JP2015528110A - 質量スペクトルを用いて免疫応答発生治療剤で治療する癌患者を選択または除外する方法 - Google Patents

質量スペクトルを用いて免疫応答発生治療剤で治療する癌患者を選択または除外する方法 Download PDF

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Abstract

治療に先立って、癌患者が酵母ベースの免疫応答発生治療剤の投与から利益を受ける可能性があるか、可能性がないかどうかを予測する方法およびシステムであって、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤の単独での、または他の抗癌療法との併用である方法およびシステムが提供される。該方法は血液誘導の患者試料の質量分析を、および判別子として、免疫応答発生治療剤を単独で、または他の抗癌療法と併用して用いて利益のあった、または利益のなかった他の癌患者からのクラス標識したスペクトルのトレーニングセットを用いて構成されるコンピュータを用いる。また、癌患者の治療方法であって、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤であってもよい酵母ベースの免疫応答発生治療剤を、本明細書に開示の質量スペクトル予測方法（それでは、スペクトルのクラス標識が患者が酵母ベースの免疫治療剤より利益を受ける可能性があることを示す）に従って試験で選択される患者に投与することを含む方法も開示される。

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１２年６月２６日付け出願の米国仮特許出願番号６１／６６４，３０８および２０１２年６月２６日付け出願の米国仮特許出願番号６１／６６４，３２９に対して３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で優先権の利益を主張するものである。米国仮特許出願番号６１／６６４，３０８および米国仮特許出願番号６１／６６４，３２９の各々の開示の内容をそのまま本明細書に組み込むものとする。
（共同研究契約に関する記載）
本発明は、２０１２年２月２２日付け作成の共同研究契約に関与する当事者により、あるいは該当事者を代表して完成された。その共同研究契約に関与する当事者は：バイオデシックス・インコーポレイテッド（Biodesix,Inc.）およびグローブイミューン・インコーポレイテッド（GlobeImmune,Inc.）である。
（配列表に対する言及）
本願はＥＦＳ−Ｗｅｂによりテキストファイルとして電子的に提出された配列表を含有する。「１２−６２１−ＰＲＯ ＳＴ２５」と称される該テキストファイルはその大きさがバイトで１９ＫＢであり、２０１３年３月１５日に記録された。そのテキストファイルに含まれる情報は、３７ＣＦＲ §１．５２（ｅ）（５）に従って、その内容を全て出典明示により本明細書の一部とする。
（発明の分野）
本発明は、一般に、癌患者の治療を誘導する方法の分野に関する。さらに具体的には、一の態様にて、本発明は、治療を開始するに先立って、患者が、単独で、あるいは標準的な抗癌剤および／または癌の治療用の他の治療計画に加えて、免疫応答発生治療剤（例えば、細胞免疫治療剤として）の投与から利益を受ける可能性がある患者の集合のメンバーであるかどうかを予測する方法に関する。免疫応答発生治療剤、および／または免疫応答発生治療剤を標準的な化学治療剤に付加することから利益を受ける可能性のない患者を特定する方法も開示される。本発明の方法は、患者の血液誘導性試料より得られる質量スペクトルデータ、該質量スペクトルデータを操作する判別子として設定されるコンピュータ、および他の癌患者から由来のクラス標識したスペクトルを含むトレーニングセットを用いる。
癌とは広範囲に及ぶ一群の種々の疾患であり、その全てで細胞増殖の非制御と関連付けられる。癌においては、細胞が制御不能に分裂して増殖し、悪性腫瘍を形成し、隣接する体の一部に浸潤する。癌はまた、リンパ系または血流を通して体のより遠い部位にまで広がり得る。癌を統計的に監視する国立がん研究所（ＮＣＩ）によれば、２０１２年に米国にて新たに癌と推定された患者の数は１，６３８，９１０件（非黒色腫皮膚癌を含まない）であり、米国で癌による一年間の死者の数は５７７，１９０件であると推定される（http://cancer.gov/cancertopics/cancerlibrary/what-is-cancer）。癌の場合、管理するか、治療するかの選択肢がある。主たる選択肢として、手術（例えば、腫瘍の外科的切除）、化学療法、放射線療法、標的癌療法（例えば、腫瘍の増殖および進行に関与する分子を特異的に標的とする、小分子薬物またはモノクローナル抗体療法）および緩和ケア、あるいはそれらのいくつかの組み合わせ（本明細書にて集合的に「抗癌療法」という）が挙げられる。
癌のさらなる療法として、免疫応答を誘発、強化または抑制する治療方法（「免疫療法」または「免疫治療剤」（本明細書にて、一般的に、「免疫応答発生治療剤」とも称される）と総称される）が挙げられる。近年、免疫療法が進行性または転移性の充実性腫瘍の治療においてますます関連するようになっている。癌に使用される免疫療法は、一般に、患者自身の免疫応答を増大または刺激し、癌細胞をよりうまく制御または排除するように設計され、化学療法、手術、放射線療法、標的癌療法の使用などの他の治療を付加的に支持するものであってもよい。腫瘍にて使用されるかかる免疫療法のいくつかの例として、（１）進行性去勢耐性前立腺癌にて用いるための、樹状細胞を刺激し、抗原に対する細胞毒性応答を活性化するプロベンジ（PROVENGE（登録商標）(Dendreon））を用いること；（２）Ｔ細胞を養子免疫伝達に付し、癌に対する細胞毒性応答を活性化すること；（３）腫瘍抗原を認識するように設計されるＴ細胞受容体を導入するウイルスを取り込むことでＴ細胞を遺伝子操作すること；（４）抗腫瘍活性を有する可能性のあるネズミアルファ−１，３−ガラクトース転移酵素を発現するようにトランスフェクトされる放射線照射の同種異系膵臓癌細胞からなる癌ワクチン、アルゲンパンツセル−Ｌ（Algenpantucel-L）を用いること；（５）ウイルスベクターに基づく免疫療法；および（６）酵母ベースの免疫療法が挙げられる。
酵母ベースの免疫療法は、タルモゲン（TARMOGEN）（登録商標）（GlobeImmune, Inc., Louisville, Colorado）技法とも称され、一般に細胞外に（細胞表面に）、細胞内に（内部にまたは細胞質に）または細胞外および細胞内の両方に、１または複数の異種標的抗原を発現する酵母ビヒクルをいう。酵母ベースの免疫療法は一般的に記載されている（例えば、米国特許第５，８３０，４６３号を参照のこと）。特定の酵母ベースの免疫治療組成物ならびにその製造および一般的な使用方法はまた、例えば、米国特許第５,８３０,４６３号、米国特許第７,０８３,７８７号、米国特許第７,７３６,６４２号、Stubbsら、Nat. Med. 7:625-629（2001）、Luら、Cancer Research 64:5084-5088（2004）およびBernsteinら、Vaccine 2008 Jan 24;26(4）:509-21（その各々を出典明示により本明細書の一部とする）に詳細に記載される。酵母ベースの癌用免疫治療剤が、例えば、米国特許第７,４６５,４５４号、米国特許第７,５６３,４４７号、米国特許第８,０６７,５５９号、米国特許第８,１５３,１３６号、米国特許公開番号２００９−００９８１５４およびＰＣＴ公開番号ＷＯ０７／１３３８３５（その各々を出典明示により本明細書の一部とする）に記載される。
酵母ベースの免疫療法は、他の免疫療法と比べて、固有の免疫応答ならびに標的抗原に対する広範囲に及ぶ養子免疫応答（ＣＤ４−依存性ＴＨ１７およびＴＨ１Ｔ細胞応答、ならびに細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を包含する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む）を誘発する独特な能力を有し、それらはすべて外因的アジュバント、サイトカインまたは他の免疫治療用分子を用いることなく、その多くは毒性の問題を有する。加えて、酵母ベースの免疫治療用組成物は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数および／または機能性を阻害し、それにより例えば、一般に、腫瘍の存在によって抑制される可能性のあるエフェクターＴ細胞応答を強化する。その上、抗体応答を生じさせることで免疫力を付与する免疫治療用組成物と比べて、酵母ベースの免疫療法により惹起される、抗原特異的で、それに広く基づき、かつ強力な細胞免疫応答は、標的とする腫瘍細胞にて、そうでないとすれば抑制的状況であるかもしれない環境にたとえ直面しても、特に効果的であると考えられる。この型の免疫療法は抗原提示細胞の関連する免疫源を提示するその自然の能力を利用するものであるため、標的抗原のＣＴＬエピトープの、またはクラスＩＩＭＨＣエピトープの効果的な酵母ベースの免疫療法を産生する正確なアイデンティティーを知る必要はなく、免疫治療作用を生じさせるいずれの免疫細胞も患者から単離することを要しない。事実、複数のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは単一の酵母ベースの免疫治療作用組成物にて標的とされ得、そのために推定Ｔ細胞エピトープまたはＴ細胞受容体を同定するためのアルゴリズムおよび複雑な公式の使用は除かれる。
患者の腫瘍細胞により発現される変異したＲａｓタンパク質に対する免疫応答を刺激するために、一連の酵母ベースの免疫治療生成物（GlobeImmune, Inc.により現在臨床開発中の「ＧＩ−４０００」として知られるタルモゲン（TARMOGEN（登録商標）を含む）候補化合物が開発された。「Ｒａｓ」は、細胞（ヒト細胞を含む）内に見られる関連したタンパク質のファミリーに付与される名称である。Ｒａｓタンパク質のファミリーのメンバーはすべて、スモールＧＴＰａｓｅと称される一連のタンパク質に属し、細胞内でのシグナルの伝達（細胞性シグナル変換）に関与する。Ｒａｓ変異は、一連の型の腫瘍（膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、大腸癌、子宮内膜および卵巣癌、ならびに黒色腫および多発性骨髄腫を含む）にわたって、合衆国で毎年、略１８０，０００件の新たな癌患者に認められる。研究により、Ｒａｓ変異のある腫瘍は正常なＲａｓの腫瘍よりも一般的な化学療法ならびに標的試薬に対する反応性が小さいことが分かった。ＮＳＣＬＣまたは大腸癌などのある癌の場合、表皮成長因子受容体（またはＥＧＦＲ）を標的とする治療は、臨床転帰を改善した。しかしながら、腫瘍中のＲａｓ変異の存在は、大腸癌でのＥＧＦＲ標的療法の使用にも拘わらず予後不良と関連付けられた。同様に、他の研究により、Ｒａｓ変異の大腸腫瘍の患者は、正常なＲａｓの患者と比べて、セツキシマブ療法、他のＥＧＦＲ標的剤から利益を得ることはなく、同じ療法で治療した場合に生存率を改善することが分かった。結果として、Ｒａｓ変異の患者は利用可能な効果的な治療の選択肢がほとんどない。Ｒａｓ変異を含有する細胞の数を減少させることは、変異したＲａｓが腫瘍増殖にて果たす役割のために、多くのヒト癌の患者に改善された臨床転帰をもたらしうる。しかしながら、これまで、後期臨床試験にて変異したＲａｓを標的とする利用可能な療法はない。
免疫療法の分野における進歩は遅いが、近年の臨床上での成功はこの解決手段の癌における治療法としての可能性を強く支持するものである。しかしながら、当該分野において、治療に先立ち、癌における免疫性治療より臨床的利益を受けるであろう患者を特定し、かつ臨床的応答者および非応答者を特定するバイオマーカーを規定することに対する要求がある。免疫療法のマーカーの例として、ＣＤ５４の発現およびインターロイキン１２ｐ７０の産生が挙げられるが、それらはまだ十分に確認されていない。また、数種の細胞免疫マーカーアッセイ（サイトカインフローサイトメトリー、ＭＨＣテトラマー、および酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ））も使用される。再現性があり、比較可能な結果を得るためには、免疫療法からの利益を予測するアッセイを標準化する必要があることに言及することが重要である。このことはこの分野ではなされてこなかった。
発明が解決すべき課題
治療に先立って、所定の癌患者が免疫応答発生治療剤を単独で、または他の抗癌薬療法と組み合わせて適用することにより利益を受ける可能性があるかどうかを、あるいは反対にかかる治療が所定の癌患者に利益をもたらす可能性がないかどうかを決定するための実践的で有用なテストに対する要求がある。本発明はこの要求に合致する。
さらには、ある種の薬物による癌患者の利益を予測し得ることに関連して関心のある先行文献として、米国特許第７，７３６，９０５号、第７，８５８，３９０号、第７，８５８，３８９号、第７，８６７，７７５号、第８，０２４，２８２号、第７，９０６，３４２号および第７，８７９，６２０号、および出願中の米国特許出願番号１３／３５６，７３０（２０１２年１月２４日出願）および米国特許出願番号１２／９３２，２９５（２０１１年２月２２日出願）（ＵＳ２０１１／０２０８４３３として公開）（これらはすべてBiodesix,Inc.に譲渡されている）が挙げられる。’９０５特許および米国特許出願番号１２／９３２，２９５（２０１１年２月２２日出願）をそのまま本明細書に組み入れる。’９０５特許は、とりわけ、ＮＳＣＬＣの癌患者が表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とする薬物から利益を受ける可能性があるかどうかを決定する質量分析を基礎とする試験を記載する。この試験はその商用バージョンにて「VeriStrat」として知られており、以下の記載における「Veristrat」への言及は、’９０５特許に記載の試験への言及をいうと理解される。
（発明の要約）
本発明は、一般に、癌患者の治療を誘導する方法の分野に関する。一の態様において、かかる癌患者の治療は癌の免疫療法であり、一の態様にて、該治療は癌の酵母ベースの免疫治療剤であり、さらに別の態様にて、該治療は変異したＲａｓ−陽性癌（すなわち、少なくともいくつかの腫瘍が変異したＲａｓタンパク質に対して陽性である癌であって、典型的にはｒａｓヌクレオチド配列中の変異を見つけることで検出される癌）の酵母ベースの免疫治療剤である。一の態様にて、該治療は変異したＲａｓ−陽性膵臓癌の酵母ベースの免疫治療剤である。
より具体的には、一の態様にて、本発明は、治療を開始するに先立って、癌患者が、酵母ベースの免疫応答発生治療剤（例えば、細胞免疫治療剤として）を単独で、または標準的な抗癌薬での治療および／または癌の治療用の他の治療計画と組み合わせて投与することで利益を受けそうな一連の患者の一員であるかどうかを予測する方法に関する。酵母ベースの免疫治療剤に、および／または免疫療法と標準的な化学治療剤との組み合わせに応答しそうにない患者を同定する方法も開示される。酵母ベースの免疫治療剤、および／または酵母ベースの免疫治療剤と標準的化学治療剤および／または他の癌治療剤の組み合わせに対してあまり応答しそうにない、または応答しそうにない患者を同定する方法も開示される。
さらに別の態様において、本発明は、治療を開始するに先立って、患者が、変異したＲａｓ−陽性癌の酵母ベースの免疫治療剤を単独で、または標準的な抗癌薬および／または癌の治療用の他の治療計画と組み合わせて投与することで利益を受けそうな一連の患者の一員であるかどうかを予測する方法に関する。変異したＲａｓ−陽性癌の酵母ベースの免疫治療剤に、および／または変異したＲａｓ−陽性癌の酵母ベースの免疫治療剤と標準的な化学治療剤および／または他の癌の治療（例えば、外科的切除）との組み合わせにあまり応答しそうにない、または応答しそうにない患者を同定する方法も開示される。一の態様において、変異したＲａｓ−陽性癌は膵臓癌である。一例として、本願明細書は、膵臓癌患者が、変異したＲａｓを標的とする酵母ベースの免疫治療剤（本明細書中にさらに詳細に記載される、ＧＩ−４０００として知られる一連の生成物）の投与を、ゲムシタビンの投与と組み合わせたことから利益を受けそうであるかを予測する方法を記載する。
本発明を開示する方法は、患者の血液誘導性試料より取得される質量スペクトルデータ、該質量スペクトルデータを操作する判別子として設定されるコンピュータ、および他の癌患者から由来のクラス標識したスペクトルを含むトレーニングセットを用いる。
出願人は、治療に先立って、癌患者が、酵母ベースの免疫応答発生治療剤を単独で、または他の抗癌療法と組み合わせて投与することで利益を受けそうな、または受けそうにないかどうかを予測する方法を見出した。該方法は血液誘導性試料の質量分析法に基づく。血液誘導性試料（例えば、血清、血漿）の使用は、免疫系の循環マーカーに洞察を与えることにより、広範囲に及ぶ免疫療法に対する感受性を測定する可能性を増大させるため、かかる使用が重要である。さらには、該方法は、患者の試料を複雑で時間のかかるアッセイに付したり、腫瘍試料を患者より取得する必要がなく、血液誘導性試料を簡単な質量分析試験に介して速やかに行うことができる。とりわけ、出願人は治療前に取得される試料での当該試験の実効性を明らかにする。したがって、該試験の実用的実施では患者より由来の治療前試料を使用し、該患者が酵母ベースの免疫応答発生治療剤より利益を受けられそうか、または受けられそうにないかどうかを予測する。
本発明を開示する方法は、質量分析計（例えば、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ装置）および判別子として機能するように設定される汎用性コンピュータを活用して実施され得る、実践的で有用な試験の形態を取る。
一の態様において、癌患者が、酵母ベースの癌用免疫応答発生治療剤を、単独で、または他の抗癌療法に加えて投与することより利益を受ける可能性があるかどうかを予測する方法であって、
（ａ）該患者の血液誘導性試料を取得する工程；
（ｂ）質量分析を該試料に対して行い、質量スペクトルを該試料より取得する工程；
（ｃ）プログラムされたコンピュータにて、１または複数の所定の前処理工程を該質量スペクトルに対して行い、該前処理工程を行った後の質量スペクトルにおいてｍ／ｚの所定の範囲にわたって選択される特徴部の強度積分値を取得し、その強度積分値を他の癌患者から由来のクラス標識したスペクトルを含むトレーニングセットと比較し、それによって質量スペクトルをクラス標識で判別する工程
からなる方法が記載される。クラス標識は、患者が、免疫応答発生治療剤を、単独での、または他の抗癌治療薬に加えることより利益を受けそうであるか、または受けそうにないかどうかを予測する。例えば、クラス標識は、「スロー」または「クイック」の形態としてもよく、「スロー」は患者が利益を受けそうであり、癌の再発までの時間または癌の疾患進行が比較的ゆっくりであることを示すのに対して、「クイック」は患者が利益を受けそうになく、再発までの時間または疾患進行が相対的に短いことを示してもよい。もちろん、他の同等のクラス標識、例えば、「利益あり」、「利益なし」、「良好」、「不調」などを用いることができる。
一の態様において、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤を、単独で、または他の抗癌治療薬に加えて、投与することより癌患者が利益を受ける可能性があるかどうかを予測する方法であって、以下の工程：
（ａ）酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤、単独で、または他の抗癌治療薬と合わせて治療されるべき患者の血液誘導性試料を取得する工程；
（ｂ）該試料について質量分析法を行い、該試料より質量スペクトルを取得する工程；
（ｃ）プログラムされたコンピュータにて、該質量スペクトルについて１または複数の所定の前処理工程を行い、その前処理工程を行った後に、質量スペクトルのｍ／ｚの所定の範囲にわたる選択される特徴部の積分強度の値を取得し、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤で治療する前にその積分強度の値を他の癌患者からのクラス標識したスペクトルを含むトレーニングセットと比較し、それによって質量スペクトルをクラス標識で判別する工程からなる方法が記載される。クラス標識は、患者が、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤を、単独で、または他の抗癌治療薬に加えることから利益を受けそうであるか、または受けそうにないかどうかを予測する。例えば、クラス標識は、「スロー」または「クイック」の形態としてもよく、「スロー」は患者が利益を受けそうであり、癌の再発までの時間または癌の疾患進行が比較的ゆっくりであることを示すのに対して、「クイック」は患者が利益を受けそうになく、再発までの時間または疾患進行が相対的に短いことを示してもよい。上記されるように、他の同等のクラス標識、例えば、「利益あり」、「利益なし」、「良好」、「不調」などを用いることができる。本発明の一の具体的な実施態様において、試験が行われる癌患者は膵臓癌の癌患者である。この実施態様にて、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤はＧＩ−４０００（下記に詳細に記載される）またはその等価物の形態としてもよい。一の態様にて、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤を、ゲムシタビンまたはその等価物と合わせて患者に投与する。本発明のこの実施態様の一の態様にて、変異したＲａｓ−陽性癌は、限定されるものではないが、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、大腸癌（ＣＲＣ）、子宮内膜癌、卵巣癌、黒色腫および多発性骨髄腫を包含し得る。
一の態様にて、本明細書の上記に、または下記に記載の上記される予測方法のいずれも、例えば、以下に限定されるものではないが、本願明細書に開示の判別に有用である質量スペクトルの特徴が、とりわけ、細胞性炎症応答の制御と関連しており、米国特許出願番号１２／９３２，２９５（２０１１年２月２２日付け出願）およびBiodesix, Incの上記される特許に記載されるように広範囲に及ぶ型の腫瘍にて予測的であると考えられる場合に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の患者および大腸癌（ＣＲＣ）の患者を含む他の癌患者に、単独で、または他の標準的抗癌剤に対するアジュバントとして適用可能であると考えられる。
本願明細書の上記または下記に記載のいずれかの方法に使用されるトレーニングセットは、好ましくは、免疫応答発生治療剤を単独で、または別の抗癌治療剤と組み合わせて投与することから利益を受けたか、利益を受けなかった他の癌患者からのクラス標識したスペクトルの形態である。判別に使用される患者のスペクトルの特徴（ｍ／ｚ範囲）は、該トレーニングセットを形成する患者の質量スペクトルの分析より研究され、選択され得る。本発明者らは、米国特許第７，７３６，９０５号にて使用され、本明細書中の表３および４に列挙される１または複数の特徴（表皮成長因子受容体阻害剤（ＥＧＦＲ−Ｉ）より利益を受けるＮＳＣＬＣ患者を予測するのに全く異なる内容にて開発された）が宿主の免疫学的および腫瘍に対する炎症応答に関連し得るため（米国特許出願公開番号２０１１／０２０８４３３を参照のこと）、それらが本発明の方法に用いるのに適切な一連の特徴であると考えた。（正確な特徴部の値は、例えば試料の型が実質的に異なるためにスペクトルの前処理の間になされるスペクトルアライメント（シフト）に応じて、’９０５特許および以下の表１−４に示される一覧の値とは異なるかもしれない。）’９０５特許に使用されるトレーニングセット（ＥＧＦＲ標的薬に対して応答した、または応答しなかったＮＳＣＬＣ患者からのスペクトル）と異なり、本発明の方法にて使用されるトレーニングセットは、免疫応答発生治療剤を、単独で、または他の抗癌治療剤と組み合わせるかのいずれかで投与することから利益を受けたか、またはその利益を受けなかった患者の試料からのスペクトルを用いる。本願における試料の型は’９０５特許に記載された血清および血漿とは異なることに留意する。しかしながら、後記されるように、他の特徴は、本明細書に示される例であるトレーニングセットを形成するスペクトルの研究から判別され得るスペクトル中にある。
本発明を開示する他の態様にて、次の工程からなる癌患者の治療方法であって、本願明細書の上記または下記に記載のいずれかの予測方法に従って試験を行い、スペクトルのクラス標識が患者が酵母ベースの免疫応答発生治療剤より利益を受ける可能性があることを示す場合には、酵母ベースの免疫応答発生治療剤を単独で、または他の抗癌剤と組み合わせて患者に投与する工程を含む方法が記載される。
一の態様にて、患者は、癌用酵母ベースの免疫治療剤で治療される前に、それと同時に、またはその後で１または複数の付加的な抗癌療法でさらに治療される。一の実施態様において、付加的な抗癌療法は、限定されるものではないが、手術（例えば、腫瘍の外科的切除）、化学療法、放射線療法、標的癌療法（例えば、腫瘍の増殖および進行に関与する分子を特異的に標的とする小分子薬物またはモノクローナル抗体療法）、および緩和ケア、あるいはそれらのいずれかの組み合わせを包含する。
本発明を開示する他の態様において、癌用酵母ベースの免疫治療剤で癌患者を治療する方法であって、本願明細書の上記または下記に記載のいずれかの予測方法に従う試験によって（スペクトルのクラス標識が、酵母ベースの癌用免疫治療剤より利益を受ける可能性のある患者を示す）選択された癌患者に酵母ベースの免疫治療剤を投与する工程からなる方法が記載される。一の態様にて、患者は、酵母ベースの癌用免疫治療剤で治療される前に、それと同時に、またはその後で１または複数の付加的な抗癌療法でさらに治療される。一の実施態様において、付加的な抗癌療法は、限定されるものではないが、手術（例えば、腫瘍の外科的切除）、化学療法、放射線療法、標的癌療法（例えば、腫瘍の増殖および進行に関与する分子を特異的に標的とする小分子薬物またはモノクローナル抗体療法）、および緩和ケア、あるいはそれらのいずれかの組み合わせを包含する。
本発明を開示するさらに別の態様において、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤で癌患者を治療する方法であって、本願明細書の上記または下記に記載のいずれかの予測方法に従う試験を行い、仮にスペクトルのクラス標識によって、患者が酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤より利益を受ける可能性があることが示される場合には、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤を投与する工程を含む方法が記載される。本発明のこの態様において、患者の少なくともいくつかの腫瘍細胞中に変異したＲａｓが同定される癌を該患者は有する。一の態様において、患者は、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫療剤で治療される前に、それと同時に、またはその後で１または複数の付加的な抗癌療法でさらに治療される。一の実施態様において、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤は、ＧＩ−４０００またはその等価物として知られている一連の酵母ベースの免疫治療剤の生成物での一の生成物である。本発明のこの実施態様の一の態様にて、変異したＲａｓ−陽性癌は、次に限定されるものではないが、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、大腸癌（ＣＲＣ）、子宮内膜癌、卵巣癌、黒色腫および多発性骨髄腫を包含する。一の態様において、癌は膵臓癌である。一の実施態様において、付加的な抗癌療法として、以下に限定されるものではないが、手術（例えば、腫瘍の外科的切除）、化学療法、放射線療法、標的癌療法（例えば、腫瘍の増殖および進行に関与する分子を特異的に標的とする小分子薬物またはモノクローナル抗体療法）、および緩和ケア、あるいはそれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。一の態様において、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤は、ゲムシタビンまたはその等価物と合わせて患者に投与される。一の実施態様において、患者は膵臓癌の癌患者であり、その療法は、ＧＩ−４０００またはその等価物（下記に詳細に記載される）として知られる一連の酵母ベースの免疫治療剤の一の生成物を、単独で、またはゲムシタビンまたはその等価物と合わせて含む。
