JP4953403B2 - がん免疫療法用細胞の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は医薬組成物及び医薬組成物の製造方法に関する。詳しくは、免疫療法用の医薬組成物、及び免疫療法用の医薬組成物の製造方法に係るものである。
現在、がんの治療法は、手術、化学療法（抗がん剤治療）、放射線療法が主流となっているが、抗がん剤による治療、放射線による治療は副作用の問題があり、近年、副作用のないがんの第４の治療法として免疫細胞療法が注目されている。現在実施されている免疫療法は、患者のリンパ球あるいはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のみを活性化及び増殖し、患者に点滴注射によって戻すという方法である。
また、近年、免疫系を構成するリンパ球の１つとして、新たにナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞が発見され、注目されている。ＮＫＴ細胞は、健常人でもヒト末梢血リンパ球に０．３〜０．５％程度しか存在しない細胞であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ：抗ＣＤ３抗体と反応する受容体）とＮＫ細胞マーカー（ＣＤ１６１分子）の両方を併せ持ち、種属にただ一種類しかないＭＨＣ（主要組織適合抗原系：個々の細胞の特徴を提示する抗原系）様分子であるＣＤ１ｄによってがん細胞から提示されるがん抗原を認識し、がんを攻撃し殺傷することが明らかになっている。また、ＮＫＴ細胞を活性化及び増殖させるには、糖脂質α―ガラクトシルセラミド（α―ＧａｌＣｅｒ）が不可欠であることが知られている。
また、特許文献１には、特定のα―ガラクトシルセラミドが骨髄細胞の増殖促進効果を有している点が見出され、特定の式で示されるα―ガラクトシルセラミドの１種または２種類以上を有効成分として含有する骨髄細胞増殖促進剤が開示されている。即ち、特許文献１には、単核球画分を培地で調製し、前記骨髄細胞増殖促進剤と、調製された単核球画分を加えて培養する方法が記載されている。
しかしながら、特許文献１に記載の骨髄細胞増殖促進剤が増殖する骨髄細胞は単球であり、ＮＫ細胞及びリンパ球の２種類の細胞を略同時に、若しくは、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞及びリンパ球の３種類の細胞を略同時に、しかも容易に活性化及び増殖させるかどうか不明であった。
本発明は、以上の点に鑑みて創案されたものであり、ＮＫ細胞及びリンパ球の２種類の細胞を略同時に、若しくは、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞及びリンパ球の３種類の細胞を略同時に、しかも容易に活性化及び増殖する、がん免疫療法用細胞の製造方法を提供することを目的とする。
上記の目的を達成するために、本発明のがん免疫療法用細胞は、固相化された抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体と、固相化された抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体と、リンパ球培地とによって培養されたリンパ球混合物を含有する。
ここで、上記リンパ球混合物は、少なくともナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びリンパ球の２種類の細胞を含有するものであることが好ましい。ＮＫ細胞及びリンパ球の２種類の細胞を略同時に容易に活性化及び増殖することができるからである。
また、より好ましくは、上記リンパ球混合物は、少なくともナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びリンパ球の３種類の細胞を含有するものである。ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞及びリンパ球の３種類の細胞を略同時に容易に活性化及び増殖することができるからである。
ここで、上記リンパ球混合物は、少なくともナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びリンパ球の２種類の細胞を含有するものであることが好ましい。ＮＫ細胞及びリンパ球の２種類の細胞を略同時に容易に活性化及び増殖することができるからである。
また、より好ましくは、上記リンパ球混合物は、少なくともナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びリンパ球の３種類の細胞を含有するものである。ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞及びリンパ球の３種類の細胞を略同時に容易に活性化及び増殖することができるからである。
ここで、固相化された抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体と、固相化された抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体と、リンパ球培地とによってリンパ球混合物を培養するため、固相化された抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体及び固相化された抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体の組み合わせにより、ＮＫ細胞及びリンパ球の２種類の細胞を略同時に、若しくは、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞及びリンパ球の３種類の細胞を略同時に、活性化及び増殖することができる。
また、本発明のがん免疫療法用細胞において、リンパ球混合物が、末梢血から分離した末梢血リンパ球の集合物である場合、採血が容易で患者に苦痛を与えることがほとんどなく、末梢血からリンパ球混合物を分離する際に煩雑な手間がかからず、更に、血液を冷蔵保存で輸送できる。
また、本発明のがん免疫療法用細胞において、リンパ球培地が、１０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン―２を含有する場合、細胞の活性化及び増殖を促進することができる。
