JP2011001315A

JP2011001315A - 膵臓癌の免疫療法剤

Info

Publication number: JP2011001315A
Application number: JP2009146739A
Authority: JP
Inventors: Junichi Masuyama; 純一益山
Original assignee: Cellex Corp
Current assignee: Cellex Corp
Priority date: 2009-06-19
Filing date: 2009-06-19
Publication date: 2011-01-06
Also published as: US20120093792A1; CN102083448A; WO2010146634A1; US8613916B2

Abstract

【課題】膵臓癌患者の生存期間を延長させる免疫療法剤を提供する。
【解決手段】膵臓癌患者の自己末梢血リンパ球を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ５２抗体により刺激することにより培養して得た免疫療法剤であって、膵臓癌患者に対して少なくとも４回投与され、１回あたりの投与量に含まれる活性化リンパ球の数が少なくとも１５×１０^９個であって活性化リンパ球のうちＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の比率が少なくとも３０％であり、かつ、特定の複数の免疫低下状態のうち、少なくとも一つの状態にある膵臓癌患者に対して投与が開始されることを特徴とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、膵臓癌患者のための免疫療法剤に関し、特に患者自身の末梢血リンパ球から培養された活性化リンパ球を主成分とし、活性化リンパ球の中に高比率のＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を含む免疫療法剤に関する。

種々の癌に対する免疫療法は、公知である。特に、養子免疫療法では、患者自身の末梢血リンパ球を抗体で刺激し培養・増殖させることによりリンパ球を活性化させる。その後、活性化されたリンパ球を、いわば免疫療法剤として当該患者に投与する。活性化リンパ球は、免疫応答機能を有している。活性化リンパ球の中には、腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を有するＴ細胞やＮＫ(natural killer)細胞が含まれている。

ＮＫ細胞は、ヒトの末梢血リンパ球に１０〜２０％含まれる大型顆粒リンパ球である。活性化されたＮＫ細胞は、腫瘍細胞やウイルス感染細胞等に対して非特異的な細胞傷害活性あるいは抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を有する。非特異的なＮＫ細胞は、Ｔ細胞やＢ細胞のように抗原による感作を必要しない。従って、ＮＫ細胞は、癌組織に誘導されると直ちに分子特異的に腫瘍細胞を攻撃する。活性化されたＮＫ細胞の表面には、腫瘍細胞を標的とすることができるＮＫＧ２Ｄ、ＴＲＡＩＬ (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand)などの表面レセプターが発現する。

特許文献１〜４は、末梢血リンパ球に含まれる種々の細胞を選択的に増殖させる培養方法を開示している。特許文献１〜３は、比較的高い割合でＮＫ細胞を増殖させる方法に関し、特許文献４は、ＮＫ細胞の割合は極少ないかほとんどない方法に関するである。

特許第３０５６２３０号公報特開２００２−４５１７４号公報特開２００６−３４０６９８号公報特許第３９５１３５０号公報

Heinemann V, et al. BMC Cancer 2008, 8:82 Tanaka T, et al Jpn J Clin Oncol 2008, 38:755 Okusaka T, et al. Cancer Chemother Pharmacol 2008, 61:615 Strumberg D, et al. 2009 Gastrointestinal Cancers Symposium, Abstract #195 Nakamura K, et al. Br J Cancer 2006, 94:1575 Ueno H, et al. 2007 ASCO, Abstract #4550 Lee G, et al. 2008 ASCO, Abstract #15577 Kim MY, et al. Jpn J Clin Oncol 2009, 39:49

特許文献１は、培養された活性化リンパ球を用いた免疫療法が３症例記載されている。その対象は、悪性メラノーマ又は肝臓癌である。特許文献２では、培養時に用いる増殖刺激用抗体を用いて腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を測定しているが、実際の癌患者への適用例は記載されていない。また、種々の癌に対する免疫療法として、ＮＫ細胞を主体としたリンパ球を用いる方法以外にも、Ｔ細胞などを主体としたリンパ球を用いる方法（特許文献４）などがある。

しかしながら、膵臓癌に対して有効な免疫療法剤は、未だ提示されていない。膵臓癌は、膵臓の構造に起因して、臓器の上皮細胞に発生した癌が臓器外部に浸潤し易く、かつ、全身に転移し易い癌である。そのため、膵臓癌と診断された時点で既に進行癌となっていることが多い。その結果、胃癌や大腸癌などに比べて、切除可能なのは２割前後と少なく、手術後の生存率も低い。因みに、非特許文献１〜８では、膵臓癌患者に対して抗癌剤のみの治療を行った場合の診断後１年間の生存率が報告されている。それらの生存率は、５４％である非特許文献５を除いて、ほとんどが１５〜３３％の範囲内にあり、膵臓癌は予後のきわめて悪い代表的癌腫である。

このように、膵臓癌は極めて進行が速いため、膵臓以外の臓器の癌に対して有効な免疫療法剤であっても、膵臓癌に対しても有効であるとは云えない。本発明の目的は、膵臓癌に対して効果的な免疫療法剤を提供することである。

