JPS61219387A - 新規な酵母プラスミドおよびその形質転換体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な酵母プラスミドおよび形質転換体に関
する。さらに詳しくは、新しいタイプの抗癌または制癌
剤のスクリーニングに有用な新規な酵母プラスミドおよ
び該プラスミドが導入された形質転換酵母、並びに該形
質転換酵母の利用に関する。

〔従来の技術〕

近年、分子生物学の進展に伴い、発癌または悪性腫瘍形
成に関与する遺伝子（以下発癌遺伝子と呼ぶ）について
多くの知見が蓄積されてきている。

例えば、これまで、多くの種類の発癌遺伝子がヒトを含
む溢血動物から見出され、現在もさらに新たな発癌遺伝
子の発見が続いている。特に最近は、ニワトリのレトロ
ウィルスから見出された発癌遺伝子の他に、ＮＩＨ３Ｔ
３と呼ばれるマウスの線維芽細胞を形質転換するという
系を用いて、新たな発癌遺伝子が見出されている。発癌
遺伝子には多くの種類（ｒａｓ＋ｓｒｃ、ａ＋ｙｃ、等
）が知られているが、上記のような系を用いて見出され
る発癌遺伝子にはｒａｓ系のものが多い（由来によりさ
らにに−ｒａｓ＋Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓなどに分けら
れている）。また、ｒａｓ遺伝子（実際はｒａｓ遺伝子
が変異により活性化されたもの）による発癌が実際にヒ
トで頻ばんにおきていることが知られている。興味ある
ことは、これらの遺伝子の多くは、ｒａｓ！白（ｒａｓ
遺伝子からの生産物）のＮ末端より１２番目のグリシン
（Ｇｌｙ）　、あるいは６１番目のグルタミン（Ｇｉｎ
）に対応する塩基配列（コドン）に変異がおきており、
それらのアミノ酸が他のアミノ酸に変っていることであ
る。そして、このような変異蛋白が正常細胞を異常な増
殖をする癌細胞に転換する引金になっていると考えられ
ている。また、このような変異ｒａｓ遺伝子は特定の癌
種に限らず多くの癌の組織や細胞に見出されている。

一方、近年米国のコールドスプリングハーバ−研究所の
一１ｇ１ｅｒらのグループとＭｅｒｋ社の５ｃｏｌｎｉ
ｃｋらにより、酵母にもヒトのｒａｓ遺伝子と高い類似
性（ホモロジー）を有する遺伝子が２個（ＲＡＳＩとＲ
ＡＳ２）存在することが見出され、それらの遺伝子の塩
基配列も決められている（Ｐｏｗｅｒｓ、Ｓ、等、セル
（Ｃｅｌｌ）３６，６０７．１９８４；およびＤｅｆｅ
ｏ−Ｊｏｎｅｓ等、ネイチａｙ　−（Ｎａｔｕｒｅ）、
３０６，７０７．１９８３）　、またこれら酵母の遺伝
子から生産される蛋白は、ヒ）　ｒａｓ蛋白に対して調
製された抗体と交叉反応することも明らかにされている
。そして興味あることには、サツカロマイセス困赳堕肛
姐匹見）属（以下単に酵母と略す）では、これら２個の
酵母のＲＡＳ遺伝子を不活性化するとその酵母は増殖で
きなくなること（Ｔａ　ｔｃｈｅ　１１．等、ネイチ＋
　−（Ｎａｔｕｒｅ）、３０９゜５２３．１９８４）　
、さらに興味あることには、Ｉ？ＡＳ２蛋白（酵母のＲ
ＡＳ２遺伝子からの産物）のＮ末端から１９９番目グリ
シン（これはヒトｒａｓ蛋白の１２番目のグリシンに相
当する）がバリン変わるとその酵母は胞子形成能がなく
なることが見出された（　Ｋａｔａｏｋａ、　Ｔ等、セ
ル（Ｃｅ１１）３７，４３７．１９８４　）。

また、ＲＡＳ２遺伝子が上記のように変異した場合、そ
の酵母を胞子形成条件下（通常、細胞の増殖はできない
）においても増殖のｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅは働くが、増
殖に必要な栄養源がないため結果的にその酵母は死滅す
ることもわかった。つまり酵母のＲＡＳ遺伝子（或いは
ＲＡＳ蛋白）は、酵母の増殖に必須ではあるが、その遺
伝子にある変異、例えばＲＡＳ２遺伝子の場合はＮ末端
から１９９番目グリシンがバリンに変わるような変異が
おきると、分化の機構（酵母では胞子形成が“分化”と
考えられている）が働かなくなり増殖のみが促進される
ことを示している。ヒトの癌細胞が分化することなく異
常な増殖すること、そしてそれがｒａｓ遺伝子の変異に
よることから考え、酵母におけるＲＡＳ遺伝子の変異に
よる上記のような現象は酵母の“癌化”と考えることが
できる。このように酵母のＲＡＳ遺伝子は学問上興味あ
るばかりでなく、ヒトの癌化の生物学的機構を解明する
上でも興味深い。

一方、ｒａｓ蛋白（特に動物由来）の生物学的機能につ
いても種々の知見が得られている。例えば、ｒａｓ蛋白
が、細胞表面レセプターに結合して細胞の機能や代謝に
変化もたらす信号の働きをするグアニントリフォスフエ
イト輸ｕａｎｉｎｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＧＴ
Ｐ）結合蛋白（Ｇ蛋白と呼ばれている）と同様な機能を
有することが示唆されている（Ｈｕｒｌｅｇ＋　Ｊ、Ｂ
。

等サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２６，８６０．１９
８４　）−また、ｒａｓ蛋白はＡＴＰからｃＡＭＰへの
反応をもたらすアデニル酸シクラーゼ（ａｄｅｎｙｌａ
ｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ）の活性を調節（実際は活性化）
し、ｃＡＭＰ量の増加はｃＡＭＰ依存性プロティンキナ
ーゼの活性をもたらし、その結果リン酸化された蛋白が
何らかの形で細胞の増殖またはｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ、
さらには分化の調節を行っていることが推察されている
。そして、酵母のＲＡＳ遺伝子も上記と同様なカスケー
ドにより酵母のｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅや胞子形成（分化
）の調節に関与しているのではないかと考えられている
（Ｔｏｄａ。

Ｔ６等、セル（Ｃｅｌｌ）４０．２７．１９８５）。

近年、ヒトや動物における発癌のメカニズムは急速に明
らかにされつつあるが、癌の治療は今世紀に残された医
学上解決されなければならない問題の１つである。

癌の化学的治療の面からみると、これまでの治療剤には
、細胞特に細胞の増殖に対して強い毒性を示すものが多
い。これは、生後ある期間を過ぎると正常な細胞は特定
の細胞を除きほとんど増殖しないのに対し、癌細胞は異
常な増殖をすることに基づいている。細胞に毒性を示す
ものとして、蛋白合成阻害剤、転写阻害側、ＤＮＡ合成
阻害剤などが考えられているが、これらの薬剤の作用は
、非特異的であり正常細胞の機能まで阻害し、これらを
投与した場合重大な副作用をもたらす危険性がある。従
って、癌細胞のみに作用する薬剤が強く望まれる。近年
、免疫学的な面から癌細胞に特異的に作用する抗体や免
疫関連物質の開発が進められているが、化学療法剤にお
いては癌細胞にのみ特異的に作用するよう薬剤はこれま
で開発されておらずまたそのような薬剤をスクリーニン
グするシステムも開発されていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従ってこの発明は、癌に対する新しいタイプの化学療法
剤をスクリーニングするための新規なスクリーニングシ
ステムを提供することを目的とする。

本発明者らは、既述の癌に関する分子生物学的知見即ち
、ヒトのｒａｓ遺伝子の変異により癌が誘発されること
、ヒトのｒａｓ遺伝子と類似性（ホモロジー）のある酵
母のＲＡＳ遺伝子の変異が、ヒトの癌化の状態と類似す
る現象（即ち、分化の機構である胞子形成過程が働かず
常に増殖の状態にあるという現象）をもたらすという知
見をもとに、酵母を用い癌細胞に特異的に作用する薬剤
のスクリーニングシステムができるのではないかと考え
鋭意研究に取り組んだ。即ち本発明者らは、酵母のＲＡ
Ｓ遺伝子の変異によって失われた胞子形成能を回復でき
るような薬剤、つまりＲＡＳ異変蛋白の活性を不活性に
するかあるいは正常な機能に戻すような薬剤■を選べば
、その中には、ｒａｓ変異をもったヒトや動物の癌細胞
または癌組織に特異的に作用する薬剤が見出されるので
はないかと考えた。

従ってこの発明の一層具体的な目的は、前記の変異ＲＡ
Ｓ遺伝子、酵母の胞子形成に関与する遺伝子等を遺伝子
工学的手法により巧みに利用して、癌に対する化学療法
剤の検出容易なスクリーニングシステムを提供すること
である。

〔問題点を解決するための手段〕

上記のような考え方に基づいて抗癌剤のスクリーニング
系を確立するためには、まず通常の胞子形成条件下で胞
子が形成され、それが容易に検出できる系を入手する必
要がある。

しかしながら、胞子の形成それ自体を検出することは必
ずしも容易ではない。従って本発明においては、胞子の
形成に関与する遺伝子の下流に大腸菌β−ガラクトシダ
ーゼの構造遺伝子を連結することによって前記胞子形成
に関与する遺伝子が発現されればそれに伴って前記β−
ガラクトシダーゼの遺伝子が発現されるようにし、β−
ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を公知の呈色反応で検出
することにより間接的に胞子形成に関与する遺伝子の発
現が検出できるようにした。従ってこの発明はまず、酵
母の胞子形成に関与する遺伝子の下流に大腸菌β−ガラ
クトシダーゼの構造遺伝子領域が連結されたＤＮＡ断片
が組み込まれた酵母プラスミドを提供する。

