DK172679B1 - CSF-protein - Google Patents

Description

DK 172679 B1

Den foreliggende opfindelse angår kolonistimulerende faktor (CSF) med en bestemt renhed, nemlig med en specifik aktivitet på mindst 1 x 107 enheder/mg ved en knog-lemarvsassay.

5 I beskrivelsen nedenfor beskrives der til forklaring af opfindelsen og for at muliggøre praktisering af denne en fremgangsmåde til fremstilling af det omhandlede CSF-protein ved rekombinante DNA-teknikker, vektorer, som indeholder genet for ekspression af dette protein, og mikroorganismer og cellelinier, som er transformeret med disse vektorer. Med samme formål beskrives også en fremgangsmåde tii isolering og 10 oprensning af det omhandlede CSF-protein fra enten naturlige eller rekombinante kilder.

Det omhandlede CSF-protein har en renhedsgrad og et aktivitetsniveau, som overstiger det, som hidtil er beskrevet.

15

De mange forskellige celletyper, som findes i blod, stammer alle fra pluripotente hæmatopoietiske stamceller. Stamceller har to funktioner: 1) de reproducerer sig selv, hvorved der opretholdes en stamcellepopulation i legemet, og 2) de tilvejebringer forældreceller, som er' er bestemt til at differentiere til en hvilken som helst af de modne blod- ^ celletyper. Den celle, som er bestemt til at differentiere ad en be stemt hæmatopoietisk vej, betegnes en forældrecelle. Forældreceller for T-lymfocyter, B-lymfocyter, granulocyter, rede blodlegemer, blodplader og eosinofiler samt tidligere forældreceller, som individuelt kan føre til flere af de modne celletyper, er blevet undersøgt ekspe- 25 rimentelt både in vivo og In vitro (T.M. Dexter, J. Pathology 1Q1, 1983, s. 415-433). Det er blevet bestemt in vitro, at formering og/el-ler differentiering af hver forældrecelletype afhænger af specifikke "faktorer", som stammer fra forskellige kilder. Fx kræver de senere forældreceller for røde blodlegemer en faktor, som kaldes erythropoietin. De faktorer, som kræves for overlevelse, formering og differenti-ering af de myeloide forældreceller, som er bestemt til at danne modne neutrofile granulocyter, monocyter og modne makrophager, kaldes kolonistimulerende faktorer (CSF'er).

2 DK 172679 B1 CSF-Aktivitet er blevet grundigt undersøgt i musen. De fleste voksne museorganer danner CSF-aktivitet. Imidlertid er kompositioner, som indeholder CSF-aktivitet, der er vundet fra forskelligt væv og ved forskellige metoder, tilsyneladende forskellige i deres biokemiske ® karakteristika. Således forbliver de strukturelle forhold mellem de forskellige faktorer ukendte. Endvidere synes CSF-aktivitet at virke i mere end ét trin af granulocyt- og makrophagudviklingen, og det har igen været uvist, om en enkelt faktor er ansvarlig for alle de iagttagne aktiviteter, eller om en forskellig faktor virker ved hvert trin.

ΙΟ (A. Burgess og D. Metcalf, Blood 56, 1980, s. 947-957.)

Human CSF-aktivitet er vundet fra placenta, visse fostervæv, makro-phager og stimulerede T-celier. En T-cellelinje (Mo), der danner én eller flere stærke CSF-aktiviteter, er blevet etableret fra en patient med en T-cellevariant af hårceileleukæmi (leukæmisk retikuloendoteli-15 ose) (Golde et al.. Blood 52, 1978, s. 1068-1072).

CSF-Aktivitetens evne til at stimulere granulocyt- og makrophagdan- nelse indikerer, at farmaceutiske præparater med CSF-aktivitet er klinisk anvendelige i situationer, hvor forøget dannelse af disse 20 (myeloide) celletyper er påkrævet. Flere patienter med ekstremt høje niveauer af tilsyneladende normale cirkulerende granulocyter har vist sig at have tumorer, som overproducerer CSF. I ét tilfælde faldt granulocyttallet ved kirurgisk fjernelse af tumoren henimod et normalt niveau, hvilket kraftigt antyder, at CSF kan være nyttigt til at regulere antallet af cirkulerende granulocyter (W. Hocking, J. Good- 25 man og D. Golde, Blood 61, 1983, s. 600). Især er CSF-præparater klinisk anvendelige til behandling af myeolo-suppression forårsaget af kemoterapeutisk eller strålingsbehandling af cancer. Endvidere er CSF-præparater nyttige til behandling af alvorlige infektioner, fordi CSF kan forøge og/eller aktivere antallet af granulocyter og/eller 30 monocyter.

3 DK 172679 B1

Der findes forskellige typer kendte CSF-aktiviteter. herunder granulocyt-CSF (G-CSF), makrophag-CSF (M-CSF), granulocyt/makrophag-CSF (GM-CSF) og multi-CSF. Den foreliggende opfindelse angår især GM-CSF med den ovennævnte aktivitet. CSF-Proteiner kendes fra forskellige animalske kilder. Den foreliggende opfindelse angår 5 især primat-CSF, navnlig humant CSF og abe-CSF.

Biologisk og biokemisk karakterisering af præparater med CSF-akti-vitet og undersøgelse af disse præparater inden for klinikken er til dato blevet hæmmet af den ringe mængde og urenhed af de humane og/eller andre primat-CSF-præparater. Det er klart, at det ville være ønskeligt at identificere det protein eller de proteiner, som er ansvarlig for CSF-aktivitet. Det ville endvidere være ønskeligt at have en primat-, fortrinsvis human kilde til sådant CSF, som let ville kunne tilvejebringe disse proteiner i mængder og i en renhed, som er tilstrækkelige til biologisk og biokemisk karakterisering og til anvendel-se som terapeutiske midler.

For nylig udviklede teknikker til molekylær kloning gør det muligt at klone en nucleotidsekvens, som indkoder et protein, og fremstille dette protein i større mængder under anvendelse af et hensigtsmæs-

20 sigt vært-vektorsystem, jfr. T. Maniatis, Molecular Cloning - A

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring

Harbor, New York, 1982. Proteinet kan derefter isoleres ved kendte separations- og oprensningsteknikker. Hidtil anvendte kloningsmetoder kan grupperes i tre generelle kategorier: 1) metoder, som er baseret på kendskab til proteinstrukturen, fx dets aminosyresekvens, 2) 25 metoder, som er baseret pa identifikation af det protein, som udtrykkes af det klonede gen, under anvendelse af et antistof, som er specifikt for dette protein, og 3) metoder, som er baseret på identifikation af en RNA-art, som kan translateres til dannelse af det protein eller den aktivitet, som indkodes af det gen, som har inter- 30 esse-

Hver af disse klasser af metoder er vanskelige at anvende, når det protein, som har interesse, såsom CSF-protein kun foreligger i meget 4 DK 172679 B1 små mængder. Hvis det er vanskeligt at få en tilstrækkelig mængde oprenset protein, er det således vanskeligt at bestemme aminosyre-sekvensen eller endog delsekvenser af proteinet. Tilsvarende udføres identifikation af et udtrykt protein ved antistofbinding fortrinsvis 5 under anvendelse af et monospecifikt, polyklonalt antiserum, som foreligger i højt titer. Et sådant antiserum kan ikke fås i fraværelse af tilstrækkelige mængder af det rene protein (antigen). Et monoklo-nalt antistof giver en alternativ mulighed, men det fornødne antistof kan også være vanskeligt at opnå i fraværelse af et hensigtsmæssigt 1Q antigen, og et sådant monoklonalt antistof reagerer eventuelt ikke med proteinet i den form, i hvilken proteinet udtrykkes af tilgængelige rekombinante vært-vektorsystemer. Endelig kræver translation af en RNA-art til dannelse af et identificerbart protein eller aktivitet, at det pågældende RNA er til stede i RNA-kilden i tilstrækkelig mængde til at give et pålideligt protein eller aktivitetssignal. Den relative mængde af et RNA, som indkoder et bestemt protein, er sædvanligvis parallelt med mængden af proteinet, således at et sjældent protein sædvanligvis indkodes af et sjældent mRNA.