本発明による膵臓癌の免疫療法に用いる免疫療法剤は、以下の構成を有する。
本発明の免疫療法剤は、膵臓癌患者の自己末梢血リンパ球を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ５２抗体により刺激することにより培養して得た免疫療法剤である。この免疫療法剤は、膵臓癌患者に対して少なくとも４回投与され、１回あたりの投与量に含まれる活性化リンパ球の数が少なくとも１５×１０^９個であって前記活性化リンパ球のうちＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の比率が少なくとも３０％であり、かつ、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる免疫低下状態の群のうち、少なくとも一つの状態にある前記膵臓癌患者に対して投与が開始されることを特徴とする。
（ａ）末梢血中のリンパ球の数が１０００／μl未満である。
（ｂ）末梢血中のリンパ球のうちＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の数が２００／μl未満である。
（ｃ）末梢血中のＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の活性が３０％未満である。
（ｄ）末梢血中のＮＫＧ２Ｄ^＋リンパ球の数が４００／μl未満である。

さらに、末梢血中のＣＤ４^＋リンパ球とＣＤ８^＋リンパ球との比が３を超える膵臓癌患者に対して投与されることが、好適である。
また、投与されるリンパ球の残余部分が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞のうちいずれか又は双方であることが好適である。
また、本発明の免疫療法剤は、抗癌剤と併用されることが好適である。

発明者は、特許文献３において、末梢血３０ml前後からＣＤ１６^＋ＮＫ細胞を大量増殖させる培養技術を提示した。ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞は、ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞と同じである。本発明の免疫療法剤は、この培養技術に基づいた大量培養方法により得た活性化リンパ球を主成分とする。この活性化リンパ球は、通常の末梢血リンパ球に比べて高比率の活性化ＮＫ細胞すなわちＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を含む。

手術の有無に関わらず膵臓癌の患者の多くは、抗癌剤による治療を施される。従来の抗癌剤のみを用いた治療開始後１年間の生存率（以下、"１年生存率"という）は、ほとんどが１５〜３３％の範囲であった（非特許文献１〜８）。これに対し、本発明の免疫療法剤による治療を施した２７症例からなる実施例においては、６３％という高い１年生存率が得られた。これは、進行の速い膵臓癌においては、画期的な結果である。これらの実施例中、療法開始後生存期間をみると、抗癌剤を併用したものについては、免疫療法剤のみの場合よりもさらに良好な結果が得られた。

本発明は、高比率の活性化ＮＫ細胞を含む免疫療法剤を、特定の投与量及び特定の対象患者（特定の免疫低下状態にある膵臓癌患者）に適用することにより、その生存率を大幅に向上させることを実現した。実現された生存率の高さは、膵臓癌において従来から予測される範囲を超えた顕著なものである。

ここで、患者の自己末梢血を培養して得られる活性化リンパ球の数及びその中に含まれるＮＫ細胞の比率は、個人差が非常に大きいという問題がある。また、活性化リンパ球の数及びＮＫ細胞の比率が同じであっても、その効果には個人差が大きいという問題もある。従って、個々人において確実に効果が得られるような投与条件の明確な境界値を示すことは、困難である。

発明者は、個人単位ではなく患者の集団において、統計的に高い確率で良好な結果を得られる免疫療法剤の投与条件及び患者の免疫状態条件を設定することが、有効であることを見出した。本発明の免疫療法剤の特徴である投与条件及び患者の免疫状態条件は、統計的に高い確率で、膵臓癌の診断後の全生存期間を大幅に延長させることができる指標としての意義がある。

本発明では、投与条件及び患者の免疫状態条件を、２７症例からなる実施例の中央値に基づいて特定した。上記の１年生存率６３％は、全実施例から得られた効果であるから、全実施例の中央値以上の免疫療法剤を投与すれば、さらに高い１年生存率が統計的に得られると期待できる。また、全実施例の中には抗癌剤を併用せずに本発明の免疫療法剤のみを適用した症例も含まれていた。従って、抗癌剤を必ず併用すれば、さらに高い１年生存率が統計的に得ることができると期待される。少なくとも１年生存率６３％の実現は、確保されるといえる。

この意味で、後述する本発明の"実施例"の概念は、一般的な実施例の概念とは若干異なる。一般的には、実施例とは、特許請求の範囲の要件に該当する症例である。しかしながら、本発明では、"実施例"の中央値に基づいて特許請求の範囲の要件を設定した。その結果、本発明の"実施例"には、必ずしも特許請求の範囲の要件に該当しない症例も含まれている。それらの症例は、参考例というべきかも知れないが、中央値を決定するためには必要な症例であった。よって、本発明の"実施例"とは、特許請求の範囲の要件を設定するために実施された全症例を称している。

進行の速い膵臓癌の癌組織に対して、また免疫機能の低下した生体に対しては、大きい免疫的なインパクトを与えることが必要である。発明者は、免疫療法において、一度にできるだけ大量の活性化リンパ球を投与すること、投与されるリンパ球がＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を少なくとも３０％含むこと、かつ少なくとも４回投与されること、が有効であることを見出した。免疫療法剤の１回あたりの投与量に含まれる効果的なリンパ球の数は、少なくとも１５×１０^９個である。これは、従来の免疫療法において、一般的に投与されていた活性化リンパ球の数の３倍以上に相当する。

