JP5016732B1

JP5016732B1 - 癌発症抑制剤、抗体産生能増強剤及び肝炎治療剤

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Publication number: JP5016732B1
Application number: JP2011537767A
Authority: JP
Inventors: 純一益山; 実彦藤田
Original assignee: Cellex Corp
Current assignee: Cellex Corp
Priority date: 2011-03-02
Filing date: 2011-03-02
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2031-03-02
Also published as: US20140023682A1; WO2012117532A1; CN103429248A; US9339537B2; JPWO2012117532A1

Abstract

本発明は、癌発症抑制剤、抗体産生能増強剤及び肝炎治療剤を提供することを課題とした。
NK細胞を投与することにより健常人の癌の発症を抑制し、またNK細胞とワクチンを患者に投与することにより、抗体産生能が増強することを見出して、本発明を完成した。
【選択図】図７

Description

本発明は、有効成分としてナチュラルキラー（以下、NK）細胞を含む癌発症抑制剤、有効成分としてNK細胞を含む抗体産生能増強剤、有効成分であるNK細胞と有効成分である肝炎ワクチンを組み合わせた肝炎治療剤、NK細胞を投与する工程を含む癌発症抑制方法、NK細胞及びワクチンを投与する工程を含む抗体産生能増強方法、並びに、NK細胞及び肝炎ワクチンを投与する工程を含む肝炎治療方法に関する。

（癌予防について）
癌が主要な死因となってから、癌治療のための薬剤の開発だけでなく、癌発症のリスク因子と抑制因子を明らかにし、それらの因子を排除または摂取することで癌予防に役立てる動きが活発になっている。代表的な癌発生のリスク因子として、喫煙など生活習慣、肝炎ウイルス（肝癌）、パルボウイルス（子宮頸癌）、ヘリコバクターピロリ（胃癌）等の持続感染が知られている。該リスク因子を排除することで結果的に癌予防に役立っている例として、B型肝炎ウイルスとパルボウイルス感染阻止のための予防ワクチン療法がある。

一方、抑制因子に関しては、食品について大規模な疫学調査が行われている。また、薬剤では、大腸癌に対し非ステロイド性抗炎症薬、乳癌に対し選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ：Selective Estrogen Modulator）が癌発症リスクを軽減することが報告されている。
これらの食品や薬剤による癌予防のメカニズムとして、癌細胞の増殖抑制、アポトーシス誘導、ホルモン受容体への修飾、あるいは癌細胞の免疫感受性の上昇などが推定されている。
これらの癌予防の考え方は、正常細胞から癌細胞への変異や癌細胞の増殖・転移といった、癌細胞側の因子をいかに抑制するかという視点に立っている。一方、癌発生に対抗する生体側の因子、すなわち腫瘍免疫学的な見地から、以下に述べるように、免疫監視能力を強化することで癌発症を抑制させることも理論的に可能である。

（免疫システムについて）
２０世紀半ばに、Burnetはマウスを用いた実験から、免疫システムが前癌細胞（precancerous）を見つけ、さらに排除することで癌への進行を阻止し、固体の恒常性を維持する免疫監視機構の存在を提唱した。その後、遺伝子改変マウスモデルの開発によって、免疫監視機構の存在が確かなものであることが証明され、Dunnらによるimmunoediting説によって、発癌と免疫システムまでの複雑な関連と過程が整理された（非特許文献１：Nat.Immunl. 2002;3:991）。

Immunoediting説によると、発癌までの過程を、elimination→equilibrium,→escapeの3段階に分け、特に最初のeliminationは免疫監視説とほぼ同義であり、初期の癌細胞がまだ大きな集団を形成する前に排除される過程である。この過程の前半では、自然免疫細胞である、NK細胞、NKT細胞、γδT細胞、マクロファージ、樹状細胞がそれぞれ協力して働き、腫瘍細胞を排除する。後半では、樹状細胞が癌抗原をT細胞に提示し、癌抗原特異的ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞のクローンが産生され、獲得免疫が自然免疫だけでは排除できなかった癌細胞を排除するように働く。
次のequilibrium段階では、正常な免疫機能を保持した生体でも免疫原性の低い癌細胞の選択が進行し、最終的に癌細胞に免疫抵抗性が獲得され、癌細胞の増殖が徐々に起こる。
3番目のescapeは、免疫システムがもはや癌細胞を認識できずに癌組織の急速な増大を招き、臨床的に癌が把握される段階である。
Equilibriumから先に進むほど癌の進行を抑制することは難しくなるので、癌発症の抑制のためには最初のeliminationの段階で確実に癌細胞を排除することが肝要である。しかし、加齢、ストレスなどによって、自然免疫細胞、獲得免疫細胞の機能が低下し、癌細胞の排除能力が十分に働かなくなる。例えば、加齢によってNK細胞の細胞傷害活性やインターフェロンγ産生能も減弱するが、一方１００歳以上の超長命者の免疫能力を見ると、自然免疫系のNK細胞とNKT細胞の機能が高く維持されていることが報告されている（非特許文献２：J.Clin.Immunol. 2009；29:416）。