Mo-Cellelinjen er blevet anvendt både som udgangsmateriale til oprens-20 ning af humane CSF'er og til identifikation af tilsvarende messenger RNA'er. Selv med denne relativt gode kilde til CSF-aktivitet har det imidlertid vist sig at være ekstremt vanskeligt at isolere en tilstrækkelig mængde af proteinet til strukturelle undersøgelser.

25 For at overvinde de problemer, som er indbygget i kloningen af den nucleotidsekvens, som indkoder et sjældent protein såsom CSF ved de ovennævnte metoder, blev der udviklet en særlig metode. Denne metode kræver blot, at genproduktet eller dets aktivitet kan måles pålideligt. Hensigtsmæssige CSF-assaymetoder er beskrevet i eksempel 2 nedenfor. Der er også udviklet en særlig oprensningsproces, som gør det 30 muligt at isolere CSF-proteinet og oprense det fra enten rekombinante eller naturlige kilder i et renheds- og aktivitetsniveau, som er meget højere end det hidtil har været muligt.

r 5 DK 172679 B1 CSF-Protein ifølge opfindelsen kan således fremstilles under anvendelse af rekombi-nantent DNA-teknologi. En særlig kloningsteknik, som kun kræver et assay for CSF-aktivitet, udnyttes til at klone cDNA, som koder for et protein med CSF-aktivitet, (dvs. CSF/cDNA). En mikroorganiske eller cellelinie, der er transformeret med en rekombi-5 nant vektor, som indeholder dette CSF/cDNA, kan anvendes til fremstilling af CSF-protein, idet CSF/cDNA'et udtrykkes ved dyrkning af en sådan mikroorganisme eller cellelinie. En transformationsvektor, som Indeholder CSF/cDNA, kan fremstilles ved: fremstilling af RNA fra en celle, som danner CSF, fremstilling af polyadenyleret messenger RNA fra dette RNA, 10 fremstilling af enkeltstrenget cDNA fra messenger RNA'et, omdannelse af det enkeltstrengede cDNA til dobbeltstrenget cDNA, indsætning af det dobbeltstrengede cDNA i transformationsvektorer og transformation af bakterier med denne vektor til dannelse af kolonier, 15 udtagning af puljer på hver 200-500 kolonier og isolering af plasmid-DNA fra hver pulje, transfektion af plasmid DNA'et til hensigtsmæssige værtsceller til ekspression af CSF-protein, dyrkning af transficerede celler og analyse af supernatanten for 2Q CSF-aktivitet, og selektion af CSF-positive puljer og screening af de kolonier, der anvendes til at udgøre puljen, til identifikation af en koloni med CSF-aktivitet.

CSF-Proteinerne ifølge opfindelsen er vækst- og differentieringshor-25 moner for cellerne i det myeloide system. De indikeres fx til klinisk anvendelse til behandling af myelo-suppression, især (symptomatisk) granulocytopeni efter kemoterapeutisk eller strålingsbehandling af cancer.

3q Opfindelsen belyses nærmere under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 viser DNA-sekvenser, som koder for el CSF-protein ifølge den foreliggende opfindelsen. Den DNA-sekvens, som er fuldstændigt angivet, koder for én variation af humant CSF, som betegnes CSF- 6 DK 172679 B1

Thr. En anden allel koder for et identisk produkt med undtagelse af, at Thr i stilling 100 er erstattet' med fle (CSF-lle). De forandringer, som er vist oven over den humane sekvens, er forskelle i den DNA-sekvens, som koder for Gibbon-CSF (CSF fra Gibbon-aben) (CSF-G).

5

Afledte aminosyresekvenser er også vist.

Fig. 2 viser skematisk fremstillingen af plasmidet pTPL ud fra plasmi-det pAdD26SVpA(3).

10 Fig. 3 er en skematisk fortsættelse af fig. 2 og viser fremstillingen af plasmidet p91023 ud fra plasmidet pTPL.

Fig. 4 er en skematisk fortsættelse af fig. 3 og viser plasmidet p91023(B).

15

Fig. G viser skematisk vektoren pTALC-185R.

Fig. 7 viser skematisk vektoren AJ-14.

De nedenstående definitioner er angivet for at lette forståelsen af den 20 foreliggende opfindelse. I det omfang, at definitionerne afviger fra den betydning, der verserer inden for teknikken, skal nedenstående definitioner befordre den rette forståelse.

Amplifikation betegner den proces, hvorved celler danner gen-genta-2g gelser inden for deres chromosomale DNA.

CSF er en biologisk aktivitet, som defineres ved de i nærværende beskrivelse beskrevne assays.

CSF-Protein er et protein fra en primat kilde, hvilket protein udviser 30 CSF-aktivitet. Til nærværende opfindelses formål omfatter udtrykket CSF-protein modificeret CSF-protein, allelle varianter af CSF-protein og CSF-protein, som indledes med en MET-rest.

7 DK 172679 B1

Nedenfor betegner retningen mod 3'-enden af en nucleotidsekvens.

En forstærker er en nucleotidsekvens, som kan forstærke transkrip-tionen af et gen uafhængig af forstærkerens stilling i forhold til genet 5 eller sekvensens orientering.

Et gen er en deoxyribonucleotidsekvens, som koder for et givet protein. Til nærværende formål omfatter et gen ikke utranslaterede tilstedende områder såsom RNA-transkriptionsinitieringssignaler, 10 polyadenyleringstilsætningssteder, promotorer eller forstærkere.

Ligation er processen til dannelse af en phosphordiesterbinding mellem 5’- og 3’-enderne på to DNA-strenge. Dette kan udføres ved adskillige velkendte enzymatiske teknikker, herunder stumpendeligation ved hjælp af T4-ligase.

15

Orientering betegner rækkefølgen af nucleotider i en DNA-sekvens.

En inverteret orientering af en DNA-sekvens er en orientering, hvor 5' til 3 -raekkefølgen af sekvensen i forhold til en anden sekvens er omvendt sammenlignet med et referencepunkt i det DNA, hvorfra 20 sekvensen blev vundet. Sådanne referencepunkter kan omfatte tran-skriptionsretningen af andre specificerede DNA-sekvenser i kilde-DNA'et eller replikationsinitieringsstedet i replikerbare vektorer, som indeholder sekvensen.

Transkription betegner syntesen af RNA fra en DNA-skabelon.

25

Transformation betegner forandring af en celles genotype ved optagelse i cellen af exogent DNA. Transformation kan i visse tilfælde detek-teres ved en ændring i cellens fænotype. Transformerede celler kaldes transformanter. Celler før transformation betegnes forældreceller.

30

Translation betegner syntesen af et polypeptid fra mRNA, 8 DK 172679 B1

Kolonistimulerende faktor-aktivitet (CSF) kan fås fra flere cellekilder, herunder kontidioneret medium fra mononucleare perifere blodlegemer, _ lunge- og placentavæv, knoglemarv, urin fra anæmiske patienter, serum og normale og neoplastiske celler af T-lymfocyt- og mononuclear phagocyt afstamning. Én cellelinje, som danner CSF, er Mo-cellelinjen, som er deponeret hos og tilgængelig fra ATCC under deponeringsnummeret CRL8066. Det CSF, som dannes af denne cellelinje, kendes som granulocyt-makrophag CSF (eller GM-CSF) og er naturligvis et 10 , h umant CSF. Én kilde til Gibbon CSF er den T-cellelinje, som beteg nes UCD MLA-144, og som er deponeret hos og tilgængeligt fra ATCC under deponeringsnummeret HB 9370, deponeret den 29. september 1983.