投与開始前の膵臓癌患者が、健常者よりも低い免疫状態にある場合に、免疫状態の大幅な改善が見られた。低い免疫状態とは、
（ａ）末梢血中のリンパ球の数が１０００／μl未満である状態、
（ｂ）末梢血中のリンパ球のうちＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の数が２００／μl未満である状態、
（ｃ）末梢血中のＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の活性が３０％未満である状態、
（ｄ）末梢血中のＮＫＧ２Ｄ^＋リンパ球の数が４００／μl未満である状態、のうち少なくとも１つに該当する場合である。患者の末梢血を採血してこれらの免疫状態を測定することにより、本発明の免疫療法の開始時期、すなわち免疫療法剤の投与開始時期の判定が可能となる。

特に、患者の免疫状態の低下が、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの範囲の境界値に到達した時点で、治療を開始することが最も好ましい。患者の免疫状態が健常者と同程度に維持されている場合は、免疫療法剤の投与に起因する免疫的なインパクトは少ないと考えられる（但し、元々免疫状態が良好に維持されていることに起因して、結果的に生存期間が長期となる割合は多くなる）。一方、患者の全身状態の悪化に伴い免疫状態が境界値よりも大きく低下している場合は、免疫療法剤の開始が既に遅すぎることが多いと考えられる。

また、末梢血中のＣＤ４^＋リンパ球とＣＤ８^＋リンパ球の比が３を超えることも、免疫低下状態の判断の指標の一つである。

さらに、投与されるリンパ球の残余部分が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞のうちいずれか又は双方であることにより、ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞との相乗的な改善効果が得られる。細胞傷害活性をもつＮＫＧ２Ｄ^＋リンパ球には、ＮＫ細胞の他に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の一部も含まれるからである。

本発明の免疫療法剤である活性化リンパ球のフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。表７の投与リンパ球数を、実施例及び好適例についてそれぞれプロットしたグラフである。表７のＮＫ細胞比率を、実施例及び好適例についてそれぞれプロットしたグラフである表６の比較例（健常者）の末梢血リンパ球数、並びに、表８の実施例（膵臓癌患者全体）及び好適例（長期生存者）の末梢血リンパ球数を、それぞれプロットしたグラフである。表６の比較例（健常者）のＮＫ細胞数、並びに、表８の実施例（膵臓癌患者全体）及び好適例（長期生存者）のＮＫ細胞数を、それぞれプロットしたグラフである。表６の比較例（健常者）のＮＫ活性、並びに、表８の実施例（膵臓癌患者全体）及び好適例（長期生存者）のＮＫ活性を、それぞれプロットしたグラフである。表６の比較例（健常者）のＮＫＧ２Ｄ^＋細胞数、並びに、表９の実施例（膵臓癌患者全体）及び好適例（長期生存者）のＮＫＧ２Ｄ^＋細胞数を、それぞれプロットしたグラフである。表６の比較例（健常者）のＣＤ４／ＣＤ８比、並びに、表９の実施例（膵臓癌患者全体）及び好適例（長期生存者）のＣＤ４／ＣＤ８比を、それぞれプロットしたグラフである。

本発明の免疫療法剤は、膵臓癌患者自身の末梢血リンパ球を培養増殖して得た活性化リンパ球を主成分として含む。以下、免疫療法剤に含まれる活性化リンパ球を、単に「リンパ球」と称する場合がある。活性化リンパ球の中には、活性化ＮＫ細胞が含まれている。本発明の免疫療法剤に含まれる活性化ＮＫ細胞は、ＣＤ３⁻及びＣＤ５６^＋の表面マーカーにより識別される。膵臓癌患者から採取した末梢血リンパ球に対して、特許文献３に記載された培養増殖方法を適用することにより、ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を高比率で得ることができる。

図１は、本発明の免疫療法剤の一実施例におけるフローサイトメトリーの測定結果を示している。横軸ＦＬ１−Ｈは表面マーカーＣＤ３の、縦軸ＦＬ２−Ｈは表面マーカーＣＤ５６の蛍光強度をそれぞれ示している。円で囲んだ部分がＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の存在を示している。この測定結果では、活性化リンパ球が約４５％のＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を含んでいる。末梢血リンパ球の培養後の活性化リンパ球に含まれるＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞比率には、大きな個人差があり、後述する実施例では、１０〜７０％の範囲に分散した。各患者における培養後のＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞比率は、当該患者の培養前のＮＫ細胞比率よりも高くなった。

図１のフローサイトメトリーにおける中央下側のもう一つの点群は、活性化Ｔ細胞を示している。活性化Ｔ細胞は、主としてＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞からなる。

本発明の免疫療法剤は、膵臓癌の診断後に単独で適用することも可能であるが、抗癌剤と併用することにより、より大きな効果が得られる。

１回あたりの投与量に含まれるリンパ球の数は、少なくとも１５×１０^９個とすることが好ましい。これは、通常の免疫療法で投与される細胞数の３倍以上に相当する。後述する実施例における最高値は、約１８×１０^９個程度であった。投与される活性化リンパ球には、ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞が少なくとも３０％含まれていることが好ましい。投与回数は、少なくとも４回が効果的である。

