酸盐和IL-2的第一培养基中孵育所述外周血单核细胞持续第一时间段，从而获得刺激的细胞群体；和
(iii)在包含α-CD3抗体和IL-2的第二培养基中孵育所述刺激的细胞群体持续第二时间段，从而获得扩增的细胞群体；和
(iv)向第二受试者施用所述扩增的细胞群体或其一部分。
在一些实施方案中，所述第一受试者是具有传染性、自身免疫性或恶性疾病或病症的受试者，所述第二受试者是供体，并且步骤(iv)是同种异体移植。在一些实施方案中，所述第一受试者和所述第二受试者是罹患传染性、自身免疫性疾病或恶性疾病或病症的受试者，并且步骤(iv)是自体移植。在一些实施方案中，所述第二培养基还包含被辐照的外周血单核细胞。在一些实施方案中，所述外周血单核细胞是同种异体外周血单核细胞。
在一些实施方案中，所述扩增的细胞群体的部分对应于治疗有效量的细胞。
在一些实施方案中，所述扩增的细胞群体的部分以药物组合物的形式提供。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指在一段时间内被施用药物组合物的生物体内，至少部分地预防或改善特定疾病例如，传染性、自身免疫性或恶性疾病的症状病征的药物组合物的量。
在一些实施方案中，步骤(iv)被多重复至少一次。在一些实施方案中，步骤(iv)重复多次。在一些实施方案中，步骤(iv)被重复到实现期望的治疗效果。
在一些实施方案中，本发明提供包含通过本发明的方法获得的T细胞的药物组合物，用于在有其需要的受试者中治疗传染性或自身免疫性疾病或恶性疾病或病症。
本发明还提供了用于扩增T细胞的试剂盒，该试剂盒包含：
(i)至少一个第一容器，其包含含有至少一种二膦酸盐的第一培养基；
(ii)至少一个第二容器，其包含含有α-CD3抗体和IL-2的第二培养基；和
(iii)使用所述试剂盒扩增T细胞群体的书面说明。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于选择T细胞的装置。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于选择T细胞的一个或更多个柱。在一些实施方案中，T细胞群体包含γδT细胞。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于培养细胞的培养装置。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含被辐照的PBMC。
在一些实施方案中，第一培养基还包含IL-2。
在一些实施方案中，第二培养基还包含被辐照的PBMC。
在一些实施方案中，试剂盒还包含至少一个第三容器，其包含含有T细胞群体的外周血细胞。在一些实施方案中，T细胞群体包含γδT细胞。在一些实施方案中，T细胞群体由γδT细胞组成。
在一些实施方案中，试剂盒还包括使用所述至少一个第一容器的说明书。根据一些实施方案，试剂盒还包括使用所述至少一个第二容器的说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包括用于调整使用所述试剂盒扩增的细胞对有其需要的受试者的施用的说明书。
在一些实施方案中，所述至少第一容器内的所述第一培养基和所述至少第二容器内的所述第二培养基中的每一种在适于保持所述培养基及其中包含的组分的稳定性的储存条件下储存。
合适的储存条件是指在储存时基本上保持培养基和培养基中的生物活性成分的物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性所需的条件。在一些实施方案中，所述第一和第二培养基中的每一种在室温(约25℃)或在30℃至少1个月是稳定的，和/或在约2-8℃至少1年或至少2年是稳定的。在一些实施方案中，所述第一和第二培养基中的每一种在培养基冷冻(至例如-70℃)和解冻之后是稳定的。在一些实施方案中，本发明的试剂盒还包含用于选择特定细胞的抗体。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于阴性选择γδT细胞的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于阳性选择γδT细胞的试剂。
在一些实施方案中，提供了用于治疗传染病、自身免疫病或恶性疾病的试剂盒，该试剂盒包含：
(i)至少一种第一容器，其包含针对γδT细胞被富集的T细胞群体，其中所述T细胞群体通过以下获得：
a.提供包含T细胞群体的外周血单核细胞；
b.在包含至少一种二膦酸盐的第一培养基中孵育所述外周血单核细
胞持续第一时间段；和
c.在包含α-CD3抗体和IL-2的第二培养基中孵育所述外周血单核细
胞持续第二时间段，从而获得针对γδT细胞被富集的所述T细胞群体
的至少100倍扩增；和
(ii)在有其需要的受试者中使用所述试剂盒用于移植所述T细胞群体的书面说明。