Til isolering af en CSF-klon kan der som nævnt anvendes en metode, som kun kræver 15 en assay-teknik for CSF-aktivitet. Først identificeres en celle, som danner CSF-akti-vitet såsom T-lymfocytceller (eller andre kilder som angivet ovenfor). Herefter høstes cellens mRNA. Der anvendes fortrinsvis T-lymfocytceller. I dette tilfælde adskilles det membranbundne mRNA, som Indeholder mRNA’et for lymfokiner, fra frit mRNA i cellerne. Denne separering formodes at berige det indsamlede mRNA 5-10 gange med 20 lymfokinsekvenser og nedsætter således besværet med at identificere den ønskede CSF-klon. Polyadenyleret mRNA fremstiles derefter ved chromatografi på oligo-dT-cellulose.

Der fremstilles et cDNA-bibliotek fra mRNA'et under anvendelse af en 25 vektor, som egner sig til transfektion til en vært til ekspression af et ønsket protein med CSF-aktivitet. Enkeltstrenget cDNA fremstilles under anvendelse af standardmetoder ved hjælp af det ovenfor frem-Ϊ stillede mRNA. RNA/cDNA-Hybriden omdannes derefter til dobbelt- I strenget cDNA-form. cDNA'et kan derefter indsættes i en egnet i • vektor.

30

Det foretrukne vært-vektorsystem til isolering af en CSF-klon er baseret på ekspression af CSF-cDNA'et i en hensigtsmæssig transformationsvektor. En hensigtsmæssig transformationsvektor kan bero på den forbigående indføring af DNA i pattedyrceller (P. Mellon, V.

9 DK 172679 B1

Parker, Y. Giuzman, T. Maniatis, Cell, 27, 1981, s. 279-288). For at isolere de ønskede CSF-transformanter kræves det ikke, at alle celler i populationen stabilt indeholder exogene gener, der udtrykker det ønskede CSF-produkt. Det er muligt forbigående af indføre exogene gener i en subpopulation af celler, således at subpolulationen udtrykker det ønskede produkt over flere dage. Da en selekterbar markør ikke kræves i transforrnationsvektoren til DNA-transfektions- og eks-pressionssystemet, kan det exogene DNA blive tabt efter vækst af cellerne i et tidsrum på 1-2 uger. Imidlertid bliver de ønskede produkter syntetiseret 2-3 dage efter 10 transfektion af egnede pattedyrceller og kan detekteres.

Det valgte vært-vektorsystem er baseret på udviklingen af CV-1-abe-cellelinjer transformeret med et SV40 DNA-molekyle, der mangler replikationsinitieringsstedet (Y. Giuzman, Cell 23, 1981, s. 175-182).

15 De transformerede CV-1-abeceller, som indeholder defekt SV40 DNA, betegnet COS (CV-1, mangler replikationsinitieringssted, SV40), indeholder ikke en komplet kopi af SV40-genomet, men danner høje niveauer af T-antigen og tillader SV40 DNA replikation. De understøtter også effektivt replikation af SV40, som indeholder sletninger i det tidlige område, og af bakterieplasmider, som indeholder SV40's replikationsinitieringssted (R.M. Myers og R. Tjian, PNAS 77, 1980. s. 6491-6495). Således udgør dette system et middel til amplificering af transficeret exogent DNA via SV40-medieret DNA-replikation for at forøge niveauet af mRNA og protein udtrykt fra det exogene DNA.

Imidlertid kan der også anvendes andre tilsvarende systemer.

25

Vektorer, der anvendes til CSF-ekspression, indeholder typisk forskellige elementer såsom forstærkere, promotorer, introner, polyade-nyleringssteder, 3'-ikke-kodende områder og translationsaktivatorer som beskrevet nedenfor.

30

De her beskrevne vektorer kan indeholde forstærkere. Forstærkere adskiller sig funktionelt fra promotorer, men virker tilsyneladende sammen med promotorer. Deres funktion på celleniveau er ikke særlig velopklaret, men deres unikke egenskab er evnen til at aktivere eller 10 DK 172679 B1 potentiere transkription uden at være positions- eller orienteringsaf-Hængig. Promotorer skal være ovenfor genet, medens forstærkere kan være til stede ovenfor eller 5' fra promotoren, inden i genet som en intron eller nedenfor genet mellem genet og et polyadenyleringssted 5 eller 3' fra polyadenyleringsstedet. Inverterede promotorer er ikke funktionelle, men det er inverterede forstærkere. Forstærkere virker i cis, dvs. indvirker kun på promotorer, hvis de er til stede på samme DNA-streng. For en generel diskussion af forstærkere se Khoury et al., Cell 33, 1983, s. 313-314.

10

Foretrukne forstærkere til anvendelse i pattedyrceller fås fra~animal-ske vira såsom simianvirus 40, polyomavirus, bovint papillomavirus, retrovirus eller adenovirus. Ideelt skal forstærkeren være fra et virus, for hvilken værtscellen er permissiv, dvs. som normalt infice-rer celler af værtstypen. Virusforstærkere kan let fås fra almindeligt tilgængelige vira. Forstærkerområderne fra flere vira,’ fx Rous-sarco-mavlrus og simianvirus 40, er velkendte, jfr. Luciw et al., Cell 33, 1983, s. 705-716. Det er et spørgsmål om rutinemæssig molekylær-biologi at udtage disse områder på grundlag af offentliggjorte restriktionskort for de pågældende vira, og om nødvendigt modificere ste-20 derne for at muliggøre den ønskede splejsning af forstærkeren i vektoren, jfr. fx Kaufman et al., J. Mol. Biol., 159, 1982, s. 601-621, og Mol. Cell Biol. 2(11), 1982, s. 1304-1319. Alternativt kan forstærkeren syntetiseres ud fra sekvensdata; størrelsen på virale forstærkere (sædvanligvis mindre end 150 bp) er tilstrækkeligt lille til, at 25 dette ville kunne gøres i praksis.

Et andet element, som skal være til stede I vektorsammensætningen, er et polyadenyleringssplejsnings-(eller tilsætnings-)sted. Dette er en DNA-sekvens, som er anbragt nedenfor de translaterede områder af et gen, idet der kort nedenfor dette tilføjes transkriptionsstopsignaler 30 og adeninribonucleotider til dannelse af en polyadeninnucleotidhale ved 3'-enden af messenger RNA'et.

Polyadenylering er vigtigt til stabilisering af messenger RNA mod nedbrydning i cellen, hvilket er en begivenhed, som nedsætter niveauet af messenger RNA og således niveauet af proteinprodukt.

11 DK 172679 B1

Eukaryote polyadenyleringssteder er velkendte. Der findes en samstemmende sekvens for eukaryote gener: hexanucleotidet 5'-AAUAAA-3‘ findes Π-30 nucleotider fra det punkt, hvor polyadenyleringen begynder. DNA-sekvenser, der indeholder polyadenyleringssteder, kan fas 5 fra vira i overensstemmelse med offentliggjorte rapporter. Eksempler på polyadenyleringssekvenser kan fås fra muse-B-globin og simian-virus 40 gener for sent eller tidligt område, men virale polyadenyleringssteder er foretrukne. Da disse sekvenser er kendte, kan de syntetiseres in vitro og ligeres til vektorerne på kendt måde.

10

Den sekvens, som adskiller polyadenyléringsstedet fra translations-stopkodonen, er fortrinsvis en utranslateret DNA-sekvens såsom et upromoveret eukaryot gen. Da sådanne sekvenser og gener ikke er forsynet med promotorer, bliver de ikke udtrykt. Sekvensen bor strække sig i en betydelig længde, i storrelsesordenen op til ca. 1000 baser, fra stopkodonen til polyadenyleringsstedet. Denne 3'-utransla-terede sekvens medfører sædvanligvis et forøget produktudbytte.

Vektoren kan terminere fra ca. 30 bp nedenfor denne sammenstemmende polyadenyleringssekvens, men det foretrækkes at bevare de 3'-sekvenser, som findes nedenfor polyadenyleringsstedet i deres 20 vildtypeomgivelser. Disse sekvenser strækker sig typisk ca. 200-600 basepar nedenfor polyadenyleringsstedet.

