JPS61502682A - リンホカインの生産および精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リンホカインの生産および精製 〔発明の分野〕 この発明は、霊長類動物の増血系前駆細胞の発育と分化を刺激する作用を有する 蛋白質の生産に関するものであり、より詳細にはコロニー形成刺激因子（Ｃ５Ｆ ）の生産ｌこ関するものである。この発明の１つの目的は、Ｃ５Ｆ蛋白質発現遺 伝子を含んだベクターを生産し、このベクターを微生物および細胞系１こ導入し 、Ｃ５Ｆ蛋白質を生産する組換え体ＤＮＡ技術によっでＣ５Ｆ蛋白質を生産する 方法を提供することＥこある。更ｌこ。

この発明の第２の目的は、天然または組換え体の何れを問わず、供給源からＣ５ Ｆ蛋白質を単離・精製する・方法を提供し、それ１こよって、従来報告されたも のより優れた純度と活性水準とを保有する精製Ｃ５Ｆ蛋白質を提供することｌこ ある。

〔発明の背景技術〕

血液中に見いだされる多数の細胞系は、何れも多分化能性造血幹細胞に由来する 。幹細胞は２つの機能を有し、（１）幹細胞自身を再生し、それ］こよつで生体 内の幹細胞数を維持し、（２）任意の成熟血球系へと分化方向の定められた子孫 細胞を提供する。特定の造血径路１こ沿つて分化方向が定められた細胞を前駆細 胞と呼ぶ。

１９２８球、Ｂ　リンパ球、顆粒球、赤血球、血小板、および好酸球の前駆細胞 、および種々の成熟血球系ｔこ独立しで発生することがある更ｌこ初期の前駆細 胞１こついで、イン・ビボ（生体内）およびイン・ビトロ（試験管内）の双方で 実験的１こ研究が行なわれた〔デキスター（１９８３年）、ジャーナル・オブ・ バンロンー、１４１巻、４１５〜４３３頁〕。イン・ビトロで、各前駆細胞系の 増殖および／または分化は、さまざまな供給源に由来するそれぞれ特異的な「因 子」Ｉこ依存しでいることが判明した。例えば１．赤血球の後期前駆細胞はエリ スロポイエチンと呼ばれる因子を必要とする。

成熟好中性顆粒球、単球および成熟マクロファージを生成する分化方向に定めら れた骨髄前駆細胞の生存。

増殖および分化ｔこ必要な因子は、コロニー形成刺激因子群（Ｃ５Ｆ群）と呼ば れる。

Ｃ５Ｆ活性はマウスで詳細１こ研究されでいる。大部分の成熟マウス組織はＣ３ Ｆ活性を産生ずる。しかし、種々の組織からさまざまな方法で入手したＣ５Ｆ活 性を含有する組成物は、その生化学的特性を異１こしているよってある。即ち、 異なった因子間の構造的関連性は、なお未知のままである。また、Ｃ５Ｆ活性は 顆粒球およびマクロファージ発生ｌこおける１つ以上の段階で作用するようでも あり、一方、観察される活性がすべで単一の因子１こよって生じるのか、あるい は各段階毎１こ異なった因子が作用するのかも明確ではない〔バージニスおよび メトカルフ（１９８０年）、ブラッド、５６巻、９４７〜９５７頁〕。

ヒ）Ｃ５Ｆ活性体は、胎盤、ある種の胎児組織、マクロファージ、刺激されたＴ 細胞から得られでいる。

１またはそれ以上の強力なＣ５Ｆ活性体を産生ずるＴ細胞系（ＭＯ）が、Ｔ細胞 変異型毛状細胞白血病（白血病性網内増殖症）の１患者から証明された〔ゴール ドら（１９７８年〕、ブラッド、５２巻、１０６８〜１０７２頁〕。

Ｃ５Ｆ活性の顆粒球およびマクロファージ産生に対する刺激能から、これらの（ 骨髄性）血球系の産生増加を必要とする状態ｆこ対しで、Ｃ５Ｆ活性を有する医 薬組成物が臨床上有用であるということが判明した。

事実、明らかＥこ正規循環内の顆粒球値が極めで高い数人の患者で、これらがＣ ５Ｆ産生過剰を伴なう腫瘍を有しでいることが示された。＠瘍を外科的に除去す ること１こよつで、１例で顆粒球が急速１こ下降し正常値へ近付いたことは、循 環顆粒球数の調節にＣ５Ｆが有用であろうということを強く示唆しでいる〔ホラ キング、グツドマン、ゴールド、ブラッド、６１巻、６００頁（１９８３年）〕 。殊ｌこ、Ｃ５Ｆ組成物は、癌の化学療法または放射線処置によって生じた骨髄 抑制の処置に対し臨床上有用である。また、Ｃ５Ｆは顆粒球数および／または単 球数を増加および／または賦活化するので、Ｃ５Ｆ組成物は重篤な感染症の処置 に有用である。

す、顆粒球・Ｃ３Ｆ（Ｇ、Ｃ３Ｆ）、マクロファージ・Ｃ５Ｆ（Ｍ・Ｃ３Ｆ）　 、顆粒球・マクロファージ・Ｃ５Ｆ（ＧＭ、Ｃ３Ｆ）および多重型Ｃ５Ｆがこれ に含まれる。この発明は特にＧＭ−Ｃ５ＦＩこ関する。この発明は特に霊長類動 物のＣ３ＦＩこ関するものであり、より詳細には、ヒトＣ３ＦおよびサルＣ３Ｆ Ｉこ関するものである。

Ｃ５Ｆ活性を有する組成物の生物学的・生化学的な特性決定および臨床段階Ｉこ おけるこれらの組成物の検討は、今日まで、ヒトおよび／またはその池の霊長類 動物のＣ３Ｆ組成物が希少で、また純粋でないことによって妨げられてきた。Ｃ ５Ｆ活性ｌこ係る蛋白質または蛋白質群を同定することが如何りこ望ましいこと であったかということは、よく理解できる。更１こ、生物学的・生化学的な特性 決定を行ない、治療剤としで使用するのｆこ十分な量および純度をもつでＣ５Ｆ 蛋白質を容易１こ供給し得る霊長類動物のＣ５Ｆ供給源、好ましくはヒ）Ｃ５Ｆ 供給源を得ることが望ましい。

最近開発された分子クローニングの技術Ｅこより、蛋白質を暗号化しているヌク レオチド配列をクローニングし、好適な宿主−ベクター系を用いてその蛋白質を 大量に生産することができる（マニアテイス、モレキュラー・クローニング、ア ・ラボラトリ−・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ− 、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク、１９８２年）。次いで、既 知の分離・精製技術Ｅこよって蛋白質を分離することができる。今日まで用いら れでいるクローニングの方法は、（１）蛋白質構造ｔこ関する知識、例えばアミ ノ酸配列ｌこ基づいて行なう方法、（２）その蛋白質］こ特異的な抗体を用いて クローン化した遺伝子１こよって発現された蛋白質の同定ｌこ基づいて行なう方 法、および（３）翻訳すると、興味ある遺伝子１こよつで暗号化された蛋白質ま たは活性体を生成することができるＲＮＡ種の同定１こ基づいで行なう方法の３ つの一般的な範Ｑ＋こ分けることができる。

これらの分野ｌこ属する各方法は、Ｃ５Ｆ遺伝子のように、対象とする遺伝子が 極めて少量しか入手できない場合、適用が困難である。即ち、十分量の精製蛋白 質の入手が困難であると、アミノ酸配列ばかりでなく、蛋白質の部分配列でさえ 決定が困難である。同様に、発現蛋白質の抗体結合ｆこよる同定は、単一特異゛ 性多クローン性高力価抗血清を使用しで実施されることが多い。そのような抗血 清は、純粋な蛋白質（抗体）が十分量存在しないと得ることができない。別の解 決法が単クローン性抗体１こよって提供されるが、これｌこ必要な抗体もまた、 好適な抗体が存在しない場合は入手困難であり、それに、そのような単クローン 性抗体は、入手可能な組換え体宿主−ベクター系ｌこよって蛋白質が発現される 形態では、その蛋白質と反応することができない。結局、ＲＮＡ種の翻訳が同定 可能な蛋白質または活性体を生成するためｔこは、ＲＮＡ供給源中ｌこ、当のＲ ＮＡが、確実な蛋白質または活性体シグナルを十分与え得るだけ豊富（こ存在し ていることが必要である。特定の蛋白質を暗号化しているＲＮＡの相対的な豊富 さは、その蛋白質の豊富さと平行しでおり、従って希少な蛋白質は、通例、希少 なｍＲＮＡ１こよって暗号化される。

ＭＯ細胞系はヒ）Ｃ５Ｆ類の精製と、対応するメツセンジャーＲＮＡ１の同定と の双方のための出発物質として使用されできた。しかし、この比較的良好なＣ５ Ｆ活性供給源でさえ、構造研究ｌこ必要な蛋白質を十分に単離することは極めて 困難であることが証明された。

Ｃ５Ｆのように希少な蛋白質を暗号化しでいるヌクレオチドを、前記の方法でク ローニングするのｌこ付随する固有な問題を克服するため、新規な方法を開発し た。この方法では、遺伝子生産物またはその活性を確実ｔこ測定できることだけ が必要である。Ｃ５Ｆ測定の好適な方法は、本明細書の実施例２に記載する。第 ２の態様では、組換え体または天然の何れを問わず、供給源からＣ５Ｆ蛋白賃を 、従来可能であったよりもはるかｔこ高い純度と活性水準で単離・精製できる精 製方法を開発した。

〔本発明ｌこ係る組換え体ＤＮＡ法の要約〕この発明の第１の態様は、先行技術 の問題を克服し、組換え体ＤＮＡ技術を使用しでＣ５Ｆ活性を有する使用可能な 蛋白質を提供することである。この発明ｌこおいで、Ｃ５Ｆ活性の検定だけが必 要である新規クローニング技術を、Ｃ５Ｆ活性を有する蛋白質を暗号化しでいる ｃＤＮＡをクローニングするのに利用する。このよう１こして、この発明はＣ３ Ｆ活性を有する蛋白質を暗号化しているｃＤＮＡ（即ち、Ｃ５Ｆ／ｃＤＮＡ）、 Ｃ５Ｆ／ｃＤＮＡ　のような組換え体ベクターを導入する微生物または細胞系、 および微生物メたは細胞系を培養することによってこのＣ５Ｆ／ｃＤＮＡを発現 することにより、Ｃ５Ｆ蛋白質を生産する方法を提供する。この発明では、クロ ーンからＣ３Ｆ蛋白質を生産するのであるから、これがＣ５Ｆ活性を有する蛋白 質であることは間違いない。この発明は、更１こＣ５Ｆ／ｃＤＮＡを含有してい る形質転換ベクターを調製・単離する方法を含んでいる。この方法は、Ｃ８Ｆを 生産する細胞からＲＮＡを作成し、 このＲＮＡからポリアデニル化メツセンジャーＲＮＡを作成し、 このメツセンジャーＲＮＡから１重鎖ｃＤＮＡを作成し、 この１重鎖ｃＤＮＡを２末鎖ｃＤＮＡへ変換し、この２末鎖ｃＤＮＡを形質転換 ベクターｌこ挿入し、このベクターで細菌を形質転換してコロニーを形成し、そ れぞれ２００〜５００コロニーのプールを拾い、各プールからプラスミドＤＮＡ を単離し、このプラスミドＤＮＡを、Ｃ５Ｆ蛋白質の発現１こ好適な宿主細胞ｌ こトランスフェクション（導入）し、トランスフェクションした細胞を培養し、 その上清のＣ５Ｆ活性を検定し。

Ｃ５Ｆ陽性プールを選出して、プール作成ｔこ使用したコロニーをスクリーニン グし、Ｃ５Ｆ活性を有するコロニーを同定する ことから成る。

この発明ｔこおけるＣ５Ｆ蛋白質は、骨髄系細胞ｆこ対する発育および分化ホル モンである。これらは、例えば骨髄抑制の臨床的処置に適用され、特１こ、癌の 化学療法または放射線処置（こ伴なう（症候的な）＠粒球減少症の臨床的処置１ こ適用される。

〔図面の簡単な説明〕

この発明において、Ｃ５Ｆ蛋白質を暗号化したＤＮＡ配列を第１図１こ示す。こ のＤＮＡ配列は、Ｃ５Ｆ−Ｔｈｒと呼ばれるヒ）Ｃ５Ｆの１変異体の暗号を完全 １こ示してい゛る。もう１つの対立遺伝子は１００番目の位置のＴｈｒ　をＩ／ ｅｌこ置換えた以外は同一な生産物（Ｃ５Ｆ−１７ｅ）を暗号化しでいる。上記 のヒト配列（こ対する変化は、ギボンＣ３Ｆ（ギボンザルのＣ３Ｆ）（Ｃ３Ｆ− Ｇ）を暗号化したＤＮＡ配列１こおける差異を示す。また、これから推論される アミノ酸配列を示す。

第２図１ｉｆ５スミＦｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）　からプラスミドｐ　Ｔ　Ｐ 　Ｌを作成する概略の説明、第３図は、第２図からの概説の続きで、プラスミド ｐ　Ｔ　Ｐ　Ｌからプラスミドｐ９１０２３　を作成する説明、第４図は、第３ 図からの概説の続きで、プラスミドｐ９１０２３（Ｂ）の説明である。

第６図はベクターｐＴＡＬＣ−１８５Ｒの模式表示、第７図はベクタＡＪ−１４ の模式表示である。

〔操作の詳細な説明〕

事例の理解を容易にするためＩこ下記の定義を設ける。

下記の定義は、当該技術分野で流通しでいる意味から定義の異なる範囲まで支配 する。

増幅とは、細胞が、その染色体ＤＮＡ内で遺伝子を反復生産するプロセスをいう 。

Ｃ５Ｆとは、本明細書１こ記載の検定により規定される生物学的活性である。

Ｃ５Ｆ蛋白質は、Ｃ５Ｆ活性を有する霊長類動物供給源から得られる蛋白質であ る。この発明の目的のため、Ｃ５Ｆ蛋白質の語は、ＭＥＴ残基１こよって先行さ れるＣ８Ｆ蛋白質、Ｃ５Ｆ蛋白質の対立遺伝性変異体および修飾Ｃ５Ｆ蛋白質を 含んでいる。

下流とは、ヌクレオチド配列の３′末端の方へ向かう方向をいう。

エンハンサ−とは、遺伝子に対するエンハンサ−の位置または配列の配向ｌこ関 係なく、遺伝子の転写を促進することができるヌクレオチド配列をいう。

遺伝子は、与えられた蛋白質を暗号化しでいるデオキシリボヌクレオチド配列で ある。この発明の目的から、遺伝子ｌこはＲＮＡ転写開始シグナル、ポリアデニ ル酸付加部位、プロモーター、またはエンハンサ−のように翻訳されないフラン キング領域を含まないこととする。

連結（ライゲーション）は、２個のＤＮＡ鎖の５′終末と３′終末との間のホス ホジエステル結合を形成スるプロセスである。これは、Ｔ４１Ｊガーゼ１こよる 平滑末端の連結を含む幾つかの公知の酵素技術ｔこよって達成することができる 。

配向とは、ＤＮＡ配列におけるヌクレオチド類の順序をいう。逆方向のＤＮＡ配 列とは、その配列が得られたＤＮＡを対照点としで比較したとき、他の１配列と の関係で５′から３′への順序が逆になっている配列をいう。そのような対照点 としでは、供給源ＤＮＡ中の他の特定のＤＮ配列の転写方向またはその配列を含 ん転写とは、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを合成することである。

形質転換とは、外来性ＤＮＡを細胞ｆことり込むこと１こよって細胞の遺伝子型 を変えることである。ある場合ｔこけ、形質転換は細胞表現型の変化ｌこよって 検出できる。形質転換以前の細胞を親細胞という。Ｉ翻訳とは、メツセンジャー ＲＮＡからポリペプチドを合成することである。

コロニー形成刺激因子活性（Ｃ５Ｆ）は末梢血単核球から得た調整培地、肺およ び胎盤組織、および骨髄、貧血患者の尿、血清、Ｔ　ＩＪンパ球および単核食細 胞系列の正常および新生物細胞を含む多数の細胞供給源から誘導することができ る。Ｃ５Ｆを生産する１細胞系は、ＡＴＣＣＩこ寄託され、ＣＲＬ８０６６　の コード番号で利用することができるＭＯ細胞系である。この細胞系ｔこよって生 産されたＣ５Ｆは顆粒球−マクロファージＣ５Ｆ（ＧＭ−Ｃ５Ｆ）　としで知ら れでおり、これは言うまでもなくヒ）Ｃ５Ｆである。ギボンＣ５Ｆの１供給源は ＵＣＤ、ＭＬＡ−１４４と名付けられたＴ細胞系であって、１９８３年９月２９ 日にＡＴＣＣｔこ寄託され、ＨＢ９３７０のコード番号で利用することができる 。

この発明１こおいで、Ｃ５Ｆクローンを単離するため１こ、Ｃ５Ｆ活性の検定技 術だけを必要とする新規方法を使用した。先ず、１９２８球細胞（または、先に 示したようなその他の供給源）のようなＣ５Ｆ活性を生産する細胞を同定する。

次いで、この細胞のｍ　ＲＮ　Ａを回収する。好ましくは、１９２８球細胞を使 用する。

そのような場合、リンホカインｌこ対するｍＲＮＡを含有しでいる膜結合型ｍＲ ＮＡを、細胞内の遊離ｍ　ＲＮ　Ａから分離する。この分離によって、採取され たｍＲＮＡはリンホカイン配列１こ対しで５〜１０倍強化されるものと確信され 、従って、所望のＣ５Ｆクローンの確認を含む労力が軽減される。次いで、オリ ゴｄＴセルロースを用いるクロマトグラフィーｌこよってポリアデニル化したメ ツセンジャーＲＮＡを作成する。

宿主Ｉこトランスフェクションしで、Ｃ５Ｆ活性を有する所望の蛋白質を発現す るの（こ好適なベクターを使用し、このｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作 成する。上（こ作成したｍＲＮＡを用いる標準的方法ｌこよって第１鎖ｃＤＮＡ を作成する。次いで、このＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを２重鎖ｃＤＮＡ形ｌ こ変換する。次いで、このｃＤＮＡを好適なベクターへ挿入することができる。

Ｃ３Ｆクローンの単離に好ましい宿主−ベクター系は、Ｃ５Ｆ／ｃＤＮＡを好適 な形質転換ベクターｌこ発現することに基づいている。好適な形質転換ベクター は、哺乳項細胞へＤＮＡを一過性ｌこ導入することｌこよって期待テキル〔メロ ン、パーカー、グルラマン、マニアテイス（１９８１年）、セル、２７巻、２７ ９〜２８８頁〕、所望のＣ８Ｆ形質転換体を単離するためＩこ、集団（ポピユレ ーション）細胞のすべてが、所望のＣ５Ｆ生産物を発現する外来性遺伝子を必ず 保有しでいる必要はない。細胞の副次集団（サブポピユレーション）が数日間に わたって所望の生産物を発現するよう、一過性に外来性遺伝子を該副次集団へ導 入することが可能である。この発明方法では、ＤＮＡ）ランスフエクションおよ び発現系における形質転換ベクターに選択マーカーを置く必要がないから、外来 性ＤＮＡは１〜２週間ｌこわたる細胞発育期間の際に消失しで終う。但し、好適 な場合は、哺乳類細胞のトランスフェクション後、２．３日は、所望の生産物の 合成が見られ、検出することができる。