在一些实施方案中，至少一个第一容器中的T细胞群体包含治疗有效量的γδT细胞。
在一些实施方案中，所述至少一个容器被保持在提供在其所包含的T细胞群体的长期储存的条件下。在一些实施方案中，所述至少一种第一容器在低温条件下储存。
通常，将至少一个容器冷冻并储存。细胞培养物的这种储存要求相对较少的时间和精力用于其维护，只要至少一个第一容器被保持在超冷(-130℃或更低)的机械冷冻机或液氮中。低温保存的培养物一旦储存在-130℃以下，通常不会发生任何可检测的变化。因此，本文公开的试剂盒适用于在储存时持续长期培养。因此，本发明的药物组合物和试剂盒可保持在不同的储存条件下，允许这些产品作为现成的产品上市。
在一些实施方案中，试剂盒还包括用于调整至少一个第一容器中的细胞向有其需要的受试者的施用的说明书。根据一些实施方案，所述试剂盒还包含以管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构描述的形式的布告，所述布告反映了被该机构批准用于人类施用的生产、使用或销售。
以下实施例被展示以更充分地说明本发明的一些实施方案。然而，其绝不应以任何方式被解释为限制本发明的宽泛的范围。本领域技术人员可以容易地设想本文公开的原理的许多变化和修改，而不偏离本发明的范围。
实施例
实施例1-来源于PBMC细胞的T细胞的扩增
从同意的个体抽取100-500ml单位的外周血，并进行Ficoll hypaqu e密度离心以获得外周血单核细胞(PBMC)。对细胞进行针对γ9δ2T细胞的以下扩增方案，其相对于初始量在每个阶段中导致约500倍的预料不到的细胞扩增：
(a)I阶段扩增(PIE)-将细胞以0.5-1X106个细胞/ml的密度接种在培养瓶中的补充有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素溶液(100μg/ml)的RPMI培养基中。用2μM唑来膦酸盐和100个国际单位(IU)/ml的重组人类IL-2(rhIL-2)刺激培养物并保持14天；每3天用带有IL-2的新鲜培养基替换培养基。在第一孵育时间后，使用利用特异性mAb免疫剥离CD4和CD8细胞，从总细胞群体纯化γδT细胞，随后在通过MACS柱后结合抗小鼠IgG微珠。洗脱的γ9δ2T细胞的纯度在继续第二阶段扩增之前通过FACS确认(>90％)，第二阶段扩增(PTE)也称为快速扩增程序(REP)。
(b)如先前对肿瘤浸润淋巴细胞详细描述的(Itzhaki等人，同上)，在GMP样条件下进行PTE，该条件允许在患者中使用扩增的细胞。简言之，将130,000个纯化的γ9δ2T细胞在20ml含有50％AIM-V培养基、50％CM(含10％人血清的RPMI 1640)、25mmol/L HEPES pH7.2、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、50μg/mL庆大霉素和5.5x10e-5mol/L 2-巯基乙醇、抗CD3抗体(Orthoclone OKT-3,30ng/mL)、3,000IU/mL I L-2和以饲养细胞比γδT细胞为200：1比例的被辐照(5000rad)的同种异体饲养细胞的快速扩增程序(REP)培养基中培养。将混合物置于垂直放置的T25烧瓶中。在第5天，用含有50％AIM-V培养基、50％CM和3,000IU/mL IL-2的新鲜培养基替代-70％的REP培养基。在第7天，将来自每个T25烧瓶的细胞转移到T75烧瓶中，并添加20mL含有10％人AB血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mmolL-谷氨酰胺和IL-2的AIM-V培养基。从第9天开始，每2-3天加入带有青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺和IL-2的AIM-V培养基，保持细胞密度为大约0.5-2x106个细胞/ml。必要时，将细胞分到两个烧瓶。
从6个健康供体获得的γδT细胞(其如上所述最初在PIE中扩增并对γδT细胞选择)在REP中的扩增倍数在下表1中展示。结果表明，第二阶段扩增产生的扩增倍数高于500。具体地，第二阶段扩增产生在500至1000的范围内的扩增倍数。
除了表1以外，图1A、1B、2A、2B、3A、3B和4展示上述扩增。从第5天开始，每隔一天通过显微细胞计数和台盼蓝排除来确定总活细胞数(图1A)。在第14天，收集细胞，计数，通过流式细胞术分析γδT细胞含量，并测试其抗GBM细胞毒性。在每个起始于从健康供体(HD)和多形性胶质母细胞瘤患者(CP；癌症患者)获得的130,000个外周血细胞的一组8个P TE实验中，对于HD和CP产量分别获得8.5±1.1×107(n＝6)和8.3±0.5×107(n＝2)γδT细胞(图1A和1B)，对应于约600倍的扩增(图1C)。HD和CP之间的扩增倍数没有显著差异(n.s)。
表1.