さらに、本発明の免疫療法剤は、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる免疫低下状態の群うち、少なくとも一つの状態にある膵臓癌患者に対して投与されることが好適である。
（ａ）末梢血中のリンパ球の数が１０００／μl未満である。
（ｂ）末梢血中のリンパ球のうちＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の数が２００／μl未満である。
（ｃ）末梢血中のＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の活性が３０％未満である。
（ｄ）末梢血中のＮＫＧ２Ｄ^＋リンパ球の数が４００／μl未満である。

後述する実施例において、上記（ａ）〜（ｄ）の免疫低下状態が、健常者に比べて有意に免疫機能の低い状態といえることを確認した。免疫低下状態にある患者に対して、大量のＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を一度に投与することにより、低下した免疫機能に大きなインパクトを与えることができた。

後述する２７症例からなる実施例における１年生存率は、６３％であった。この１年生存率６３％は、従来の膵臓癌の１年生存率よりも格段に良好な結果である。本発明の免疫療法剤における１回あたりの投与量に含まれるリンパ球数及びＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞比率は、全実施例おける中央値に基づいてそれぞれ設定された。従って、これらの中央値を最低値として本発明の免疫療法剤を投与することにより、全実施例における結果である６３％よりも、さらに高い１年生存率が得られると期待される。なお、中央値は、元々は測定値であるから有効数字を考慮すべきであるが、本発明では、より高い生存率を得るための指標として中央値を採用したので、実際には、その有効数字に関係なく概算的な数値を設定した。

さらに、末梢血中のＣＤ４^＋Ｔ細胞とＣＤ８^＋Ｔ細胞の比が３を超える患者に対して投与されることが、好適である。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の減少もまた、免疫低下状態の指標の一つである。よって、膵臓癌患者では、健常者に比べてＣＤ４^＋Ｔ細胞とＣＤ８^＋Ｔ細胞の比の数値が大きい傾向がある。

免疫療法剤の投与後における長期生存者（療法開始後１０か月以上生存）では、投与の前後において、末梢血中のＮＫＧ２Ｄ^＋リンパ球の数の著しい増加が見られた。さらに、末梢血中のリンパ球数の増加、ＮＫ細胞数の増加、ＮＫ活性の増大、及び、ＣＤ４／ＣＤ８比の低下、も見られた。短期生存者（療法開始後５か月以内死亡）では、投与の前後においてこれらのパラメータに有意差が無かった。この事実から、免疫療法剤の投与によって免疫低下状態から急速に免疫機能が増強されることが、生存期間の延長に繋がることが推察される。

末期状態の患者を除いて、免疫療法剤の投与による免疫機能の急速な増強は、個人差が大きい。従って、個々人において確実に効果が得られるような投与条件及び患者の免疫状態条件の明確な境界値を示すことは困難である。しかしながら、上記の投与条件及び患者免疫状態条件に従って免疫療法剤を投与すれば、統計的・確率的には、６３％よりも高い１年生存率が得られると期待される。上記の投与条件は、１年生存率６３％を示した実施例の集団における中央値に基づくからである。

（１）リンパ球の培養増殖方法
以下の工程により、膵臓癌患者の自己末梢血リンパ球の培養増殖を行った。
・工程１：リン酸緩衝液（ＰＢＳ）２０mlに対し、抗ＣＤ３抗体（０．１μl／ml、オルソクローンＯＫＴ３、ヤンセンファーマ株式会社より入手可能）及び抗ＣＤ５２抗体（２０〜４０μl／ml、MABCAMPATH、バイエル社より入手可能）を溶解させた。
・工程２：工程１の溶液を、２２５cm^２のフラスコに入れ、４℃で一晩静置させた。
・工程３：固相化した抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ５２抗体を、ＰＢＳで２回洗浄した。
・工程４：膵臓癌患者からヘパリン加末梢血３０mlを採取し、Ficoll-Paque Plus(Amersham Pharmacia Biotech株式会社より入手可能)を媒体として用いた密度勾配遠心法により、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。
・工程５：ＩＬ−２（５００単位／ml、Chiron社）を含むＫＢＭ−ＮＫＣＧＭ−１（コージンバイオ株式会社より入手可能）に、工程４で分離したＰＢＭＣを０．５〜１×１０^６／mlの濃度で浮遊させ、さらに患者血漿２〜１０％を加えて培養液とした。この段階で培養液は６０〜１２０ｍｌになる。この培養液を、工程３で得た固相化抗体を処理した培養フラスコに添加した。その後、５％ＣＯ^２培養器内３７℃の環境下で培養した。なお、血漿は健常者から得られた血清で代替してもよい。
・工程６：培養開始から３〜５日目に、多数のコロニーが作られ、芽球化（blast化）したことを確認したところで、培養液をさらに２０〜１００％追加し、ＩＬ−２を５００単位／ml添加した。通常この時期は培養開始してから３日目である。
・工程７：工程６で培養液を追加してから対数増殖期に入った１〜３日目に（多くは１日目）、活性化リンパ球を含んだ培養液を、ＫＢＭ−ＮＫＣＧＭ−１Ｂ（１リットル入りバッグ）に注入した。通常、これを２〜３バッグに分注した。分注後３〜４日間隔で１バッグあたり、ＫＢＭ−ＮＫＣＧＭ−１を１００〜３００ｍｌ、及び、ＩＬ−２を１０〜２０万単位、添加した。
・工程８：培養開始１４〜２１日目（２２日以上は、活性が低下することが多いため）に、バッグから培養液を遠心管に移し、これを６００Ｇで１０分遠心した。遠心管からペレットを残して上清を吸引した後、ペレットにＰＢＳを加え洗浄し、再び遠心操作をおこなった。この作業を２〜３回繰り返し、培養リンパ球をよく洗浄した。最後に、ペレットを集め、生理的食塩水１００mlに浮遊させ、これにヒト血清アルブミン２〜４％添加した。最後に、無菌テスト、エンドトキシンテストが陰性であることを確認した。
（なお、得られたリンパ球浮遊液は、調整後４時間以内に、患者の末梢静脈より３０〜６０分間で投与した。）
・工程９（成分解析）：生理的食塩水に浮遊させたリンパ球は、所定の数の細胞をエッペンドルフチューブに取り、これに所定の標識抗体を加え、定法により細胞を染色した。染色した細胞はただちにフローサイトメトリーで解析し、ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の比率を求めた（図１参照）。