最も好い宿主−ベクター系は、複製起点を欠＜５ｖ４０のＤＮＡ分子を導入した サルｔｙ３ｃｖ−１細胞系の開発に基づいている〔グルラマン、セル、２３巻、 １７５〜１８２頁（１９８１年）〕。欠損５Ｖ４ＱＤＮＡを含んでいるＣＯ５と 名付けられたサルの形質転換ｃｖ−１細胞は、５ｖ４０ゲノムの完全なコピーを 含んでいないが、高濃度の巨大Ｔ抗原を生産し、またＳＶ４０／ＤＮＡ複製を許 容する。また、これらは初期領域および５Ｖ４Ｑの複製起点を含んでいる細菌性 プラスミドの欠失を有する５ｖ４０の複製を効率よく支持する〔マイヤーズ、ツ ジャン（１９８０年）、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ− ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニー、７７巻、６４９１〜６４ ９５頁〕。このようｌこ、この系は、外来性ＤＮＡから発現されたｍ　ＲＮ　Ａ および蛋白質の濃度を高めるため、５Ｖ４０）こよるＤＮＡ複裂を介しで、トラ ンスフェクションした外来性ＤＮＡを増幅する手段を提供する。但し、他の類似 の系もまた使用できる。

ＣＳＦ発現に使用するベクター類は１、典型的に下記に記載のように、エンハン サ−、プロモーター、イントロン、ポリアデニル化部位、３′−非暗号化領域お よび翻訳活性化領域のような種々の要素を含んでいる。

ベクター類はエンハンサ−を含むことができる。エンハンサ−は機能約１こプロ モーターと区別されるが、プロモーターと協調しで作動するようである。細胞レ ベルＩこおけるその機能はよく判っていないが、その特異な性能は位置または配 向ｆこ関係なく転写を活性化または増強する働きである。プロモーターは遺伝子 の上流に存在する必要があるが、エンハンサ−は上流、即ちプロモーターから５ ′−上流の遺伝子内１こイントロンとしで、または遺伝子から下流、遺伝子とポ リアデニル化部位との間またはポリアデニル化部位から３′−下流ｌこ存在する ことができる。逆方向のプロモーターは機能しないが、逆方向のエンハンサ−は 機能する。エンハンサ−はシスｔこ作用する。即ち、プロモーターが同−ＤＮＡ 鎖上１こある場合だけ、エンハンサ−はプロモーターｌこ影響を与える。エンハ ンサ−ｆこ関する一般的な論考（ごついでは、コーリーら、セル、３３巻、３１ ３〜３１４頁（１９８３年）を参照。

哺乳類細胞ｌこ使用する好ましいエンハンサ−は、シミアン・ウィルス４０、ポ リオーマ・ウィルス、ウシ乳頭１誼ウイルス、レトロウィルスまたはアデノウィ ルスから得られる。理想的１こは、エンハンサ−は宿主が許容するウィルス、即 ち、宿主型細胞ｌこ普通１こ感染するウィルスから得るべきである。ウィルス性 エンハンサ−は公的に利用可能なウィルス類から容易２こ得ることができる。２ ．３のウィルス、例えばラウス肉腫ウィルスおよびシミアン・ウィルスのエンハ ンサ−ａｍはよく知られでいる〔ルシウら、セル、３３巻、７０５〜７１６頁（ １９８３年）〕。公開された当面のウィルスの制限酵素地図１こ基ついでこれら の領域を切り出し、必要ならば、該エンハンサ−を所望のベクターへ挿入し得る ようその部位を修飾することは、分子生物学１こおいて日常行なわれることであ る〔例えば、カウフマンら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、 １５９巻、６０１〜６２１頁（１９８２年）、およびモレキュラー・セル・バイ オロジー、２巻（１１号）、１３０４〜１３１９頁（１９８２年）を参照１こせ よ〕。別法として、エンハンサ−を配列データから合成することもできる。ウィ ルス性エンハンサ−の大きさく一般に、約１５０　ｂｐより小さい）は、合成を 実際ｆこ達成し得る程度に十分小さい。

ベクター組立で体内に存在すべきもう１つの要素はポリアデニル化切り継ぎ（ス プライシング）（または付加）部位である。この部位は遺伝子の翻訳領域から僅 か下流に位置しでいるＤＮＡ配列であり、転写が停止した所から交代に、アデニ ン・リボヌクレオチドが付加し、メツセンジャーＲＮＡの３′−末端ｔこポリア デニン・ヌクレオチド尾部を形成する。ポリアデニル化安定化するの（こ重要で ある。

真核性ポリアデニル化部位はよく知られでいる。真核遺伝子１こは一致した配列 が存在しでいる。ポリアデニル化が始まる所から１１〜３０ヌクレオチドｌこ５ ′−ＡＡＵＡＡＡ　−３’の６ヌクレオチドが見いだされる。

ポリアデニル化部位を含んでいるＤＮＡ配列は、公知文献ｌこしたがってウィル スから得ることができる。例示的ｔこは、ポリアデニル化部位はマウス・ベータ ーグロブリンから得られ、またシミアン・ウィル４０の初期または後期領域遺伝 子から得ることができる。但し、ウィルス性ポリアデニル化部位の方が好ましい 。これらの配列は既知であるので、イン・ビトロで合成し、通常の手法によりベ クターと連結できる。

翻訳停止コドンからポリアデニル化部位を隔離する部位は、好ましくは非促進真 核遺伝子のような翻訳されないＤＮＡ配列である。そのような配列および遺伝子 はプロモーターを賦与されないので、発現されないはずである。この配列は停止 コドンからポリアデニル化部位まで、約１０００塩基程度までのかなりの鎖長で あるべきである。この３′の翻訳されない配列は、一般１こ生産物収量の増加を 招来する。ベクターは一致したポリアデニル化配列から約ａｏｂｐ下流から終結 することができるが、野性型環境においでポリアデニル化部位から下流１こ見い だされる３′−配列を保持しでいることが望ましい。このような配列は典型的ｔ こはポリアデニル化部位から下流ｆこ、約２００〜６００塩基対の鎖長である。

ベクターの翻訳されず１こ転写される部分にイントロンが存在すると、生産物収 量を増加することができる。

そのようなイントロンは宿主細胞や遺伝子供給源以外の供給源から得ることがで きる。例えば、アデノウィルスの３分節系リーダーの第２イントロンからの５′ −接合部位、およびアデノウィルス主後期プロモーターの転写開始部位から下流 を挿入した免疫グロブリン遺伝子からの３′−接合部位を含んでいる雑種イント ロンは生産物収量を増加する結果を生じる。

Ｃ５Ｆクローニングおよび発現ベクターの好ましい態様（こは、翻訳活性化遺伝 子がある。翻訳活性化遺伝子とは、所望のメツセンジャーＲＮＡの翻訳に影響を 与える蛋白質またはＲＮＡ生産物を暗号化しでいる遺伝子である。最良の例はア デノ随伴ウィルス（ＶＡ）遺伝子（ＶＡＩ）であって、このものは転写されで短 かいＲＮＡ断片となり、アデノウィルス主後期ｍ　ＲＮ　Ａの５′の翻訳されな い領域ｌこある配列と相互に反応する〔シンマッパヤら、（１９８２年）、セル 、３巻、５４３頁〕。ＶＡＯＲＮＡＩこよって翻訳活性化されるのｆこ必要な配 列はアデノウィルス後期ｍＲＮＡ　３分節系リーダー内にある。アデノウィルス ３分節系リーダーは、アデノウィルス・ゲノムの隣接しでいない領域と接合し合 い、アデノウィルスの主後期転写体５′終末に存在しでいる。ＶＲのＲＮＡは３ 分節系リーダー配列を含んでいるｍ　ＲＮ　Ａと反応し合って、その翻訳を活性 化することができる。従って好ましいｃＤＮＡクローニングと発現ベクターは、 ３分節系リーダーとアデノウィルスＶＡ遺伝子との切り継ぎ（スプライス）形を 含んでいる。

これらのベクター類は、当該技術分野の専門家ｌことって公知の手法により合成 できる。エンハンサ−、プロモーター等のようなベクター要素は、天然供給源ま たは、前記のよう１こ合成された供給源より入手できる。

基本的）こはそれらの要素が、例えばウィルス機能に見られる要素のよう；こ大 （］１こ入手可能なりＮＡ内１こ見いだされる場合、あるいは、例えばポリアデ ニル化部位のよう１こ合成できる場合は、制限酵素の好適な使用；こよって、供 給源微生物を単純培養し、そのＤＮＡを好適なエンドヌクレアーゼで消化し、Ｄ ＮＡ断片を分離し、興味ある要素を保有しているＤＮＡを同定し、これと同一の ものを再生すること１こよって、大量のベクターを得ることができる。通常、形 質転換ベクターは少量が組立てられ、次いで、原核性プラスミドまたはファージ のように好適な自律複製を行なう合成ベクターと連結されるはずである。多くの 場合ｐＢＲ３２２プラスミドが使用できる（カウフマンら、前掲）。

合成ベクターは、例えばそれを許容する原核微生物のトランスフェクションによ って、多数の合成ベクターのコピーを復製し、細胞溶解ｌこよって合成ベクター を回収し、細胞残層から合成ベクターを分離する通常の手法Ｉこ従い、連結した 形質転換ベクターをクローニングするのに使用する。

Ｃ５Ｆ活性を生産する細胞からｃＤＮＡを含有しでいるベクターを調製し、次い で、これをエシェリキアコＩＪ　ｌこ導入し、ペトリ皿の１皿当たり約２０００ コロニーの割合となるよう１こ、これを培ｉする。コロニーをニトロセルロース ・フィルターｌこ採取Ｌ、フィルターを新たな平板１こ移し、これをマスター（ 基準標本）としで保存する。コロニーが発育した後、レプリカを作成し、レプリ カ・フィルターの切片がマスター平板の対応部分と合成し得るようｌこ、注意深 くこれ１こ印を入れることｆこより、切片を基準標本と対応させる。

各レプリカ・フィルターを裁断し、あらかじめ１枚当たり一定数のコロニーを含 ませである切片（好ましくは、１個片当たり約２００〜５００コロニー）を作成 する。各切片からコロニーをＬ−グロスのような培地に播種し、遠心によって菌 を捕集し、プラスミドＤＮＡを分離する。各切片毎に得られたプラスミドＤＮＡ を、蛋白質発現に好適な宿主へと導入（トランスフェクション）する。ここにお いで、好ましい合成ベクターは、真核細胞ｌこ有害な配列を欠失しでいるエシェ リキア・コリの変異株プラスミドｐＢＲ３２２である（カウフマンら、前掲参照 ）。この変異株を使用することＩこよって、導入に先立ち、プラスミド残基を欠 失させる必要がなくなった。導入を行なった細胞を発育させた後、培地のＣ５Ｆ 活性を検定する。陽性検定の場合は、Ｃ５Ｆ／ｃＤＮＡ　を保有しているコロニ ーが、フィルターの特定切片１こ存在することを示しでいる。

基準マスター・フィルター切片の、どのクローンがＣ５Ｆ／ｃＤＮＡ　を含んで いるのかを決定するためＩこ、フィルター切片上の各クローンをそれぞれ採取し 、これを発育させる。次Ｉこ、この培養を１つのマトリックス；こ配置する。マ トリックスの満の各行および縦の各列毎１こ１つづつプールを作る。プールした 各培養毎ｉこＤＮＡ試料を作成し、これらを発現用宿主細胞へそれぞれ導入する 。これらのプールから採取した上清のＣ５Ｆ活性を検定する。ある縦の列のプー ルと、ある横の行のプールがＣ５Ｆ活性を生産したとする。これら２つのプール に共通するクローンｔこ（１：ｓＦ／ｃＤＮＡが含まれでいるはずである。もし マトリックスに１個以上の陽性クローンが含まれでいたら、１個より多くの縦列 および横の行が陽性であるはずである。このような場合１こは、更に、少数のク ローンでのスクリーニングが必要であるかも知れない。

制限酵素１こよってクローンからＣ５Ｆ／ｃＤＮＡ　をができる。ここ１こ記載 した方法が、Ｃ５Ｆ／ｃＤＮＡを任意の供給源から得るのｉこ使用できることは 容易に理解できよう。第１図１こ、この発明１こよるＣ５Ｆ／ＣＤＮＡの完全な りＮＡ配列と、それを翻訳したＣ５Ｆ蛋白質生産物の予測されるアミノ酸配列と を併記しで示す。

この発明ＥこよるＣ５Ｆ活性を備える蛋白質を暗号化した第１図（こ示すような りＮＡ配列を、通常の方法によって修飾し、記載した検定試験でなおＣ５Ｆ活性 を保有しでいる目的のＣ５Ｆ蛋白質の変異形を作成することができる。例えば、 １個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸を他のアミノ酸と置換することが できる。その１部を引用して説明の一部とするベルギー特許第８９８０１６号に は、システィンを例えばセリンに置換するそのような技術の代表例を開示しでい る。

この発明のＣ５Ｆ／ｃＤＮＡｌこは、ＡＴＧ　コドン１こよって先行される本来 のＣＳ　Ｆ　／　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　遺伝子と、Ｃ５Ｆ蛋白質の対立遺伝子性変異 形を暗号化しでいるＣ５Ｆ／ｃＤＮＡが包含される。１つの対立遺伝子を第１図 に示す。この発明者が発見したもう１つの対立遺伝子は、第１図１こ示した３６ ５番目の位置のシトシン残基の代わりにチミジン残基を有する。この発明のＣ５ Ｆ蛋白質は、Ｃ５Ｆ蛋白質のｌ−メチオニン誘導体（Ｍｅｔ−Ｃ５Ｆ）　および Ｃ５Ｆ蛋白質の対立遺伝子性変異形を包含する。第１図の配列で示される成熟Ｃ ５Ｆ蛋白質は、Ａｌａ　−Ｐ　ｒ　ｏ　−ＡＩ！ａ・Ａｒｇ−−−−−−ののヌ クレオチドの後の矢印で示される。Ｍｅｔ−Ｃ３ＦはＭｅｔ−Ａｌａ　−Ｐｒｏ 　・Ａｌａ−Ａｒｇ−−−−−・　の配列で始まる。第１図１こ示した対立遺伝 子性変異形は１００番目のアミノ酸残基にＴｈｒを有しく矢印の後のＡｌａで始 まる）、Ｃ３Ｆ（Ｔｈｒ）としで示すことができる。

もう１つの変異形は、１００番目にＩｌｅ残基を有するものでＣ３Ｆ（Ｉｌｅ） 　としで示される。この発明の精製Ｃ５Ｆ蛋白質は、ヒト骨髄細胞で検定すると 、蛋白質１ｍｇ当たり少なくとも１０７単位／ηの比活性を有し、好ましくは少 なくとも４×１０　単位／ｑの比活性を有する。

Ｃ５Ｆの発現に用いる宿主−ベクター系は原核系でも真核系でもよいが、Ｃ５Ｆ の複雑さから、好ましい発現系は哺乳類系のものである。発現は、好適なＣ５Ｆ ベクターを原核細胞または真核細胞ｌこ導入することによって、容易ｌこ達成さ れる。前記の方法により得られたＤＮＡ配列は、好適なプロモーターの支配下１ こ哺乳類細胞へ直接発現できる。当該技術分野の専門家に周知の外来性プロモー ターを使用することができる。原核細胞または酵母細胞へＣ５Ｆを発現するため １こは、先導配列（または分泌配列）を除去しなければならない。第１図１こ成 熟Ｃ５Ｆ蛋白質のＮ末端コドンの位置を示しである。これは、当該技術分野の専 門家１こ周知の標準的な手法を用いで実施することができる。一旦、所望のＣ５ Ｆ／ｃＤＮＡが得られれば、既知の好適な手技を用いで、Ｃ５Ｆ蛋白質を発現す る。例えば、Ｃ５Ｆ／ｃＤＮＡ　を好適なベクターに挿入し、好適な宿主細胞へ ベクターを導入し、形質転換された細胞を選択し、これらの形質転換体を培養し で、Ｃ５Ｆ活性を発現する。好適な宿主細胞としては、細菌（例えば、エシェリ キア・コリ）、酵母、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ）および昆虫細胞が挙げられ る。このようにしで生産されたＣ３Ｆ蛋白質は、蛋白質のＮ末端にメチオニン基 を有することができる（これをＭｅｔ−Ｃ５Ｆと呼ぶ）。原核細胞または真核細 胞ｊこよって生産される成熟蛋白質は、原核細胞生産物が天然生産物と同程度、 もしくはある程度の差をもつでグリコジル化され得る点を除けば、同じアミノ酸 配列を示す。下記の実施例Ｉこおいで、Ｃ５Ｆ蛋白質を得るため通常用いる各種 の方法を説明する。その他の方法、または材料（例えば、ベクター）１こついて は、実施例および下記の記載に基づけば当１亥技術分野の専門家１こ容易に明白 となろう。

好適な原核または真核細胞１こ発現したＣ３Ｆ蛋白質は、当該技術分野の専門家 に周知の精良・分離手法によって再生することができる。但し、明示したようｔ こ、この発明はまた、組換え体または天然の何れの供給源からでもＣ５Ｆ蛋白質 を高純度で、しかも高活性で入手できる精製方法を提供する。

〔本発明の精製方法の要約〕

この発明は先行技術の諸問題を克服しでＣ５Ｆ活性を有する蛋白質を精製する方 法を提供する。この発明によるＣ５Ｆ蛋白質は、ヒト骨髄検定法１こよって検定 すると、蛋白質１η当たり、少なくとも約１×１０７単位の比活性を有し、好ま しくは少なくとも約２×１０７単位、一層好ましくは少なくとも約４ぺ１０　単 位の比活性を有する。

この発明におけるＣ５Ｆ蛋白質の精製方法・は、下記の通り行なう。蛋白質を８ ０％飽和硫酸アンモニウムで沈澱させ、Ｃ５Ｆ蛋白質を含有するペレットを作成 する。該ペレットをｐＨ約６〜約８の範囲の緩衝液ｆこ再懸濁させる。Ｃ５Ｆを 含有する該緩衝液をクロマトグラフィー・カラムｌこ掛け、塩化ナトリウムを含 有する緩衝液で溶出し、Ｃ３Ｆ活性を有する両分を捕集する。活性画分をプール し、これをＣ４逆相カラムに掛け、Ｏ→９０％アセトニトリル勾配で溶出して、 活性画分を採取する。

〔精製方法ｔこ関する図面の簡単な説明〕第５図Ｉこ精製Ｃ５Ｆ蛋白質の５ＤＳ −ＰＡＧＥ分析を示す。

〔精製方法の詳細な説明〕

この発明方法１こよって精製するＣ５Ｆ蛋白質は、前記の組換え体ＤＮＡ処理の 出発供給源としで使用した、例えばＭＯ細胞系またはＵＣＤ、ＭＬＡ−１４４ギ ボン細胞系等の任意の天然供給源から誘導することができる。

