JP2001314183A - キラー活性を増強したリンパ球 - Google Patents
キラー活性を増強したリンパ球Info
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- JP2001314183A JP2001314183A JP2000146392A JP2000146392A JP2001314183A JP 2001314183 A JP2001314183 A JP 2001314183A JP 2000146392 A JP2000146392 A JP 2000146392A JP 2000146392 A JP2000146392 A JP 2000146392A JP 2001314183 A JP2001314183 A JP 2001314183A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 免疫調節剤（biological response modifier
s：ＢＲＭ）活性化キラー細胞（ＢＡＫ細胞）免疫療法
の効果をより高めることができる、キラー細胞の細胞障
害性が高められた、ＢＲＭによって活性化されたキラー
細胞を含むリンパ球やかかるリンパ球の製造方法を提供
すること。 【解決手段】 末梢血から分取した単核細胞を固相化抗
ＣＤ３抗体の存在下でインキュベーションした後、ＩＬ
−２含有培地で培養し、次いでＩＬ−２及びＩＦＮ−α
で所定時間活性化処理する。所定時間の活性化処理とし
て、１０００単位／ｍｌのＩＬ−２と１０００〜２００
０単位／ｍｌのＩＦＮ−αで約１５分間の処理を行うこ
とにより、ダウジ（Daudi）癌細胞に対する細胞障害活
性が１５０溶解ユニット以上のリンパ球を得ることがで
きる。
s：ＢＲＭ）活性化キラー細胞（ＢＡＫ細胞）免疫療法
の効果をより高めることができる、キラー細胞の細胞障
害性が高められた、ＢＲＭによって活性化されたキラー
細胞を含むリンパ球やかかるリンパ球の製造方法を提供
すること。 【解決手段】 末梢血から分取した単核細胞を固相化抗
ＣＤ３抗体の存在下でインキュベーションした後、ＩＬ
−２含有培地で培養し、次いでＩＬ−２及びＩＦＮ−α
で所定時間活性化処理する。所定時間の活性化処理とし
て、１０００単位／ｍｌのＩＬ−２と１０００〜２００
０単位／ｍｌのＩＦＮ−αで約１５分間の処理を行うこ
とにより、ダウジ（Daudi）癌細胞に対する細胞障害活
性が１５０溶解ユニット以上のリンパ球を得ることがで
きる。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】進行性癌患者に対し延命効果
をもち、患者のクオリティーオブライフ（ＱＯＬ）を改
善するための新しい養子免疫療法に用いることができ
る、癌細胞に対するキラー活性を増強したリンパ球とそ
の製造方法に関する。
をもち、患者のクオリティーオブライフ（ＱＯＬ）を改
善するための新しい養子免疫療法に用いることができ
る、癌細胞に対するキラー活性を増強したリンパ球とそ
の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、抗癌治療の目標は一般に癌の治癒
や癌組織の縮減に重点がおかれていたが、現在の医学は
患者が身体的に良好な状態にあることに加えて、患者の
ＱＯＬを維持する為の精神的ケアを重要視するようにな
ってきている。癌治療における化学療法や放射線治療は
癌細胞を殺傷するが、健全な細胞（特に骨髄細胞）をも
殺傷するため、副作用を誘発したりＱＯＬを低下させ
る。かかる状況の中で、副作用を誘発することなく、癌
細胞のみを殺傷する免疫療法を開発する試みが最近活発
に研究されている。
や癌組織の縮減に重点がおかれていたが、現在の医学は
患者が身体的に良好な状態にあることに加えて、患者の
ＱＯＬを維持する為の精神的ケアを重要視するようにな
ってきている。癌治療における化学療法や放射線治療は
癌細胞を殺傷するが、健全な細胞（特に骨髄細胞）をも
殺傷するため、副作用を誘発したりＱＯＬを低下させ
る。かかる状況の中で、副作用を誘発することなく、癌
細胞のみを殺傷する免疫療法を開発する試みが最近活発
に研究されている。
【０００３】キラー細胞の有する細胞障害活性を利用し
て、癌細胞を殺傷する方法として知られている免疫療法
として、リンホカイン活性化キラー (lymphokine activ
atedkiller cells:ＬＡＫ) 細胞を用いる養子免疫療法
がローゼンベルグにより報告されている(Immunology To
day 1988; 9: 58-62)。この養子免疫療法は、患者の末
梢単核細胞からキラー細胞を分離し、インターロイキン
−２（ＩＬ−２）とともに培養し、活性化された細胞を
ＩＬ−２と共に患者体内に戻すという方法であるが、副
作用があり満足できるものではなかった。次いで、癌組
織からリンパ球を分離しＩＬ−２で刺激し、活性化され
たリンパ球を患者にＩＬ−２と共に戻す癌浸潤性リンパ
球(tumor infiltrating lymphocyte: ＴＩＬ)療法が報
告された(J. Clin. Oncol. 1989; 7: 250-61, J. Immun
ol. 1989; 142: 4520-6, J. Immunol. 1991; 146: 1700
-7)が、この療法も副作用があり満足できるものではな
かった。また、癌特異的ＣＤ８陽性のキラー細胞を利用
する細胞障害性Ｔリンパ球(cytotoxic T lymphocytes:
ＣＴＬ)療法と呼ばれる方法も報告されている(Jpn. J.
Cancer Res. 1989: 50: 337-45)が、この療法も副作用
の他に、ＣＴＬの処理に時間がかかる等の問題があっ
た。本発明者も、生物製剤(biological responsemodifi
ers: ＢＲＭ)活性化キラー細胞(ＢＲＭ activated kill
er:ＢＡＫ細胞)療法について報告（以下「前報」とい
う）している（Biotherapy 1998; 11: 241-253）。この
ＢＡＫ細胞療法は、癌患者の末梢血からリンパ球を取り
出し、癌細胞を特異的に障害する細胞を選択し、その細
胞障害活性を高める処理をしたリンパ球を患者に戻すこ
とによって、癌細胞の増殖を抑制し、また癌細胞を殺傷
することにより、癌細胞に起因する症状を改善し軽減す
るものである。
て、癌細胞を殺傷する方法として知られている免疫療法
として、リンホカイン活性化キラー (lymphokine activ
atedkiller cells:ＬＡＫ) 細胞を用いる養子免疫療法
がローゼンベルグにより報告されている(Immunology To
day 1988; 9: 58-62)。この養子免疫療法は、患者の末
梢単核細胞からキラー細胞を分離し、インターロイキン
−２（ＩＬ−２）とともに培養し、活性化された細胞を
ＩＬ−２と共に患者体内に戻すという方法であるが、副
作用があり満足できるものではなかった。次いで、癌組
織からリンパ球を分離しＩＬ−２で刺激し、活性化され
たリンパ球を患者にＩＬ−２と共に戻す癌浸潤性リンパ
球(tumor infiltrating lymphocyte: ＴＩＬ)療法が報
告された(J. Clin. Oncol. 1989; 7: 250-61, J. Immun
ol. 1989; 142: 4520-6, J. Immunol. 1991; 146: 1700
-7)が、この療法も副作用があり満足できるものではな
かった。また、癌特異的ＣＤ８陽性のキラー細胞を利用
する細胞障害性Ｔリンパ球(cytotoxic T lymphocytes:
ＣＴＬ)療法と呼ばれる方法も報告されている(Jpn. J.
Cancer Res. 1989: 50: 337-45)が、この療法も副作用
の他に、ＣＴＬの処理に時間がかかる等の問題があっ
た。本発明者も、生物製剤(biological responsemodifi
ers: ＢＲＭ)活性化キラー細胞(ＢＲＭ activated kill
er:ＢＡＫ細胞)療法について報告（以下「前報」とい
う）している（Biotherapy 1998; 11: 241-253）。この
ＢＡＫ細胞療法は、癌患者の末梢血からリンパ球を取り
出し、癌細胞を特異的に障害する細胞を選択し、その細
胞障害活性を高める処理をしたリンパ球を患者に戻すこ
とによって、癌細胞の増殖を抑制し、また癌細胞を殺傷
することにより、癌細胞に起因する症状を改善し軽減す
るものである。
【０００４】Ｔリンパ球の表面に存在し、癌細胞等の表
面にある抗原を認識するＴ細胞レセプター(T cell rece
ptor: ＴＣＲ)にはαβ鎖とγδ鎖があり、αβ鎖を有
するαβＴ細胞と、γδ鎖を有するγδＴ細胞とが知ら
れている。αβＴ細胞は主要組織適合遺伝子複合体(maj
or histocompatibility coｍplex：ＭＨＣ)依存性であ
るが、γδＴ細胞はＭＨＣ非依存性である。αβ鎖とγ
δ鎖はともにＴリンパ球細胞表面上でＣＤ３蛋白複合体
と非共有結合によって結合し、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体を
形成することが知られている。可溶性の抗ＣＤ３抗体と
ＩＬ−２により処理した従来のＬＡＫ細胞は多数のαβ
Ｔ細胞を含有し、癌細胞と正常な白血球の両方を殺傷す
るため、副作用を引き起こす。αβＴ細胞は癌細胞のみ
ならず健全な白血球細胞等に対しても細胞障害性を有す
るが、他方γδＴ細胞は癌細胞に対してのみ細胞障害性
を有するため、患者の末梢血から採取したＴ細胞のう
ち、γδＴ細胞を選択し、その細胞障害活性をＢＲＭで
活性化したＢＡＫ細胞の濃度を高めることが肝要であ
る。すなわち、ＢＡＫ細胞療法においては、キラー細胞
の細胞障害活性を高めると共に、癌細胞を特異的に傷害
するキラー活性の比率を高めることが重要である。
面にある抗原を認識するＴ細胞レセプター(T cell rece