本発明の他の態様において、癌患者を酵母ベースの癌用免疫治療剤を用いて治療する方法であって、本願明細書の上記または下記に記載のいずれかの予測方法に従う試験によって（スペクトルのクラス標識が、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤より利益を受ける可能性のある患者を示す）選択された癌患者に酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤を投与する工程を含む方法が記載される。本発明のこの態様において、患者は変異したＲａｓが該患者からの腫瘍細胞中に同定される癌を有する。一の態様において、患者は、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤で治療される前に、それと同時に、またはその後で１または複数の付加的な抗癌療法でさらに治療される。一の実施態様において、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤は、ＧＩ−４０００またはその等価物として知られる一連の酵母ベースの免疫療法の生成物での一の生成物である。本発明のこの実施態様の一の態様にて、変異したＲａｓ−陽性癌として、限定されるものではないが、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、大腸癌（ＣＲＣ）、子宮内膜癌、卵巣癌、黒色腫および多発性骨髄腫が挙げられ得る。一の態様において、癌は膵臓癌である。一の実施態様において、付加的な抗癌療法として、限定されるものではないが、手術（例えば、腫瘍の外科的切除）、化学療法、放射線療法、標的癌療法（例えば、腫瘍の増殖および進行に関与する分子を特異的に標的とする小分子薬物またはモノクローナル抗体療法）、および緩和ケア、あるいはそれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。一の態様において、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤は、ゲムシタビンまたはその等価物と合わせて患者に投与される。一の実施態様において、患者は膵臓癌の癌患者であり、その療法は、ＧＩ−４０００またはその等価物（下記に詳細に記載される）として知られる一連の酵母ベースの免疫療法の生成物における一の生成物を、単独で、またはゲムシタビンまたはその等価物と合わせて含む。一の態様において、癌患者の腫瘍は、酵母ベースの免疫療法の組成物を用いる治療の前に外科的に切除される。
酵母ベースの免疫療法を用いて癌の患者を治療する方法のいずれかの態様において、酵母ベースの免疫療法は、以下に限定されるものではないが、患者の腫瘍と関連して少なくとも１つの癌抗原を発現するか、または該腫瘍により発現する、加熱不活化の組換え全酵母を包含し得る。一の態様にて、酵母は、以下に限定されるものではないが、サッカロマイセスを含む、一の属の酵母から由来し得る。一の態様にて、酵母は、以下に限定されるものではないが、サッカロマイセス・セレビシエを含む、一の種の酵母から由来し得る。
別の態様にて、癌患者が酵母ベースの免疫応答発生治療剤を、単独で、または他の抗癌剤と組み合わせて投与することから利益を受ける可能性があるかどうかを予測するシステムを開示する。該システムは癌患者から由来の血液誘導性試料より質量スペクトルを発生する質量分析計を含む。該システムはまた、他の癌患者から由来のクラス標識されたスペクトルのトレーニングセットを記憶する機械可読記録媒体を含む。該トレーニングセットは、酵母ベースの免疫応答発生治療剤より、それ単独で、または他の抗癌剤と合わせるかのいずれかで利益を受けなかった複数の患者から由来のクラス標識されたスペクトル、および細胞性免疫治療剤より、それ単独で、または他の抗癌剤と合わせるかのいずれかで利益を受けた複数の患者から由来のクラス標識されたスペクトルを含む。該システムはまた、質量スペクトルに作用し、該トレーニングセットを用いて質量スペクトルを判別し、その質量スペクトルについてクラス標識を行うように設定されているコンピュータシステムであって、ここでそのクラス標識を用いて患者が、酵母ベースの免疫応答発生治療剤の投与より、それ単独で、または他の抗癌剤と合わせるかのいずれかで利益を受ける可能性があるかどうかを予測するコンピュータシステムを含む。
他の態様にて、癌患者が酵母ベースの癌用免疫治療剤の投与より、それ単独で、または他の抗癌治療剤での治療と合わせることから利益を受ける可能性があるかどうかを予測するシステムを開示する。該システムは癌患者から由来の血液誘導性試料より質量スペクトルを発生する質量分析計を含む。該システムはまた、他の癌患者から由来のクラス標識されたスペクトルのトレーニングセットを記憶する機械可読記録媒体を含む。該トレーニングセットは、酵母ベースの癌用免疫治療剤より、それ単独で、または他の抗癌治療剤での治療と合わせるかのいずれかで利益を受けなかった複数の患者から由来のクラス標識されたスペクトル、および酵母ベースの癌用免疫治療剤より、それ単独で、または他の抗癌治療剤での治療と合わせるかのいずれかで利益を受けた複数の患者から由来のクラス標識されたスペクトルを含む。該システムはさらに、質量スペクトルに作用し、該トレーニングセットを用いて質量スペクトルを判別し、その質量スペクトルについてクラス標識を行うように設定されているコンピュータシステムであって、ここでそのクラス標識を用いて患者が、酵母ベースの癌用免疫治療剤の投与より、それ単独で、または他の抗癌治療剤での治療と合わせるかのいずれかで利益を受ける可能性があるかどうかを予測するコンピュータシステムを含む。
別の態様にて、癌患者が酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤の投与より、それ単独で、または他の抗癌治療剤での治療と合わせることから利益を受ける可能性があるかどうかを予測するシステムを開示する。該システムは癌患者から由来の血液誘導性試料より質量スペクトルを発生する質量分析計を含む。該システムはまた、他の癌患者から由来のクラス標識されたスペクトルのトレーニングセットを記憶する機械可読記録媒体を含む。該トレーニングセットは、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤より、それ単独で、または他の抗癌治療剤での治療と合わせるかのいずれかで利益を受けなかった複数の患者から由来のクラス標識されたスペクトル、および酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤より、それ単独で、または他の抗癌治療剤での治療と合わせるかのいずれかで利益を受けた複数の患者から由来のクラス標識されたスペクトルを含む。該システムはさらに、質量スペクトルに作用し、該トレーニングセットを用いて質量スペクトルを判別し、その質量スペクトルについてクラス標識を行うように設定されているコンピュータシステムであって、ここでそのクラス標識を用いて患者が、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤の投与より、それ単独で、または他の抗癌治療剤での治療と合わせるかのいずれかで利益を受ける可能性があるかどうかを予測するコンピュータシステムを含む。一の態様において、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤は、ＧＩ−４０００として知られる一連の生成物に含まれる一の生成物である。一の態様にて、変異したＲａｓ−陽性癌は、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、大腸癌（ＣＲＣ）、子宮内膜癌、卵巣癌、黒色腫および多発性骨髄腫より選択される。一の態様において、癌は膵臓癌である。
次の詳細な記載は、添付図面を参考とし、かかる図面は例示として提供されるものであり、本発明を限定するものではない。
変異したＲａｓ−陽性癌を標的とするGlobeImmune社製の一連の酵母ベースの免疫療法用生成物（ＧＩ−４０００として知られる）を用い、膵臓癌におけるフェーズ２臨床試験の設計を示す概略図である。
図２Ａおよび２Ｂは、無再発生存（ＲＦＳ）および全生存（ＯＳ）のカプラン−マイヤープロットであって、本発明にて開示される質量分析法の、膵臓癌の治療にて、ＧＩ−４０００およびゲムシタビンの組み合わせより利益を受ける可能性がある患者を同定する能力を説明する。
図３Ａ−３Ｆは、Ｋ−最近傍判別アルゴリズムにて使用されるＫ個の異なる値の膵臓癌の治療の際のＧＩ−４０００およびゲムシタビンの研究における、治療および対照の両方のアームの患者についてＲＦＳおよびＯＳの対となるカプラン−マイヤープロットを示す。図３Ａ−３ＢにてＫの値は１であり、図３Ｃおよび３ＤにてＫの値は３であり、図３Ｅおよび３ＦにてＫの値は５であった。プロットは、治療アーム（ゲムシタビンおよびＧＩ−４０００の両方で治療される患者）にて、悪化せず治療の利益を受けた患者であって、その上に治療アームの何人かは対照アームの何人かの患者よりも悪化した患者を選別する出願人の判別子の能力を示す。したがって、プロットは、本件出願人の質量スペクトル方法の、免疫応答発生治療剤での治療から利益を受ける可能性のあるそれらの患者と、免疫応答発生治療剤での治療から利益を受けない可能性のあるそれらの患者との両方を予測する能力を示す。
図４Ａ−４Ｈは、本明細書に記載の技法、および２０１２年５月２９日出願の米国仮特許出願６１／６５２，３９４（その内容をそのまま本明細書に組み込む）に記載の技法を用いて、血液誘導性試料の質量分析の「ディープＭＡＬＤＩ」法で１５０，０００回のショットを用いて得られるスペクトルに基づき判別子により規定されるようなＧＩ−４０００およびゲムシタビンの研究でのＲＦＳおよびＯＳの対となるカプラン−マイヤープロットを示す。図４Ａ−４Ｂ、４Ｃ−４Ｄ、４Ｅ−４Ｆおよび４Ｈ−４Ｈは、各々、判別に使用される質量スペクトルの異なるピークの対に基づき、各々、４種の異なる判別子から得られるＲＦＳおよびＯＳをプロットで示す。
膵臓癌／ＧＩ−４０００およびゲムシタビンの研究の際に使用される判別子を確認するための交差検定のフローチャートを示す。
図３Ｅ−３Ｆの「希釈直打ち（dilute-and-shoot）」判別子の交差検定分析からのＲＦＳの「クイック」と「スロー」の群間のハザード比の分布をプロットで示す。
図７ＡはＧＩ−４０００およびゲムシタビンの研究の際の交差検定分析の試験セットの「クイック」および「スロー」の群のＲＦＳ中央値の分布をプロットで示す。図７ＢはＧＩ−４０００およびゲムシタビンの研究の際の交差検定分析の試験セットの「クイック」および「スロー」の群間のＲＦＳ中央値の差の分布をプロットで示す。プロットは共に図３Ｅ−３Ｆの「希釈直打ち」判別子を使用する。
図３Ｅ−３Ｆの「希釈直打ち」判別子の交差検定分析の際の対照アームおよび試験セットの「クイック」および「スロー」の群の中央値の分布をプロットで示す。
図３Ｅ−３Ｆの「希釈直打ち」判別子の交差検定分析の際の試験セットおよび対照アーム間の「スロー」群についての中央値の差の分布をプロットで示す。
図１０Ａは、図３Ｅ−３Ｆの「希釈直打ち」判別子の交差検定分析の際の判別子に使用されるＫ個の異なる値について対照アームにおけるスローのクイック判別に対する割合の分布をプロットで示す。図１０ＢはＫ−最近傍判別子に使用されるＫ個の種々の値について交差検定分析に用いられる試験セットのハザード比をプロットで示す。
免疫応答発生治療剤を単独で、または他の抗癌剤との組み合わせからの癌患者の利益、または不利益を予測する試験方法のフローチャートを示す。
血液誘導の患者の試料の試験を行い、該患者が免疫応答発生治療剤の単独での、または他の抗癌剤との組み合わせからの利益を受ける可能性があるかどうかを予測するシステムを説明する。
図１３Ａ−１３Ｌは、２０１２年５月２９日出願の係属中の米国仮特許出願６１／６５２，３９４（その内容をそのまま本明細書に組み込む）の技法を用い、５００，０００回のショットを用いるディープＭＡＬＤＩ法より取得されるスペクトルに基づいて、判別子により定められるようなＧＩ−４０００およびゲムシタビンの研究の際のＲＦＳおよびＯＳの対となるカプラン−マイヤープロットを示す。図１３Ａ−１３Ｂ、１３Ｃ−１３Ｄ、１３Ｅ−１３Ｆ、１３Ｇ−１３Ｈ、１３Ｉ−１３Ｊおよび１３Ｋ−１３Ｌの各々は、判別に用いられる質量スペクトルの異なる対のピークまたは特徴に基づき、６個の個々の異なる判別子からのＲＦＳおよびＯＳのプロットを示す。
１５０，０００回のショットを用いるディープＭＡＬＤＩ法より取得されるスペクトルを使用して開発された図４Ａ−４Ｈの判別子に対する交差検定分析からのＲＦＳについての「クイック」および「スロー」の群間のハザード比の分布をプロットで示す。
５００，０００回のショットを用いるディープＭＡＬＤＩ法より取得されるスペクトルを使用して開発された図１３Ａ−１３Ｌの判別子に対する交差検定分析からのＲＦＳについての「クイック」および「スロー」の群間のハザード比の分布をプロットで示す。
図１６Ａ−１６Ｃは、選択される質量／電荷の範囲（ｍ／ｚ比 ７，０００〜８，０００）にある同じ試料の３つのＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示すものであり、ショット数の増加に伴い、検出可能なピーク容量が増加することを示す。図１６Ａのスペクトルを２，０００回のショットより得、図１６Ｂのスペクトルを１００，０００回のショットより得、図１６Ｃのスペクトルを５００，０００回のショットより得た。本発明者らの方法より得られる図１６Ｂおよび１６Ｃのスペクトルが、どのようにして、図１６Ａのスペクトルに存在せず、本質的にノイズとして認められる、その試料の豊富なスペクトル情報を示すのかに注意する。
図１６Ｄおよび１６Ｅは、質量スペクトルのさらなる例であり、本発明者らのディープ−ＭＡＬＤＩ法にて取得される膨大なダイナミックレンジのスペクトルを示す。図１６Ｄにて、７１４０〜７８９０Ｄａのｍ／ｚの範囲にあるスペクトルの一部を、約５００，０００回のショットで取得される豊富なスペクトル情報を示す図１６Ｄの差し込み図にて拡大して図示する。図１６Ｅにて、さらなるスペクトル情報を示すためにＹ軸を増幅し、ｍ／ｚが約９５２０の領域でのピーク（ディープ−ＭＡＬＤＩ法で暴露されるが、典型的な約１，０００回のショットのスペクトルでは可視できない）のスペクトルを差し込み図にて図示する。
図１７Ａは長方形のアレイにて３８４個の試料スポットまたは「スポット」を配置して含有するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的プレートの平面図である。スポットは列番号１．．．２４と、行記号Ａ．．．Ｐにより同定され、例えば左上部のスポットはＡ１として同定される。図１７Ｂは、Ｘ／Ｙロケーション座標と、スポットの中心に起源（０，０）とを有する、５ｘ５の長方形のグリッドに分割して示される、個々の試料スポットＰ１の拡大図である。長方形のグリッドとロケーション座標を自動化ラスタ走査方法にて用い、本明細書に詳細に記載されるようにスポットから１００、０００回以上のショットでスペクトルを獲得する。
図１７ＡのＭＡＬＤＩプレートの単一スポットに正確に置かれた生物試料／マトリックスの混合物の写真である。理想的には、該スポットは、図１８に示されるように、そのスポット内にむらなく均一な結晶化試料を含有する。
図１８のスポットから１００，０００回以上のショットを得るのに使用する可能性のあるラスタ走査パターンの一例である。スポットを何度も（例えば、２５回）ラスタ走査する。図１９に示される一連の各符号（トライアングル、スクエア、Ｘ等）は、個々に別個のＸ／Ｙロケーションを示し、スポットは一回のラスタ走査で走査（ショット）される。各ロケーションでは、スポットを何度もショットに、例えば７００または８００回のショットに供することができる。
図１８試料スポットでの図１９のラスタ走査パターンの重ね合わせを図示する。
例えば、図１７Ｂまたは図２０のラスタ走査において、ロケーション／ラスタに付き８００回のレーザーショットで蓄積されたスペクトルを集計するためのコマンドを示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置のユーザーインターフェースから由来のスクリーンショットを示す。
試料／マトリックスの混合物が空間的に均一な様式で結晶化しない領域を示す試料スポットの一部の画像である。
装置内のカメラで捕らえられた一部のスポットの画像を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置のユーザーインターフェースから由来のスクリーンショット、およびスポットの自動ラスタ走査のための一群のスポットの選択を示す。
スペクトル評価手段、スペクトル集積手段および異なるパターンでのファイアリングのためにスポットを横切るレーザーの移動手段を示す、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置のユーザーインターフェースから由来の別のスクリーンショットを示す。
データ獲得の間の過渡スペクトルを許容または拒絶するための評価頁のスクリーンショットを示す。
バックグランドピークを削除するための除外リストを示すスクリーンショットを示す。
詳細な説明、実施例および実験結果
本明細書において、免疫応答発生治療剤についての予測試験、関連する判別子およびシステム、ならびにこれらの試験、判別子およびシステムにより特定される患者の治療が記載される。
特に、治療に先立って、癌患者が酵母ベースの免疫応答発生治療剤を単独で、または他の抗癌療法と合わせて投与することから利益を受ける可能性があるか、またはないかどうかを推定する方法を本明細書に記載する。また、治療に先立って、癌患者が変異したＲａｓ−陽性癌（限定されないが、膵臓癌を含む）用の酵母ベースの免疫療法（例えば、本明細書に記載のＧＩ−４０００）から利益を受ける可能性があるか、またはないかどうかを推定する方法も本明細書に記載する。本発明の方法は、治療前に得られた血液誘導性試料（例えば、血清または血漿）を質量分析法に供し、該質量分析法により明らかにされる該試料中のプロテオミクスシグナチャーに基づいて判別することに基づく。血液誘導性試料の使用は、免疫系の循環マーカーに関する理解を付与することにより、免疫療法に対する世界的規模での感受性を測定する可能性を拡大するため、その使用は重要である。その上、該方法は、患者の試料を複雑で時間のかかるアッセイを行う必要がなく、あるいは患者から腫瘍試料を取得する必要がなく、血液誘導性試料より簡単な質量分析試験を介して迅速に行われ得る。該試験は、仮に患者が利益を受ける可能性があると推定される場合には、該治療は患者に改善された転帰をもたらすであろうとの確信をもって進めることができ、それに対して患者が先立って利益を受ける可能性がないと推定される場合には、患者は他の治療（患者が利益を誘導する可能性があるか、または他の治療選択肢が考えられ得る）に向かって誘導され得る点で有用である。
酵母ベースの癌用免疫応答発生治療剤が、単独で、または他の抗癌療法との組み合わせで、患者（まず、本願明細書の上記または下記に記載のいずれかの予測方法に従う方法または試験により、酵母ベースの癌用免疫応答発生治療剤より利益を受ける可能性があると選択された患者）を治療するための方法（例えば、該試験または方法にて得られたスペクトルのクラス標識は、患者が酵母ベースの癌用免疫応答発生治療剤より利益を受ける可能性があることを示唆する）も本明細書に記載する。
また、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤（例えば、本明細書に記載のＧＩ−４０００）が、単独で、または他の抗癌剤と合わせて、患者（まず、本願明細書の上記または下記に記載のいずれかの予測方法に従う方法または試験により、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤より利益を受ける可能性があると選択された患者）を治療するための方法（例えば、該試験または方法にて得られたスペクトルのクラス標識は、患者が酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤より利益を受ける可能性があることを示唆する）も本明細書に記載する。本発明のこれらのいずれの治療方法においても、該方法は酵母ベースの免疫応答発生治療剤（以下に限定されるものではないが、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤を含んでもよい）を、癌抗原を発現する癌を有する対象であって、本明細書に記載の本発明のいずれかの推定方法に従う試験によって該組成物の投与より利益を受ける可能性があると同定または選択された対象に投与する工程を含む。
ＧＩ−４０００−０２を記載する実施例：膵臓癌におけるＧＩ−４０００およびゲムシタビンについてのフェーズ２ｂ臨床試験
ＧＩ−４０００−０２は、膵臓癌を切除したＲ０またはＲ１の患者においてＧＩ−４０００＋ゲムシタビンまたはプラセボ＋ゲムシタビンの、完全登録制のフェーズ２ｂの無作為で二重盲検のプラセボを対照とする多施設でのアジュバント臨床試験である（図１を参照）。Ｒ０切除は外科的縁で微視的残留疾患のないものと定義される。Ｒ１切除は外科的縁で微視的残留疾患があるものと定義される。Ｒ０およびＲ１の患者は予想される生存率が異なっており、Ｒ０患者は平均してより長命である。この臨床試験にて、腫瘍組織の一の試料をスクリーニングの間に各対象より取得し、Ｒａｓ変異の存在について該腫瘍を評価した。対象が生成物関連の変異を有する場合、該対象の腫瘍の特異的なＲａｓ変異と適合するＧＩ−４０００酵母ベースの免疫治療生成物を投与した（ＧＩ−４０００シリーズは以下に詳細に記載する）。
研究集団は、米国の３９カ所の施設と、５カ所の国際施設で登録されているＲａｓ変異の膵臓癌を切除した１７６名の対象からなる。切除後に、切除状態により対象を将来的に２群に分け、その両方のＲ１およびＲ０群を一対一の割合で無作為に２つの治療群に割り当て、４０Ｙ．Ｕ．（「Ｙ．Ｕ．」は「酵母ユニット（Yeast Unit）または酵母細胞等価物である：１Ｙ．Ｕ．＝１０００万個の酵母細胞である」のＧＩ−４０００＋ゲムシタビンまたはプラセボ＋ゲムシタビンのいずれかを投与する。３９人のＲ１対象を登録し、その内の１９人をＧＩ−４０００＋ゲムシタビン群に、２０人をプラセボ＋ゲムシタビン群に割り当てた。１３７人のＲ０対象を登録し、その内の６９人をＧＩ−４０００＋ゲムシタビン群に、６８人をプラセボ＋ゲムシタビン群に割り当てた。４０Ｙ．Ｕ．用量のＧＩ−４０００を４つに分けて、アームとレッグの各々に１０Ｙ．Ｕ．皮下注射で投与した。切除とゲムシタビン療法を開始する間にＧＩ−４０００またはプラセボのいずれかを対象に週に３回投与した。すべての対象を切除後の６週間と８週間の間に開始するゲムシタビンの毎月のサイクルを６回まで投与した。毎月のゲムシタビンの治療で予定されるブレークと一致するように、ゲムシタビンの各サイクル後に、ＧＩ−４０００またはプラセボを月毎に投与した。対象が研究を止めるか、体験している疾患が再発するか、または死亡するまで、ＧＩ−４０００またはプラセボの毎月の投与を続けた。結果に影響のあることが分かっている、次の予後因子：（ａ）リンパ節状態を膵臓癌細胞の微視的証拠の有無によって規定した。陽性結節は予後指標不良であると考えられる；（ｂ）患者の総体的な健康を反映する５段階（０、１、２、３、４）評価からなる一般状態であって、０は最も好ましい状態であり、４は最悪の状態である；（ｃ）腫瘍組織量の基準として役立つ膵臓癌細胞の血中バイオマーカーであるＣＡ１９−９。高レベルのＣＡ１９−９は臨床結果不良と関連付けられる；（ｄ）一般に、結果不良と関連付けられる大きさよりも大きな、数センチに及ぶ大きさの腫瘍；および（ｅ）Ｉ段階からＩＶ段階の範囲にあり、原発性腫瘍の大きさ、局所浸潤の程度、局部リンパ節の掛かり合いの程度、原発性腫瘍から離れた癌の全身的広まりからなる、標準化された評点システムに基づいて特定される腫瘍段階；を含む、多くの疾患特異的基線特徴を評価した。
この臨床試験の主要エンドポイントは再発なしでの生存であった。副次エンドポイントは、全生存、免疫応答およびＣＡ１９−９などの疾患組織量のバイオマーカーを包含した。現在まで、ＧＩ−４０００とアジュバントのゲムシタビンとの組み合わせが、Ｒａｓ−変異陽性膵臓癌対象の生存において臨床的に有意義な効果の証拠：（ａ）ＯＳ中央値にて２．６ヶ月の改善（１４．６ヶ月に比べて１７．２ヶ月）；１８％の相対的改善；（ｂ）ＧＩ−４０００の免疫応答者でＯＳ中央値における５．０ヶ月の改善（１４．６ヶ月に比べて１９．６ヶ月）；３４％の相対的改善；（ｃ）１年間の生存にて１６％の利益（７２％対５６％）；３０％の相対的改善；および（ｄ）ＲＦＳ中央値にて１ヶ月の改善（ＧＩ−４０００／ゲムシタビンで９．６ヶ月対８．５ヶ月）；１３％の相対的利益；を含む証拠を示した。加えて、ＧＩ−４０００は免疫原性であって、Ｒ１対象において十分に耐性があり：（ａ）ＧＩ−４０００／ゲムシタビンのアームへの注射では７／１５（４７％）であるのに対して、プラセボ／ゲムシタビンのアームでは１／１２（８％）がＲａｓ変異特異的Ｔ細胞応答を有し；（ｂ）ＧＩ−４０００は十分に耐性であり、現在まで有意な新規毒性の証拠はない。さらなる結果が、下記に詳細に記載される、本発明の推定質量スペクトル法が開発された後に観察された。
推定質量分析法
本明細書に開示の質量分析法の一例が、上記の膵臓癌のＧＩ−４０００＋ゲムシタビンのフェーズ２ｂ臨床試験における試料研究と合わせて、下記に詳細に記載される。ＧＩ−４０００＋ゲムシタビンの組み合わせを受ける患者はすべてではないが、何人かは、ゲムシタビンとプラセボを受ける患者と比べて、ＲＦＳおよびＯＳにて実質的な改善を体験する。治療に先立って、一の患者が、利益を受ける可能性のある（下記検討にて「スロー」と称する）患者のクラスの一員であるか、あるいは反対に利益を受ける可能性のない（下記検討にて「クイック」と称する）患者のクラスの一員であるかどうかを推定する判別子が開発された。図２Ａおよび２Ｂは、ＧＩ−４０００と、ゲムシタビンとの組み合わせから利益を受ける可能性のあることを示す、プロテオミクスシグナチャーに関して陽性の患者の無再生生存（ＲＦＳ）および全生存（ＯＳ）のカプラン−マイヤープロットである。図２Ａは遅延再発（「スロー」）プロテオミクスシグナチャーの患者についての処理群（ＧＩ−４０００に対するプラセボ）でのＲＦＳを示すのに対して、図２Ｂは遅延再発プロテオミクスシグナチャーの患者についての処理群でのＯＳを示す。プロットは、膵臓癌の治療にて、本明細書に開示の質量分析法のＧＩ−４０００とゲムシタビンとの組み合わせより利益を受ける可能性のある患者を同定する能力を示す。さらには、アームの治療にて、ＧＩ−４０００とゲムシタビンとの組み合わせより利益を受けるか、または利益を受けなかった患者を同定する本発明者の方法の能力を示す本発明者らの研究からのカプラン−マイヤープロットを、下記の図３および４と合わせて検討する。