別法としで、この発明の組換え体ＤＮＡ技術を使用しでＣ３Ｆ蛋白質を作成する ことができる。

何れの供給源からのＣ５Ｆであれ、この発明方法ｌこよって精製することか可能 である。Ｃ５Ｆ蛋白質の任意の供給源から得た調整培地を、好ましくは１−当た り少なくとも、蛋白質的０．１〜の蛋白質濃度まで、限外沖過１こよって濃縮す る。次いで、これ１こ８０％飽和硫酸アンモニウムを加えること１こより、蛋白 質を沈澱させる。得られたペレットをｐＨ約６〜約８の範囲に調節した緩衝水溶 液ｌこ再懸濁させる。好適な緩衝液の例としてはトリス−塩酸、ＨＥＰＥＳ、ク エン酸ナトリウム等が挙げられる。

緩衝溶液をカラム・クロマトグラフィーにより分別する。クロマトグラフィー・ カラムに充填する好適な材料はオクチルセファロース、ＤＥＡＥ−ウルトロゲル 、ＡｃＡ４４−ウルトロゲル、ＡＣＡ５４−ウルトロゲル等である。１またはそ れ以上のこれらの材料を連続使用することによって、一層高い純度を得ることが できる。

各カラム毎の画分を採取し、Ｃ５Ｆ活性を検定する。

活性画分をプールし、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦ ＢＡ）等で希釈しＣ４逆相カラムに掛ける。次いでＴＦＡまたはＨＦＢＡ中、０ →９０％アセトニトリル勾配を用い、プール画分をカラムｆこ増用するのｉこ何 れの酸を使用したかＩこよつで、それぞれ好ましくは０．１０％または０．１５ ％（容積／容積）の濃度で、Ｃ５Ｆ活性を溶出する。

Ｃ５Ｆ活性を有する両分は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動；こよって 分析する〔ラムリ、ネーチャー、２２７巻、６８０頁（１９７０年）の記載の通 り、１３．５％ゲル〕。前記のクロマトグラフィー・カラム材料を使用して追加 的処理を行なえば、Ｃ５Ｆ蛋白質を更に同質性Ｉこ精製することができる。

５０５−ＰＡＧＥＩこよって分別した精製Ｃ５Ｆ蛋白質は約１５０００〜約２６ ０００ダルトンの範囲の見掛けの分子量を示し、非同質的なＣ５Ｆ蛋白質の挙動 を呈した。見掛けの大きさのこの異質性はこの蛋白質の著しいグリコジル化ｌこ 起因しでおり、糖蛋白質ｌこ共通した像である。調整培地のＭＯ細胞から更ｌこ 純度の低い試料を５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（非還児的条件で）によって分別し、ゲル から溶出した蛋白質を検定すると、見掛けの分子量が約２８０００〜３００００ 　のＣ５Ｆ活性を有する第２の蛋白質の存在が明らか１こなった。

Ｃ５Ｆ活性をオクチルセファロース、ＤＥＡＥ−ウルトロゲルＩこ結合させ、Ｃ ４逆相カラムから溶出する。

Ｃ５Ｆ活性のおよそ６０％がＣｏｎ−Ａ（コンカナバリンＡ）セファロースｌこ 結合しく４０％は通過する）、α−メチルマンノシドで溶出する。

組換え体Ｃ５Ｆの低塩分ゲル沖過による分子量分析から、活性の約３０％は１９ ０００　の推定分子量で溶出したが、物質の７０％は約３８０００　の分子量ｔ こ相当する位置で溶出し、２Ｍ体として挙動した。もしこのカラムにＩＭ−Ｎａ Ｃ１溶液を含ませると、すべでの活性は約１９０００　ダルトンｔこ幅広いピー クを示して溶出する。

精製Ｃ５Ｆは、４Ｍ−グアニジン塩酸塩、ｌＱｍＭ−ＥＤＴＡ、ｌＱｍＭ−２− １ルカプトエタノール、３０％（ｖ／ｖ）エタノール中、４℃（ｐＨ７，４）で インキュベートすると、少なくとも１６時間安定である。

またＣ５Ｆ活性は、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（ｐＨ２，０）　およ び０．１％ＴＦＡ＋２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中で安定である。

既述のよう１こ、この発明のＣ５Ｆ蛋白質は、例えば癌の化学療法または放射線 処置によって生じる顆粒球減少症（症候性の）のような骨髄抑制の処置１こ適用 される。また、この発明のＣ５Ｆ蛋白質は重症感染症の処置に使用することを適 応とする。このような適用では、患者１当り約２００〜１０００μｇ　の投与量 が指示される。Ｃ５Ｆ蛋白質は、好ましくは好適な薬理学的担体ｌこ溶解し、経 静脈、的ｔこ患者に注射する。そのような担体の例は、薬理学的食塩水およびヒ ト血清アルブミン−食塩水である。

この発明のＣ５Ｆ蛋白質はまた、他の活性および用途を有する。例えば、ネズミ 項のＣ５Ｆは好中球を賦活する。従って、この発明の霊長類動物Ｃ５Ｆもまた、 好中球を賦活することが期待される。それ故ｌこＣ５Ｆの生理学的機能は数倍ｌ こも達し得る。このリンホカインは、骨髄では宿主防御１こ働くエフェクター細 胞の増殖と分化を刺激し、一方末梢では、新生および既存の細胞を賦活すること ができる。Ｃ５Ｆの局所的な免疫応答としで、Ｃ５Ｆは炎症領域または炎傷から 離れた部位で、好中球の循環を維持することができる。好中球の不適切な局在化 および／または賦活は、リウマチ様関節炎のような種々の免疫を介する障害の機 能変化とみなすことができる。

下記の諸例を説明することｌこよって、更１ここの発明の理解を深めることがで きよう。但し、これらは単１こ例示的な説明を意図するものであって、これによ ってこの発明の請求の範囲が制限されるものではない。

特に明記しない限り、実施例において温度は℃で示す。

制限エンドヌクレアーゼ酵素は、商業的な提供先の勧告１こよる条件および操作 方法１こ従い使用する。連結（ライゲーション）反応は、この発明１こ引用して 説明の一部とするマニアナイスらの記載（前掲、２４５〜６頁）１こより、その ２４６頁１こ記載の緩衝液を使用し、１〜１００μｇ／−のＤＮＡ濃度を用いで 、平滑末端ＤＮＡの場合は２３℃、［付着末端ＪＤＮＡの場合は１６℃の温度で 実施する。電気泳動は９０ｍＭトリス−はう酸、ｌ　Ｑ　ｍＭ　Ｅ　ＤＴ　Ａを 含有する０、　５〜１．５％アガロースゲルで行なう。放射性標識ＤＮＡは、す べで、標識手段の何れを問わず　Ｐで標識した。

「迅速調製」とは、例えばマニアナイスらの記載（前掲、３６５〜３７３頁）の ようＩこ、バタテリオファージまたはプラスミドＤＮＡの迅速、小規模生産をい う。

〔実施例Ａ〕

〔第１段階）Ｍｏ細胞系培養 ＭＯ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１３０６６）は、通常通り、２０％ウシ胎児血ａ（Ｆ ｅ２）、２ｍＭ−グｔレタミ＞、１００単位／−ストレプトマイシン、１００μ ｇ／ｍｔペニシリンを含有するα（６％Ｃ０２）、またはイスコープ（１０％Ｃ ０２）培地に発育させた。細胞は４〜５日毎ｌこ植継ぎ培養すべきである。細胞 を計数し、ファルコンＴ−１７５フラスコで１００〜１５０．ｎｌの培地Ｉこ、 ３〜４Ｘ１０５／Ｃ１１の密度で播踵する。細胞は、２０％ＦＣ３中で４〜７日 毎に倍１こなる。増殖速度は一定でなく、細胞は時に増殖を停止したようｌこ見 え、次いで一挙１こ増殖を始める。ＭＯ細胞は無血清培地に発育できる。細胞を Ｆｅ２から無血清培地へ移す場合、洗浄しない方がはるかに細胞の生存がよい。

無血清培地（ＳＦ）における細胞の最適密度は５×１０　細胞／−である。細胞 は無血清培地中で３１日問わずかに増殖しく少なくとも一定数を維持し）、次い で少なくとも４日間、２０％ＦＣ５を加えて養育すべきである。ＳＦ培地が必要 ならば、細胞に明らかな害を与えることなく、数カ月間、この増殖日程（ＳＦ３ 日間、２０％ＦＣ５４日間）を週単位で繰返すことができる。

〔第２段階ＩＣ５Ｆ活性の検定 Ａ、骨髄検定法 新鮮な骨髄を入手する。２０番、２２番、次いで２５番ゲージの注射針を通すこ とによって、骨片を破砕する。滅菌した燐酸緩衝食塩溶液（ＰＢＣ）で１＝１に 希釈しく室温）、フィコール・パーク（６ｒｎｌフイコールの上１こ約３Ｑｒｎ ｌＢＭ−ＰＢＳを重ねる）を重層する。

１５００ｒＰｍで４０分間（室温）遠心する。脂肪とＰＢＳを除去しで棄てる。

低密度層をピペットで除去する。ＰＢＳで２回洗浄し、計数する。細胞をＲＰＭ Ｉ（ギブコ社から、ＲＰＭ１１６００として購入）＋１０％ＨＩＦＣ５（熱処理 不活性化ＦＣ５）で３時間培養し、付着細胞を採取する。

培養培地（その都度、新たｌこ調製）：２０％ＦＣ５ ０，３％寒天（水に溶解し、４０℃１こ冷却）２Ｘイスコープ（ｌ５ｏｃｏｖｅ 　）　（寒天と１：１の割合）１％Ｐ／Ｓ　（最終濃度：ストレプトマイシン１ ００単位／−、ペニシリン１００μｇ／−）１０−４Ｍ−α−チオグリコレート （１０−２Ｍ−予製品から２ｘイスコープで調製） 寒天を約４０６Ｉこ冷却し他の成分と混合する。

水浴で３７〜３８°　１こ冷却し、この温度に保つ。

３時間後、付着細胞でないものをピペットで除去する。遠心し、計数する。２× １０　細胞／−の培養培地を添加し、水浴温度を３７〜３８°に調節しで維持す る。マイクロ滴定板のウェル（穴）の第１横列に試料を２穴づつ加える（例えば 、トランスフェクションした細胞からの培地。通常、１０μｌ試料）。細胞懸濁 液１００μｌづつ、各ウェルｌこ加える。更ｌこ細胞懸濁液５０μｌづつを、第 １横列の各ウェルに追加する。

完全１こ混合し、第１横列から、溶液５０μ！を次の横列に移す。このよう１こ しで、平板上、１：３の希釈となるまで順次希釈を続ける。平板をパラフィルム で包む。十分な加温環境中で、１０％Ｃ０２，３７℃で１０〜１４日間、インキ ュベートし、コロニー数を計算する。

コロニー数の計数は、各ウェル毎に発育したコロニーの全数を数える。各検定毎 １こ、数個づつ試料を加えないでウェルを培養しくブランク）、バックグラウン ド・コロニー数を得る。試料を含んでいる各ウェルから得られたコロニー数から 、ブランク・ウェルの平均発育コロニー数を差引く。Ｃ５Ｆ濃度がほぼ飽和した 状態の場合、Ｃ５Ｆの１単位は、ヒト、骨髄細胞数１０５当たりのバックグラウ ンド（１０細胞／ｍｔで培養）１こ対して、更に１コロニー多く生成を刺激する 量ｔこ相当する。はぼ飽和した濃度は、希釈１こより、種々の希釈１ｆ：Ｉこお けるコロニー数を比較し、飽和濃度から直ぐ下の濃度を見いだすこと１こより決 定する。

この検定によって、顆粒球、単球またはその双方の血球系が計数される。コロニ ーにおける血球の型は、そのコロニーを採集し、独立した細胞を染色することに よって決定する。

Ｂ、ＫＧ−１細胞検定 ＫＧ−１細胞〔ブラッド％５６巻、３号、（１９８０年）〕は、イスコープ培地 ＋１０％ＦＣ３に１週間当たり２回継代し、各継代毎に２×１０　細胞／−を播 種使用する。検定は、前記の骨髄の場合と同じ方法で行ない、但しＫＧ−１細胞 の場合、寒天混合物１こ４Ｘ１０３細胞／−で培養する。

各ウェルに発育するコロニー数を算定し、前記の骨髄検定の場合のようＥこバッ クグラウンド数を差引く。

ＩＫＧ−１ｃｓＦ単位／−は、発育するＫＧ−１コロニーの最高数（飽和）の半 分の発育を刺激するＣ５Ｆ濃度である。最高数は、数個のウェルでＣ５Ｆの飽和 濃度を含むことｆこよって得られる。

〔第３段階〕ベクターＰ９１０２３（Ｂ）の組立て形質転換ベクターは、カウフ マンらの記載〔モレキュラー・セル・バイオロジー、２巻、１１号、１３０４〜 １３１９頁（１９８２年）〕のｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）である。このベクタ ーは第２図に示す構造を有する。即ち、このプラスミドはアデノウィルス２　（ Ａｄ２）の主後期プロモーターの転写調節に支配されているマウス・ジヒドロ葉 酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡ遺伝子を含んでいる。５′−接合部位はア デノウィルスＤＮＡに含まれており、免疫グロブリン遺伝子から誘導された３′ −接合部位はＡｄ２主後期プロモーターとＤＨＦＲ暗号配列との間に介在しでい る。５Ｖ４Ｑの初期ポリアデニル化部位はＤＨＦＲ′暗号配列の下流ｌこ存在す る。ｐＡｄＤ２６５ＶｐＡ（３）の原核系誘導部分はｐ　Ｓ　Ｖ　Ｏｄに由来し ており〔メ・ロン、パーカー、グルラマン、マニアナイス、（１９８１年）、セ ル、２７巻、２７９〜２８８頁〕、ヒトの細胞で複製を阻害することが知られで いるｐＢＲ３２２配列を含んでいない〔ラスキーおよびボッチャン（１９８１年 ）、ネーチャー（ロンドン）、２９３巻、７９〜８１頁〕。

第２図１コ示シタよう１こ、ｐＡｄＤ２６５ＶｐＡ（３）をプラスミドＰＣｖＳ ｖＬ２　へ変換する。ｐＡｄ−Ｄ２６ＳｖＰＡ（３）にある２つのＰＳＥ１部位 の１個を欠失するｃと＋ｃよってＰＡｄＤ２６ＳＶ−ＰＡ（３）をプラスミｌ’ ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）（ｄ）へ変換する。これは、Ｐｓｔｌで部分消化し 〔１個のＰｓｔ１部位　だけを切断した線状プラスミドの副次集団（サブポピユ レーション）を得ることができるよう、不足した酵素活性を険相する〕、次いで フレノウで処理し、連結してプラスミドを再び環状１こ戻し、エシェリキア・コ リに導入して、５Ｖ４Ｑポリアデニル化配列の３１の位置にあるＰｓｔ　１部位 の欠失をスクリーニングすることｌこよって達成される。

第２図Ｉこ示したように、アデノウィルスの３分節系リーダーおよびウィルス随 伴遺伝子（ＶＡ遺伝子）をｐＡｄＤ　２６　Ｓ　Ｖ　ｐＡ（３）（’）へ挿入し た。先ずＰｖｕｌｉでｐＡｄＤ２６５ＶｐＡ（３）（ｄ）を切［ｒし、３分節系 リーダーを含んでいる３つのうちの１番目の要素の３′−位で間装した線状分子 を作成した。ＰＪＡＷ４３（ザインら（１９７９年）、セル、１６巻、８５１頁 〕をＸｈｏｌで消化し、フレノウで処理し、ＰｖｕｌＪ　で消化し、アクリルア ミド・ゲルで電気泳動することによって〔６％トリス−はう酸緩衝液：マニアテ イスら（１９８２年）、前掲〕、第２リーダーと第３リーダーの１部とを含有し でいる１４０塩基対の断片を単離した。次いでこの１４０ｂｐ断片を、先にＰｖ ｕ　■で消化したＰＡｄＤ２６５ＶＰＡ（３）（ｄ）　へ連結シタ。この連結生 産物を使用して、これをテトラサイクリン耐性エシェリキア・コリ１こ導入し、 グランシュタインーホグネスの方法１こより、１４０　ｂｐ断片１こハイブリッ ド形成した　Ｐ標識プローブを使用してコロニーをスクリーニングした。ハイブ リッド化陽性のコロニーからＤＮＡを調製し、再構築されたＰｖｕ　ｆ（部位が 、アデノウィルスの第２および第３後期リーダー１こ特有な挿入された１４０塩 基対の５′であるか、３′であ不かを試映した。Ｐｖｕ　■部位の正しい配向は 、１４０ｂｐ挿入体の５′側である。このプラスミドを、第２図でｐ　Ｔ　Ｐ　 Ｌ　と命名した。

５Ｖ４ＱＤＮＡをＡｖａｌ）で消化し、その末端をＰｏｌ工のフレノウ断片で平 滑化し、Ｘｈｏｌ　リンカ−をこの断片（こ連結し、Ｘｈｏｌで消化しでＸｈｏ １部位を開々し、ゲル電気泳動１こよって４番目ｆこ大きい（Ｄ）断片を単離す ることｌこよって、５Ｖ４Ｑエンハンサ−配列ヲ含んでいるＳＶ４０のＡｖａｌ ＩＤ断片を得た。次いで、この断片をＸｈｏ　ｌ　切断ｐ　Ｔ　Ｐ　Ｌに連結し で、プラスミｌ／ＰＣＶＳＶＴＬ２−ＴＰＬを得た。ｐＣＶＳＶＬ２−ＴＰＬ　 ｌこおける５Ｖ４０Ｄ断片の配向は、５Ｖ４Ｑの後期プロモーターがアデノウィ ルス主後期プロモーターと同一の配向となるようにした。

ＰＣＶＳＶＬ２−ＰＴＬ　へ７デ／随伴ｆｔ　イ／ｌ／　７．　（ＶＡ）遺伝子 を導入するため、先ず、アデノウィルス２型ＨｉｎｄｌＢ断片を含んでいるプラ スミドｐＢＲ３２２を組立でた。アデノウィルス・２型ＤＮＡをＨｉｎｄ　［［ で消化し、ゲル電気泳動を行なってＢ断片を単離する。

次いでこの断片を、あらかじめＨｉｎｄ［［で消化したｐＢＲ３２２へ導入する 。エシェリキア・コリをアンピシリン耐性に転換し、組換え体をＨｉｎｄ［Ｂ断 片の挿入１こついでスクリーニングし、挿入体の配向を制限酵素消化ｔこよって 決定した。ｐ　ＢＲ３２２−ＡｄＨ４ｎｄ″［［Ｂはアデノウィルス２型Ｈｉｎ ｄ［［Ｂ断片を第３図１こ示した配向で含んでいる。

第３図に示したようｌこ、ＶＡ遺伝子は、プラスミドｐＢＲ３２２−ＡｄＨｉｎ ｄＩ［Ｂ　から、これをＨｐａ工で消化し、ＥｃｏＲ１リンカ−を加え、）ｉ、 ｃｏＲｌで消化し、１．４Ｋｂ断片を回収することｌこよって都合よく得られる 。次いで、ＥｃｏＲｌ接着末端を有する断片をｐ　Ｔ　ＲＬのＥ　ｃ　ｏ　Ｒ１ 部位（あらかじめＥＣ０ＲＩで消化した）へ連結する。エシェリキア・コリＨＢ ＩＯＩＩこ導入し。