本発明のスクリーニング系は上記の胞子形成系に加えて
変異ＲＡＳ遺伝子系を含まなければならない。従ってこ
の発明はさらに、酵母の胞子形成に関与する遺伝子が発
現されるとそれに伴って大腸菌β−ガラクトシダーゼの
構造遺伝子領域も発現されるように酵母の胞子形成に関
与する遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼの構造遺伝
子領域が連結されたＤＮＡ断片および動物の発癌遺伝子
とホモロジーを有し且つ突然変異を含む遺伝子が組み込
まれた酵母プラスミドを提供する。このプラスミドにお
いては、変異ＲＡＳ遺伝子の発現生成物（蛋白）の作用
に起因して胞子形成遺伝子の発現が抑制されているが、
該発現生成物に対してなんらかの態様で拮抗する物！（
候補抗癌剤）が添加されれば前記発現生成物の機能がブ
ロックされ胞子形成遺伝子が発現し、この発現がβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子の発現を介して検出される。

上記のようなプラスミドの機能は言うまでもなく宿主酵
母中で発揮されるが、前記胞子形成に関与する遺伝子が
発現するためには前記宿主はへテロ型２倍体酵母でなけ
ればならない。従ってこの発明はさらに、酵母の胞子形
成に関与する遺伝子が発現されるとそれに伴って大腸菌
β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子領域も発現されるよ
うに酵母の胞子形成に関与する遺伝子と大腸菌β−ガラ
クトシダーゼの構造遺伝子領域とが連結されたＤＮＡ断
片、および動物の発癌遺伝子とホモロジーを有し且つ突
然変異を含む酵母由来の遺伝子が組み込まれた酵母プラ
スミドによって形質転換された　ＭＡＴａ／ＭＡＴα型
２倍体酵母形質転換株を提供する。これにより、この発
明の第１のスクリーニング系が確立される。

しかしながら、宿主が１倍体酵母又はホモ型２倍体酵母
であっても、これらの酵母が染色体上に有しない方の接
合型対立遺伝子をプラスミドにより導入すれば胞子形成
遺伝子を発現せしめることができる。従ってこの発明は
さらに、動物の発癌遺伝子とホモロジーを有し且つ突然
変異を含む酵母由来の遺伝子と、ＭＡＴａまたはＭＡＴ
ａで表される酵母の接合型支配対立遺伝子とが組み込ま
れた酵母プラスミドを提供する。

このプラスミドを、β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子に
連結された胞子形成に関与する遺伝子を含有する前記の
プラスミドと共にＭＡＴａ型又はＭＡＴａ型の１倍体酵
母に形質転換することにより前記とは異る第２のスクリ
ーニング系が確立される。従ってこの発明はさらに、酵
母の胞子形成に関与する遺伝子が発現されるとそれに伴
って大腸菌β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子も発現さ
れるように酵母の胞子形成に関与する遺伝子と大腸菌β
−ガラクトシダーゼの構造遺伝子とが連結されたＤＮＡ
断片が組込まれた酵母プラスミドと、動物の発癌遺伝子
とホモロジーを有し且つ突然変異を含む酵母由来の遺伝
子とＭＡＴａまたはＭＡＴａで表される酵母の接合型支
配対立遺伝子とが組み込まれた酵母プラスミドとによっ
て形質転換された１倍体酵母形質転換株を提供する。

同様にしてこの発明は、酵母の胞子形成に関与する遺伝
子が発現されるとそれに伴って大腸菌β−ガラクトシダ
ーゼの構造遺伝子領域も発現されるように酵母の胞子形
成に関与する遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼの構
造遺伝子領域とが連結されたＤＮＡ断片、および動物の
発癌遺伝子とホモロジーを有し且つ突然変異を含む酵母
由来の遺伝子が組み込まれたＱ母プラスミドと、ＭＡＴ
ａまたはＭＡＴａで表わされる酵母の接合型支配対立遺
伝子とが組み込まれた酵母プラスミドとによって形質転
換された１缶体酵母形質転換株を提供する。

前記のいずれのスクリーニング系においても、変異ＲＡ
Ｓ遺伝子をプラスミドにより宿主に導入したが、染色体
上にＲＡＳ変異を有する宿主を用いることもできる。す
なわち、核内染色体上にＲＡＳ変異を有する１倍体酵母
を、β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子に連結された胞子
形成に関与する遺伝子を含有するプラスミド及び　ＭＡ
ＴａまたはＭＡＴα遺伝子を含有するプラスミドによっ
て形質転換するか、あるいは核内染色体上にＲＡＳ変異
とｓｉｒ３変異（１倍体であるが、接合型かへテロの状
態になっているために接合能を示さない変異）を有する
宿主をβ−ガラクトシダーゼが構造遺伝子に連結された
胞子形成に関連する遺伝子を含有するプラスミドによっ
て形質転換することにより第３のスクリーニング形が確
立される。

従ってこの発明はさらに、酵母の胞子形成に関与する遺
伝子が発現されるとそれに伴って大腸菌β−ガラクトシ
ダーゼの構造遺伝子領域も発現されるように酵母の胞子
形成に関与する遺伝子と大腸菌β−ガラクトシダーゼの
構造遺伝子領域とが連結されたＤＮＡ断片が組み込まれ
ている酵母プラスミド、およびＭＡＴａまたはＭＡＴａ
で表わされる酵母の接合型支配対立遺伝子が組み込まれ
たプラスミドによって形質転換された、核内染色体上に
ＲＡＳ変異をもつ１倍体形質転換株−並びに、酵母の胞
子形成に関与する遺伝子が発現されるとそれに伴って大
腸菌β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子領域も発現され
るように酵母の胞子形成に関与する遺伝子と大腸菌β−
ガラクトシダーゼの構造遺伝子領域とが連結されたＤＮ
Ａ断片が組み込まれている酵母プラスミドによって形質
転換された、核内染色体上にＲＡＳ変異とｓｉｒ３変異
とをもつ１倍体形質転換株を提供する。

この発明に最後に、上記の種々の形質転換株をＳＰＯ−
Ｘ−ＧＡＬ培地上で培養してコロニーを形成せしめ、被
験物質の存在下で該コロニーを青色にすることができる
該被験物質を選択することを特徴とする抗癌または制癌
作用を有する物質のスクリーニング法を提供する。

〔具体的な詳明） 次に前記のプラスミドを作製するための方法を具体的に
説明する。

酵母サン力ロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ−
肚些し並■旦虹憇：以下酵母と略す）には、哺乳動物の
ｒａｓ遺伝子と高いホモロジーを有する２種類の酵母Ｒ
ＡＳ遺伝子（以下、ＲＡＳＩ　、　ＲＡＳ２と略す）が
知られているが、本発明者らは既に報告されている論文
（Ｐｏｗｅｒｓ、　Ｓ、等セル（Ｃｅｌｌ）３６，６０
７．１９８４およびＤｅｆｅｏ−Ｊｏｎｅｓ、等ネイチ
７−（Ｎａｔｕｒｅ）　　３０６゜７０７、１９８３）
を参考にして酵母（Ｘ２１８０−ＩＢ株）からＲＡＳ２
遺伝子を単離する（第２図）。次に、Ｍ１３ファージを
用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｔｉｏｎ法（Ｚｏｌ
ｌｅｒ。

Ｍ、Ｊ、及びＳｍｉ　Ｌｈ、　Ｍ、　ニュウクレイック
・アシド・リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅ５）１
０．６４８７．１９８２）により、ＲＡＳ２蛋白のＮ末
端から１９番目のグリシン（Ｇｌｙ）がバリン（Ｖａｌ
）に或いは６８番目のグルタミン（Ｇｉｎ）がロイシン
（Ｌｅｕ）になるようにＲＡＳ２遺伝子上の塩基配列に
変異をもたらしく以下、各々の変異をＲＡＳ２”目９．
ＲＡＳ２”ｕｔｈ”　テ表わす：第２図から第４図参照
）、これを大腸菌・酵母シャトルベクターに挿入したプ
ラスミド（以下、各々をｐＬＡＳ２”■’、　ｐＬＡＳ
２Ｌ−ｕ６８で表わす：第５図、第６図参照）を造成す
る。

一方、胞子形成（つまり酵母における“分化”）の有無
を容易に判定できるような酵母を作製するため、第１図
に示すように、酵母の胞子形成に関与する遺伝子の１つ
であるＳＰＯＴ７が、プラスミドＹＢＦ１３にクローン
化されたプラスミド１２５Ｌ−１８４（大阪市立大壷井
博士より譲渡）を種々の制限酵素およびエキソヌクレア
ーゼＢａ１３１で処理することによりＳＰＯＴ７遺伝子
を小片化後（＾、Ｂ、Ｃ，Ｄグループ：第１図−Ｂ）第
１図−片と、ＹＥＰ１３（７）ＡＩ）’　（７ンピシリ
ン耐性遺伝子）、ＬＥＵ２　（酵母のＬＥＵ２遺伝子）
およびＩＲＩ（酵母のレプリコンの１つ）を含む５ａｌ
−Ｈｉｎｄｌ［断片、並びにプラスミドｐＭｃ１４０３
　（Ｃａ−ｓａｄａｂａｎプラスミドとも呼ばれる：ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、）１４３，９７１゜１９８０）の°１ａｃＺ　
（β−ガラクトシダーゼ遺伝子の１部）を含むＳｍａｌ
−ＳａｌＩ断片を連結させたプラスミドＹＥ、Ａ〜ｙＥ
Ｉ、Ｄを造成し、ＬＥＵ２マーカーを指標にこれをａ／
α型２倍体酵母に導入する。次に、胞子形成できる条件
となる酢酸カリウムを含み、４０　ｐ　ｇ／ｌｎｌのＸ
−ＧＡＬおよび５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液を含むＸ
−ＧＡＬ寒天培地（以下ＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ培地と略す
）上で青色のコロニーとなる形質転換体を分離し、該形
質転換株からＳＰＯＴ７遺伝子断片を含むプラスミド例
えばＹＥｐＢ３を回収する。なお、プラスミドＹＥＪ３
は大腸菌ＪＡ２２１株に導入され、この菌株Ｊ＾２２１
／ＹＥｐＢ３は５８Ｍ２７７と命名され、工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第８１４７号（ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−８１４７）として寄託されている。このプラス
ミドをもつ形質転換酵母株は、胞子形成条件下。