本発明者らの研究にて、質量スペクトルの発生に適する試料は、上記に詳細に記載されるＧＩ−４０００−０２に登録される９０人の患者から利用可能であった。試料は血液に由来し、この特定のケースでは、従来の密度に基づく分離方法により全血より得られる血漿であった。全血（ヘパリンナトリウム処理、ガラス管中）を室温での夜間のデリバリーで臨床試験サイトよりGlobeImmune研究所で受け取り、採血の３０時間以内に加工処理した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離するのに、血液をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ；Gibco／InVitrogenカタログ番号１４１９０−２５０）でおよそ１：１に希釈し、Leucosep（登録商標）管（Greiner）中にフィコールハイパック（Ficoll-Hypaque）勾配にて積層させ、１０００ｘｇで外界温度で１０分間遠心分離に付した。細胞をその勾配より収穫する前に、Ｄ−ＰＢＳで希釈した血漿を吸引し、−８０℃で凍結させた。本発明の質量スペクトル法に使用する前に、試料を解凍し、等分し、次に使用するまで一旦再凍結させた。
標準的希釈直打ち法（ＤＮＳ）および係属中の米国仮特許出願番号６１／６５２，３９４（２０１２年５月２９日出願）（出典明示により本明細書の一部とする）に記載の「ディープＭＡＬＤＩ」法を用いて、試料よりスペクトルを作成し、下記により詳細に記載する。
本発明者らは、希釈直打ち法について、米国特許第７，７３６，９０５号およびBiodesix,Inc.の上記した特許文献に記載されるように、VeriStrat試験を行ったが、判別子は有用な情報をもたらさないことが判明した。VeriStratの不良群（Poor）試料はほとんど確認されず、いずれの治療アームにおいても、VeriStratの良好群（Good）および不良群の患者の間で有意な違いは見いだせなかった。
かくして、新しいトレーニングセットでの新たな判別子を定める必要があった。本発明者らはVeriStratの特徴が癌の存在に対する宿主免疫性および炎症応答と関連していると考えるため、本発明者らはそれらが有用である可能性があると考える（米国特許出願公開番号２０１１／０２０８４３３を参照のこと）。実際、VeriStrat試験に用いられたスペクトルの質量スペクトルの特徴部（下記の表３および４を参照のこと）が、膵臓癌の研究にて判別するのに使用され得る；ただし、下記に示されるように、判別子のトレーニングセットは適切に規定され、スペクトルの前処理操作は変更されていることを条件とする。判別子のデザインおよびトレーニングセットのこの発見を次のセクションに記載する。
判別子のデザイン
ＧＩ−４０００治療で患者の予後がより良いおよびより悪い群に分けるのに判別子を設計する際に最初にしたことは、より良いおよびより悪い再発なしでの生存（ＲＦＳ）の患者のトレーニングセットを規定することであった。ＲＦＳの時間分布に基づいて、２７６日前に再発した患者をクイック再発（「クイック」）患者として、および５００日前に再発事象のない患者をスロー再発（「スロー」）患者として規定することを決定した。この操作で、「クイック」群に２０人の患者、および「スロー」群に１４人の患者、中間時点でＲＦＳの９人の患者が付与された。（アサイド：実際に、２７６日前に２１人のＲＦＳ事象の患者がいるが、この計画を開始した際に、これらの患者の一人のスペクトルを目的から外し、そこでこの患者は、初めは、「希釈直打ち法」および１５０，０００回のショットのディープＭＡＬＤＩ分析のトレーニングセットに含められず、判別子を全群に適用する場合に用いられるに過ぎなかった。５００，０００回のショットのディープＭＡＬＤＩ分析では、この患者の血漿試料が治療の間に採取されるため、この患者をトレーニングセットに含め、長い再発時間を有する一人の患者を排除した。）「スロー」および「クイック」群を特定するのに異なるカットオフ点を設けることにより、あるいはその群を特定するのに死に至るまでの時間が速いか遅いかとすることで、同様の結果を得ることが可能であろう。
「クイック」および「スロー」群のトレーニングセットを特定する場合、比較され得る質量スペクトルは、米国特許第７、７３６，９０５号の方法（バックグラウンド除去法、部分イオン電流正規化法およびスペクトルアライメントを含む）を用いて前処理された。該前処理の細かな操作は希釈直打ちスペクトルおよびディープＭＡＬＤＩスペクトルの場合と異なるが、その一般的操作は同様である。最初に、バックグラウンドを推定し、スペクトルから除去する。そのスペクトルを部分イオン電流に正規化する。部分イオン電流を計算するのに使用される領域は、質量スペクトルの強くおよび最も変化するピークを排除する限り、種々の方法で選択され得る。その結果を下記を示す希釈直打ち判別子の例において、部分イオン電流の計算および正規化に使用される領域は３ｋＤａ−１１．４ｋＤａ、１３ｋＤａ−１５ｋＤａおよび１６．１−３０ｋＤａであるが、他の選択を行うこともできる。例えば、５００，０００回のショットのディープＭＡＬＤＩスペクトルをベースとする判別子では、部分イオン電流の正規化に使用される領域は４．９ｋＤａ−６．５４ｋＤａ、１２ｋＤａ−１３．５ｋＤａ、および１８ｋＤａ−２７ｋＤａであった。そのスペクトルのノイズを推定する。そのスペクトルのピークを検出すれば、アライメント点のセットを用いて該スペクトルを一列に並べることができる。アライメント点の一のセットは、一列に並べられるスペクトルの大部分に共通する、スペクトルにて検出されるピークのサブセットを選択することによりコンパイルすることができるか、あるいはこれまでの経験から大抵のスペクトルに存在することが分かっているピークより事前に選択され得る。これらは次のｍ／ｚ位置：６４３４．５、６６３２．１、１１６８６．９、１２８６４．８、１５１３１．１、１５８７１．５および２８１０２．５にピークがある。仮に試料から質量スペクトルデータを取得するためにディープＭＡＬＤＩ方法（後記する説明を参照のこと）が使用されるとすれば、該スペクトルの他の特徴部を部分イオン電流の正規化およびスペクトルアライメントに用いうることは特筆に価し、ディープＭＡＬＤＩスペクトルにさらに適するバックグラウンド除去のための前処理方法を用いてもよい。例えば、５００，０００回のショットのディープＭＡＬＤＩスペクトルをベースとする下記の判別子において、以下のアライメント点：３３１５、４１５３、４４５７、４７１０、４８５５、５２８９、６４３１、６６２９、６８３５、７５６１、７９３１、８２０２、８８０７、８９１２、９７０７、１２８５６、１３７３５、１４０３１、１４１３４、１５１１７、１５８５６、１７３６６、２１０４６、２７８９０、２８０１９、２８０６７および２８２２８を用いた。しかしながら、スペクトルを獲得する両方の方法で、アライメント点の数および位置について他の選択をすることが可能であることに注意すべきである。
スペクトルの前処理はスペクトルを相互に比較できるようにし、次にそれらを用いて、外部考察より特定される特徴部に基づいて、判別子を作成することができ、あるいはスペクトル群を比較し、群間で異なった形で発現される特徴部を決定することができ、次にこれらの特徴部のサブセットを選択し、このセットの特徴部を用いて判別子を構築することができる。下記に示される結果を有する判別子の一つは、外部考察より特定される特徴部を用いて構築された。
VeriStrat判別子にて使用される質量スペクトル（下記の表３および４を参照のこと）は腫瘍の存在に対する宿主応答と関連付けられる炎症過程と相互関係を示し（出典明示により本明細書の一部とされる本願出願人の先願である２０１１年２月２２日付け出願の米国特許出願番号１２／９３２，２９５を参照のこと）、これは免疫系の腫瘍に対する応答と関連付けられると考えられるため、ＧＩ−４０００治療の後に患者の再発時間より特定されるスペクトルの新たな基準となるセットでの８つのVeriStrat特徴部を使用する試みは興味深かった。結果を下記の表３に示す。しかしながら、その比較の間に２つの基準となるセット群の間を区別することが判明した特徴部を用いて他の判別子を構築できた。希釈直打ちスペクトルでは、これらの特徴部は、１または複数の以下の特徴部を包含する：
Figure 2015528110
表１の１または複数の特徴部は、判別子にて用いるための表２、３および５に示される特徴部と合わせて使用され得る。
１５０,０００回ショットの「ディープＭＡＬＤＩ」スペクトルでは、判別に有用な特徴部として、以下：
Figure 2015528110
Figure 2015528110

Figure 2015528110

に示される特徴部が挙げられる。
５００,０００回ショットの「ディープＭＡＬＤＩ」スペクトルでは、判別に有用な特徴部として、以下：
Figure 2015528110
Figure 2015528110

Figure 2015528110

Figure 2015528110
に示される特徴部が挙げられる。
スペクトルの正規化を改善することでさらなる差別化ピークが明らかとなり、かくして上記した一覧がすべてであると考えられるものではないことに留意する。正確なｍ／ｚの位置は前処理の間のスペクトルアライメントに応じて再びわずかなシフトに供される。
Ａ． 希釈直打ちスペクトルをベースとする判別子
図３Ａ−３Ｆのプロットは、基準セットの「スロー」および「クイック」の定義（「スロー」＝５００日前に再発事象なし、「クイック」＝２７６日前の再発）、VeriStratの特徴部の定義（表３および４）および希釈直打ちの前処理スペクトルを用いて構築された判別子の成果を示す。該判別子をＧＩ−４０００（治療）アームのスペクトル、およびプラセボ（対照）アームの４６種のスペクトルに適用した。判別子はＫ−最近傍判別アルゴリズム（米国特許第７，７３６，９０５号を参照のこと）に基づいてスペクトルに対するクイックまたはスローのクラス標識を生じさせ、ここで図３Ａ−３ＢはＫ＝１での判別を示し、図３Ｃ−３ＤはＫ＝３での判別を示し、図３Ｅおよび３ＦはＫ＝５での判別を示す。
図３Ａ−３Ｆに示されるこれらの結果から、本発明者らは治療アーム（ＧＩ−４０００＋ゲムシタビン）を２つの群、「クイック」および「スロー」群に分けることが可能であることが分かる（ここで、「クイック」群は「スロー」群よりも、ＲＦＳおよびＯＳの両方において、有意に悪化した転帰を有する）。反対に、対照アーム（ゲムシタビン＋プラセボ）では「クイック」および「スロー」群の両方で同様のＲＦＳを有する。「スロー」群ではＧＩ−４０００に味方してＲＦＳの治療利益がある。ＯＳにおける治療効果のケースでは解読が困難であり、「スロー」群のＧＩ−４０００の添加からの治療利益は、再発後に受ける治療によって希釈されるかもしれない。ＯＳの解析はまた、コホートの３８％での事象の打ち切りによっても困難となる。
「クイック」治療アームが対照アームよりも低いことは、「クイック」患者がＧＩ−４０００＋ゲムシタビンでの治療から利益を受けなかったことを意味することに注意する。従って、免疫応答を刺激する治療より利益を受ける可能性がない患者を予測する能力を有する判別子が提供される。
Ｂ． １５０,０００回ショットのディープＭＡＬＤＩをベースとする判別子
前処理されたディープＭＡＬＤＩスペクトルおよび上記のトレーニングセットの「クイック」および「スロー」群の比較より選択される特徴部に基づく判別子の成果を図４Ａおよび４Ｂに図示し、ここで図４Ａは治療アームではＲＦＳにおけるクイックおよびスロー患者を分けるが、対照アームではそうでない、判別子の能力を示し、図４Ｂは治療アームではＯＳにおけるクイックおよびスロー患者を分けるが、対照アームではそうでない、判別子の能力を示す。判別子に使用される特徴部は表４の８個の特徴部に近づくように選択された。ＲＦＳおよびＯＳの両方の治療アームで「クイック」および「スロー」群の間で有意な分離が観察されたが、対照アームではそうではなかった。顕著に異なるものではないが、「スロー」群は、特にＲＦＳで、プラセボの対照アームと比較してＧＩ−４０００治療でより良好な転帰の傾向を示す。
図４Ｃ−４Ｄ、４Ｅ−４Ｆおよび４Ｇ−４Ｈは、試料のディープＭＡＬＤＩ質量分析および上記した表２に列挙されるディープＭＡＬＤＩの７７個の特徴部のサブセットを用いて３種のさらなる判別子についてＲＦＳおよびＯＳのカプラン−マイヤープロットである。３種の判別子はすべて、２７６日前の再発時間を有する患者（「クイック」）からの２０種のスペクトルと、５００日前に再発事象または打ち切りのない患者（「スロー」）からの１４種のスペクトルとの基準セット、ディープＭＡＬＤＩスペクトルを最適化するための同じ前処理操作、およびＫ＝５のＫ−最近傍判別アルゴリズムを用いた。
図４Ｃおよび４Ｄの判別子は、上記の表２の７７種の候補特徴部の一覧からの特徴部のサブセットを用いた。本発明者らはｐ値で７７種の特徴部をソートし、ｐ値の低い（その相対的発現差を記載する）２０種の特徴部を用いた：
Figure 2015528110
図４Ｅおよび４Ｆは第３のディープＭＡＬＤＩ判別子についてのＲＦＳおよびＯＳのカプラン−マイヤープロットを示す。この例で、本発明者らはVeriStrat特徴部の領域（表３および４）にある、あるいは該領域と強く相関する、スペクトルの一覧（表２）からの特徴部を用いた。
Figure 2015528110
第４のディープＭＡＬＤＩ判別子についての結果を図４Ｇ−４Ｈに示す。この判別子で、本発明者らは群間におけるその発現レベルが、図４Ｅ−４Ｆの判別子の結果と反対方向に相互に関連付けられ、VeriStrat特徴部に関連付けられない特徴部のサブセット（表２）を用いた。
Figure 2015528110
図４Ａ−４ＨのディープＭＡＬＤＩ判別子が、治療アームにてクイックおよびスロー患者を明確に分離するのに対して、対照アームではほとんどあるいは全く分離を示さず、かくして図３Ａ−３Ｆの「希釈直打ち」判別子と同様の成果を示すことに注意する。
図３Ａ−３Ｆおよび４Ａ−４Ｈの結果を解釈するにおいて、基準セットの判別子が解析に使用されるため、上記した結果は「クイック」および「スロー」群の間の分離を過大に評価する傾向にある。残念なことに、判別子の成果を独立した方法で試験するために、それと一緒に利用できる確認セットはまだなかった。かくして、判別子の成果を評価する別の方法を提供するために、後記の「判別子の交差検定」のセクションに記載されるように、交差検定分析を実施した。
Ｃ． ５００,０００回ショットのディープＭＡＬＤＩスペクトルをベースとする判別子
対照アームではできないが、治療アームにおけるＲＦＳにて「クイック」および「スロー」患者を分離することのできる判別子はまた、５００,０００回ショットのディープＭＡＬＤＩスペクトルを用いて構築され得る。ディープＭＡＬＤＩスペクトルを、このセクションで提示されるすべての判別子について全く同じ前処理を行い、これらの判別子のトレーニングセットはまたも上記される「クイック」および「スロー」の再発群であった。このディープＭＡＬＤＩ分析の時点で、最新の生存データを利用し、これらの判別子の成果の分析ではセクションＡおよびＢに提示されるそれらの判別子と関連する最新のデータを使用した。各判別子に用いられる差別化特徴部のセットは上記の表５に示される９７個の特徴部のサブセットであった。Ｋ−最近傍判別アルゴリズム用に選択されたＫ近傍体を各判別子用に最適化した。図１３Ａ−１３Ｌは、５００，０００回ショットのディープＭＡＬＤＩスペクトルおよび表５に列挙される９７個の特徴部のサブセットを用いて構築される６種の判別子の成果を示すＲＦＳおよびＯＳのカプラン−マイヤープロットである。
図１３Ａおよび１３Ｂの判別子は表５に示される一覧からの４２個の特徴部のサブセットを用いた。それらの判別子は、VeriStrat特徴部（表３および４）のｍ／ｚ領域に含まれる特徴部と、トレーニングセットの「スロー」および「クイック」群間を差別化するための低単変量ｐ値に基づいて選択されるさらなる特徴部との両方を含むように選択された。この判別子で、Ｋ＝３であることが最適であることが判明し、使用される特徴部の中心（ｍ／ｚ）を表６の第１列に列挙する。
Figure 2015528110
Figure 2015528110
図１３Ｃおよび１３Ｄの判別子は、トレーニングセットの「スロー」および「クイック」群間を差別化するための単変量ｐ値に、および「スロー」および「クイック」群間の特徴部の振幅値の割合に基づいて選択される、表５に示される一覧からの３２個の特徴部（所定の特徴部の中心 ｍ／ｚ）のサブセットを用いた。この判別子はＫ＝３を、および表６の第２列に列挙される特徴部を用いた。１９個の特徴部がこの判別子およびこれまでのものに共通するが、この判別子はまた、これまでの判別子に使用されなかった１３個の特徴部を含有し、さらにはカプラン−マイヤープロットに関して同様の成果を付与する。
図１３Ｅおよび１３Ｆの判別子を上記の判別子の基準と同様の基準を用いて開発し、Ｋ＝５を用いた。使用される特徴部を表６の第３列に列挙する。該判別子は図１３Ａおよび１３Ｂの判別子と共通するその２５個の特徴部のうち２３個を有し、図１３Ｃおよび１３Ｄの判別子と半分以上で共通した。判別子に選択される特徴部の類似性に拘わらず、カプラン−マイヤープロットにおける成果は、この判別子がＧＩ−４０００からの治療効果を予測するよりもむしろ、転帰を予測するものであることを示唆する。
図１３Ｇおよび１３Ｈの判別子は、表６の第４列に列挙される、図１３Ｅおよび１３Ｆの判別子の特徴部の１３個のサブセット、およびＫ＝５を用いた；カプラン−マイヤープロットは最初の２種のディープＭＡＬＤＩ判別子とより類似する成果を示す（図１３Ａ−Ｄ）。
図１３Ｉおよび１３Ｊの判別子を表３のVeriStrat特徴部のｍ／ｚ領域にない特徴部を用いて構築した。しかしながら、カプラン−マイヤープロットについて、VeriStrat特徴部のｍ／ｚ領域からの特徴部を含む判別子と同様の成果のあることが分かる。使用される特徴部を表６の第５列に列挙し、この判別子ではＫ＝７である。
図１３Ｋおよび１３Ｌの判別子は、表６の最後の列に列挙される８個の特徴部を用いるだけで、Ｋ＝３である。８個のうち４個の特徴部は他のいずれの判別子にも使用されなかった。さらに、カプラン−マイヤープロットで評価した成果は他の試験した判別子と著しく異なるものではない。
これらのディープＭＡＬＤＩ判別子の大部分はまた、治療アームにて「クイック」および「スロー」と判別された患者を明確に分離するのに対して、対照アームではほとんど分離を示さず、かくして「希釈直打ち」判別子およびあまりショットしないディープＭＡＬＤＩに基づく判別子と同様の成果を示すことに留意する。
判別子の交差検定
Ａ．一般的定式化およびその「希釈直打ち」判別子への適用
図３Ａ−３Ｆに示され、かつ上記される「希釈直打ち」判別子の交差検定を図５に示される操作に従うことで行った。
図５の工程１００の操作にて、判別に用いられる特徴部（ピークまたはｍ／ｚ領域）および前処理工程（バックグラウンド除去、正規化およびアライメント）を固定した。次に、工程１０２、１０４、１０５および１０６を、ループ１０８で示される繰り返し形式にて実施した。工程１０２にて、判別子の成果を試験するのに、１０個のスペクトルを無作為に選択して除外する。工程１０４にて、スペクトルのレファレンスセットを、同じ再発までの時間（ＴＴＲ）基準、すなわち２７６日前の再発で定められる「クイック」と、上記で定義される「スロー」（５００日前に再発のない）とを用いて残りの３４個のスペクトルより選択した。工程１０５で、Ｋ−最近傍判別アルゴリズムのＫ値を選択した。工程１０６で、判別子の成果を、ハザード比（ＨＲ）およびスペクトルの「試験セット」での中央値について評価した。スペクトルの試験セットは、レファレンスセット（工程１０４）に含まれない治療アームのスペクトル、すなわち工程１０２で除外された１０個のスペクトル＋２７６日と５００日の間のＴＴＲの患者から由来の他のいずれかのスペクトルである。この過程（１０８）を何度も（この例では７０回）繰り返した。
図５の操作は、検討中での特定の研究で付与されるレファレンスおよび試験セットを適切に選択することで一般的適用性があることが理解されよう。
図５の交差検定は、該確認が判別子の成果を次のように過小評価するため、その下限を提供する傾向にある：
１． 交差検定する判別子のレファレンスセットは、成果に衝撃を与えうる、最初の判別子のセットよりも小さい。
２． レファレンスセットに含まれない試料の試験セットは、上記した１０個の中間再発スペクトルよりも大きいが、まだ小さい。このことは計数的統計にて大きな可変性をもたらす可能性があり、あるケースで、群の大きさが極めて小さい場合に、これらの統計は無意味であり得る。
３． 試験セットは全体としては治療アーム群を代表するものではない。該セットには中間の再発時間を有する患者が高割合で含有される。この不均衡は試験セットの結果を試験セット以外での他の群（例えば、対照アーム）と比較することを難しくする。
これらの制限があるにも拘わらず、「クイック」および「スロー」群の定義およびVeriStrat特徴部を用いて構築される判別子の交差検定分析により、ある有用な洞察が得られた。図６は、対照アーム、全治療アームおよび試験セット（判別子のレファレンスセットを除く治療アーム）についての交差検定分析においてリアリゼーション（realization）が７０と計算された「クイック」および「スロー」群の間のハザード比の分布を示す。すべての判別子は対照アームで１に近いＨＲを生成したのに対して、試験セットでのＨＲの中央値は、全治療アームでの値に近い、３．１であった。
図７Ａおよび７Ｂは、交差検定分析における試験セットでの「クイック」および「スロー」群におけるＲＦＳ中央値の分布を示す。図７Ａにて、「スロー」群の中央値は３８２日付近に集中しており、それに対して「クイック」群での中央値は２７４日付近に集中している。図７Ｂは試験セットにおける「クイック」および「スロー」群間の中央値の差異の分布を示す。中央値間の差異は１１１日付近に集中し、臨床的に有意義な差異は極めて小さなリアリゼーションで「クイック」群よりも「スロー」群で小さな中央値を示す。試験セットと対照アームの比較はその２つの群間の再発時間の分布の不均衡により複雑となるが、対照群および試験セット内の「クイック」および「スロー」群での中央値の観察は、その「スロー」試験セットの中央値が、「クイック」および「スロー」対照群の中央値の上に優勢に位置し、それらが順次に「クイック」試験セットの中央値の上に位置することを示す。交差検定分析における対照アームと試験セットの「クイック」および「スロー」群の中央値の分布をプロットして示す、図８を参照のこと。
さらに、試験セットと対照アーム間の「スロー」群の中央値の差異の分布は、ほとんど全てのリアリゼーションにて、母集団にて不均衡であるにも拘わらず、試験セットのＲＦＳ中央値が対照アームの中央値よりも大きいことを示す（試験セットと対照アーム間の「スロー」群についての中央値における差異の分布をプロットして示す図９を参照のこと）。ＲＦＳ中央値の平均的差異はおよそ６０日であり、意義のある臨床的差異でもある。
ＯＳの交差検定分析は、最初に利用可能な臨床データにおいて全コホートの３分の１を越えて打ち切られたデータがあることで妨げとなる。
交差検定分析の別の結果は、スロー判別：クイック判別の割合の、Ｋ−最近傍判別子にて使用されるＫの選択への依存度を決定することであった。対照アームにおけるスロー：クイックの判別の割合の分布を判別子にて使用される異なるＫ値に対してプロットして示す図１０Ａを参照のこと。図１０Ｂは種々のＫ値について交差検定分析の試験セットで計算したハザード比の分布をプロットして示す。本発明者らが交差検定した場合、７０回の反復の各々において、３、５または７のＫ値を選択した（図５、工程１０５）。本発明者らはおおまかに各々の１／３を有し、それでＫ＝３、５および７の分布の各々において少なくとも２０の値があった。Ｋ＝１で生じたことを理解するために、本発明者らはＫ＝１を用いる公差検定を１９回反復して再び行った。スローのクイックに対するハザード比は、Ｋ＝５の試験セットにおいて最大であることが判明した。図１０Ｂはまた、７０回すべての交差検定分析の反復について対照アームで取得されるハザード比の分布をプロットして示す。図１０Ｂは対照アームではどのような値のＫが使用されても大きな違いはなく、その分布が極めて狭いことを示す。図１０Ａと一緒に考慮した場合、図１０Ｂは、Ｋ−最近傍判別アルゴリズムにて複数のＫの選択が可能であるが、Ｋ＝５がおそらくは好ましい選択であることを示す。
Ｂ． ディープＭＡＬＤＩスペクトルをベースとする判別子の交差検定
同じ交差検定方法の、上記に示される４つの１５０,０００回ショットのディープＭＡＬＤＩスペクトルをベースとする判別子への適用は、そのうちの２つがＧＩ−４０００の添加からの相対的治療利益を予測する能力に関して優れた成果を有することを示す。図１４は、交差検定の対照アームおよび試験セットの両方で図４Ａ−４Ｈから由来の４つの判別子についてＲＦＳで「クイック」および「スロー」と判別される患者間のハザード比の分布を示す。図４Ｃ−４Ｆの判別子について観察されるハザード比の中央値は試験セットおよび対照アームで類似するが、他の２つの判別子で観察されるハザード比の中央値は対照アームでよりも試験セットにて大きく、このことは対照アームよりも治療アーム内でＲＦＳでの「クイック」および「スロー」群間のより大きな分離を示すカプラン−マイヤープロットからの成果評価を支持し、さらに判別子がＧＩ−４０００をゲムシタビンに添加するコントロールレジメにて推定能を有することを支持する。
Ｃ． ５００,０００回ショットのディープＭＡＬＤＩスペクトルをベースとする判別子の交差検定
同じ交差検定方法をまた、上記に示され、図１３Ａ−Ｍにて評価される、６つの５００，０００回ショットのディープＭＡＬＤＩスペクトルをベース判別子に適用した。交差検定の対照アームおよび試験セットの両方での各判別子のハザード比の分布を図１５に示す。これは、全治療および対照アームを示す、カプラン−マイヤープロットの成果における明確な違いが、成果を交差検定方法で評価した場合に、常に維持されるとは限らないことを示すものである。加えて、交差検定においてでさえ、同様の性能特徴点を有する、特徴部の異なるセットを用いて多くの異なる判別子を構築することが可能なことも明らかである。
トレーニングセットでは「クイック」および「スロー」群のメンバーが同数でない可能性のあることに留意する。群の大きさが等しくない問題に対処するために、本発明者らは、一部に、本発明者らが治療アームにおいて有した再発時間の分布の結果である、相対的なレファレンス群の大きさを選択した。再発時間が２５０日と２７５日の間にある患者が多く発生したが、それはおそらくは、ＭＲＩ／ＣＴ検査の計画と一致したからであった。それで、それらの時間の間にある群を分けるための適当な環境はないようであった。しかしながら、本発明者らはとにかくより大きな再発群を考慮することがベターであり、そのためにこの群がより好ましいと決定した。Ｋ−最近傍判別アルゴリズムはレファレンスセットにおける群の異なる大きさを考慮して調整することができ、そのためにトレーニングセットにて群の大きさが等しくないことは、原則としては、問題ではない。
有用な実施試験
本明細書を通して開示されるように、有用な実施試験がこの開示の知見より得られる。一の態様は、本発明の試験方法が、特定の癌患者が酵母ベースの免疫応答発生治療剤を単独でまたは他の治療剤に加えるかのいずれかで投与することより利益を受ける可能性があるか、あるいは可能性のない一群の癌患者のメンバーであるかどうかを特定することである。さらに別の態様は、本発明の試験方法が、特定の癌患者が酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤（ＧＩ−４０００など）を単独でまたは他の治療剤に加えるかのいずれかで投与することより利益を受ける可能性があるか、あるいは可能性のない一群の癌患者のメンバーであるかどうかを特定することである。この特定は治療に先立ってなされうる。