テトラサイクリン耐性１こついで選択した後、コロニーをフィルター・ハイブリ ダイゼーションによっでスクリーニングし、ＶＡ遺伝子ｌこ特異的であるＤＮＡ プローブを得る。ＤＮＡはハイブリダイゼーション陽性のクローンから調製し、 制限エンドヌクレアーゼ酵素消化１こよって形質決定を行なう。生産物プラスミ ドを。

Ｐ９１０２３　と命名する。

ｐ９１０２３　１こある２つのＥ　ｃ　ｏ　Ｒ１部位を除去する。

ｐ９１０２３をＥｃｏＲｌ　で完全に切り出すと、２つのＤＮＡ断片が生じる。

１つは約７ｋｂで、他方は１．３ｋｂの共１こＶＡ遺伝子を含んでいる断片であ る。Ｐｏｌ工のフレノウ断片を用いてこの２つの断片の末端を平滑化し、次いで ２つの断片、即ち１，３ｋｂおよび７ｋｂを互いｔこ再連結する。ＶＡ遺伝子を 含んでｐ９１０２３と類似し、但し２つのＥｃｏＲ１部位を欠失しでいるプラス ミドｐ　９１０２３　（Ａ）　は、ＶＡ遺伝子断片でグランシュタイン・ホグネ ス・スクリーニング、および通常の制限部位分析ｔこよって同定される。

次いで、Ｐ９１０２３（Ａ）　にただ１つだけあるＰｓｔ１部位を除去し、Ｅｃ ｏＲｉ部位で置き換える。

Ｐ９１０２３（Ａ）をＰｓｔ　ｌで完全ｔこ切断し、これをＰｏｌ工のフレノウ 断片で処理すると平滑末端を生じる。このＰ　９１０２３　（Ａ）のＰｓｔ　工 平滑末端部位ｆこＥｃｏＲニリンカーを連結する。Ｐｓｔ工　平滑末端部位ｌこ ＥｃｏＲｌが結合した線状Ｐ　９１０２３　（Ａ）を、連結しなかったリンカ− から分離し、ＥｃｏＲｌ　で完全消化し、次いた。このプラスミドはＰ　９１０ ２３　（Ａ）　と近似した構造を有するが、但しＰｓｔ　１部位であった位置に Ｅｃ。

ＲＪ部位が導入されでいることを確かめた。

［第４段階］ｃＤＮＡライブラリーの作成ＭＯ細胞をＰＨＡおよびＰＭＡで１６ 〜２０時間誘導すると、リンホカイン産生が高まった。細胞を２０％ＦＣ３，０ ，３％（ｖ／ｖ）ＰＨＡ　および’ａｎｇ／ｍｔＴＰＡを含有するイソコープ培 地１こ５×１０５細胞／−の密度で培養した。遠心ｌこより細胞を回収した。ペ レットとした細胞を水冷した細胞溶解緩衝液２０−〔Ｒ３Ｂ緩衝液：０．ＯＩＭ −トリス−塩酸（ｐＨ７，４）、０．０１Ｍ−ＫＣＩ、　０．００１５Ｍ−Ｍｇ Ｃ１２，１μｇ／−シクロヘキサイミド、５０単位／ｒｎｌＲＮＡｓｉｎ、５ｍ Ｍ−ジチオトレイトール〕ｌこ再懸濁させた。氷上で５分間細胞を膨化させ、次 いで固く密着したドーンス（ｄｏｕｎｃｅ　）　＊ガラス・ホモジナイザーで１ ０回転しで１機械的Ｅここれを破砕した。このホモジネートを低速回転で遠心し くベックマンゴ６型遠心機、２０００ＲＰＭ　）、核および未分解の細胞を除去 した。上清を氷上に保存し、核ペレットをもう一度Ｒ５ＢＩＱ艷に懸濁し、低速 回転で遠心した。２回目の上清を１回目。

の上清とプールし、プールした上清を低速で遠心し、残存しでいる核および未分 解細胞の混入を除去した。

遠心ｆこよって得た上清ｆこ２　Ｍ　−ＫＣＩ　を加えて０．１５Ｍ−ＫＣＩの 濃度にし、これを高速回転で遠心して（ベックマンｓ　ｗ　２　Ｂ型ローター、 ２５００　ＯＲＰＭ。

３０分間）、細胞膜をペレット化した。細胞膜ペレットを冷Ｒ５Ｂで注意深く洗 浄し、次いでこれを、２Ｍ−蔗糖および１．１５Ｍ−ＫＣＩを含有するＲ５Ｂ１ ２−１こ再懸局させた。ベックマンＳＭ４１遠心チユーブ（こ、２．５Ｍ−蔗糖 およびＱ、１５Ｍ−ＫＣｌを含有するＲ５Ｂ２ｒｎｌを加え、その上ｌこ細胞膜 液の２Ｍ−蔗糖液６ｒｎｌを重層し、２層の不連続勾配を作成した。チューブの 最上＠ｌこ、更ｌこ１．３Ｍ−蔗糖とｏ、１層Ｍ−Ｋｃｌを含有するＲ５Ｂ２． ５−を充填した。この勾配を４℃で２７００ＯＲＰＭで４時間回転した（ベック マンＳＷ層（２，０Ｍおよび１．３Ｍの蔗糖層間の境界面）を側壁から注意深く 採取した。２つの勾配からの膜画分をプールし、これを蒸留水１容積で希釈し、 次いでトリトンＸ−１００およびデヒドロコール酸ナトリウムをそれぞれ０．５ ％となるよう１こ加え、等容積のフェノールで抽出した。更ｆこ、水層をフェノ ールおよびクロロホルムの１：１混合物で抽出し、最後１こ等容積のクロロホル ムで抽出した。次にＮａＣ１を０．２５　Ｍと冷エタノール２．５容積とを加え で、−２０℃で１夜インキユベートすることにより、細胞膜に結合しでいるＲＮ Ａを沈澱させた。沈澱したＲＮＡを遠心によつで捕集しくベックマン、Ｊ−６型 遠心機、４０００ＲＰＭ、１０分の細胞からＲＮＡ約１ｍ９が得られた。０．５ 　ｒｎｌオリゴｄＴ−セルロース・カラムを通しでクロマトグラフィーを行ない 、総・ＲＮＡからメツセンジャーＲＮＡ（ｍ　ＲＮ　Ａ　）　を分離した。即ち 、ＲＮＡを７０℃で５分間加熱した後、氷上で急速ｌこ冷却し、次いで、室温の 結合緩衝液（Ｑ、　５　Ｍ　−ＬｉＣ／、０．ＯＩＭ−１−リス−塩酸（ｐＨ７ ，４）０．００２Ｍ−ＥＤＴＡ、０．１％５ＤＳ）でこの液を５倍１こ希釈した 。このＲＮＡ−結合緩衝液溶液を、結合緩衝液で飽和したオリゴｄＴ−セルロー ス・カラム１こ室温で通過させた。カラムを結合緩衝液５ｒｎ！で洗浄した後、 更１こ、０．１５Ｍ−ｔｉｃ／、０．ＯＩＭ−トリス−塩酸（ｐＨ７，４）、０ ．　ＯＯ２Ｍ　−ＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳから成る溶液５μｌで洗浄した 。

最後に、０．ＯＩＭ−トリス−塩酸（ｐＨ７，４）、０、００２Ｍ　−ＥＤＴＡ 　および０．１％ＳＤＳから成る溶液２ｒｎｌでｍ　ＲＮ　Ａを溶出した。Ｎａ Ｃｌを０．２５　Ｍまで加え、２．５容積のエタノールを加えて一２０℃ｌこ１ 夜インキユベートすること１こより、ｍ　ＲＮ　Ａが沈澱した。

遠心により、沈澱したｍ　ＲＮ　Ａを捕集した（ベックマン、５ｗ５５型ロータ ー、３００００ＲＰＭ、３０分間）。

注意深くチューブから上清を除去し、得られたｍ　ＲＮ　Ａのペレットを再び水 ５０−に懸濁した。ｍ　ＲＮ　Ａの悪濁液にＮ　ａ　Ｃ／　を加えて０．２５　 Ｍとし、次いでフェノールおよびクロロホルムの１層１混合液で１回抽出し、次 いてり°ロロホルムで３回抽出した。２．５容積のエタノールを加えることによ り、ｍ　ＲＮ　Ａが沈澱した。ドライアイス／エタノール浴で凍結・融解を数回 繰り返し１次いでエツペンドルフ遠心機で１５分間遠心した。

チューブを注意深く傾斜しで上清を除き、ｍ　ＲＮ　Ａペレットを蒸留水２０μ ｌに懸濁させた。最終収量はｍＲＮＡ約３０μｇであった。

標準的方法を用いて第１鎖ｃＤＮＡを作成した。すなわち、細胞膜ｍＲＮＡＩＱ μｇをｃＤＮＡ合成反応混合液１００．ｃｌ　（３００ｍＭ−１−リス（ＰＨ９ ，４）、１４０　ｍＭ　−ＭｇＣ１，、，１０ｍＭ−β−メルカプトエタノール 、各５００μＭのｄＡＴＰ　、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、プライマー としてオリゴ−ｄＴ５μｇ（燐酸化、平均サイズ１２〜１８個）、ＰｄＣＴＰ１ ５０μｃｉ　（４００Ｃｉ／　ミリモル）、リボヌクレアーゼ・インヒビターＲ ＮＡ５ｉｎ　’；ｌ　Ｑ単位、含有〕ｌこ希釈した。逆転写酵素１００単位を添 加して反応を開始し、４２℃で３０分間インキュベートした。ＥＤＴＡを４０ｍ Ｍまで加えて反応を停止し、ＲＮＡを０．２Ｍ−ＮａＯＨ中で６５℃で２０分間 インキュベートすること１こよって分解した。２Ｍ−トリス（ｐＨ７，４）　２ ０μｊを加えて塩基を中和した。反応混合物をフェノール／クロロホルムで抽出 し、これを１０ｍＭ−ＩＪス５０ｔｔｌ　（ｐＨ７，５）、ｌ　ｍ　Ｍ　−Ｅ　 Ｄ　Ｔ　Ａ　（Ｔ　Ｅ　）で逆抽出して、水層をプールした。第１鎖ＤＮＡをＤ ＮＡポリメラーゼ■のフレノウ断片と反応液１００μ！　〔５０ｍＭ−燐酸カリ ウム（ｐＨ７，４）、２．３ｍＭ−ｏＴ丁、２−ｙｌルｔ）プ）　エタ／−／Ｌ 、、１０ｍＭ−ＭｇＣ／２　、各１５０マイクロモルづつの４種の三燐酸デオキ シヌクレオチド、Ｐ−ｄｃＴＰ２５μＣｉ、含有〕中で１２時間１６℃でインキ ュベートすること１こより、２重鎖ｃＤＮＡに変換した。フェノール／クロロホ ルムで抽出することによって反応を停止し、水層を１ｒｎｌのセファデックスＧ −５０カラムに通すこと１こより組込まれなかった三燐酸エステルを除去した。

溶出した両分をプールし、エタノールで沈澱させた。

ｃＤＮＡペレットを冷エタノールで洗浄し、次いでこれを、２０　ｍＭ　）リス （ＰＨ８，０）、ｌ　ｍ　Ｍ　−ＥＤＴＡ　。

８０μＭ−５−アデノシルメチオニン、ＥｃｏＲ１メチラーゼ３００単位の反応 液２００μｌｌこ再懸濁して３７℃で６０分間インキュベートした。フェノール ／クロロホルム抽出１こよつで反応を停止し、メチル化されたｃＤＮＡをエタノ ール沈澱１こより捕集した。

ｃＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗１争し、これを５１緩衝液（マニマテ イスら）２００μ／Ｉこ懸濁し、Ｓｌ−ヌクレアーゼ２００単位と３０°Ｃで３ ０分間インキュベートした。フェノール／クロロホルム抽出（こよって反応を停 止し、エタノール沈澱によりｃＤＮＡを捕集した。

２重鎖ｌこしたｃＤＮＡを２５単位のフレノウと２０ｍＭ−）　リ　Ｘ（ＰＨ７ ，４）　、５　０ｍＭ−ＮｈＣｌ、　１　０ｍＭ−２−メルカプトエタノール、 各５００μＭづつの４種の三燐酸デオキシヌクレオチドからなる反応液１００μ ｌ中で３０分間室温でインキュベートすることにより、平滑化した。フェノール ／クロロホルム抽出１こよって反応を停止し、エタノール沈澱によりｃＤＮＡを 捕集した。

Ｔ４リガーゼ緩衝液５０μ！　（マニエスタら）中で、・ｃＤＮＡとＲ１リンカ −（ユニ・イングランド・バイオラボから購入）（配列、ＰＣＧＧＡＡＴＴＣＣ Ｇ）５ＱＱピコモルとを、Ｔ　４１Ｊガ一ゼ２０００単位を用いて１夜１６℃で インキュベートして連結した。７０℃、２０分間インキュベートすることｔこよ って反応を停止し、次いで、その最終塩濃度がＱ、１Ｍ−ＮａＣｌ、ｌＱｍＭ− ＭｇＣ／２．５０ｍＭ−トリス−ＣＩ　（ｐＨ７，４）となるよう１こ、この液 を３００μｌ！ｌこ希釈した。次いてＥｃ。

ＲＩ７００　単位でｃＤＮＡを２分間３７°　で消化した。

フェノール／クロロホルム抽出１こよって反応を停止し、エタノール沈澱１こよ りｃＤＮＡを捕集した。そのペレットを再びＴＥ５０ｐｌに懸濁し、５ｒｎｌの Ｃｌ−４Ｂカラムを通過させた。溶出する両分をプールし、エタノールで沈澱さ せた。沈澱したｃＤＮＡのトリス−酢酸緩衝液溶液を、臭化エチジウム１μｇ／ −の存在下に１％アガロース・ゲルで電気泳動した。標準的なガラス粉末法を用 いで、５００〜４０００塩基対の大きさのｃＤＮＡをゲルから単離した。溶出し たｃ　Ｄ　Ｎ　Ａをフェノール／クロロネルで抽出し、エタノール沈澱ヲ行すい 、得られたペレット（エタノール洗浄後）をＴＥ５Ｑμｍ＋こ再懸濁した。最終 収量はｃＤＮＡ１００〜５００　ｎｇであった。

発現ベクターＰ　９１０２３　（Ｂ）の作成は先に記載した。ＥｃｏＲｌで消化 し、ホスファターゼ処理をした該ベクター（５００ｎｇ　）を１００　ｎｇのｃ ＤＮＡと反応液（標準Ｔ４１Ｊガーゼ反応液）１００μｊ中で１６℃で１夜イン キユベートしで連結させた。フェノール／クロロホルム抽出ｌこよって反応を停 止し、ｔ　ＲＮＡ　５μｇをキャリヤーとして添加後、エタノール沈澱ｌこより 連結されたｃＤＮＡを捕集した。

エタノールで沈澱させたｃＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、これをＴＥ １００μ１１こ懸濁させた。

このＤＮＡのアリコート４μｌを使用して、エシェリキア・コＩＪ　Ｍ　Ｃ１０ ６１の形質転換を行なった（１００μＥの形質転換に４μＥを使用）。それぞれ １％寒天、づつの形質転換を塗布し、３７°で１夜インキユベートした。各平板 毎に約２０００個のコロニーが発育し、合計的５００００　コロニーを得た。コ ロニーの直径が約０．５　ｍｍに達した後、平板表面に乾燥フィルターを注意深 く載せ、次いでこれをフィルターから静か１こ剥がすことにより、コロニーをニ トロセルロース・ディスク（１３７ｍｍ）へ移す。平板上のすべてのコロニーを フィルターへ移したら、新た１こ調製したＴｅｔ平板へこのフィルターを置く（ コロニー側を上にして）。

コロニーを数時間発育させた後、各フィルター毎１こ、新しく濡らしたフィルタ ーを正確ｆこ元のフィルターに重ね、互い１こ圧しつけた後、これを剥がして、 各フィルターを新たに調製したＴｅｔ平板に戻し、平板を３７゜で１夜インキユ ベートすることｌこより、各１枚づつのレプリカを作成した。各レプリカは、元 のフィルターと再度揃えることができるよう１こ注意深く印をした。

〔第５段階〕プラスミドＤＮＡプールの作成２５枚の各レプリカ・フィルターは 、外科用メスを使用しで注意深く裁断し、元のマスター・フィルターに対する各 方向を注意しながら８組の断片ｌこ分けた。

各断片からコロニーを１０−のＬ−ブロスｌこ塗抹した。

遠心ｌこよって菌を捕集しくベックマンＪ−６型遠心機、３０００ＲＰＭ、１０ 分間）、これを２５％蔗糖、５０Ｍ−トリス−塩酸（ｐＨ８，０）から成る溶液 ０．６　ｍ／に再浮遊させ、これｌこ５η／−のリゾチーム０．１２−を加えで 、氷上で５〜１０分間インキュベートすることｌこよりプロトプラストに変換さ せた。次ｌこ、該プロトプラストを室温で１０分間インキュベートした後、０． ５Ｍ−ＥＤＴＡｏ、１２５−を加え、更（こ１０％ＳＤＳの５０ｍＭ−）リス− 塩酸（ｐＨ８，０）溶液０．１２ｍ／ヲ加えで、これを溶菌した。溶菌物を静か ｊこ混合し、室温で１５分間インキュベートした後、５Ｍ−ＮａＣｌＯ，３、ｎ ｌを加えて蛋白質および染色体ＤＮＡを沈澱させた。氷上で１５分間インキュベ ート後、溶菌物をエツペンドルフ遠心機で冷時３０分間遠心した。上清を注意深 く除去すると粘着性のＤＮＡ／蛋白質ペレットが残るので、これ１こ水２．５− を加えで希釈した。混合物を１−のフェノールで抽出し、遠心により層別しくツ ルポール５５−３４型ローター、１０に、１０分間）、水層を新しいチューブ１ こ採った。５　Ｍ　−ＮａＣｌ０．５　ｍＡおよび冷エタノール７．５−を加え 、ドライアイス／エタノール浴で混合物を数回凍結することにより、ＤＮＡを沈 澱させた。遠心Ｉこよって沈澱を捕集しくツルボール５ｓ−３４型、１０に、１ ５分間）、これを０．３Ｍ−酢酸ナトリウム０．３−に再懸濁し、エタノール１ −を加えて再沈澱させた（エツペンドルフ・チューブ中で行なう）。ドライアイ ス／エタノール浴に１０〜１５分間放置後、沈澱したＤＮＡを遠心ｌこよって捕 集しくエツヘンドルフ、５分間）、目的とするペレットを滅菌ＴＥ　（ｉ　Ｑｍ Ｍ　−１−リ　ス　（ＰＨ８）　、１　ｍ　Ｍ　−ＥＤＴＡ〕１００μｍ＋こ再 懸濁した。代表的な作成例から、５〜１０μｇのプラスミドＤＮＡが得られた。