ptor: ＴＣＲ)にはαβ鎖とγδ鎖があり、αβ鎖を有
するαβＴ細胞と、γδ鎖を有するγδＴ細胞とが知ら
れている。αβＴ細胞は主要組織適合遺伝子複合体(maj
or histocompatibility coｍplex：ＭＨＣ)依存性であ
るが、γδＴ細胞はＭＨＣ非依存性である。αβ鎖とγ
δ鎖はともにＴリンパ球細胞表面上でＣＤ３蛋白複合体
と非共有結合によって結合し、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体を
形成することが知られている。可溶性の抗ＣＤ３抗体と
ＩＬ−２により処理した従来のＬＡＫ細胞は多数のαβ
Ｔ細胞を含有し、癌細胞と正常な白血球の両方を殺傷す
るため、副作用を引き起こす。αβＴ細胞は癌細胞のみ
ならず健全な白血球細胞等に対しても細胞障害性を有す
るが、他方γδＴ細胞は癌細胞に対してのみ細胞障害性
を有するため、患者の末梢血から採取したＴ細胞のう
ち、γδＴ細胞を選択し、その細胞障害活性をＢＲＭで
活性化したＢＡＫ細胞の濃度を高めることが肝要であ
る。すなわち、ＢＡＫ細胞療法においては、キラー細胞
の細胞障害活性を高めると共に、癌細胞を特異的に傷害
するキラー活性の比率を高めることが重要である。
【０００５】前報において、癌細胞を特異的に傷害する
キラー活性の比率を高めるには、あらかじめ抗ＣＤ３抗
体をフラスコ内壁に固定した固相化抗ＣＤ３抗体を用い
て、癌患者から採取したリンパ球を培養することが有効
であることを、本発明者らは既に報告しており、この固
相化抗ＣＤ３抗体を用いて処理したリンパ球には多くの
γδＴ細胞とＮＫ（ナチュラルキラー）細胞が含まれて
いる。また本発明者らは、ＢＲＭ活性化γδＴ細胞が抗
癌性のサイトカイン類（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α等）を
生産し、これらＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αがＢＡＫ細胞の
主要な細胞障害性サイトカイン類であること（Clin Can
cer Res 3, 633-643, 1997）や、ＣＤ５６陽性（ＣＤ５
６+）細胞はＣＤ５６陰性（ＣＤ５６-）細胞よりも強い
細胞障害活性を有すること（J Immunol Methods 136, 1
-9, 1996）を既に報告している。
キラー活性の比率を高めるには、あらかじめ抗ＣＤ３抗
体をフラスコ内壁に固定した固相化抗ＣＤ３抗体を用い
て、癌患者から採取したリンパ球を培養することが有効
であることを、本発明者らは既に報告しており、この固
相化抗ＣＤ３抗体を用いて処理したリンパ球には多くの
γδＴ細胞とＮＫ（ナチュラルキラー）細胞が含まれて
いる。また本発明者らは、ＢＲＭ活性化γδＴ細胞が抗
癌性のサイトカイン類（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α等）を
生産し、これらＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αがＢＡＫ細胞の
主要な細胞障害性サイトカイン類であること（Clin Can
cer Res 3, 633-643, 1997）や、ＣＤ５６陽性（ＣＤ５
６+）細胞はＣＤ５６陰性（ＣＤ５６-）細胞よりも強い
細胞障害活性を有すること（J Immunol Methods 136, 1
-9, 1996）を既に報告している。
【０００６】前報において報告した新しいタイプの養子
免疫療法であるＢＡＫ細胞療法は、固定化された抗ＣＤ
３抗体、ＩＬ−２及びＩＦＮ−αで活性化されたリンパ
球を用いるものであり、これらの活性化されかつ増殖し
たリンパ球は多くのＣＤ５６陽性細胞から構成されてお
り、ＣＤ５６陽性のＭＨＣ−非依存性のキラー細胞であ
るγδＴ細胞及びＮＫ（ナチュラルキラー）細胞が約半
分を占めている。ＮＫ細胞は数種類の標的細胞株に対す
る自然発生的な細胞障害性を媒介するＣＤ１６ +のリン
パ球として定義され、ＣＤ５６抗原の発現に基づき二つ
のサブセットに分類されている。このうちＣＤ１６+Ｃ
Ｄ５６+ＮＫ細胞は、ＣＤ１６+ＣＤ５６-ＮＫ細胞より
も強い細胞障害活性を有している。ＣＤ５６抗原はＭＨ
Ｃ−非依存性細胞障害性を媒介するＣＤ３+Ｔリンパ球
の小さなサブセット上でも発現される。前報において
は、γδＴ+ＣＤ５６+細胞はγδＴ+ＣＤ５６-細胞より
も強い細胞障害性を持つことを示した。γδＴ細胞及び
ＣＤ１６陽性ＮＫ細胞のうちで、ＣＤ５６陽性細胞が特
に強いキラー細胞であることも示されている。かかるＣ
Ｄ５６抗原は神経細胞接着分子（neural cell adhesion
molecule：ＮＣＡＭ）と同一物質であり、この神経系
及びその他の組織の胚発達の間に種々の部位に発現する
ＮＣＡＭは、細胞表面上に５つのＩｇＧ様の領域を有す
ることも知られている。
免疫療法であるＢＡＫ細胞療法は、固定化された抗ＣＤ
３抗体、ＩＬ−２及びＩＦＮ−αで活性化されたリンパ
球を用いるものであり、これらの活性化されかつ増殖し
たリンパ球は多くのＣＤ５６陽性細胞から構成されてお
り、ＣＤ５６陽性のＭＨＣ−非依存性のキラー細胞であ
るγδＴ細胞及びＮＫ（ナチュラルキラー）細胞が約半
分を占めている。ＮＫ細胞は数種類の標的細胞株に対す
る自然発生的な細胞障害性を媒介するＣＤ１６ +のリン
パ球として定義され、ＣＤ５６抗原の発現に基づき二つ
のサブセットに分類されている。このうちＣＤ１６+Ｃ
Ｄ５６+ＮＫ細胞は、ＣＤ１６+ＣＤ５６-ＮＫ細胞より
も強い細胞障害活性を有している。ＣＤ５６抗原はＭＨ
Ｃ−非依存性細胞障害性を媒介するＣＤ３+Ｔリンパ球
の小さなサブセット上でも発現される。前報において
は、γδＴ+ＣＤ５６+細胞はγδＴ+ＣＤ５６-細胞より
も強い細胞障害性を持つことを示した。γδＴ細胞及び
ＣＤ１６陽性ＮＫ細胞のうちで、ＣＤ５６陽性細胞が特
に強いキラー細胞であることも示されている。かかるＣ
Ｄ５６抗原は神経細胞接着分子（neural cell adhesion
molecule：ＮＣＡＭ）と同一物質であり、この神経系
及びその他の組織の胚発達の間に種々の部位に発現する
ＮＣＡＭは、細胞表面上に５つのＩｇＧ様の領域を有す
ることも知られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らが前報にお
いて報告した前記ＢＡＫ細胞免疫療法は有効な方法であ
ったが、更に改善の余地がないとはいえなかった。本発
明の課題は、ＢＡＫ細胞免疫療法の効果をより高めるこ
とができる、キラー細胞の細胞障害性が高められた、Ｂ
ＲＭによって活性化されたキラー細胞を含むリンパ球や
かかるリンパ球の製造方法を提供することにある。
いて報告した前記ＢＡＫ細胞免疫療法は有効な方法であ
ったが、更に改善の余地がないとはいえなかった。本発
明の課題は、ＢＡＫ細胞免疫療法の効果をより高めるこ
とができる、キラー細胞の細胞障害性が高められた、Ｂ
ＲＭによって活性化されたキラー細胞を含むリンパ球や
かかるリンパ球の製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】前記ＢＡＫ細胞免疫療法
におけるＢＲＭによるリンパ球中のγδＴ細胞とＮＫ細
胞の活性化は、ＩＬ−２を加えた培地中で約２週間培養
し、最後にＩＬ−２とＩＦＮ−αで再活性化することに
よってなされるが、ＢＲＭによる活性化の条件を改善す
ることにより、前報に比べ細胞障害性が著しく改善され
たＢＡＫ細胞を含むリンパ球が得られることがわかっ
た。また、ＢＲＭによる活性化処理により増加するＣＤ
５６陽性細胞が、癌等の患者の苦痛を和らげる効果を有
するβ−エンドルフィンを産生することを初めて見い出
した。そして、前記細胞障害性が著しく改善されたＢＡ
Ｋ細胞を含むリンパ球を、かかるリンパ球を採取した進
行性癌患者に投与したところ、患者に対し延命効果があ
ること、ＱＯＬの向上に寄与すること、副作用がないこ
と、場合によっては原発性癌の消失や縮小効果があるこ
とを確認し、本発明を完成するに至った。
におけるＢＲＭによるリンパ球中のγδＴ細胞とＮＫ細
胞の活性化は、ＩＬ−２を加えた培地中で約２週間培養
し、最後にＩＬ−２とＩＦＮ−αで再活性化することに
よってなされるが、ＢＲＭによる活性化の条件を改善す
ることにより、前報に比べ細胞障害性が著しく改善され
たＢＡＫ細胞を含むリンパ球が得られることがわかっ
た。また、ＢＲＭによる活性化処理により増加するＣＤ
５６陽性細胞が、癌等の患者の苦痛を和らげる効果を有
するβ−エンドルフィンを産生することを初めて見い出
した。そして、前記細胞障害性が著しく改善されたＢＡ
Ｋ細胞を含むリンパ球を、かかるリンパ球を採取した進
行性癌患者に投与したところ、患者に対し延命効果があ
ること、ＱＯＬの向上に寄与すること、副作用がないこ
と、場合によっては原発性癌の消失や縮小効果があるこ
とを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち本発明は、末梢血から分取した単
核細胞を固相化抗ＣＤ３抗体の存在下で培養した後、Ｉ
Ｌ−２含有培地で培養し、次いでＩＬ−２及びＩＦＮ−
αで活性化処理することにより得られ、ダウディ癌細胞
に対する細胞障害活性が、１５０溶解ユニット以上であ
ることを特徴とする生物製剤（ＢＲＭ）によって活性化
されたキラー細胞を含むリンパ球（請求項１）や、ダウ
ディ癌細胞に対する細胞障害活性が、１８０溶解ユニッ
ト以上であることを特徴とする請求項１記載の生物製剤
（ＢＲＭ）によって活性化されたキラー細胞を含むリン
パ球（請求項２）や、生物製剤（ＢＲＭ）によって活性
化されたキラー細胞が、生物製剤（ＢＲＭ）によって活
性化されたγδＴ細胞及び／又はＮＫ細胞であることを
特徴とする請求項１又は２記載の生物製剤によって活性
化されたキラー細胞を含むリンパ球（請求項３）や、生
物製剤（ＢＲＭ）によって活性化されたγδＴ細胞及び