一例では、該方法は、以下の工程：ａ）患者から血液誘導性試料を取得すること；ｂ）該血液誘導性試料の質量スペクトルを質量分析計を用いて取得すること；ｃ）プログラムされたコンピュータにて、所定の前処理工程を該質量スペクトルに対して行い、該前処理工程を行った後のスペクトルにおいてｍ／ｚの所定の範囲にわたって選択される特徴部の強度積分値を取得し、その強度積分値を他の癌患者から由来のクラス標識したスペクトルを含むトレーニングセットと比較し、質量スペクトルをクラス標識で判別することを含む。該スペクトルに割り当てられるクラス標識を用いて患者が酵母ベースの免疫応答発生治療剤を単独でまたは他の治療剤に加えるかのいずれかで投与する形態での治療より利益を受ける可能性があるか、あるいは可能性がないかどうかを予測する。
もう一つ別の例において、該方法は、以下の工程：ａ）患者から血液誘導性試料を取得すること；ｂ）該血液誘導性試料の質量スペクトルを質量分析計を用いて取得すること；ｃ）プログラムされたコンピュータにて、所定の前処理工程を該質量スペクトルに対して行い、該前処理工程を行った後のスペクトルにおいてｍ／ｚの所定の範囲にわたって選択される特徴部の強度積分値を取得し、その強度積分値を他の癌患者から由来のクラス標識したスペクトルを含むトレーニングセットと比較し、質量スペクトルをクラス標識で判別することを含む。該スペクトルに割り当てられるクラス標識を用いて患者が酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤を単独でまたは他の治療剤に加えるかのいずれかで投与する形態での治療より利益を受ける可能性があるか、あるいは可能性がないかどうかを予測する。
該試験をプロセス３００として図１１にてフローチャートの形態で示す。
工程３０２で、患者から血液誘導性試料を取得する。この例での試料は、該試料にある処理工程を付した後の血漿（例えば、従前の密度分離法により全血より得られた血漿）である。一の実施態様において、血液誘導性試料を３つのアリコートに分け、質量分析およびその後の工程３０４、３０６（サブ工程３０８、３１０および３１２を含む）、３１４、３１６および３１８を、各アリコートに対して、独立して行う。アリコートの数は変更可能であり、例えば４、５または１０個のアリコートがあってもよく、各アリコートをその後の処理工程に供する。
工程３０４で、試料（アリコート）を質量分析に供する。質量分析の好ましい方法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）−飛行時間（ＴＯＦ）の質量分析法であるが、いわゆる質量分析の「ディープＭＡＬＤＩ」法（その内容をそのまま本明細書に組み込む、２０１２年５月２９日付けで出願された係属中の米国特許仮出願６１／６５２，３９４に開示される方法）（下記参照のこと）を含む、他の方法も可能である。質量分析法は、当該分野で一般的であるように、強度値を多数の質量／電荷（ｍ／ｚ）値で表すデータ点からなる質量スペクトルを作成する。一の実施態様において、試料を解凍し、４℃で５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離に付す。さらに、試料をＭｉｌｌｉＱ水中に１：１０または１：５で希釈してもよい。希釈試料をＭＡＬＤＩプレート上の無作為に割り当てられた位置に３通りでスポットする（すなわち、当該分野にて知られている、３つの異なるＭＡＬＤＩ標的または「スポット」上にスポットする）。０.７５μＬの希釈試料をＭＡＬＤＩプレート上にスポットした後、３５ｍｇ／ｍＬ シナピン酸（５０％アセトニトリルおよび０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中）（０.７５μＬ）を添加し、ピペットを５回上下することで混合してもよい。プレートを室温で乾燥させてもよい。本発明の方針に従って試料を調製および処理するのに他の技法および操作を利用してもよいことを認識すべきである。
質量スペクトルは、スペクトルを自動または手動で収集するVoyager DE-PROまたはDE-STR MALDI TOF質量分析計を用い、リニアモードにて陽イオンで獲得されてもよい。（もちろん、他のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置、例えばBruker Corporationの装置を用いることもできる。）各試料について平均で２，０００個のスペクトルを生成するために、各ＭＡＬＤＩスポット内の７または５個の位置から７５または１００個のスペクトルを収集する。該スペクトルをタンパク質標体（インスリン（ウシ）、チオレドキシン（イー・コリ）およびアポミオグロビン（ウマ））の混合物を用いて外部較正する。
ディープＭＡＬＤＩ法が、下記に示される工程３０４にて、１のＭＡＬＤＩプレートのスポット、または複数のＭＡＬＤＩプレート上で使用されてもよいことに注意する。
工程３０６では、工程３０４で取得されたスペクトルを１または複数の所定の前処理工程に供する。前処理工程３０６を、汎用性コンピュータにて、工程３０４で得られた質量スペクトルデータについて操作するソフトウェア命令を用いて実行する。前処理工程３０６はバックグラウンド除去（工程３０８）、正規化（工程３１０）およびアライメント（３１２）を包含する。バックグラウンド除去の工程は、好ましくは、スペクトルにてロバストで非対称の推定されるバックグラウンドを生じさせ、該スペクトルから該バックグラウンドを取り除くことを含む。工程３０８は米国特許第７，７３６，９０５号（出典明示により本明細書の一部とする）に記載のバックグラウンド除去技法を用いる。正規化工程３１０はバックグラウンド除去されたスペクトルの正規化を含む。正規化は米国特許第７，７３６，９０５号に記載の部分イオン電流の正規化、または全イオン電流の正規化の形態とすることができる。米国特許第７，７３６，９０５号に記載の工程３１２は、正規化されたバックグラウンド除去のスペクトルを、使用されるトレーニングセットにおけるスペクトルを判別子によって調査することにより得ることができる、所定の質量スケールに並べる。前処理工程はまた、ＧＩ−４０００＋ゲムシタビンの臨床試験の上記した記載にていくらか詳細に記載される。しかしながら、部分イオン電流の正規化およびアライメントに使用される前処理工程の特性、例えば特徴部またはスペクトル領域は変化してもよい。
前処理工程３０６がなされると、プロセス３００はスペクトルにおいて所定のｍ／ｚの範囲で積分強度を取得する工程３１４に進む。正規化およびバックグラウンド除去された強度値をこれらのｍ／ｚ範囲にわたって積分しうる。この積分値（すなわち、対応する所定のｍ／ｚの範囲内の強度の総和）を一の特徴部に割り当てる。所定のｍ／ｚの範囲は、対応する特徴部のｍ／ｚの平均位置でそのピーク幅に対応する幅をもってその回りの間隔として定義されてもよい。この工程はまた、米国特許第７，７３６，９０５号においてさらに詳細に記載される。
工程３１４では、一の可能な実施態様において、スペクトルにおける強度の積分値を１または複数の次に示されるｍ／ｚの範囲で得る：
Figure 2015528110
一の実施態様において、以下の表４に列挙されるピークを中心とする、またはそのピークを取り囲む８個までのｍ／ｚの範囲でその値を取得する。これらのピークの有意性および発見方法は、米国特許第７，７３６，９０５号および米国出願番号１２／９３２,２９５（２０１１年２月２２日付け出願、米国２０１１／０２０８４３３として公開）（それらの内容をそのまま本明細書中に組み込む）にて説明されている。実際には、表３および４中の上記した幅（範囲）またはピーク位置は、例えば、スペクトルアライメントの実施の仕方で変動するため、多少変化してもよい。さらには、「ディープＭＡＬＤＩ」技法（以下の記載を参照のこと）を用いることで、判別に使用できる多数の特徴部がスペクトルで明らかとなることに注意する。希釈直打ち質量分析の場合、表１中の１または複数のピークを、または表１と表３および４の特徴部の組み合わせを判別に用いることができる。さらには、「ディープＭＡＬＤＩ」技法を用いることで、多数の特徴部がスペクトルで明らかとなり、その組み合わせも判別に使用され得ることに注意する。表２、５および６ならびに上記の図４Ａ−４Ｈの例を参照のこと。
工程３１６では、工程３１４で取得された値を一の判別子（その説明される実施態様においてＫ−最近傍（ＫＮＮ）判別子である）に供給する。判別子が他の多数の患者から由来のクラス標識したスペクトルのトレーニングセットを活用する。トレーニングセットは、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤を単独で、または他の抗癌治療剤と併用するかのいずれであってもよい、酵母ベースの癌用免疫治療剤などの免疫応答発生治療剤から利益をうけるか、または利益を受けないかのいずれかの患者からのクラス標識したスペクトルを含むであろう。例えば、上記した実施例に記載のＧＩ−４０００の実験でのトレーニングセットは、再発までに「クイック」および「スロー」な時間にある群のクラス標識したスペクトルを含んだ。かかるスペクトルに割り当てられたクラス標識は「クイック」、「スロー」、または「有益」、「無回答」、「良好」、「不良」等などの等価標識の形態を取りうる。ＫＮＮ判別アルゴリズムの工程３１４およびトレーニングセットへの適用は、本質的に、米国特許第７，７３６，９０５号に記載されるように、強度積分値と、多次元特徴部空間における所定のスペクトルの特徴部とを比較することからの距離計算であり、かつ多数決アルゴリズムである。他の判別子（確率的ＫＮＮ判別子、サポートベクターマシン、または別の判別子を含む）を用いうる。
工程３１８では、判別子は、スペクトル用の標識、例えば「クイック」または「スロー」を生成する。該方法は、単一アリコートで、または試料を３つのアリコートに分離して行うことができ、その中で工程３０４−３１８は所定の患者試料からの３つのアリコートで並行して行われる（あるいは如何なる数のアリコートも使用される）。工程３２０では、すべてのアリコートが同じクラス標識を生成するかどうかを決定するのにチェックがなされる。そうでないとすれば、工程３２２で示されるように未定義（または中間）結果に戻される。あらゆるアリコートが同じ標識を生成すれば、該標識は工程３２４に示されるように報告される。
本明細書に記載されるように、次に工程３２４で報告されるクラス標識を用いて患者を治療するように導く。例えば、判別工程に従って、「クイック」と標識された膵臓癌のそれらの患者は、酵母ベースの癌用免疫治療剤（酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤であってもよい）などの免疫応答発生治療剤の単独での、あるいは他の抗癌剤（ゲムシタビンを含む）と併用するかのいずれかの治療から利益を受ける可能性がないと予測される。もう一つ別の例として、判別後の膵臓癌患者のスペクトルのクラス標識が該試験に従って「スロー」と同定されるならば、その場合には、該患者は、酵母ベースの癌用免疫治療剤（酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤であってもよい）などの免疫応答発生治療剤を単独で、あるいはゲムシタビンと併用するかのいずれかから利益を受ける可能性があると予測され、該患者は酵母ベースの癌用免疫治療剤（酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤であってもよい）などの免疫応答発生治療剤を単独で、あるいはゲムシタビンと併用して投与することで治療を進めることとなる。
工程３０６、３１４、３１６および３１８は、典型的には、前処理工程３０６、工程３１４での強度積分値の取得、ＫＮＮ判別アルゴリズムの工程３１６での適用、およびクラス標識の工程３１８での生成をコードするソフトウェアを用いてプログラムされた汎用コンピュータで実施されることが理解されよう。工程３１６で使用されるクラス標識したスペクトルのトレーニングセットは、コンピュータの記憶媒体に格納されるか、または該コンピュータとアクセス可能な記憶媒体に格納される。
コンピュータをプログラムする方法は、有利には、米国特許第７，７３６，９０５号に記載されるように、実験室試験処理センターで実施されてもよい。
Figure 2015528110
注記）表４に特定されるピークのｍ／ｚ値は、トレーニングセットにて使用されるスペクトルをすべて並べるのに使用されるスペクトルアライメントプロセスに、および前処理にて試験スペクトルを並べることに応じて、ｍ／ｚ値は高いまたは低い方向に少しシフトしてもよい。
図１２は、本発明の方法を行うのに使用され得る実験室試験処理システム４００の概ブロック図である。該システム４００は、例えば試験サービスプロバイザービジネスにて、多数の患者試料用の実験室試験処理センターとして機能する実験室で実施されてもよい。該システム４００は、血液誘導性試料４０２（全血、血漿、血清、あるいは他の処理工程に付した後の血漿、例えば従前の密度をベースとする分離方法による全血からの血漿）を受け入れる。該試料を希釈し、上記した操作を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦプレート（pate）４０４の１または複数のスポット上にアリコートし、次にそれをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計４０６中に挿入する。質量分析計は、従来通りに、データ対（ｍ／ｚ位置、強度）の形態にて、質量スペクトル４０８を作成する。次に質量スペクトルデータをデータベースまたは機器可読記録媒体４１０にデジタル形態で格納する。記録媒体４１０は、例えばローカル・エリア・ネットワークを介して汎用性コンピュータ４１４とアクセス可能であるが、その詳細は重要なことではない。記憶媒体４１０はさらにトレーニングセット４１２のクラス標識したスペクトルを格納する。スペクトル４０８に前処理工程（バックグラウンド除去、正規化およびアライメント）を施すソフトウェア命令をコンピュータ４１０に実装し、前処理後のスペクトルに関して判別アルゴリズム（例えば、Ｋ−最近傍）を遂行し、トレーニングセットデータ４１２を用いるためにコード化する。次に、図１１に説明されるように、コンピュータでスペクトル４０８に対するクラス標識を生成し、それを用いてこの図１１に開示されるように治療の指導を行う。
試験システム４００はコンピュータネットワーク４２２を介して遠隔のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置４２０より質量スペクトルのデータを受信し、図１１の工程３０４−３２４を行うことができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置は、判別コンピュータ４１４を実施している組織に加盟していても、していなくてもよい、遠隔のクリニック、病院または研究所と結び付けることができるが、一般に、標準化および再現性を確保するためには、クラス標識の判別および生成を行う同じ組織がまた、患者の試料の質量分析を行うことでもあろう。
質量スペクトルを取得するための「ディープＭＡＬＤＩ」方法
ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）−ＴＯＦ（飛行時間）の質量分析法において、試料／マトリックスの混合物を金属プレート（ＭＡＬＤＩプレートとして知られる）上の所定の位置（本明細書において「スポット」または「試料スポット」）に置く。スポット上の一の位置にレーザービームを一瞬向け（「ショット」として知られる）、試料の分子または他の成分の脱離およびイオン化を生じさせる。試料の成分はイオン検出器の方に「飛行」する。該装置は、質量スペクトルの形態にて、試料中の成分（分子）の質量と電荷の割合（ｍ／ｚ）および相対強度を測定する。
典型的には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定にて、ＭＡＬＤＩプレート上の各スポットに数百回のショットを打ち込み、得られたスペクトル（一ショットに付き一のスペクトル）を集計または平均化し、各スポットでの全質量スペクトルを作成する。
少なくとも、血清および血漿などの複合的生物試料のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の領域における社会通念は、およそ１０００回より多くのショットを試料に供する必要はなく、そうでなければタンパク質の含有量が枯渇し、その装置のレーザーおよび検出器が過度に損耗し、しかもさらにショットしても、該試料についてさらなる情報を有意な量で得ることができないというものである。よって、例えばバイオマーカー・ディスカバリーを研究する間で、質量分析データを複合的生物試料から取得する場合には、試料スポットに付き５００−１０００回のショットを用いるのが一般的である。
最近の試験的研究において、本発明者らは、同じＭＡＬＤＩスポットからの多数の（２０，０００回より多く、典型的には１００，０００回〜５００，０００回の）ショットを集めて平均化すること、あるいは同じ試料の複数のスポットから由来の蓄積したスペクトルの組み合わせを集めて平均化することで、ノイズのシグナルに対する相対レベルの減少が得られ、複合的生物試料の質量分析法から有意な量のさらなるスペクトル情報が明らかとなることを見出した。その上、種々の基準となるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いるパラダイムは明らかに間違っていると思われる。第一に、スポット上のタンパク質の含有量が完全に枯渇する前に、単一のスポットに数十万回のショットを行うことが可能である。第二に、多数のショットを平均化することで得られるノイズの減少はこれまでに可視化できなかったピーク（すなわち、１０００回のショットでは明らかでないピーク）の出現をもたらす。第三に、これまでに可視化できたピークであっても、より明確に特徴付けられ、試料を極めて多数の（１０００回よりもずっと多い）ショットに供する場合に、さらに信頼できるピーク強度の測定、および試料間での比較が可能となる。
一例として、血液性試料などの複合的生物試料を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法にて単一スポットで大多数のショット（＞２０，０００回のショット、さらには１００，０００および５００，０００回のショット）に供することで、ノイズレベルの減少、これまで可視化できなかったピーク（すなわち、２，０００回のショットで明らかでなかったピーク）の暴露がもたらされることを見出した。その上、この操作は試料のタンパク質含量を枯渇させることなく行うことができる。加えて、これまでに可視化できたピークもより明確に定められ、試料間でより信頼できる比較が可能となる。血液性試料の標準スペクトル（約１，０００回ショット）にて、典型的には６０−８０個のピークが可視でき、それに対して２００，０００回のショットで、典型的には約２００−２２０個のピークが可視でき、５００，０００回のショットで、典型的には約４５０−４８０個のピークが可視でき、そして２，８００，０００回のショットで、典型的には約７６０個のピークが可視できる。本明細書で報告されるピーク数はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの機器設定に関連し、これらの数値は大まかな目安にすぎず；機器設定に応じて、また個々のピーク検出アルゴリズムに応じて、（もちろん実際の試料で）より多くのまたは少ないピークが可視できるであろうことを認識すべきである。さらに、ピークの特性および（存在量と関連付けられる）強度の数量化も、下記の図１６Ａ−１６Ｄに示されるように、少なくともある基準下にあることがベターであることに留意しなければならない。
例えば、２００，０００回のショットで明らかとなるピークは、血清試料中に存在する微量な無傷の（未消化の）タンパク質に相当するものと考えられる。本明細書に記載の技法、および本明細書にて「ディープ−ＭＡＬＤＩ」方法（すなわち、同じスポットから、または複数のスポットの組み合わせから、スポット当たり２０，０００回より多くのショット、好ましくはおおよそ２５０，０００ないし７５０，０００回以上のショットに付される方法）と称される技法を用いる場合、極めて多くのタンパク質が、場合によっては、血清試料中に存在するタンパク質全体の少なくとも半分が、半定量的および再現可能な様式で検出され得る。半定量的様式での検出は、強度（ピーク高、ピーク下面積）の測定値が、試料中のタンパク質の絶対的存在量または濃度と関連付けられることを意味する。再現可能な様式での検出は、同じ試料を何度も測定し、許容可能な変動係数の範囲内で同じ結果を得ることができることを意味する。
単一のＭＡＬＤＩスポットから２０，０００回より多くのショットを得ることは、最新のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置の限界を上回り得る；しかしながら、本発明者らはこの明細書にてこの限界付近で操作する数種の方法を記載する。理想的には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置は本明細書にて記載される「ディープ−ＭＡＬＤＩ」法に適合するように設計され、かかる装置について、自動ラスタ走査特性および単一スポット上に非常に多くのショットの実施能を含む、数種の具体的な提案が次の記載にて提示される。
ＭＡＬＤＩ試料スポットで数十万回のショットを用いる際に最も急を要する問題は、一般的なスポット調製においては、スポット内のあるいくつかのショットロケーションだけが、結合スペクトル中のシグナルに実質的に寄与するのに十分なイオン電流を発生させることである。初期の結果は、労働集約的な手動による操作を用い、レーザーショットに対してＭＡＬＤＩプレート上の一の所定のスポット内でイオン高収率のロケーションを視覚的に選択して取得され、この方法を続けることが可能であるが、レーザーショットのロケーションを選択する工程を自動化することが可能であり、それが本発明のハイスループットでの履行に好ましい（そうでなければ、簡単な理由として、多くのレーザーショットを無駄にすることなく、実質的にレーザーの寿命を下げることもない）。別の方法は、無作為に選択される最大多数のロケーションが高イオン電流を発生するようにＭＡＬＤＩスポットの質を向上することである。該方法は、両方共に、ディープ−ＭＡＬＤＩスペクトルの作成において有用である。
スペクトル取得を自動化するいくつかの方法が本願明細書のこのセクションに記載されている。その取得の自動化は、ラスタ方式にてスポットのレーザー走査の最適運動パターンを限定し、そして１個またはそれ以上のスポットから約７５０，０００または３，０００，０００回のショットを得るのに一のスポット内での別個のＸ／Ｙ座標のロケーションで複数のラスタ走査に付すための特定のシーケンスを作成することを含む。例えば、４個の試料スポットの各々について２５０，０００回のショットより取得されるスペクトルを合わせて１，０００，０００回のショットの一のスペクトルとすることができる。上記されるように、同じ試料を含有する複数のスポットで集められた数十万回から数百万回のショットを平均化して一のスペクトルを作成し得る。自動化の一の方法が、一の試料スポットを連続していないＸ／Ｙラスタ走査に供するラスタファイルを作成することを含む。別法は、スポットをサブグリッド（例えば、３ｘ３または５ｘ５グリッド）に分割し、サブスポットの別個のＸ／Ｙ座標のロケーションでラスタ走査に付するためのラスタファイルを作成することを含む。第三の方法として、スペクトル取得（複数のショット）のために相対的に高濃度の試料材料を含有する目的とする領域、および／またはタンパク質濃度が相対的に低いそれらの領域を同定するのに画像解析法を用いて、タンパク質濃度が相対的に高い領域でのスペクトル取得を行う方法が開示される
試料をＭＡＬＤＩプレートに適用する（「スポッティング」）方法を最適化し、単一のスポット内で試料／マトリックスのむらなく均一な結晶を生成することが下記に記載される。この方法は、自動化された方法を用いて、ＭＡＬＤＩプレート上の単一のスポットから数十万回のショットを得ることを容易にする。
本明細書のこの知見および方法には、バイオマーカーディスカバリー、試験開発、材料試験、現在の試験法の妥当性確認、および例えば、バイオマーカーディスカバリーの試みにおける仮説生成を含む、多くの用途がある。具体的には、該方法は本願明細書に記載の推定試験に適用しうると考えられる。該方法はさらに、現在の方法と比べて、ハイスループット方式での、複合的試料中のさらに多量のタンパク質を再現して定量するその能力により、質量分析検査における「希釈直打ち」の可能性を強化する。
本明細書のこのセクションにて使用される用語：
１． 「過渡スペクトル」なる語は、ＭＡＬＤＩスポットにおける単一のロケーションまたはＸ／Ｙ位置を対象とする単一パケットのレーザーショット（各パケットは所定数のショット、例えば１００回、５００回、８００回等のショットからなる）より取得されるスペクトルをいう。
２． 「ロケーションスペクトル」なる語は、ＭＡＬＤＩスポットの同じロケーションにレーザー照射をｘ回行った１個またはそれ以上の過渡スペクトルの集積したまとまったスペクトルをいう。
３． 「スポットスペクトル」なる語は、単一のＭＡＬＤＩスポットを全体にわたって照射する間に取得されるすべてのロケーションスペクトルのまとまったものをいう。スポットスペクトルは、集計操作を行い、ロケーションスペクトルをまとめるだけで、あるいはロケーションスペクトルで配置操作および／または正規化操作（例えば、全イオン電流の正規化）を行った後で集計操作を行うことで取得することができる。スポットスペクトルは、典型的には、ＭＡＬＤＩスポット上の１０００００〜５０００００回のショットで取得され得る。スポットスペクトルを取得するのに、ａ）ロケーションスペクトルでのバックグラウンド除去および正規化を行い、まとめること；ｂ）ロケーションスペクトルでのバックグラウンド除去および配置操作を行い、まとめること；ｃ）ロケーションスペクトルのバックグラウンド除去、配置および正規化操作を行い、まとめることを含む、他の選択肢も可能である。本発明者らは、最良のダイナミックレンジが、ロケーションスペクトルを全イオン電流の正規化に付し（詳細については、米国特許第７７３６９０５号を参照のこと）、次にまとめることにより達成され；いずれのバックグラウンド除去もスポットスペクトルにてなされうることを見出した。
４． 「ショットロケーション」なる語は、レーザー光が照射用のＭＡＬＤＩスポットをインターセプトする所定のロケーションをいう。ＭＡＬＤＩスポットに付き２０００００回または５０００００回のショットを得るために、レーザー光を、例えば、手動で、またはより好ましくは、ラスタ光がスポットを越えてラスタ走査する自動方式にて、ＭＡＬＤＩスポットを越えて多数（例えば、数百）の個々のショットロケーションに向ける。下記に説明されるように、すぐ隣のスポットロケーションを連続して照射することは一般に望ましくないため、ラスタパターンの設計が重要である。かくして、ラスタパターンの設計は空間としていくらか離れているショットロケーションを連続して選択し、ＭＡＬＤＩスポット全体にわたって空間的にシフトする方式にて走査を繰り返し、スポット内のすぐ隣のロケーションを連続して照射することを回避する。
５． 「過渡スペクトルの選別」なる語は、過渡スペクトルを受け入れるか、または拒むのかに用いる選別または選択工程をいう。一例として、過渡スペクトルの選別にて、過渡スペクトルが受け入れられるためには、所定のｍ／ｚの範囲内にある最低数（例えば、５個）のピークがその過渡スペクトルになければならず、過渡スペクトルにおけるシグナルのノイズに対する割合は特定の閾値より上になければならない。スペクトルの全イオン電流がある所定の閾値を越える必要があるなどの他の選別基準を用いることもでき、または下記に説明されるような除外リストまたは包含リストを用いることによって選別基準を設けてもよい。スペクトルの選別は全体において過渡スペクトルを許容するか、拒絶するかのいずれかである。
６． 本明細書にて使用される場合、「複合的生物試料」なる語は、その大多数が大きなダイナミックレンジにわたって、典型的には数桁にわたって広がっている、数十万個の分析物、例えば無傷のタンパク質を含有する試料として定義される。かかる複合的生物試料の例として、血液またはその成分（血清または血漿）、リンパ液、導管流体、脳脊髄液および前立腺圧搾血清（expressed prostate serum）が挙げられる。かかる複合的生物試料はまた、環境または食品試料からなり得る。