また、上記の目的を達成するために、本発明のがん免疫療法用細胞の製造方法は、固相化された抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体及び固相化された抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体の存在下で、リンパ球培地に、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びリンパ球の２種類の細胞を含有するリンパ球混合物を加えて、前記２種類の細胞を、顆粒球コロ二一刺激因子の非存在下で略同時に共培養し共培養し活性化及び増殖させる。
また、本発明のがん免疫療法用細胞の製造方法は、固相化された抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体及び固相化された抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体の存在下で、リンパ球培地に、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞，ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びリンパ球の３種類の細胞を含有するリンパ球混合物を加えて、前記３種類の細胞を、顆粒球コロ二一刺激因子の非存在下で略同時に共培養し活性化及び増殖させる。
また、本発明のがん免疫療法用細胞の製造方法は、固相化された抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体及び固相化された抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体の存在下で、リンパ球培地に、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞，ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びリンパ球の３種類の細胞を含有するリンパ球混合物を加えて、前記３種類の細胞を、顆粒球コロ二一刺激因子の非存在下で略同時に共培養し活性化及び増殖させる。
ここで、固相化された抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体及び固相化された抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体の存在下で、リンパ球培地にリンパ球混合物を加えるため、固相化された抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体及び固相化された抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体の組み合わせにより、ＮＫ細胞及びリンパ球の２種類の細胞を略同時に、若しくは、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞及びリンパ球の３種類の細胞を略同時に、活性化及び増殖することができる。
また、本発明のがん免疫療法用細胞の製造方法において、固相化された抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体及び固相化された抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体の存在下で、リンパ球培地にリンパ球混合物を加えて培養した後、リンパ球混合物を含んだリンパ球培地を、非固相化抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体及び非固相化抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体の存在下で、別のリンパ球培地に加える場合、細胞への過剰な刺激を与えることで生じるアポトーシス（細胞死）を抑えることができる。
本発明に係るがん免疫療法用細胞は、ＮＫ細胞及びリンパ球の２種類の細胞、若しくは、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞及びリンパ球の３種類の細胞が増殖及び活性化したものである。
本発明に係るがん免疫療法用細胞の製造方法は、ＮＫ細胞及びリンパ球の２種類の細胞を略同時に、若しくは、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞及びリンパ球の３種類の細胞を略同時に、しかも容易に活性化及び増殖することができる。
以下、本発明の実施の形態について説明する。
まず、本発明の方法により増殖及び活性化させる３種類の細胞のうち特にＮＫＴ細胞（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞）は、前述のように健常人の末梢血中でも０．３〜０．５％と極めて微量にしか存在せず、強い抗腫瘍作用、抗アレルギー作用、自己免疫疾患抑制作用、臓器移植後の拒絶反応抑制作用などを有することが知られる細胞である。
また、ＮＫＴ細胞は細胞膜表面にＮＫ細胞マーカーであるＣＤ１６１分子と、ＣＤ３分子が会合したＴ細胞受容体を共有している。ヒトのＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞受容体がＶα２４＋Ｖβ１１＋の配列を有している。それ故に、ヒトのＮＫＴ細胞は抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ１６１抗体と結合すると活性化し、増殖することができる。リンパ球は、Ｔ細胞（Ｔリンパ球）とも呼ばれ細胞膜表面にＴ細胞受容体（ＣＤ３分子）を有し、抗ＣＤ３抗体と結合すると活性化し、増殖することができる。ＮＫ細胞は細胞膜表面にＣＤ１６１分子を発現し、抗ＣＤ１６１抗体と結合すると活性化し、増殖することができるが、Ｔ細胞受容体を持っていないので抗ＣＤ３抗体とは結合することは無く、抗ＣＤ３抗体によって活性化及び増殖することはない。
まず、本発明の方法により増殖及び活性化させる３種類の細胞のうち特にＮＫＴ細胞（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞）は、前述のように健常人の末梢血中でも０．３〜０．５％と極めて微量にしか存在せず、強い抗腫瘍作用、抗アレルギー作用、自己免疫疾患抑制作用、臓器移植後の拒絶反応抑制作用などを有することが知られる細胞である。