（２）培養増殖後の活性化リンパ球の特徴
培養増殖後の活性化リンパ球のフローサイトメトリーにより、次の結果が得られた。
活性化リンパ球に含まれるＮＫ細胞及びＴ細胞の細胞表面には、ＣＸＣＲ３ケモカイン受容体、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＲＡＩＬの高発現が見られた。ＮＫ細胞には、特異的な活性化受容体ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６の発現が見られた。また、癌患者で低下ないし陰性化するシグナル伝達分子ＣＤ３ζ鎖、ＤＡＰ１２、ＦｃεＲ１の再発現が見られた。また、ＮＫ細胞には、持続的ＩＦＮγ産生があり、少なくとも３週間の培養まで、細胞傷害活性（Ｋ５６２を標的にした定法による）が高く維持される。具体的には、２１日目の培養リンパ球からＮＫ細胞を純化し、この細胞傷害活性を測定すると、５０％ｌｙｓｉｓのＥ/Ｔｒａｔｉｏは１．０７と高活性であった（低い値ほど高活性であることを示す）。因みに、ＣＤ３抗体で培養した活性化Ｔリンパ球では７１．４５であった。

（３）膵臓癌患者への投与方法
上記のリンパ球の培養増殖方法における工程８の後、４時間以内に、生理的食塩水浮遊リンパ球を、患者の末梢静脈より３０〜６０分間で投与した。

（４）免疫療法剤による膵臓癌患者の治療結果
（４−１）全生存期間及び療法後生存期間の結果
表１の上欄は、本発明の免疫療法剤を投与した膵臓病患者（実施例）の全生存期間と１年生存率の結果を示す。膵臓癌の最初の診断後から２００９年４月時点までの全症例の診療記録に基づく。いずれも、４回以上の免疫療法剤の投与を行った。３回以下の投与の症例では、ＥＣＯＧＰＳ(Eastern Cooperative Oncology Group performance status、以下"ＰＳ"と省略)が３〜４で全身状態が悪く末期状態であったことから、免疫療法を始めて２ヶ月以内に死亡したため、実施例には含めなかった。実施例の２７症例のうち、２１症例が抗癌剤を併用した。６症例は、抗癌剤なしで本発明の免疫療法剤のみを用いた。

表１の下欄の比較例８件は、抗癌剤のみにより治療した膵臓病患者の全生存期間と１年生存率の結果を示す（非特許文献１〜８にそれぞれ記載）。比較例で用いられた抗癌剤は、塩酸ゲムシタビン（ＧＥＭ）又はＳ−１、あるいはその併用である。

表１に見られるように、実施例（２７症例）の全生存期間は、中央値が１４．０か月であり、１年生存率は６３％であった。これに対し、比較例ではその多くが１年生存率１５〜３３％の範囲内であり、最高値は５４％の１件のみであった。実施例２７症例のうち、"抗がん剤併用あり"、"膵臓切除なし"、"膵臓切除なしでかつＰＳが０〜１"、"ＰＳが２〜３"、及び"転移あり（ステージIVb）"の各サブグループについて、それぞれ全生存期間と１年生存率を算出したところ、いずれも比較例より良好な結果が得られた。この結果から、本発明の免疫療法剤を投与することにより、さらに好適には免疫療法剤と抗癌剤を併用することにより、抗癌剤単独の投与よりも全生存期間を延長させ１年生存率を高められることが実証された。

表２の（ａ）は、表１に示した実施例（２７症例）と、投与回数が３回以下の比較例（９症例）の詳細データを示す。表２の比較例のうち８症例は、免疫療法の開始時に既にＰＳ３〜４であり、末期状態であったため、投与回数が少ないうちに死亡した症例である。実施例の全生存期間は１４．０か月であり、免疫療法後生存期間は９．０か月であった。実施例の免疫療法後生存期間は、比較例のそれよりも明らかに長かった（有意差p=0.00001、Mann-Whitney検定）。

表２の（ｂ）は、（ａ）の実施例のうち、２００９年４月時点の生存者１２症例の詳細データである。１２症例中、１０症例に転移があるものの、全生存期間の中央値は１８．０か月であり、免疫療法後生存期間は平均１３．５か月である。これらの症例の中には、後述する免疫療法後生存期間が１０．０か月以上の患者（長期生存者）が含まれている。これらの長期生存者では、急速かつ大きな免疫機能の回復が見られた（後述）。