对来自上述研究人群的健康受试者的一个示例性样品进行流式细胞术分析(图2A、2B、3A、3B和4)。最初，获得了用针对CD3(Y轴)和γ9(X轴)的单克隆抗体染色的PBMC的流式细胞术点图(图2A)。数据表明，2.64％的细胞是CD3+Vγ9+。接下来，将细胞在含有唑来膦酸盐和白介素2的细胞培养物中孵育14天(图2B)。该第一阶段的扩增导致79.6％的细胞被两种抗体染色，即表达Vγ9的T细胞(图2B中的右上象限)。通过将细胞传递到免疫磁性柱上以剥离CD4和CD8细胞，实现Vγ9+T细胞的进一步富集。这一富集步骤导致97.7％(从79.6％)的Vγ9+T细胞。通过图3A和3B所示的分析确认了剥离的效率，其中97.7％的细胞是表达Vγ9的T细胞(图3A中的右上象限)，只有0.08％的细胞表达CD8而0.28％表达CD4(图3B)。图4展示的分析给出了图2B所示的细胞经历第二阶段扩增即快速扩增方案(REP)后的CD3+Vγ9+T细胞的百分比。结果表明，该培养物中87.1％的T细胞是CD3+Vγ9+T细胞，并且相对于该实施例中从初级(第一阶段)扩增回收的细胞的扩增倍数为X540。
实施例2–扩增的T细胞的活性
使用IFNγ分泌测定法测试按实施例1中详述的培养、扩增和分离的γδT细胞针对GBM细胞系的反应性。使用或不使用唑来膦酸盐地，将γδT细胞与三种GBM细胞系U251、U87和T98G以5：1的效应物对靶的比例一起孵育48小时。孵育后，分析上清液的IFNγ分泌。PTE来源的γδT细胞在培养基(Med)中建立了一定的自发性IFNγ分泌，但响应于GBM细胞系的IF Nγ分泌显著较高(p<0.01；图5)。
总之，结果表明，两阶段扩增法提供高产量的存活且有效的γδT细胞。
用于测试扩增的效应γδT细胞的活性的另外的研究如下进行：在室温将肿瘤细胞系T98G、U87、U251(多形性成胶质细胞瘤)和Daudi(淋巴瘤)靶细胞用2.5mM的5,6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)(Mo lecular probes)标记10分钟。此后，用相同体积的FBS(胎牛血清)猝灭CFSE，并用生长培养基洗涤两次。带有或不带有2mM唑来膦酸盐下，以各种效应物与靶(E：T)比例将标记的靶细胞与通过REP获得的效应γδT细胞或类似地活化/扩增的γδT细胞(对照)一起接种在圆底96孔板中过夜。第二天早晨收获细胞并用碘化丙啶(PI)染色。用对CFSE标记的群体中PI阳性细胞的流式细胞术分析测量特异性裂解。从实验样品中减去无效应物的靶细胞对PI的背景吸收。结果示于图6A至6D中。结果表明，用唑来膦酸盐培养的效应γδT细胞诱导最显著和有效的治疗(细胞毒性)。与效应物γδT细胞相比，对照细胞(γδT细胞)没有发挥有效的作用。
以上具体实施方案的描述将如此完全地揭示本发明的一般性质，使得其他人可以通过应用现有的知识，容易地为各种应用修改和/或调整此类具体实施方案而不需要过度实验且不背离一般概念，且因此，此类调整和修改应当并且预期被包含在本公开的实施方案的等效方式的含义和范围内。应理解的是，本文采用的措辞或术语是为了描述而非限制的目的。用于进行各种本公开的功能的工具、材料和步骤可采取多种替代形式而不背离本发明。

Claims (23)

1.一种用于快速扩增T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(i).提供包含T细胞群体的外周血单核细胞；
(ii).在包含至少一种二膦酸盐的第一培养基中孵育所述外周血单核细胞持续第一时间段，从而获得所述T细胞群体的第一阶段扩增；和
(iii).在包含α-CD3抗体和白介素-2的第二培养基中孵育所述外周血单核细胞持续第二时间段，从而获得所述T细胞群体的第二阶段扩增，其中所述第二阶段扩增为至少100倍扩增。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述T细胞的群体包含γδT细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述T细胞群体由γδT细胞组成。