（癌発症抑制手段）
現在のところ、癌発症抑制手段として報告されているのは、すべて癌細胞に直接働いてその進展を抑制する、食品、サプリメント（セレニウム、ビタミンなど）、抗炎症薬、ＳＥＲＭ（選択的エストロゲン調節薬）に限られ、必ずしもその抑制効果は高くはない。また、加齢などによるワクチン効果減弱への対処は、ワクチンアジュバントやワクチンの１回投与量や投与回数を増やすことに留まっている。

（肝炎について）
Ｂ型肝炎ウイルスに感染している慢性肝炎患者は全世界に３億６千万人おり、肝硬変、肝癌の予備群として大きな問題となっている。予防に使用するＢ型肝炎ワクチンをＢ型慢性肝炎の「治療」ワクチンとして、ウイルス増殖阻害剤との併用で試みられたが、満足な臨床的改善は見られていない（非特許文献３：Vaccine 2007;25:8585、非特許文献４：Hepat. Res. Treat. 2010;2010:817580）。
さらに、新しいＤＮＡワクチン（非特許文献５：Gene Ther. 2006;13:1110）や免疫複合体ワクチン（非特許文献６：PLoS One 2008;3:e2565）の臨床試験のように「治療」ワクチン療法の開発も模索されている。
しかしながら、通常のＨＢワクチンを投与しても抗体価が上昇しない、又は極めて上昇しにくい集団（例えば、60歳以上の男性）が存在していることが問題となっている。
加えて、肝炎の治療では、一般にインターフェロンを使用している。しかし、患者によって治療効果が異なり、新たな治療方法の確立が必要とされている。

（抗体産生増強剤について）
抗体産生増強剤に関する報告がされている。
特許文献１は、「茶多糖類を有効成分とする抗体産生誘導剤」を開示している。
特許文献２は、「卵白を含有することを特徴とするワクチンの抗体産生能増強剤」を開示している。
しかしながら、上記文献では、「NK細胞を含む抗体産生増強剤」については開示又は示唆がない。さらに、NK細胞は抗体産生能を抑制するという報告が多数されている（非特許文献７：Cell. Immunol. 1995;161:42）。すなわち、従来の知見では、NK細胞は抗体産生能を抑制するということが一般的であった。

特開2006-340698 特開平5-124972

Nat.Immunl. 2002;3:991 J.Clin.Immunol. 2009;29:416 Vaccine 2007;25:8585 Hepat. Res. Treat. 2010;2010:817580 Gene Ther. 2006;13:1110 PLoS One 2008;3:e2565 Cell. Immunol. 1995;161:42

癌細胞のelimination過程では、NK細胞、NKT細胞、γδT細胞、マクロファージ、樹状細胞、T細胞のさまざまな免疫細胞が参画するが、癌細胞排除にどの免疫細胞が主要なのか不明である。
そこで、本発明者らは、「該主要な免疫担当細胞が判明すれば、その機能を人為的に高めることにより、免疫監視能力が向上し、elimination過程を再強化させることができ、さらにこの再強化を行うことで、強化しない場合と比較し、最終的に癌発症の低下が期待される」と考えた。
さらに、本発明者らは、「先に述べたワクチン療法においても、癌発症と同じく加齢によって、NK細胞、樹状細胞の機能低下、ナイーヴT細胞、B細胞の減少は外来抗原に対する免疫反応能力が低下すること、事実、Ｂ型肝炎ワクチンにおいては、一部の健常者、ＨＩＶ陽性患者、透析患者、アルコール中毒患者で抗体が誘導されず、無・低反応性が指摘されている」という知見を基にして、このような無・低反応性は最終的に慢性肝炎、肝癌のリスクが高まると考えた。
さらに、本発明者は、「無・低反応性の原因となっている免疫反応能力の低下を再び高めることによって、ワクチン効果が誘導され、最終的には癌、特に肝癌の予防が可能となる」と考えた。
そこで、本発明者は、上記知見を基にして、癌発症抑制剤、抗体産生能増強剤及び肝炎治療剤を提供することを課題とした。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、NK細胞を投与することにより癌の発症を抑制し、さらにはNK細胞とワクチンを患者に投与することにより、抗体産生能が増強することを見出して、本発明を完成した。