Tilstedeværelsen af introner i den utranslaterede transkriberede del af vektoren kan forøge produktudbyttet. Sådanne introner kan fås fra __ andre kilder end værtscellerne eller genkilderne. Fx medfører en 25 s hybrid intron, som omfatter et 5'-splejsningssted fra den anden intron i den fra adenovirus stammende tredelte ledersekvens og et 3'-splejs- ningssted fra et immunoglobulingen indsat nedenfor transkriptions- startsstedet i den fra adenovirus stammende sene hovedpromotor, et forøget produktudbytte.

30 12 DK 172679 B1

Fortrinsvis findes et translationsaktiverende gen i CSF-klonings- og ekspressionsvektoren. Translationsaktivatorer er gener, der indkoder enten protein- eller RNA-pro-dukter, der påvirker translationen af et ønsket mRNA. Det bedste eksempel er det fra adenovirus stammende virus-forbundne (VA)-gen (VAI), der transkriberes til en kort 5 RNA-art, som samvirker med sekvenser i det 5'-utranslaterede område i de fra adenovirus stammende sene hoved-mRNA’er (Thimmappaya et al., Cell 3, 1982, s.

543). De nødvendige sekvenser til translationsaktivering ved hjælp af VA-RNA ligger inden for den fra adenovirus stammende mRNA tredelte sene ledersekvens. Den fra adenovirus stammende tredelte ledersekvens splejses sammen fra de ikke-10 tilstødende områder i adenovirus-genomet og findes på 5’-enden af fra adenovirus stammende sene hovedtranskriptor. VA-RNA kan samvirke til aktivering af translation af mRNA, som indeholder den tredelte ledersekvens. Således omfatter den foretrukne cDNA-klonings- og ekspressionsvektor den splejsede form af den tredelte ledersekvens og adenovirus-VA-generne.

15

Disse vektorer kan syntetiseres ved teknikker, som er velkendte for fagfolk. Vektorernes bestanddele såsom forstærkere, promotorer og lignende kan fås fra naturlige kilder eller syntetiséres som ovenfor beskrevet. Hvis bestanddeiene findes i DNA, som er tilgængeligt i 20 store mængder, fx bestanddele såsom virusfunktioner, eller hvis de kan syntetiseres, fx polyadenyleringssteder, kan der ved hensigtsmæssig anvendelse af restriktionsenzymer fås store mængder vektor ved simpelt hen at dyrke kildeorganismen, spalte dets DNA med en hensigtsmæssig endonuclease, adskille DNA-fragmenterne, identificere det DNA, som indeholder det element, som har interesse, og udvinde 25 dette. Sædvanligvis vil en transformationsvektor blive samlet i små mængder og derefter blive ligeret til en hensigtsmæssig autonomt replikerende syntesevektor såsom et prokaryot plasmid eller phag. I de fleste tilfælde kan anvendes pBR322 plasmidet, jfr. Kaufman et al., op. cit.

30

Syntesevektorerne anvendes til at klone de ligerede transformations-vektorer på sædvanlig måde, fx ved transfektion af en permissiv prokaryot organisme, replikation af syntesevektoren til et højt kopital og isolering af syntesevektoren ved cellelyse og separation af synte-j sevektoren fra celleresterne.

A

i i 13 DK 172679 B1

De vektorer, som indeholder cDNA fremstillet ud fra en celle, der producerer CSF*aktivitet, transficeres derefter til E. coli og udplades på petriskåle med ca. 2000 kolonier pr. skål. Kolonierne løftes over på et nitrocellulosefilter, og filteret overføres til en ny plade, som 5 beholdes som master. Efter dyrkning af disse kolonier fremstilles replika, der sammenlignes med originalen ved omhyggelig markering, således at sektioner af replikafiltrene kan identificeres med den tilsvarende del af master-pladen.

Hvert replikafilter skæres i sektioner, som indeholder et forudbestemt 10 antal kolonier pr. sektion, fortrinsvis ca. 200-500 kolonier pr. sektion. Kolonierne fra hver sektion skrabes ud i medium såsom L-væ-ske, bakterierne indsamles ved centrifugering, og plasmid-DNA'et separeres. Plasmid-DNA’et fra hver sektion transficeres i en hensigtsmæssig vært til proteinekspression. Den i nærværende sammenhæng 15 foretrukne syntesevektor er en mutant af E. coli-plasmidet pBR322, hvorfra sekvenser, som er skadelige for eukaryote celler, er blevet slettet, jfr. Kaufman et al., op. cit. Anvendelse af denne mutant imødegår ethvert behov for at slette plasmidresten før transfektion.

Efter dyrkning af de transficerede celler analyseres mediet for CSF-2Q aktivitet. Et positivt assay viser, at en koloni, der indeholder CSF/-cDNA findes på en bestemt sektion af et filter.

For at bestemme hvilken af klonerne på sektionen af det oprindelige master-filter, som indeholder CSF/cDNA, udtages og dyrkes hver klon på filtersektionen. Kulturerne anbringes derefter i en matrix. Der 25 fremstilles puljer fra hver horisontal række og vertikal søjle af matrixen. DNA-Prøver fremstilles ud fra hver i pulje samlet kultur og transficeres i værtscellerne til ekspression. Supernatanter fra disse puljer analyseres for CSF-aktivitet. Én pulje fra en vertikal række og én pulje fra en horisontal række bør danne CSF-aktivitet. Den klon, 20 som er fælles for disse puljer, vil indeholde CSF/cDNA. Hvis matrixen indeholder mere end én positiv klon, vil mere end én horisontal og vertikal række være positive. I et sådant tilfælde kan yderligere screening af et lille antal kloner være nødvendig.

14 DK 172679 B1 CSF/cDNA'et udtages fra klonerne med restriktionsenzymer og kan sekventeres ved kendte teknikker. Det vil forstås, at den her beskrevne procedure kan anvendes til opnåelse af et CSF/cDNA fra en hvilken som helst kilde. Den komplette DNA-sekvens af et CSF/cDNA ^ ifølge opfindelsen er vist i fig. 1 sammen med den forventede amino-syresekvens af det translaterede CSF-protein.

Den DNA-sekvens, der koder for et protein med CSF-aktivitet ifølge opfindelsen såsom det, der er vist i fig. 1, kan modificeres ved sædvanlige teknikker til frembringelse af variationer i det færdige CSF-protein, som stadigvæk vil have CSF-aktivitet i de i nærværende beskrivelse beskrevne assay-tests. Således kan fx én, to, tre, fire eller fem aminosyrer erstattes med andre aminosyrer. I belgisk patentskrift nr, 898,016, hvortil der henvises, beskrives en sådan typisk teknik til erstatning af cystein med fx serin.

15

Det beskrevne CSF/cDNA kan være det modne CSF/cDNA-gen, som indledes med en ATG-kodon, og CSF/cDNA, som koder for allelle variationer af CSF-protein. Én allel er vist i fig. 1. En anden allel, som er fundet af nærværende opfindere, har en thymidinrest i stilling 365 i stedet for den i fig. 1 viste cytosinrest. CSF-Proteinet ifølge 20 opfindelsen omfatter 1-methioninderivatet af CSF-protein (Met-CSF) og allelle variationer af CSF-protein. Det modne CSF-protein, som er vist ved sekvensen i fig. 1, begynder med sekvensen Ala. Pro. Ala. Arg. .., hvis begyndelse er angivet med en pil efter nucleotid nr. 59 i fig. 1.

Met-CSF’en begynder med sekvensen Met. Ala. Pro. Ala. Arg. ... Den i fig. 1 viste allelle variation har en Thr ved aminosyrerest nr. 100 25 (begyndende ved Ala efter pilen) og kan betegnes som CSF (Thr).