ではＳＰＯＴ７遺伝子が発現されるとＳＰＯＴ７からの
ｒｅａｄ　ｔｈｒｏｕｇｈによりβ−ガラクトシダーゼ
も産生されその結果Ｘ−ＧＡＬ寒天培地で青色のコロニ
ーとなる（　’　１ａｃＺはＳＰＯＴ？構造遺伝子中の
下流部に読み枠が合うように連結されている）。即ち、
５ｐｏ−Ｘ−ＧＡＬ培地で青色になるか否かにより、胞
子形成（“分化”）の有無を容易に判別することができ
る。尚、ＳＰＯＴ７の構造遺伝子領域は、胞子形成条件
下で発現されるものであればＳＰＯＴ７遺伝子のプロモ
ータ以外の適当なプロモータによって発現させてもよい
。

続いて、このＹＥｐＢ３と先に造成した酵母の変異ＲＡ
Ｓ２遺伝子を含むプラスミドｐＲＡＳ２ＶｍＬ　ｌ　９
またはｐＲＡＳ２Ｌ＠ｕ＆８、とシャトルベクターであ
るＹＥ、１３とから第７図に示すような工程で、本発明
の１つであるプラスミドＹＥｐＢ３−ＲＡＳ２　（具体
的にはＹＥｐＢ３−　ＲＡＳ２”■’とＹＥｌ、Ｂ３−
ＲＡＳ２Ｌｅｕ６８：　コの２つのプラスミドを総称し
ＹＥｐＢ３−　ＲＡＳ２と呼ぶこともある。

）を造成する。コ（７）　７’　ラスミＦ　ＹＥｐＢ３
−　ＲＡＳ２”口９は大腸菌ＪＡ２２１株に導入され、
この菌株ＪＡ２２１　／ＹＥｐＢ３−ＲＡＳ２”口９ハ
ＳＭＢ２７９と命名され、工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研菌寄第８１４９号（ＦＥＲＭ　Ｐ−８１４
９）　として寄託されている。

尚、第７図のＹＥｐＢ３−　ＲＡＳ２においては、ＳＰ
ＯＴ７−’　１ａｃＺ遺伝子に隣接して、変異ＲＡＳ２
遺伝子（第７図ではＲＡＳ２で表わされている）が連結
されているが、該ＲＡＳ遺伝子の位置は必ずしもこれに
限るものでない。例えば、後述するように染色体ＤＮＡ
に組み込まれたものであってもよい。また、該変異ＲＡ
Ｓの構造遺伝子は他の適当な酵母のプロモータ支配下に
発現されてもよい。さらに、ここでは胞子形成に関与す
る遺伝子としてはＳＰＯＴ７を用いているが、胞子形成
条件下に発現される遺伝子であればこれに限るものでは
ない。

また、酵母の変異ＲＡＳ遺伝子としてＲＡＳ２Ｖ−Ｌ　
＋　９およびＲＡＳ２”ｕ６’を用いているが、既述し
たように胞子形成条件下で胞子形成せず細胞が死に至る
ような変異ＲＡＳ遺伝子であればこれらに限るものでは
ない。

酵母にはＭＡＴａとＭＡＴａ（或いはａとα）で表わさ
れる接合型が存在するが、酵母が胞子形成するにはこれ
らの接合型を支配する対立遺伝子（各々ＭＡＴａとＭＡ
Ｔａで表わす）がへテロ型（例えば遺伝子型としてＭＡ
Ｔａ／ＭＡＴα型：ａ／αで表わされることもある）に
なっていることが必須である。従って、１倍体酵母（通
常１倍体はＭＡＴａまたはＭＡＴａのいずれか１つの遺
伝子をもつ）や同型接合型２倍体（Ｍ＾ＴａまたはＭＡ
Ｔａのいずれかを２個もつ）などでは通常胞子形成能を
有しない。従って、第１図で造成されるプラスミドＹＥ
ｐＢａ上のＳＰＯＴ７遺伝子は、該プラスミドをａ／α
型２倍体宿主に導入しないと発現しない。従って、第７
図に示したプラスミドＹＥｐＢ３−　ＲＡＳ２もａ／α
型２倍体に導入する必要がある。

そこで、本発明者らは、１倍体酵母を宿主して使用して
本発明の目的のために使用できるようなプラスミド群を
造成した（第８図および第９図）。

まず、形質転換体の選択マーカーとなる［ＩＲＡ３遺伝
子と酵母のＭＡＴａまたはＭＡＴα遺伝子を含むプラス
ミドＹＣｐＭＡＴａおよびＹＣｐＭＡＴ　ｅｘを、プラ
スミドＤＸ（ＭＡＴａ）または２．５（ＭＡＴａ）（い
ずれもコールドスプリングハーバ−研究所のＪ、Ｈｉｃ
ｋｓ博士より大阪大学・工学部大嶋泰治博士経由で譲渡
）およびシャトルベクターＹＣｐ１９　（Ｓｔｉｎｃｈ
ｃｏｍｂ、　Ｄ、Ｔ、ジャーナル・オプ・モレキュラー
・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ　、）　１５８．１５７．１９８２）から造成
する（第８図）。

このプラスミドは、これを導入することにより１倍体酵
母の接合型支配対立遺伝子型をヘテロ（遺伝子型として
ＭＡＴａ／ＭＡＴα）にするためのもので、ＭＡＴａの
１倍体に対してはＹＣｐＭＡＴａを、ＭＡＴ　ｃｔの１
倍体に対してはＹＣｐＭＡＴａを導入することにより該
遺伝子型をヘテロにすることができる。つまり、１倍体
酵母にＹＣｐＭＡＴａまたはＹＣｌ、ＭＡＴａと第２図
に示したＹＥ、８３−　ＲＡＳ２とを形質転換すれば本
発明の目的の１つとする形質転換酵母が得られる。

ＭＡＴａまたはＭＡＴα遺伝子は、酵母の変異ＲＡＳ遺
伝子’ｌｃモツフラスミＦｐＲＡＳ２ＶａＬ１９マタハ
ｐＲＡＳ２””＠（第７図参照）に組み込んでもよい。

第９図は、ＭＡＴａ遺伝子と変異ＲＡＳ２遺伝子（ＲＡ
Ｓ２”目９又はＲＡＳ２Ｌｅｕ６８）を組み込んだブー
ｙスミドＹＣｐＭＡＴａ　−ＲＡＳ２（ＹＣ，ＭＡＴａ
−ＲＡＳ２”口９とＹＣｐＭＡＴａ−ＲＡＳ２Ｌｅｕ６
８　（Ｄ総称）の造成の概略を示したものである。第８
図のように、該プラスミドは、先に造成したｐＲＡＳ２
””　’　マタはｐＲＡＳ２Ｌ１１１Ｊ＆ｌｌ　（第７
図参照）、Ｄｘ　（ＭＡＴａ）およびＶＣ，１９から容
易に造成することができる。このプラスミドを、胞子形
成に関与する遺伝子例えばＳＰＯＴ７をもってプラスミ
ドＹＥｐＢ３（第１図参照）とともにＭＡＴａの１倍体
酵母に導入すれば、本発明の目的に適した形質転換株を
得ることができる。なお、プラスミドＹＣｐＭＡＴａ−
ＲＡｓ２ＶａＬ９は大腸菌ＪＡ２２１株に導入され、こ
の菌株ＪＡ２２１／ＹＣｐＭＡＴａ−ＲＡＳ２””　”
　はＳＢｌ’１２７Ｂと老台され、工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研菌寄第８１４８号（ＦＥＲＭ　Ｐ
−８１４８）として寄託されている。

次に、上記のようにして造成された一連のプラスミドに
よって形質転換された酵母を用いて、はたして酵母の胞
子形成即ち“分化”がＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ培地上で判別
できるか否かを検討した（第１゜第２．第３表参照）。

以下余白 筆１表 Ｒ１−６１Ａ　ＭＡＴａ／ＭＡＴαＹＥｐＢ３　　　　
　　　青色Ｒ３−６＾　ＭＡＴａ　　　　　ＹＥ、Ｒ３
白色Ｒ３−６Ａ　　ＭＡＴａ　　　　　ＹＥ、８３　＋
　ＹＣｐＭＡＴ　ｃｘ　　青色Ｒ３−４０ＭＡＴａ　　
　　ＹＥｐＢ３　　　　　　　白色Ｒ３−４Ｄ　　ＭＡ
Ｔ　ｅｘ　　　　ＹＥｐＢ３　＋　ＹＣｐＭＡＴａ　　
青色第１表は、形質転換株の接合型支配対立遺伝子かへ
テロ型になると、プラスミドＹＥｐＢ３上の胞子形成に
関与する遺伝子（ＳＰＯＴ７）が発現され（即ち“分化
”の系が働き）それに伴うβ−ガラクトシダーゼの産生
により、該形質転換株はＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ培地上で青
色コロニーとなり、接合型支配対立遺伝子かへテロでな
い場合は該形質転換株の５ｐｏ−ｘ−ＧＡＬ培地上で白
色のままであることを確認したコントロールの実験の結
果を示したもので、期待通りの現象が得られたことを示
している。