つまり、本発明は、以下の通りである。
「１．有効成分であるNK細胞を含む健常人用癌発症抑制剤。
２．前記NK細胞が活性化NK細胞である前項１に記載の健常人用癌発症抑制剤。
３．活性化NK細胞を健常人に投与することを特徴とする健常人の癌発症抑制方法。
４．前記活性化NK細胞は、前記健常者由来のNK細胞である前項３に記載の癌発症抑制方法。
５．有効成分であるNK細胞を含むワクチンの抗体産生能増強剤。
６．前記ワクチンが肝炎ワクチンである前項５に記載の抗体産生能増強剤。
７．前記肝炎ワクチンがB型肝炎ワクチンである前項６に記載の抗体産生能増強剤。
８．前記NK細胞は活性化NK細胞である前項５〜７のいずれか１に記載の抗体産生能増強剤。
９．有効成分であるNK細胞と有効成分である肝炎ワクチンを組み合わせたことを特徴とする肝炎治療剤。
１０．前記肝炎ワクチンがB型肝炎ワクチンである前項９に記載の肝炎治療剤。
１１．有効成分であるNK細胞を含むワクチンの抗体産生能増強剤、及び肝炎ワクチンを含む肝炎治療用キット。
１２．前記肝炎ワクチンがB型肝炎ワクチンである前項１１に記載の肝炎治療用キット。
１３．以下の工程（１）（２）又は（１）'（２）'を含む患者のワクチンの抗体産生能増強方法。
（１）活性化NK細胞を患者に投与する工程
（２）ワクチンを該患者に投与する工程
（１）' ワクチンを患者に投与する工程
（２）' 活性化NK細胞を該患者に投与する工程
１４．前記活性化NK細胞は、前記患者由来のNK細胞である前項１３に記載の抗体産生能増強方法。
１５．前記ワクチンが肝炎ワクチンである前項１３又は１４に記載の抗体産生能増強方法。
１６．前記肝炎ワクチンがB型肝炎ワクチンである前項１５に記載の抗体産生能増強方法。
１７．以下の工程（１）（２）又は（１）'（２）'を含む肝炎治療方法。
（１）活性化NK細胞を患者に投与する工程
（２）ワクチンを該患者に投与する工程
（１）' ワクチンを患者に投与する工程
（２）' 活性化NK細胞を該患者に投与する工程
１８．前記活性化NK細胞は、前記患者由来のNK細胞である前項１７に記載の抗体産生能増強方法。
１９．前記肝炎がB型肝炎である前項１７又は１８に記載の肝炎治療方法。」

本発明の癌発症抑制剤及び癌発症抑制方法により、健常人の癌の発症を抑制した。さらに、本発明の抗体産生能増強剤及び抗体産生能増強法方法により、ワクチン単独では抗体価が上昇しにくい症例に対しても抗体価を上昇させることができた。

投与したNK細胞数の測定結果（実施例２）投与リンパ球亜群の解析結果（実施例２） NK細胞投与群と非投与群の年齢のプロファイル（実施例２） NK細胞投与群と非投与群のNK細胞凍結保存期間（実施例２） NK細胞投与群の各健常人のプロファイル（実施例２）非投与群の各健常人のプロファイル（実施例２） NK細胞投与群と非投与群の癌発症率の結果（実施例２）各種の癌発症抑制率の結果（実施例２） NK細胞投与群とＴリンパ球投与群で投与したNK細胞数の比較（実施例３）活性化NK細胞投与によるＨＢｓワクチン効果増強結果（実施例３）活性化Ｔ細胞投与によるＨＢｓワクチン効果増強結果（実施例３）

発明を実施するための形態１

（NK細胞）
本発明で使用するNK細胞は、自体公知の方法で取得したいかなるNK細胞も利用することができる。しかし、活性化NK細胞を使用することが好ましい。
なお、NK細胞の提供者（ドナー）とNK細胞の被提供者（レシーピエント）は、同種であることが好ましい。例えば、ドナーがヒトの場合には、レシーピエントはヒトである。
また、NK細胞の提供者とNK細胞の被提供者は、同一個体であることがより好ましい。例えば、ドナーが提供者Ｘの場合には、レシーピエントは提供者Ｘである。