各試料は。

元のフィルターの２００〜５００コロニーからのＤＮＡを含んでいた。、２５枚 のフィルターから合計２００個のＤＮＡ試料が作成された。

〔第６段階）Ｃ５Ｆクローンの単離 第５段階で得られた各ＤＮＡ試料は、下記の記載のよう（こ、それぞれ個別にサ ルＭ６ＣＯ５細胞へ導入した。

Ｍ６細胞を、１０％加熱失活処理ウシつ児血清（ＨＩＦＣ５）を含有するダルベ ツコの修飾１こよるイーグル培地（ＤＭＥ、ギブコ社より入手）Ｉこ常法通り発 育させ、１週間に２回、１：６の希釈で分割する。Ｍ６細胞は、１：６に分割し て２４時間後がトランスフェクションし易い。導入する２４時間前に、１．２Ｘ １０８個のＭ６細胞（１：６分割）を、ＤＭＥ−）−ＩＱ％ＨＩＦＣ５液１．５ １から成るセル・ファクトリ−（ヌンク社から入手）へ播種する。トランスフェ クション直前ｌこ、平板を吸引し、血清を含んでいない（ＳＦ）ＤＭＥ７−で２ 回洗浄する。ＤＮＡを０．１Ｍ−）リス（ｐＨ７，３））こｍ解し、２ｍＭ−グ ルタミン、ストレプトマイシン１００μｇ／ｉ、ペニシリン１００単位／−およ びＤＥＡＥ−デキストランｏ、２ｓＩＩ９／−を含有するＤＭＥ培地をこれに加 えてトリス−ＤＮＡ溶液の全容量が４−となるよう１こ調製する。溶解したＤＮ Ａを含有しでいる培地４ｒｎｌを、Ｍ（ｉｃＯ５細胞を含有する平板に加え１２ 時間インキュベートする。

インキュベーション終了後、ＳＦ−ＤＭＥ７−で細胞を１〜２回洗浄する。これ ｔこ１０％Ｈ１−ＦＳＣ、ペニシリン１ｏ　ｏ　単位／ｍ１．ストレプトマイシ ン１００μｇ／ｍｇ　、２ｍＭ−グルタミンおよびＱ、　ｌ　ｍ　Ｍ−クロロキ ンを含有するＤＭＥ５−を加え、細胞を２′／２時間インキュベーションシタ。

２１／２時間後、ＳＦ−ＤＭＥで１回洗浄し、次いで、平板１枚当たりＤＭＥ− ）−ＩＱ％ＨＩＦＣ５ＩＱ−を加える。３０時間後、培地を吸引し１次いで平板 １枚当たりＤＭＥ＋１０％Ｉ（ＩＦＣ５４−を追加する。更ｌこ２４〜２６時間 インキュベーション後、調整培地を回収する。

トランスフェクションした各培地は、ＫＧ−ｘ検定を用いでＣ５Ｆ活性を検定し た。Ｃ５Ｆ活性が陽性の場合は、試料毎に対応するマスター・フィルターのクロ ーンを確認しなければならない。例えば、Ｃ５Ｆ活性の形質導入陽性が１つあれ ば、このトランスフェクションＤＮＡが誘導された１元のマスター・フィルター 切片のすべでのコロニーを拾い上げた。これらのコロニーの３２０個を、ブロス ＋テトラサイクリン１０μｇ／ｍｔから成る培地３−へ拾い上げた。３２０個の コロニーを１８Ｘ１８のマトリックスに配置した。各横の行および縦の列毎１こ １つづつプールを作成した（合計３６プール）（但し、最後の横の丘は１４個で ある〕。

プールした各培養からＤＮＡ試料を作成し、これを使用し″ＣＣＯ５細胞へ導入 した。これらのトランスフェクションの上清ｌこついで、ＫＧ−トコロニー検定 ヲ用い、検定した。このトランスフェクションの組合せか、ら、２つの陽性試料 が得られた。その１つは縦の列であり、もう１つは横の行であった。この２つの プール；こ共通しでいる培養はＣ８Ｆクローンを含んでいる。

この培養から１２個の独立したクローンを単離し、先１こ記載の通り、Ｌ−ブロ スの１〇−培養から小規模生産ＤＮＡを作成した。これらの標品から得た１０μ ｌのＤＮＡ試料をＥｃｏＲｌ　で消化し、得られたＤＮＡ断片をアガロース・ゲ ル電気泳動１こより分析した。１２個のクローンのうち９個に、共通した約７５ ０塩基対の挿入体があった。これらのクローンの４個から得たＤＮＡと、残りの ３個のクローンのＤＮＡを、前記のようシこＭ（３ＣＯ５へ導入した。これらの トランスフェクションの上清についで、ＫＧ−１および骨髄１こよるＣ５Ｆ検定 を用いて検定を行なった。何れの検定でも。

７５０１）Ｐ断片を含んでいる４個のクローンは、すべてＭ３ＣＯ５細胞によっ て高濃度のＣ５Ｆ活性を発現されるが、一方、他の３個のクローンでは発現され ないことが明らか１こなった。従って、Ｃ５Ｆの暗号領域は７５０　ｂｐの挿入 体内ｌこ位置しているに相違ない。

陽性クローンをＥｃｏλ１で消化することにより、Ｃ５Ｆを暗号化しでいるＤＮ Ａを形質転換ベクターから脱離し、この断片をＭ１３にサブクローンし、標準的 なジデオキシ配列決定法を用いて配列決定を行ない、第１図に示した配列を得た 。ＣＯＳ細胞においで、Ｃ５Ｆ発現を指示することが最初ｌこ解明されたプラス ミドＰ　９１０２３　（Ｂ）−Ｃ５ＦをｐｃｓＦ−１と命名した。

このプラスミドは、エシェリキア・コリのＭＣ１０６１株としで、寄託番号ＡＴ ＣＣ３９７４のもと１こ１９８４年７月２日、アメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクション（ＡＴＣＣ）１こ寄託された。

〔第７段階）Ｃ５Ｆ蛋白質の発現 第６段階で単離した、ＣＳ　Ｆ　／　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを含有しでいるベクターｐ 　９１０２３　（Ｂ）を導入したサルのＭ６ＣＯＳ細胞を、第６段階の記載のよ うｌこ培地１こ発育させ、Ｃ３Ｆ蛋白質を生産させた。

即ち、このＤＮＡ（ｐｃｓＦ−１）の１■を０．１Ｍ−トリス（ＰＨ７，３）ｌ ｒｎｌに溶解し、これｌこ２　ｍ　Ｍ　−グルタミン、１００単位／−ストレプ トマイシン、１００μｇ／−ペニシリン（Ｐ／Ｓ）、０．２５’９７ｍ／ＤＥＡ Ｅ−デキストラン（分子量５ｏｏｏｏｏ、ファルマシア社製）を含有するＤＭＥ ６００ｔｎｌを加えた。６００−のＤＮＡ−ＤＥＡＥ−デキストラン溶液をセル ・ファクトリ−内でＭ３ＣＯ５細胞１こ加え、３７°　で１２時間インキュベー ションした。インキュベーション後、細胞をＳＦ−ＤＭＥ９００−で１回洗浄し 、次いで０．１ｒｎＭ−りｏロキン、１０％ＨＩＦＣ５，２ｍＭ−グルタミンお よびＰ／Ｓを含有しているＤＭＥ６００−と２．５時間インキュベートする。ク ロロキンを含有しでいる培地を吸引後、細胞をＳＦ−ＤＭＥで洗浄し、新た；こ １０％ＨＩ　Ｆ　ＣＳを含有するＤＭＥ１５００−を加えで培養する。３０時間 後、細胞をＳ　Ｆ−ＤＭＥで洗浄し、培地をＳＦ−ＤＭＥ８００−と置き換え、 この培地で２４時間３７℃で放置しでコンデショニングする。調整培地を吸引し 、新たにＳＭ−ＤＭＥ８００ｄと置き換える。細胞を２４時間放置しで、この培 地でコンディショニングし、次いて調整培地を捕集する。

できるだけ回収した後、アミコン２．５１チエンバーでＶＭＳメンプランを使用 し、加圧限外諷過ｆこよって、この調整培地試料を２０倍に濃縮する（分子ｍ５ ｏｏ。

でカットオフ）。

〔第８段階〕組換え体Ｃ５Ｆの精製 濃縮した調製培地２００ｍ１（第７段４階、原材料４１から）に固体塩化アンモ ニウムを加えで、３０％飽和濃度とし、沈澱する蛋白質を遠心によって捕集した 。

更１こ、その上清に固体塩化アンモニウムを追加しで。

８０％飽和濃度とし、沈澱する蛋白質を遠心１こより捕集した。ペレットをＩＭ −ＮａＣ１含有の２０　ｍ　Ｍ−クエン酸ナトリウム（ｐＨ６，１）ｓｍｌ＋こ 再懸濁した。溶解した蛋白質を、これと同じ緩衝液で飽和したウルトロゲルＡｃ Ａ３４の１．６Ｘ１００ｃｍカラムに掛けた。

見掛けの分子量が１９にダルトンまたは溶出液が約９０−となった後、Ｃ５Ｆ活 性をカラムから溶出した。ゲル沖過を低いイオン強度で行なうとカラムから溶出 するＣ５Ｆ活性は約１９にダルトンと３８にダルトンの２つの見掛は分子量の位 置に現われ、ＧＭ−Ｃ５Ｆが２量体を生成し易いことを示しでいる。活性画分を プールし、０．１５％ＴＦＡ濃度としく１０％ＴＦＡを加えること１こよって） 、これを０．１％ＴＦＡで飽和したビグツクＣ４カラム（０，４６ｘ　２５ＣＩ ｌ）へ掛けた。カラムをアセトニトリル０→９０％の濃度勾配のＯ１１％ＴＦＡ で展開した（１−／分、全敬３４０ｍ／）。Ｃ５Ｆ活性はアセトニ）　ＩＪル濃 度３９〜４３％（画分１６〜２０）で溶出した画分１９の試料２０−をＳＤＳポ リアクリルアミド・ゲル電気泳動ｆこよって分析した〔ゲル濃度１３．５％、ラ ミリ、ネーチャー、２２７巻、６８０頁（１９７０年）〕。見掛けの分子量１８ 〜２６にダルトンの単一な蛋白質の幅広いバンドが観察された６Ｃ５Ｆのこのや や幅広いサイズ幅は糖蛋白質（こ共通した像であって、広範囲に変化する炭水化 物の付加Ｆこよるものである。１９両分の蛋白質は、応用生物系微量アミノ酸気 相分析装置１こよりエドマン分解をうける。約２０μｇの蛋白質を適用し、最初 の１６個のアミノ酸配列は（Ａ−Ｐ−Ａ−Ｒ−５−Ｐ−５−Ｐ−５−Ｔ−Ｑ　− Ｐ−Ｗ−Ｅ−Ｈ）であった。高収量で得られるこの単一な蛋白質のアミノ酸配列 から、１９両分のＣ５Ｆ蛋白質は同質性Ｉこ精製されでいることが示唆される。

生物検定で、１９画分はＡ２８０の吸収１単位当たり３×１０７単位であった。

標帛品蛋白質の水溶液では、蛋白質１■当たりの吸光度Ａ２８０　における吸収 は０．８〜１．２単位であるから、ヒトの骨髄細胞１こよって検定した精製蛋白 質の比活性は約１×１０７〜約４Ｘ１０７単位／ηである。

〔実施例Ｂ〕

ギボンＣ５Ｆのクローン形成 〔第１段階〕ギポンＴ細胞からｍ　ＲＮ　Ａの作成ＵＣＤ−ＭＬＡ　１４４とい う名のギボンＴ細胞系試料を、２０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含んでいるａｐ ＋ｖ１■１６４ｏ（ギブコ社から購入）で全細胞数が１×１０９となるまで数週 間培養した。ＲＰＭ　１１６４０＋１％ＦＣ５１−当たりに、１２−０−テトラ デカノイルホルボール−１３−アセター）　（ＴＰ　Ａ）ｌＱｎｇの存在下に細 胞を２４時間賦活し、高濃度のＣ５Ｆを生産するよう誘導した。遠心によって細 胞を回収しく１１０００ＲＰ、１５分間）、燐酸緩衝食塩ｉ　（ＰＢＳ）で１回 洗浄し、更１こ遠心して細胞を捕集した。

実施例Ａｌこ記載したＭｏ細胞ＲＮＡの作成と同じ方法を用いで、これらの細胞 から、細胞膜に結合しでいるポリソーム（ＭＢＰ）ｍＲＮＡを作成した。

〔第２段階〕第１鎖ｃＤＮＡ反応 Ｍ　Ｂ　Ｐ　−ｍＲＮＡ　（第１段階）６μｇを合成反応混合液（実施例Ａ、第 ４段階、参照）５０μｊ１こ希釈し、逆転写酵素を添加して反応を開始した。４ ２℃で３０分間インキュベーションしり後、ＥＤＴＡを５ＱｍＭまで加えるとと ｌこより反応を停止し、水を加えて１００μｌとなるよう希釈した。混合物をフ ェノール／クロロホルム、次いでクロロホルムで抽出シタ。２−のセファロース ＣＬ−４Ｂカラムでクロマトグラフィーを行ない組込まれなかった三燐酸エステ ルからｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを分離した。溶出画分をプールし、エタノ ール沈澱によりハイブリッドを捕集した。

最終収量５７０　ｎｇであった。

〔第３段階〕第２鎖ｃＣＮＡ反応 第１鎖ｃＤＮＡペレツト（第２段階）を水５０ｍｊｉこ懸濁し、エシェリキア・ コリ・ポリメラーゼエ、エシェリキア・コリ・リガーゼ、およびリボヌクレアー ゼＨを含んだ標準反応混合液を用いて第２鎖合成を実施した。反応液を１６℃で １夜インキユベートし、次いで３７℃で１時間インキュベートした。ＥＤＴＡを 加えて反応を停止し、フェノール／クロロホルムで抽出した。セファロースＣＬ −４Ｂカラムでクロマトグラフィーを行ない組込まれなかった三燐酸エステルか らｃＤＮＡを分離し、溶出画分をプールし、エタノール沈澱によりｃＤＮＡを捕 集した。

〔第４段階〕組換え体ｃＤＮＡ作成 ｃＤＮＡペレット（第３段階）を水７５μｌに懸濁した。末端転移酵素を含んで いる標準反応液２５μｌへ、このｃＤＮＡ溶液を加え、３０℃で５分間インキュ ベートすること１こよつでｃＤＮＡの末端Ｅこホモポリマー性Ｃ「尾部」を付加 したっＥＤＴＡを４ＱｍＭ加え、６８℃で１０分間加熱しで失活させること１こ よって反応を停止した。尾部化を行なったこのｃＤＮＡＩＱｎｇ　Ｉこ　、Ｉ　 Ｑ　ｍＭ　−）　リ　ｘ　（ｐＨ７，５）　、１ｍＭＥＤＴ　、ｌＱＱｍＭ−Ｎ ａＣ／から成る液１０μｊ中でＧ尾部化ｐＢＲ３２２（ネン社より購入）をアニ ーリングした。

アニーリング反応は６８°で１Ｑ分間、次いで５７°で２時間インキュベートす ることによって行なった。

〔第５段階〕細菌の形質転換 エシェリキア・コリＭＣ１０６１株をＬ−プロスｔこ発育させ、氷上で冷却し、 遠心しで回収し、形質転換１こ用いるためＣａ　Ｃ，ｌ　２で処理した。次いで 、アニーリング反応を行なったｃＤＮＡ５μｊをＣａ　Ｃｌ　２処理細菌２００ μｌとインキュベートした。アニーリングをしたｃＤＮＡをすべで使用して、そ のような形質転換を１５回行ない、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｔ　を含有し た１５Ｃ１１の１％寒天Ｌしブロス平板上１こ、これらを拡げた。各平板ｌこ、 それぞれ約１０００コロニーが発育した。

〔第６段階〕レプリカ培養 形質転換によって得られた１００００個　のコロニーを、それぞれっま楊子で拾 い上げ、新たｌこ調製した平板ｌこ移しく１平板当たり５００個、基盤目状に） 、３７℃で１夜発育させた。乾燥したニトロセルロース・フィルターを平板表面 上にしっかりと圧しつけることによって、各プレートからコロニーを拾い上げた 。このレプリカ・フィルターを作成したつマスター・フロルターは４℃で貯蔵し 、一方、レプリカ・フィルターは塩基で処理し、焙焼しでハ・イブリッド形成用 Ｉこ調製した。

〔第７段階〕　Ｐ−標識ハイブリダイゼーション・プローブの作成 制限酵素ＥｃｏＲ１１こよる制限消化と、トリス酢酸および臭化エチジウムを用 いたアガロース・ゲル電気泳動ｌこよつで、ｐＣ５Ｆ−１からｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿 入体を単離した。ゲルから、ｃＤＮＡ断片を含んでいるバンドを切り出し、ガラ ス粉末法Ｉこより精製した。

ｃＤＮＡ断片３００　ｎｇを１０ｘＴ４ＤＮＡ　ポリメラーゼ緩衝液（０，３３ Ｍ−トリス酢酸（ｐＨ７，９）、０．６６Ｍ−酢酸カリウム、０．ＩＭ−酢酸マ グネシウム、ｌＱｍＭ−ジチオトレイトール〕１μｊおよびＴ４ＤＮＡポリメラ ーゼ３単位にュー・イングランド・バイオラブズ）へ加え、これを水１０μｌで 希釈した。

３７℃で５〜１０分間インキュベートした後、この混合物を１０ＸＴ４ＤＮＡポ リメラーゼ緩衝液１μｊ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ　Ｏ各２ｍＭ溶液１　 ／Ｊ／づつ、３２Ｐ−ｄＡＴＰＩＱμ１（１０μＣｉ／μｊ、３０００Ｃｉ　／ 　ミリモル）、ＴｒＤＮＡポリメラーゼ３単位ト混合した。３７℃で２０分間イ ンキユベートシて反応を行なった。次いで２ｍ　Ｍ　−ｄ　Ａ　Ｔ　Ｐ　ｌμｌ を加え、更ｌこ１０分間３７℃で反応液をインキュベートシタ。

セファデックスＧ１００カラムを用いたクロマトグラフィー１こよって、組込ま れなかった三燐酸エステルを標識ｃ　ＤＮＡから分離した。下紙の配列：ＡＴＣ ＴＣＧ　ＣＴＧ　ＣＡＣＡＧ を有する合成オリゴヌクレオチドから第２のプローブを作成した。この配列はＣ ５Ｆ暗号領域のアミノ末端と相補的である。このオリゴヌクレオチドは、標準的 なポリヌクレオチドキナーゼ反応ｌこよってその５′−末端ｌこ　Ｐ−ｄＡＴＰ を標識した。

〔第８段階３Ｃ３Ｆ−ｃＤＮＡクローンの単離標準的なハイブリダイゼーション ・スクリーニング−１ｃＤＮＡでハイブリダイゼーションした。これらのうち、 約２０個は更にハイブリダイゼーションしてオリゴヌクレオチド標識プローブと した。これらのうちの１個ｔこついで、その暗号領域の配列決定を行なった。そ の配列データから、多くの塩基置換が見受けられ、その幾つかは発現蛋白質Ｉこ おけるアミノ酸の相違を生じる。第１図においで、実施例Ａでクローニングした ヒトＣ５Ｆ遺伝子のＤＮＡ配列の上１ここれらの差異を示した。