／又はＮＫ細胞が、β−エンドルフィン産生能を有する
ＣＤ５６陽性細胞であることを特徴とする請求項３記載
の生物製剤（ＢＲＭ）によって活性化されたキラー細胞
を含むリンパ球（請求項４）や、β−エンドルフィン産
生能を有するＣＤ５６陽性細胞が５０％以上含まれてい
ることを特徴とする請求項４記載の生物製剤（ＢＲＭ）
によって活性化されたキラー細胞を含むリンパ球（請求
項５）や、生物製剤（ＢＲＭ）を実質的に含まないこと
を特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の生物製剤
（ＢＲＭ）によって活性化されたキラー細胞を含むリン
パ球（請求項６）や、生物製剤（ＢＲＭ）がＩＬ−２及
びＩＦＮ−αであることを特徴とする請求項６記載の生
物製剤（ＢＲＭ）によって活性化されたキラー細胞を含
むリンパ球（請求項７）に関する。
核細胞を固相化抗ＣＤ３抗体の存在下で培養した後、Ｉ
Ｌ−２含有培地で培養し、次いでＩＬ−２及びＩＦＮ−
αで活性化処理することにより得られ、ダウディ癌細胞
に対する細胞障害活性が、１５０溶解ユニット以上であ
ることを特徴とする生物製剤（ＢＲＭ）によって活性化
されたキラー細胞を含むリンパ球（請求項１）や、ダウ
ディ癌細胞に対する細胞障害活性が、１８０溶解ユニッ
ト以上であることを特徴とする請求項１記載の生物製剤
（ＢＲＭ）によって活性化されたキラー細胞を含むリン
パ球（請求項２）や、生物製剤（ＢＲＭ）によって活性
化されたキラー細胞が、生物製剤（ＢＲＭ）によって活
性化されたγδＴ細胞及び／又はＮＫ細胞であることを
特徴とする請求項１又は２記載の生物製剤によって活性
化されたキラー細胞を含むリンパ球（請求項３）や、生
物製剤（ＢＲＭ）によって活性化されたγδＴ細胞及び
／又はＮＫ細胞が、β−エンドルフィン産生能を有する
ＣＤ５６陽性細胞であることを特徴とする請求項３記載
の生物製剤（ＢＲＭ）によって活性化されたキラー細胞
を含むリンパ球（請求項４）や、β−エンドルフィン産
生能を有するＣＤ５６陽性細胞が５０％以上含まれてい
ることを特徴とする請求項４記載の生物製剤（ＢＲＭ）
によって活性化されたキラー細胞を含むリンパ球（請求
項５）や、生物製剤（ＢＲＭ）を実質的に含まないこと
を特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の生物製剤
（ＢＲＭ）によって活性化されたキラー細胞を含むリン
パ球（請求項６）や、生物製剤（ＢＲＭ）がＩＬ−２及
びＩＦＮ−αであることを特徴とする請求項６記載の生
物製剤（ＢＲＭ）によって活性化されたキラー細胞を含
むリンパ球（請求項７）に関する。
【００１０】また本発明は、末梢血から分取した単核細
胞を固相化抗ＣＤ３抗体の存在下でインキュベーション
した後、ＩＬ−２含有培地で培養し、次いでＩＬ−２及
びＩＦＮ−αで所定時間活性化処理することを特徴とす
る請求項１〜７のいずれか記載の活性化されたキラー細
胞を含むリンパ球の製造方法（請求項８）や、ＩＬ−２
含有培地での培養が、単球の共存下に行われることを特
徴とする請求項８記載の活性化されたキラー細胞を含む
リンパ球の製造方法（請求項９）や、ＩＬ−２及びＩＦ
Ｎ−αによる所定時間の活性化処理が、１０００単位／
ｍｌのＩＬ−２と１０００〜２０００単位／ｍｌのＩＦ
Ｎ−αで約１５分間行う活性化処理であることを特徴と
する請求項８又は９記載の活性化されたキラー細胞を含
むリンパ球の製造方法（請求項１０）に関する。
胞を固相化抗ＣＤ３抗体の存在下でインキュベーション
した後、ＩＬ−２含有培地で培養し、次いでＩＬ−２及
びＩＦＮ−αで所定時間活性化処理することを特徴とす
る請求項１〜７のいずれか記載の活性化されたキラー細
胞を含むリンパ球の製造方法（請求項８）や、ＩＬ−２
含有培地での培養が、単球の共存下に行われることを特
徴とする請求項８記載の活性化されたキラー細胞を含む
リンパ球の製造方法（請求項９）や、ＩＬ−２及びＩＦ
Ｎ−αによる所定時間の活性化処理が、１０００単位／
ｍｌのＩＬ−２と１０００〜２０００単位／ｍｌのＩＦ
Ｎ−αで約１５分間行う活性化処理であることを特徴と
する請求項８又は９記載の活性化されたキラー細胞を含
むリンパ球の製造方法（請求項１０）に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明のＢＲＭによって活性化さ
れたキラー細胞を含むリンパ球は、ダウディ（Daudi）
癌細胞に対する細胞障害活性が１５０溶解ユニット以
上、好ましくは１８０溶解ユニット以上であることを特
徴とし、上記ＢＲＭとしては末梢血単核細胞（ＰＢＭ
Ｃ）に作用してその細胞障害活性を高めうるものであれ
ば特に制限されないが、インターフェロンやインターロ
イキン等のサイトカイン類を例示することができ、具体
的に、ＩＬ−２やＩＦＮ−α等を挙げることができる。
れたキラー細胞を含むリンパ球は、ダウディ（Daudi）
癌細胞に対する細胞障害活性が１５０溶解ユニット以
上、好ましくは１８０溶解ユニット以上であることを特
徴とし、上記ＢＲＭとしては末梢血単核細胞（ＰＢＭ
Ｃ）に作用してその細胞障害活性を高めうるものであれ
ば特に制限されないが、インターフェロンやインターロ
イキン等のサイトカイン類を例示することができ、具体
的に、ＩＬ−２やＩＦＮ−α等を挙げることができる。
【００１２】また、上記キラー細胞としては、癌細胞等
の細胞障害活性を有する細胞であれば特に制限されるも
のではないが、正常細胞を傷害することなく、癌細胞を
特異的に傷害するキラー細胞が好ましい。かかる癌細胞
を特異的に傷害するキラー細胞として、具体的に、ＴＣ
Ｒγδ鎖を有するγδＴ細胞や、ＩｇＧ型抗体のＦｃ部
分に結合する細胞表面受容体として知られるＣＤ１６膜
貫通型抗原を発現するＮＫ細胞等を挙げることができ、
これらの中でもβ−エンドルフィン産生能を有するＣＤ
５６陽性細胞、すなわちＣＤ５６陽性のγδＴ細胞やＣ
Ｄ５６陽性のＮＫ細胞が好ましい。
の細胞障害活性を有する細胞であれば特に制限されるも
のではないが、正常細胞を傷害することなく、癌細胞を
特異的に傷害するキラー細胞が好ましい。かかる癌細胞
を特異的に傷害するキラー細胞として、具体的に、ＴＣ
Ｒγδ鎖を有するγδＴ細胞や、ＩｇＧ型抗体のＦｃ部
分に結合する細胞表面受容体として知られるＣＤ１６膜
貫通型抗原を発現するＮＫ細胞等を挙げることができ、
これらの中でもβ−エンドルフィン産生能を有するＣＤ
５６陽性細胞、すなわちＣＤ５６陽性のγδＴ細胞やＣ
Ｄ５６陽性のＮＫ細胞が好ましい。
【００１３】本発明のＢＲＭによって活性化されたキラ
ー細胞を含むリンパ球としては、ＣＤ５６陽性のγδＴ
細胞やＮＫ細胞が５０％以上含まれているリンパ球が、
強い癌細胞特異的障害活性やβ−エンドルフィン産生に
よるＱＯＬ改善の点から好ましく、また、活性化処理に
使用したＩＬ−２、ＩＦＮ−α等の生物製剤（ＢＲＭ）
が実質的に含まれていないリンパ球が副作用を抑制しう
る点で好ましい。
ー細胞を含むリンパ球としては、ＣＤ５６陽性のγδＴ
細胞やＮＫ細胞が５０％以上含まれているリンパ球が、
強い癌細胞特異的障害活性やβ−エンドルフィン産生に
よるＱＯＬ改善の点から好ましく、また、活性化処理に
使用したＩＬ−２、ＩＦＮ−α等の生物製剤（ＢＲＭ）
が実質的に含まれていないリンパ球が副作用を抑制しう
る点で好ましい。
【００１４】また、前記「溶解ユニット」は以下のよう
に定義される。エフェクター細胞とＣｒ56等の放射性物
質で標識されたダウディ細胞又はＫ５６２細胞等の標的
細胞とを接触せしめ、該標的細胞から放出される放射性
物質の量［測定放出値(ｃｐｍ)］と、該標的細胞に取り
込まれた全放射性物質の量［最大放出値(ｃｐｍ)］と、
放射性物質測定環境下における放射性物質の検出量［バ
ックグラウンド(ｃｐｍ)］とをスペクトルガンマカウン
ター等でそれぞれ測定し、次式（数１）により比放出率
(％)を算出する。１溶解ユニットは、１×１０7のエフ
ェクター細胞が標的細胞からの比放出率３０％を誘導す
る標的細胞の数として求められる。したがって、１溶解
ユニットは、１×１０7のエフェクター細胞がその３０
％を殺傷することができる標的細胞数を意味することに
なる。
に定義される。エフェクター細胞とＣｒ56等の放射性物
質で標識されたダウディ細胞又はＫ５６２細胞等の標的
細胞とを接触せしめ、該標的細胞から放出される放射性
物質の量［測定放出値(ｃｐｍ)］と、該標的細胞に取り
込まれた全放射性物質の量［最大放出値(ｃｐｍ)］と、
放射性物質測定環境下における放射性物質の検出量［バ
ックグラウンド(ｃｐｍ)］とをスペクトルガンマカウン
ター等でそれぞれ測定し、次式（数１）により比放出率
(％)を算出する。１溶解ユニットは、１×１０7のエフ
ェクター細胞が標的細胞からの比放出率３０％を誘導す
る標的細胞の数として求められる。したがって、１溶解
ユニットは、１×１０7のエフェクター細胞がその３０
％を殺傷することができる標的細胞数を意味することに
なる。
【００１５】
【数１】
【００１６】本発明のＢＲＭによって活性化されたキラ
ー細胞を含むリンパ球は、例えば、以下のようにして調
製することができる。末梢血から分離したＰＢＭＣを、
培養器の内壁に固定した固相化抗ＣＤ３抗体の存在下で
インキュベートし、ＴＣＲと会合して抗原認識複合体を
形成するＣＤ３（抗原）の抗ＣＤ３抗体との結合を利用
して、特にＣＤ５６陽性のγδＴ細胞を培養器内壁に付
着させ、次いでＩＬ−２含有培地で培養し、Ｔ細胞やＮ
Ｋ細胞、特にＣＤ５６陽性のγδＴ細胞やＣＤ５６陽性
のＮＫ細胞を増殖させた後、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α等の
ＢＲＭを用いて所定時間活性化処理することにより得る
ことができる。そして、このようにして得られたリンパ
球を洗浄し、活性化処理に用いたＩＬ−２、ＩＦＮ−α
等のＢＲＭを実質的に除去しておくことが好ましい。ま