表３は、実施例（２７症例）について、免疫療法開始時のＰＳと、免疫療法後の生存期間をまとめた表である。ＰＳ０〜１の第１群とＰＳ２〜３の第２群に分けて比較している。”ＣＩ”は、信頼区間を示す。第１群と第２群は、全生存期間で中央値に差がみられるが、免疫療法後生存期間を含め、Mann-Whitney検定による有意差はなかった。ＰＳ２〜３は、ＰＳ０〜１に比べて全身状態は悪いが、後述するように抗癌剤との併用が可能であれば、ＰＳ０〜１とほぼ同等の効果が得られることが判明した。

表４は、実施例（２７症例）について、免疫療法開始時の抗癌剤使用状況と生存期間の関係を示す表である。
第１群は、"抗癌剤無し"又は"抗癌剤無効後"である。第２群は、"抗癌剤と免疫療法剤の同時併用"である。第１群と第２群では、全生存期間に差はなかったが、免疫療法後生存期間には、有意差（p<0.05、Welch法によるｔ検定）が認められた。このことは、本発明の免疫療法剤と抗癌剤の併用が相乗効果をもたらし、生存期間の延長に寄与することを示している。なお、第１群についても、表１の比較例の抗癌剤のみの場合に比べて、遙かに良好な結果となっており、免疫療法剤のみであっても十分な効果が得られた。

さらに、表４の第２群については、抗癌剤の種類別の生存期間を調べた。症例数が少ないために統計的検討はできなかったが、ＧＥＭ単独よりも、ＴＳ−１単独の方が全生存期間の中央値が長かった。さらに、ＴＳ−１単独よりもＧＥＭとＴＳ−１併用の方が全生存期間の中央値が長かった。

表５は、実施例（２７症例）と、長期生存者の詳細データをまとめた表である。長期生存者（LST:Long Survival Time）とは、実施例のうち、免疫療法開始後１０．０か月以上生存した１１症例をいう。長期生存者は、実施例の中で特に良好な結果が得られたという意味で、”好適例”と称することとする。（この”好適例”の意味は、結果のみに基づいており、実施条件は他の実施例と同様であるので、一般的な好適例の意味とは若干異なる。言い換えるならば、”参考好適例”である。）

表５に示されるように、実施例と好適例の間には、臨床的背景（進行度、ＰＳ、切除の有無、抗癌剤併用）における大きな差は認められなかった。このことは、好適例の患者が、それ以外の実施例の患者に比べて、臨床的に格別良好な状態にあったのではないことを意味する。すなわち、このことは、表１の本発明の実施例における全生存期間及び１年生存率の大幅な向上が、臨床状態の良好な患者に由来するものではないことを裏付けている。表１の本発明の実施例の良好な結果は、所定の投与条件及び所定の患者免疫状態の条件に従って免疫療法剤を投与するという本発明の構成により、もたらされたものである。

（４−２）実施例における免疫的変化の測定
＜測定方法＞
膵臓癌患者の実施例（２７症例）のうち、測定可能であった２４症例について、本発明の免疫療法剤の投与前後の免疫的変化を測定した。但し、一部の測定項目については、測定できない場合があった。
免疫療法剤による治療開始直前に末梢血を採血し、４回以上の免疫療法剤の投与による治療を行い、治療後の６か月以内に１〜２か月間隔で末梢血を採血した。

測定項目は、以下の通りである。
・毎回の投与リンパ球数
・毎回の投与リンパ球に含まれるＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞比率
・末梢血中のリンパ球数
・末梢血中のＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞数
・末梢血中のＮＫ活性
・末梢血中のＮＫＧ２Ｄ^＋リンパ球数
・末梢血中のＣＤ４／ＣＤ８比

投与リンパ球数及びそのＮＫ細胞比率、並びに、治療前後の末梢血リンパ球数、末梢血ＮＫ細胞数、末梢血ＮＫＧ２Ｄ^＋リンパ球数、及びＣＥＤ４／ＣＤ８比については、全血法を用い、蛍光標識により抗体染色し、フローサイトメトリーにより測定した。
ＮＫ活性については、^５１Ｃｒにより標識した腫瘍細胞Ｋ５６２に対する細胞傷害活性を測定する方法（ＳＲＬ社に外注）を用いた。
毎回の投与リンパ球数及びそのＮＫ細胞比率は、平均することにより、１回あたりの数値をそれぞれ算出した。
治療後の末梢血について複数回測定した場合は、治療開始直前の測定値に対して最も変化の大きかった値を比較対象とした。

正常対照として、年齢を合致させた健常者２４名（中央値年齢６１歳、範囲５３〜７２歳）についても、末梢血を採血し、実施例と同じ項目の測定を行った。それらの結果を、表６の比較例１〜２４とした。

＜比較例（健常者）の測定結果＞
表６は、比較例（健常者）１〜２４の末梢血の測定結果をまとめた表である。表６の各項目の測定値をプロットしたグラフは、後述する図４〜図８中にそれぞれ示している。