また、ＮＫＴ細胞は細胞膜表面にＮＫ細胞マーカーであるＣＤ１６１分子と、ＣＤ３分子が会合したＴ細胞受容体を共有している。ヒトのＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞受容体がＶα２４＋Ｖβ１１＋の配列を有している。それ故に、ヒトのＮＫＴ細胞は抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ１６１抗体と結合すると活性化し、増殖することができる。リンパ球は、Ｔ細胞（Ｔリンパ球）とも呼ばれ細胞膜表面にＴ細胞受容体（ＣＤ３分子）を有し、抗ＣＤ３抗体と結合すると活性化し、増殖することができる。ＮＫ細胞は細胞膜表面にＣＤ１６１分子を発現し、抗ＣＤ１６１抗体と結合すると活性化し、増殖することができるが、Ｔ細胞受容体を持っていないので抗ＣＤ３抗体とは結合することは無く、抗ＣＤ３抗体によって活性化及び増殖することはない。
このようなＮＫＴ細胞 （Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞）、ＮＫ細胞及びリンパ球を本発明
において増殖及び活性化するには、出発物質としてリンパ球混合物を用いる。
また、リンパ球混合物は、生体から採取可能なリンパ球の集合であり、末梢血リンパ球、臍帯血リンパ球、リンパ節リンパ球、腫瘍内浸潤リンパ球、がん性腹水・がん性胸水浸潤リンパ球等がある。リンパ球混合物は生体の各部から採血、バイオプシー（生体穿刺）、ドレナージ (排液法)、手術等の方法によって採取することができる。リンパ球を含む細胞混合物は目的に応じた方法によって処理し、比重１．０７７のリンパ球分離用試薬によってリンパ球混合物として分離することができる。
において増殖及び活性化するには、出発物質としてリンパ球混合物を用いる。
また、リンパ球混合物は、生体から採取可能なリンパ球の集合であり、末梢血リンパ球、臍帯血リンパ球、リンパ節リンパ球、腫瘍内浸潤リンパ球、がん性腹水・がん性胸水浸潤リンパ球等がある。リンパ球混合物は生体の各部から採血、バイオプシー（生体穿刺）、ドレナージ (排液法)、手術等の方法によって採取することができる。リンパ球を含む細胞混合物は目的に応じた方法によって処理し、比重１．０７７のリンパ球分離用試薬によってリンパ球混合物として分離することができる。
このリンパ球混合物からＮＫＴ細砲を単離させて使用することも可能であるが、手間を簡略化するなどの理由で、リンパ球混合物の状態で使用するのが最適である。
リンパ球混合物中のNKT細胞（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞）、NK細胞、リンパ球だけを単離して使用することもできるが、高価な機器を必要とすること、高度な技術が必要なこと、単離に多大な時間と経費を費やす必要があり、特定の施設でしかできないという理由で好ましくない。
なお、免疫療法用細胞医薬組成物に、ＮＫＴ細胞（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞）、ＮＫ細胞及びリンパ球が活性及び増殖されたリンパ球混合物を利用する場合には、このリンパ球混合物は、投与される患者自身の細胞であることが望ましい。
リンパ球混合物中のNKT細胞（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞）、NK細胞、リンパ球だけを単離して使用することもできるが、高価な機器を必要とすること、高度な技術が必要なこと、単離に多大な時間と経費を費やす必要があり、特定の施設でしかできないという理由で好ましくない。
なお、免疫療法用細胞医薬組成物に、ＮＫＴ細胞（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞）、ＮＫ細胞及びリンパ球が活性及び増殖されたリンパ球混合物を利用する場合には、このリンパ球混合物は、投与される患者自身の細胞であることが望ましい。
また、このリンパ球混合物を培養するための培地であるリンパ球培養液としては、従来からリンパ球の細胞培養に用いられているＲＰＭＩ−１６４０を基盤として作成されている各種の培養液が利用可能である。
また、細胞の初期培養用及び二次培養用のリンパ球培養液には、１０００Ｕ／ｍｌ（１０００単位／ｍｌ）のインターロイキン２(ＩＬ−２)を含有させるのが好ましい。低濃度のＩＬ−２よりも１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含有させることにより、細胞の増殖率及び活性度を向上することができるからである。
また、ＩＬ−２は細胞の増殖及び活性化に影響を与えることが知られているサイトカイン（細胞から遊離される免疫物質）であり、人工的にも合成できることから、本発明においても使用できる。
また、ＩＬ−２は細胞の増殖及び活性化に影響を与えることが知られているサイトカイン（細胞から遊離される免疫物質）であり、人工的にも合成できることから、本発明においても使用できる。
また、α−ガラクトシルセラミドを用いた実験系で、がん患者のリンパ球を培養する際、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロ二一刺激因子）を含有させることによりＮＫＴ細胞の増殖を改善できることが報告されているが、本発明においては、わざわざＧ−ＣＳＦを使用しなくても、容易に培養することができ、活性度及び増殖率を向上することが期待できる。
なお、本発明において、リンパ球混合物に抗原提示細胞（がん抗原をＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、リンパ球に伝達する細胞）を加えてもよいが、ここでは、抗原提示細胞を加えない培養方法を使用するのが好適である。本発明は、抗原提示細胞を加えなくても細胞の増殖及び活性化に与える影響は少なく、これによりリンパ球培養方法の手間を簡略化することができるからである。
一方、本発明の初期培養及び二次培養で細胞を増殖及び活性化する方法で使用する培養容器は、リンパ球培養液及びリンパ球混合物を収容可能な容器本体に、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ１６１抗体が二重固相化された固相化培養容器を使用する。さらに培養を継続する場合は、抗ＣＤ３抗体や抗ＣＤ１６１抗体で固相化されていない非固相化培養容器（ＣＯ２透過バッグ）内で培養を継続することを特徴とする。