た、上記培養増殖時に単球を共存させることにより、よ
り細胞障害活性の強いキラー細胞を含むリンパ球を得る
ことができる。
ー細胞を含むリンパ球は、例えば、以下のようにして調
製することができる。末梢血から分離したＰＢＭＣを、
培養器の内壁に固定した固相化抗ＣＤ３抗体の存在下で
インキュベートし、ＴＣＲと会合して抗原認識複合体を
形成するＣＤ３（抗原）の抗ＣＤ３抗体との結合を利用
して、特にＣＤ５６陽性のγδＴ細胞を培養器内壁に付
着させ、次いでＩＬ−２含有培地で培養し、Ｔ細胞やＮ
Ｋ細胞、特にＣＤ５６陽性のγδＴ細胞やＣＤ５６陽性
のＮＫ細胞を増殖させた後、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α等の
ＢＲＭを用いて所定時間活性化処理することにより得る
ことができる。そして、このようにして得られたリンパ
球を洗浄し、活性化処理に用いたＩＬ−２、ＩＦＮ−α
等のＢＲＭを実質的に除去しておくことが好ましい。ま
た、上記培養増殖時に単球を共存させることにより、よ
り細胞障害活性の強いキラー細胞を含むリンパ球を得る
ことができる。
【００１７】上記活性化処理としては、ダウディ癌細胞
等の標的細胞に対する細胞障害活性が１５０溶解ユニッ
ト以上となる処理であれば特に制限されるものでなく、
使用するＢＲＭの種類・組合せ、濃度、処理時間等を適
宜選択することができる。例えば、活性化処理にＢＲＭ
としてＩＬ−２とＩＦＮ−αを用いる場合について具体
的に説明すると、１０００単位／ｍｌのＩＬ−２と１０
００〜２０００単位／ｍｌのＩＦＮ−αで約１５分間の
活性化処理により、ダウディ癌細胞等の標的細胞に対す
る細胞障害活性が１５０溶解ユニット以上となるリンパ
球を得ることができる。上記１０００単位／ｍｌのＩＬ
−２と１０００単位／ｍｌのＩＦＮ−αとを用いる場
合、処理時間を１５分より少し長くしてもよく、また、
１０００単位／ｍｌのＩＬ−２と２０００単位／ｍｌの
ＩＦＮ−αとを用いるときは、処理時間を１５分より少
し短くしてもよい。
等の標的細胞に対する細胞障害活性が１５０溶解ユニッ
ト以上となる処理であれば特に制限されるものでなく、
使用するＢＲＭの種類・組合せ、濃度、処理時間等を適
宜選択することができる。例えば、活性化処理にＢＲＭ
としてＩＬ−２とＩＦＮ−αを用いる場合について具体
的に説明すると、１０００単位／ｍｌのＩＬ−２と１０
００〜２０００単位／ｍｌのＩＦＮ−αで約１５分間の
活性化処理により、ダウディ癌細胞等の標的細胞に対す
る細胞障害活性が１５０溶解ユニット以上となるリンパ
球を得ることができる。上記１０００単位／ｍｌのＩＬ
−２と１０００単位／ｍｌのＩＦＮ−αとを用いる場
合、処理時間を１５分より少し長くしてもよく、また、
１０００単位／ｍｌのＩＬ−２と２０００単位／ｍｌの
ＩＦＮ−αとを用いるときは、処理時間を１５分より少
し短くしてもよい。
【００１８】前述した前報においては、１０００単位／
ｍｌのＩＬ−２と５００単位／ｍｌのＩＦＮ−αとで１
時間活性化処理を行ったが、かかる活性化処理では、最
大１３０溶解ユニットのダウディ癌細胞等の標的細胞に
対する細胞障害活性しか得られないが、上記のように、
１０００単位／ｍｌのＩＬ−２と１０００単位／ｍｌの
ＩＦＮ−αで１５分間活性化処理すると溶解ユニット２
００以上の本発明のリンパ球を、１０００単位／ｍｌの
ＩＬ−２と２０００単位／ｍｌのＩＦＮ−αで１５分間
活性化処理すると溶解ユニット１８０程度の本発明のリ
ンパ球を得ることができる。なお、このような処理濃度
と処理時間を変えた活性化処理により、細胞障害活性が
上記のように大きく変化する理由は定かではないが、Ｂ
ＲＭにより活性化されたＢＡＫ細胞は、当初約２０％の
ＣＤ５６陽性細胞を含有するに過ぎないが、２週間培養
・増殖することによってＣＤ５６陽性細胞が約５０％あ
るいは５０％以上に増えたこともその一因と考えられ
る。
ｍｌのＩＬ−２と５００単位／ｍｌのＩＦＮ−αとで１
時間活性化処理を行ったが、かかる活性化処理では、最
大１３０溶解ユニットのダウディ癌細胞等の標的細胞に
対する細胞障害活性しか得られないが、上記のように、
１０００単位／ｍｌのＩＬ−２と１０００単位／ｍｌの
ＩＦＮ−αで１５分間活性化処理すると溶解ユニット２
００以上の本発明のリンパ球を、１０００単位／ｍｌの
ＩＬ−２と２０００単位／ｍｌのＩＦＮ−αで１５分間
活性化処理すると溶解ユニット１８０程度の本発明のリ
ンパ球を得ることができる。なお、このような処理濃度
と処理時間を変えた活性化処理により、細胞障害活性が
上記のように大きく変化する理由は定かではないが、Ｂ
ＲＭにより活性化されたＢＡＫ細胞は、当初約２０％の
ＣＤ５６陽性細胞を含有するに過ぎないが、２週間培養
・増殖することによってＣＤ５６陽性細胞が約５０％あ
るいは５０％以上に増えたこともその一因と考えられ
る。
【００１９】
【実施例】以下に、実施例を掲げて本発明を具体的に説
明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限
定されるものではない。 実施例１［ＢＡＫ細胞活性を高めたリンパ球の製造］ （材料）ＢＡＫ細胞活性を高めたリンパ球の製造には、
以下の材料を使用した。ＯＫＴ３クローン（オルト フ
ァーマシュチカル、アメリカ）から精製された抗ＣＤ３
モノクローナル抗体は、ヤンセン協和（東京）から購入
したものを、遺伝子組換え大腸菌で製造したヒトＩＬ−
２（ｒｈＩＬ−２）は塩野義製薬（東京）から購入した
ものを、ヒト天然ＩＦＮ−αは、住友製薬（大阪）から
購入したものを、それぞれ用いた。
明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限
定されるものではない。 実施例１［ＢＡＫ細胞活性を高めたリンパ球の製造］ （材料）ＢＡＫ細胞活性を高めたリンパ球の製造には、
以下の材料を使用した。ＯＫＴ３クローン（オルト フ
ァーマシュチカル、アメリカ）から精製された抗ＣＤ３
モノクローナル抗体は、ヤンセン協和（東京）から購入
したものを、遺伝子組換え大腸菌で製造したヒトＩＬ−
２（ｒｈＩＬ−２）は塩野義製薬（東京）から購入した
ものを、ヒト天然ＩＦＮ−αは、住友製薬（大阪）から
購入したものを、それぞれ用いた。
【００２０】（ＢＡＫ細胞活性を高めたリンパ球の調製
法）複数の進行性癌患者から採取した末梢血２０ｍｌを
ヘパリン処理した後、フィコール−パーク密度勾配遠心
分離（３５０×ｇ、２５分）して、中間に層状になった
リンパ球を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）画分を分取
した。得られたＰＢＭＣ３〜５×１０7個を、１０％の
ヒトＡＢ血清とｒｈＩＬ−２を７００単位／ｍｌで含む
３０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０＋７培地（日研生物医学研
究所社製）に加えた後、抗ＣＤ３抗体で被覆された２２
５ｃｍ2培養フラスコ中で一晩インキュベートした。次
いで、３０ｍｌのＰＢＭＣを上記フラスコに添加し、Ｃ
Ｏ2雰囲気下３７℃で２日間培養し、さらにＲＰＭＩ１
６４０＋７培地を６０ｍｌ加え、さらに１〜２日培養し
た。
法）複数の進行性癌患者から採取した末梢血２０ｍｌを
ヘパリン処理した後、フィコール−パーク密度勾配遠心
分離（３５０×ｇ、２５分）して、中間に層状になった
リンパ球を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）画分を分取
した。得られたＰＢＭＣ３〜５×１０7個を、１０％の
ヒトＡＢ血清とｒｈＩＬ−２を７００単位／ｍｌで含む
３０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０＋７培地（日研生物医学研
究所社製）に加えた後、抗ＣＤ３抗体で被覆された２２
５ｃｍ2培養フラスコ中で一晩インキュベートした。次
いで、３０ｍｌのＰＢＭＣを上記フラスコに添加し、Ｃ
Ｏ2雰囲気下３７℃で２日間培養し、さらにＲＰＭＩ１
６４０＋７培地を６０ｍｌ加え、さらに１〜２日培養し
た。
【００２１】培養物を３つのフラスコに分け非接着性細
胞を２〜３日培養した。１７５単位／ｍｌのＩＬ−２と
２％のヒトＡＢ血清を含むHyMedium930B-10（ニプロ社
製）１リットルを含むガス透過性のバッグに移し、２〜
３日間培養して２つのバッグに分け、これをさらに２〜
３日間培養して４つのバッグに分けた。殺菌試験とエン
ドトキシンアッセイを行い問題の無いことを確認した
後、１０００単位／ｍｌのＩＬ−２と１０００単位／ｍ
ｌのＩＦＮ−αによって１５分間活性化処理を行った。
０．１％のヒトアルブミンを含む生理食塩水中で遠心分
離することによって２回洗浄し、ＩＬ−２及びＩＦＮ−
αを除去し、得られた０．５〜１．０×１０10のリンパ
球を２．５％のヒトアルブミンを含む生理食塩水２００
ｍｌを含む輸液バッグに入れた。この０．５〜１．０×
１０10のリンパ球が、１回のＢＡＫ細胞療法において１
時間かけて静脈に点滴投与される量である。
胞を２〜３日培養した。１７５単位／ｍｌのＩＬ−２と
２％のヒトＡＢ血清を含むHyMedium930B-10（ニプロ社
製）１リットルを含むガス透過性のバッグに移し、２〜
３日間培養して２つのバッグに分け、これをさらに２〜
３日間培養して４つのバッグに分けた。殺菌試験とエン
ドトキシンアッセイを行い問題の無いことを確認した
後、１０００単位／ｍｌのＩＬ−２と１０００単位／ｍ
ｌのＩＦＮ−αによって１５分間活性化処理を行った。
０．１％のヒトアルブミンを含む生理食塩水中で遠心分
離することによって２回洗浄し、ＩＬ−２及びＩＦＮ−
αを除去し、得られた０．５〜１．０×１０10のリンパ
球を２．５％のヒトアルブミンを含む生理食塩水２００
ｍｌを含む輸液バッグに入れた。この０．５〜１．０×
１０10のリンパ球が、１回のＢＡＫ細胞療法において１
時間かけて静脈に点滴投与される量である。