〔実施例Ｃ〕

末梢血リンパ球ｍＲＮＡからのＣ５Ｆクローニング〔第１段階〕末梢血リンパ球 からのｍ　ＲＮ　Ａ調製４本のプラズマフエレーゼ（血漿搬出）副産物（赤十字 から購入）をフィコール／ハイバーク濃度勾配法ｌζよって分別し、末梢血リン パ球を調製した。５％ウシ胎児血清、０，１７％フィトヘマグルチニンおよび１ ０ｎｇ／−ホルボール・ミリステート・アセテート（ＰＭＡ）　の存在下１こ、 低密度λＰＭＩ７１６４０　が２×１０６細胞／−の密度で得られた（合計６× １０９細胞）。細胞を遠心１こよって捕集しく１１０００ＲＰ、５分間）、燐酸 緩衝食塩液（’Ｐｕ５）で１回洗浄し、もう一度遠心ｔこよって捕泉した。細胞 を冷トリトン細胞溶解緩衝液５０ｒｎｌ［１４０ｍＭ−ＮａＣ／、ｌ、５ｍＭ− ＭｇＣ１２、Ｉ　ＱｍＭ　−）　リ　ス　（ＰＨ８，６）　、０．５　％トリト ンＸ−１００）ｌこ懸濁させ、ｌＱｍＭ−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）および ５０単位／ｒｎｌＲＮＡｓｉｎ（バイオチック社より購入）で行なう緩和な溶解 手法によって細胞質λＮＡを調製した。この分解物を２等分し、それぞれ２０％ 蔗糖を含有しでいる溶解緩衝液１０−の層の上に重層した。細胞咳は冷時、遠心 ！こよつで除去した（４℃、４００ＲＰＭ、５分間）。

上層（細胞質抽出分）を注意深く捕集し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を 最終濃度が１％となるようｆこ添加した。この溶液を等容積のフェノール／クロ ロホルム混合物（１：１）で２回抽出し、冷エタノール２．５容積を加えでＲＮ Ａを沈澱させた。沈澱したＲＮＡを遠心によッテ捕集しく　４０００ＲＰＭ、１ ５分間）。

更１ここれを０．１５Ｍ−）リス（ＰＨ７，５）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、０．２５ Ｍ−ＮａＣ／（ＴＥ緩衝液＋０．２５　Ｍ−ＮａＣｊ’）に再懸濁し、冷エタノ ール２．５容積を加えて再沈澱させた。最後に、遠心ｔこよっでＲＮＡを捕集し 、水５ｍ／ｌこ懸濁した。最終収量７．５ηであった。

オリゴｄＴセルロースで選び出すことによって、全細胞質ＲＮＡからメツセンジ ャーＲＮＡ、ｊｉ−単離した。

全ＲＮＡ２．５ｍ９を６５°で５分間加熱した。０．５ＭとなるようにＮ　ａ　 Ｃｌ　を加え、ＲＮＡが室温１こ戻るまで放冷した。Ｃ（７）ＲＮＡをＴ　Ｅ　 十Ｑ、５　Ｍ　−ＮａＣＡ’　（結合緩衝液）で飽和した１−のオリゴｄＴセル ロース１こ通過させた。結合緩衝液でカラムを十分に洗い、結合していないＲＮ Ａを除去した。結合しでいるメツセンソ＋−ＲＮＡは水３ｉで溶出し、４　Ｍ　 −Ｎａｃｌ！０．２ｍｌおよび２，５容積の冷エタノールを加えること１こよっ て沈澱させた。沈澱したｍＲＮＡを遠心によって捕集した（２５０００ＲＰＭ、 ３０分間）。最終ペレット（約１００μｇ）は水５０μｌに懸濁した。

〔第２段階〕第２鎖ｃＤＮＡ反応 ＰＢＬ（末梢血リンパ球）　Ｏｍ　ＲＮ　Ａ　２０　／ｊ　ｇをＣＤＮＡ合成反 応液５０ｐｌ　（１００ｍＭ−）リス（ｐＨ８，４）、１４３　ｍＭ　−ＫＣｌ 、１０　ｍ　Ｍ　−Ｍ　ｇｃ１２．１０ｍＭ−２−メルカプトエタノール、ｄＡ ＴＰ。

ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ　（−れぞれ４００ｔｔＭ。

プライマーとしでオリゴｄＴ５μｇ（平均サイズ１２〜１８個）、　Ｐ　−ｄＣ ＴＰ　２　５　μｃｉ　（４００μｍＣｉ　／ミリモル）およびリボヌクレアー ゼ・インヒビタ−ＲＮＡ５ｉｎ２０単位、含有〕に希釈した。３７℃で逆転写酵 素６０単位を添加することによって反応を開始し、４２°Ｃで３０分間インキュ ベートした。４３ｍＭとなるまでＥＤＴＡを加えることによって反応を停止し、 フェノールを飽和した等等積の水で抽出した。フェノール層をＴＥ緩衝液５０μ ｌで逆抽出した。水層をプールした。プールした水層は、ＴＥを飽和したセファ ロースＣＬ−４Ｂ（シグマ社より購入）の５−カラムを通過させること１こよっ で、組込まれなかった三燐酸エステルからｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　／　ＲＮ　Ａハイブ リッドを分離した。カラムから溶出する両分をプールし、ＮａＣ／を加えて２５ ０ｍＭとし、２．５容積の冷エタノールを加えて核酸を沈澱させた。遠心により ハイブリッドを捕集した（　４００００ＲＰＭ、３０分間）。最終ペレット（Ｃ ＤＮＡ２．５μｇ）は水５０μ１１こ懸濁した。

〔第３段階〕第２鎖ｃＤＮＡ反応 エシェリキア・コリＤＮＡポリメラーゼ、エシェリキア・コリＤＮＡリガーゼお よびエシェリキア・コリＲＮＡ　ｓｅ　Ｈの各酵素の組合わせ作用；こより、第 ２鎖ｃＤＮＡを合成した。反応混合液（°５０μｌ　）は、２０ｍＭ−ト　リ　 ス　（ＰＨ８，０）　、４　ｍＭ　−ＭｇＣ１２、１，２ｍＭ−ＥＤＴＡ、　２ ５μＭ−ＮＡＤ％ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ　。

ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ　それぞれ１００　ａＭづつ、および：３２Ｐ−ｄＣＴＰ　 ５０μ”（３０００Ｃｉ／　ミリモル）を含んでいる。ＤＮＡポリメラーゼエ３ 単位、ＤＮＡリガーゼ０．５単位、ＲＮＡ５ｅＨ０，７５単位を添加し、１６゜ で１８時間、次いで３７°で１時間インキュベートすることによって反応を行な った。ＥＤＴＡを加えて４０ｍＭとして反応を停止し、等容積のフェノールを加 えて抽出を行なった。フェノール層をＴＥ５Ｑμｌで逆抽出し、水層をプールし 、前記（第１鎖反応）で記載のようｌこセファロースＣＬ−４Ｂカラムを用いる クロマトグラフィー１こよって、組込まれなかった三燐酸エステルからｃＤＮＡ を分離した。　Ｐ　の取り込みｌこ基づき、第１鎖ｃＤＮＡは定量的に２本鎖の 形態に変換された。

〔第４段階〕組換え体ｃＤＮＡ作成 −２−メ／Ｉ／カプトエタノール、１　ｍ　Ｍ　−ＣＯＣｌ　２　、およびター ミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ９単位、含有〕中で、３ ０’Ｃで５分間緩和に加熱することにより、ｃＤＮＡの末端（こホモポリマーｃ 「尾部」を付加した。４ＱｍＭまでＥＤＴＡを加え、６０℃で１０分間加熱する こと１こよって反応を停止した。反応液１００μ／（１０ｍＭ−）リス（ＰＨ７ ，５）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｌＱＱｍＭ−ＮａＣ／　〕中で、この尾部化を行な ったｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　２００　ｇ　ｌこＧ−尾部化ｐＡＴ１５３（アマージャム 社より購入）　５００μｇをアニーリングした。アニーリング反応は、予備的に ６８℃で５分間インキュベートした後、５７℃で２時間行なった。

〔第５段階〕細菌の形質転換 ｃＤＮＡアニリング反応生産物を使用し、直接これをエシェリキア・コｌＪＭｃ １０６１株ｌこ導入した。細菌細胞の新鮮なコロニーを用いでＬ−ブロス５０ｍ ７１こ播種し、５５０　ｎｍ　ｌこおける光学密度が０．２５となるまで、数時 間発育させた。細胞を氷上で冷却し、遠心により回収した（２００ＯＲＰＭ、１ ０分間）。そのペレットを冷０．１　Ｍ　−Ｃａ　Ｃｌ　２溶液１０−に懸濁し 、氷上で１０分間静置した。細胞を遠心ｌこよって捕集しく２０ＣＩＯＲＰＭ、 　５分間）、再びＱ、ｌ　Ｍ　−Ｃａ　Ｃ／　２２．５＋ｙＪｌこ懸濁した。次 いで、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのアニーリング反応物１０μｌとＣａ　Ｃｌ　２処理細菌 ２００μｌとを氷上で３０分間、次いで３７℃で２分間インキュベートし、次１ こＬ−ブロス０．８−を加えて最終的ｌこ３７℃で３０分間インキュベートした 。

アニーリングしたｃＤＮＡをすべで使用し、このような形質転換を２０回行なっ た。各形質転換混合物を、それぞれテトラサイクリン１０μｇ／＋ｎｌを含有す る１％寒天Ｌしブロス平板（直径１５　ａｍ　）　ｆこ拡げた。２０個の形質転 換から、合計２０個のそのような平板を作成し、これらを３７℃で１夜インキユ ベートした。各平板ｌこ平均約１５００個の細菌コロニーが発育し、合計３００ ００　コロニーであった。

〔第６段階〕レプリカ培養 乾燥した１　３７　ｍｍのニトロセルロース・フィルターをコロニーの表面部１ こ押しつけ、これを平板から持ち上げることによって、各平板１こ増殖した元の コロニーヲニトロセルロースに移した。標準的なレプリカ培養方法によってこの フィルターから、それぞれ２枚の同じレプリカを作成した。即ち、元となる各フ ィルターを正方形のガラス片上に静置した正方形の滅菌押紙（ワットマン３ＭＭ ）上に、コロニー側を上にして注意深く置く。あらかじめ湿らせた新しいニトロ セルロース・フィルターを、注意深くマスター・フィルターの上１こ揃え、第２ の正方形の滅菌沖紙をその上ｆこかぶせ、完全１こサンドイッチＩこしたものを 、更に第２のガラス片を載せでしつかり押さえつけた。サンドイッチＩこしたフ ィルターＩこ番号を付し、また、将来それらを正しく揃えることができるよう、 各フィルターの非対称の位置ｌこ３個のピンホールをあけた。レプリカをマスタ ー・フィルターから除き、テトラサイクリンを含有しでいる新しいＬ−グロス寒 天板ｌこコロニー側を上１こして置いた。同様の方法で、すみやか１こ第２のレ プリカを作成した。各マスター・フィルターを平板に戻し、すべでの平板は、細 菌コロニーの直径がｌ　ｍｍ　ｌこ達するまで、数時間３７°でインキュベート した。元となるマスター・フィルターは、４℃で貯蔵し、レプリカは下記のハイ ブリッド形成用としで、使用した。

〔第７膜 調製 Ｑ，５Ｍ−ＮａＯＨ１１．５Ｍ−ＮａＣ／　＋ｃ浸したｆ紙（ワットマン３ＭＭ ）の上ｌこ、各レプリカ・フィルター（第６段階）をコロニー側を上１こし°て ７分間載せた。

フィルターを、ＩＭ−トリス（ＰＨ７．５）、１．　５　Ｍ　−ＮａＣ／　ｌこ 浸した中和戸紙に２分間移し、次いで第２の中和沖紙のセット１ζ５〜１０分間 移した。最後１こ、フィルターをＳＳＣ緩衝液（０．０１５Ｍ−クエン酸ナトリ ウム、０．１５Ｍ−Ｎａ（Ｊ（ｐＨ　７．４）３１こ浸したフィルター上に５分 間放置し、自然乾燥し、真空で８０℃で１〜２時間時間ライク。

〔第８段階３　Ｃ　Ｓ　Ｆ　／　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンの単離前記の実施例Ｂ Ｉこ記載のようＩこ、複製フィルターから放射性標識ｐ　Ｃ　Ｓ　Ｆ　−　１　 ／　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入体でプローブを作成した。そのうち約２０個のコロニー がｃＤＮＡでハイブリッドを形成した。これらのうち１２個をマスター・フィル ターから拾い、更１こ分析を行なうため、Ｌ−グロスで１夜発育させた。これら のクローンから得られたＤＮＡ試料（迅速調製）の制限酵素（Ｐｓｔｌ）による 消化物のうちの３個は、はとんど完全な鎖長を有しでいた。これらのうちの１個 についで配列決定を行なった。このクローンの、Ｃ５Ｆ暗号領域配列はｐＣ５Ｆ の対応する配列と同一であった〔即ち、３６５の位置にＴを有するＣ３Ｆ（１／ ｅ））。

〔実施例Ｄ〕

ＭＯ細胞系からのＣ５Ｆの精製 ＭＯ細胞系Ｉこ随伴するＨＴＬＶ−■ウィルスを失活させるため（こ、血清を含 んでいないＭＯ調整培地（４０／）を５５℃で３０分間インキュベートした。１ ００００分子量をカット・オフするメンプラン・７０ルタＦＴＧＣＣ　０．　１ ３　９平方米（１．５平方フイート）〕を有するペリコン・カセットを使用する 加圧式限外沖過ｌこより。

この培地を濃縮した。更ｔこ、硫酸アンモニウム沈澱（８０％飽和）ｔこより蛋 白質を濃縮した。最終蛋白質ペレット（　８　０　０ｍｇ）を２０ｍＭ−　トリ ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（トリス−塩酸）　（　ｐＨ７、４ 　）　１　０　０ｍ／ｌこ再懸濁し、これと同じ緩衝液で透析した（各回４１づ つ，３回変える）。透析した蛋白質を、これと同じ緩衝液で飽和したＤＥＡＥ（ （ジエチルアミンエチル）−ウルトロゲル）２．５Ｘ１００ｇのカラムに掛けた 。カラムを２０ｍＭ−１リス−塩酸（ｐＨ７、４）８００ｒｎｌで洗浄し、次い で０．　１　２　Ｍ　−　ＮａＣ／を含有した２０ｍＭ−）リス−塩酸（ＰＨ７ ．４）８００−でＣ３Ｆ活性を溶出した。１０−両分を捕集し、Ｃ５Ｆを検定し た。活性画分（３）をプールし、加圧式限外沖過（アミ７７７ＭＳメンプラン、 ５０００分子量でカット・オフ）により６倍（５−）に濃縮した。

ＤＥＡＥカラムで濃縮した試料を、２　０　ｍ　Ｍ　−　Ｎ　−　２−ヒドロキ シエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（　ＨＥＰＥＳ　）　（　ＰＨ 　７．５　）　、５　０　ｍＭ−ＮａＣ１。

０、０１％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−８０００）で飽和したＡｃＡ　４ ４　ウルトロゲル（１０〜１３０にダルトンの分別能を有するアクリルアミド・ アガロース・ウルトロゲル）の１．６Ｘ１００ｃｍカラム１こ掛けた。

Ｃ５Ｆ活性は見掛けの分子ｆｆ１３０にダルトンでカラムから溶出した。活性画 分をプールし、１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えることによつで０．１ ５％ＴＦＡ１１度（Ｖ／Ｖ　）とし、これをビグツクＣ４逆相カラム（１ｘ　２ ５　ｃｒｙ　）　Ｉコ掛けた。０．１９６ＴＦ　Ａ　（Ｖ／Ｖ）中、アセトニト リルＯ→９０％の直線勾配で、４ｒｎｌ／分の速度でカラムを展開した（合計１ ０００ｒｎｌ）。アセトニトリル約４７％（Ｖ／Ｖ　）の濃度でＣ５Ｆ活性が溶 出された。０．１５％（Ｖ／Ｖ　）へブタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）　をプール した活性画分の１／２容積加えること＋こ、Ｊ：つＵｏ、０ｓ９６（Ｖ／Ｖ）Ｈ ＦＢＡ　濃度とし、０．１５９６　（Ｖ／Ｖ　）　ＨＦＢＡ　テ飽和したビダッ クＣ４ｈ　５ム（０，４６ｘ　２５　Ｃ１１）　Ｉｃ　掛ケタ。ｏ、　１ｓ　９ ６（Ｖ／Ｖ）ＨＦＢＡ中、アセトニトリル０→９０％（ｖ／ｖ）の直線勾配で、 １−７分の速度でカラムを展開した（合計３４０ｉ）。Ｃ５Ｆ活性はアセトニト リル約５３％（Ｖ／Ｖ　）の濃度で溶出された。両分３７〜４４（各１−）で活 性が認められた。画分４０の０．１５−を４倍１こ濃縮しくサバント・スピード ・バック濃縮機使用）、２ｘＳＤＳゲル試料緩衝液［０，１２５Ｍ−）リス−塩 酸（ｐＨ６，８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、ｏ、ｏ４％ブロムフェノ ール・ブルー）４０μｌを加えた。これらの試料を２分間沸とうさせ、１３．５ ％ＳＤＳゲルＩこ適用した〔ラムリ、ネーチャー、２２７巻、６８０頁（１９７ ０年）〕（第２図参照）。測定の結果、両分（＃４０）は１１００００　骨髄Ｃ ５Ｆ単位／−であった。これはＡ２８０　吸収単位当たり、約３．０Ｘ１０　単 位に相当する。代表的な蛋白質は１η当たり、０．８〜１．２Ａ２８０　単位の 吸光係数を有するので、骨髄検定で、精製したＣ５Ｆは約１×１０〜約４Ｘ１０ 　単位／ηの比活性を示した。精製したＧＭ−Ｃ５Ｆの試料１μｇで応用生物系 微量アミノ酸気相配列決定装置を使用するエドマン分解を行なった。残基３から ５までの配列はＡｈａ　ＡｒｇｏＳｅｒ　と決定した◎〔実施例Ｅ〕 文献記載のようにプロトプラスト融合１こより〔サントリ・ゴールディンら、モ レキュラー・セル・バイオロジー、１巻、７４３〜７５２頁（１９８１年）〕、 ＣＨＯ細胞におけるＣ５Ｆ配列、プラスミドｐ９１０２３（Ｂ）−Ｃ５Ｆの同時 形質転換（コトランスホーメーション）および増幅をＤＨＦＲ欠乏ＣＨＯ細胞Ｄ ＵＫＸ−Ｂｌｌ　（チェージンおよびアーラウブ、ブローシーディング・オブ・ ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、７７巻 、４２１６頁（１９８０年）〕へ導入した。ＣＨＯ細胞の発育および維持１こ関 しでは、カウフマンおよびシャープ〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ ロジー、１５０巻、６０１〜６２１頁（１９８１年）〕の記載がある。