第２表 活性型ＲＡＳ変異におけるＳＰＯＴ７−　”　１ａｃＺ
の発現？１−６１Ａ　Ｍ＾Ｔａ／ＭＡＴａ　ＹＥ、Ｒ３
−ＲＡＳ２青−〃ＹＥｐＢ３−ＲＡＳ２Ｌｅｕ　白 〃〃ＹＥｐＢ３−ＲＡＳ２Ｌｅｕ白 ２３−４Ｄ　ＭＡＴａ　ＹＥ−８３”ＹＣｐＭＡＴａ−
ＲＡＳ２青〃　　　　　　　〃　　　　　　　Ｙｔｉ、
Ｒ３＋ＹＣ，ＭＡＴａ−ＲＡＳ２””雫　　白’　　　
＃　　　ＹＥ、Ｒ３＋　ＹＣ，ＭＡＴａ−ＲＡＳ２Ｌｅ
ｕ白’　　”　ＹＥ、Ｒ３−ＲＡＳ２＋ＹＣｐＭＡＴａ
青〃ｓ　　　ＹＥ、Ｒ３−ＲＡＳ２””　”　＋　ＹＣ
，ＭＡＴａ白”　　　〃ＹＥｐＢ３−ＲＡＳ２”ＩＩ＆
”　＋　ＹＣ，ＭＡＴａ白率注：染色体上にＲＡｓＶ−
ＬＩ９遺伝子をもつ宿主第２表は、酵母の変異ＲＡＳ２
遺伝子をもつプラスミ）’　、　ＹＥｐＢ３−ＲＡＳ２
ＶａＬ１９　ｔ＋　Ｌ　＜　ハＹＥｐＢ３−ＲＡＳ２Ｖ
ａＬ１９、またはＹＣｐＭＡＴａ−ＲＡＳ２”Ｌ１２も
しくはＹＣｐＭＡＴａ−ＲＡＳ２Ｌｅｕ６８。

が導入された形質転換株では、たとえ該形質転換株の接
合型支配対立遺伝子かへテロ型になっても、ＲＡＳ２遺
伝子の変異（ＲＡＳ２ＶａＬ１９またはＲＡＳ２”ｕ′
’　）により　（実際は変異ＲＡＳ２蚕白の産生により
）、胞子形成に関与する遺伝子（ＳＰＯＴ７）が抑制さ
れ結果的に該形質転換株はＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ培地上で
白色コロニーとなることを調べた実験の結果を示し、期
待通りの結果が得られたことを示している。

尚、第２表中のＹＥｐＢ３−ＲＡＳ２およびＹＣｐＭＡ
Ｔａ−ＲＡＳ２は、未変異の正常な酵母のＲＡＳ２遺伝
子を各々第２図および第９図の工程に準じて造成された
プラスミドであることを示す。同表中の宿主酵母Ｒ３−
４Ｄ（ＲＡＳ２”Ｌ１２）は、酵母の変異ＲＡＳ遺伝子
ＲＡＳ２％’−Ｌ　ｌ　９が染色体に組み込まれた（実
際は染色体上の正常なＲＡＳ２遺伝子と変異ＲＡＳ２遺
伝子とが組み替わった）１倍体酵母であり、ＹＥｐＢ３
とＹＣｐＭＡＴａの両プラスミドで形質転換された該宿
主酵母は、ＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ培地上で白色となること
から（宿主酵母が野生型ならば青色となる）、変異ＲＡ
Ｓ２遺伝子は必ずしもプラスミド上に存在することが必
須ではないことを示している。尚、この場合ある条件で
接合型かへテロ型になるような変異をもつ酵母、例えば
ａｉｒ３−８変異１倍体株（低温ではＭＡＴａ又はＭＡ
Ｔ　αの接合型を示すが高温では接合型かへテロの状態
になり接合能を示さない変異株）を宿主として用いれば
、ＹＥｐＢ３のようなプラスミドを導入するだけで目的
とする形質転換株を得ることができる。即ちＹＣｐＭＡ
Ｔａのような接合型支配遺伝子をもつプラスミドをさら
に導入する必要はない。

いずれにせよ、接合型かへテロ型になり、ＲＡＳ２変異
遺伝子をもち、酵母の胞子形成能（分化）の有無が容易
に判別できるようなものであれば本発明の形質転換株は
上記のような形質転換株に限らなくてもよい。

〔発明の効果〕 上記の第１表および第２表の結果は、本発明のプラスミ
ドおよび形質転換体が、例えばＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ培地
上のコロニーの色（青色）の有無を判別するだけで、新
しい薬剤特にｒａｓ遺伝子の変異に伴う発癌または癌化
を抑制するような特異的な薬剤をスクリーニングする系
として利用できる可能性があることを示している。即ち
、ＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ培地上での白色を青色に変えるよ
うな薬剤を選ぶことにより、新しいタイプの抗癌または
制癌剤を見出しうる可能性があることを示している。

また、前記のｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅｌｉ節に関与するカ
スケードから考え、上記のような酵母のＲＡＳ変異を利
用する以外に、松本ら（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、に、等プ
ロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・ナカデミー
・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステ
イト・オブ・アメリカ（、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ。

Ｓｃｉ、）ＵＳＡ７９．２３５５．１９８２）によって
報告されている酵母のｂｃｙｌ変異（ｃＡＭＰの生産を
増加させるような変異で、この変異をもつ酵母はＲＡＳ
変異の場合と同様、ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅに異常が生じ
胞子形成ができない）を用いても、制癌または抗癌剤の
スクリーニングが期待されよう。即ち、ｂｃｙｌ変異に
起因する異常な代謝を正常に戻す即ち胞子形成能を回復
させるような薬剤を選べばよい。この場合、ＲＡＳ変異
の代りに、染色体上にｂｃｙｌ変異をもつ酵母を宿主と
し、これに例えば酵母の胞子形成遺伝子と大腸菌”　１
ａｃＺ遺伝子とか連結されたＤＮＡ断片をもつプラスミ
ド（例えばＹＥｐＢ３）を導入した形質転換株を造成す
る。但し、ｂｃｙｌ変異を用いる場合当然のことながら
発癌の原因の１つと考えられている癌遺伝子の産物（例
えば変異ｒａｓ蛋白）に影響を及ぼす薬剤のスクリーニ
ングではない。

尚、変異ＲＡＳ蛋白はＧＴＰ加水分解活性（ＧＴＰａｇ
ｅ）を低下させること（ＭｃＧｒａｔｈ、等、ネイチ＋
　−（Ｎａｔ−ｕｒｅ）３１０，６４４．１９８４）か
ら、変異ＲＡＳ蛋白を精製しく例えば組換えＤＮＡ技術
を用いてつくられた大腸菌の培養物から精製）、試験管
内でＧＴＰａｓｅ活性が回復するような薬剤を探索する
ことも考えられるが、インビトロ（試験管内）系よりも
本発明のようによりインービボに近い系の方が目的とす
る薬剤のスクリーニングには適していると考えられる。

次に実施例によりこの発明をさらに詳細に説明する。

Ｉｔ例」ユ　　　・　に　与する遺伝子の発現がこれま
で、酵母のある種の遺伝子の支配下に大腸菌のβ−ガラ
クトシダーゼの構造遺伝子である１　ａｃＺ遺伝子を発
現させ、その結果生成するβ−ガラクトシダーゼの活性
（β−ガラクトシダーゼが生成するとその酵母はＸ−Ｇ
ＡＬ培地上で青色コロニーとなる）を指標に酵母細胞中
での該遺伝子の発現の有無を調べることに関しては種々
の報告がみられる〔例えば、Ｒｏｓｅ、　Ｍ、等、プロ
シーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オプ・サイエンシス・オプ・ザ・ユナイテッド・ステイ
ト・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７８．２４６０．１９８１）。本発明
者らは、この系を利用し：酵母の胞子形成に関与する遺
伝子の発現が容易に判別できるようなプラスミドの造成
を行った。即ち、これまで酵母の胞子形成に関与する多
くの遺伝子が知られているが、その１つであるＳＰＯＴ
７遺伝子がクローニングされているプラスミド１２５Ｌ
　−１８４（ＳＰＯＴ７遺伝子を含む約５ＫｂのＤＮＡ
断片が、プラスミドＹＥ、１３のＢａｍＨＩ切断部位に
挿入されているプラスミド）を、大阪市立大・理学部壷
井基夫博士より入手し、ＳＰＯＴ７遺伝子の発現に伴い
β−ガラクトシダーゼが生成するようなプラスミド、す
なわちＳＰＯＴ７遺伝子支配下に°１ａｃＺ遺伝子（β
−ガラクトシダーゼの構造遺伝子の５′端側か１部欠除
しているが活性あるβ−ガラクトシダーゼ活性を有する
蛋白質を生成する遺伝子をいう）が発現するプラスミド
の造成を行った（第１図Ａ。

Ｂ、およびＣ）。

プラスミド１２５Ｌ−１８４５０μｇを、制限酵素５ａ
ｌＩおよびＰｓｔＩを用いて完全に分解し、ＳＰＯＴ７
遺伝子を含む７．６ＫｂのＤＮＡ断片を寒天電気泳動に
より分離後、電気泳動（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅ）法
により遊離しエタノ−、ル沈澱により回収した。得られ
た？、　６　ＫｂのＤＮＡ断片の標品を２等分し、一方
をＸｂａｌを用いて完全に分解し、ＸｂａＩ粘着末端を
両端に有する４、　Ｉ　ＫｂよりなるＤＮＡ断片、及び
２．ＩＫｂよりなるＸｂａｌ−５ａｉｌ粘着末端を有す
るＤＮＡ断片を得、もう一方をＥｃｏＲＩを用いて限定
分解することにより５ａｉｌ−ＥｃｏＲＩ粘着末端を有
するＤＮＡ断片及びＰｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ粘着末端を有
するＤＮＡ断片を得る。それぞれを４ｕｎｉｔのエキソ
ヌクレアーゼＢａ１３１を用い３０℃で各々１分間、２
分間、又は３分間反応させた後混合しフェノール抽出し
、ＤＮＡ断片をエノール沈澱により回収した。次に旧ｎ
ｄＩ［［を用いて完全に分解し、寒天電気泳動により分
離した後それぞれ約４　Ｋｂ、約１．５Ｋｂ　、約２．
５Ｋｂ及び約３Ｋｂよりなる一方の端に旧ｎｄＩＩＩ粘
着末端もう一方はＢａ１３１分解により生じた非粘着末
端を有するＤＮＡ断片を得、それぞれをＡ、Ｂ、Ｃ及び
Ｄグループ断片とした（第１図ＡおよびＢ参照）。