【００２２】実施例２［活性化処理の条件］ （試料の調製）ＩＬ−２とＩＦＮ−αを用いた活性化処
理条件（ＩＦＮ−α濃度、処理時間）について検討し
た。固相化抗ＣＤ３抗体処理に続くＩＬ−２存在下での
２週間の培養・増殖後のＰＢＭＣを、１０００単位／ｍ
ｌのＩＬ−２と、１０００単位／ｍｌ又は２０００単位
／ｍｌのＩＦＮ−αで、１５分間又は３０分間活性化処
理を行い、得られた６種類のＢＡＫを含むリンパ球をエ
フェクター細胞とし、ダウディ細胞を標的細胞とする細
胞障害活性について調べた。なお、対照としては、ＩＬ
−２とＩＦＮ−αを添加することなく、１５分間インキ
ュベーションしたものを用いた。
理条件（ＩＦＮ−α濃度、処理時間）について検討し
た。固相化抗ＣＤ３抗体処理に続くＩＬ−２存在下での
２週間の培養・増殖後のＰＢＭＣを、１０００単位／ｍ
ｌのＩＬ−２と、１０００単位／ｍｌ又は２０００単位
／ｍｌのＩＦＮ−αで、１５分間又は３０分間活性化処
理を行い、得られた６種類のＢＡＫを含むリンパ球をエ
フェクター細胞とし、ダウディ細胞を標的細胞とする細
胞障害活性について調べた。なお、対照としては、ＩＬ
−２とＩＦＮ−αを添加することなく、１５分間インキ
ュベーションしたものを用いた。
【００２３】（細胞障害活性の測定）上記活性化処理に
より得られたエフェクター細胞（２×１０6）を、１０
％のヒト血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌを入れ
た２４ウェルの平底プレートでインキュベートした。３
７℃で２４時間インキュベートした後、エフェクター細
胞をＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した後、１０％子
牛血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁
した。一方、標的細胞であるダウディ細胞を、０．５ｍ
ｌのクロム酸ナトリウム（Ｃｒ56、比活性５ｍＣｉ／ｍ
ｌ；ICN, CostaMesa, CA）を用い３７℃で９０分間で標
識し、１０％子牛血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３
回洗い、新しい培地に再懸濁し、１×１０4／ウェルの
エフェクター細胞が予め加えられている９６ウェルＵ底
プレート（ベクトンディッキンソンラボ社製）に所定の
標的細胞濃度となるように加えた。９６ウェルＵ底プレ
ートを５０×ｇで遠心分離し、上澄を各ウェルから回収
しスペクトルガンマカウンター（Packard Instrument,
Downers Grove, IL）で、標的細胞から放出される放射
性物質の量［測定放出値(ｃｐｍ)］を測定した。また、
標的細胞に取り込まれた全放射性物質の量［最大放出値
(ｃｐｍ)］は標的細胞を３％トリトンＸ−１００（シグ
マ社製）でインキュベートした後に測定した。そして、
放射性物質測定環境下における放射性物質の検出量をバ
ックグラウンド(ｃｐｍ)とし、前記比放出率(％)の式
（数１）より算出した比放出率が３０％となる標的細胞
数を求め、その値を１×１０7のエフェクター細胞当た
りの殺傷標的細胞数に換算、すなわち１０００倍して溶
解ユニット値とした。結果を図１に示す。
より得られたエフェクター細胞（２×１０6）を、１０
％のヒト血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌを入れ
た２４ウェルの平底プレートでインキュベートした。３
７℃で２４時間インキュベートした後、エフェクター細
胞をＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した後、１０％子
牛血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁
した。一方、標的細胞であるダウディ細胞を、０．５ｍ
ｌのクロム酸ナトリウム（Ｃｒ56、比活性５ｍＣｉ／ｍ
ｌ；ICN, CostaMesa, CA）を用い３７℃で９０分間で標
識し、１０％子牛血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３
回洗い、新しい培地に再懸濁し、１×１０4／ウェルの
エフェクター細胞が予め加えられている９６ウェルＵ底
プレート（ベクトンディッキンソンラボ社製）に所定の
標的細胞濃度となるように加えた。９６ウェルＵ底プレ
ートを５０×ｇで遠心分離し、上澄を各ウェルから回収
しスペクトルガンマカウンター（Packard Instrument,
Downers Grove, IL）で、標的細胞から放出される放射
性物質の量［測定放出値(ｃｐｍ)］を測定した。また、
標的細胞に取り込まれた全放射性物質の量［最大放出値
(ｃｐｍ)］は標的細胞を３％トリトンＸ−１００（シグ
マ社製）でインキュベートした後に測定した。そして、
放射性物質測定環境下における放射性物質の検出量をバ
ックグラウンド(ｃｐｍ)とし、前記比放出率(％)の式
（数１）より算出した比放出率が３０％となる標的細胞
数を求め、その値を１×１０7のエフェクター細胞当た
りの殺傷標的細胞数に換算、すなわち１０００倍して溶
解ユニット値とした。結果を図１に示す。
【００２４】図１から明らかなように、１０００単位／
ｍｌのＩＬ−２と１０００単位／ｍｌのＩＦＮ−αとを
用いて１５分間活性化処理したもの、及び、１０００単
位／ｍｌのＩＬ−２と２０００単位／ｍｌのＩＦＮ−α
とを用いて１５分間活性化処理したものは、溶解ユニッ
トが、それぞれ１８０程度及び２００以上であり、極め
て高いことがわかった。一方、１０００単位／ｍｌのＩ
Ｌ−２と１０００単位／ｍｌ又は２０００単位／ｍｌの
ＩＦＮ−αとを用いて３０分間活性化処理したものは、
１０００単位／ｍｌのＩＬ−２のみを用いて１５分間又
は３０分間活性化処理したものと同程度の細胞障害活性
を示し、同濃度で１５分間活性化処理したものに比べて
細胞障害活性が低かった。
ｍｌのＩＬ−２と１０００単位／ｍｌのＩＦＮ−αとを
用いて１５分間活性化処理したもの、及び、１０００単
位／ｍｌのＩＬ−２と２０００単位／ｍｌのＩＦＮ−α
とを用いて１５分間活性化処理したものは、溶解ユニッ
トが、それぞれ１８０程度及び２００以上であり、極め
て高いことがわかった。一方、１０００単位／ｍｌのＩ
Ｌ−２と１０００単位／ｍｌ又は２０００単位／ｍｌの
ＩＦＮ−αとを用いて３０分間活性化処理したものは、
１０００単位／ｍｌのＩＬ−２のみを用いて１５分間又
は３０分間活性化処理したものと同程度の細胞障害活性
を示し、同濃度で１５分間活性化処理したものに比べて
細胞障害活性が低かった。
【００２５】実施例３［リンパ球の培養・増殖特性及び
性状］ （材料）ＮＫ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ５６
陽性細胞を定量するために、それぞれフルオレセインイ
ソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したＦＩＴＣ抗Ｃ
Ｄ１６モノクローナル抗体、ＦＩＴＣ抗ＴＣＲαβモノ
クローナル抗体、ＦＩＴＣ抗ＴＣＲγδモノクローナル
抗体、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識したＰＥ抗ＣＤ
５６モノクローナル抗体を用い、これらモノクローナル
抗体はベクトンディッキンソン（マウンテンビュー、カ
リホルニア）から購入した。また、細胞内サイトカイン
分析のためのペリジニン−クロロフィル蛋白標識化抗Ｃ
Ｄ３抗体及びＰＥ標識化抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗
体もベクトンディッキンソンから購入した。
性状］ （材料）ＮＫ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ５６
陽性細胞を定量するために、それぞれフルオレセインイ
ソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したＦＩＴＣ抗Ｃ
Ｄ１６モノクローナル抗体、ＦＩＴＣ抗ＴＣＲαβモノ
クローナル抗体、ＦＩＴＣ抗ＴＣＲγδモノクローナル
抗体、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識したＰＥ抗ＣＤ
５６モノクローナル抗体を用い、これらモノクローナル
抗体はベクトンディッキンソン（マウンテンビュー、カ
リホルニア）から購入した。また、細胞内サイトカイン
分析のためのペリジニン−クロロフィル蛋白標識化抗Ｃ
Ｄ３抗体及びＰＥ標識化抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗
体もベクトンディッキンソンから購入した。
【００２６】（フローサイトメトリー）細胞の一定量を
氷上で３０分間適量のＦＩＴＣ又はＰＥで標識したモノ
クローナル抗体で染色した。細胞を非標識化モノクロー
ナル抗体と３０分間氷上でインキュベートし、冷たいＲ
ＰＭＩ１６４０で洗浄し、それからＦＩＴＣ結合をした
ヤギＦ(ａｂ′)2抗マウス免疫グロブリン抗体又は抗ラ
ット免疫グロブリン抗体（Cappel, Durham, NC）を用い
て染色した。染色したこれらの細胞を２回洗浄し、０．
５ｍｌの冷たいＲＰＭＩに再度懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ
フローサイトメーター（ベクトンディッキンソン社製）
により分析した。イソタイプ適合モノクローナル抗体を
ネガティブコントロールとして用いた。ＩＦＮ−γ生産
性γδＴ細胞は前報(Biotherapy 11, 241-53, 1998)に
記載した方法と同様フローサイトメトリー法（Flow cyt
ometry）により測定した。
氷上で３０分間適量のＦＩＴＣ又はＰＥで標識したモノ