また、初期培養及び二次培養のための培養容器本体としては、特に限定されるものではなく、硬質樹脂製容器、軟質樹脂製可撓性容器、ガラス製容器などが使用可能である。
また、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ１６１抗体は、この容器本体のリンパ球培養液及びリンパ球混合物と接する接液表面の少なくとも一部、好ましくは全部に固相化されるのがよい。
固相化に使用される抗ＣＤ３抗体は、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞表面のＴ細胞受容体に会合して存在するＣＤ３分子が特異的に反応する抗体である。
また、ＣＤ３分子は、Ｔ細胞受容体と共に抗原提示細胞のＭＨＣ（主要組織適合抗原系：がん細胞の表面に発現する抗原で、Ｔ細胞にがん細胞を認識させ、がん細胞の排除に関わる免疫反応を開始させる）分子及び抗原を認識して細胞内に伝達するために機能する分子であり、抗ＣＤ３抗体によりＮＫＴ細胞、Ｔ細胞に刺激が与えられることにより、細胞の増殖及び活性化が引き起こされる。
また、ＣＤ３分子は、Ｔ細胞受容体と共に抗原提示細胞のＭＨＣ（主要組織適合抗原系：がん細胞の表面に発現する抗原で、Ｔ細胞にがん細胞を認識させ、がん細胞の排除に関わる免疫反応を開始させる）分子及び抗原を認識して細胞内に伝達するために機能する分子であり、抗ＣＤ３抗体によりＮＫＴ細胞、Ｔ細胞に刺激が与えられることにより、細胞の増殖及び活性化が引き起こされる。
また、固相化に使用される抗ＣＤ１６１抗体は、ＮＫＴ細胞表面やＮＫ細胞表面に存在するＮＫＲ−Ｐ１Ａ（ＣＤ１６１）分子が特異的に反応する抗体である。このＣＤ１６１抗体はＮＫＴ細胞及びＮＫ細胞の表面マーカーとして知られているが、ＮＫＴ細胞表面のＣＤ１６１分子とのリガンド（配位子または結合部位）は未だ明らかではない。しかし、抗ＣＤ１６１抗体でＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞を刺激することにより、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞の活性化に影響を与える。
また、培養容器には、これらの抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ１６１抗体との両方を固相化させる必要がある。一方だけでは、ＮＫＴ細胞は増殖及び活性化できないからである。
次に、固相化の方法について説明する。抗ＣＤ３抗体を培養容器に固相化するには、例えば、滅菌されたリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用い抗ＣＤ３抗体を１μｇ／ｍｌの濃度となるように調整し、この抗体を培養容器に注入し、２４時間室温で静置した後、適量のリン酸緩衝液で余分な抗体を洗浄することにより抗ＣＤ３抗体を固相化する。
その後、滅菌されたリン酸緩衝液で抗ＣＤ１６１抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度となるように調整し、この抗体を培養容器に注入し、２４時間室温で静置した後、適量のリン酸緩衝液で余分な抗体を洗浄することにより抗ＣＤ１６１抗体を固相化する。このような固相化方法は特に限定されるものではなく、適宜選択することが可能である。
その後、滅菌されたリン酸緩衝液で抗ＣＤ１６１抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度となるように調整し、この抗体を培養容器に注入し、２４時間室温で静置した後、適量のリン酸緩衝液で余分な抗体を洗浄することにより抗ＣＤ１６１抗体を固相化する。このような固相化方法は特に限定されるものではなく、適宜選択することが可能である。
次に、このように二重固相化した培養容器を用いてＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、リンパ球を同時に増殖及び活性化させる方法について説明する。
本発明ではリンパ球混合物をリンパ球培養液と共に培養容器内に収容して培養する。ここでは、前記のように調製されたリンパ球培養液にリンパ球混合物を混合して浮遊（分散）させた状態で、培養容器内に収容して３７℃のＣＯ２インキュベータの中で静置することにより行う。
このとき、リンパ球培養液中のリンパ球混合物の濃度を、１×１０７〜１．５×１０７（１０００〜１５００万）個／ｍｌに調整するのが好適である。また、特に限定されるものではないが、抗体が固相化された培養容器の接液面の面積に対して均一水平となるようにリンパ球培養液を収容するのが好適である。
そして、この培養容器を５％ＣＯ２濃度、３７℃の条件下のインキュベータ内で、５〜６日間静置することにより初期培養及び二次培養を行う。
本発明ではリンパ球混合物をリンパ球培養液と共に培養容器内に収容して培養する。ここでは、前記のように調製されたリンパ球培養液にリンパ球混合物を混合して浮遊（分散）させた状態で、培養容器内に収容して３７℃のＣＯ２インキュベータの中で静置することにより行う。
このとき、リンパ球培養液中のリンパ球混合物の濃度を、１×１０７〜１．５×１０７（１０００〜１５００万）個／ｍｌに調整するのが好適である。また、特に限定されるものではないが、抗体が固相化された培養容器の接液面の面積に対して均一水平となるようにリンパ球培養液を収容するのが好適である。
そして、この培養容器を５％ＣＯ２濃度、３７℃の条件下のインキュベータ内で、５〜６日間静置することにより初期培養及び二次培養を行う。
この培養過程では、全期間を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ１６１抗体が固相化された同一の培養容器において培養を行うことも可能である。このように培養期間の全てで細胞膜表面のＣＤ３分子及びＣＤ１６１分子に刺激を与えていても、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、リンパ球を安全確実に増殖及び活性化することができる。
一方、培養期間の初期例えば５〜６日間、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ１６１抗体が固相化された培養容器において培養を行った後、リンパ球混合物を含むリンパ球培養液を、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ１６１抗体が固相化されていない非固相化培養容器に移して培養を継続し、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞及びリンパ球を増殖及び活性化することも可能である。この非固相化培養容器としては、ＣＯ２透過バッグ以外にも固相化培養容器の容器本体と同様のものを使用してもよい。