次にプラスミドＹＥＰ１３を旧ｎｄＩ［［で完全に分解
し、５ａｌＩで限定分解して得られる約１０ＫｂのＤＮ
Ａ断片と、プラスミドｐＭｃ１４０３を５ＩＩＩａＩ及
び５ａｌＩで完全に分解して得られる約６Ｋｂの断片を
前述のＡ、Ｂ、Ｃ及びＤグループ断片とそれぞれ混合し
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合した。このリガーゼ
反応液を大腸菌ＪＡ２２１に形質転換しアンピシリン耐
性を示す形質転換体を得た。それぞれ約１０００個の形
質転換体を混合培養し、それより常法に従いプラスミド
ＤＮＡを分離精製した。得られたプラスミド群（ＹＨ，
Ａ、ＹＥｐＢ、ＹＥｐＣ及びＹＥｐＤ）をそれぞれ２倍
体酵母Ｘ５３１　（ＭＡＴａ／ＭＡＴα、１ｅｕ２／１
ｅｕ２．ｈｉｓ３／ｈｉｓ３．ｕｒａ３／ｕｒａ３．　
ｔｒｐｌ／１ｒｐｌ）をＩｔｏらの方法〔ジャーナル・
オプ・バタテリオロジー（Ｊ　−Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
）　１５３．１６３゜１９８３）により形質転換し、ロ
イシン非要求性形質転換体を得た。生じたロインシン非
要求性コロニーを４０　μｇ／１ｍ　１２のＸ−Ｇａ１
　（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−Ｄ
−ガラクトシド）を含む胞子形成培地（１％酢酸カリウ
ム、０．１％酵母エキス、０．０５％クルコース、２％
寒天ヲ５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液でｐＨ７，０に調
整した寒天培地（塩１ｓＰｏ−Ｘ−ＧＡＬ寒天培地と呼
ぶ）にレプリカし、３０℃で１０日間培養を続けた。

もし’　１ａｃＺ遺伝子が発現すればそのコロニーは青
色となる。ＹＥｐＢを供与ＤＮＡとした酵母形質転換体
群より青色を示すコロニーが４個得られた（約１％の頻
度）。それぞれ酵母形質転換体よりプラスミドＤＮＡを
分離し、それらを供与ＤＮＡとして大腸菌ＪＡ２２１に
形質転換を行いアンピシリン耐性コロニーについてプラ
スミドの解析を行った。

その結果、いずれも約１８Ｋｂのプラスミドであること
、さらに制限酵素解析の結果それらのプラスミドは約１
．５ＫｂのＳＰＯＴ？遺伝子由来の断片と約６ＫｂのＩ
ａｃＺ遺伝子由来の断片がＹＨＰ１３の旧ｎｄＩ［Ｉ、
５ａｌＩ部位に挿入されたものであることが明らかとな
った。４個の酵母形質転換体由来のプラスミドをそれぞ
れＹＥｐＢｌ、ＹＥｐＢ２、ＹＥｐＢ３及びＹＥＪ４と
名付けた（第１図Ｃ参照）。

次にこの４種のプラスミドを胞子形成能の良い２倍体酵
母Ｒ１−６Ｒ１−６１Ａ（／ＭＡＴ　ｅｘ　、　Ｉｙｓ
２／１ｙｓ２．１ｅｕ２／１ｅｕ２．　ｕｒａ３／ｕｒ
ａ３）に形質転換し、得られたロイシン非要求性形質転
換体をＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ寒天培地を用いて解析したと
ころ、いずれのプラスミド（ＹＥ、８１〜ＹＥｐＢ４）
　（７）場合においてもＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ培地上で２
〜３日培養することにより青色コロニーを形成シた。

また、この青色コロニーの細胞はいずれも胞子形成して
いた。また、４０μｇ／ｍｆｆ　Ｘ−ＧＡＬを含む栄養
増殖寒天培地Ｃ０，６７％Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅ
ｎｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ）。

２％グルコース、２％寒天、３６／１ｇ／ｍ１Ｌ−リジ
ン、２９／ｍ　ｌウラシル〕上では３日培養後も青色を
示さず、胞子形成も認められなかった。

次に上記形質転換体のうち、ＹＥｐ８３形質転換体（Ｒ
１−６１Ａ　（ＹＥｐＢ３）　）を選び、栄養増殖液体
培地で培養した対数増殖後期の細胞を水で洗滌後１％の
酢酸カリウム、水、栄養増殖液体培地それぞれに約５　
ＸＩＯ’細胞／細胞１取ｌ様に懸濁３０℃で３日間培養
した。続いて、クロロホルムとＳＯＳで処理した細胞を
用いてβ−ガラクトシダーゼ活性をＪ。

Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒの方法に準じて行った〔エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ゼネティクス（Ｅｘｐｅｒ
ｉ−ｍｅｎｔ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙｚ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒｒ　ＮＹ）＋　ｐｐ、３５２３５５、１９７２）。

その結果、１％酢酸カリウムに懸濁した場合にのみ活性
が認められた。その活性は２．４ｕｎｉｔ／ｍｊ！懸渇
液１　ｕｎｉｔ／ｎｍｏｌの０−ニトロフェノール−β
−Ｄ−ガラクトシドを２８℃、１分間に分解する量）で
あった、又胞子形成も１％酢酸カリウムを用いた場合の
み認められた。

次に１倍体酵母の場合について検討した。ＹＥｐＢ３を
用い１倍体酵母Ｒ３−４Ｄ　（ＭＡＴ　ｃｔ　、　１ｅ
ｕｚ＋　ｕｒａｓ”）を形質転換した。得られたロイシ
ン非要求性形質転換体を前述の５ｐｏ−に−ＧＡＬに移
し３０℃で培養した。１週間後でもそのコロニーは青色
を示さなかった。

しかしクローン化されたＭＡＴａの遺伝子を含むプラス
ミドＹＣｐＭＡＴａ　（第８図）を共存させた形質転換
ではＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ上で３日後青色を示した。又こ
の２種のプラスミドを有する酵母形質転換体よりＹＣｐ
ＭＡＴａ　（ウラシルの要求性で選択）を脱落させたク
ローンについて検討した結果やはり青色を示さなかった
。この結果はＹＥｐＢ３の”　１ａｃＺの発現にはＭＡ
ＴａおよびＭＡＴα両ＭＡＴ遺伝子の存在が必要である
ことおよびＹＥｐＢ３の’　１ａｃＺ遺伝子はＳＰＯＴ
７遺伝子の支配下で胞子形成時に特異的に発現している
を示している。

Ｗ側ヱユ　ＲＡＳ２゛　　云　のクローニング（２゛）
サツカロミセス酵母χ２１８０−ＩＢ（ＭＡＴα５ＵＣ
２ｍａ１ｇａｊ！　２　ＣＵＰＬ；Ｙｅａｓｔ　ｇｅｎ
ｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　ｃｅｎｔｅｒカリフォルニア大
学バークレー校から入手可能）の染色体ＤＮＡをＣｒｙ
ｅｒらの方法〔メソド・イン・セル・バイオロジー（Ｍ
ｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｖｏ
ｌ、１２゜３９−４４．１９７５）に従って分離した。

ＲＡＳ２遺伝子はＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｍ分解により生
じる約３ＫｂＤＮＡ断片上にあることはすでに報告され
ている（Ｓ、Ｐｏｗｅｒｓ等：セル（Ｃｅ１１）３６．
６０７−６１２．１９８４；およびり、ＤｅＦｅｏ−Ｊ
ａｎｅｓ等：ネイチャ−（Ｎａｔｕｒｅ）３０６゜７０
７−７０９．１９８３　）　、そ、：、　テＸ２１８０
−ＩＢより得られた染色体ＤＮＡをｆｉｃｏＲＩ及び旧
ｎｄｌｌｒで分解したＤＮＡ断片を寒天ゲル電気泳動法
により分離し、約３ＫｂのＤＮＡ断片を含む寒天ゲルを
切り出し電気溶出法（ｅ　ｌｅｅ　ｔｒｏｅ　１　ｕ　
ｔｅ）により遊離させ、エタノール沈殿によりＤＮＡを
回収した。一方、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ
Ｉ［［で分解後、４．３ＫｂよりなるＤＮＡを分離精製
した。この両ＤＮＡ断片を混合しＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて結合し、大腸菌ＪＡ２２１を形質転換した。又Ｓ
、Ｐｏｗｅｒｓらの報告（前述）によるとＲＡＳ２遺伝
子を含む３ＫｂＤＮＡ断片には１ケ所のＥｃｏＲＶ、Ｐ
ｓｔＩ切断部位、２ケ所のＨｐａＩ切断部位がある。従
って先に得られた大腸菌形質転換体のプラスミドを解析
し、クローニングした約３ＫｂＤＮＡ断片上に１ケ所の
ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩ、２ケ所のＨｐａＩ切断部位を有
するものを得た。そのうちの１つのプラスミドを、ＲＡ
Ｓ２とした。この、ＲＡＳ２をＥｃｏＲＩ　とＰｓｔＩ
で分解し、ＲＡＳ２遺伝子を含む１．９Ｋｂ　ＤＮＡ断
片を得た。このＤＮＡ断片をＭ１３〜．１８ＲＦＴ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　ｐ−ｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓより入手）のＰｓ　ｔｌとＥｃｏ　Ｉ切断部位にクロ
ーニングし、Ｍ２Ｓ−ｐ１８−ＲＡＳ２（ＲＩ／Ｐｓｔ
ｌ）を得た。Ｍ２Ｓ、、１Ｂ−ＲＡＳ２（ＲＩ／Ｐｓｔ
Ｉ）の大腸菌ＪＭ１０３形質転換体よりファージ１本鎖
ＤＮＡを分離し、Ｍ１３シーケンシングブライマー（Ｍ
１３ペンタデカマー・シーケンシングプライ？−：Ｎｅ
ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いてＦ
、Ｓａｎｇｅｒの方法〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
　、　２１４．１２０５−１２１０．１９８１）に従っ
て塩基配列を決定した。ＰｓｔＩ切断部位よりＥＣ０Ｉ
に向っての塩基配列はＳ、Ｐｏｗｅｒｓらの報告（前述
）と一致した。