（NK細胞の取得方法）
本発明で使用するNK細胞は、自体公知の方法で取得することができる（参照：表１）。NK細胞は、末梢血、リンパ節、胸腺、骨髄、腫瘍、胸水、腹水又は臍帯血から採取された単核球、より好ましくは末梢血単核球から誘導して取得する。
例えば、末梢血から比重遠心法により、NK細胞を含む単核球を回収することができる。また、例えば、NK細胞上に特異的に発現する細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、セルソーター、パニング、抗体磁気ビーズ法などによりNK細胞を単離することができる。

（NK細胞の活性化方法）
本発明のNK細胞活性化方法では、Ｔ細胞及びNK細胞を含む単核球にＣＤ３アゴニスト及びＣＤ５２アゴニストによる刺激を与えることにより、NK細胞をＴ細胞よりも活性化させることができ、NK細胞をＫ５６２等と混合させることなく安全に且つ簡単に増殖することができる。特に、Ｔ細胞及びNK細胞を含む単核球にＣＤ３アゴニストとＣＤ５２アゴニストによる刺激を、ＩＬ−２存在下で行うことにより、ＩＬ−２単独刺激に比べ、NK細胞をＴ細胞よりも増殖させることができる。また、本発明のNK細胞活性化方法を用いればNK細胞を１０００倍以上にも増殖させることができる（参照：特開2005-124568）。

（健常人用癌発症抑制剤）
本発明の健常人用癌発症抑制剤は、少なくとも有効成分であるNK細胞、好ましくは活性化NK細胞を含み、より好ましくは活性化NK細胞が全細胞中で最も多く含む。
また、本発明の癌発症抑制剤は、NK細胞以外の細胞、例えばNKT細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、γδT細胞など免疫細胞を含有することができる。加えて、本発明の癌発症抑制剤は、NK細胞を任意の他の治療のための有効成分との混合物としても含有することができる。
本発明の癌発症抑制剤は、有効量の有効成分を薬理学的に許容される一種若しくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。薬理学的に許容される担体は種々の物質が知られており、それらから適宜選択して使用されるが、緩衝液や、各種塩、血清、アルブミン、アミノ酸などの添加物を例示できる。
なお、本発明で意味する「健常人」とは、各種の検査・診断により癌と診断されていない哺乳類を意味し、癌以外の疾患を有する哺乳類も含む。さらに、癌細胞・腫瘍の大きさにより、現時点では治療が不要な哺乳類も含む。

本発明の健常人用癌発症抑制剤は、通常は、注射剤や点滴剤などの剤型で提供される。本発明の健常人用癌発症抑制剤は、好ましくは、受容者の体液（血液など）と等張な滅菌水性担体中に活性化NK細胞が懸濁された懸濁液である。該水性担体としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などを挙げることができる。これらの水性担体には、更に、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、安定化剤などを添加することもできる。
本発明の健常人用癌発症抑制剤中に含まれるNK細胞及び／又は活性化されたNK細胞の濃度は、通常、約１×１０^５〜１×１０^１１個／ｍｌ、好ましくは約１×１０^６〜１×１０^１０個／ｍｌの範囲であるが、特に限定されない。細胞濃度が低すぎると、投与に時間がかかるため患者への負担が増大し、細胞濃度が高すぎると、細胞同士が凝集してしまう可能性がある。

（癌発症抑制方法）
本発明の癌発症抑制方法は、NK細胞、好ましくは活性化NK細胞を健常人に投与する。なお、必ずしも該NK細胞は、該健常人由来のNK細胞である必要がない。しかしながら、好ましくは、少なくとも以下の工程を含む。
（１）健常人から取得したNK細胞を増殖・活性化させる工程
（２）該活性化したNK細胞を該健常人に投与する工程
また、NK細胞は、注射、点滴等により人体の血管に投与することが好ましい。
NK細胞又は活性化処理したNK細胞の投与は１回の投与当たり１０^２〜１０^１２個を投与し、年に１〜１２回これを繰り返すが、好ましくは１〜２回投与を行う。
より詳しくは、NK細胞又は活性化処理したNK細胞の投与量は、投与形態、患者の年齢、体重等により異なるが、通常、１回の投与につき、活性化されたNK細胞の数として、通常１×１０^７〜１×１０^１１個、好ましくは１×１０^８〜１×１０^１０個の用量で投与される。