En anden variation har en lle-rest i stilling 100 og kan betegnes CSF (Ile). CSF-protein ifølge opfindelsen udviser en specifik aktivitet på mindst 10^ enheder/mg protein og fortrinsvis mindst 4 x 10^ enheder/mg protein, når det analyseres med humane knogle-30 marvsceller.

1 Vært-vektorsystemer til ekspression af CSF kan være prokaryote eller I eukaryote, men CSF's kompleksitet kan gøre, at et pattedyrekspres sionssystem foretrækkes. Ekspression udføres let ved transformation 15 DK 172679 B1 af prokaryote eller eukaryote celler med en hensigtsmæssig CSF-vek-tor. Den DNA-sekvens, som fås ved ovennævnte fremgangsmåde, kan udtrykkes direkte i pattedyrceller under kontrol af en hensigtsmæssig g promotor. Heterologe promotorer, som er velkendte for fagfolk, kan anvendes. For at udtrykke CSF i prokaryote celler eller gærceller, må ledersekvensen (eller sekretionssekvensen) fjernes. Positionen af kodonen for N-terminalen af det modne CSF-protein er vist i fig- 1.

Dette kan gøres under anvendelse af standardteknikker, som er velkendte for fagfolk. Når først den ønskede CSF/cDNA-klon er 10 vundet, anvendes kendte og hensigtsmæssige midler til udtrykkelse af CSF-proteinet, fx indsætning i en hensigtsmæssig vektor og transfek-tion af vektoren til en hensigtsmæssig værtscelle, udvælgelse af transformerede celler og dyrkning af disse transformanter til udtrykkelse af CSF-aktivitet. Egnede værtsceller omfatter bakterier, fx

E. coli, gær, pattedyrceller, fx CHO-celler, og insektceller. Det IP

således dannede CSF-protein kan have en methioningruppe ved N-ter-minalen af proteinet (i nærværende sammenhæng betegnet Met-CSF).

Det modne protein, der dannes af prokaryote og eukaryote celler, vil i øvrigt være identisk i aminosyresekvens, men det eukaryote produkt kan være glycosyleret i samme eller et andet omfang end i det natur-20 |ige produkt. Forskellige metoder til fremstilling af CSF-protein er vist i nedenstående eksempler. Andre metoder eller materialer, fx vektorer, vil være åbenlyse for fagfolk på grundlag af. eksemplerne og den indledende beskrivelse.

25 CSF-Protein udtrykt i hensigtsmæssige prokaryote eller eukaryote celler kan isoleres ved oprensnings- og separeringsteknikker, som er kendte for fagfolk. Oprensningen kan imidlertid også gennemføres ved en særlig metode, som gør det muligt at isolere CSF-protein fra både rekombinante og naturlige kilder med høj renhed og aktivitet.

30 Denne særlige metode til oprensning af CSF-protein omfatter udfældning af proteinet med ammoniumsulfat ved 80%’s mætning til dannelse af en pellet, som indeholder CSF-proteinet, resuspension af pelleten I en pufret opløsning ved en pH i området fra ca. 6 til ca. 8, anbringelse af den pufrede opløsning, som indeholder CSF, på en chromatografisk søjle, eluering med den pufrede opløsning, som indeholder natri- 16 DK 172679 B1 umchloiid, og indsamling af fraktionerne med CSF-aktivitet, samling af de aktive fraktioner i pulje, anbringelse deraf på en C4-reversfasesøjle og eluering med en 0-90%’s acetonitrilgradient til indsamling af den aktive fraktion.

5 Fig. 5 viser SDS-PAGE-analyse af det oprensede CSF-protein.

CSF-proteinet ifølge opfindelsen kan fås fra en hvilken som helst af de naturlige kilder, som er beskrevet ovenfor som udgangskilder for den rekombinante DNA-proces, fx Mo-cellelinjen eller UCD MLA-144 Gibbon-cellelinjen.

Alternativt kan CSF-proteinet fremstilles under .anvendelse af de heri beskrevne rekombinante DNA-teknikker.

CSF'en fra en hvilken som helst kilde kan oprenses ved den 15 heri beskrevne fremgangsmåde. Det konditionerede medium fra en hvilken som helst kilde til CSF-protein koncentreres fortrinsvis ved ultrafiltrering til en proteinkoncentration på mindst ca. 0,1 mg protein pr. ml. Proteinet udfældes derefter ved tilsætning af ammoniumsulfat til 80%'s mætning.

20 Den resulterende pellet resuspenderes i en vandig oplosning - - pufret ved en pH i området fra ca. 6 til ca. 8. Eksempler på hensigtsmæssige puffere omfatter Tris-HCl, HEPES, natriumcitrat og lignende.

Den puf rede opløsning fraktioneres ved søjlechromatografi. Egnede 25 materialer til anvendelse i chromatografisøjlen er octylsepharose, DEAE-ultrogel, AcA44-ultrogel, AcA-54-ultrogel og lignende. Ét eller flere af disse materialer kan anvendes sekventielt til opnåelse af 1 højere renhed.

30 Fraktioner fra hver søjle indsamles og analyseres for CSF-aktivitet.

De aktive fraktioner samles i pulje og fortyndes med trifluoreddike-syre (TFA), heptafluorsmørsyre (HFBA) eller lignende og anbringes på en C4-reversfasesojle. CSF-Aktiviteten elueres derefter under anvendelse af en 0-90% acetonitrilgradient i TFA eller HFBA, for- 17 DK 172679 B1 trinsvis ved en koncentration på henholdsvis 0,10% eller 0,15% (v/v), afhængigt af hvilken syre blev anvendt til at anbringe de i pulje samlede fraktioner på søjlen.

5 Fraktionerne med CSF-aktivitet analyseres ved SDS-polyacrylamidgel-elektroforese (13,5% gel som beskrevet af U. Lammli, Nature 227, 1970, s. 680). Yderligere behandlinger under anvendelse af de ovennævnte chromatografisøjlematerialer kan oprense CSF-proteinet yderligere til homogenitet.

10

Oprenset CSF-protein fraktioneret ved SDS-PAGE afslørede et heterogent CSF-protein med en tilsyneladende molekylvægt i området fra ca.

15.000 til ca. 26.000 daltons. Denne tilsyneladende størrelsesheterogenitet skyldes den omfattende glycosylering af proteinet og er et almindeligt træk ved glycoproteiner. Fraktionering af mindre opren- 15 sede prøver fra Mo-cellekonditioneret medium ved SDS-PAGE (under ikke-reducerende betingelser) og analyse af protein elueret fra gelen afslørede tilstedeværelsen af et andet protein med CSF-aktivitet med en tilsyneladende molekylvægt på ca. 28,000-30.000.

2ø CSF-Aktivitet binder og eiuerer fra octylsepharose, DEAE-ultrogel og C4-reversfasesøjlen. Ca. 60% af CSF-aktiviteten binder til Con-A-se-pharose (40%'s gennemløb) og kan elueres med e-methylmannosid.

Molekylvægtanalyse af rekombinant CSF ved gelfiltrering i lav saltopløsning viste, at ca. 30% af aktiviteten eluerede med en skønnet 25 molekylvægt på ca. 19.000, men 70% af materialet opførte sig som dimerer og eluerede ved en stilling svarende til en molekylvægt på ca. 38.000. Hvis 1M NaCI inkorporeres i denne søjle, eiuerer hele aktiviteten i en bred top ved ca. 19.000 daltons.

20 Det oprensede CSF er stabilt i mindst 16 timer ved inkubation ved 4°C (pH 7,4) i 4M guanidinhydrochlorid, i 10 mM EDTA, 10 mM 2-mercaptoethanol og i 30% (v/v) ethanol. CSF-Aktiviteten er også stabil i 0,1%'s trifluoreddikesyre (TFA) (pH 2,0) og 0,1%'s TFA plus 25% (v/v) acetonitril.