「ディープＭＡＬＤＩ」法で示されるスペクトル情報の一例を図１６Ａ−１６Ｅに示す。図１６Ａ−１６Ｃは、同じ試料（血清）の３種のスペクトルを示しており、選択された範囲の質量／電荷（ｍ／ｚ比 ７，０００〜８，０００）のプロットであって、ショット数の増加に伴い、検出可能なピークの体積が増加することを示す。図１６Ａのスペクトルは２，０００回のショットより得られ、図１６Ｂのスペクトルは１００，０００回のショットより得られ、図１６Ｃのスペクトルは５００，０００回のショットより得られた。図１６Ａのスペクトルが本質的にノイズとしてどのように示され、関心のある認識できるスペクトル情報をほとんどまたは全く有しないことが明らかであることに特に留意する。図１６Ａと図１６Ｂを対比して、図１６Ｂのスペクトル（１００，０００回のショットより取得されるスペクトル）は、図１６Ａのスペクトル中には存在しない、個々のピーク（例えば、１０で特定されるピーク）を多く含有する。図１６Ｃのスペクトルにて、そのスペクトルに示されるが、他のスペクトルでは示されないか、またはスペクトルの基部にてノイズと見なされる可能性のある、多くのピークがある。図１６Ｃおよび１６Ｂを図１６Ａと比較した場合、図１６Ａ（２，０００回のショット）のスペクトルでは存在しない、豊富なスペクトル情報が１００，０００回のショットおよび５００，０００回のショットで明らかにされ、図１６Ｂおよび１６Ｃで示されるように、ディープ−ＭＡＬＤＩ法によりノイズレベルが減少する。
図１６Ｂおよび１６Ｃのスペクトルでは、該スペクトルのダイナミックレンジに対する感度が上がっており、ピーク強度を存在量に相関させることができる。ピーク強度を用いて複合的生物試料を所定の濃度で存在する分子の存在について解析することが可能である。例えば、この方法では、試料中の目的とする（質量が既知の）分子を定め、標体を標的とする存在量のレベル（モル濃度、またはｐｐｍ）にまでドープし、ＭＡＬＤＩプレートに適用し；分子が標体中に特定の存在量（強度）でスペクトル中に確実に存在するまで（既知のｍ／ｚ位置でピークが存在するまで）、多数（例えば、１００，０００回より多く）のショットをプレートに対して行い、そのショット数（「ｘ」）を記録する。「対照スペクトル」と称されるスペクトルを作成するこの操作を慣用的定量および標準化方法に供し、当業者に明らかであるように、信頼性を保証する。このように、試験の目的とする試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびｘ回のショットに供する。得られたスペクトルで、目的とする分子に対応する既知の位置でのピークの強度が、対照スペクトル中のピークの強度よりも小さいとなれば、その場合には、試料中の目的とする分子の濃度が対照スペクトルの作成に用いられる試料中の分子の濃度よりも低い。この方法は複数の分析物に同時に用いることができる。さらには、目的とする分子について、ｘ回のショットで既知の一連の濃度にわたって複数の対照スペクトルを得ることができ、試験スペクトルを対照スペクトルと対比し、試験試料中にある目的とする分子の濃度の概算を決定し得る。この方法は、例えばアスリートの薬物試験、代謝物濃度の試験、環境試料試験等などの多くの目的に使用され得る。目的とする分子は、ほぼ１Ｋダルトンないし５０Ｋダルトンの質量範囲にある、タンパク質、例えば代謝物、癌抗原（ＣＡ）１２５、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｃ−反応性タンパク質等であり得る。
図１６Ｄは、ディープ−ＭＡＬＤＩ法にて明らかにされる、スペクトルにおける膨大なダイナミックレンジの一の実例である。図１６Ｄ中の差し込み図は、ｍ／ｚが７１４０ｋＤａと７８９０ｋＤａの間の範囲にあるスペクトルの一部であり、約５００，０００回のショットで得られるスペクトルおよび多数のピーク１０を示す。バックグランドの推定値（点線）を該スペクトルに重ね合わせ、それを差し引き、バックグラウンド除去したスペクトルを作成することができる。差し込み図のスペクトル情報、特にピーク１０の多くが図１６Ｄの主たる部分では可視できない。図１６Ｅにて、さらなるスペクトル情報、特に強度情報を示すためにＹ軸を増幅し、ｍ／ｚが約９５２０の領域でのピーク（ディープ−ＭＡＬＤＩ法で明らかにされるが、典型的な約１０００回のショットのスペクトルでは可視できない）のスペクトルを差し込み図にて示す。
図１６Ａは長方形のアレイにて３８４個の試料スポットまたは「スポット」１４を配置して含有するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの標的プレート１２の平面図である。スポットは列番号１．．．２４と、行記号Ａ．．．Ｐにより同定され、例えば左上部のスポットはＡ１と同定される。図１６Ｂは、その上に起源（０，０）を有するＸ／Ｙ座標システム（１６）を重ね合わせた、個々の試料スポットＰ１（１４）の拡大図である。該試料スポット（１４）は５ｘ５の長方形のグリッド（２５）に分割され、個々のサブスポット（１８）で示される。長方形のグリッド（１８）とロケーション座標システム（１６）を自動化ラスタ走査方法にて用い、下記に詳細に記載されるようにスポットから１００，０００回以上のショットを取得する。
大多数のショット（＞２０，０００回）の自動生成が絶対に必要であるわけではなく、現在利用可能なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置に現存する特徴が使用され得ることにまず留意した。一般に、現在のディープ−ＭＡＬＤＩ法では、レーザーショットに暴露された場合に、高いタンパク質収率をもたらすＭＡＬＤＩスポット上のロケーションを選択することが重要である。現存する質量分析装置の標準的ソフトウェアは、規則正しい予め定められたパス、すなわち（スポットの中心から）スクエアパターン、ヘキサゴンパターン、スパイラルパターンを用いてスポットを移動することを可能とする。ＭＡＬＤＩプレートのショットロケーションは、Bruker Corporationの既存のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置に入れられているFlexControl（登録商標）（Bruker）質量分析制御ソフトウェアの一部である、「ティーチング」と称されるプロセスにて決定される。（本明細書にて、折に触れて、Bruker Corporation装置の機能に言及するが、本発明の方法は、もちろん、特定の製造業者の特定の装置に限定されるものではない。）
被検査物／マトリックスの混合物をスポットに均等に分布して含有するＭＡＬＤＩスポットの一例を図１８に示す。Bruker Corporationからの質量分析装置には、ＭＡＬＤＩスポットの領域を表示するカメラが内蔵されており；光り輝くロケーション３０を手動で選別し、レーザーを狙い定める。暗いロケーション３２は回避すべきである。光り輝くロケーションで高収率が得られないことが時にあるが、それは塩の結晶の存在と関連付けられるかもしれない。照射の間に、スポット中の領域は枯渇し始めうる；そのため、暗い領域（枯渇した収率の低い領域）は回避する必要がある。手動でのアプローチを続け、照射の間のスポットの画像を取得し、表示する。
予備実験の間に、本発明者らは、ショットを用いれば用いるほど、優れたロケーションを見つけることがますます困難になることを見出した。この効果は同じスポットを繰り返し用いた場合、例えば前の５０万回のショットの後に、２回目の５０万回のショットを付加する場合にも見られた。２回目のショットで、期待されるような質量スペクトルにおけるノイズレベルの大きな減少は得られなかった。実際に、得られる平均化されたスペクトルは全体の質が悪く、それはおそらくは空のロケーションが過多で、そのショットを平均化しているためである。これは、ショットロケーションを選択し、スペクトルを許容または拒絶するのに肉眼だけを用い、過渡スペクトルの選別を用いない場合に、初期のロケーションに対するバイアスの取得をもたらす可能性があり、かかるバイアスは制御する必要がある。仮に自動化ラスタ走査およびロケーションスペクトルの選別を用いるならば、このバイアスは排除される。
しかしながら、スループットを向上させるには、ロケーション選択の工程を自動化し、所定のスポットから多数のショットを取得することが望ましい。次のセクションには、数種の方法が記載される。以下に記載の方法は、血清（３μＬ）の試料要件で、ＭＡＬＤＩプレートにおける３つのスポットに置かれた一の試料から１３−１５分に７５０，０００回のショット（スポット当たり２５０，０００回のショット）を取得する能力を有する。
スペクトル収集の自動化
ＭＡＬＤＩプレート上の所定のスポット内で複数のショットのためのロケーションを肉眼で選択し、スポット当たり１００，０００回または５００，０００回のショットを得るのに労働集約的な手動工程を用いて結果を得、この方法を推し進めることも可能であるが、レーザーショットのロケーションを選択する工程の自動化が可能であり、数種の方法が本明細書に記載される。その取得の自動化は、ラスタ方式におけるスポットのラスタ走査の最適移動パターンを限定すること、および一のスポット内にある別個のＸ／Ｙロケーションで複数のラスタ走査を行うためのシーケンス発生に付し、例えば試料スポットから１００，０００回、２５０，０００回または５００，０００回のショットを得ることを含む。自動化の一の方法として、一の試料スポットの連続していないＸ／Ｙラスタ走査についてラスタファイルを作成することが挙げられる。すぐ隣にあるスポットのロケーションを連続してショットすることは一般に望ましくないため、ラスタパターンの設計は重要である。かくして、ラスタパターンの設計は、空間的にある程度離れているショットロケーションを連続して選択し、空間的にシフトする方式にてＭＡＬＤＩスポット全体の走査を繰り返し、該スポットにおけるすぐ隣のロケーションを連続して照射することを回避し、新たなショットロケーションを選択する。
他の方法は、スポットをサブスポットのグリッド（例えば、３ｘ３または５ｘ５のグリッド）に分割し（図１７Ｂを参照のこと）、そのサブスポットの別個のＸ／Ｙロケーションでラスタ走査のためのラスタ走査ファイルを作成することを含む。
第三の方法は、画像分析法を用い、スペクトル取得（多数のショット）のために相対的に高濃度の試料材料を含有する目的とする領域を同定するように、および／または試料（例えば、タンパク質）濃度が相対的に低いそれらの領域を同定し、相対的に低濃度の試料（例えば、タンパク質）の領域でのスペクトル取得を回避するように開示される。
Ａ． 連続していないＸ／Ｙ座標のラスタ走査
一のスポットから多数のショットを取得する工程の一の自動化方法は、一の試料スポットの連続していないなＸ／Ｙラスタ走査のためのラスタファイルを作成することを含む。この方法を図１９および２０と関連して記載する。
図１９は図１８のスポット１４から１００，０００回以上のショットを取得するのに用いるためのラスタ走査パターン５００の図面である。スポット１４は連続的に複数回、例えば２５回ラスタ走査される。図１９に示される一連の符号５０２は、スポットが単一のラスタ走査にてスキャン（ショット）される、個々に別個のＸ／Ｙロケーションを示す。Ｘ／Ｙロケーションは中心（位置０，０）を起源とする図示される座標系に従って規定される。走査する間で、ラスタが各ロケーションに向けられる時に、そのロケーションにある試料は極めて多くのショット、例えばポジション／ロケーションに付き７００回または８００回のショットに供され得る。図１９に示されるパターンから、各ラスタ走査がそのスポット内で個々に別個のロケーションを照射することからなることが分かる。個々のラスタ走査は連続してなされ、それによりスポット内のすぐ隣のロケーションを照射することを回避する。図２０は図１９のラスタパターンの図１８のスポットへの重ね合わせを示す。
図１９に示されるラスタ走査のための連続していないＸ／Ｙ座標での２５のラスタファイルを作成する操作は、２０１２年５月２９日出願の米国仮特許出願番号６１／６５２，３９４のアペンディクスに記載されており、関心のある者にとって該文献もさらなる出典となる。
Ｂ． スポットをサブスポットに分離するためのグリッドの使用およびサブスポットのラスタ走査
この方法の目的は、データ取得の間に「許容される」スペクトルをもたらす、試料スポット（すなわち、スポットＡ１、スポットＡ２等）上のロケーション／ラスタを手動で選択する工程を自動化し、数十万のスペクトルがサム・バッファー（sum buffer）に加えられるまでこれを行うことである。数十万のスペクトルをまとめ上げ／平均化することは、シグナル／ノイズの割合を増大させ、したがって上記されるように有意により多くのピークの検出を可能とする。
上記される連続していないラスタ走査を用いる場合のように、このセクションに記載されるようなグリッドの使用は、試料／マトリックス混合物が、図１８に示されるように、スポット全体にわたって実質的にむらなく均一に分配されている場合に最もよく機能する。本発明にてこれを行うのに好ましい方法は、本明細書中、血清およびシナピン酸（マトリックス）の希釈および照射について後記される。したがって、本発明者らは、このむらのない分配のために、試料スポット上の実質的にすべてのロケーション／ラスタからスペクトルを取得し、そのことはすべてのロケーション／ラスタを「許容される」スペクトルについて前駆的に評価する必要性を排除する。
一の試料スポット上の数十万のスペクトルの収集は、スポット１４をサブスポットまたはグリッド因子１８（試料スポットを覆う）にさらに細かく分割するグリッド（図１７Ｂ）を規定し、所望の数のスペクトルがサム・バッファーに加えられるまで、各サブスポット１８内の各ロケーション／グリッド点／ラスタから所定の数のスペクトルを集めることにより達成され得る。従来バージョンのBrukerソフトウェアは、自動方式で試料スポットに付き合計で最大２０，０００種のスペクトルの総和を可能とするに過ぎない（図２１）。
この限定を回避するために、本発明者らは最初に５ｘ５のグリッド領域（図１７Ｂ、１６）を規定し、それで各試料スポットを２５個（８ｘ８）のグリッドまたはサブスポット１８に分割する（図１７Ｂ）。各グリッドまたはサブスポット１８について別個のラスタファイルを作成する。装置は、２０，０００個のスペクトルが（スペクトル）サム・バッファーに加えられるまで、グリッド１８内の各ロケーション／ラスタで８００個のスペクトル（ショット）を取得するようにする。その時点で、自動化方法は、該装置が次のグリッドまたはサブスポット１８に動き、次にラスタファイルを使用し、別の２０，０００個のスペクトルを作成するように指示するであろう。実際には、各サブスポット１８について１つの、２５個のラスタファイルを設計し、その各々を、別個のオートキセキュート（AutoXecute）ＴＭ法（Bruker）に適用し、その方法にセットアップした評価に従ってデータを取得する。
この操作で、各２０，０００回のショットのバッチにおいて、フレックスイメージング（flexImaging）ＴＭ（Bruker）などの画像アプリケーションを用いる必要がなく、Brukerのフレックスコントロール（flexcontrol）ＴＭソフトウェアのツールを用いて、５００，０００回のショットのスペクトル（グリッド当たり２０，０００回のショットのスペクトルｘ２５個のグリッド）の取得が可能である。この操作の結果は１の試料スポットに対して２５個のスペクトルファイルであり、各々が、合計で２０，０００個のショットスペクトルからなる１つのまとまったスペクトルを含有する。次にこれらの２５個のスペクトルファイルをまとめ、例えば図１６Ｃ、１６Ｄおよび１６Ｅに示されるような、５００，０００回のショットより取得される、ＭＡＬＤＩプレート上の単一スポットに関する全スペクトルを作成することができる。
最新のバージョンのフレックスコントロールＴＭ（Bruker）は、５００，０００回までのショットから統合されたスペクトルを集積することを可能とする。例えば、図２１でのオートエクセキュート（autoExecute）ＴＭ（Bruker）法のエディターは、８００個のショット工程（ロケーション／ラスタ当たり８００回のショット）にて合計で２０，０００回のショットを可能とする。
しかしながら、試料スポットに付き１つのまとまったスペクトル（ｘ個の過渡スペクトルの合計）を収集することができるに過ぎない。本発明者らはＭＳ装置において現存するソフトウェアの特性に調整する必要があった。これらの調整に伴って、本発明者らは、上記されるようなグリッドを形成する、１または複数のラスタよりスペクトルを取得し、個々に過渡またはロケーションスペクトルを記録し得る。例えば、該装置は、図１７Ｂのグリッドまたはサブスポット１８における各ラスタ（ｘ、ｙ位置）で取得される各８００回のショットロケーションスペクトルを、サム・バッファーに加えることを必要とせず、収集して記録するようにされ得る。同じ工程を試料スポットＡ１、Ａ２、Ａ３等内のすべてのサブスポットについて繰り返す（例えば、８００個のショットスペクトルが試料スポットに付き２５０個のラスタより取得され得る、すなわち試料スポットに付き２００，０００回のショットが取得され得る）。ロケーションスペクトルは、オートエクセキュートＴＭ（Bruker）にてスペクトルの選別を適用して、または適用することなく取得され得る。
Ｃ． 画像解析
スペクトル取得を自動化するための一の選択肢は、特に、試料がスポット全体にわたって空間的にむらなく分散しておらず、代わりに別の領域で濃縮して存在する状況下にある、スポット上にある高タンパク質収率／高試料濃度の空間的ロケーションを同定するための画像処理方法である。一の可能性のある実施態様において、その装置に内蔵されているカメラを用いてトレーニングスポットの光画像を取得する。次に、質量スペクトルを該トレーニングスポット上のロケーションのラスタより取得する。得られた質量スペクトルを、該スポットの光画像と組み合わせて用いて判別機構を作製し、光画像から、所定の試料調製物より調製されるさらなるスポットの高収率ロケーションを検出する。この判別を次に実際の試料スポットに適用する。これは洗練された解決手段であるが、カメラフィードをキャプチャーし、カメラ画像からレーザーショットのロケーションにロケーションを再現可能にキャリブレートする問題に直面した。
別の方法は、質量分析計を用い、一のスポットを質量スペクトル画像化方法にて直接研究するものである。この方法の意図は、まず、予備走査を行い、一のスポット上のファインスケール（スクエア）パターンの各ロケーションに少数のショット（数十回のショット）を照射することである。これらの各ラスタロケーションのスペクトルを収集し、ｍ／ｚの所定の範囲内にある全イオン電流、またはイオン電流を各ロケーションについて記録する。予備走査を実施して得られるＮ最高強度のロケーションに基づき新たなラスタファイルを作成し、最終の質量スペクトルの取得に使用する。この方法は、最適なソリューションとしてBrukerのフレックスイメージングＴＭソフトウェアを用い、質量スペクトルの画像化操作にて複数のスペクトルを作成する。ソフトウェアでこれらのスペクトルを解析し、最終のラスタ走査パターンを作成する。この方法はマトリックスとしてシナピン酸を用いる標準的な希釈および照射工程では有用である可能性があるが、他のマトリックスおよび予め分別された試料セットでは（例えば、ＣＬＣＣＡであって、Leszyk,J.D.、Evaluation of the new MALDI Matrix 4-Chloro-a-Cyanocinnamic Acid, J. Biomolecular Techniques, 21:81-91 (2010)を参照のこと）準最適であるかもしれず、他の方法ではＮＯＧ沈降法が適合する（Zhang N.ら、Effects of common surfactants on protein digestion and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of the digested peptides using two-layer sample preparation. Rapid Commun. Mass Spectrom. 18:889-896 (2004)）。この別法での重要な態様は、生成されるファイルが大きすぎないように、ＭＳ画像化部における取得のセッティング値を見つけることである。標準的な取得ファイルは、１メガバイトの次数であり、４００ｘ４００のラスタ走査（４００個のロケーション、ロケーションに付き４００回のショット)で、本発明者らは１６，０００個のスペクトルを作成する。これらのスペクトルの要件は全く面倒ではなく、本発明者らは全イオン電流を評価する必要があるにすぎないため、解像度を低くセッティングして操作することができる。自動スペクトル取得セッティングより使用可能なロケーションのリストを直接取得することが、すなわち取得に成功した、または失敗したリストを得ることが可能である。本発明者らの研究から、ＭＳ画像化パッケージの一部として質量の情報選別を用い、（ファイルリストを介して認識される）ロケーションのリストを作成することが可能であると思われる。このことはプロトタイプのワークフローを作成するのに大いに役立つであろうが、半手動工程を回避するには特化したソフトウェアを用いて最適化する必要があろう。
図２２は、マトリックスとしてＣＬＣＣＡを用いるＭＡＬＤＩスポットの部位を示し、高収率の領域は線形構造物からなり、低収率の領域は暗領域として示される。これらのケースでは、マトリックス試料は図２０に示されるように極めて不均一に結晶化し、画像解析法が最も理にかなっているようである。画像解析で相対的に高収率の領域（１２０、１２２）を確認する。左下部にある領域１２４などの相対的に低収率の領域およびマトリックス領域１２６は画像解析用ソフトウェアで確認され、照射の間では無視される。
スポット上の高収率および低収率の領域を確認するための画像解析用ソフトウェアは種々の形態を取ることができ、当業者により開発され得る。例えば、スポットの黒白の画像（図１９）はピクセルの配列からなり、各々が８ビットの量子化された値を有し、０が黒色（シグナルなし）であり、２２５が白色（飽和状態）である。「高収率」と同定される約１００よりも大きなピクセル値を有するピクセル、および相対的に「低収率」と同定される４０よりも小さいピクセル値を有するピクセルを特定することによるなどの選別操作を用いて相対的に高収率の領域を確認する。次に対応するピクセルが１００以上の値を有する試料スポットの領域でピクセル走査を始める。ピクセル値が２４０−２５５であるスポットのロケーションの領域は、塩結晶または低収率をもたらす他の特性を有すると決定することができるため、かかるロケーションを選別して取り除くことも可能である。図２２に再び関連して、結晶構造１２０、１２２のピクセルは１００−２４０の範囲内にあるピクセル値を有し、それで走査されるであろうが、黒色領域１２４および１２６は走査されない。形態学的処理技法を用いて図２２の結晶１２０などの構造を確認することもできる。画像解析用ソフトウェアは、走査する領域を決定するのに、形態学的処理および選別することの両方を含みうる。さらに、走査工程の間に（試料が枯渇するために）スポットを変更し、画像処理を走査の間に行い、一のスポットから１００，０００回以上のショットを生じさせる工程にわたってその照射を最適化し、低濃度の試料のそれらのロケーションを照射の間に回避することが可能である。
図２３は、プレートのスポット１４、この場合にはスポットＦ１７の画像１３２を含む、装置のワークステーション１３０のディスプレイを示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置からのスクリーンショットである。該プレートのレイアウトを１２’で示し、スポットＦ１７は１４’で示される．一群のスポット１３４（Ｄ９〜Ｆ２０）を、上記の画像解析方法を用いて、自動モードで作動させるために選択する。
図２４は該装置から由来の別のスクリーンショットである。最新の装置は、使用者に過渡スペクトルを許容するか、拒絶するかの評価領域を設定し（評価タブを用いる）、スポットに付きどれくらいの数のスペクトルを蓄積させるかを設定し（蓄積タブを用いる）、レーザーが特定のパターンで発射しうるようにスポットを横切って「移動する」こと（図示されるように、「移動」タブを用いる）を可能とする。選択肢は、例えば、ヘキサゴンまたはスパイラルの形態の無作為なウォークまたは移動を包含する。ソフトウェアはまた、７５０回のショットのスペクトルを一のショットロケーションから収集し、ついで次のショットロケーションに移動するまで、使用者がレーザーを発射し、かかるパラメータに従ってすべてのスペクトルを取得し、添加し続けることを可能とする。ショットロケーションが失敗したスポットであると考えられるまでに、トライアルの回数を設定することができる。同様に、低収率の領域を確認し、その領域での照射を回避する画像解析方法は、これら判断の失敗を著しく減少または排除する助けとなる。
図２５は、１５０で示されるように、過渡スペクトルを許容または拒絶する質量範囲を選択する、評価の頁を示す。取得の間に、過渡スペクトルが、設定閾値（解像度、シグナル強度または他の因子に基づく）をパスする所定の範囲内に、この場合には５，０００〜１８，０００Ｄａの範囲内にピークを有しないならば、その時には該スペクトルは拒絶されるであろう。すなわち、過渡スペクトルはサム・バッファーに加えられず、ロケーションスペクトル（すべてのショットからのスペクトルのまとめ）を形成するであろう。
図２６は、評価に含めたくない特別なピークがある場合に、これらのピークを「バックグラウンド・ピーク」とする排除リストおよびタグを作成しうる、評価の頁を示す。ソフトウェアは、バックグラウンド・ピークを規定するマトリックス用の所定の「コントロールリスト」を有するか、またはピークリストを取り込むことができる。
複数のスポットからのスペクトルの収集
一般に、ディープ−ＭＡＬＤＩ法を拡張し、複数のスポットからのスペクトルを合わせることができる。例えば、標準的ＭＡＬＤＩプレート上の各スポットＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４およびＡ５（図１７Ａを参照のこと）から試料の５００，０００回のショットを取得し、その得られたスペクトルを合計で２，５００，０００個のスペクトル（ショット）からなる一の全体のスペクトルに合わせる（まとめる）ことができる。推測するに、複数のショットからのスペクトルを合わせて極端に大きな数字のショットに達することができない、すなわち１００個のスポットにて各スポットで１００万回のショットを行い、１億回のショットの結果を付与しうることができないと考える理由はない。この操作に実践上の制限、例えばレーザーはあまりにも頻繁に失敗するという制限があるかもしれない。
ディープＭＡＬＤＩにて複数のスポットからスペクトルを収集する例
本発明の方法の一の実施例にて、上記される方法を用い、複数のスポットを走査するために手動でまたは自動的に生成されるラスタを用いて、ＭＡＬＤＩプレート上で同じ血清の複数のスポットから５百万回のショットから由来のスペクトルを収集することが可能である。この方法において、ＭＡＬＤＩプレート上で単一試料の均一のスポットを再現可能な方法で取得することが好ましい。これは上記した方法を用いて達成され得る。
１．希釈した血清のＭＡＬＤＩ標的プレート上へのスポット処理
操作：
血清をＨＰＬＣ等級の水で１：１０に希釈し、かき混ぜる。試料をマトリックス（５０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ中シナピン酸（２０ｍｇ／ｍＬ）と１：１（ｖ／ｖ）で０．５ｍＬのマイクロ管中で混合し、かき混ぜる。マトリックス／試料の混合物（４μＬ）でＭＡＬＤＩ標的上の１または複数のスポットにスポット処理する。
ＭＡＬＤＩプレートにある３６個のスポット（ロケーション）をこの実施例にて使用した：
管１：ＭＡＬＤＩプレートのロケーションＥ１３、Ｅ１４およびＥ１５上にスポット処理する
管２：ロケーションＥ１６、Ｅ１７およびＥ１８上にスポット処理する