（ワクチンの抗体産生能増強剤）
本発明のワクチンの抗体産生能増強剤は、少なくとも有効成分であるNK細胞、好ましくは活性化NK細胞を含み、より好ましくは活性化NK細胞が全細胞中で最も多く含む。
また、本発明のワクチンの抗体産生能増強剤は、NK細胞以外の細胞、例えば、NKT細胞、T細胞、樹状細胞、γδT細胞など免疫細胞を含むことができる。加えて、本発明のワクチンの抗体産生能増強剤は、NK細胞を任意の他の治療のための有効成分との混合物としても含有することができる。
本発明のワクチンの抗体産生能増強剤は、有効量の有効成分を薬理学的に許容される一種若しくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。薬理学的に許容される担体は種々の物質が知られており、それらから適宜選択して使用されるが、緩衝液や、各種塩、血清、アルブミン、アミノ酸などの添加物を例示できる。

（ワクチンの抗体産生能増強方法）
本発明のワクチンの抗体産生能増強方法は、NK細胞（好ましくは活性化NK細胞）、ワクチンを患者に投与する。なお、必ずしも該NK細胞は、該患者由来のNK細胞である必要がない。
しかしながら、好ましくは、少なくとも以下の工程を含む。なお、下記（１）と（２）の工程は順番を変更することもできる。
（１）患者から取得した活性化NK細胞を該患者に投与する工程
（２）ワクチンを該患者に投与する工程

（ワクチン）
本発明の増強剤が使用できる「ワクチン」としては特に限定されるものではなく、生ワクチン、不活性化ワクチン、ペプチドワクチン、プラスミドＤＮＡワクチン、抗原抗体複合体ワクチン等に使用できる。ワクチンは、自体公知の市販のワクチンを使用することができる。
本発明の増強剤は、好ましくは、肝炎ワクチン、より好ましくは、B型肝炎ワクチンに使用する。

（肝炎治療剤）
本発明の肝炎治療剤は、少なくとも、有効成分であるNK細胞と有効成分である肝炎ワクチンを組み合わせた肝炎治療剤である。
なお、本発明の治療剤は、有効成分であるNK細胞と有効成分である肝炎ワクチンを、同時又は別々に、患者に投与できる形態となっている。

（肝炎治療用キット）
本発明の肝炎治療用キットは、少なくとも、有効成分であるNK細胞を含むワクチンの抗体産生能増強剤、並びに肝炎ワクチンを含む。
本発明のキットは、抗体産生能増強剤と肝炎ワクチンを、同時又は別々に、患者に投与できる形態となっている。

（肝炎治療方法）
本発明の肝炎治療方法は、NK細胞（好ましくは活性化NK細胞）、肝炎ワクチンを患者に投与する。なお、必ずしも該NK細胞は、該患者由来のNK細胞である必要がない。
しかしながら、好ましくは、少なくとも以下の工程を含む。なお、下記（１）と（２）の工程は順番を変更することもできる。
（１）肝炎患者から取得した活性化NK細胞を該患者に投与する工程
（２）肝炎ワクチンを該患者に投与する工程

（抗体産生能増強剤、肝炎治療剤の形態）
本発明の抗体産生能増強剤、肝炎治療剤の形態は、生体内に経口投与される緩衝水剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等からなる薬剤に含有されて用いられてもよく、皮下注射、筋肉注射、静脈注射等により生体内に非経口投与される注射剤、点滴剤、座剤等からなる薬剤に含有されて用いられてもよい。
本発明の抗体産生能増強剤、肝炎治療剤は、凍結乾燥されていてもよく、治療効果上許容される担体、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、賦形等の種々の添加物と共に薬剤に含有されて用いられてもよい。
本発明の抗体産生能増強剤、肝炎治療剤の投与法及び投与量は、前臨床試験や臨床試験の過程との関連において適宜決定される。本発明の抗体産生能増強剤、肝炎治療剤を経口投与する場合には、投与量は、通常、成人に対して１日当たり約0.01mg〜約1000mg（含まれるNK細胞及び／又は活性化されたNK細胞の濃度は、通常、約１×１０^５〜１×１０^１１個／ｍｌ、好ましくは約１×１０^６〜１．０×１０^１０個／ｍｌの範囲である）であり、斯かる経口投与を１回又は数回に分けて行う。また、本発明の抗体産生能増強剤、肝炎治療剤を非経口投与する場合には、投与量は、通常、成人に対して１回当たり約0.01mg〜約1000mg（含まれるNK細胞及び／又は活性化されたNK細胞の濃度は、通常、約１×１０^５〜１×１０^１１個／ｍｌ、好ましくは約１×１０^６〜１×１０^１０個／ｍｌの範囲である）である。
なお、経口投与又は非経口投与による医薬組成物の投与量は、年齢、体重及び病気の症状に応じて決定される。