＜実施例（膵臓癌患者）の測定結果＞
・投与リンパ球数及びＮＫ細胞比率
表７は、実施例（膵臓癌患者）２７症例のうち、測定を行った２４症例について、１回あたりの投与リンパ球数、ＮＫ細胞率、全生存期間、及び療法開始後生存期間をまとめた表である。（実施例のうち初期の３症例については、免疫的測定ができなかった。）
表７中、番号を太枠で囲った実施例は、好適例（長期生存者）の１１症例である（以下の表においても同様）。

図２は、表７の投与リンパ球数を、実施例及び好適例についてそれぞれプロットしたグラフである。"Ｍ"は、中央値を示す（以下の図も同様）。
実施例全体の投与リンパ球数は、１０．４×１０^９〜１７．６×１０^９／回の範囲に分布し、中央値は、１４．８×１０^９／回である。自己末梢血の培養増殖により得られるリンパ球数は、個人のバラツキが大きいため、投与リンパ球数の好適な数値範囲を明確に特定することは困難である。しかしながら、表１及び表２で示した通り、実施例全体の１年生存率は６３％と、抗癌剤のみの治療に比べて高率であった。従って、少なくとも中央値の１４．８×１０^９／回すなわち約１５×１０^９／回のリンパ球を投与することにより、統計的には、１年生存率６３％を上回る効果が得られると推察される。よって、本発明の効果をほぼ確実に得るための投与リンパ球数の下限値として、全実施例の中央値を採用することとし、投与リンパ球数を少なくとも１５×１０^９／回と設定した。

図３は、表７のＮＫ細胞比率を、実施例及び好適例についてそれぞれプロットしたグラフである。実施例全体のＮＫ細胞比率は、１．９〜６９．９％と広範囲に分布し、中央値は、３１．８％すなわち約３０％である。投与リンパ球数と同様に、ＮＫ細胞比率も個人のバラツキが非常に大きい。従って、本発明の効果をほぼ確実に得るための好適なＮＫ細胞比率の下限値として、全実施例の中央値を採用することとし、ＮＫ細胞比率を少なくとも３０％と設定した。

なお、投与リンパ球数及びＮＫ細胞比率において、実施例全体と、そのサブグループである長期生存者との間には、有意差はなかった（Kruskal-Wallis検定）。このことは、投与リンパ球数及びＮＫ細胞比率の設定において、実施例全体の測定値を用いたことの妥当性を示している。

・末梢血中のリンパ球数
表８の左欄は、実施例（膵臓癌患者）２４症例の治療前後の末梢血リンパ球数の測定値である。
図４は、表６の比較例（健常者）の末梢血リンパ球数、並びに、表８の実施例（膵臓癌患者全体）及び好適例（長期生存者）の末梢血リンパ球数を、それぞれプロットしたグラフである。

免疫療法前の実施例は、比較例よりもリンパ球数が減少していた（有意差ｐ＜０．００１、Mann-Whitney検定）。免疫療法前の実施例の中央値は、１０００／μlであった。この臨床結果から得た中央値を、免疫療法の開始時を判断する指標の一つとして用いることができる。例えば、患者の末梢血リンパ球数が１０００／μl未満となったとき、免疫低下状態にあると判定して免疫療法を開始する。

免疫療法後の実施例のリンパ球数は、免疫療法前よりも上昇した（有意差ｐ＜０．０１、Wilcoxon検定）。免疫療法後の実施例は、比較例とほぼ同レベルとなった。

好適例では、免疫療法前のリンパ球数が比較的良好に保たれた症例が多く、免疫療法後はさらに上昇した（有意差ｐ＜０．０１、Wilcoxon検定）。好適例の１１症例中１０症例が１８００／μl以上であったが、比較例とは有意差はなかった。

・末梢血中のＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞数
表８の中央欄は実施例（膵臓癌患者）２４症例の治療前後のＮＫ細胞数の測定値である。
図５は、表６の比較例（健常者）のＮＫ細胞数、並びに、表８の実施例（膵臓癌患者全体）及び好適例（長期生存者）のＮＫ細胞数を、それぞれプロットしたグラフである。

免疫療法前の実施例は、比較例よりもＮＫ細胞数が減少していた（有意差ｐ＜０．００１、Mann-Whitney検定）。比較例のほとんどは２００〜４００／μlであった。これに対し、免疫療法前の実施例の中央値は１６９／μlすなわち約２００／μlであった。この臨床結果から得た中央値を、免疫療法の開始時を判断する指標の一つとして用いることができる。例えば、患者のＮＫ細胞数が２００／μl未満となったとき、免疫低下状態にあると判定して免疫療法を開始する。

免疫療法後の実施例のＮＫ細胞数は、免疫療法前よりも上昇した（有意差ｐ＜０．０１、Wilcoxon検定）。免疫療法後の実施例のうち８症例は、４００／μlを上回った。これら８症例中の５症例が、長期生存者であった。これは、急速な免疫機能の改善が生存期間の延長に寄与することを示している。

・末梢血中のＮＫ活性
表８の右欄は実施例（膵臓癌患者）２２症例の治療前後のＮＫ活性の測定値である。
図６は、表６の比較例（健常者）のＮＫ活性、並びに、表８の実施例（膵臓癌患者全体）及び好適例（長期生存者）のＮＫ活性を、それぞれプロットしたグラフである。