クローナル抗体で染色した。細胞を非標識化モノクロー
ナル抗体と３０分間氷上でインキュベートし、冷たいＲ
ＰＭＩ１６４０で洗浄し、それからＦＩＴＣ結合をした
ヤギＦ(ａｂ′)2抗マウス免疫グロブリン抗体又は抗ラ
ット免疫グロブリン抗体（Cappel, Durham, NC）を用い
て染色した。染色したこれらの細胞を２回洗浄し、０．
５ｍｌの冷たいＲＰＭＩに再度懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ
フローサイトメーター（ベクトンディッキンソン社製）
により分析した。イソタイプ適合モノクローナル抗体を
ネガティブコントロールとして用いた。ＩＦＮ−γ生産
性γδＴ細胞は前報(Biotherapy 11, 241-53, 1998)に
記載した方法と同様フローサイトメトリー法（Flow cyt
ometry）により測定した。
【００２７】（ＣＤ５６陽性細胞とＣＤ５６陰性細胞の
単離）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、ＣＤ５６陽性
及びＣＤ５６陰性リンパ球を、マイクロビーズ（Milten
yi Biotech Inc社製)を用いたガイセルハルトらの方法
（Geiselhart et al. Natural Immunity 15, 227-33, 1
996）により単離した。簡単に説明すれば、フィコール
−パーク(Ficoll-Paque)密度勾配遠心分離法により末梢
血からＰＢＭＣを分離し、得られたＰＢＭＣ中のＣＤ５
６陽性細胞を、抗ＣＤ５６抗体と結合した磁気マイクロ
ビーズで被覆し、磁気カラムを用いて陽性的に選択し溶
出した。また、ＣＤ５６陰性細胞は磁気的に消費されそ
のままの細胞として分離された。これらのＣＤ５６陽性
細胞及びＣＤ５６陰性細胞の純度は、ＦＡＣＳ（fluore
scence activated cell sorter：蛍光活性化セルソータ
ー）分析によりそれぞれ９８％であることがわかった。
単離）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、ＣＤ５６陽性
及びＣＤ５６陰性リンパ球を、マイクロビーズ（Milten
yi Biotech Inc社製)を用いたガイセルハルトらの方法
（Geiselhart et al. Natural Immunity 15, 227-33, 1
996）により単離した。簡単に説明すれば、フィコール
−パーク(Ficoll-Paque)密度勾配遠心分離法により末梢
血からＰＢＭＣを分離し、得られたＰＢＭＣ中のＣＤ５
６陽性細胞を、抗ＣＤ５６抗体と結合した磁気マイクロ
ビーズで被覆し、磁気カラムを用いて陽性的に選択し溶
出した。また、ＣＤ５６陰性細胞は磁気的に消費されそ
のままの細胞として分離された。これらのＣＤ５６陽性
細胞及びＣＤ５６陰性細胞の純度は、ＦＡＣＳ（fluore
scence activated cell sorter：蛍光活性化セルソータ
ー）分析によりそれぞれ９８％であることがわかった。
【００２８】（ＩＬ−２存在下２週間の培養によるＣＤ
５６陽性細胞等の増加）後記する表３に示される癌患者
３名から末梢血を数ヶ月にわたり複数回採取し、ＩＬ−
２存在下２週間培養する実施例１記載の方法で活性化さ
れたキラー細胞を含むリンパ球を調製した。そして、培
養の前後におけるＮＫ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ５６陽性
細胞の増加について調べた。結果を図２に示す。図２に
示されるように、患者番号１においては、γδＴ細胞と
ＣＤ１６陽性細胞の両細胞数が培養によって増加し、患
者番号６においては、γδＴ細胞の数が増加し、患者番
号１１においては、ＣＤ１６陽性細胞の数が増加するこ
との他、ＣＤ５６陽性細胞の数は全ての患者において増
加することや、ＢＡＫ細胞の主な集団（ポピュレーショ
ン）はＣＤ５６陽性γδＴ細胞、ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞
等のＣＤ５６陽性細胞からなることがわかった。
５６陽性細胞等の増加）後記する表３に示される癌患者
３名から末梢血を数ヶ月にわたり複数回採取し、ＩＬ−
２存在下２週間培養する実施例１記載の方法で活性化さ
れたキラー細胞を含むリンパ球を調製した。そして、培
養の前後におけるＮＫ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ５６陽性
細胞の増加について調べた。結果を図２に示す。図２に
示されるように、患者番号１においては、γδＴ細胞と
ＣＤ１６陽性細胞の両細胞数が培養によって増加し、患
者番号６においては、γδＴ細胞の数が増加し、患者番
号１１においては、ＣＤ１６陽性細胞の数が増加するこ
との他、ＣＤ５６陽性細胞の数は全ての患者において増
加することや、ＢＡＫ細胞の主な集団（ポピュレーショ
ン）はＣＤ５６陽性γδＴ細胞、ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞
等のＣＤ５６陽性細胞からなることがわかった。
【００２９】また、実施例１におけるＩＬ−２存在下の
２週間の培養時における単球共存の細胞障害活性やＣＤ
５６陽性細胞数に及ぼす影響について調べた。単球非共
存下での培養とするために、培養器内壁に付着した細胞
を除去した状態で培養する以外は、単球共存下の培養で
ある実施例１と同様に行った。また、細胞障害活性はダ
ウディ細胞に加えてＫ−５６２細胞を用いる以外は実施
例２と同様に行った。結果を表１に示す。表１から、末
梢血リンパ球中のＣＤ５６陽性細胞を増殖するために
は、培養する際に単球を共存させることが好ましいこと
や、ＢＡＫ細胞を付着性単球の非共存下で培養すると、
Ｋ−５６２細胞（ＮＫ細胞の標的細胞）及びダウディ細
胞に対する細胞障害活性は増加しないことがわかった。
２週間の培養時における単球共存の細胞障害活性やＣＤ
５６陽性細胞数に及ぼす影響について調べた。単球非共
存下での培養とするために、培養器内壁に付着した細胞
を除去した状態で培養する以外は、単球共存下の培養で
ある実施例１と同様に行った。また、細胞障害活性はダ
ウディ細胞に加えてＫ−５６２細胞を用いる以外は実施
例２と同様に行った。結果を表１に示す。表１から、末
梢血リンパ球中のＣＤ５６陽性細胞を増殖するために
は、培養する際に単球を共存させることが好ましいこと
や、ＢＡＫ細胞を付着性単球の非共存下で培養すると、
Ｋ−５６２細胞（ＮＫ細胞の標的細胞）及びダウディ細
胞に対する細胞障害活性は増加しないことがわかった。
【００３０】
【表１】
【００３１】（β−エンドルフィンの分泌に関する新し
い知見）また、図２からわかるように、ＢＡＫ細胞は培
養前約２０％のＣＤ５６陽性細胞を含有するが、２週間
培養するとＣＤ５６陽性細胞は約５０％に増加し、ＢＡ
Ｋ細胞の多くはＣＤ５６陽性細胞であることがわかっ
た。また、前報において、ＣＤ５６陽性（ＣＤ５６+）
細胞はＣＤ５６陰性（ＣＤ５６-）細胞よりも強い細胞
障害活性を有することを報告した。他方、β−エンドル
フィンはＮＫ細胞活性を増進し、ＮＫ細胞及びヒト末梢
血リンパ球によるＩＦＮ−γの生産を増進する。そこ
で、ＣＤ５６陽性細胞がβ−エンドルフィンを産生する
かどうかについて調べた。
い知見）また、図２からわかるように、ＢＡＫ細胞は培
養前約２０％のＣＤ５６陽性細胞を含有するが、２週間
培養するとＣＤ５６陽性細胞は約５０％に増加し、ＢＡ
Ｋ細胞の多くはＣＤ５６陽性細胞であることがわかっ
た。また、前報において、ＣＤ５６陽性（ＣＤ５６+）
細胞はＣＤ５６陰性（ＣＤ５６-）細胞よりも強い細胞
障害活性を有することを報告した。他方、β−エンドル
フィンはＮＫ細胞活性を増進し、ＮＫ細胞及びヒト末梢
血リンパ球によるＩＦＮ−γの生産を増進する。そこ
で、ＣＤ５６陽性細胞がβ−エンドルフィンを産生する
かどうかについて調べた。
【００３２】（β−エンドルフィンの分析法）リンパ球
の培養上澄中のβ−エンドルフィンは、ラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ；INCSTAR Corp. 社製）により分析し
た。培養上澄をウサギ抗β−エンドルフィン血清と１６
〜２４時間４℃でインキュベートした。［125Ｉ］でラ
ベルしたβ−エンドルフィンを加え、さらに１６〜２４
時間４℃でインキュベートした。相分離はヤギ抗ウサギ
抗体の事前沈殿複合体で２０分間４℃にて行った。その
溶液を７６０×ｇで２０分遠心分離し、その上澄を捨
て、それぞれの試験管中の沈殿物をガンマシンチレーシ
ョンカウンターで測定した。このβ−エンドルフィン抗
体の交差−反応活性はヒトβ−エンドルフィン中で１０
０％であり、エンケファリン(enkephalin)、ＡＣＴＨ及
びバソプレッシン中では０．０１％以下であった。
の培養上澄中のβ−エンドルフィンは、ラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ；INCSTAR Corp. 社製）により分析し
た。培養上澄をウサギ抗β−エンドルフィン血清と１６
〜２４時間４℃でインキュベートした。［125Ｉ］でラ
ベルしたβ−エンドルフィンを加え、さらに１６〜２４
時間４℃でインキュベートした。相分離はヤギ抗ウサギ
抗体の事前沈殿複合体で２０分間４℃にて行った。その
溶液を７６０×ｇで２０分遠心分離し、その上澄を捨
て、それぞれの試験管中の沈殿物をガンマシンチレーシ
ョンカウンターで測定した。このβ−エンドルフィン抗
体の交差−反応活性はヒトβ−エンドルフィン中で１０
０％であり、エンケファリン(enkephalin)、ＡＣＴＨ及
びバソプレッシン中では０．０１％以下であった。
【００３３】（ＣＤ５６陽性細胞のβ−エンドルフィン
の産生）ＣＤ５６陽性細胞及びＣＤ５６陰性細胞は、前
記マイクロビーズ法によって末梢血単核細胞（ＰＢＭ