プロトプラスト融合のため１こ、Ｐ　９１０２３　（Ｂ）−Ｃ５Ｆ−１をエンエ リキア・コリＨＢ　１０１株Ｉこ導入し、０．５％カザミノ酸、０．４％グルコ ース、０．０１２％Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４，５μｇ／ｍｌチアミンおよび１０μｇ／ −テトラサイクリンを含有しでいるｍ９塩５０−１こ細菌を発育させ、６００　 ｎｍの吸光度０．６を示すまで増殖した。クロラムフェニコールを加えて２５０ μｇ／−とし、プラスミド・コピー数を増幅するため、培養を更に１６時間３７ ℃でインキュベートした。細胞を４℃で、３０００ｘｇ、１０分間遠心し、２０ ％蔗糖を含有した冷５０ｍＭ−トリス−ｅｔｃｐＨ８，ｏ）２．５ｍｔ＋こペレ ッ）を懸ｓさせた。リゾチームを加え（０，２５Ｍ−１−リス−〇／（ｐＨ８， ０）の５η／−溶液３．５ｍ／）、混合物を５分間氷上１こ放置した。ＥＤＴＡ （０，２５Ｍ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）　１ｍ１３を加え、更ｆこ５分間氷上に 置き、次いで０．０５Ｍ−トリス−Ｃ／’（ｐＨｓ、ｏ　）　１．０−を徐々１ こ加えた。菌がプロトプラストに変化するまで、懸濁液を３７℃で１５分間イン キュベートした。次いで、１０％蔗糖および１０ｍＭ−ＭｇＣ１２を含有したあ らかじめ温めである培地２０−で、この忍濁液を徐々に希釈し、これを１５分間 ３７℃で保った。６穴（ウェル）プレートで、プロトプラスト溶液（約１０９／ ｄ）をＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲ欠乏ＤＵＫＸ−Ｂｌ　ｌ　）（ｌウェル当たり、約 Ｉ　Ｘ　１０６　細胞）に約１〜２　ｘ　１０’プロトプラスト／細胞の割合で 加え、ＩＥＣＫ型遠心機の回転微量滴定盤ローターで遠心しく　２００ＯＲＰＭ 、８公開）、プロトプラストを細胞上Ｉこペレットした。遠心後、吸引１こよつ で上清を除去した。ＰＥ０−１４５０（ベーカー・ケミカル・カンパニー）のポ リエチレングリコール溶液５０ｇを５０艷に含有しでいる培地２−づつを、６穴 プレートの各ウェルＩこ加えた。細胞を再び２００ＯＲＰＭで９０秒間遠心して ポリエチレングリコール溶液を除去し、プレートを各ウェル毎ｌこ４−の培地で ３回洗浄した。次いで、細胞をトリプシン化し、１０％０％ラン面清含有培地１ ０−１こ懸濁し、円錐チューブｆこ入れ、臨床検査用遠心機で５ＱＱＲＰＭの回 ５＋こより遠心した。３個のウェルからペレットとした細胞をプールして、１０ Ｃ＋Ｉの組織培養皿へ播種した。カナマイシン、チミジン、アデノシン、デオキ シアデノシン、ペニシリン、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｔおよび１０％ ウシ胎児透析血清を含有しでいる新たに調製した培地を各プレート１こ加えた。

プロトプラストに変化して残存しでいる細胞の発育を阻止するため１こは、カナ マイシンが含まれる。

２日後、１０％ウシ胎児透析血清、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含 み、但しヌクレオシドを含有していないα培地へ１：１５の割合で細胞を植え継 いだ。次いで、４〜５日後ｌこ、これと同じ選択培地（但し、ヌクレオシドを含 有しない）を補給して細胞を培養した。

コロニーは選択培地に植え継いで１０〜１２日後１こ発現した。メトトレキサー ト（ＭＴＸ）選択および増幅には、下記の２通りの態様がある。第１の態様では 、単一で独立した形質転換クローン体をＤＨＦＲ発現を基準ｌこして単離し、次 いで外来性ＤＮＡのコピー数を増幅する条件、即ちメトトレキサート濃度を増加 した発育条件下で各クローンを増殖した。第２の態様では、多種類の各独立した 形質転換体のプールをＤＨＦＲ発現を基準Ｉこしで単離し、外来性ＤＮＡを増幅 する条件、即ちメトトレキサート濃度を増加した発育条件下で一緒に増殖した。

次いで、集団選択したクローン集団から個々の独立した複数個のクローンを単離 し、これ１こついでそれぞれＧＭ−Ｃ５Ｆ発現を分析した。高水準のＧＭ−Ｃ５ Ｆ発現を示すクローン類は、更Ｅこ外来性ＤＮＡを増幅する（即ち、培地内のメ トトレキサート濃度を増加した発育）条件下で再び発育させた。

１つの実験において、ＤＨＦＲ＋の７個の形質転換体を、ヌクレオシド類を欠除 しているα培地ヘプールしで培養した。これらの細胞を、ＭＴＸ濃度０．０２μ Ｍから始め１次いで０．１．０．５および２．ＯｐＭとＭＴＸを逐次段階的に増 加した濃度内で発育させた。ＫＧ−１細胞検定でＧＭ−Ｃ８Ｆ活性を検定すると 、これらの細胞は１−当たり３０００〜１２０００　単位の活性を生産しでいた 。選ばれた集団を０．５μＭ、ＭＴＸでクローニングし、２．０μＭ、ＭＴＸで クローニングした。

０．５μＭ、ＭＴＸ　で得られたクローン（０１０、Ｄ２およびＢ（３）を、続 いて２．０μＭ、ＭＴＸ　の培地内での発育Ｉこよって選び出した。ＫＧ−１細 胞検定でＧＭ−Ｃ５Ｆ活性を検定すると、これらのクローン細胞系は１−当たり １５０００〜３００００　単位のＧＭ−Ｃ５Ｆ活性を生産した。本実施例１こ従 って生産されたＧＭ−Ｃ５Ｆは、第１図においでＣ３Ｆ−Ｔｈｒ　で示されるア ミノ酸配列を有する。

〔実施例Ｆ〕

エシェリキア・コリＩこおけるＧＭ−Ｃ５Ｆの発現下６図ｆこ模式的に説明を加 えたベクターｐ　Ｔ　Ａ　Ｌ　Ｃ−１８５Ｒから、ＧＭ−Ｃ５Ｆをエシェリキア ・コリ配列ＡＴＧ、ＣＣＡ、ＣＣＡ、ＣＣＴ、ＣＣＴ、ＴＣＴ、ＣＣＡ、ＴＣＴ 、ＣＣＡ、ＴＣＴ、ＡＣＴで始まり、これは成熟ＧＭ−Ｃ５Ｆ　の最初の１１個 のアミノ酸残基を決定する。ｐＴＡＬＣ−１９５Ｒｌこある残りのＧＭ−Ｃ５Ｆ の暗号配列はｐＣＧＦ−１の配列、ヌクレオチド９４−４４７と同一であり、そ れにＴＡＲ・ＴＡＲ，ＴＡＧ配列が続いでいる。３連のターミネータ−の直後に 続いてＰＵＣ−１８ポリリンカーがある。ｐＵＣ−１８ポリリンカーから１００ 塩基下流ｔこ、ｐＢＲ３２２からのテトラサイクリン耐性遺伝子が、Ｃ５Ｆ遺伝 子とは反対の配向性で挿入された。テトラサイクリン耐性遺伝子はそれ自身のプ ロモーターを保有している。時計の針と反対方向を持続したままで、次にβ−ラ クタマーゼの遺伝子があり、その後ｌこは複製のｐＵＣ−１（３（ＣｏＬＥｌ） 　起源が続く。

Ｃ５Ｆ配列へ回帰する前のプラスミドの最終構造の特徴はＰＬ−プロモーターで ある。スカツツマンおよびローゼンバーク〔「モレキュラー・クローニング、ア ・ラボラトリ−・マニュアルＪ（１９８２年）、マールド・スプリング・ハーバ −１４１９頁〕の記載のようｌこ、このプロモーターは最も重要である。Ｃ５Ｆ 発現は、熱誘導後、このＰＬ−プロモーターによって好適なエシェリキア・コリ 宿主株に推進される。

すべでの株組立に用いられる親株はＷ３１１０１ａｃＩ　Ｌ８である〔ブレンド およびプタシュネ、プロシー−ディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・ オブ・サイエンシズ・ザ・ＵＳＡ、７８巻（１９８１年）、４２０４〜４２０８ 頁〕。

λ−ＤＮＡの断片（λ−ヌクレオチド３４４９９−３８２１４）は、Ｗ３１１０ 　ｌａｃ　ｌ０Ｌ８の染色体のＩａｃ　Ｚ座位に組込まれた。この組込みは、ｐ ＢＲ３２２の復製起源と共Ｉこクロラムフェニコールおよびアンピシリン耐性遺 伝子を保有しでいるＰＢＲ３２２５配列を構成する組込みベクターを使用して行 なわれた〔ポリバー、ジーン、４巻、（１９７８年）、１２１〜１３６頁〕。λ ＤＮＡは、それ自身がＬａｃ（）ＢｓｔＥｉｌ　部位からＩａｃＺの下流にある Ｔｔｈｉｌｌ工部位まで伸長している断片としてプラスミドｌこ存在しでいる１ ａｃＺへ挿入される。

ＩａｃＺ染色体コピーへのλ−ＤＮＡの組込みは相同組換えによって達成され、 Ｉａｃ　、アンピシリン感受性、クロラムフェニコール耐性のコロニーが見出さ れた。挿入されたλ−ＤＮＡを除くすべでのプラスミド外配列の除去を誘導する 第２の組換え反応現象は、ラクトース−マツコンキー培養平板でスクリーニング した。第２の組換え反応現象に伴って、最初の１ａｃ士、ａｍｐ　Ｓ％ｃａｍＲ 表現型は１ａｃ−、ａｍｐ５、ｃ　ａ　ｍ　’表現型に変化した。得られた株は ＧＬ４００と命名し、　３０’でＡ８．４２°でＡ３であった。この表現型はＣ 工８５７の対立遺伝子の官能染色体コピーの存在を証明している。

ＧＬ４００は、５Ｇ２０２５２　株１こ生成した溶菌物からのＰＬ形質導入ｌこ よってＩｏｎ−を表わした（　Ｉａｃ△Ｕ１６９、ａｒａ△１３９、ｒｐｓｌ　 ＩｏｎＡ　１００）　。”１０は選択培地でＴｅｔＪこついてスクリーニングす ること１こよって元へ戻った〔マロイ、ヌン、ジャーナル・オブ・バクテリオロ ジー、１４５巻（１９８１年）、１１１０〜１１１２頁〕。

最終の宿主株をＧＩ４１３　と命名した（Ｉａｃｌ　ｔ、Ｂ、Ｉａｃ　Ｚ△（λ Ｃｉ　、ＲＥＸ　％Ｎ）、Ｉｏｎ△１００〕。

ｐＴＡＬＣ−１８５ＲをＧＩ４１３　へ導入した。この株を１夜培養し、テトラ サイクリン７μｇ／ｍｔ　ヲ含有している誘導培地５−１こ３０°で発育させた 。誘導培地は１Ｆ当たり、下記の成分を含有する。

カザミノ酸　２０　ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４，７７Ｈ２Ｏ６ グリセリン　１　％ ビタミンＢ、　２　グ Ｃａ　Ｃｌ　・２　Ｈ２０２Ｉｎ９ Ｍｇ　Ｃ１２・６　Ｈ２Ｏ０，２ｇ １夜培養した培養１２５μｌを、テトラサイクリン７μｇ／−を含有しているこ の培地（２５ｍ／）ｌこ播種し、培養がＡ３５００．５の密度に達するまで水浴 中で３０℃で振盪した。その後、すみやかに４０’　の水浴１こ移し、更１こ２ 時間振盪しで、ＧＭ　−ＣＳ　Ｐを合成させた。細胞を回収し、５ＤＳ−ポリア クリルアミド・ゲル電気泳動によって、そのＣ５Ｆ含量を検定した。

この条件下ＦこおいでＧＭ−Ｃ５Ｆは、細胞蛋白質の約５％となった。

〔実施例Ｇ〕

サツカロミセス・セレビシアエにおけるＧＭ−Ｃ５Ｆの発現 Ａ、ベクターの組立て ウラシル生合成径路ｔこ含まれでいる１酵素遺伝子（ＵＲＡ３）を選択遺伝子と し、複製の２μ起源として含有しているプラスミドを組立でた。このプラスミド は、酵母の２ミクロン・プラスミドがらの複製起源を含んだ断片を付加すること により、Ｙ１ｐ５　［ホトスタインら、ジーン、８巻、１７〜２４頁（１９７９ 年）〕から誘導した。

Ｂ、グリセルアルデヒド燐酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）遺伝子の単離 酵母からＧＰＤＨの２個の遺伝子を単離した（ホランドおよびホランド、ジャー ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２５５巻、２５９６〜２６０５頁 （１９８０年）〕。開示されでいる配列から合成したオリゴヌクレオチド・プロ ーブを、酵母ゲノムＤＮＡのプラスミド・ライブラリーから標準的な方法でＧＰ ＤＨ遺伝子を単離するのｆこ使用した。完全なＧＡＰ４９１遺伝子を含んでいる プラスミドは、以前１こ寄託しである（　ＡＴＣＣＮｏ、　３９７７７　）。

Ｃ０異種遺伝子（ヘテロローガス・ジーン）発現のためのグリセルアルデヒド燐 酸デヒドロゲナーゼ・プロモーターの作成 所望の異種構造遺伝子の始めから、自然１こ間隔を置イＴ：　Ｇ　Ｐ　Ｄ　Ｈ７ ’　ｏモーターを入れたプラスミドを組立でた。これはＣＰＤＨ構造遺伝子のイ ニシエーター・メチオニン・コドン１こ直ぐ隣接してＫｐｎ工部位を導入するこ と１こよって達成された。このプロモーター「カセット」を酵母発現ベクターＹ Ｏｐｌ　に挿入した。

Ｄ、α因子遺伝子の単離 フェロモンを交配するα因子の遺伝子は酵母から単離されているしカージャンお よびハースカウイツ、セル、３０巻、９３３〜９４３頁（１９８２年）〕。この 配列から合成された１オリゴヌクレオチド・プローブを、酵母ゲノムＤＮＡのプ ラスミド・ライブラリーから標準的な方法で単離するの１こ使用した。

Ｅ、Ｃ５Ｆ発現プラスミドの作成 上記の諸要素およびヒ）Ｃ５Ｆ遺伝子から、発現ベクター（ＡＪ１４、第７図） を標準的な方法により組立てた。このベクターｌこおいで、Ｃ５Ｆの天然の先導 配列は除去され、成熟Ｃ５Ｆを暗号化しでいる配列はα因子のプレープロ配列に 隣接しで挿入されている。

ＧＰＤＨプロモーター、α因子のプレープロ配列および成熟Ｃ３Ｆ配列間の接合 部を要約しく下記）、ジデオキシヌクレオチド配列決定法ｆこより確かめられた 。

ＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧ、ＣＧＴＴＴＴＣＣＴＴＣＡ、、、、、、１．。

ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＧＣＧ　ＧＡＡ　ＧＣＴ、ＧＣＡ　ＣＣＣＧＣＣＣＧ ＣＴＣＧ・・・・・・ Ｆ、ＧＭ−Ｃ５Ｆの発現 プラスミドＡＪ１４をサツカロミセス・セレビシアエの１株に導入した。細胞を 培養し、Ｃ５Ｆが生産された。

以上の説明］こより、下記（こ示すこの発明の特殊態様が一般１こ着想され、こ の発明を構成する。

１、Ｃ５Ｆを生産する細胞からＲＮＡを作成し、このＲＮＡからポリアデニル化 したメツセンジャーＲＮＡを作成し、 このメツセンジャーＲＮＡから１不備ｃＤＮＡを作成し・ この１不備ｃＤＮＡを２不備ｃＤＮＡＩこ変換し、この２不備ｃＤＮＡを形質転 換ベクターへ挿入し、このベクターで細菌を形質転換しで、コロニーを生成し・ それぞれ２００〜５００個のコロニーのプールを拾い、各プールからそれぞれプ ラスミドＤＮＡを単離し、Ｃ５Ｆ蛋白質を発現するためｌこ、このプラスミドＤ ＮＡを好適な宿主細胞へ導入し、 導入した細胞を培養しで、その上清のＣ５Ｆ活性を検定し、 Ｃ５Ｆ陽性のプールを選び、そのプールの作成Ｉこ使用したコロニーをスクリー ニングしでＣ５Ｆ活性を有するコロニーを同定すること を含んで成るＣ　Ｓ　Ｆ　／　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを含有している形質転換ベクター の作成および単離方法。

２、Ｃ５Ｆを生産する細胞が１９７３球である第１項記載の方法。

３、第１項記載の方法ｆこよって作成された発現ベクター１こよって形質転換さ れた細胞であって、蛋白質を分泌する真核細胞。

４、第５項記載の細胞が哺乳細胞であることから成る細胞。

５、第１項記載の方法ｌこおいて、更ｌこ、Ｃ５Ｆ活性を有するコロニーからＣ ３Ｆ蛋白質を暗号化しでいるＤＮＡを単離し、Ｃ５Ｆを暗号化しているこのＤＮ Ａを、該Ｃ３Ｆ／ＤＮＡと異種のブロモ７ターを保有する発現ベクターへ挿入す ることを含んで成る第１項記載の方法。

６、第５項記載の方法１こよって作成された発現ベクターにより形質転換された 細胞。

７、細胞が原核細胞である第６項記載の細胞。

８、細胞が真核細胞である第６項記載の細胞。

９、Ｃ３Ｆを暗号化しでいるｃＤＮＡｏｌｏ、第１図１こ示したヌクレオチド配 列を有しでいるＤＮＡ １１、Ｃ５Ｆを暗号化したｃＤＮＡを含んでいる発現ベクター。

１２、第１図１こ示したヌクレオチド配列を含んでいる発現ベクター。

１３、第１１項記載の発現ベクターまたはその対立遺伝子性変異体を含んでいる 形質転換細胞。

１４、第１２項記載の発現ベクターを含んでいる形質変換細胞。

１５、その細胞が原核細胞である第１３項記載の細胞。

１６、その細胞が原核細胞である第１４項記載の細胞。

１７、その細胞が真核細胞である第１３項記載の細胞。

１８、その細胞が真核細胞である第１４項記載の細胞。

１９、その細胞が酵母細胞である第１７項記載の細胞。

２０、その細胞が酵母細胞である第１８項記載の細胞。

２１、その細胞が哺乳類細胞である第１７項記載の細胞。

２２、その細胞が唾乳類細胞である第１８項記載の細胞。

２３、その細胞か昆虫細胞である第１７項記載の細胞。

２４、その細胞が昆虫細胞である第１８項記載の細胞。

２５、　ＣＳ　Ｆを暗号化しているｃＤＮＡを発現することｌこよって形質転換 細胞中に作成されるＣ５Ｆ蛋白質。

２６、その細胞が原核細胞である第２５項記載の蛋白質。

２７、その細胞が真核細胞である第２５項記載の蛋白質。

２８、その細胞が酵母細胞である第２７項記載の蛋白質。

２９、その細胞が１甫乳類細胞である第２７項記載の蛋白質。

３０、その細胞が昆虫細胞である第２７項記載の蛋白質。

３１、事実上、天然起源の蛋白質を含んでいないＣ５Ｆ蛋白質。

３２、事実上、ヒト起源の蛋白質を含んでいないＣ５：Ｆ蛋白質。

３３、事実上、グリコシレージョンを含んでいないＣ５Ｆ蛋白質。

３４、形質転換された真核細胞中でＣ５Ｆ蛋白質を暗号化したｃＤＮＡの発現１ こよりグリコジル化されたＣ５Ｆ蛋白質。

３５、その真核細胞が１甫乳類細胞または昆虫細胞である第３４項記載のＣ５Ｆ 蛋白質。

３６、第１図１こ示したヌクレオチド配列を有するｃＤＮ　Ａを発現すること１ こよって作成されたＣ５Ｆ蛋白質。

３７、その細胞が原核細胞である第３６項記載の蛋白質。

３８、その細胞が真核細胞である第３６項記載の蛋白質。

３９、その細胞が酵母細胞である第３８項記載の蛋白質。

４０、その細胞が１甫乳類細胞である第３８項記載の蛋白質。

４１、その細胞が昆虫細胞である第３８項記載の蛋白質。

４２、°事実上、第１図に示したアミノ酸配列またはその対立遺伝子性変異体を 有するヒト・Ｃ５Ｆ蛋白質。

４３、そのＣ３ＦがＣＳ　Ｆ　（Ｔｂｒ）　テアル第４２項記載のＣ５Ｆ蛋白質 。

４４、そＣ７）Ｃ５ＦがＣＳ　Ｆ　（Ｉｌｅ）である第４２項記載のＣ５Ｆ蛋白 質。

４５、ソ（７）Ｃ５ＦがＭｅｔ−Ｃ５Ｆである第４２項記載のＣ５Ｆ蛋白質。

４６、そのｃｓＦがＣ５ＦとＭｅｔ−Ｃ５Ｆとの混合物である第４２項記載のＣ ５Ｆ蛋白質。

４７、薬理学的な担体中１こＣ８Ｆ蛋白質の骨髄抑制処置量を含有している骨髄 抑制の処置に用いる治療用組成物。

４８、　ＣＳ　Ｆ蛋白質で哺乳類を処置することを含んで成る骨髄抑制を罹患し でいる哺乳類の処置方法つ４９、薬理学的な担体中にＣ３Ｆ蛋白質を含んで成る 治療用組成物を該哺乳類動物（こ静脈注射することをそ５Ｑ、Ｃ３蛋白質の有効 量で哺乳類を処置することを△ 含んで成る、顆粒性循環白血球数を増加させる哺乳類の処置方法。