実施例２で得られたＭ１３＋ｗｐ１８　ＲＡＳ２（Ｒ１
／Ｐｓｔ［）を用いて、Ｔ、　Ｋａｔａｏｋａらの報告
〔セノ喧Ｃａ１ｌ）３７゜４３７−４４５．１９８４）
と同様の方法によりＲＡＳ２蛋白のＮ末端より１９番目
のアミノ酸残基（グリシン）をバリンに変換させるため
の、該グリシンのコドンの２番目の塩基対をＣ／Ｇから
Ａ／Ｔに化学合成プライマーＤＡＮを用いて試験管内変
異を行った（第３図参照）。つまり化学合成したＡＢ１
１２−１５ｒ＊ｅｒ　ＤＮＡ　（５’−＾＾ＣＡＣＣＡ
ＡＣＡＣＣＡＣＣ−３’　”）　　とＭ１３ｍｐ１８−
ＲＡＳ２（Ｒ１／Ｐｓｔｌ）ファージＤＮＡを混合し、
アニールさせた後ポリメラーゼＫｌｅｎｏｗ断片及び４
ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ。

ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ）を加えＤＮＡ合成した後
、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを加え反応させた。反応溶液を
用いて大腸菌ＪＭ１０３を形質転換し、生じたプラーク
をニトロセルロースフィルター（Ｓ＆Ｓ社製ＢＡ８５）
に移した。フィルターを０．ＩＮ　ＮａＱＨ，１，５Ｍ
　ＮａＣ１を含む溶液に３０秒間浸し、ペーパタオル上
に置き溶液を除いてから０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　
（ｐＨ７，４）、２ＸＳＳＣ（１ｘ　ｓｓｃは０．１５
Ｍ　ＮａＣ１、０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム、　ｐ
Ｈ７，０）に３０秒間浸した後ペーパタオル上に置いた
。次に２ＸＳＳＣに３０秒間浸した後ペーパータオル上
に置き水分を除いた。次に室温で１時間乾燥させ、続い
て８０℃で３時間加熱することによりファージＤＮＡを
固定した。

次に５′末端をｒ　”−Ｐ−ＡＴＰとポリヌクレオチド
キナーゼを用いラベルしたＡＢ１１２をプローグとして
ハイブリダイゼーションを行った。方法はＪｅｆｆｒｅ
ｙｓとＦｌａｕｅｌｌの方法〔セル（ＣｅｌｌＨ２：４
２９−４３９　、１９７７）に準じて行った。ハイブリ
ダイゼーションは４５℃で１８時間行ない、反応終了後
、フィルターを０．　Ｉ　Ｘ５ＳＣ−０，１χＳＤＳ溶
液を用い４５℃で４０分間洗滌を２回行った。フィルタ
ーを乾燥し、ラジオオートグラフした後、ハイブリダイ
ズしたプラークを検討した。ハイブリダイズしたプラー
クよりファージをとり大腸菌ＪＭ１０３に感染させ再び
プラークを形成させた。生じたプラークを前述の方法に
より再びラベルしたＡＢ１１２をプローブとしてハイブ
リダイゼーションを行ない、ハイブリダイズしたプラー
クを検出した。このプラークよりファージを得、大腸菌
ＪＭ１０３に感染させた後培養した。培養終了後遠心分
離を行ないその上清よりファージＤＮＡ　、沈澱した細
胞より二重鎖ＤＮＡを分離した。ファージＩ）ＮＡを用
いて前述の方法によりＤＮＡの塩基配列を検討した結果
目的の塩基配列変化が起っていた（１９番目のグリシン
に相当するコドン中でバリンに相当するコドンに変化）
。

このプラスミツド（Ｍ１３＋ａｐ１Ｂ−ＲＡＳ２”Ｌ１
２（Ｒ１／Ｐｓｔｌ））二重鎖ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及び
Ｐｓｔｌで分解し得られる１、９　ＫｂのＤＮＡ断片及
びｐＲＡＳ２をＰｓｔｌ及びＥｃｏＲＩで分解したとき
に得られる０、７５Ｋｂ、　　４．７Ｋｂ断片を混合し
、連結処理し、ｐＲＡＳ２Ｖ−Ｌｌ’ｌを得た（第５図
）。

続いて、上記と同様な手法を用いてｐＲＡＳ２Ｌ″ｕ６
″の造成を行った（第４図および第６図参照）。即ち、
ｐＲＡＳ２をＰｓｔｌと旧ｎｄＩ［Ｉを用いて分解した
ときに得られるＲＡＳ２遺伝子領域を含む約１．ＩＫｂ
のＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ１８のＰｓｔＩ及び旧ｎｄＩ
［Ｉ切断部位にクローニングし、Ｍ１３ｍｐ１８−ＲＡ
Ｓ２　（Ｐｓｔｌ／Ｈｉｎｄｌ［［）を得た。このＭ１
３ｍｐ１８−ＲＡＳ２　（ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩ［［）
と化学合成したＡＢ１２７１５ｍｅｒＤＮ＾（５’　−
ＴＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＣ−３’　”）を用いて
ＲＡＳ２蛋白のＮ末端より６８番目のグルタミン残基に
相当するコドンであるＣＡＧからＣＴＧ　（口イシンに
相当する）の変換を前述と同様の方法で行った（第４図
）。得られたＲＡＳ２蛋白のＮ末端より６８番目のアミ
ノ酸残基のコドンがグルタミンのコドンからロイシンの
コドンに変化したＭ１３ｍｐ１８−ＲＡＳ２ＶａＬ１９
を得た。尚、ＤＮＡ　（７）塩基配列をそのＲＦＩ型二
重鎖ＤＮＡ　、及びＭ１３リバーズ・シーケンシングブ
ライマー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｂａｂｓ社
製）を用いて前述の方法で確認した。次にこの二重鎖Ｄ
ＮＡをＰｓｔｌ及び旧ｎｄｎＩを用いて切断し得られる
約１．ＩＫｂ　ＤＮＡ断片とｐＲＡＳ２をＰｓｔＩ及び
旧ｎｄｎ［を用いて切断し得られる２、６５Ｋｂ及び３
．６ＫｂのＤＮＡ断片を混合し連結処理し目的とするプ
ラスミドｐＲＡＳ２Ｌ＠Ｉｌ＆Ｉを得た（第６図）。

ｉ　　ＹＥＰＢ３−ＲＡＳ２（ＹＥｐＢａ−ＲＡＳ２ｖ
０””。

ＹＥＰＢ３−ＲＡＳ２Ｌｅｕ）　１７）　　製（第７　
）続いて胞子形成時の特異的発現を検討できるＳＰＯＴ
７遺伝子支配下に°ＩａｃＺ遺伝子を発現できる領域（
実施例１参照）、及びＲＡＳ２　（３ＩＲＡＳ２Ｌｅｕ
もしくはＲＡＳ２Ｌｅｕ）遺伝子を共に含むプラスミド
を以下のようにして作製した（第７図）、プラスミドＹ
Ｅｐ１３　（Ｊ、Ｂｒｏａｃｈ等、ジーン（Ｇｅｎｅ）
　８　、１２１−１３３、１９７９）をＢａｍＨＴで分
解後、Ｔ４ＯＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いてＢ
ａｍＨＩ粘着末端を平滑末端にし、さらにＰｖｕ　ＩＩ
で完全分解後連結処理することにより、ＹＥ、１３のＢ
ａｍＨＩ切断部位とＰｖｕ　ＩＩ切断部位との間の１．
７Ｋｂ　ＤＮＡ断片が欠落したＹＥｐ１３ΔＢａｍ旧を
作製した０次に、実施例１で得られたＹＥｐＢａをＳａ
ｌ　Ｉを用いて完全に分解した後Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼ及びｄＮＴＰを用いて５ａｌｌ粘着末端を平滑末端と
旧ｎｄＩ［［を用いて分解し、ＳＰＯＴ？遺伝子及び’
　１ａｃＺ遺伝子を含む約７．５ＫｂのＤＮＡ断片を前
述の方法で分離した。一方、ｐＲＡＳ２　（実施例２参
照）、又はｐＲＡＳ２０目９もしくはｐＲＡＳ２””＠
（実施例３〜６参照）をＥｃｏＲＩを用いて分解した後
、Ｔ４ＯＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰを用いてＥｃｏ
ＲＩ粘着末端を平滑末端としさらにＢａｍＨＩを用いて
分解し、ＲＡＳ２遺伝子（又はｕｓ２ＶａＬ１９もしく
はＲＡＳ２Ｌｅｕ遺伝子）を含む約３．３ＫｂのＤＮＡ
断片を前述の方法で得た。

一方、先に作製したＹＨｐ１３ΔＢａｍＨＩを旧ｎｄＩ
［Ｉ及びＢａｍＨＩを用いて完全に分解し、９．ＯＫｂ
のＤＮＡ断片を得た。そして、先に得たＤＮＡ断片を含
めこれらの３種のＤＮＡ断片を混合し連結処理すること
により目的とするプラスミドＹＥｐＢ３−ＲＡＳ２　、
ＹＥｐＢａ−ＲＡＳ２ＶａＬ１９、およびＹＥｐＢａ−
ＲＡＳ２Ｌｅｕを得た。

ここで得られた３種のプラスミド及びＹＥｐＢａをそれ
ぞれ２倍体酵母Ｒ１−６１Ａに形質転換し得られたロイ
シン非要求性形質転換体をＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ寒天培　
。

地を用いて解析したところ、ＹＥｐＢ３、ＹＥｐＢａ　
−ＲＡＳ２（野性型ＲＡＳ２）による形質転換体は青色
コロニートナーｙ　タカＹＥｐＢ３−　ＲＡＳ２””　
’、ＹＥｐ８３−ＲＡＳ２”ｕｈ”は白色コロニーであ
り（第２表参照）、後者の形質転換体でのＳＰＯＴ７の
発現は阻害されていた。