管３：ロケーションＥ１９、Ｅ２０およびＥ２１上にスポット処理する
管４：ロケーションＥ２２、Ｅ２３およびＥ２４上にスポット処理する
管５：ロケーションＦ１、Ｆ２およびＦ３上にスポット処理する
管６：ロケーションＦ４、Ｆ５およびＦ６上にスポット処理する
管７：ロケーションＦ７、Ｆ８およびＦ９上にスポット処理する
管８：ロケーションＦ１０、Ｆ１１およびＦ１２上にスポット処理する
管９：ロケーションＦ１３、Ｆ１４およびＦ１５上にスポット処理する
管１０：ロケーションＦ１６、Ｆ１７およびＦ１８上にスポット処理する
管１１：ロケーションＦ１９、Ｆ２０およびＦ２１上にスポット処理する
管１２：ロケーションＦ２２、Ｆ２３およびＦ２４上にスポット処理する
試料のスポットＥ１３〜Ｆ１８（管１−１０）は、かき混ぜた後で、同じピペットチップで３回直接適用し（各管中の１５μＬのうち、３ｘ４μＬ）；その一方で最後の６個の試料のスポットＦ１９−Ｆ２４（管１１および１２）もスポットＥ１３−Ｆ１８のように適用するが、プレート上にはピペットでアップダウンさせて適用した。標的プレートを卓上に置くことでＭＡＬＤＩプレート上のスポットを外界温度で乾燥させた。
結果：
スポットＥ１３〜Ｆ１７（プレート上でさらに混合することなく、プレートに直に適用されているスポット）の場合、各管で３番目のスポットは最初の２つのスポットよりも明らかに均一であった。均一性は視覚的に評価し；３番目のスポットが最も均一で、２番目のスポットが２番目に均一で、最初のスポットが均一性が最も低かった；ただし、管４からの３個のスポットの２番目であるＥ２３はその例外であり、２番目のスポット処理よりも各管での３番目のスポット処理のように見えた。
管中でかき混ぜることで混合し、プレートにピペットでアップダウンして適用した試料のスポットＦ１８、Ｆ１９、Ｆ２０、Ｆ２１、Ｆ２３およびＦ２４は等しく同様であり、Ｅ１３〜Ｆ１７のセットの３番目のスポットと同じ均一な外観を有した。Ｆ２２はＥ２３とほとんど同じように見えた。
２． ５百万回のショットからのスペクトルの取得
上記した操作を行った後に、スポットに付き約３１２，５００回のショットに付した質量スペクトルデータを１６個のＭＡＬＤＩスポット：
Ｅ１５、Ｅ１８、Ｅ２１、Ｅ２３、Ｅ２４、Ｆ３、Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１２、Ｆ１５、Ｆ１８、Ｆ１９、Ｆ２０、Ｆ２１、Ｆ２３、およびＦ２４
より取得した。
上記のラスタ走査ファイルを用いて、各スポットからのスペクトルを総合し、約５，０００，０００回のショットより取得される試料の全体のスペクトルを作成した。
ＭＡＬＤＩプレートへの試料適用（スポット処理）の最適化
ＭＡＬＤＩプレートへの試料適用を最適化し、結晶化試料をＭＡＬＤＩプレート上の各試料スポットに均一でむらなく分配した。その一例を図１５に示す。下記されるように、いくつかの実験を行い、試料混合物のＭＡＬＤＩプレート上のスポットに供給する（「スポット処理する」）ための最適操作を見つけた。これらの実験をこのセクションで記載する。
最初に、血清との数種の異なる調製物を調製した。特記されない限り、マトリックス（２μＬ）を加えた。特記されない限り、希釈した試料と、マトリックス媒体とを試料調製管中で混合した。試料調製管から複数のアリコートを取ることは結晶化に影響を及ぼすため、特記されない限り、本発明者らは単一の調製管から１個より多くのスポットにスポット処理を付与しなかった。
研磨した金属プレート実験を行い、均一なスポットを生成した。操作は次のとおりであった：
１． 試料を１／１０に希釈し（２μＬの試料＋１８μＬの水）、次に５０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ中のマトリックス（シナピン酸、２５ｍｇ／ｍＬ）と１：１（ｖ／ｖ）で混合し、マトリックス（２μＬ）をスポット処理に付す。この操作で良好で均一な結晶は得られなかった。
２． マトリックス・チップを準備する。マトリックス（２μＬ）をスポット・チップにピペットで付与し、それを３０秒間放置する。試料を１／１０に希釈し（２μＬの試料＋１８μＬの水）、次に５０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ中のマトリックス（シナピン酸、２５ｍｇ／ｍＬ）と１：１（ｖ／ｖ）で混合する。過剰量のマトリックスをピペット・チップからイジェクトする。ピペット・チップを試料・マトリックスの混合物に入れ、ピペットで３回アップダウンする。そのチップを変えることなく、試料・マトリックスの混合物（２μＬ）をスポット処理に付す。この操作により、均一で良好な結晶が形成された。試料・マトリックスの混合物が光沢のある金属プレートと同じくらいに広がらないのは、これが研磨した金属プレートだからである。ピペット・チップに残る乾燥した結晶は、それがさらなる結晶を形成するための種として機能することで結晶化を改善するかもしれない。
３． 温度の結晶化に対する効果を実験した。試料を１／１０に希釈し（２μＬの試料＋１８μＬの水）、次に５０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ中のマトリックス（シナピン酸、２５ｍｇ／ｍＬ）と１：１（ｖ／ｖ）で混合する。試料を３７℃の水浴中に５分間入れる。試料を水浴から取りだし、直ちにスポット処理に付す。この操作により、良好で均一な結晶は生成されなかった。
４． 上記の実験２を繰り返すが、試料の混合物を２μＬではなく４μＬでスポット処理に付す。この操作により、均一である良好な結晶が形成された。４μＬをスポット処理に付すことで、スポットの直径をすべて覆い、良好な結晶およびデータが生成される。これが現在のところ最適であると考えられる操作である。
本発明でスポット処理に付す操作は例示として提案されているものであり、限定するものではなく、この開示されている方法に変形を加えることももちろん可能である。例えば、管中でマトリックスと試料との混合物を混合し、スポット処理に付すまでにそれを数分間放置してもよい。より均一な結晶を得ることは、同じピペット・チップを用いて同じ管からより多くのスポットを生成することが分かる。例えば、同じチップを用いて同じ管から１０個のスポットをスポット処理に付し、最後から５個かそこらのスポットのデータを収集することができるに過ぎず；あるいはまた、ＭＡＬＤＩプレート上へのスポット処理を開始する前に、該管の最初の５個のアリコート（４μＬ）を廃棄し得る。
本発明者らは、同じピペット・チップを用い、同じ試料管から光沢のある金属の標的プレート上に１０回スポット処理（スポットに付き２．５μＬ）に付すが、１の操作に従って、同様の結果（スペクトルの質）が得られることも見出した。
さらなる考察
技術再現性
技術再現性の実験は、例えば１００個のバッチで１，０００回の技術的再現を毎日行って実施され得る。（プレート上にある、またはプレート上にない）試料（スポット）調製物への依存性、特により均一なイオン電流の生成をもたらす調製方法があるかどうかを確かめるために、例えば試料の希釈度を変更して実験することができる。高収率のロケーションの数がスポットからスポットへどのように変化しているか、この変動をどのようにして最小限に抑えるかをモニター観察することもできる。取得および調製を高レベルの精度でモニターし、記録を付けることが実施において優れている。
試料間の再現性
試料間の変動と同様に試料間の再現性も実験され得る。新たな現象が起こるかもしれない：ある試料はタンパク質に富み、より高収率のロケーションを含むスポットが得られるかもしれない。ある種の試料の属性（光学密度および色相）から基準を得ることも、あるいは（例えば、血清用の）試料取得装置を画一化し、より再現可能な操作をすることも可能である。最大の変数をカバーしようとするのに、できるだけ不均一な供給源と組み合わせた試料のセットを用いてもよい。かかるセットは、研究中で、既知の試料の収集および条件に従って適合する、現存するセットから得るべきであり、そのことは現存する試料のデータベースの使用を強固なものとする。
感度
スペクトル中でより多くのピークを観察することは、この方法でどの存在量の範囲を見つけることができ、実際にタンパク質のどの型を可視できるのかといった問題を提起する。このことは、複合的試料のＭＡＬＤＩ ＭＳにおいて、存在量がより多いタンパク質からのイオンが存在量の少ないタンパク質からのイオンシグナルを抑制する概念としての「イオン抑制」のために、存在量の少ないイオンを観察することができず、したがって存在量の少ないタンパク質は検出できなくなるという、「社会通念」を解決する。実際、ピーク体積の増加が観察されることは（例えば、図１６Ｃを参考のこと）この解釈について疑問を投げかける。さらには、ＭＡＬＤＩ ＭＳの（半）定量的特性を真摯に受け止めなければならないようである。仮にタンパク質の存在量が数桁にわたって広範囲に広がっているとするならば、その対応する質量スペクトルはピーク高（もっと厳密に言えば、ピーク下面積）において大きな違いを示すことによってこの挙動を模倣すると考える。存在量の少ないタンパク質がイオン化しないためではなく、むしろ該タンパク質に対応するピークの振幅は極めて小さいために、ＭＡＬＤＩスペクトルにおいて存在量の少ないタンパク質を観察しようとは考えない。質量分析法にて大きなピークに焦点を当てることが一般的な方法であり、存在量の少ないピークは桁違いに小さいため、これらのピークがこれまでに観察されていないことは意外でもなんでもない。イオン抑制のような現象が起きないとか、イオン化の可能性が一の役割を果たさないと言っているわけではなく、これらの現象が存在量の少ないタンパク質が起源であるピークを完全に抑制するものではなく、スペクトルの強度の低い領域にて存在量の少ないタンパク質のピークを探すならば、該タンパク質は実際に観察できるようになると言うものである。かなりの割合の血清プロテオームに及ぶ探求は、このように、質量スペクトルのダイナミックレンジを広げるための探求とみなすことができる。他の計数に基づくいかなる技法とも同様に、この問題に対する簡単な解決方法は検出されるイオンの数（飛行時間容器当たりのイオンの数）を増やすことで統計値を上げることである。
社会通念に反するこの簡単な解釈にてより信頼を得るために、質量スペクトルのダイナミックレンジを確立し、それをタンパク質の存在量と結び付けることが望ましい。これは共に分析化学の観点から、感度曲線（ｍ／ｚの関数として）を確立し、ならびにあるピークに対応するタンパク質の同定、およびＥＬＩＳＡのような直交技法を介してこれらのタンパク質の存在量の比較測定を介して行われる。
予め分別された試料の使用
この開示の方法は、試料を分画するための沈殿方法、例えばＮＯＧ沈殿法、脱脂方法等と組み合わせて使用され得る。該方法はＣＬＣＣＡ等の他のマトリックスと一緒に使用され得る。これらの方法はまた、ディープ−ＭＡＬＤＩ法から大きく利益を受け得る可能性がある。試料の前分別に用いる予備データは、異なるピークを実際に見つけるが、そのピーク体積は少しも最適でなかったことを示す。一の目的として、このことは存在量が極めて多いタンパク質を取り除くと考えられる。
過去には、本発明者らは、枯渇および／または質量選別を用いてアルブミンおよびヘモグロビンなどの望ましくないタンパク質の含量を減らそうとしてきたが、これらの方法はいずれも完全な除去に至らず、これらのピークは可視できるままであった。本明細書に記載の、枯渇した、または質量選別した試料でのディープ−ＭＡＬＤＩ法の使用は、大きなピークの減少はまた、存在量があまり多くないタンパク質を見つけるのに不可欠なダイナミックレンジを減らすため、より優れた結果をもたらすはずである。
スペクトル取得のセッティングの道理にかなった選択肢の獲得
オートエクセキュート（autoExecute）ＴＭ（Bruker）法において、特定の基準を通る過渡スペクトルを収集するだけのために、フィルターリングのセッティングを規定することが可能である；本発明者らの場合には、外部定義閾値よりも大きな全イオン電流を有するそれらの過渡スペクトル（＜ｘｘ＞回のショットより発生する）を加えたいだけである。これは単純な操作では可能であると思えないが、同様の目的に用いることのできる処理方法のタブには選別基準がある。あるいはまた、ピーク評価方法にてこの目的に適合しうるパラメータがある。これはショットの数を減らさないが、初期のショットに向かうショットバイアスの問題、すなわちノイズだけからなる過渡シグナルを取得しないという問題を克服する可能性がある。過渡スペクトルを統合し、ロケーションスペクトルを作成するにおいて、自動選別操作の使用はバイアスの問題を回避する。
増大するスポットの大きさ
レーザー照射の大きさ、ならびにグリッドの大きさを予めラスタ処理する工程のための最小とすることより生じる限界を考慮すると、標準的なスポットで十分なイオン生成のあるショットロケーションでは十分ではない可能性がある。これを処理する簡単な方法がスポットの大きさを増やすことである。フレックスイメージングＴＭ（Bruker）ソフトウェアはこの工程を極めて容易に支持する。この目的に適するかもしれないＭＳ画像用アプリケーションに使用される矩形スポッティング領域の選択肢もある。大きなスポットを用いることでさらに有利な点は、類似する数の適切なショットロケーションを位置付けることができるかどうか、スポット間で同じような質のスペクトルが得られるかどうかを心配する必要がないことである。試料の体積は問題を提起しないようである。スポットをより大きくすることが可能であるならば、ロジスティックを減らし、同じ取得のために複数のスポットで取り組むことができ、それは大多数のショットに不可欠かもしれない。
「ディープＭＡＬＤＩ」法に関するさらなる考察が、２０１２年５月２９日出願の米国仮特許出願番号６１／６５２，３９４に記載されており、関心のある者はこの文献も対象とする。
酵母ベースの免疫療法および本発明の治療方法
本願明細書に開示の一の実施態様は酵母ベースの免疫治療組成物の使用であって、腫瘍細胞により発現される癌抗原に対する治療的免疫応答を癌患者において刺激するように設計される使用を対象とする。本発明の方法は、癌抗原を発現する癌を患っており、本明細書に記載のいずれかの質量スペクトル推定方法に従ってなされた試験によって該組成物の投与から利益を受ける可能性があると特定または選択される対象に酵母ベースの癌用免疫治療組成物（すなわち、癌抗原を含む組成物）を投与する工程を含む。
さらに具体的には、一の態様にて、酵母ベースの癌用免疫治療剤で癌患者を治療する方法を記載する。該方法は、（ａ）本明細書に記載のいずれかの推定方法に従って試験を行い、スペクトルのクラス標識が酵母ベースの癌用免疫治療剤より患者が利益を受ける可能性があることを示すならば、（ｂ）酵母ベースの癌用免疫治療剤を投与する、工程を含む。一の態様において、該患者はまた、酵母ベースの癌用免疫治療剤で治療される前に、それと同時に、あるいはその後で、１または複数のさらなる抗癌療法で治療される。一の実施態様において、さらなる抗癌療法は、限定されないが、手術（例えば、腫瘍の外科的切除）、化学療法、放射線療法、標的癌療法（例えば、腫瘍の増殖および進行に関与する分子を特異的に標的とする、小分子薬物またはモノクローナル抗体療法）および緩和ケア、あるいはそれらのいくつかの組み合わせを包含する。
他の態様において、本願明細書の開示は、酵母ベースの癌用免疫治療剤で癌患者を治療する方法に関する。該方法は、本明細書に記載のいずれかの推定方法に従い、ここでスペクトルのクラス標識が該患者が酵母ベースの癌用免疫治療剤より利益を受ける可能性があることを示す、試験によって選択される癌患者に酵母ベースの癌用免疫治療剤を投与する工程を含む。一の態様にて、該患者はまた、酵母ベースの癌用免疫治療剤で治療される前に、それと同時に、あるいはその後で、１または複数のさらなる抗癌療法で治療される。一の実施態様にて、さらなる抗癌療法は、限定されないが、手術（例えば、腫瘍の外科的切除）、化学療法、放射線療法、標的癌療法（例えば、腫瘍の増殖および進行に関与する分子を特異的に標的とする、小分子薬物またはモノクローナル抗体療法）および緩和ケア、あるいはそれらのいくつかの組み合わせを包含する。
本明細書に開示のさらに別の態様において、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤で癌患者を治療する方法が記載される。この方法は、（ａ）上記したいずれかの推定方法に従って試験を行い、スペクトルのクラス標識が酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤より患者が利益を受ける可能性があることを示すならば、（ｂ）酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤を投与する、工程を含む。一の態様にて、該患者はまた、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤で治療される前に、それと同時に、あるいはその後で、１または複数のさらなる抗癌療法で治療される。一の実施態様において、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤は、ＧＩ−４０００またはその等価物として知られる、一連の酵母ベースの免疫治療生成物の製品である。本発明のこの実施態様の一の態様において、変異したＲａｓ−陽性癌として、限定されないが、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、大腸癌（ＣＲＣ）、子宮内膜癌、卵巣癌、黒色腫および多発性骨髄腫が挙げられる。一の態様にて、癌は膵臓癌である。一の実施態様にて、さらなる抗癌療法は、限定されないが、手術（例えば、腫瘍の外科的切除）、化学療法、放射線療法、標的癌療法（例えば、腫瘍の増殖および進行に関与する分子を特異的に標的とする、小分子薬物またはモノクローナル抗体療法）および緩和ケア、あるいはそれらのいくつかの組み合わせを包含する。一の態様にて、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤は、ゲムシタビンまたはその等価物と合わせて患者に投与される。一の実施態様において、患者は膵臓癌患者であり、その療法はＧＩ−４０００またはその等価物として知られている一連の酵母ベースの免疫治療生成物の製品を、単独で、またはゲムシタビンと組み合わせて含む。一の態様にて、癌患者の腫瘍は酵母ベースの免疫治療組成物での治療の前に外科的に切除されている。
本明細書に開示のさらに別の態様において、酵母ベースの癌用免疫治療剤で癌患者を治療する方法が記載される。該方法は、本願明細書に記載の本発明のいずれかの推定方法に従う試験によって選択された癌患者に変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤を投与する工程を含み、ここでスペクトルのクラス標識は酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤より患者が利益を受ける可能性があることを示す。一の態様にて、該患者はまた、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤で治療される前に、それと同時に、あるいはその後で、１または複数のさらなる抗癌療法で治療される。一の実施態様において、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤は、ＧＩ−４０００またはその等価物として知られる、一連の酵母ベースの免疫治療生成物の製品である。
本発明のこの実施態様の一の態様において、変異したＲａｓ−陽性癌として、限定されないが、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、大腸癌（ＣＲＣ）、子宮内膜癌、卵巣癌、黒色腫および多発性骨髄腫が挙げられる。一の態様にて、癌は膵臓癌である。一の実施態様にて、さらなる抗癌療法は、限定されないが、手術（例えば、腫瘍の外科的切除）、化学療法、放射線療法、標的癌療法（例えば、腫瘍の増殖および進行に関与する分子を特異的に標的とする、小分子薬物またはモノクローナル抗体療法）および緩和ケア、あるいはそれらのいくつかの組み合わせを包含する。一の態様にて、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤は、ゲムシタビンまたはその等価物と合わせて患者に投与される。一の実施態様において、患者は膵臓癌患者であり、その療法はＧＩ−４０００またはその等価物として知られている一連の酵母ベースの免疫治療生成物の製品を、単独で、またはゲムシタビンと組み合わせて含む。一の態様にて、癌患者の腫瘍は酵母ベースの免疫治療組成物での治療の前に外科的に切除されている。
本明細書は、その開示にて、「酵母ベースの免疫療法」なる語を用い、かかる語は「酵母ベースの免疫治療組成物」、「酵母ベースの免疫治療生成物」、「酵母ベースの免疫治療組成物」、「酵母ベースの組成物」、「酵母ベースの免疫治療剤」、「酵母ベースのワクチン」またはこれらの語の誘導体と互換的に使用されてもよい。本明細書で使用される場合、酵母ベースの免疫治療組成物は、酵母ビヒクル成分と対象の疾患または症状を標的とする抗原成分とを含む、組成物をいう（すなわち、酵母ベースの癌用免疫治療組成物は酵母ビヒクル成分と患者の癌を標的とする癌抗原成分とを含む）。本発明にて有用な変異したＲａｓ抗原を含む酵母ベースの免疫治療組成物は患者にて変異したＲａｓ−陽性腫瘍を標的とする。この組成物は、「酵母−Ｒａｓ免疫治療組成物」または「Ｒａｓ抗原を発現する酵母ベースの免疫治療組成物」あるいは「酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤」ということもできる。酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤は、限定されないが、「ＧＩ−４０００」として知られる一連の酵母ベースの免疫治療生成物を包含する。
酵母ビヒクルとコンジュゲートするにおいて、酵母ベースの免疫治療生成物に含まれる癌抗原（例えば、変異したＲａｓ抗原）は、酵母ビヒクルにより（酵母細胞質体、酵母細胞形骸、または酵母膜エキスあるいはそれらのフラクションに所望によりさらに加工処理され得る、無傷な酵母または酵母スフェロプラストにより）組換えタンパク質として発現されるのが最も一般的であるが、１または複数のかかる癌抗原が酵母ビヒクルに負荷されるか、あるいはまた酵母ビヒクルと複合化し、該ビヒクルに結合し、それと混合するか、またはそれと一緒に投与され、本発明において有用な組成物を形成することが本発明の一の実施態様である。
本発明の一の態様にて、１または複数の本発明の酵母ベースの免疫治療組成物に有用な抗原として、いずれかの癌または腫瘍関連抗原が挙げられる。一の態様において、抗原は前新生物性状態または過形成性状態に付随する抗原を包含する。抗原はまた、癌に伴っても、あるいは癌の原因であってもよい。かかる抗原は腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または組織特異的抗原、それらのエピトープ、あるいはそれらのエピトープアゴニストであってもよい。癌抗原は、以下に限定されないが、いずれかの腫瘍または癌（以下に限定されないが、黒色腫、扁平上皮癌、乳癌、頭頚部癌、甲状腺癌、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、脳癌、管肉腫、血管肉腫、肥満細胞腫、白血病、リンパ腫、原発性肝癌、肺癌、膵臓癌、消化器癌（大腸癌を含む）、腎細胞癌、造血器異常増殖およびそれらの転移癌を含む）から由来の抗原を包含する。
適切な癌抗原は、以下に限定されないが、変異したＲａｓ腫瘍性タンパク質（例えば、米国特許第７，４６５，４５４号および第７，５６３，４４７号を参照）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびＣＡＰ−１、ＣＡＰ−１−６Ｄなどのそのエピトープ（GenBank受入番号Ｍ２９５４０またはZarembaら、1997, Cancer Research 57：4570-4577）、ＭＡＲＴ−１（Kawakamiら、J. Exp. Med. 180:347-352, 1994）、ＭＡＧＥ−１（米国特許第５，７５０，３９５号）、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ（米国特許第５，６４８，２２６号）、ＧＰ−１００（Kawakamiら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91：6458-6462, 1992）、ＭＵＣ−１（例えば、Jeromeら、J. Immunol., 151：1654-1662（1993））、ＭＵＣ−２、正常なおよび変異したｐ５３腫瘍性タンパク質（Hollsteinら、Nucleic Acids Res. 22:3551-3555, 1994）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原；Israeliら、Cancer Res. 53:227-230, 1993）、チロシナーゼ（Kwonら、PNAS 84:7473-7477, 1987）、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）（Cohenら、Nucleic Acid Res. 18:2807-2808, 1990；米国特許第５，８４０，８３９号）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Chenら、PNAS 94：1914-1918, 1997）、ＴＲＰ−２（Jacksonら、EMBOJ, 11:527-535, 1992）、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原；Xueら、The Prostate, 30：73-78（1997））、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ／ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２（米国特許第５，５５０，２１４号）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体；Harrisら、Breast Cancer Res. Treat, 29:1-2（1994））、ｈＴＥＲＴ、ｐ７３、Ｂ−ＲＡＦ（Ｂ−Ｒａｆプロトオンコジーンセリン／トレオニン−タンパク質キナーゼ；Sithanandamら、（1990）, Oncogene 5(12）：1775-80）、腺腫様多発結腸ポリープ（ＡＰＣ）、Ｍｙｃ、フォン・ヒッペル−リンダウタンパク質（ＶＨＬ）、Ｒｂ−１、Ｒｂ−２およびアンドロゲン受容体（ＡＲ）、Ｓｍａｄ４、ＭＤＲ１（Ｐ−糖タンパク質としても公知）、Ｆｌｔ−３、ＢＲＣＡ−１（乳癌１；米国特許第５，７４７，２８２号）、ＢＲＣＡ−２（乳癌２；米国特許第５，７４７，２８２号）、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−１、ブラキュリ（GenBank受入番号ＮＰ ００３１７２．１またはＮＭ ００３１８１．２；Edwardsら、1996, Genome Res. 6:226-233）、ＨＥＲＶ−Ｈ（ヒト内在性レトロウイルスＨ）、ＨＥＲＶ−Ｋ（ヒト内在性レトロウイルスＫ）、ＴＷＩＳＴ（GenBank受入番号ＮＭ ０００４７４およびＮＰ ０００４６５）、メソテリン（Kojimaら、1995, J. Biol. Chem. 270(37）：21984-90；ChangおよびPastan、1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93(1）：136-40）、ＮＧＥＰ（前立腺で発現される新たな遺伝子（New Gene Expressed in Prostate）；Beraら、2004, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(9）：3059-3064；Ceredaら、2010, Cancer Immunol. Immunother. 59(1）：63-71；GenBank受入番号ＡＡＴ４０１３９またはＡＡＴ４０１４０）、かかる抗原および組織特異的抗原の修飾体、かかる抗原のスプライス変種、および／またはかかる抗原のエピトープアゴニストを包含する。他の癌抗原も当該分野にて知られている。他の癌抗原も、当該分野にて公知の方法、例えば米国特許第４，５１４，５０６号に開示される方法により、同定され、単離され、かつクローン化されてもよい。癌抗原はまた、１または複数の成長因子および各々のスプライス変種を含んでもよい。