このようにすれば、細胞への過剰な刺激を防止してアポト一シス（細胞死）を抑えて、更にＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞及びリンパ球を同時に増殖及び活性化することができる。また、初期培養及び二次培養により増殖及び活性化された、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞及びリンパ球の全部または一部を別の培養容器に取り出して更に増殖させる際、その培養容器に抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ１６１抗体を固相化する手間を省くことができる。
本発明で使用する培養方法は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ１６１抗体を用いることによって、ＮＫＴ細胞であるＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞、ＮＫ細胞及びリンパ球を同時に、かつ容易に増殖及び活性化できる。しかも、細胞を増殖及び活性化する際、それぞれの細胞を単離する手間を省くことができ、技術的に３種類の細胞を同時に、かつ容易に増殖及び活性化することができる。
また、本発明で使用する培養方法は、ＮＫＴ細胞（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞）及びＮＫＴ細胞の一部であってＮＫＴ細胞と同様に抗腫瘍作用、免疫調整作用を有するＶα２４+Ｖβ１１−細胞をも高い増殖率で活性化することができる。
Ｖα２４＋Ｖβ１１−細胞は、ＮＫＴ細胞（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞）と同様に膜表面にＣＤ１６１分子を保有しており、ＮＫＴ細胞同様に高い増殖率で活性化できる。これは、抗ＣＤ１６１抗体がＶα２４＋細胞のＣＤ１６１分子に対する共有刺激因子（ｃｏ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）として作用したためと考えられる。また、抗ＣＤ１61抗体がＶα２４＋Ｖβ１１−細胞を増殖及び活性化する過程は、ＮＫＴ細胞（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞）を増殖及び活性化する過程と同一のためと考えられる。
また、本発明で使用する培養方法では、ＮＫＴ細胞を特異的に活性化させるα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）を用いることなく、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ１６１抗体を用いてＮＫＴ細胞（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞）及びＶα２４＋Ｖβ１１−細胞（ＮＫＴ細胞の一部）を増殖及び活性化できる。その原因として、Ｔ細胞の膜表面に存在するＣＤ４、ＣＤ８分子がそれぞれＭＨＣクラスＩＩ分子とＭＨＣクラスＩ分子の共有レセプター（ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）として存在するように、Ｖα２４+ＮＫＴ細胞のＣＤ１６１分子が細胞を増殖及び活性化に導くＣＤ１ｄを直接認識することができる共有レセプターか、或いはＣＤ１６１分子のリガンド（共有結合部）がＣＤ１ｄそのものであるためであると考えることができる。
また、培養期間中には、ＮＫＴ細胞が増殖及び活性化されてインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）等のサイトカインが産生される。
また、培養期間中には、ＮＫＴ細胞が増殖及び活性化されてインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）等のサイトカインが産生される。
以上のようにして培養することにより、ＮＫＴ細胞（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞）、ＮＫ細胞、リンパ球が同時に増殖及び活性化されたリンパ球混合物（培養混合物）を得ることができる。
このようにして得られたリンパ球混合物（培養混合物）は、燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、ＮＫＴ細胞またはＮＫＴ細胞を含有する混合物として種々の用途に使用することができる。
また 免疫療法用細胞医薬の用途に使用する場合には、培養容器から取り出されたリン
パ球混合物（培養混合物）は２５０ｍｌの燐酸緩衝液（ＰＢＳ）により２〜３回遠心及び洗浄され、１００ｍｌの生理食塩水に浮遊させて輸液等の薬液とすればよい。
また このような薬液の、ＮＫＴ細胞の濃度は、リンパ球混合物全量基準で５〜４０％、ＮＫ細胞の濃度は、リンパ球混合物全量基準で２５〜６０％、リンハ球の濃度は、リンパ球混合物全量基準で３０〜６０％程度とするのが好ましい。
そして、この免疫療法用細胞医薬を患者に投与することにより、増殖及び活性化されたＮＫＴ細胞（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞）及びＮＫ細胞、リンパ球の安定した抗腫瘍作用、抗アレルギー作用、自己免疫疾患抑制作用、臓器移植後の拒絶反応抑制作用によって優れた治療効果を期待できる。
パ球混合物（培養混合物）は２５０ｍｌの燐酸緩衝液（ＰＢＳ）により２〜３回遠心及び洗浄され、１００ｍｌの生理食塩水に浮遊させて輸液等の薬液とすればよい。
また このような薬液の、ＮＫＴ細胞の濃度は、リンパ球混合物全量基準で５〜４０％、ＮＫ細胞の濃度は、リンパ球混合物全量基準で２５〜６０％、リンハ球の濃度は、リンパ球混合物全量基準で３０〜６０％程度とするのが好ましい。
そして、この免疫療法用細胞医薬を患者に投与することにより、増殖及び活性化されたＮＫＴ細胞（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞）及びＮＫ細胞、リンパ球の安定した抗腫瘍作用、抗アレルギー作用、自己免疫疾患抑制作用、臓器移植後の拒絶反応抑制作用によって優れた治療効果を期待できる。