ｌｆＬ例５．　　ＹＣＭＡＴａＳＹｃ　ＭＡＴａの　１
（第８皿） ＭＡＴａ又はＭＡＴ　α遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−Ｈｎ
ｉｄ　Ｉ［［ＤＮＡ断片がｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−
Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ切断部位にクローニングされたプラス
ミドＤＸ　（ＭＡＴａ）および２．５　（ＭＡＴａ）（
コールドスプリングハーバ−研究所、Ｊ、Ｈｉｃｋｓよ
り成人・工学部・醗酵工学科大島教授経由で入手）をそ
れぞれＥｃｏＲＩで分解後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及
び４ｄＮＴＰを用いてＥｃｏＲＩ粘着末端を満たすこと
により平滑末端とした。次にそれぞれにＳａｌ　Ｉリン
カ−を加え連続処理することによりＳａｔ　Ｉ切断部位
を挿入したｐＢＲ３２２−ＭＡＴａ−３ａｌ　Ｉおよび
ｐＢＲ３２２−ＭＡＴ　ａ−３ａｌを得た−　ｐＢＲ３
２２−ＭＡＴａ−Ｓａｌ　ＩおよびｐＢＲ３２２−ＭＡ
Ｔａ−３ａｌ　ＩをそれぞれＳａｌ　ＩとＢａ１ＩＩＩ
Ｉで分解し、ＭＡＴａまたはＭＡＴα遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を得た。一方、ＹＣ，１９（Ｄ、Ｔ、Ｓｉｎｃｈ
ｃｏｍｂ、Ｃ。

ＭａｎｎおよびＲ，１１，Ｄａｖｉｓ：ジャーナル・オ
プ・モノキエラーバイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．’Ｂｉｏ
ｌ）１５８．１５７−１７９゜１９８２）をＳａｌ　ｒ
とＢａｍＨＩで分解し、ＣＥＮ４＋　ａｒｓｌ＋ＵＲＡ
３を含むＤＮＡ断片を得、先に得たＭＡＴａ又はＭＡＴ
α遺伝子を含むＤＮＡ断片と混合後連結処理することに
より目的とするプラスミドＹＣｐＭＡＴａおよびＹＣＰ
ＭＡＴαを得た（第８図）。

１倍体宿主においてＲＡＳ２遺伝子のＳＰＯＴ？遺伝子
発現に及ぼす影響をみる為にＭＡＴ遺伝子とＲＡＳ２遺
伝子とを共に有するプラスミドを作製した。ベクターと
して低コピー数プラスミドであるＶＣ，１９を用いた。

ｐＲＡＳ２　（又はｐＲＪＳ２ＶａＬ　ｌ　９もしくは
ｐＨ６Ｓ２Ｌａｕ＆＠）をＥｃｏＲＩ及びＢａａ＋ＨＩ
で分解しＲＡＳ２遺伝子を含む約３．３ＫｂのＤＮＡ断
片を得た。次に、ＶＣ，１９を旧ｎｄｎＩを用いて部分
的に切断し、生じた粘着末端を７４ＤＮＡポリメラーゼ
及び４ｄＮＴＰを用いて満たし平滑末端にした後Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで結合し、ｙｃ、１９のＴＲＰＩ遺伝子上
にある旧ｎｄｌｌｌ切断部位の消失したＹＣｐ１９　（
Ｈ）を得た。このＶＣ，１９（Ｈ）をＨｉｎｄｌＩ［お
よびＢａｌ１ｌｌを用いて完全に分解し、ＵＲＡ３遺伝
子、ＡＲＳＩ遺伝子及びＣＥＮ４遺伝子を含むＤＮＡ断
片を得た。一方ＤＸ（ＭＡＴａ）をＥｃｏＲＩ及びＨｉ
ｎｄｌ［［を用いて完全に分解し、ＭＡＴａ遺伝子を含
むＤＮＡ断片を得た。これらの３種のＤＮＡ断片を混合
し連結することにより目的とするプラスミドＹＣ，ＭＡ
Ｔａ　−ＲＡＳ２゜ＹＣｐＭＡＴａ−ＲＡＳ２Ｌｅｕ　
、およびＹＣｐＭＡＴａ−ＲＡＳ２Ｌｅｕを得た。

ヌＪＦ倒ｊユＳＰＯＴ７−　’　１ａｃＺ　　　におけ
る　八実施例１で得られたＹＥｐＢａを用いてａ／α型
２倍体酵母Ｒ１−６１Ａ　（ＭＡＴａ／ＭＡＴα）、　
α接合型１倍体酵母Ｒ３−Ｒ３−６Ａ（ａ：　、　Ｌｅ
ｕ２．ｕｒａ３）及びα接合型１倍体酵母Ｒ３−４Ｒ３
−４０（、Ｌｅｕ２＋　ｕｒａ３）を形質転換しロイシ
ン非要求性形質転換体を得た。それぞれをプラスミド選
択寒天培地（Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ
　Ｗｌｏ　ａｍｉｎ。

ａｃｉｄ　（Ｄｉｆｃｏ社製”）　０．６７％、グルコ
ース２％、寒天２％、Ｌ−リジン３６μｇ／ｍｊ！　、
ウラシル２９　ｔｔ　ｇ／ｍｌ〕で３０℃、３日間増殖
させた後生じたコロニーをＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ寒天培地
に移し、３０℃で培養した。

培養３日後、ａ／α２倍体酵母体酵母Ｒ１Ａを宿主とし
た場合は、その形質転換体のコロニーは青色を示した。

しかしＲ３−６ＡおよびＲ３−４０を宿主とした場合は
、いずれの形質転換体も７日後も呈色しなかった。一方
、Ｒ３−６Ａを、実施例４で得られたＭＡＴα遺伝子を
有するＹＣｐＭＡＴαとＹｌｉ、Ｂａとで同時に形質転
換体した、あるいはＲ３−４Ｄを、ＭＡＴａ遺伝子を有
するＹＣＪＡＴａとＹＩ！ｐＢ３とで同時に形質転換体
したロイシン及びウラシル非要求性形質転換体クローニ
ン１よ、ＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ寒天寒天上地上０℃培養３
日後、青色のコロニーを与えた。しかし、Ｒ３−６Ａ　
（ＹＥｐＢ３゜ＹＣ，ＭＡＴα〕をウラシルを含む選択
場培地で培養し、ウラシル要求性となったクローン、即
ちＶＣ，ＭＡＴαプラスミドが脱落したクローンについ
て検討した結果、ＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ寒天寒天上地上呈
色反応はみられなかった。又それらのウラシル要求性ク
ローンはすべてａ接合型を示したがウラシル非要求性ク
ローンは無接合型であった。Ｒ３−４Ｄ　　（ＹＥｐＢ
ａ。

Ｙ　Ｃｐ　Ｍ　Ａ　Ｔ　ａ　）についても同様な結果が
得られた。これらの結果は、ＳＰＯＴ７−１ａｃＺ遺伝
子は、接合型に依存しており、ＭＡＴａおよびＭＡＴα
両遺伝子を有する宿主においてのみ発現されることを示
している。

続いて、ＲＡＳ２遺伝子の変異によるＳＰＯＴ７−　’
　１ａｃＺの発現への影響を調べるため、ＳＰＯＴ？−
’　ＩａｃＺが発現されＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ培地上で青
色コロニーを呈するような形質転換株となる宿主（第１
表参照）に、変異ＲＡＳ２遺伝子を含むプラスミドの導
入を行い、該形質転換株のＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ培地上で
のコロニーの呈色の有無を実施例７で述べた同様な方法
で調べた。その結果を第２表に示す。

実施例４でも述べたように、野生型のＲＡＳ２遺伝子を
含むプラスミドＹｌ！、Ｂ３−ＲＡＳ２で形質転換され
たＭＡＴａ／ＭＡＴ　ａ型２倍体は、ＳＰＯ−Ｘ−ＧＡ
Ｌ培地上で青色のコロニーを与えたが、変異ＲＡＳ２遺
伝子を含むプラスミド、ＹＥｐＢａ−ＲＡＳ２””　９
まタハＹＥｐＢ３−ＲＡＳ２”“８で形質転換された上
記２倍体のコロニーは白色を呈し、ＳＰＯＴ７−　’　
１ａｃＺの発現が阻止されていた。また、第２表に示す
ように、野生型のＲＡＳ２遺伝子を含むプラスミドＹＣ
，ＭＡＴａ−ＲＡＳ２によって形質転換された１培体形
質転換体は、ＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ培地上で青色のコロニ
ーを与えるのに対し、変異ＲＡＳ２遺伝子をもつプラス
ミドＹＣｐＭＡＴａ−ＲＡＳ２”■”またはＹＣｐＭＡ
Ｔａ−ＲＡＳ２””＠によって形質転換された上記と同
じ宿主の１倍体形質転換株は白色コロニーを与えた。ま
た、同様な結果は、ＹＥｐＢ３−ＲＡＳ２関連のプラス
ミドによって形質転換される１倍体宿主酵母においても
得られた。即ち、野生型のＲＡＳ２遺伝子をもつＹＥｐ
Ｂ３−ＲＡＳ２プラスミドの代りに、変異ＲＡＳ２遺伝
子をもツＹＥｐＢ３−ＲＡＳ２”’　”またはＹＥｐＢ
３−ＲＡＳ２Ｌ″ｕ”　テ形質転換された１倍体宿主は
、ＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ培地上で前者が青色を呈したのに
対し、後者では白色を呈した。

さらに、ＹＥｐＢ３とＹＣｐＭＡＴａ両プラスミドによ
って形質転換されＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ培地上で青色を呈
するようになるＭＡＴα型宿主Ｒ３−４０（第１表参照
）の染色体上の野生型ＲＡＳ２遺伝子の代りに、変異Ｒ
ＡＳ２遺伝子（ＲＡＳ２ＶａＬ１９）が挿入された宿主
〔第２表）Ｒ３−４０（ＲＡＳ２Ｖ■１９）〕に上記と
同じ２種類のプラスミドが導入された形質転換株はＳＰ
Ｏ−Ｘ−ＧＡＬ培地上で白色を呈した。