本発明の一の態様にて、癌抗原は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡＰ−１、ＣＡＰ−１−６Ｄなどのそのエピトープからなるまたはそのエピトープのみからなるポリペプチド（GenBank受入番号Ｍ２９５４０またはZarembaら、1997, Cancer Research 57:4570-4577）、修飾されたＣＥＡ、ＣＥＡのスプライス変種、かかるＣＥＡタンパク質のエピトープアゴニスト、および／またはＣＥＡの少なくとも１つの免疫原性ドメインまたはそのアゴニストエピトープを含む融合タンパク質である。一の態様にて、ＣＥＡは修飾ＣＥＡであり、それは２００７年３月１日公開の米国特許公開番号ＵＳ２００７ ００４８８６０にて配列番号：４５の核酸でコードされる、該刊行物中で配列番号４６で示されるアミノ酸配列を有する修飾されたＣＥＡに相当する。
本発明の一の態様にて、酵母ベースの免疫治療組成物は、ヒトブラキュリ（human Brachyury）を標的とする。ブラキュリ抗原およびブラキュリを標的とする酵母ベースの免疫治療組成物は、２０１２年９月２０日付け公開のＰＣＴ公開番号２０１２／１２５９９８に記載されている。
本発明の一の態様にて、酵母ベースの免疫治療組成物はムチン−１（ＭＵＣ−１）を標的とする。ＭＵＣ−１抗原およびＭＵＣ−１を標的とする酵母ベースの免疫治療組成物は、２０１３年２月２１日付け公開のＰＣＴ公開番号２０１３／０２５９７２に記載される。
本発明の一の態様にて、酵母ベースの免疫治療組成物は変異したＲａｓ−陽性癌を標的とする。ｒａｓは、数個の変異が特定の位置で生じ、１または複数の型の癌の発達と関連付けられることが分かっている発癌遺伝子である。従って、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療生成物は、特定の癌において変異していることが分かっているアミノ酸残基を含有するＲａｓ の少なくとも１つの免疫原性ドメインを含む。かかる癌として、限定されないが、膵臓癌、ＮＳＣＬＣ、大腸癌、子宮内膜癌および卵巣癌、ならびに黒色腫および多発性骨髄腫が挙げられる。一の態様において、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療生成物は、２個、３個またはそれ以上のＲａｓの免疫原性ドメインを含有し、ここで各ドメインは、Ｒａｓタンパク質にて生じる数種またはすべての既知の変異を補うために、特定の癌にて生じることが分かっている１またはそれ以上の異なるＲａｓ変異を含有する。例えば、本発明の一の態様にて、酵母ベースの免疫治療組成物に用いられるＲａｓ抗原は、野生型Ｒａｓタンパク質に関連して、アミノ酸位置１２，１３、５９、６１、７３、７４、７５、７６、７７および／または７８を含有する野生型Ｒａｓタンパク質の少なくとも５−９個の連続するアミノ酸残基を含み、ここで位置１２，１３、５９、６１、７３、７４、７５、７６、７７および／または７８でのアミノ酸残基は野生型Ｒａｓタンパク質との関連で変異している。一の態様にて、癌抗原は：（ａ）野生型Ｒａｓタンパク質の少なくとも位置４−２０または少なくとも位置８−１６を含むタンパク質（ただし、野生型Ｒａｓタンパク質に関して位置１２でのアミノ酸残基は変異していることを条件とする）；（ｂ）野生型Ｒａｓタンパク質の少なくとも位置５−２１または少なくとも位置９−１７を含むタンパク質（ただし、野生型Ｒａｓタンパク質に関して位置１３でのアミノ酸残基は変異していることを条件とする）；（ｃ）野生型Ｒａｓタンパク質の少なくとも位置５１−６７または少なくとも位置５５−６３を含むタンパク質（ただし、野生型Ｒａｓタンパク質に関して位置５９でのアミノ酸残基は変異していることを条件とする）；（ｄ）野生型Ｒａｓタンパク質の少なくとも位置５３−６９または少なくとも位置５７−６５を含むタンパク質（ただし、野生型Ｒａｓタンパク質に関して位置６１でのアミノ酸残基は変異していることを条件とする）；（ｅ）野生型Ｒａｓタンパク質の少なくとも位置６５−８１または少なくとも位置６９−７７を含むタンパク質（ただし、野生型Ｒａｓタンパク質に関して位置７３でのアミノ酸残基は変異していることを条件とする）；（ｆ）野生型Ｒａｓタンパク質の少なくとも位置６６−８２または少なくとも位置７０−７８を含むタンパク質（ただし、野生型Ｒａｓタンパク質に関して位置７４でのアミノ酸残基は変異していることを条件とする）；（ｇ）野生型Ｒａｓタンパク質の少なくとも位置６７−８３または少なくとも位置７１−７９を含むタンパク質（ただし、野生型Ｒａｓタンパク質に関して位置７５でのアミノ酸残基は変異していることを条件とする）；（ｈ）野生型Ｒａｓタンパク質の少なくとも位置６９−８４または少なくとも位置７３−８１を含むタンパク質（ただし、野生型Ｒａｓタンパク質に関して位置７７でのアミノ酸残基は変異していることを条件とする）；（ｉ）野生型Ｒａｓタンパク質の少なくとも位置７０−８５または少なくとも位置７４−８２を含むタンパク質（ただし、野生型Ｒａｓタンパク質に関して位置７８でのアミノ酸残基は変異していることを条件とする）；および／または（ｊ）野生型Ｒａｓタンパク質の少なくとも位置６８−８４または少なくとも位置７２−８０を含むタンパク質（ただし、野生型Ｒａｓタンパク質に関して位置７６でのアミノ酸残基は変異していることを条件とする）を包含する。ヒトとマウス配列はＲａｓタンパク質のこれらの領域で同一であり、かつＫ−Ｒａｓ、Ｈ−ＲａｓおよびＮ−ＲａｓはＲａｓタンパク質のこれらの領域で同一であるため、これらの位置は、一般に、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−ＲａｓおよびＨ−Ｒａｓに、およびヒトおよびマウス配列に、ならびに他の配列に相当することに留意する。
本明細書で使用されるように、「ＧＩ−４０００」なる語は、一般に、一連の酵母ベースの免疫治療組成物（TARMOGEN（登録商標）製品）をいい、酵母ベースの免疫治療組成物の各々は、ヒトの癌で観察されるＲａｓ変異を標的とする１または複数のＲａｓ変異を発現する。かかる変異は腫瘍の発達と関連付けられる。臨床的に使用され、本明細書の実施例に記載されるＧＩ−４０００は、現在では、一連の４種の酵母ベースの免疫治療生成物のバージョン（個々に、ＧＩ−４０１４、ＧＩ−４０１５、ＧＩ−４０１６およびＧＩ−４０２０と称される）からなる。各バージョンは、３つのＲａｓ変異（天然Ｒａｓタンパク質について位置１２での１つの変異および天然Ｒａｓタンパク質について位置６１での２つの変異）の独特な組み合わせを含有する融合タンパク質を組換えにより発現し、ヒト癌にて観察される最も一般的なＲａｓ変異のうち７つ（位置１２での４つの異なる変異および位置６１での３つの異なる変異）を全体として標的とする、熱失活した完全（無傷）サッカロマイセス・セレビシエ酵母である。ＧＩ−４０００臨床試験にて、各患者の腫瘍を配列決定し、その患者の腫瘍に含まれる特異的なＲａｓ変異を同定し、次に同定された変異タンパク質を含有する対応の酵母−Ｒａｓ免疫治療生成物を投与する。ＧＩ−４０００シリーズの各製品を別個に製造し、バイアルに入れた。
さらに詳しくは、現在において臨床で使用されるＧＩ−４０００製品のシリーズ（個々に、ＧＩ−４０１４、ＧＩ−４０１５、ＧＩ−４０１６およびＧＩ−４０２０と称される）の酵母ベースの免疫治療組成物によって発現される各融合タンパク質は、一般に、Ｎ−末端からＣ−末端方向に向かって、次の全体構造を有するアミノ酸配列：（１）２個のアミノ酸Ｎ−末端ペプチド配列（Ｍ−Ｖ）、（２）天然Ｒａｓタンパク質の位置６１に相当する位置に単一のアミノ酸置換を有する位置５６−６７に相当するアミノ酸配列、および（３）天然Ｒａｓタンパク質の位置１２および６１の各々に相当する位置に２個の単一アミノ酸置換を有するＲａｓの位置２−１６５に相当するアミノ酸配列を有する。各融合タンパク質での３つのアミノ酸置換の特有の組み合わせが融合タンパク質を相互に区別させる。他の構造物、および変異したＲａｓ−陽性癌を標的とする免疫原性ドメインの酵母ベースの免疫治療生成物内での組織化が可能であり、例えば米国特許第７，４６５，４５４号に詳細に記載される。
ＧＩ−４０１４をコードする構築物のヌクレオチド配列および翻訳されたアミノ酸配列を、各々、配列番号：１および２で示す。ＧＩ−４０１４は次のＲａｓ変異：Ｑ６１Ｌ−Ｇ１２Ｖ−Ｑ６１Ｒを含む。ＧＩ−４０１５をコードする構築物のヌクレオチド配列および翻訳されたアミノ酸配列を、各々、配列番号：３および４で示す。ＧＩ−４０１５は次のＲａｓ変異：Ｑ６１Ｌ−Ｇ１２Ｃ−Ｑ６１Ｒを含む。ＧＩ−４０１６をコードする構築物のヌクレオチド配列および翻訳されたアミノ酸配列を、各々、配列番号：５および６で示す。ＧＩ−４０１６は次のＲａｓ変異：Ｑ６１Ｌ−Ｇ１２Ｄ−Ｑ６１Ｒを含む。ＧＩ−４０２０をコードする構築物のヌクレオチド配列および翻訳されたアミノ酸配列を、各々、配列番号：７および８で示す。ＧＩ−４０２０は次のＲａｓ変異：Ｑ６１Ｌ−Ｇ１２Ｒ−Ｑ６１Ｈを含む。
本発明はまた、上記したいずれかのＲａｓ抗原の相同体の使用を包含する。一の態様にて、本発明は、本明細書に記載のいずれか１つのＲａｓ抗原（本明細書に記載の特定の配列識別子により、タンパク質または融合タンパク質の全長にわたって、あるいは融合タンパク質の所定のセグメント、または所定のタンパク質あるいはそのドメイン（融合タンパク質の一部を形成する免疫原性ドメインまたは機能的ドメイン（すなわち、少なくとも１つの生体活性を有するドメイン））に関して言及されるいずれのＲａｓ抗原も含む）のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＲａｓ抗原の使用を包含する。本明細書で使用される場合、特記されない限り、百分率（％）同一性への言及は、（１）標準デフォルトパラメータでｂｌａｓｔｐ（アミノ酸検索用）およびｂｌａｓｔｎ（核酸検索用）を用いるＢＬＡＳＴ２．０ベーシックＢＬＡＳＴ相同性検索（ここで、問い合わせ配列は（Altschul,S.F.、Madden,T.L.、Schaaffer,A.A.、Zhang,J.、Zhang,Z.、Miller,W.＆Lipman,D.J.（1997）「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.」Nucleic Acids Res. 25:3389-3402（出典明示により本明細書の一部とする）に記載される）デフォルトにより低複合性領域についてフィルターに付される）；（２）ＢＬＡＳＴ２アライメント（下記のパラメータを用いる）;および／または（３）標準デフォルトパラメータを用いるＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（位置特異的反復ＢＬＡＳＴ）を用いて行われる相同性の評価をいう。
本発明にて使用されるいずれの酵母ベースの免疫治療組成物においても、酵母ビヒクルに関する次の態様が本発明に含まれる。本発明によれば、酵母ビヒクルは、本発明において有用な治療用組成物中に、１または複数の抗原、その免疫原性ドメインまたはそのエピトープと合わせて用いることのできる、いずれかの酵母細胞（例えば、全細胞または無傷細胞）またはその誘導体（下記参照）である。したがって、酵母ビヒクルは、以下に限定されないが、生無傷（全体）酵母微生物（すなわち、細胞壁を含むそのすべての成分を有する酵母細胞）、死滅（死菌）または失活無傷酵母微生物、あるいは無傷／全体酵母の誘導体（酵母スフェロプラスト（すなわち、細胞壁を欠く酵母細胞）、酵母細胞質体（すなわち、細胞壁および核を欠く酵母細胞）、酵母細胞形骸（すなわち、細胞壁、核および細胞質を欠く酵母細胞）、細胞内酵母膜エキスまたはそのフラクション（酵母膜粒子とも称され、以前は細胞内酵母粒子と称されていた）、他のいずれかの酵母粒子、または酵母細胞壁調製物を含む）を含むことができる。これらの酵母ビヒクルは、米国特許第５，８３０，４６３号、米国特許第７，０８３，７８７号および米国特許第７，７３６，６４２号（それらの開示を出典明示により本明細書の一部とする）に詳細に記載されている。
いずれの酵母菌株も本発明にて有用な酵母ベースの免疫治療生成物を生成するのに用いることができる。本発明で用いてもよい酵母菌株の属は、限定されないが、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、カンジダ属（Candida）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、ハンセヌラ属（Hansenula）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、ピキア属（Pichia）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）およびヤロウィア属（Yarrowia）を包含する。本発明にて用いても良い酵母菌株の種は、限定されないが、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・ケフィア（Candida kefyr）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、クリプトコッカス・ラウレンティ（Cryptococcus laurentii）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ハンセヌラ・アノマラ（Hansenula anomala）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロミセス・マルキシアヌス・バー・ラクチス（Kluyveromyces marxianus var. lactis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）およびヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）を包含する。これらの多くの種は、上記した種の範囲内に含まれることを意図とする、種々の亜種、型、亜型等を包含すると理解されるべきである。
本発明において有用な酵母ベースの免疫治療生成物を生成する方法は、これまでに、例えば、米国特許第５，８３０，４６３号、米国特許第７，０８３，７８７号および米国特許第７，７３６，６４２号（それらの開示を出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。本発明にて有用な酵母ベースの免疫治療生成物は、典型的には、死滅または失活されている。酵母の死滅または失活は当該分野にて公知の種々の適切ないずれかの方法で達成され得る。例えば、酵母の加熱不活化は酵母を失活する標準的方法であり、当業者は標的抗原の構造的変化を、所望によって、当該分野にて公知の標準的方法により、モニター観察できる。あるいはまた、化学的、電気的、放射性またはＵＶ方法などの、酵母を失活する他の方法を用いることもできる。
酵母ビヒクルは、当業者に知られている多数の技法を用いて、対象に投与され得る調製物を含め、本発明の酵母ベースの免疫治療用組成物または生成物に処方され得る。例えば、酵母ビヒクルは凍結乾燥により乾燥され得る。酵母ビヒクルを含む製剤はまた、ベーキングまたは醸造操作で使用される酵母についてなされるように、酵母をケークまたは錠剤に充填することによっても調製され得る。さらに、酵母ビヒクルは、宿主または宿主細胞によって容認される、等張緩衝液などの医薬的に許容される賦形剤と混合され得る。かかる賦形剤の例として、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、ハンクス液、および他の生理平衡塩水溶液が挙げられる。不揮発性油、ゴマ油、オレイン酸エチル、またはトリグリセリドなどの非水性ビヒクルも使用され得る。他の有用な製剤は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、グリセロールまたはデキストランなどの増粘剤を含有する懸濁液を包含する。賦形剤はまた、等張性および化学安定性を高める物質などの、添加剤を少量で含み得る。標準製剤は、注射液あるいは注射用懸濁液または溶液として適切な液体に溶解させることのできる固体のいずれかであり得る。このように非液体製剤では、賦形剤は、例えば、デキストロース、ヒト血清アルブミン、および／または保存剤を含み得、投与前にそれに滅菌水または生理食塩水を添加し得る。組成物はヒト対象に投与するのに適するように処方されるべきである（例えば、製造条件はヒトにおける使用に適する必要があり、投与用の組成物の完成および／または免疫治療剤の投薬の調製に使用されるいずれの賦形剤または製剤もヒトでの使用に適する必要がある）。本発明の一の態様にて、酵母ベースの免疫治療用組成物は、非経口経路（例えば、皮下、腹腔内、筋肉内または皮内注射による、あるいは他の適切な非経口経路）によるなどの、患者または対象の注射による投与用に処方される。
治療方法として、酵母ベースの免疫治療用組成物を対象または個体に送達（投与、免疫処理）することが挙げられる。投与方法はエクスビボまたはインビボで実施され得るが、典型的にはインビボで実施される。酵母ベースの免疫治療用組成物の投与は、全身性投与、粘膜投与および／または標的部位の位置に近位の部位（例えば腫瘍部位近辺の部位）での投与であり得る。適切な投与経路は当業者に明らかであり、それは予防または治療すべき癌の型、および／または標的細胞集団または組織に依存する。許容される種々の投与方法として、以下に限定されないが、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、結節内投与、冠動脈内投与、動脈内投与（例えば、頸動脈内）、皮下投与、経皮送達、気管内投与、関節内投与、脳室内投与、吸入（例えば、エアロゾル）、頭蓋内、脊髄内、眼内、耳、鼻内、経口、肺投与、カテーテルの含浸、ならびに組織への直接注射が挙げられる。一の態様にて、投与経路として：静脈内、腹腔内、皮下、皮内、結節内、筋肉内、経皮、吸入、鼻内、経口、眼内、関節内、頭蓋内および脊髄内投与が挙げられる。非経口用送達は、皮内、筋肉内、腹腔内、胸膜内、肺内、静脈内、皮下、動脈カテーテルおよび静脈カテーテル経路を包含し得る。耳用送達は点耳薬を包含し得、鼻内送達は点鼻剤または鼻内注射を包含し得、眼内送達は点眼剤を包含し得る。エアロゾル（吸入）送達はまた、当該分野での標準的方法（例えば、Striblingら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189:11277-11281, 1992を参照のこと）を用いて実施することができる。一の態様にて、本発明の酵母ベースの免疫治療用組成物は皮下投与される。一の態様において、酵母ベースの免疫治療用組成物は腫瘍環境に直接投与される。
一般に、酵母ベースの免疫治療用組成物の適切な単回用量は、適当な期間にわたって１回または複数回投与した場合に、１または複数の癌抗原またはエピトープに対して抗原特異的免疫応答を惹起するのに効果的な量にて患者の身体にある所定の型の細胞、組織または領域に、酵母ビヒクルおよび癌抗原を効果的に付与することのできる用量である。例えば、一の実施態様において、本発明にて有用な酵母ベースの免疫治療剤の単回用量は、組成物を投与する生物の体重１ｋｇ当たり約１ｘ１０５〜約５ｘ１０７個の酵母細胞当量である。一の態様にて、本発明にて有用な酵母ベースの免疫治療剤の単回用量は、用量当たり（すなわち、１生物に付き）、０．１ｘ１０６個の細胞の増加にて（すなわち、１．１ｘ１０６個の細胞、１．２ｘ１０６個の細胞、１．３ｘ１０６個の細胞．．．）、そのいずれの中間の用量も含めて、約０．１Ｙ．Ｕ．（１ｘ１０６個の細胞）〜約１００Ｙ．Ｕ．（１ｘ１０９個の細胞）である。本明細書で使用される際の「Ｙ．Ｕ．」なる語は「酵母単位」または「酵母細胞当量」であり、ここに１Ｙ．Ｕ．＝１０７個細胞である。一の実施態様において、用量は、１Ｙ．Ｕ．〜４０Ｙ．Ｕ．の用量、１Ｙ．Ｕ．〜５０Ｙ．Ｕ．の用量、１Ｙ．Ｕ．〜６０Ｙ．Ｕ．の用量、１Ｙ．Ｕ．〜７０Ｙ．Ｕ．の用量、または１Ｙ．Ｕ．〜８０Ｙ．Ｕ．の用量を、一の態様にて、１０Ｙ．Ｕ．と４０Ｙ．Ｕ．、５０Ｙ．Ｕ．、６０Ｙ．Ｕ．、７０Ｙ．Ｕ．または８０Ｙ．Ｕ．の間の用量を含む。一の実施態様において、用量は個体の異なる部位に投与されるが、同じ投与期間の間に投与される。例えば、４０Ｙ．Ｕ．用量は、注射により１０Ｙ．Ｕ．用量で、個体の４つの異なる部位に一の投与期間中に投与されてもよく、あるいは２０Ｙ．Ｕ．用量を同じ投与期間の間に注射で５Ｙ．Ｕ．の用量で個体の４つの異なる部位に投与してもよく、または１０Ｙ．Ｕ．用量で注射により個体の２つの異なる部位に投与してもよい。本発明は、一定量の酵母ベースの免疫治療用組成物（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０Ｙ．Ｕ．またはそれ以上の量）を個体の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる部位に投与し、単回用量を形成することを含む。
酵母ベースの免疫治療用組成物の「ブースター」または「ブースト」は、例えば、抗原に対する免疫応答が薄れた時に、あるいは特定の抗原に対する免疫応答を提供するか、または記憶応答を誘発する必要がある場合に投与される。ブースターは、初回投与から、約１、２、３、４、５、６、７または８週間離して、一月に１回、二月に１回、三月に１回、毎年、数年に１回に投与され得る。一の実施態様にて、投与計画は単回用量を数週間から、数ヶ月、数年までの期間にわたって少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれ以上の回数にて投与される。一の実施態様において、その用量を週に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれ以上の用量で投与し、つづいて月に必要に応じて所望の治療結果が達成される用量で投与する。患者の腫瘍が再発するか、あるいは患者が寛解傾向にあると考えられた後であっても、さらなる用量を投与しうる。
一の態様にて、個体はさらに、癌の治療に有用な少なくとも１つの他の治療用化合物または治療用プロトコル（抗癌療法）で治療される。癌の治療に有用である、さらなる薬剤、組成物またはプロトコル（例、治療用プロトコル）は、以下に限定されないが、化学療法、腫瘍の外科的切除、放射線療法、同種異系または自己幹細胞移植、サイトカイン療法、養子Ｔ細胞移植および／または第二免疫治療用組成物（例えば、付加的酵母ベースの免疫治療剤、組換えウイルスベースの免疫治療剤（ウイルスベクター）、サイトカイン治療剤、免疫刺激治療剤（免疫刺激特性を有する化学治療剤を含む）、ＤＮＡワクチン、および他の免疫治療用組成物、および／または標的癌治療剤（例えば、小分子薬、生物製剤または腫瘍成長および進行に関与する分子、以下に限定されないが、選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）、アロマターゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン／トレオニンキナーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、レチノイド受容体活性化剤、アポトーシス刺激剤、血管新生阻害剤、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤または免疫刺激剤を含む分子）を特異的に標的とするモノクローナル抗体治療剤）の投与を包含する。これらの付加的な治療剤および治療用プロトコルはいずれも、本発明の免疫治療用組成物の前に、同時に、交互に、または後に、あるいは異なる時点で投与されてもよい。例えば、化学療法または標的癌療法と合わせて個体に投与される場合、免疫治療用組成物の効能を最大限とするために、化学療法または標的癌療法の投薬の間の「ホリデー」の間に酵母ベースの免疫治療用組成物を投与することが望ましい。腫瘍の外科的切除が酵母ベースの免疫治療用組成物の投与に対して優先することが多いが、付加的または主要な手術が、酵母ベースの免疫治療用組成物の投与の間に、またはその後にあってもよい。
例えば、本明細書に記載の本発明の治療方法に関するいずれの実施態様においても、一の態様にて、個体が癌である場合、該個体は別の癌用療法で治療される予定であるか、既に治療されている。かかる療法は、限定されないが、化学療法、放射線療法、標的癌療法、腫瘍の外科的切除、幹細胞移植、サイトカイン療法、養子Ｔ細胞移植および／または第二免疫治療用組成物の投与を含む、本明細書で上記されるいずれかの治療用プロトコルまたはそれらのいずれかの治療用化合物または薬剤の使用を包含しうる。第二免疫治療用組成物を投与する場合において、かかる組成物は、付加的酵母ベースの免疫治療剤、組換えウイルスベースの免疫治療剤（ウイルスベクター）、免疫刺激治療剤（免疫刺激特性を有する化学治療剤を含む）、ＤＮＡワクチン、および他の免疫治療用組成物を包含してもよい。
本明細書で使用される場合、「癌を治療すること」、またはそのあらゆる変化形（例えば、「癌の治療」等）は、一般に、癌が発生した場合に（例えば、一の個体にて癌と診断されるか、癌が検出された場合に）、処理の少なくとも１つの治療目標（その治療がない場合と比較して）で、本発明の酵母ベースの免疫治療用組成物を投与することをいい、その治療目標として、腫瘍負荷の軽減、腫瘍増殖の阻害、再発なしでの個体の生存率の増加、個体の全生存の増加、転移性癌の発症または発生の遅延、阻害、停止または防止（腫瘍転移および／または原発癌の外部組織の腫瘍浸潤および／または癌の転移性進行に付随する他の工程の発生開始の遅延、阻害、停止または防止によるなど）、癌進行の遅延または停止、腫瘍に対する免疫応答の改善、腫瘍抗原に対する長期記憶免疫応答の改善、および／または個体の総体的な健康の改善が挙げられる。癌を「防止する」または癌より「保護する」、またはそのあらゆる変化形（例えば、「癌の防止」等）とは、一般に、癌が発生する前に、または特定段階の癌もしくは癌にて腫瘍抗原の発現が生じる前に、処理の少なくとも１つの治療目標（その治療がない場合と比較して）で、本発明の組成物を投与することをいい、その治療目標として、癌の発症または発生の防止または遅延、あるいは万一治療後に癌が発生した場合には、少なくとも癌の重篤度の軽減（例えば、腫瘍増殖レベルの軽減、癌進行の停止、癌に対する免疫応答の改善、転移工程の阻害）もしくは個体の転帰の改善（例えば、再発なしでの生存および／または全生存の改善）が挙げられる。
本発明の治療方法にて、酵母ベースの免疫治療用組成物および他の抗癌治療剤は、いずれの脊椎動物も含め、いずれの動物にも、特に脊椎動物種、哺乳類のいずれのメンバー（限定されないが、霊長類、げっ歯動物、家畜およびペットを含む）にも投与され得る。「個体」は哺乳類などの脊椎動物（限定するものではなく、ヒトを含む）である。「個体」なる語は、「動物」、「対象」または「患者」なる語と互換的に使用され得る。
本発明によれば、本明細書中における「抗原」なる語の一般的使用は、タンパク質のいずれの部分（ペプチド、部分タンパク質、完全長タンパク質）をもいい、ここで該タンパク質は天然に存在するか、あるいは合成的に細胞性組成物（全細胞、細胞ライゼートまたは残骸細胞）に、炭水化物、もしくは他の分子、またはその一部に誘導される。抗原は、免疫系の構成成分（例えば、Ｔ細胞、抗体）と遭遇して同一または類似する抗原に対する抗原特異的免疫応答（例えば、体液性および／または細胞介在性免疫応答）を惹起する可能性がある。