（対象）
本発明の癌発症抑制剤、抗体産生能増強剤、肝炎治療剤、癌発症抑制方法、抗体産生能増強方法、並びに肝炎治療方法の対象は、ヒトを含む哺乳類を対象とする。例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ（特に、競馬用ウマ）、ブタ等が例示される。

以下に本発明を実施例により具体的に説明する。なお、これらの実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。

（NK細胞の培養・増殖）
以下の工程により、自己末梢血リンパ球の培養・増殖を行うことにより、活性化NK細胞の培養・増殖を行った。
（工程１）
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）２０mlに対し、オルソクローンＯＫＴ３：０．１μl／ml（抗ＣＤ３抗体，ヤンセンファーマより入手）及びMABCAMPATH：２０〜４０μl／ml（抗ＣＤ５２抗体、バイエルより入手可）の溶液を作成した。
（工程２）
工程１の溶液を、それぞれ別の２２５cm^２のフラスコに分注し、４℃で一晩静置させた。
（工程３）
工程２のフラスコをＰＢＳで２回洗浄した。
（工程４）
健常人からヘパリン加末梢血３０mlを採取し、Ficoll-Paque Plus(Amersham Pharmacia Biotech株式会社より入手)を媒体として用いた密度勾配遠心法により、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。
（工程５）
ＩＬ−２（５００単位／ml、Chiron社）を含むＮＫＧＭ培地（コージンバイオ株式会社より入手）に、工程４で分離したＰＢＭＣを０．５〜１×１０^６／mlの濃度で浮遊させ、さらに患者血漿２〜１０％を加えて培養液とした。この段階で培養液は６０〜１２０ｍｌになった。この培養液を、工程３で得た固相化抗体処理した培養フラスコに添加した。その後、５％ＣＯ_２培養器内３７℃の環境下で培養した。
（工程６）
培養開始から３〜５日目に、多数のコロニーが作られ、芽球化（blast化）したことを確認して、培養液を２０〜１００％追加し、さらにＩＬ−２を５００単位／ml添加した。通常この時期は培養開始してから３日目であった。
（工程７）
工程６で培養液を追加してから対数増殖期に入った１〜３日目（多くは１日目）に、活性化リンパ球を含んだ培養液を、ＮＫＧＭ−B（１リットル入りバッグ）に注入した。さらに、これを２〜３バッグに分注した。分注後３〜４日間隔で１バッグあたり、ＮＫＧＭ培地を１００〜３００ｍｌ、及び、ＩＬ−２を１０〜２０万単位、添加した。
（工程８）
培養開始１４〜２１日目に、バッグから培養液を遠心管に移し、これを６００Ｇで１０分遠心した。遠心管からペレットを残して上清を吸引した後、ペレットにＰＢＳを加え洗浄し、再び遠心操作をおこなった。この作業を２〜３回繰り返し、培養リンパ球をよく洗浄した。最後に、ペレットを集め、生理的食塩水１００mlに浮遊させ、これにヒト血清アルブミン２〜４％添加した。最後に、無菌テスト、エンドトキシンテストが陰性であることを確認した。
（凍結保存と解凍）
培養開始後、３〜７日で培養細胞を洗浄し、保存液であるKMバンカー（コージンバイオ）とともに凍結用チューブにいれ、液体窒素タンク内で−１９０℃以下に保って保存した。解凍後は、IL-2添加NKGM培養液で１０〜１４日間培養した。

（培養液中の活性化リンパ球の解析結果）
上記培養・増殖したNK細胞表面には、ＣＸＣＲ３ケモカイン受容体、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＲＡＩＬ、特異的な活性化受容体ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６の発現が見られた。加えて、培養NK細胞には、持続的ＩＦＮγ産生があり、少なくとも３週間の培養まで、Ｋ５６２を標的した細胞傷害活性が高く維持されることが確認された。
以上により、溶液中には活性化したNK細胞が高濃度で存在していることを確認した。

（活性化NK細胞の投与による癌発症抑制の確認）
健常人から得られた活性化NK細胞を含む培養リンパ球を該健常人に投与した。そして、該投与された健常人と非投与健常人の癌発症率を確認した。詳細は、以下の通りである。