５１、事実上、第１図に示したアミノ酸配列またはその対立遺伝性変異体を有す るギボンＣＳ　Ｆ０５２、そのＣ５ＦがＣ３Ｆ（Ｔｈｒ）テアル第５１項記載の Ｃ５Ｆ蛋白質。

５３、そのＣ５ＦがＣ３Ｆ（Ｉｌｅ）である第５１項記載のＣ３Ｆ蛋白質。

５４、そのＣ５ＦがＭｅｔ−Ｃ５Ｆ　テある第５１項記載のＣ５Ｆ蛋白質。

５５、そのＣ３ＦがＣ３ＦとＭｅｔ−Ｃ５Ｆとの混合物である第５１項記載のＣ ３Ｆ蛋白質。

５６、水性媒質ｌこ懸濁した蛋白質類の混合物からＣ５，Ｆ蛋白質を精製する方 法であって、 ８０％飽和硫酸アンモニウムにより蛋白質を沈澱させて、Ｃ５Ｆ蛋白質を含有し たペレットを作成し、ｐＨ約６〜約８の範囲１こ緩衝した溶液ｌこそのペレット を再懸濁させ、 Ｃ３Ｆを含有する緩衝溶液をクロマトグラフィーカラム１こ掛け、塩化す）ＩＪ ウムを含有する緩衝溶液でＣ５Ｆ活性を溶出し、Ｃ５Ｆ活性を保有する両分を捕 集し、活性画分をプールし、プールした両分をＣ４逆相カラムに掛け、アセトニ トリルのＯ→９０％の濃度勾配置こよつでＣ５Ｆ活性を溶出し、Ｃ３Ｆ活性を含 んでいる画分を捕集すること を含んで成るＣ５Ｆ蛋白質の精製方法。

５７、その緩衝液をトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、Ｎ−２− ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸、およびクエン酸ナト リウムの中から選ぶ第５６項記載の方法。

５８、クロマトグラフィー・カラムにオクチルセファロース、ジェチルアミノエ チルウルトロゲルまたはアクリルアミド−アガロース・ウルトロゲルを充填する 第５６項記載の方法。

５９、プールした画分を０４カラムへ掛ける前Ｉこそれぞれ先ず、トリフルオロ 酢酸溶液またはへブタフルオロ酪酸溶液中Ｉこおけるアセトニトリルの濃度勾配 で、プールした両分を処理する第５６項記載の方法。

６０、）Ｕフルオロ酢酸またはへブタフルオロ酪酸の溶出液濃度がそれぞれ０． １０％またはｏ、１５％（ｖ／ｖ）である第５９項記載の方法。

６１、Ｃ５Ｆ蛋白質を含有している水性媒質を、先ず３０％飽和硫酸アンモニウ ムで処理して蛋白質を沈澱させ、その上清を残りの段階ｌこ用いる第５６項記載 の方法。

６２、　第５６項の方法においで、硫酸アンモニウムで蛋白質を沈澱させてペレ ットを作成する段階の後、そのペレットをトリス−塩酸溶液ｌこ再懸濁し、得ら れた溶液を透析し、 透析した溶液をＤＥＡＥ−ウルトラゲルのカラムに掛け、 このカラムを少な（とも０．ＩＭ−ＮａＣｌを含有しでいるトリス−塩酸溶液で 溶出し、Ｃ３Ｆ活性を含有する両分を捕集し、 活性画分をプールし、プールした両分をＮａ　Ｃ１およびポリエチレングリコー ルを含有しているＨＥＰＥＳ溶液で飽和したＡＣＡ４４−ウルトロゲルを充填し たカラムｆこ掛け、 Ｎａ　Ｃ１およびポリエチレングリコールを含んだＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ溶液でカラ ムを溶出し、Ｃ５Ｆ活性を含有する両分を捕集し、 Ｃ３Ｆ活性を含有する両分をプールし、プールした両分をトリフルオロ酢酸で処 理し。

ムｌこ掛け、トリフルオロ酢酸溶液中ｌこおけるアセトニトリルの０→９０％濃 度勾配で溶出し、Ｃ５Ｆ活性を含有する両分を捕集し、 Ｃ５Ｆ活性を含有する両分をプールし、プールした画分をヘプタフルオロ酪酸で 処理し、処理した溶液を第２０Ｃ４逆相カラムに掛け、 第２のＣ４逆相カラムをヘプタフルオロ酪酸中ｌこおけるアセトニリルのＯ→９ ０％濃度勾配で溶出しで、Ｃ５Ｆ活性を有する画分を捕集する ことを含んで成る第５６項記載の方法 ６３、第５６項の方法ｌこおいで、硫酸アンモニウムで蛋白質を沈澱させてペレ ットを作成する段階の後、そのペレットをＮ　ａ　Ｃｌ　を含有しでいるクエン 酸ナトリウム溶液に再懸濁させ、これと同じ緩衝液で飽和したアクリルアミド− アガロース・ウルトラゲルを充填したカラムにこの溶液を掛け、 カラムをクエン酸ナトリウムおよびＮａ　ＣＡ’　の溶液で溶出し、Ｃ５Ｆ活性 を有する両分を捕集し、Ｃ３Ｆ活性を有する画分をプールし、トリフルオロ酢酸 で処理し、処理溶液をＣ４逆相カラムｊこ掛け、このカラムをトリフルオロ酢酸 溶液中におけるアセトニトリルのＯ→９０％濃度勾配で溶出し、Ｃ５Ｆ活性を有 する両分を捕集する ことを含んで成る第５６項記載の方法。

６４、骨髄検定１こおいで、少なくとも約１×１０単位／ｍ９の比活性を有する Ｃ５Ｆ蛋白質。

６５、約１５０００〜約２６０００　ダルトンの分子量を有する第６４項記載の Ｃ５Ｆ蛋白質。

６６、骨髄検定ｔこおいて、蛋白質１ｎｙｉ当たり少なくとも約４×１０　単位 の比活性を有する第６４項記載のＣ５Ｆ蛋白質。

６７、Ｃ３ＦをＭｏ細胞調整培地から精製する第５６項記載の方法。

６８、発現可能なＣ８Ｆ遺伝子を含んでいる組換え体ベクターでトランスフェク ションした細胞のＪＦＩこよって得られた培地からＣ５Ｆを精製する第５６項記 載の方法。

６９、Ｐ９１０２３（Ｂ）−Ｃ５ＦでトランスフェクションしたＣＯ５細胞の培 養Ｅこよって得られた培地からＣ５Ｆを精製する第５６項記載の方法。

７０、霊長類動物細胞のコロニー形成刺激因子（Ｃ８Ｆ）蛋白質を暗号化しでい る遺伝子を好適なベクターへ挿入し、その遺伝子を挿入した該ベクターを真核ま たは原核性宿主細胞へ導入し、そのＣ５Ｆ蛋白質を発現し、単離することを含ん で成る霊長類動物Ｃ５Ｆ蛋白質の生産方法。

７１、そのＣ５Ｆ蛋白質が顆粒性白血球（顆粒球）−マクロファージＣ５Ｆであ る第７０項記載の方法。

７２、Ｃ５Ｆ蛋白質が第１図ｔＴ）ＣＳ　Ｆ　−ｔｈｒテ示されたアミノ酸配列 を有する第７０項記載の方法。

７３、Ｃ８Ｆ蛋白質が第１図のＣ３Ｆ−ｉｌｅて示されたアミノ酸配列を有する 第７０項記載の方法。

７４、　ＣＳ　Ｆ蛋白質がギボンザルの顆粒性白血球−マクロファージＣ５Ｆで ある第７０項記載の方法。

７５、Ｃ５Ｆ蛋白質が第１図のＣ３Ｆ−Ｇで示されたアミノ酸配列を有する第７ ０項記載の方法。

７５、Ｃ５Ｆ蛋白質が天然産Ｃ５Ｆのアミノ酸配列と一致しており、但し、天然 Ｃ５Ｆの生物学的活性ｌこ事実上影響することなく、１またはそれ以上のアミノ 酸を追加し、置換し、または除去した蛋白質である第７０項記載の方法。

７７、Ｃ５Ｆ蛋白質が天然産Ｃ３Ｆのアミノ酸配列と一致しでおり、但し、１ま たはそれ以上のシスティン残基を他のアミノ酸残基で置換したものである第７６ 項記載の方法。

７８、Ｃ３Ｆ蛋白質が天然産Ｃ８Ｆのアミノ酸配列を有し、但し、その配列がメ チオニン残基により先行される第７７項記載の方法。

７９、成熟形の第４２．４３．４５．４６項記載のＣ５Ｆ蛋白質。

８０、シグナル・ポテンシエーター開始領域を含んでいる第４２．４３．４５． ４６項記載のＣ５Ｆ蛋白質。

８１．１２７個のアミノ酸を有するＣ５Ｆ蛋白質。

８２、ＡＴＣＣ３９７５４の番号でＡＴＣＣｌこ寄託されでいるエシェリキア・ コリＭＣ１０６Ｉ　を発現することｌこよって得ることができるＣ５Ｆ蛋白質、 またはＡＴＣＣＩこ寄託されでいるプラスミドＰ９１ｏ２３（Ｂ）−Ｃ５Ｆの１ ２７アミノ酸のＣ５Ｆ暗号化ヌクレオチド配列。・ ＠ＣｒＧ１１Ａ＠＠ＡｆｔＴｅｌＣＴＩＣＡ・＾（ｉｃｅＴＩＣＴＩＣＴＣＴＴ Ｉ！ＧＧＣＫＶＧＴＩＧＣＣＴＧＣＲｒｒＴｑ　Ｌｆｉｌ＠１＊　Ｓｗ　Ｌｅ＋ 　Ｌｅｗ　Ｌｅｅ　Ｌｍ　１１１ｇ　Ｔｈｅ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｃ−Ｔ Ｃｅｌｌ＾ｃｅｆＨ１：ＴＡ（ＡＩＡｃｔＣＣｔＣＴ＠ＧＡ−ｅＴＩＴｋＣＡＭ ＩＣＡ＠５ａｃＣＴＩｅｌｌｌｉＧｃＡＧＣトＰ四ロｎＣｙ＊Ｌｎ＋＠ｉｎ丁Ｖ ＾ｒ＠ＬｅｅＵ＋ａＬＭＴｑｐＪｓ＠１１−１１１Ｌｏ＾ｐｇｌｉｌｙＳｖｅＴ ｃｌｌｃｃＡＡＩＣＴＩ：ＡＡＩＧｅｌ：ＣＣｔｍｌｋＣｔＡＴＩＡｆｌｌｓｅ ｃａｔｅｌａｍｅｆｉｌｅ４４１ＣＡ＠ＣＡＣＬＨｎｗｐ　ＬＩＩｓ　Ｌｍ　Ｌ ｙｓ　Ｇｔｙ　Ｐｎ　Ｌｏｗ　ｎｗｐ　ＲｕＨｒ　＾Ｉｓ　Ｓｗ　ＩＩｓ　Ｔｙ 　Ｌｇｓ　ｉｌｅ　ｌｌ５ＥＲ５ＡＴＺＢＬＡＴＴ 第２＠ 第３図 第４図 ｐ　９１０２３　（Ａ） 第５図 ＳＯ５ＰＡＧＥ　ＯＦ ０Ｍ−Ｃ５Ｆ 第６図 ｐ　ＴＡＬＣ−１８Ｓ　Ｒ 第７図 Ｃ５Ｆ　発現　プラスミド　ＡＪ−１４国際！Ｉｌを報告′ ｌ絢１”１４＠両ｍ＋ｍ　Ｎｏ、ＰＣＴ／ＥＰ　９５／ＱＱ３２５１ｍ＊ｎ’ａ ｈｅ＃ａｌａｓ１１Ｍ＋＋＋１＆ＰＣＴ／ＥＰ８５１００コ２６ＡＮＮＥＸ　Ｔ ｏ　ＴＨＥ　ＩＮＴＥｆｔ）ＩＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣ！（ＲＥＰＯＲＴ　 ＯＮ

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）組換え体ＣＳＦ蛋白質
2. （２）骨髄検定において１×１０７単位／ｍｇの比活性を有するＣＳＦ蛋白質。
3. （３）組換え体ＣＳＦ蛋白質である請求の範囲第２項記載のＣＳＦ蛋白質。
4. （４）ヒト顆粒性白血球−マクロフアージＣＳＦである請求の範囲第１項記載の ＣＳＦ蛋白質。
5. （５）第１図のＣＳＦ−ｔｈｒ、第１図のＣＳＦ−ｉｌｅまたは第１図のＣＳＦ −Ｇで示されるアミノ酸配列を有する請求の範囲第１項記載のＣＳＦ蛋白質。
6. （６）第１図に示すようにＡ１ａ・Ｐｒｏ………で始まるアミノ酸配列を含むか 、またはメチオニン残基がＡｌａ・Ｐｒｏ……で始まるアミノ酸配列に先行して いる請求の範囲第１項記載のＣＳＦ蛋白質。
7. （７）天然産ＣＳＦとアミノ酸配列が一致し、但し、事実上、天然ＣＳＦの生物 学的活性に影響することなく１またはそれ以上のアミノ酸を追加し、置換し、ま たは除去したＣＳＦ蛋白質である請求の範囲第１項記載のＣＳＦ蛋白質。
8. （８）天然ＣＳＦのアミノ酸配列を有し、但し、その配列にメチオニン残基が先 行しているＣＳＦ蛋白質である請求の範囲第項記載のＣＳＦ蛋白質。
9. （９）このベクターを導入した真核性または原核性宿主細胞から発現することに よつて得られたＣＳＦ蛋白質を単離することを含んで成り、上記ベクターは上記 ＣＳＦ蛋白質を暗号化している遺伝子を挿入したものである請求の範囲第１項記 載のＣＳＦ蛋白質の製造方法。
10. （１０）発現がエシエリキア・コリ、ＣＨＯまたは酵母から起こる請求の範囲第 ９項記載の方法。
11. （１１）ＣＳＦを生産する細胞からＲＮＡを作成し、このＲＮＡからポリアデニ ル化したメツセンジヤーＲＮＡを作成し、 このメツセンジヤーＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡを作成し、 この１本鎖ｃＤＮＡを２本鎖ｃＤＮＡに変換し、この２本鎖ｃＤＮＡを形質転換 ベクターへ挿入し、このベクターで細菌を形質転換して、コロニーを生成し、 それぞれ２００〜５００個のコロニーのプールを採取し、各プールからそれぞれ プラスミドＤＮＡを単離し、ＣＳＦ蛋白質を発現するために、このプラスミドＤ ＮＡを好適な宿主細胞へ導入し、 導入した細胞を培養して、その上清のＣＳＦ活性を検定し、 ＣＳＦ陽性のプールを選び、そのプールの作成に使用したコロニーをスクリーニ ングしてＣＳＦ活性を有するコロニーを同定すること を含んで成るＣＳＦ／ｃＤＮＡを含有している形質転換ベクターの作成および単 離方法。
12. （１２）水性媒質に懸濁した蛋白質類の混合物からＣＳＦ蛋白質を精製する方法 であつて、 ８０％飽和硫酸アンモニウムによつて蛋白質を沈殿させて、ＣＳＦ蛋白質を含有 したペレツトを作成し、ｐＨ約６〜約８の範囲に緩衝した溶液にそのベレツトを 再懸濁させ、 ＣＳＦを含有する緩衝溶液をクロマトグラフイーカラムに掛け、塩化ナトリウム を含有する緩衝溶液でＣＳＦ活性を溶出し、ＣＳＦ活性を保有する画分を捕集し 、活性面分をプールし、プールした画分をＣ４逆相カラムに掛け、アセトニトリ ルの０→９０％の濃度勾配によつてＣＳＦ活性を溶出し、ＣＳＦ活性を含んでい る画分を捕集すること を含んで成るＣＳＦ蛋白質の精製方法。
13. （１３）請求の範囲第１項記載のＣＳＦを暗号化しているｃＤＮＡ、または発現 ベクター。
14. （１４）請求の範囲第１項記載のＣＳＦを含有した医薬組成物、または治療上の 請求の範囲第１項記載のＣＳＦの使用。
15. （１５）請求の範囲第１項記載のＣＳＦを多くの処置を必要とする動物に投与す ることを含んで成る動物における感染または顆粒球減少症の処置または好中球活 性化の方法、またはそのような方法のための医薬組成物を製造するのに使用する 請求の範囲第１項記載のＣＳＦの用途。
16. （１６）請求の範囲第１２項記載の方法に従つて作成したＣＳＦを含有している 医薬組成物。
17. （１７）請求の範囲第１２項記載のＣＳＦを多くの処置を必要とする動物に投与 することを含んで成る動物における感染または顆粒球減少症の処置または好中球 活性化の方法、またはそのような方法のための医薬組成物を製造するのに使用す る請求の範囲第１２項記載のＣＳＦの用途。
18. （１８）ＡＴＣＣ３９７５４の番号でＡＴＣＣに寄託されているエシエリキア・ コリＭＣ１０６Ｉを発現することによつて得ることができるＣＳＦ蛋白質、また はＡＴＣＣに寄託されているプラスミドＰ９１０２３（Ｂ）−ＣＳＦの１２７ア ミノ酸のＣＳＦ暗号化ヌクレオチド配列。