Ｃ）から単離した。次いで、２．５ｍｌの１０6細胞を
ＲＰＭＩ１６４０培地中で血清を添加せずに１６時間培
養した培養上澄におけるβ−エンドルフィンを、前記β
−エンドルフィンの分析法により測定した。結果を表２
に示す。表２に示されるように、ＣＤ５６陽性細胞だけ
が８ｐｇ／ｍｌのβ−エンドルフィンを産生した。この
産生量は、１０9個のＣＤ５６陽性細胞の場合、２０ｎ
ｇのβ−エンドルフィンが生産されることに相当する。
通常のヒトの血漿中のβ−エンドルフィンは５．８±
１．１ｐｇ／ｍｌであり、本発明のＢＡＫ細胞療法に用
いられるＢＡＫ細胞によって生産されるβ−エンドルフ
ィンは２０ｎｇとなるので、生体にとって有意の量とい
える。
の産生）ＣＤ５６陽性細胞及びＣＤ５６陰性細胞は、前
記マイクロビーズ法によって末梢血単核細胞（ＰＢＭ
Ｃ）から単離した。次いで、２．５ｍｌの１０6細胞を
ＲＰＭＩ１６４０培地中で血清を添加せずに１６時間培
養した培養上澄におけるβ−エンドルフィンを、前記β
−エンドルフィンの分析法により測定した。結果を表２
に示す。表２に示されるように、ＣＤ５６陽性細胞だけ
が８ｐｇ／ｍｌのβ−エンドルフィンを産生した。この
産生量は、１０9個のＣＤ５６陽性細胞の場合、２０ｎ
ｇのβ−エンドルフィンが生産されることに相当する。
通常のヒトの血漿中のβ−エンドルフィンは５．８±
１．１ｐｇ／ｍｌであり、本発明のＢＡＫ細胞療法に用
いられるＢＡＫ細胞によって生産されるβ−エンドルフ
ィンは２０ｎｇとなるので、生体にとって有意の量とい
える。
【００３４】
【表２】
【００３５】上記のように、ＣＤ５６陽性細胞とＣＤ５
６陰性細胞と比較した結果、ＣＤ５６陽性細胞のみがβ
−エンドルフィンを産生することを初めて明らかにし
た。ＣＤ５６陽性細胞はその細胞膜表面にＮＣＡＭをも
ち、脳ホルモンのβ−エンドルフィンを産生することか
ら、神経−免疫−エンドクリン(neuro-immune-endocrin
e：ＮＩＥ)系に直接的に関与する、多機能的ＮＩＥ細胞
であると考えられる。かかるＣＤ５６陽性細胞が多機能
ＮＩＥ細胞であることはこれまで全く知られていなかっ
た。このように、ＣＤ５６陽性細胞によるβ−エンドル
フィンの生産はＢＡＫ細胞療法によって誘起される一連
の抗癌反応に重要な役割を果たしていると考えられる。
他方、β−エンドルフィンは非常に重要な鎮痛・鎮静作
用を示す。したがって、ＢＡＫ細胞療法を始めて２〜３
週間後に患者が満足すべきＱＯＬを報告したのはこれが
理由であると推察される。
６陰性細胞と比較した結果、ＣＤ５６陽性細胞のみがβ
−エンドルフィンを産生することを初めて明らかにし
た。ＣＤ５６陽性細胞はその細胞膜表面にＮＣＡＭをも
ち、脳ホルモンのβ−エンドルフィンを産生することか
ら、神経−免疫−エンドクリン(neuro-immune-endocrin
e：ＮＩＥ)系に直接的に関与する、多機能的ＮＩＥ細胞
であると考えられる。かかるＣＤ５６陽性細胞が多機能
ＮＩＥ細胞であることはこれまで全く知られていなかっ
た。このように、ＣＤ５６陽性細胞によるβ−エンドル
フィンの生産はＢＡＫ細胞療法によって誘起される一連
の抗癌反応に重要な役割を果たしていると考えられる。
他方、β−エンドルフィンは非常に重要な鎮痛・鎮静作
用を示す。したがって、ＢＡＫ細胞療法を始めて２〜３
週間後に患者が満足すべきＱＯＬを報告したのはこれが
理由であると推察される。
【００３６】実施例４［臨床試験］ 本発明のＢＡＫ細胞活性を高めた自己リンパ球を用いた
ＢＡＫ細胞療法を施した患者は、余命が数ヶ月と予測さ
れる化学治療を拒否した１３人の進行性癌患者、及び手
術を受けた後の転移の防止を希望した４人の患者であ
る。前報において、ＩＦＮ−γ生産性のγδＴ細胞の割
合が１％以下の進行癌患者はＢＡＫ細胞治療の対象にな
らないことから、全ての患者のＩＦＮ−γ生産性のγδ
Ｔ細胞の割合が１％以上であることかどうかを確認し
た。表３に、患者の性別、年齢、原発病巣、転移病巣、
ＩＦＮ−γ生産性のγδＴ細胞の割合を示した。
ＢＡＫ細胞療法を施した患者は、余命が数ヶ月と予測さ
れる化学治療を拒否した１３人の進行性癌患者、及び手
術を受けた後の転移の防止を希望した４人の患者であ
る。前報において、ＩＦＮ−γ生産性のγδＴ細胞の割
合が１％以下の進行癌患者はＢＡＫ細胞治療の対象にな
らないことから、全ての患者のＩＦＮ−γ生産性のγδ
Ｔ細胞の割合が１％以上であることかどうかを確認し
た。表３に、患者の性別、年齢、原発病巣、転移病巣、
ＩＦＮ−γ生産性のγδＴ細胞の割合を示した。
【００３７】
【表３】
【００３８】インフォームドコンセントを与えてから、
通院によるＢＡＫ細胞治療の対象とした。平均６×１０
9の本発明のＢＡＫ細胞を１時間かけて月１回又は２週
間に１回点滴注射した。ＢＡＫ細胞治療の結果を表４に
示す。全ての患者の行動状態（performance status）は
カルノフスキー指標で８０％以上であった。また表４に
示されているように、２週間培養することによって患者
１７人全てのＰＢＭＣ中のＣＤ５６陽性細胞数が増加す
ることがわかった。ＢＡＫ細胞治療の間中、癌マーカー
としての免疫抑制性酸性蛋白（ＩＡＰ）及びＱＯＬマー
カーとしてフェーススケールを測定し記録した。表２及
び図３に示されるように、たとえ癌マーカー蛋白（ＩＡ
Ｐ）が増加した場合でも、全ての患者のＱＯＬは満足な
状態であるか改善された。番号１の患者の場合、図２に
示されるように、培養によってγδＴ細胞及びＮＫ細胞
（ＣＤ１６陽性細胞）の数が増加した。肺への転移癌の
大きさは像分析の結果３年間変化せず、患者の全体的状
況は大変良好であった（図３）。番号１０の患者の場
合、図２に示されるように、培養によってγδＴ細胞及
びＣＤ５６陽性細胞の数が増加した。番号１０の患者は
硬性胃癌に冒されていたが２週間に一度飛行機で札幌か
ら通院することができた。このことは、全般的に良好な
ＱＯＬが１７月以上維持できたことを示している（図
３）。この患者は免疫療法の開始した後１８月後、手術
した後３０月後に死亡したが、死亡の１月前まで多くの
好きな活動に参加していた。図３に示すように、ＢＡＫ
細胞治療が細菌汚染のためできなくなった７月、番号５
の患者の雰囲気は悪くなった。番号８の患者の場合、図
２に示されるように、培養によってＮＫ細胞（ＣＤ１６
陽性細胞）及びＣＤ５６陽性細胞の数が増加した。番号
８の患者は手術不可能な肺癌にかかっていたが、ＢＡＫ
細胞治療を始めてからＣＴ像分析によれば癌が消失し
た。
通院によるＢＡＫ細胞治療の対象とした。平均６×１０
9の本発明のＢＡＫ細胞を１時間かけて月１回又は２週
間に１回点滴注射した。ＢＡＫ細胞治療の結果を表４に
示す。全ての患者の行動状態（performance status）は
カルノフスキー指標で８０％以上であった。また表４に
示されているように、２週間培養することによって患者
１７人全てのＰＢＭＣ中のＣＤ５６陽性細胞数が増加す
ることがわかった。ＢＡＫ細胞治療の間中、癌マーカー
としての免疫抑制性酸性蛋白（ＩＡＰ）及びＱＯＬマー
カーとしてフェーススケールを測定し記録した。表２及
び図３に示されるように、たとえ癌マーカー蛋白（ＩＡ
Ｐ）が増加した場合でも、全ての患者のＱＯＬは満足な
状態であるか改善された。番号１の患者の場合、図２に
示されるように、培養によってγδＴ細胞及びＮＫ細胞
（ＣＤ１６陽性細胞）の数が増加した。肺への転移癌の
大きさは像分析の結果３年間変化せず、患者の全体的状
況は大変良好であった（図３）。番号１０の患者の場
合、図２に示されるように、培養によってγδＴ細胞及
びＣＤ５６陽性細胞の数が増加した。番号１０の患者は
硬性胃癌に冒されていたが２週間に一度飛行機で札幌か
ら通院することができた。このことは、全般的に良好な
ＱＯＬが１７月以上維持できたことを示している（図
３）。この患者は免疫療法の開始した後１８月後、手術
した後３０月後に死亡したが、死亡の１月前まで多くの
好きな活動に参加していた。図３に示すように、ＢＡＫ
細胞治療が細菌汚染のためできなくなった７月、番号５
の患者の雰囲気は悪くなった。番号８の患者の場合、図
２に示されるように、培養によってＮＫ細胞（ＣＤ１６
陽性細胞）及びＣＤ５６陽性細胞の数が増加した。番号
８の患者は手術不可能な肺癌にかかっていたが、ＢＡＫ
細胞治療を始めてからＣＴ像分析によれば癌が消失し
た。
【００３９】
【表４】
【００４０】１７人全ての患者の行動状態はカルノフス
キーの指標で８０％以上であり、彼等は２週間に１回の
割合で通院した。番号１〜７及び９〜１３の患者の場
合、原発性癌が除去されたにも拘わらず、多くの手術不
可能な転移癌があった。これらの患者は２〜３月しか生
存出来ないと判断される状態であったが、１６月以上に
亘ってＢＡＫ細胞治療を受けた。これは、ＢＡＫ細胞治
療が進行癌患者に対し副作用の無い延命効果があること
を意味する。これら番号１〜７及び９〜１３の患者の場
合、症像分析（ＣＴ及び／又はＭＲＩ）によれば、癌の
大きさは変化しなかった。したがって、これらの患者に
対するＢＡＫ細胞療法は、従来の化学療法で用いられる
基準からすれば効果なしと判定される。しかし、これら
の患者の行動状態（performance status）は、カルノフ
スキー指標によれば８０％以上であり、彼等のＱＯＬ指
数は１０段階のフェーススケールを使った評価によれば
維持されたか改善された。
キーの指標で８０％以上であり、彼等は２週間に１回の
割合で通院した。番号１〜７及び９〜１３の患者の場
合、原発性癌が除去されたにも拘わらず、多くの手術不
可能な転移癌があった。これらの患者は２〜３月しか生
存出来ないと判断される状態であったが、１６月以上に
亘ってＢＡＫ細胞治療を受けた。これは、ＢＡＫ細胞治
療が進行癌患者に対し副作用の無い延命効果があること
を意味する。これら番号１〜７及び９〜１３の患者の場
合、症像分析（ＣＴ及び／又はＭＲＩ）によれば、癌の
大きさは変化しなかった。したがって、これらの患者に
対するＢＡＫ細胞療法は、従来の化学療法で用いられる