（NK細胞の投与）
実施例１の培養リンパ球を解凍し、IL-2添加NKGM培養液で１０〜１４日間培養後これを洗浄し、１００ｍｌの生理的食塩水に浮遊させ健常人の静脈から点滴投与した。
１回あたり投与した培養自己リンパ球数は、１０．７×１０^９個であった（参照：図１）。加えて、投与したリンパ球のうち、CD3-CD56+NK細胞またはCD56+リンパ球をもっとも多く含んでいた（図２）。
なお、投与の詳細は以下の通りでる。

（健常人のNK細胞投与群と非投与群）
健常人一人につき１０回分またはそれ以上の投与ができるNK細胞の凍結保存を２００６年から開始した。２０１１年まで最低１３ヶ月以上保存した103例を対象とした。このうち本人の希望により保存期間中に１回以上投与した「投与群」は53例（男31例、女22例）、投与を希望しなかった「非投与群」は50例（男25例、女25例）であった。投与群は合計242回投与し、１人あたりの投与回数は、１回〜57回で、中央値は3回であった。癌発症までの期間は保存開始から癌発症までの月数とした。

（投与群と非投与群のプロファイル）
両群全例のプロファイルである年齢（図３）及び保存期間（図４）には統計的有意差はなかった。投与群と非投与群はその母集団に差がないことから、両群の比較でNK細胞投与による癌発症抑制を統計的に示すことできることがわかった。

（投与群の癌発症抑制の効果の確認）
保存期間中に癌と診断されたのは、「投与群」で１例、「非投与群」で７例であった（表２、図５及び図６）。その保存期間を横軸にとった発症率曲線からログランク検定を行った（図７）。結果は両群の癌発症率に有意差を認め、その相対危険度(Relative Risk)は0.24で、投与することで癌発症が76％抑制された。

（NK細胞投与による癌発症抑制と他の癌予防法との比較）
既報の癌予防法である、セレニウム（BJU Int. 2003;91:608）、コーヒー（Nutr. Cancer 2010;62:21）、緑茶（Am.J.Epidemiol. 2008;167:71）、タモキシフェン（Lancet 2003;361:296）、ラロキシフェン（JAMA. 1999;281:2189）、アスピリン（J.Natl.Cancer Inst. 2009;101:256）と本発明の癌発症抑制効果を示した（表３、図８）。本発明の癌発症抑制効果は、他と比べて優れた効果を示した。

（活性化NK細胞投与による抗体価上昇の確認）
健常人５名（Ａ〜Ｅ）由来の活性化NK細胞、さらにはＨＢワクチンを、それぞれ自身に１〜３回投与して、抗体価の上昇を確認した。
コントロールとして、健常者（Ｆ〜Ｈ）由来の「NK細胞を大量増殖していない活性化Ｔリンパ球」、さらにはＨＢワクチンを、それぞれ自身に投与した、抗体価の上昇を確認した。
なお、NK細胞を大量増殖していない活性化Ｔリンパ球の培養・増殖方法は以下の通りである。

（活性化Ｔリンパ球の培養・増殖方法）
以下の工程により、自己活性化Ｔリンパ球を得るため、末梢血リンパ球の培養・増殖を行った。
（工程１）
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）２０mlに対し、活性化Ｔ細胞の培養では、抗ＣＤ３抗体５μl／ml（オルソクローンＯＫＴ３，ヤンセンファーマより入手）の溶液を作成した。
（工程２）
工程１の溶液を、それぞれ別の２２５cm^２のフラスコに分注し、４℃で一晩静置させた。
（工程３）
工程２のフラスコをＰＢＳで２回洗浄した。
（工程４）
健常人（F〜H）からヘパリン加末梢血３０mlを採取し、Ficoll-Paque Plus(Amersham Pharmacia Biotech株式会社より入手可能)を媒体として用いた密度勾配遠心法により、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。
（工程５）
ＩＬ−２（５００単位／ml、Chiron社）を含むＮＫＧＭ培地（コージンバイオ株式会社より入手）に、工程４で分離したＰＢＭＣを０．５〜１×１０^６／mlの濃度で浮遊させ、さらに患者血漿２〜１０％を加えて培養液とした。この段階で培養液は６０〜１２０ｍｌになった。この培養液を、工程３の固相化抗体処理した培養フラスコに添加した。その後、５％ＣＯ_２培養器内３７℃の環境下で培養した。
（工程６）
培養開始から３〜５日目に、多数のコロニーが作られ、芽球化（blast化）したことを確認したところで、培養液をさらに２０〜１００％追加し、ＩＬ−２を５００単位／ml添加した。通常この時期は培養開始してから３日目であった。
（工程７）
工程６で培養液を追加してから対数増殖期に入った１〜３日目に（多くは１日目）、活性化リンパ球を含んだ培養液を、ＮＫＧＭ−B（１リットル入りバッグ）に注入した。通常、これを２〜３バッグに分注した。分注後３〜４日間隔で１バッグあたり、ＮＫＧＭ培地を１００〜３００ｍｌ、及び、ＩＬ−２を１０〜２０万単位、添加した。
（工程８）
培養開始１４〜２１日目に、バッグから培養液を遠心管に移し、これを６００Ｇで１０分遠心した。遠心管からペレットを残して上清を吸引した後、ペレットにＰＢＳを加え洗浄し、再び遠心操作をおこなった。この作業を２〜３回繰り返し、培養リンパ球をよく洗浄した。最後に、ペレットを集め、生理的食塩水１００mlに浮遊させ、これにヒト血清アルブミン２〜４％添加した。最後に、無菌テスト、エンドトキシンテストが陰性であることを確認した。