以下、実施例について説明する。
（リンパ球混合物）
がん患者１５名（肺がん５名、肝臓がん４名、結腸がん２名、胃がん１名、悪性リンパ腫１名、乳がん１名、前立腺がん１名、病期：ステージ（Ｓｔａｇｅ）ＩＩ〜ＩＶ）の末梢血を採血し、比重１．００７のリンパ球分離用試薬にて遠心分離することにより、それぞれの患者毎に別々にリンパ球混合物サンプルを作成した。
（リンパ球混合物）
がん患者１５名（肺がん５名、肝臓がん４名、結腸がん２名、胃がん１名、悪性リンパ腫１名、乳がん１名、前立腺がん１名、病期：ステージ（Ｓｔａｇｅ）ＩＩ〜ＩＶ）の末梢血を採血し、比重１．００７のリンパ球分離用試薬にて遠心分離することにより、それぞれの患者毎に別々にリンパ球混合物サンプルを作成した。
（リンパ球培養液の調製）
ＲＰＭＩ−１６４０を基盤にした培養液に、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含有させたリンパ球培養液を調製した。
ＲＰＭＩ−１６４０を基盤にした培養液に、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含有させたリンパ球培養液を調製した。
（モノクローナル抗体）
抗ヒトＣＤ３抗体としてＵＣＴＨ−１（ＢＤバイオサイエンス社製）、抗ヒトＣＤ１６１抗体として１９１．Ｂ８（イムノテック社製）を用いた。ＮＫＴ（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋）細胞、Ｖα２４＋Ｖβ１１−細胞のフローサイトメトリ解析のためにＦＩＴＣ標識抗Ｖα２４抗体Ｃ１５（イムノテック社製）、ＰＥ標識抗Ｖβ１１抗体Ｃ２１（イムノアック社製）をそれぞれ用いた。Ｔ細胞（ヘルパー／インデューサーＴ細胞）の解析にはＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ２９抗体、ＮＫ細胞の解析にはＰＥ抗ＣＤ１６抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ５７抗体（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いた。
抗ヒトＣＤ３抗体としてＵＣＴＨ−１（ＢＤバイオサイエンス社製）、抗ヒトＣＤ１６１抗体として１９１．Ｂ８（イムノテック社製）を用いた。ＮＫＴ（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋）細胞、Ｖα２４＋Ｖβ１１−細胞のフローサイトメトリ解析のためにＦＩＴＣ標識抗Ｖα２４抗体Ｃ１５（イムノテック社製）、ＰＥ標識抗Ｖβ１１抗体Ｃ２１（イムノアック社製）をそれぞれ用いた。Ｔ細胞（ヘルパー／インデューサーＴ細胞）の解析にはＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ２９抗体、ＮＫ細胞の解析にはＰＥ抗ＣＤ１６抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ５７抗体（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いた。
（固相化培養容器の作製）
予め、底部内表面積が７５ｃｍ２と２２５ｃｍ２のフラスコに抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ１６１抗体で固相化処理を施して固相化フラスコを作製した。
固相化処理は、１μｇ／ｍｌに調整した抗ＣＤ３抗体をフラスコに注入し、２４時間室温にて静置した後、余分な抗体をリン酸緩衝液で洗い流すことにより行なった。次に、１０μｇ／ｍｌになるように調整した抗ＣＤ１６１抗体をフラスコに注入し、さらに２４時間室温にて静置した後、５℃の冷蔵庫に保存し、使用時に余分な抗体をリン酸緩衝液で洗い流して使用した。
予め、底部内表面積が７５ｃｍ２と２２５ｃｍ２のフラスコに抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ１６１抗体で固相化処理を施して固相化フラスコを作製した。
固相化処理は、１μｇ／ｍｌに調整した抗ＣＤ３抗体をフラスコに注入し、２４時間室温にて静置した後、余分な抗体をリン酸緩衝液で洗い流すことにより行なった。次に、１０μｇ／ｍｌになるように調整した抗ＣＤ１６１抗体をフラスコに注入し、さらに２４時間室温にて静置した後、５℃の冷蔵庫に保存し、使用時に余分な抗体をリン酸緩衝液で洗い流して使用した。
（実施例１）
前述の１５名のがん患者のリンパ球混合物を用い、これらのサンプルを細胞数１×１０７〜１．５×１０７／ｍｌ（１０００〜１５００万個／ｍｌ）になるように調整した後、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含むリンパ球培養液５０ｍｌに浮遊させ、７５ｃｍ２のフラスコにて４〜５日間培養した（初期培養）。二次培養は、４〜５日後に２２５ｃｍ２のフラスコに細胞を移し２００ｍｌの培養液中で１〜２日間培養した。初期培養及び二次培養には抗ＣＤ３抗体ＵＣＴＨ−１、抗ＣＤ１６１抗体１９１．Ｂ８を用いて固相化したフラスコを使用した。培養は全期間を通じ５％ＣＯ２、３７℃でのインキュベータ内で行なった。
前述の１５名のがん患者のリンパ球混合物を用い、これらのサンプルを細胞数１×１０７〜１．５×１０７／ｍｌ（１０００〜１５００万個／ｍｌ）になるように調整した後、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含むリンパ球培養液５０ｍｌに浮遊させ、７５ｃｍ２のフラスコにて４〜５日間培養した（初期培養）。二次培養は、４〜５日後に２２５ｃｍ２のフラスコに細胞を移し２００ｍｌの培養液中で１〜２日間培養した。初期培養及び二次培養には抗ＣＤ３抗体ＵＣＴＨ−１、抗ＣＤ１６１抗体１９１．Ｂ８を用いて固相化したフラスコを使用した。培養は全期間を通じ５％ＣＯ２、３７℃でのインキュベータ内で行なった。
更に、肺がんの患者（Ａ）、胃がんの患者（Ｂ）、肝臓がんの患者（Ｃ）について、培養開始時と培養開始後６日目における上清液中のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の濃度を測定した。結果を図１に示す。図中、サンプルＡ〜Ｃそれぞれの左グラフ（白い部分）は培養開始時のＩＦＮ−γの濃度を示し、右のグラフ（黒い部分）は培養開始後６日目のＩＦＮ−γの濃度を示す。