基準からすれば効果なしと判定される。しかし、これら
の患者の行動状態（performance status）は、カルノフ
スキー指標によれば８０％以上であり、彼等のＱＯＬ指
数は１０段階のフェーススケールを使った評価によれば
維持されたか改善された。
【００４１】そこで、以下の新しい判定基準を導入する
ことにした。従来の固形癌の化学療法による効果判定で
は病巣像が消失し、４週間以上持続した場合を「著効」
（ＣＲ）、病巣面積が５０％以上の縮小が４週間以上持
続した場合を「有効」（ＰＲ）、病巣面積が５０％未満
縮小、又は２５％以内増大が４週間以上持続した場合を
「不変」（ＮＣ）、病巣面積が２５％以上増大した場合
を「進行」（ＰＤ）としており、画像上腫瘍の大きさが
不変であれば治療の効果がないとされてきた。しかし、
癌組織が存在しても副作用がなく、ＱＯＬが良好な状態
に維持されているならば患者にとって問題がないことか
ら、免疫療法では癌組織を無理矢理殺傷することはしな
いため、ＢＡＫ細胞治療の効果判定基準として新しくＰ
ＲとＮＣの間に病巣面積が５０％未満縮小、又は２５％
以内増大が６ヶ月以上続く場合として「長期不変」（pr
olonged ＮＣ）を加えた。この判定基準を加えた番号１
〜１３の患者の固形癌治療効果の判定結果を表４に示
す。病巣の画像が消失した番号８及び番号１３の患者に
つきＣＲの例が２例、番号１〜７及び１２の患者につき
prolonged ＮＣの例が８例となり、ＢＡＫ細胞治療の効
果がより一層明確となった。また、番号１４〜１７の手
術後の転移予防のためにＢＡＫ細胞治療を行った４名の
患者については、癌転移の無い期間がそれぞれ４６、３
７、３１及び１８月続いた。このことは、ＢＡＫ細胞治
療が癌転移予防効果を有することを意味する。
ことにした。従来の固形癌の化学療法による効果判定で
は病巣像が消失し、４週間以上持続した場合を「著効」
（ＣＲ）、病巣面積が５０％以上の縮小が４週間以上持
続した場合を「有効」（ＰＲ）、病巣面積が５０％未満
縮小、又は２５％以内増大が４週間以上持続した場合を
「不変」（ＮＣ）、病巣面積が２５％以上増大した場合
を「進行」（ＰＤ）としており、画像上腫瘍の大きさが
不変であれば治療の効果がないとされてきた。しかし、
癌組織が存在しても副作用がなく、ＱＯＬが良好な状態
に維持されているならば患者にとって問題がないことか
ら、免疫療法では癌組織を無理矢理殺傷することはしな
いため、ＢＡＫ細胞治療の効果判定基準として新しくＰ
ＲとＮＣの間に病巣面積が５０％未満縮小、又は２５％
以内増大が６ヶ月以上続く場合として「長期不変」（pr
olonged ＮＣ）を加えた。この判定基準を加えた番号１
〜１３の患者の固形癌治療効果の判定結果を表４に示
す。病巣の画像が消失した番号８及び番号１３の患者に
つきＣＲの例が２例、番号１〜７及び１２の患者につき
prolonged ＮＣの例が８例となり、ＢＡＫ細胞治療の効
果がより一層明確となった。また、番号１４〜１７の手
術後の転移予防のためにＢＡＫ細胞治療を行った４名の
患者については、癌転移の無い期間がそれぞれ４６、３
７、３１及び１８月続いた。このことは、ＢＡＫ細胞治
療が癌転移予防効果を有することを意味する。
【００４２】表４及び図３のヒト免疫抑制性酸性蛋白質
（ＩＡＰ）はヒト血清α１−酸性糖蛋白質の一つであ
り、癌マーカー蛋白質である。ＩＡＰの血清濃度はヤギ
抗ヒトＩＡＰ血清抗体を用いる単一放射免疫拡散法によ
り測定した。精製されたＩＡＰを用いた検量線は３０μ
ｇ／ｍｌと１５００μｇ／ｍｌの間で直線であった。ま
た、表４及び図３中のフェーススケールとは、図４に示
されるように、異なったムードを表す順番に並べた１０
枚の絵である。目、眉毛、及び口の微妙な変化が少しず
つ違ったムードを表している。その顔はムードが悪い順
に１〜１０の番号が付されており、１が最も良いムード
であり、１０は最も良くないムードである。試験官がこ
れらの顔を指差して患者に「これらの顔は最初の大変幸
福なものから最後の大変悲しいものまであります。今日
のあなたの気持ちを最も良く表している顔を指差してく
ださい。」といって患者に指差すものをムードとして採
用する。
（ＩＡＰ）はヒト血清α１−酸性糖蛋白質の一つであ
り、癌マーカー蛋白質である。ＩＡＰの血清濃度はヤギ
抗ヒトＩＡＰ血清抗体を用いる単一放射免疫拡散法によ
り測定した。精製されたＩＡＰを用いた検量線は３０μ
ｇ／ｍｌと１５００μｇ／ｍｌの間で直線であった。ま
た、表４及び図３中のフェーススケールとは、図４に示
されるように、異なったムードを表す順番に並べた１０
枚の絵である。目、眉毛、及び口の微妙な変化が少しず
つ違ったムードを表している。その顔はムードが悪い順
に１〜１０の番号が付されており、１が最も良いムード
であり、１０は最も良くないムードである。試験官がこ
れらの顔を指差して患者に「これらの顔は最初の大変幸
福なものから最後の大変悲しいものまであります。今日
のあなたの気持ちを最も良く表している顔を指差してく
ださい。」といって患者に指差すものをムードとして採
用する。
【００４３】
【発明の効果】本発明の生物製剤（ＢＲＭ）によって活
性化されたキラー細胞を含むリンパ球は、ＣＤ系の各種
レセプターやサイトカインの免疫系における相互作用の
解明、癌治療の基礎的研究に有用であるばかりでなく、
癌患者に投与することにより延命効果があり、患者のＱ
ＯＬを向上させることができ、しかも副作用が無いの
で、新しい免疫療法を可能とする。
性化されたキラー細胞を含むリンパ球は、ＣＤ系の各種
レセプターやサイトカインの免疫系における相互作用の
解明、癌治療の基礎的研究に有用であるばかりでなく、
癌患者に投与することにより延命効果があり、患者のＱ
ＯＬを向上させることができ、しかも副作用が無いの
で、新しい免疫療法を可能とする。
【図１】ＩＬ−２とＩＦＮ−αとを用いた活性化処理に
おける細胞障害活性の程度を溶解ユニットで示した図で
ある。
おける細胞障害活性の程度を溶解ユニットで示した図で
ある。
【図２】末梢血由来のリンパ球をＩＬ−２存在下に培養
したときのＮＫ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ５６陽性細胞の
細胞数の変化を示す図である。
したときのＮＫ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ５６陽性細胞の
細胞数の変化を示す図である。
【図３】本発明のリンパ球を用いて治療した患者の経過
を示す図である。
を示す図である。
【図４】ＱＯＬを測定するために用いたフェーススケー
ルの図である。
ルの図である。
Claims (10)
- 【請求項１】 末梢血から分取した単核細胞を固相化抗
ＣＤ３抗体の存在下で培養した後、ＩＬ−２含有培地で
培養し、次いでＩＬ−２及びＩＦＮ−αで活性化処理す
ることにより得られ、ダウディ癌細胞に対する細胞障害
活性が、１５０溶解ユニット以上であることを特徴とす
る生物製剤（ＢＲＭ）によって活性化されたキラー細胞
を含むリンパ球。 - 【請求項２】 ダウディ癌細胞に対する細胞障害活性
が、１８０溶解ユニット以上であることを特徴とする請
求項１記載の生物製剤（ＢＲＭ）によって活性化された
キラー細胞を含むリンパ球。 - 【請求項３】 生物製剤（ＢＲＭ）によって活性化され
たキラー細胞が、生物製剤（ＢＲＭ）によって活性化さ
れたγδＴ細胞及び／又はＮＫ細胞であることを特徴と
する請求項１又は２記載の生物製剤によって活性化され
たキラー細胞を含むリンパ球。 - 【請求項４】 生物製剤（ＢＲＭ）によって活性化され
たγδＴ細胞及び／又はＮＫ細胞が、β−エンドルフィ
ン産生能を有するＣＤ５６陽性細胞であることを特徴と
する請求項３記載の生物製剤（ＢＲＭ）によって活性化
されたキラー細胞を含むリンパ球。 - 【請求項５】 β−エンドルフィン産生能を有するＣＤ
５６陽性細胞が５０％以上含まれていることを特徴とす
る請求項４記載の生物製剤（ＢＲＭ）によって活性化さ
れたキラー細胞を含むリンパ球。 - 【請求項６】 生物製剤（ＢＲＭ）を実質的に含まない
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の生物製
剤（ＢＲＭ）によって活性化されたキラー細胞を含むリ
ンパ球。 - 【請求項７】 生物製剤（ＢＲＭ）がＩＬ−２及びＩＦ
Ｎ−αであることを特徴とする請求項６記載の生物製剤
（ＢＲＭ）によって活性化されたキラー細胞を含むリン
パ球。 - 【請求項８】 末梢血から分取した単核細胞を固相化抗
ＣＤ３抗体の存在下でインキュベーションした後、ＩＬ
−２含有培地で培養し、次いでＩＬ−２及びＩＦＮ−α
で所定時間活性化処理することを特徴とする請求項１〜
７のいずれか記載の活性化されたキラー細胞を含むリン
パ球の製造方法。 - 【請求項９】 ＩＬ−２含有培地での培養が、単球の共
存下に行われることを特徴とする請求項８記載の活性化
されたキラー細胞を含むリンパ球の製造方法。 - 【請求項１０】 ＩＬ−２及びＩＦＮ−αによる所定時
間の活性化処理が、１０００単位／ｍｌのＩＬ−２と１
０００〜２０００単位／ｍｌのＩＦＮ−αで約１５分間
行う活性化処理であることを特徴とする請求項８又は９
記載の活性化されたキラー細胞を含むリンパ球の製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000146392A JP3904374B2 (ja) | 2000-02-29 | 2000-05-18 | キラー活性を増強したリンパ球 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000053627 | 2000-02-29 | ||
| JP2000-53627 | 2000-02-29 | ||
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