【図面の簡単な説明】

第１図Ａ、Ｂ、及びＣは、プラスミドＹＥｐＢ３の作製
方法を示す図であり； 第２図は、ＲＡＳ２遺伝子の分離方法を示し、第３図は
、Ｍ１３ファージを用いた試験管内変異法によるＲＡＳ
２”ＬＩ　９遺伝子の作製方法を示し；第４図は、Ｍ１
３ファージを用いた試験管内変異法によるＲＡＳ２”ｕ
＆”遺伝子の作製方法を示し；第５図は、プラスミドｐ
ＲＡＳ２”’　＋　９の作製方法を示し： 第６図は、プラスミドｐＲＡＳ２Ｌ１１＋１＆１１の作
製方法を示し； 第７図は、プラスミＦｐＢ３−ＲＡＳ２（ＹＥ、Ｒ３−
ＲＡＳ２”’　”ＹＥｐＢ３−ＲＡＳ２ＬＬ■６”）の
作製方法を示し；第８図は、プラスミドＹＣｐＭＡＴａ
及びＹＣ，ＭＡＴ　ｆｆの作製を示し；そして、 第９図はプラスミド１’ＣＩ、ＭＡＴａ　−ＲＡＳ２、
ＹＣｐＭＡＴａ　−ＲＡＳ２ＶａＬ１９及びＹＣｐＭＡ
Ｔａ−ＲＡＳ２Ｌｅｕ　（７）作製方法を示す。 以下余白 第５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酵母の胞子形成に関与する遺伝子の下流に大腸菌β
   −ガラクトシダーゼの構造遺伝子領域が連結されたＤＮ
   Ａ断片が組み込まれた酵母プラスミド。 ２、酵母の胞子形成に関与する遺伝子が発現されるとそ
   れに伴って大腸菌β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子も
   発現されるように、酵母の胞子形成に関与する遺伝子と
   大腸菌β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子が連結されて
   いることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の酵母
   プラスミド。 ３、酵母の胞子形成に関与する遺伝子がＳＰＯＴ７で表
   わされる特許請求の範囲第１項又は第２項記載の酵母プ
   ラスミド。 ４、大腸菌β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子領域が‘ｌ
   ａｃＺで表わされる特許請求の範囲第１項又は第２項記
   載の酵母プラスミド。 ５、酵母がサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
   ｅｓ）属に属する特許請求の範囲第１項〜第３項のいず
   れか１項に記載の酵母プラスミド。 ６、ＹＥ＿ｐＢ３で表わされる特許請求の範囲第１項〜
   第５項のいずれか１項に記載の酵母プラスミド。 ７、酵母の胞子形成に関与する遺伝子が発現されるとそ
   れに伴って大腸菌β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子領
   域も発現されるように酵母の胞子形成に関与する遺伝子
   と大腸菌β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子領域が連結
   されたＤＮＡ断片、および動物の発癌遺伝子とホモロジ
   ーを有し且つ突然変異を含む酵母由来の遺伝子が組み込
   まれた酵母プラスミド。 ８、動物の発癌遺伝子がヒトｒａｓ遺伝子である特許請
   求の範囲第７項記載の酵母プラスミド。 ９、発癌遺伝子とホモロジーのある酵母由来の遺伝子が
   酵母の由来のＲＡＳ２遺伝子である特許請求の範囲第７
   項記載の酵母プラスミド。 １０、酵母由来の遺伝子上の突然変異が酵母の胞子形成
   を抑制するような点突然変異（ｐｏｉｎｔ　ｍｕｔａ−
   ｔｉｏｎ）である特許請求の範囲第７項記載の酵母プラ
   スミド。 １１、点突然変異が、ＲＡＳ２＾Ｖ＾ａ＾Ｌ＾１＾９ま
   たはＲＡＳ２＾Ｌ＾ｅ＾ｕで表わされる変異である特許
   請求の範囲第１０項記載の酵母プラスミド。 １２、ＹＥｐＢ３−ＲＡＳ２＾Ｖ＾ａ＾Ｌ＾１＾９また
   はＹＥｐＢ３−ＲＡＳ２＾Ｌ＾ｅ＾ｕ＾６＾８で表され
   る特許請求の範囲第７項〜１１項のいずれか１項に記載
   の酵母プラスミド。 １３、酵母の胞子形成に関与する遺伝子が発現されると
   それに伴って大腸菌β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子
   領域も発現されるように酵母の胞子形成に関与する遺伝
   子と大腸菌β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子領域とが
   連結されたＤＮＡ断片、および動物の発癌遺伝子とホモ
   ロジーを有し且つ突然変異を含む酵母由来の遺伝子が組
   み込まれた酵母プラスミドによって形質転換されたＭＡ
   Ｔａ／ＭＡＴα型２倍体酵母形質転換株。 １４、上記新規な酵母プラスミドがＹＥｐＢ３−ＲＡＳ
   ２＾Ｖ＾ａ＾Ｌ＾１＾９またはＹＥｐＢ３−ＲＡＳ２＾
   Ｌ＾ｅ＾ｕ＾６＾８である特許請求の範囲第１３項記載
   の形質転換株。 １５、動物の発癌遺伝子とホモロジーを有し且つ突然変
   異を含む酵母由来の遺伝子と、ＭＡＴａまたはＭＡＴα
   で表される酵母の接合型支配対立遺伝子とが組み込まれ
   た酵母プラスミド。 １６、ＹＣｐＭＡＴａ−ＲＡＳ２＾Ｖ＾ａ＾Ｌ＾１＾９
   またはＹＣｐＭＡＴａ−ＲＡＳ２＾Ｌ＾ｅ＾ｕ＾６＾８
   で表される特許請求の範囲第１５項記載の酵母プラスミ
   ド。 １７、酵母の胞子形成に関与する遺伝子が発現されると
   それに伴って大腸菌β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子
   も発現されるように酵母の胞子形成に関与する遺伝子と
   大腸菌β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子とが連結され
   たＤＮＡ断片が組込まれた酵母プラスミドと、動物の発
   癌遺伝子とホモロジーを有し且つ突然変異を含む酵母由
   来の遺伝子とＭＡＴａまたはＭＡＴαで表される酵母の
   接合型支配対立遺伝子とが組み込まれた酵母プラスミド
   とによって形質転換された１倍体酵母形質転換株。 １８、ＹＥｐＢ３で表されるプラスミドと、ＹＣｐＭＡ
   Ｔａ−ＲＡＳ２＾Ｖ＾ａ＾Ｌ＾１＾９またはＹＣｐＭＡ
   Ｔａ−ＲＡＳ２＾Ｌ＾ｅ＾ｕ＾６＾８で表されるプラス
   ミドとによって形質転換された特許請求の範囲第１７項
   記載の酵母形質転換株。 １９、酵母の胞子形成に関与する遺伝子が発現されると
   それに伴って大腸菌β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子
   領域も発現されるように酵母の胞子形成に関与する遺伝
   子と大腸菌β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子領域とが
   連結されたＤＮＡ断片、および動物の発癌遺伝子とホモ
   ロジーを有し且つ突然変異を含む酵母由来の遺伝子が組
   み込まれた酵母プラスミドと、ＭＡＴａまたはＭＡＴα
   で表される酵母の接合型支配対立遺伝子とが組み込まれ
   た酵母プラスミドとによって形質転換された１倍体酵母
   形質転換株。 ２０、ＹＥｐＢ３−ＲＡＳ２＾Ｖ＾ａ＾Ｌ＾１＾９又は
   ＹＥｐＢ３−ＲＡＳ＾Ｌ＾ｅ＾ｕ＾６＾８で表わされる
   プラスミドと、ＹＣｐＭＡＴａまたはＹＣｐＭＡＴαで
   表わされるプラスミドとにより形質転換された特許請求
   の範囲第１９項記載の酵母形質転換株。 ２１、酵母の胞子形成に関する遺伝子が発現されるとそ
   れに伴って大腸菌β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子領
   域も発現されるように酵母の胞子形成に関与する遺伝子
   と大腸菌β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子領域とが連
   結されたＤＮＡ断片が組み込まれている酵母プラスミド
   、およびＭＡＴａまたはＭＡＴαで表される酵母の接合
   型支配対立遺伝子が組み込まれたプラスミドによって形
   質転換された、核内染色体上にＲＡＳ変異をもつ１倍体
   形質転換株。 ２２、ＲＡＳ変異がＲＡＳ２＾Ｖ＾ａ＾Ｌ＾１＾９また
   ＲＡＳ２＾Ｌ＾ｅ＾ｕ＾６＾８で表される変異である特
   許請求の範囲第２１項記載の形質転換株。 ２３、酵母の胞子形成に関与する遺伝子が発現されると
   それに伴って大腸菌β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子
   領域も発現されるように酵母の胞子形成に関与する遺伝
   子と大腸菌β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子領域とが
   連結されたＤＮＡ断片が組み込まれている酵母プラスミ
   ドによって形質転換された、核内染色体上にＲＡＳ変異
   とｓｉｒ３変異とをもつ１倍体形質転換株。 ２４、ＲＡＳ変異がＲＡＳ２＾Ｖ＾ａ＾Ｌ＾１＾９また
   ＲＡＳ２＾Ｌ＾ｅ＾ｕ＾６＾８で表される変異である特
   許請求の範囲第２３項記載の形質転換株。 ２５、動物の発癌遺伝子とホモロジーを有し且つ、突然
   変異を含む酵母由来の遺伝子を有するために胞子形成に
   関与する遺伝子の発現が抑制され結果的にＳＰＯ−Ｘ−
   ＧＡＬ培地上で白色コロニーを形成する酵母形質転換体
   を、被験物質の存在下でＳＰＯ−Ｘ−ＧＡＬ培地上で青
   色のコロニーを形成することができるようにある該被験
   物質から選ばれることを特徴とする抗癌作用または制癌
   作用を有する物質のスクリーニング法。