図１から明らかなように、ＩＦＮ−γの濃度が培養開始時の濃度に比べ１８００〜２４００倍となり、ＮＫＴ細胞の増殖及び活性化によるＩＦＮ−γの産生が確認された。
図１から明らかなように、ＩＦＮ−γの濃度が培養開始時の濃度に比べ１８００〜２４００倍となり、ＮＫＴ細胞の増殖及び活性化によるＩＦＮ−γの産生が確認された。
（実施例２）
実施例１と同一の条件にて４〜６日間初期培養及び二次培養を実施し、その後、培養途中のリンパ球混合物が含有されているリンパ球培養液を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ１６１抗体で固定化されていない１７５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含有する１０００ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０を基盤にした培養液に移して、培養液合計１２００ｍｌで培養を継続し、初期培養から合計１４日間の培養を行った。
また、培養開始後４日、６日、１４日目の細胞増殖率を、培養開始時（０倍）と比較して表１に示す。
実施例１と同一の条件にて４〜６日間初期培養及び二次培養を実施し、その後、培養途中のリンパ球混合物が含有されているリンパ球培養液を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ１６１抗体で固定化されていない１７５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含有する１０００ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０を基盤にした培養液に移して、培養液合計１２００ｍｌで培養を継続し、初期培養から合計１４日間の培養を行った。
また、培養開始後４日、６日、１４日目の細胞増殖率を、培養開始時（０倍）と比較して表１に示す。
表１から明らかなように、固相化された抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体と、固相化された抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体と、リンパ球培養液とによって培養されたリンパ球混合物は、ＮＫＴ細胞、Ｖα２４＋Ｖβ１１−細胞、ＮＫ細胞及びリンパ球の数が略同時に活性化及び増殖していることが判る。
（治療実施例）
以下、治療実施例について説明する。
（がん患者）
がん患者１５名（肺がん５名、肝臓がん４名、結腸がん２名、胃がん１名、悪性リンパ腫１名、乳がん１名、前立腺がん１名、病期：ステージ（Ｓｔａｇｅ）ＩＩ〜ＩＶ）について、本発明のがん免疫療法用細胞（免疫療法用細胞医薬）の効果を検討した。
以下、治療実施例について説明する。
（がん患者）
がん患者１５名（肺がん５名、肝臓がん４名、結腸がん２名、胃がん１名、悪性リンパ腫１名、乳がん１名、前立腺がん１名、病期：ステージ（Ｓｔａｇｅ）ＩＩ〜ＩＶ）について、本発明のがん免疫療法用細胞（免疫療法用細胞医薬）の効果を検討した。
（免疫療法用細胞医薬の製造）
がん患者から採血後、上記の方法で１４日間培養したリンパ球混合物を培養容器から取り出し、２５０ｍｌの滅菌燐酸緩衝液（ＰＢＳ）により２回遠心及び洗浄した。その後、総細胞数・ＮＫ細胞数・リンパ球細胞数、又は、総細胞数・ＮＫＴ細胞数・ＮＫ細胞数・リンパ球細胞数をそれぞれ算定し、培養細胞を１００ｍｌの生理食塩液に浮遊させてテルモ分離バッグ（テルモ社製、テルフレックスＴ−０２０）に移し輸液用の薬液とした。
輸液用細胞薬液中のそれぞれの細胞数の分布を表２、表３に示す。なお、表中の細胞数の単位は、億個である。
がん患者から採血後、上記の方法で１４日間培養したリンパ球混合物を培養容器から取り出し、２５０ｍｌの滅菌燐酸緩衝液（ＰＢＳ）により２回遠心及び洗浄した。その後、総細胞数・ＮＫ細胞数・リンパ球細胞数、又は、総細胞数・ＮＫＴ細胞数・ＮＫ細胞数・リンパ球細胞数をそれぞれ算定し、培養細胞を１００ｍｌの生理食塩液に浮遊させてテルモ分離バッグ（テルモ社製、テルフレックスＴ−０２０）に移し輸液用の薬液とした。
輸液用細胞薬液中のそれぞれの細胞数の分布を表２、表３に示す。なお、表中の細胞数の単位は、億個である。
（免疫療法用細胞医薬の投与方法）
治療は、１００ｍｌの生理食塩液に浮遊させたＮＫ細胞及びリンパ球、若しくは、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、リンパ球を静脈に点滴注射によって行なった。点滴注射を行う静脈は特に限定しない。点滴の時間は１５〜３０分が好適である。
治療は、１００ｍｌの生理食塩液に浮遊させたＮＫ細胞及びリンパ球、若しくは、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、リンパ球を静脈に点滴注射によって行なった。点滴注射を行う静脈は特に限定しない。点滴の時間は１５〜３０分が好適である。
（治療の日程）
採血後、２週間隔で約３ケ月かけ６回の治療を行なった。次回培養のための採血は、それぞれ２週間おきに点滴治療の前に採血した。
採血後、２週間隔で約３ケ月かけ６回の治療を行なった。次回培養のための採血は、それぞれ２週間おきに点滴治療の前に採血した。
（治療効果の判定）
６回治療終了後、３〜４週間後にＣＴ、ＭＲＩの撮影、腫瘍マーカー値の測定、ＮＫＴ細胞数などの細胞数の測定、血液及び生化学一般検査などを行い総合的に患者の状態を判定した。
６回治療終了後、３〜４週間後にＣＴ、ＭＲＩの撮影、腫瘍マーカー値の測定、ＮＫＴ細胞数などの細胞数の測定、血液及び生化学一般検査などを行い総合的に患者の状態を判定した。
（治療効果の判定基準）
治療効果の判定はＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４段階とし、以下の判定方法で行なった。
Ａ：腫瘍が消失または２５％以上縮小した。腫瘍マーカーが下がった。再発または転移の兆しがない。
Ｂ：腫瘍の大きさ及び転移の状況も不変。腫瘍マーカーが下降あるいは横ばい。生活の質（ＱＯＬ）が治療前より改善された。
Ｃ：腫瘍が少しずつ増大し、腫瘍マーカーも少しずつ上昇しているが、緩やかな進行であると思われる。
Ｄ：この治療に関係なく、腫瘍が２０％以上増大し、腫瘍マーカーが著しく上昇した。生活の質が低下した。
がん患者１５名の治療成績を表４に示す。
治療効果の判定はＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４段階とし、以下の判定方法で行なった。