（培養活性化NK細胞若しくはＴ細胞投与並びにＢ型肝炎ワクチンの投与手順）
NK細胞投与群は、健常人５名（Ａ〜Ｅ）に自身の培養活性化NK細胞を肘静脈から投与し、その３日後に遺伝子組み換えＨＢワクチン0.5ｍｌ（ビームゲン、化血研）を筋注した。ワクチン投与４週後にＨＢｓ抗体価を調べた。この組み合わせで、１回目のあと６週後に２回目、６ヵ月後に３回目をおこなった。なお、ＡとＣは１回の投与で終了した。
なお、コントロールとして、Ｔリンパ球投与群は、健常人３名（Ｆ〜Ｈ）に「NK細胞を大量に含まない培養活性化Ｔリンパ球」を各自に静脈注射し、さらにＨＢワクチンを自身に投与した。投与の間隔はNK投与群と同じである。

（NK細胞数の測定）
実施例１で得られたNK細胞を含む培養リンパ球（生理的食塩水に浮遊させている）及び上記生理的食塩水に浮遊させたリンパ球をエッペンドルフチューブに取り、これに所定の標識抗体を加え、定法により細胞を染色した。染色した細胞はただちにフローサイトメトリーで解析し、ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋NK細胞数を測定した。

（NK細胞数の測定結果）
実施例１で得られたNK細胞を含む培養リンパ球及び上記生理的食塩水に浮遊させたリンパ球中のNK細胞数の平均値を図９に示す。
図９は各例の投与NK細胞数の平均値をプロットしたものである。投与NK細胞数は、NK細胞投与群（Ａ〜Ｅ）では平均４．８×１０^９個であり、一方、Ｔリンパ球投与群（Ｆ〜Ｈ）では平均０．５×１０^９個であった。これにより、NK細胞投与群は、Ｔリンパ球投与群と比較して約１０倍のNK細胞が投与された。

（HBs抗体価の測定方法）
上記投与前後の健常者Ａ〜Ｈから取得した血中のHBs抗体価を自体公知のCLIA法（chemiluminescent immunoassay）を使用して測定した。この方法の正常値は10.0ｍＩＵ/ｍｌ未満である。

（HBs抗体価の測定結果）
健常者Ａ〜Ｈから取得した血中のHBs抗体価を図１０と図１１に示す。５例中４例（80%：Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄの４名）において、有意に高い抗体価を誘導することができた（参照：図１０）。
一方、コントロールである活性化Ｔリンパ球（投与NK細胞が１億個未満である）とB型肝炎ワクチンの投与では、抗体価の明らかな上昇は見られなかった（参照：図１１）。
以上により、NK細胞及びB型肝炎ワクチンを投与することにより、抗体価を上昇させることができた。特に、健常者Ａ〜Ｄは、抗体価が上昇しにくい60歳以上の男性であることも考慮すると、本発明は非常に優れた抗体価上昇効果を示した。

（総論）
上記実施例３の結果により、NK細胞、さらに肝炎ワクチンを患者に投与すれば、肝炎を治療することができると考えられる。

本発明では、新たな癌発症抑制剤及び抗体産生能増強剤の提供を可能とした。

Claims

有効成分であるNK細胞を含むB型肝炎ワクチンの抗体産生能増強剤であって、投与対象が60歳以上であることを特徴とする抗体産生能増強剤。
前記投与対象が男性である請求項１に記載の抗体産生能増強剤。
前記NK細胞は活性化NK細胞である請求項１又は２のいずれか１に記載の抗体産生能増強剤。
癌患者のB型肝炎ワクチンである請求項１〜３のいずれか１に記載の抗体産生能増強剤。