免疫療法前の実施例は、比較例よりもＮＫ活性が減少していた（有意差ｐ＜０．００１、Mann-Whitney検定）。免疫療法前の実施例の中央値は、２８％すなわち約３０％であった。この臨床結果から得た中央値を、免疫療法の開始時を判断する指標の一つとして用いることができる。例えば、患者のＮＫ活性が３０％未満となったとき、免疫低下状態にあると判定して免疫療法を開始する。

免疫療法後の実施例のＮＫ活性は、免疫療法前よりも上昇した（有意差ｐ＜０．０１、Wilcoxon検定）。中央値は、２８％から４３％へ上昇した。

・末梢血中のＮＫＧ２Ｄ^＋リンパ球数
表９の左欄は実施例（膵臓癌患者）２４症例の治療前後のＮＫＧ２Ｄ^＋細胞数の測定値である。ＮＫＧ２Ｄ^＋細胞には、全てのＮＫ細胞と、Ｔ細胞の一部が含まれる。
図７は、表６の比較例（健常者）のＮＫＧ２Ｄ^＋細胞数、並びに、表９の実施例（膵臓癌患者全体）及び好適例（長期生存者）のＮＫＧ２Ｄ^＋細胞数を、それぞれプロットしたグラフである。

免疫療法前の実施例は、比較例よりもＮＫＧ２Ｄ^＋細胞数が減少していた（有意差ｐ＜０．００１、Mann-Whitney検定）。免疫療法前の実施例の中央値は、４０３／μlすなわち約４００／μlであった。この臨床結果から得た中央値を、免疫療法の開始時を判断する指標の一つとして用いることができる。例えば、患者のＮＫＧ２Ｄ^＋細胞数が４００／μl未満となったとき、免疫低下状態にあると判定して免疫療法を開始する。

免疫療法後の実施例のＮＫＧ２Ｄ^＋細胞数は、免疫療法前よりも上昇した（有意差ｐ＜０．０１、Wilcoxon検定）。中央値は、４０３／μlから７８３／μlへ上昇した。ＮＫＧ２Ｄ^＋細胞の増加は、ＮＫ細胞のみの増加ではなく、Ｔ細胞の増加にもよる。長期生存者では、免疫療法の前後で中央値が約３倍となり、比較例よりも有意に高かった（ｐ＜０．０１、Mann-Whitney検定）。長期生存者１１症例中、９症例が８００／μｌ以上であった。ＮＫＧ２Ｄ^＋細胞数が８００／μｌ以上に増加することが、生存期間の延長に寄与することが示唆された。

・末梢血中のＣＤ４／ＣＤ８比
表９の右欄は実施例（膵臓癌患者）２４症例の治療前後のＣＤ４／ＣＤ８比の測定値である。癌患者では、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が健常者よりも低下する傾向があり、その結果、ＣＤ４／ＣＤ８比が健常者よりも小さくなる傾向がある。

図８は、表６の比較例（健常者）のＣＤ４／ＣＤ８比、並びに、表９の実施例（膵臓癌患者全体）及び好適例（長期生存者）のＣＤ４／ＣＤ８比を、それぞれプロットしたグラフである。

免疫療法前の実施例は、統計的には比較例との有意差はみられなかった（ns、Mann-Whitney検定）。しかしながら、個々の症例では、ＣＤ４／ＣＤ８比が健常者に比べて高くなる例が多かった。免疫療法前の実施例の中央値は、３．１すなわち約３であった。免疫療法の開始時を判断する指標の一つとして用いる場合は、ＣＤ４／ＣＤ８比が３を超える場合が目安となる。

免疫療法後の実施例のＣＤ４／ＣＤ８比は、免疫療法前よりも半減した（有意差ｐ＜０．００１、Wilcoxon検定）。長期生存者でも、ＣＤ４／ＣＤ８比が免疫療法前よりも半減した（有意差ｐ＜０．０００１、Wilcoxon検定）。これは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増加とＣＤ４^＋Ｔ細胞の減少によると考えられる。

Claims

膵臓癌患者の自己末梢血リンパ球を、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ５２抗体により刺激することにより培養して得た免疫療法剤であって、
前記膵臓癌患者に対して少なくとも４回投与され、１回あたりの投与量に含まれる活性化リンパ球の数が少なくとも１５×１０^９個であって前記活性化リンパ球のうちＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の比率が少なくとも３０％であり、かつ、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる免疫低下状態の群のうち、少なくとも一つの状態にある前記膵臓癌患者に対して投与が開始されることを特徴とする膵臓癌の免疫療法剤。
（ａ）末梢血中のリンパ球の数が１０００／μl未満である。
（ｂ）末梢血中のリンパ球のうちＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の数が２００／μl未満である。
（ｃ）末梢血中のＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の活性が３０％未満である。
（ｄ）末梢血中のＮＫＧ２Ｄ^＋リンパ球の数が４００／μl未満である。
末梢血中のＣＤ４^＋リンパ球とＣＤ８^＋リンパ球の比が３を超える患者に対して投与されることを特徴とする請求項１に記載の膵臓癌の免疫療法剤。
投与される前記リンパ球の残余部分が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞のうちいずれか又は双方であることを特徴とする請求項１に記載の膵臓癌の免疫療法剤。
抗癌剤と併用されることを特徴とする請求項１の膵臓癌の免疫療法剤。