4.根据权利要求1所述的方法，其中外周血单核细胞从罹患恶性疾病、自身免疫病或传染病的受试者获得。
5.根据权利要求4所述的方法，所述方法还包括将步骤(iii)中获得的T细胞群体或其一部分移植到所述受试者。
6.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在步骤(iii)之前从所述外周血单核细胞中选择和分离T细胞，并将分离的T细胞孵育在所述第二培养基中。
7.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在步骤(iii)之后选择和分离γδT细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一培养基还包含白介素-2。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)中的所述外周血单核细胞具有约0.5X106至1X106细胞/ml的细胞密度。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二时间段是至少10天。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种二膦酸盐选自由以下组成的组：唑来膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、英卡膦酸、依替膦酸、利塞膦酸、替鲁膦酸、其组合、其盐及其水合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一种二膦酸盐是唑来膦酸。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二培养基还包含被辐照的外周血单核细胞。
14.根据权利要求6所述的方法，其中所述T细胞群体的所述第二阶段扩增为至少200倍扩增。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述T细胞群体的所述第一阶段扩增为至少100倍扩增。
16.一种药物组合物，包含通过根据权利要求1所述的方法获得的所述T细胞群体。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，所述药物组合物还包含至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。
18.一种在有其需要的受试者中治疗传染性、自身免疫性或恶性疾病或病症的方法，包括：
(i)从受试者获得包含T细胞群体的外周血单核细胞；
(ii)在包含至少一种二膦酸盐的第一培养基中孵育所述外周血单核细胞持续第一时间段，从而获得所述T细胞群体的第一阶段扩增；
(iii)在包含α-CD3抗体和IL-2的第二培养基中孵育所述外周血单核细胞持续第二时间段，从而获得所述T细胞群体的第二阶段扩增，其中所述第二阶段扩增为至少100倍扩增；和
(iv)向所述受试者施用所述细胞或其一部分。
19.根据权利要求18所述的方法，所述方法还包括在步骤(iii)之前从所述外周血单核细胞中选择和分离T细胞，并将分离的T细胞孵育在所述第二培养基中。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述T细胞的群体包含γδT细胞。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述T细胞群体由γδT细胞组成。
22.根据权利要求18所述的方法，所述方法还包括多重复步骤(iv)至少一次。
23.根据权利要求16所述的药物组合物用于在有其需要的受试者中治疗传染性、自身免疫性或恶性疾病或病症的用途。
CN201580054125.5A 2014-10-06 2015-09-24 使用双膦酸盐、抗cd3抗体和il‑2扩增t细胞群体 Pending CN106795493A (zh)

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