抗原は、単一エピトープ、単一免疫原性ドメインのように小さくても、それより大きくてもよく、複数のエピトープまたは免疫原性ドメインを含んでもよい。抗原の大きさそれ自体は、約８−１２個のアミノ酸（すなわちペプチド）のように小さく、および完全長タンパク質、多量体、融合タンパク質、キメラタンパク質、全細胞、全微生物またはその一部（例えば、全細胞のライゼートまたは微生物のエキス）のように大きくすることができる。さらに、抗原は、酵母ビヒクルに、または本発明の組成物に負荷され得る、炭水化物を含みうる。ある実施態様において（例えば、抗原が酵母ビヒクルによって組換え核酸分子より発現される場合）、該抗原は全細胞または微生物であるよりも、むしろタンパク質、融合タンパク質、キメラタンパク質またはその断片であることが理解されよう。
抗原が酵母において発現されるものである場合、抗原は酵母内での組換え操作により発現能を有する最小限の大きさのものであり、典型的には、アミノ酸の長さが少なくとも２５個もしくはそれ以上、または少なくとも２６個以上、少なくとも２７個以上、少なくとも２８個以上、少なくとも２９個以上、少なくとも３０個以上、少なくとも３１個以上、少なくとも３２個以上、少なくとも３３個以上、少なくとも３４個以上、少なくとも３５個以上、少なくとも３６個以上、少なくとも３７個以上、少なくとも３８個以上、少なくとも３９個以上、少なくとも４０個以上、少なくとも４１個以上、少なくとも４２個以上、少なくとも４３個以上、少なくとも４４個以上、少なくとも４５個以上、少なくとも４６個以上、少なくとも４７個以上、少なくとも４８個以上、少なくとも４９個以上、またはアミノ酸の長さが少なくとも５０個もしくはそれ以上であるか、あるいはアミノ酸の長さが少なくとも２５−５０個、アミノ酸の長さが少なくとも３０−５０個、またはアミノ酸の長さが少なくとも３５−５０個、またはアミノ酸の長さが少なくとも４０−５０個、またはアミノ酸の長さが少なくとも４５−５０個である。より小さなタンパク質を発現させてもよく、かなり大きなタンパク質（例えば、アミノ酸の長さが数百の、あるいはアミノ酸の長さが二、三千のタンパク質）を発現させてもよい。一の態様にて、完全長タンパク質、あるいはＮ−および／またはＣ−末端より１または複数のアミノ酸を欠失している（例えば、Ｎ−および／またはＣ−末端より約１個〜約２０個のアミノ酸を欠失している）その構造的または機能的ドメインまたはその免疫原性ドメインを発現させてもよい。融合タンパク質およびキメラタンパク質も本発明にて発現されてもよい抗原である。「標的抗原」は、本発明の免疫治療組成物によって特異的に標的とされる抗原（すなわち、その抗原に対する免疫応答の惹起が望まれる抗原）である。例えば、「Ｒａｓ抗原」は、抗原の標的がまた腫瘍により発現される対応するＲａｓタンパク質を標的とするように、１または複数のＲａｓタンパク質より誘導される、設計される、または生成される抗原である。「変異したＲａｓ抗原」は、具体的には、１または複数のアミノ酸変異を含有するＲａｓ抗原をいう。本発明で用いる場合、かかる変異は、腫瘍のＲａｓタンパク質に認められる変異に相当し、腫瘍の発達および／または腫瘍の進行と関連付けられる。
免疫応答の刺激に言及する場合、「免疫原」なる語は「抗原」なる語の部分集合であり、従って、場合によっては、「抗原」なる語と互換的に使用され得る。本明細書で用いる場合の免疫原は、免疫原の個体への投与が、該個体の免疫系と遭遇して同一または類似する抗原に対する抗原特異的免疫応答をしかけるように、体液性および／または細胞介在性免疫応答を惹起する（すなわち、免疫原性である）抗原を記載する。一の実施態様において、酵母ベースの免疫治療組成物に含まれる免疫原は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答（例えば、ＴＨ１、ＴＨ２および／またはＴＨ１７）および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答（例えば、ＣＴＬ応答）を含む、細胞介在性免疫応答を惹起する。
所定の抗原の「免疫原性ドメイン」は、動物に投与された場合に、免疫原として作用するエピトープを少なくとも１つ含有する抗原のいずれかの部分、フラグメントまたはエピトープ（例えば、ペプチドフラグメントまたはサブユニットあるいは抗体エピトープまたは他の構造エピトープ）であり得る。従って、免疫原性ドメインは、単一のアミノ酸よりも大きく、少なくとも、免疫原として作用しうるエピトープを最低１つ含有するのに十分な大きさである。例えば、単一タンパク質は複数の異なる免疫原性ドメインを含有しうる。免疫原性ドメインは、体液性免疫応答の場合（この場合に構造ドメインが考えられる）のように、タンパク質内で線状配列である必要はない。
エピトープは、本明細書にて、免疫系に付与されると、適切な共刺激シグナルおよび／または免疫系の活性化細胞に関して、免疫応答を惹起するのに十分である、所定の抗原内での単一の免疫原性部位として定義される。言い換えれば、エピトープは免疫系の成分により実際に認識される抗原の一部であり、また抗原決定基と称されてもよい。当業者は、Ｔ細胞エピトープが大きさおよび組成にてＢ細胞または抗体エピトープと異なり、クラスＩ ＭＨＣ経路を介して提示されるエピトープがクラスＩＩ ＭＨＣ経路を介して提示されるエピトープと大きさおよび構造の属性にて異なることを認識するであろう。例えば、クラスＩ ＭＨＣ分子により提示されるＴ細胞エピトープは、典型的には、アミノ酸の長さが８〜１１であるのに対して、クラスＩＩ ＭＨＣ分子により提示されるエピトープは長さがそれほど制限的ではなく、８個のアミノ酸から２５個までのアミノ酸またはそれ以上であってもよい。加えて、Ｔ細胞エピトープは、エピトープが結合する特定のＭＨＣ分子に応じて、推定される構造的特徴を有する。エピトープは線形配列エピトープまたは構造エピトープ（保存結合領域）であり得る。大抵の抗体は構造エピトープを認識する。
本発明の種々の実施態様が詳細に記載されているが、当業者であればこれらの実施態様から修飾および工夫を思い付くことは明らかである。しかしながら、かかる修飾および工夫は、後記する特許請求の範囲に示されるように、発明の範囲内にあると明白に認識されるであろう。

Claims (75)

  1. 癌患者が、酵母ベースの癌用免疫応答発生治療剤を、単独で、または他の抗癌療法に加えて投与することから利益を受ける可能性があるかどうかを予測する方法であり、
    （ａ）該患者の血液誘導性試料を取得する工程；
    （ｂ）質量分析を該試料に対して行い、質量スペクトルを該試料より取得する工程；
    （ｃ）プログラムされたコンピュータにて、１または複数の所定の前処理工程を該質量スペクトルに対して行い、該前処理工程を行った後の質量スペクトルにおいてｍ／ｚの所定の範囲にわたって選択される特徴部の強度積分値を取得し、その強度積分値を他の癌患者から由来のクラス標識したスペクトルを含むトレーニングセットと比較し、質量スペクトルを利益または非利益状態を示すクラス標識で判別する工程
    からなる方法であって、
    ここで該クラス標識により、該患者が酵母ベースの免疫応答発生治療剤を単独で、または他の抗癌療法との併用で利益を受ける可能性があるかどうかを予測する、方法。
  2. 酵母ベースの免疫治療剤が酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤がＧＩ−４０００またはその等価物を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 変異したＲａｓ−陽性癌の療法に用いるための酵母ベースの免疫治療剤が、ゲムシタビンまたはその等価物と併用して患者に投与される、請求項３に記載の方法。
  5. 癌患者が膵臓癌患者を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 癌患者が膵臓癌患者を含む、請求項２に記載の方法。
  7. トレーニングセットが、酵母ベースの免疫応答発生治療剤または免疫治療剤を単独で、または他の抗癌療法と合わせて投与することから利益を受けた、および利益を受けなかった他の癌患者からのクラス標識したスペクトルを含む、請求項１に記載の方法。
  8. 選択される特徴が、表１、２、３、４、５または６に列挙される１または複数の特徴部を含む、請求項１に記載の方法。
  9. 癌患者が、酵母ベースの免疫応答発生治療剤を、単独で、または他の抗癌療法と合わせて投与することから利益を受けない可能性があるかどうかを予測する方法であり、
    （ａ）該患者の血液誘導性試料を取得する工程；
    （ｂ）質量分析を該試料に対して行い、質量スペクトルを該試料より取得する工程；
    （ｃ）プログラムされたコンピュータにて、１または複数の所定の前処理工程を該質量スペクトルに対して行い、該前処理工程を行った後の質量スペクトルにおいてｍ／ｚの所定の範囲にわたって選択される特徴部の強度積分値を取得し、その強度積分値を他の癌患者から由来のクラス標識したスペクトルを含むトレーニングセットと比較し、質量スペクトルを利益または非利益状態を示すクラス標識で判別する工程
    からなる方法であって、
    ここで該クラス標識により、該患者が酵母ベースの免疫応答発生治療剤を単独で、または他の抗癌療法との併用で利益を受けない可能性があるかどうかが予測される、方法。
  10. 酵母ベースの癌用免疫治療剤が酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤がＧＩ−４０００またはその等価物を含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 患者が、変異したＲａｓ−陽性癌の療法に用いるための酵母ベースの免疫治療剤を、ゲムシタビンまたはその等価物と併用して投与することから利益を受けない可能性のあることを予測する、請求項１０に記載の方法。
  13. 癌患者が膵臓癌患者を含む、請求項９に記載の方法。
  14. トレーニングセットが、免疫治療剤を単独で、または他の抗癌療法と合わせて投与することから利益を受けた、および利益を受けなかった他の癌患者からのクラス標識したスペクトルを含む、請求項９に記載の方法。
  15. 選択される特徴が、表１、２、３、４、５または６に列挙される１または複数の特徴部を含む、請求項９に記載の方法。
  16. 癌患者が、酵母ベースの免疫応答発生治療剤を、単独で、または他の抗癌療法と合わせて投与することから利益を受ける可能性があるかどうかを予測するシステムであり、
    該癌患者の血液誘導性試料から質量スペクトルを作成する質量分析計；
    他の癌患者からのクラス標識したスペクトルのトレーニングセット（酵母ベースの免疫応答発生治療剤を単独で、または他の抗癌療法との併用で利益を受けなかった複数の患者からのクラス標識したスペクトル、および免疫応答発生治療剤を単独で、または他の抗癌剤との併用で利益を受けた複数の患者からのクラス標識したスペクトルを含むトレーニングセット）を格納する装置可読記録媒体；
    質量スペクトルに作用し、その質量スペクトルを該トレーニングセットを用い、該質量スペクトルについてのクラス標識（利益または非利益状態を示す）を作成して判別するように構成されており、ここで該クラス標識により、該患者が酵母ベースの免疫応答発生治療剤を単独で、または他の抗癌剤との併用で利益を受ける可能性があるかどうかが予測される、コンピュータシステム
    を組み合わせて含む、システム。
  17. クラス標識が、患者が酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤の投与より利益を受ける可能性があるかどうかを予測する、請求項１６記載のシステム。
  18. 酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤がＧＩ−４０００またはその等価物を含む、請求項１６に記載のシステム。
  19. クラス標識が、患者がＧＩ−４０００およびゲムシタビンの患者への投与より利益を受ける可能性があるかどうかを予測する、請求項１６に記載のシステム。
  20. 癌患者が膵臓癌患者を含む、請求項１６に記載のシステム。
  21. コンピュータが、そのスペクトルの、表１、２、３、４、５または６に列挙される１または複数の特徴部を含むｍ／ｚの範囲にて、該特徴部の強度積分値を取得するように構成される、請求項１６に記載のシステム。
  22. 癌患者が、酵母ベースの免疫応答発生治療剤を、単独で、または他の抗癌療法と合わせて投与することから利益を受けない可能性があるかどうかを予測するシステムであり、
    該癌患者の血液誘導性試料から質量スペクトルを作成する質量分析計；
    他の癌患者からのクラス標識したスペクトルのトレーニングセット（免疫応答発生治療剤を単独で、または他の抗癌療法との併用で利益を受けなかった複数の患者からのクラス標識したスペクトル、および免疫応答発生治療剤を単独で、または他の抗癌剤との併用で利益を受けた複数の患者からのクラス標識したスペクトルを含むトレーニングセット）を格納する装置可読記録媒体；
    質量スペクトルに作用し、その質量スペクトルを該トレーニングセットを用い、該質量スペクトルについてのクラス標識（利益または非利益状態を示す）を作成して判別するように構成されており、ここで該クラス標識により、該患者が酵母ベースの免疫治療剤を単独で、または他の抗癌剤との併用で利益を受けない可能性があるかどうかが予測される、コンピュータシステム
    を組み合わせて含む、システム。
  23. 酵母ベースの癌用免疫治療剤が酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤を含む、請求項２２に記載のシステム。
  24. 酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤がＧＩ−４０００またはその等価物を含む、請求項２３に記載のシステム。
  25. クラス標識が、患者がＧＩ−４０００およびゲムシタビンの投与より利益を受けない可能性があるかどうかを予測する、請求項２４に記載のシステム。
  26. 癌患者が膵臓癌患者を含む、請求項２４に記載のシステム。
  27. コンピュータが、そのスペクトルの、表１、２、３、４、５または６に列挙される１または複数の特徴部を含むｍ／ｚの範囲にて、該特徴部の強度積分値を取得するように構成される、請求項２２に記載のシステム。
  28. 質量分析を試料に対して行う工程が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を実施することを含む、請求項１に記載の方法。
  29. ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析が、ディープＭＡＬＤＩ質量分析（血液誘導性試料を２０，０００回より多いレーザーショットに供する質量分析）を行うことを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 所定のｍ／ｚの範囲を癌患者の血液誘導性試料の複数の質量スペクトルを調査して得、その質量スペクトルの各々が、血液誘導性試料を２０，０００回より多くのレーザーショットに供して取得される、請求項１に記載の方法。
  31. 質量分析計が、血液誘導性試料を２０，０００回より多くのレーザーショットに供することでスペクトルを取得するように構成されているＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を含む、請求項１６に記載のシステム。
  32. 判別アルゴリズムを遂行するコンピュータと、複数の癌患者から由来のクラス標識された質量スペクトル（酵母ベースの免疫応答発生治療剤の、単独での、または他の抗癌療法との併用から利益を受けなかった複数の癌患者から由来のクラス標識された質量スペクトル、および酵母ベースの免疫応答発生治療剤の、単独での、または他の抗癌療法との併用から利益を受けた複数の癌患者から由来のクラス標識された質量スペクトルを含み、そのクラス標識が利益または非利益の状態を示す）を含む判別子に関するデータをトレーニングセットの形態にて格納する持続性コンピュータ可読媒体とを合わせた、構成体。
  33. 持続性コンピュータ可読媒体が、複数の癌患者から由来のクラス標識された質量スペクトル（酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤の、単独での、または他の抗癌療法との併用から利益を受けなかった複数の癌患者から由来のクラス標識された質量スペクトル、および酵母ベースのＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤の、単独での、または他の抗癌療法との併用から利益を受けた複数の癌患者から由来のクラス標識された質量スペクトルを含み、そのクラス標識が利益または非利益の状態を示す）を含む判別子に関するデータをトレーニングセットの形態にて格納する、請求項３２に記載の構成体。
  34. クラス標識が、トレーニングセットにおける患者がＧＩ−４０００およびゲムシタビンの併用投与から利益を受けたか、あるいは利益を受けなかったかどうかを示す、請求項３３に記載の構成体。
  35. トレーニングセットにおける癌患者が膵臓癌患者を含む、請求項３２に記載の構成体。
  36. 媒体が、トレーニングセット中の特徴部（表１、２、３または４に列挙される１または複数の特徴部を含む）を、試験質量スペクトルと比較し、それで該試験質量スペクトルについてのクラス標識を作成するためのコードを判別子の形態にて格納する、請求項３２に記載の構成体。
  37. 請求項３２に記載の持続性コンピュータ可読媒体、および
    請求項３２のトレーニングセットを用いて癌患者のスペクトルを判別するための判別子として構成される汎用性コンピュータ
    を含む、質量スペクトルを判別するためのシステム。
  38. コンピュータにＫ最近傍判別子をインプリメントする、請求項３７記載のシステム。
  39. 治療に先立って、癌患者が酵母ベースの免疫応答発生治療剤から利益を受ける可能性があるかどうかを予測するための判別子を生成する方法であって、
    ａ）酵母ベースの免疫応答発生治療剤の単独での、または他の抗癌療法との併用による治療の後に得られる多数の患者の試料について質量分析を行い、対応する質量スペクトルのセットを作成する工程；
    ｂ）工程ａ）の試料を得た患者を、該患者が該治療より利益を得るか得ないかに対応する２つの群に選別し、その各スペクトルに利益または非利益の状態を示すクラス標識を付与することで、判別子についてのトレーニングセットを生成する工程；
    ｃ）２つの群からのスペクトルを分析し、その２つの群の患者のスペクトル特性における識別特徴部を同定する工程；および
    ｄ）クラス標識されたスペクトルおよび工程ｃ）にて同定された識別特徴部を用いる判別アルゴリズムを、該治療剤を投与された別の患者からのスペクトルの試験セットに適用し、その判別アルゴリズムの実行を評価することにより、かかる識別特徴部の、該治療からの患者の利益の予測能を試験する工程
    を含む、方法。
  40. ２つの群の患者のスペクトルにおいて異なる識別特徴部を用いて、工程ｂ）、ｃ）およびｄ）を繰り返すことを含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 判別アルゴリズムがＫ−最近傍アルゴリズムを含む、請求項３９に記載の方法。
  42. 工程ａ）の質量分析が、試料を２０，０００回よりも多いレーザーショットに供する、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計でのディープＭＡＬＤＩ質量分析を含む、請求項３９に記載の方法。
  43. 識別特徴部が表１、２、３、４、５または６に列挙される１または複数の特徴部を含む、請求項３９に記載の方法。
  44. トレーニングセットにおけるスペクトルでの特徴部に基づいて、部分イオン電流の正規化を行うことをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
  45. クラス標識がトレーニングセットにおける患者の臨床データを調査することで決定される、請求項３９に記載の方法。
  46. 酵母ベースの癌用免疫治療剤を癌患者に投与することを含み、ここで、該患者は質量分析および判別試験により選別されている、癌の治療方法であって、
    該試験が、
    （ａ）該患者から由来の血液誘導性試料を質量分析に付し、該試料から質量スペクトルを取得する工程；
    （ｂ）プログラムされたコンピュータにて、該質量スペクトルに対して１または複数の所定の前処理工程を行い、該前処理工程を行った後の質量スペクトルにおいてｍ／ｚの所定の範囲にわたって選択される特徴部の強度積分値を取得し、その強度積分値を酵母ベースの免疫治療剤で治療した他の癌患者から由来のクラス標識したスペクトルを含むトレーニングセットと比較し、質量スペクトルを利益または非利益状態を示すクラス標識で判別する工程
    からなり、
    ここで質量スペクトルのクラス標識が、該患者が酵母ベースの癌用免疫治療剤から利益を受ける可能性があることを示す、方法。
  47. 患者が、酵母ベースの癌用免疫治療剤での治療の前に、それと同時に、あるいはその後のいずれかで、１または複数のさらなる抗癌療法でさらに治療される、請求項４６に記載の方法。
  48. さらなる抗癌療法が、手術、化学療法、放射線療法、標的癌療法、緩和ケア、あるいはそれらのいくつかの組み合わせより選択される、請求項４７に記載の方法。
  49. 酵母ベースの免疫治療剤が、患者の癌から由来の１または複数の癌抗原を発現する、加熱不活化の組換え全酵母である、請求項４６に記載の方法。
  50. 酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項４９に記載の方法。
  51. 患者が変異したＲａｓ−陽性癌を患っており、該患者に酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤を投与する、請求項４６に記載の方法。
  52. 患者が、酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤での治療の前に、それと同時に、あるいはその後のいずれかで、１または複数のさらなる抗癌療法でさらに治療される、請求項５１に記載の方法。
  53. さらなる抗癌療法が、手術、化学療法、放射線療法、標的癌療法、緩和ケア、あるいはそれらのいくつかの組み合わせより選択される、請求項５２に記載の方法。
  54. 変異したＲａｓ−陽性癌が、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、大腸癌、子宮内膜、卵巣癌、黒色腫または多発性骨髄腫より選択される、請求項５１に記載の方法。
  55. 変異したＲａｓ−陽性癌が膵臓癌である、請求項５１に記載の方法。
  56. 酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤が、変異したＲａｓ抗原を発現する、加熱不活化の組換え全酵母である、請求項５１に記載の方法。
  57. 酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤が、酵母ベースの免疫治療用生成物であるＧＩ−４０００シリーズの生成物、またはその等価物である、請求項５５に記載の方法。
  58. 生成物がＧＩ−４０１４、ＧＩ−４０１５、ＧＩ−４０１６またはＧＩ−４０２０より選択される、請求項５７に記載の方法。
  59. 酵母ベースの免疫治療剤がゲムシタビンまたはその等価物と併用して投与される、請求項５１に記載の方法。
  60. 癌患者の腫瘍が、酵母ベースの免疫治療剤での治療の前に、外科的に切除される、請求項５１に記載の方法。
  61. トレーニングセットが、酵母ベースの免疫治療剤を単独で、または他の抗癌療法と合わせるかのいずれかで投与することから利益を受けた、および利益を受けなかった他の癌患者からのクラス標識したスペクトルを含む、請求項４９に記載の方法。
  62. 所定の特徴部が、表１、２、３、４、５または６に列挙される１または複数の特徴部を含む、請求項４９に記載の方法。
  63. 試料になされる質量分析が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の実施を含む、請求項４９に記載の方法。
  64. ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析が、血液誘導性試料を２０，０００回よりも多いレーザーショットに供する、ディープＭＡＬＤＩ質量分析の実施を含む、請求項６３に記載の方法。
  65. 所定のｍ／ｚの範囲が、癌患者の血液誘導性試料を２０，０００回より多くのレーザーショットに供するディープＭＡＬＤＩ質量分析によって取得される該癌患者の複数の質量スペクトルを調査することで取得される、請求項４９に記載の方法。
  66. 酵母ベースの免疫治療剤を用いる癌の治療方法であって、
    ａ）該患者から由来の血液誘導性試料を質量分析に付し、該試料から質量スペクトルを取得する工程；
    ｂ）プログラムされたコンピュータにて、該質量スペクトルに対して１または複数の所定の前処理工程を行い、該前処理工程を行った後の質量スペクトルにおいてｍ／ｚの所定の範囲にわたって選択される特徴部の強度積分値を取得し、その強度積分値を酵母ベースの免疫治療剤で治療した他の癌患者から由来のクラス標識したスペクトルを含むトレーニングセットと比較し、質量スペクトルを利益または非利益状態を示すクラス標識で判別する工程；および
    ｃ）質量スペクトルのクラス標識が該患者が酵母ベースの癌用免疫治療剤から利益を受ける可能性があることを示す場合に、酵母ベースの癌用免疫治療剤を癌患者に投与する工程
    を含む、方法。
  67. 患者が、酵母ベースの癌用免疫治療剤での治療の前に、それと同時に、あるいはその後のいずれかで、１または複数のさらなる抗癌療法でさらに治療される、請求項６６に記載の方法。
  68. 酵母ベースの免疫治療剤が、患者の癌より由来の１または複数の癌抗原を発現する、サッカロマイセス・セレビシエからの加熱不活化の組換え全酵母である、請求項６６に記載の方法。
  69. 患者が変異したＲａｓ−陽性癌を患っており、該患者に酵母ベースの変異したＲａｓ−陽性癌用免疫治療剤を投与する、請求項６６に記載の方法。
  70. 生成物がＧＩ−４０１４、ＧＩ−４０１５、ＧＩ−４０１６またはＧＩ−４０２０より選択される、請求項６９に記載の方法。
  71. トレーニングセットが、酵母ベースの免疫治療剤を単独で、または他の抗癌療法と合わせるかのいずれかで投与することから利益を受けた、および利益を受けなかった他の癌患者からのクラス標識したスペクトルを含む、請求項６６に記載の方法。
  72. 所定の特徴部が、表１、２、３、４、５または６に列挙される１または複数の特徴部を含む、請求項６６に記載の方法。
  73. 試料になされる質量分析が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の実施を含む、請求項６６に記載の方法。
  74. ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析が、血液誘導性試料を２０，０００回よりも多いレーザーショットに供する、マルチショットの質量分析の実施を含む、請求項７３に記載の方法。
  75. 所定のｍ／ｚの範囲が、癌患者の血液誘導性試料を２０，０００回より多くのレーザーショットに供するマルチショットの質量分析によって取得される該癌患者の複数の質量スペクトルを調査することで取得される、請求項６６に記載の方法。
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