18 DK 172679 B1

Som ovenfor anført indikeres CSF-proteinet ifølge opfindelsen til anvendelse i behandlingen af myelo-suppression såsom (symptomatisk) granulocytopeni, der fx forårsages af kemoterapeutisk behandling eller strålingsbehandling af cancer. Endvidere indikeres CSF-protei-® nerne ifølge opfindelsen til anvendelse ved behandling af alvorlig infektion. Til en sådan anvendelse indikeres typisk en dosis på ca.

200-1000 yg pr. patient. CSF-Proteinet injiceres fortrinsvis intravenøst i patienten i en egnet farmakologisk bærer. Eksempler på sådanne bærere omfatter farmakologisk saltopløsning og humant serumalbu-10 min i saltopløsning.

Endvidere har CSF-proteinerne ifølge opfindelsen andre aktiviteter og anvendelser. Det har fx vist sig, at murine CSF'er aktiverer neutro- filer. Det forventes således, at primat-CSF’erne ifølge opfindelsen også vil aktivere neutrofiler. Derfor kan CSF's fysiologiske funktioner 15 være mangfoldige. I knoglemarven kan denne lymfokin stimulere formering og differentiering af effektorceller til værtsforsvar, medens nye og eksisterende celler kan aktiveres i periferien. I et lokaliseret immunologisk respons kan CSF holde cirkulerende neutrofiler i eller væk fra inflammationsområder. Uhensigtsmæssig lokalisering og/eller 20 aktivering af neutrofiler kan være involveret i patofysiologien af en række immunmedierede lidelser såsom rheumatoid arthritis.

Foretrukne udførelsesformer for CSF-proteinet ifølge opfindelsen, som har en specifik aktivitet på mindst 1 x 107 enheder/mg ved en knoglemarvsassay, er følgende: 25 (A) CSF-Protein, som fremstilles ved at udtrykke cDNA, der koder for CSF, i en transformeret celle.

. (B) CSF-Protein, som er i det væsentlige fri for protein af nativ oprindelse.

30 (C) CSF-Protein, som er i det væsentlige fri for glycosylering.

(D) CSF-Protein, som er glycosyleret ved ekspression af cDNA, der koder for CSF-protein, i en transformeret eukaryot celle.

19 DK 172679 B1 (E) CSF-Protein, der er fremstillet ved at udtrykke cDNA med den i Hg. 1 viste nu-cleotidsekvens.

(F) Humant CSF-protein med i det væsentlige den i fig. 1 viste aminosyresekvens 5 eller en allel variant deraf.

(G) Gibbon-CSF med i det væsentlige den i fig. 1 viste aminosyresekvens eller en allel variant deraf.

10 (H) CSF-Protein som anført under (F) i moden form.

(I) CSF-Protein med 127 aminosyrer.

(J) CSF-Proteln, som fås ved ekspression af E. coli MC1061, der er deponeret i 15 ATCC under deponeringsnummeret ATCC 39754, eller det 127 aminosyre lange CSF, der indkodes af det deponerede plasmid p91023(B)-CSF’s nucleotidse-kvens.

20 Opfindelsen beskrives nærmere ved nedenstående eksempler, der ikke skal anses for at begrænse opfindelsens sande omfang som angivet i kravene.

I eksemplerne anvendes restriktionsendonucleaser under de betingelser og på den måde, som anbefales af forhandlerne. Ligationsreakti-25 oner udfores som beskrevet af Mamatis et al., supra s. 245-6, hvortil der henvises, under anvendelse af den på side 246 beskrevne puffer

og en DN A-koncentration på 1-100 |jg/ml ved en temperatur på 23°C

til stumpendet DNA og 16°C til "klæbeendet" DNA. Elektroforese udfores i 0,5-1,5%'s agarosegeler indeholdende 90 mM Tris-borat, 10 32 30 mM EDTA. Alt radiomærket DNA er mærket med P, uanset hvilken mærkningsteknik der anvendtes.

Ved udtrykket "hurtig præparation" forstås en hurtig produktion i lille målestok af bakteriophag- eller plasmid-DNA, fx som beskrevet i Maniatis et al., supra, s. 365-373.

20 DK 172679 B1

EKSEMPEL A

Trin 1. Mo-Cellelinjekulturer

Mo-Celier (ATCC CRL 8066) blev rutinemæssigt dyrket i o-(6% COj) eller Iscove’s (10% COj) medium indeholdende 20% føtalt kalveserum 5 (FCS), 2 mM glutamin, 100 U/ml streptomycin og 100 v9/ml penicillin.

Cellerne bor subkultiveres hver 4-5 dage. Cellerne tælles og podes i Falcon T-175-kolber i 100-150 ml medium ved en tæthed på 3-4 x 10^ celler/ml. Celleantallet vil fordobles i 20%'s FCS hver 4-7 dage. Væksthastigheden er ikke konstant, og celler kan af og til tilsyneladende 10 ophore med at vokse og derefter gennemgå vækstspurter. Mo-Celler kan dyrkes i serumfrit medium. Overlevelsen er meget bedre, når cellerne ikke vaskes, når de overføres fra FCS til serumfrit medium.

Den optimale tæthed i serumfrit medium (SF) er 5 x 10^ celler/ml.

Cellerne vil vokse en smule (eller i det mindste opretholde et konstant 15 antal) i 3 dage i serumfrit medium og bor derefter tilføres 20%'s FCS i mindst 4 dage. Dette vækstprogram (3 dages SF, 4 dages 20%'s FCS) kan gentages hver uge, hvis der kræves SF-medium, uden at cellerne tilsyneladende tager skade i flere måneder.

Trin 2. Analyse af CSF-aktivitet 20 A. Knoglemarvsassay

Der fås frisk knoglemarv, og spikelerne skilles ad ved at trække dem gennem en kanyle nr. 20, 22 og derefter 25. Der fortyndes 1:1 med steril phosphatpuffersaltopløsning (PBS) (stuetemperatur), og det fortyndede materiale lægges over Ficoll-Paque (ca. 30 ml BM-PBS over 25 6 ml Ficoll). Der centrifugeres ved 1500 omdr./minut i 40 minutter ved stuetemperatur. Fedt og PBS-fasen fjernes og kasseres. Fasen med ringe massefylde afpipetteres. Vaskes to gange med PBS og * 3 tælles. Cellerne udplades i RPMI (fås fra GIBCO som RPMI 1640) plus 10% Hl FCS (varmeinaktiveret FCS) i 3 timer for at fjerne adhærerende 30 celler.

21 DK 172679 B1

Udpfadningsmedium (frisk fremstillet):

20% FCS

0,3% agar opløst i vand og afkølet til 40°C to gange Iscove's (1:1 v/v med agar) 5 1% P/S slutkoncentration på 100 U/ml streptomycin og 100 vg/ml penicillin 4 2 10'* M e-thioglycerol i to gange Iscove's fra en 10~z M stamop- løsning.

Agar afkøles til ca. 40°C og blandes med de øvrige bestanddele.

10 Blandingen afkøles i vandbad til 37-38eC og holdes ved denne temperatur.

Efter 3 timer afpipetteres de ikke-adhærerende celler. Der centrifugeres og tælles. Der tilsættes 2 x 10** celler/ml udpladningsmedium, og de holdes i vandbad ved kontrolleret temperatur på 37-38°C.

15 Prøverne tilsættes (fx medium fra transficerede celler; sædvanligvis 10 pl's prøver) til den første række af brønde i en mikrotiterplade in duplo. 100 μΙ cellesuspension tilsættes pr. brønd. Der tilsættes yderligere 50 μΙ cellesuspension til hver brønd i den første række. Der blandes grundigt og overføres 50 yl opløsning fra den første række til 20 den næste række, etc., og der fortsættes med 1:3 fortyndinger hen over pladen. Pladen pakkes ind i parafilm. Cellerne inkuberes i 10-14 dage ved 10% CC^ og 37°C i fuldstændig fugtig atmosfære, og kolonierne tælles.