Ａ：腫瘍が消失または２５％以上縮小した。腫瘍マーカーが下がった。再発または転移の兆しがない。
Ｂ：腫瘍の大きさ及び転移の状況も不変。腫瘍マーカーが下降あるいは横ばい。生活の質（ＱＯＬ）が治療前より改善された。
Ｃ：腫瘍が少しずつ増大し、腫瘍マーカーも少しずつ上昇しているが、緩やかな進行であると思われる。
Ｄ：この治療に関係なく、腫瘍が２０％以上増大し、腫瘍マーカーが著しく上昇した。生活の質が低下した。
がん患者１５名の治療成績を表４に示す。
腫瘍マーカー値の↑は上昇を、↓は下降を、→は変化なしを示す。
表４から明らかなように、本発明のがん免疫療法用細胞を用いて、がん患者の治療を行なった結果、１５名のがん患者中１３名のがん患者について、病状の改善が見られた。
このように、本発明は、固相化された抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体と、固相化された抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体と、リンパ球培地とによってリンパ球混合物を培養するため、固相化された抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体及び固相化された抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体の組み合わせによりＮＫＴ細胞を活性化及び増殖することができ、また、抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体によって、リンパ球混合物中のリンパ球のみを活性化及び増殖することができ、更に、抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体によって、ＮＫ細胞を活性化及び増殖することができるので、ＮＫ細胞及びリンパ球の２種類の細胞を略同時に、若しくは、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞及びリンパ球の３種類の細胞を略同時に、しかも容易に活性化及び増殖することができる。
また、本発明のがん免疫療法用細胞は、強力な抗腫瘍作用、抗アレルギー作用、自己免疫疾患抑制作用及び臓器移植後の拒絶反応抑制作用を有するＮＫＴ細胞（Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞）が、ＮＫ細胞及びリンパ球と略同時に増殖及び活性化されるので、リンパ球あるいはＮＫ細胞のみを用いた医薬組成物の免疫療法に比べて更に効果的である。
また、リンパ球混合物が、末梢血から分離した末梢血リンパ球の集合物なので、採血が容易で患者に苦痛を与えることがほとんどなく、末梢血かリンパ球混合物を分離する際に煩雑な手間がかからず、更に、血液を冷蔵保存で輸送できる。
また、固相化された抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体及び固相化された抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体の存在下で、リンパ球培地にリンパ球混合物を加えて培養した後、リンパ球混合物を含んだリンパ球培地を、非固相化抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体及び非固相化抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体の存在下で、別のリンパ球培地に加えるので、細胞への過剰な刺激を与えることで生じる細胞死を抑えることができる。
A 肺がんの患者
B 胃がんの患者
C 肝臓がんの患者
B 胃がんの患者
C 肝臓がんの患者
Claims (5)
- 固相化された抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体及び固相化された抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体の存在下で、リンパ球培地に、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びリンパ球の２種類の細胞を含有するリンパ球混合物を加えて、前記２種類の細胞を、顆粒球コロ二一刺激因子の非存在下で略同時に共培養し共培養し活性化及び増殖させたことを特徴とするがん免疫療法用細胞の製造方法。
- 固相化された抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体及び固相化された抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体の存在下で、リンパ球培地に、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞，ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びリンパ球の３種類の細胞を含有するリンパ球混合物を加えて、前記３種類の細胞を、顆粒球コロ二一刺激因子の非存在下で略同時に共培養し活性化及び増殖させたことを特徴とするがん免疫療法用細胞の製造方法。
- 前記リンパ球混合物が、末梢血から分離した末梢血リンパ球の集合物である請求項１又は２に記載のがん免疫療法用細胞の製造方法。
- 前記リンパ球培地が、１０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン―２を含有する請求項１又は２に記載のがん免疫療法用細胞の製造方法。
- 固相化された抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体及び固相化された抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体の存在下で、リンパ球培地に前記リンパ球混合物を加えて培養した後、該リンパ球混合物を含んだリンパ球培地を、非固相化抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体及び非固相化抗ヒトＣＤ１６１モノクローナル抗体の存在下で、別のリンパ球培地に加える請求項１又は２に記載のがん免疫療法用細胞の製造方法。
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