Til tælling af kolonierne tælles det totale antal kolonier, som vokser i 25 hver brønd. I hvert assay udplades adskillige brønde, uden at der inkluderes en prøve (kontrol) for at få en baggrunds-kolonitælling.

Det gennemsnitlige antal kolonier, som vokser i kontrolbrøndene, trækkes fra antallet af kolonier, som findes i hver af de brønde, som indeholder prøver. Én CSF-enhed er den mængde, som stimulerer 30 dannelsen af én koloni over baggrundsniveauet pr. 10^ humane knoglemarvsceller (udpladet ved 10** celler pr. ml), når CSF-koncentratio-nen er under mætning. Koncentrationen under mætning bestemmes ved fortynding og sammenligning af antallet af kolonier ved forskellige 22 DK 172679 B1 fortyndinger for af finde koncentrationen lige under mætningsniveauet.

I dette assay tælles de kolonier, som indeholder granulocyter, mono-cyter eller begge typer celler. Celletyperne i kolonierne bestemmes 5 ved at udtage kolonier og plette individuelle celler.

B. KG-1-Celleassay KG-1-Celler [Blood, bind 56, nr. 3, 1980) dyrkes i Iscove's medium plus 10% føtalt kalveserum, som udskiftes to gange om ugen og udpo-des ved hver udskiftning i 2 x 10 celler/ml. Cellerne anvendes kun 10 til assay mellem udskiftning 30-35. Assayet er det samme som for knoglemarv som beskrevet ovenfor med undtagelse af, at KG-1-celler- 3 ne udplades i agarblandingen ved 4 x 10 celler/ml.

Antallet af kolonier, som vokser i hver brønd, bestemmes, og baggrundtællingen trækkes fra som i det ovenfor beskrevne knoglemarvs-15 assay. Én KG-1 CSF-enhed/ml er den CSF-koncentration, som stimulerer halvdelen af maksimalantallet (mætning) KG-1-kolonier til vækst. Maksimalantallet opnås ved at inkorporere et mætningsniveau af CSF i flere brønde.

Trin 3. Konstruktion af vektoren p91023(B) - 20 Transformationsvektoren var pAdD26SVpA(3) beskrevet i Kaufman et al.. Mol. Cell Biol. 2 (11), 1982, s. 1304-1319. Den har den i fig. 2 viste struktur. Kort fortalt indeholder dette plasmid et muse-dihydro-: folatreduktase (DHFR)-cDNA-gen, som er under transkriptionskontrol Ϊ af adenovirus 2's (Ad2) sene hovedpromotor. Et 5'-splejsningssted er 25 inkluderet i adenovirus-DNA'et, og et 3'-splejsningssted, som stammer -i fra et immunoglobulingen, findes mellem den Ad2 sene hovedpromotor og den DHFR-kodende sekvens. Det tidlige polyadenyleringssted fra SV40 findes nedenfor den DHFR-kodende sekvens. Den prokaryotaf-ledte sektion af pAdD26SVpA(3) stammer fra pSVOd (P. Mellon, V.

30 Parker, Y. Gluzman og T. Maniatis, Cell 27, 1981, s. 279-288) og i indeholder ikke de pBR322-sekvenser, som vides at inhibere replika- 23 DK 172679 B1 tion i pattedyrceller (M. Lusky og M. Botchan, Nature (London) 293, 1981, s. 79-81).

pAdD26SVpA(3) omdannes til plasmidet pCVSVL2 som vist i fig. 2. pAdD26SVpA(3) omdannes til plasmidet pAdD26SVpA(3) (d) ved 5 sletning af et af de to Pstl-steder i pAdD26SVpA(3). Dette udfores ved partiel spaltning med Pst I (under anvendelse af et underskud af enzymaktivitet, således at der fås en subpopulation af lineariserede plasmider, hvor kun ét Pstl-sted er spaltet), efterfulgt af behandling med Klenow-fragmentet, ligation til recirkularisering af plasmidet, 10 transformation af E. coli og screening for sletning af Pstl-stedet, som findes 3' for SV40-polyadenyleringssekvensen.

De fra adenovirus stammende tredeite leder- og virusforbundne gener (VA-gener) blev indsat i pAdD26SVpA(3) (d) som vist i fig. 2. Forst blev pAdD26SVpA(3) (d) spaltet med PVuW til dannelse af et lineært 15 molekyle, som er åbnet i 3'-delen af det første af de tre elementer, som omfatter den tredelte ledersekvens. Derefter blev pJAW 43 (Zain et al.. Cell 16, 1979, s. 851) spaltet med Xho\, behandlet med Klenow-fragmentet, spaltet med Pvi/ll, og det 140 basepar lange fragment, som indeholdt den anden og en del af den tredje ledersekvens, 20 blev isoleret ved elektroforese på en acrylamidge! (6% i Tris-boratpuf-fer; Maniatis et al., supra). Det 140 bp lange fragment blev derefter ligeret til det med Pvull spaltede pAdD26SVpA(3) (d). Ligationsproduktet blev anvendt til transformation af E. coli til tetracyclinresi-stens, og kolonier blev screenede ved Grunstein-Hogness-proceduren 25 under anvendelse af en P-mærket probe, som hybridiserer til det 140 basepar lange fragment. Der blev fremstillet DNA fra positivt hybridiserende kolonier for at teste, om det rekonstruerede Pvulisted var 5’ eller 3’ af det indsatte 140 basepar lange DNA, som var specifikt for den anden og tredje fra adenovirus stammende sene 30 ledersekvens. Den korrekte orientering af Pvul I-stedet er på 5'-siden af den 140 basepar lange indsætning. Dette plasmid betegnes pTPL i fig. 2.

Avail D-fragmentet fra SV40, som indeholder SV40 forstærkersekvensen, blev vundet ved spaltning af SV40 DNA med Avail, enderne blev 24 DK 172679 B1 gjort stumpe med Klenow-fragmentet af polymerase I, Xho\- lin kere blev ligeret til fragmenterne, der blev spaltet med Xho\ for at åbne Xho\-stedet, og det fjerde største (D)-fragment blev isoleret ved gelelektroforese. Dette fragment blev derefter ligeret til det med 5 Xho\-spaltede pTPL, hvilket gav plasmidet pCVSVL2-TPL. Orienteringen af SV40 D-fragmentet i pCVSVL2-TPL var en sådan, at den SV40 sene promotor er i samme orientering som den fra adenovirus stammende sene hovedpromotor.

Til indføring af de fra adenovirus stammende virusforbundne (VA)-10 gener i pCVSVL2-TPL konstrueres først et plasmid pBR322, som indeholder adenovirus type 2 Hind III B-fragmentet. Adenovirus type 2 DNA spaltes med Hind 111, og B-fragmentet isoleres efter gelelektroforese. Dette fragment indsættes derefter i pBR322, som forinden er blevet spaltet med HindUl. Efter transformation af E. coii til ampicil-15 linresistens, screenes rekombinanter for indsætning af Hind III B-frag-mentet, og den indsatte orientering bestemmes ved restriktionsenzymspaltning. pBR322-Ad Hind III B indeholder adenovirus type 2 Hind III B-fragmentet i den i fig. 3 viste orientering.

Som vist i fig. 3 fås VA-generne bekvemt fra plasmidet pBR322-Ad 20 Hind III B ved spaltning med Ηρα I, tilføjelse af EcoRl-linkere og spaltning med EcoRI og isolering af det 1,4 kb lange fragment. Fragmentet, som har EcoRI-klæbeender, ligeres derefter i EcoRI-stedet på pTPL (der forinden er blevet spaltet med EcoRI). Efter transformation af E. coli HB101 og selektion for tetracyclinresistens screenes kolonier 25 ved filterhybridisering til en DNA-probe, som er specifik for VA-ge-i nerne. Der fremstilles DNA fra positivt hybridiserende kloner, hvilket DNA karakteriseres ved restriktionsendonucleasespaltning. Det resulterende plasmid betegnes p91023.

De to EcoRI-steder i p91023 fjernes. p91023 spaltes helt med EcoRI, ; ϋ 30 hvilket genererer to DNA-fragmenter, et med en længde på ca. 7 Kb og et andet med en længde på ca. 1,3 kb, som indeholder VA-generne. Enderne på begge fragmenter udfyldes med Klenow-fragmentet af polymerase I, hvorefter begge fragmenter, dvs. 1,3 kb og 7 kb, på ny ligeres sammen. Der identificeres et plasmid p91023(A), som inde 25 DK 172679 B1 holder VA-generne, og som svarer til p91023, men hvor de to EcoRisteder er slettet, ved Grunstein-Hogness-screening med VA-genfrag-mentet og ved konventionel restriktionsstedanalyse.

Derefter fjernes det enkelte Pstl-sted i p91023(A) og erstattes med et 5 £coRI-sted. p91023(A) spaltes fuldstændigt med Pstl, og derefter behandles det med Klenow-fragmentet af polymerase I for at danne stumpe ender. £coRI-linkere ligeres til det stumpendede Pstl-sted på p91023(A). Det lineære p91023(A), hvortil der i det stumpendede Pstl-sted er føjet £coRI-linkere, adskilles fra uligerede linkere og 10 spaltes fuldstændigt med £coRI, hvorefter det religeres. Der isoleres et plasmid p91023(B), som identificeres til at have en tilsvarende struktur som p91023(A), men hvor et £coRI-sted er anbragt i det tidligere Pstl-sted.

Trin 4. Fremstilling af et cDNA-bibliotek 15 Mo-Celler blev induceret i 16-20 timer med PHA og PMA for at forøge deres lymfokindannelse. Cellerne blev udpladet ved 5 x 10^ celler/ml i Iscove's medium med 20% FCS, 0,3% (v/v) PHA og 5 ng/ml TPA.

Cellerne blev indsamlet ved centrifugering. De pelleterede celler blev resuspenderet i 20 ml iskoldt hypotonisk lysepuffer (RSB-puffer: 20 0,01M Tris-HCI, pH 7,4, 0,01M KCI, 0,0015M MgCI2, 1 vg/ml cyclo- heximid, 50 enheder/ml RNAsin og 5 mM dithiothreitol) . Cellerne lodes kvælde på is i 5 minutter og blev derefter sprængt mekanisk med 10 slag af en tætsluttende glashomogenisator. Homogenatet blev centrifugeret ved lav hastighed (2000 omdr./minut i en Beckman J6-centrifu-25 ge) for at fjerne kerner og ikke-lyserede celler. Supernatanten blev holdt på is, medens kernepelleten blev resuspenderet i 10 ml RSB og på ny centrifugeret ved lav hastighed. Denne anden supernatant blev samlet i pulje med den første, og de kombinerede supernatanter blev centrifugeret ved lav hastighed for at fjerne resterende kontamination 30 med kerner og ikke-lyserede celler. Supernatanten fra denne centrifugering blev bragt op på 0,15M KCI ved tilsætning af 2M KCI, hvorefter den blev centrifugeret ved høj hastighed (25.000 omdr./minut,

Beckman SW28-rotor i 30 minutter) for at pelletere membranerne. Membranpelleten blev omhyggeligt vasket med koldt RSB, hvorefter 26 DK 172679 B1 den blev resuspenderet i 12 ml RSB, som indeholde 2M saccharose og 1,15M KCI. Der blev fremstillet to diskontinuerlige gradienter i Beckman SW41-centrifugerør ved anbringelse af 6 ml membranopløsning I 2M saccharose over 2 m( RSB med 2,5M saccharose og 0,15M KCI.

5 Rørene blev fyldt til randen ved anbringelse af 2,5 ml RSB indeholdende 1,3M saccharose og 0,15M KCI ovenover. Disse gradienter blev centrifugeret i 4 timer ved 27.000 omdr./minut (Beckman SW41-rotor) ved 4°C. Membranfasen (ved grænsefladen mellem 2,OM og 1,3M saccharose) blev forsigtigt fjernet fra siden under anvendelse af en kanyle 10 nr. 18 og sprøjte. Membranfraktionerne fra de to gradienter blev samlet i pulje og fortyndet med ét volumen destilleret vand, hvorefter de blev bragt på 0,5% Triton® X-100 og 0,5% natriumdeoxycholat, hvorefter de blev ekstraheret med et lige så stort volumen phenol.

Den vandige fase blev reekstraheret med en 1:1-blanding af phenol og 15 chloroform og derefter med et lige så stort volumen chloroform. Til slut blev membranbundet RNA udfældet ved tilsætning af NaCI op til 0,25M og 2,5 volumen kold ethanol og inkuberet natten over ved -20°C. Det udfældede RNA blevet indsamlet ved centrifugering (4000 omdr./minut i 10 minutter i Beckman J-6-centrifugen) og blev resu-20 spenderet i 1 ml destilleret vand. Fra 2 X 10 celler fås ca. 1 mg RNA. Messenger-RNA'et (mRNA) blev isoleret ud fra det totale RNA ved chromatografi på en 0,5 ml oligo-dT-cellulosesøjle. Kort fortalt blev RNA'et opvarmet til 70°C i 5 minutter, hurtigt afkølet på is og derefter fortyndet fem gange med bindingspuffer (0.5M LiCI, 0,01M 25 Tris-HCI, pH 7,4, 0,002M EDTA og 0,1% SDS) ved stuetemperatur.

RNA'et i bindingspufferen blev passeret gennem oligo dT-cellulosesøj-len ækvilibreret med bindingspuffer ved stuetemperatur. Søjlen blev vasket med 5 ml bindingspuffer og derefter med 5 yl 0,15M LiCI, 0,01M Tris-HCI, pH 7,4, 0,002M EDTA og 0,1% SDS. mRNA'et blev 30 elueret med 2 ml 0.01M Tris-HCI, pH 7,4, 0,002M EDTA og 0,1% SDS. mRNA'et blev udfældet ved tilsætning af NaCI op til 0,25M og 2,5 volumen ethanol og inkubation natten over ved -20°C. Det udfældede mRNA blev indsamlet ved centrifugering (30.000 omdr./minut i 30 minutter i en Beckman SW55-rotor). Væsken blev forsigtigt fjernet fra 35 røret, og mRNA-pelleten blev resuspenderet i 50 ml vand. Det resu-spenderede mRNA blev bragt op på 0,25M NaCI og derefter ekstraheret i 1 time med en l:1-blanding af phenol og chloroform og derefter tre gange med chloroform. mRNA'et blev udfældet ved tilsætning 27 DK 172679 B1 af 2,5 volumen ethanol. Blandingen blev frosset og optøet flere gange i et tøris/ethanolbad og derefter centrifugeret i 15 minutter i en Eppendorf-centrifuge. Væsken blev forsigtigt fjernet fra røret, og mRNA-pelleten blev resuspenderet i 20 vi destilleret vand. Det endeli-5 ge udbytte var ca. 30 yg mRNA.

Enkeltstrenget cDNA blev fremstillet ved standardmetoder. Kort fortalt blev 10 yg membran-mRNA fortyndet i en 100 yl cDNA-synte-sereaktionsblanding indeholdende 300 mM Tris, pH 8,4, 140 mM KCI, 10 mM MgClj, 10 mM B-mercaptoethanol, 500 yM hver af dATP, dGTP, 10 dCTP og dTTP, 5 yg oligo-dT (phosphoryleret og med en gennem- 32 snitsstørrelse pi 12-18) som primer, 150 yCi af P dCTP (400 Ci/mil-limol) og 20 enheder af ribonucleaseinhibitoren RNAsin. Reaktionen blev startet ved tilsætning af 100 enheder revers transkriptase og inkuberet i 30 minutter ved 42°C. Reaktionen blev standset ved 15 tilsætning af EDTA til 40 mM, og RNA'et blev nedbrudt ved inkubation i 20 minutter ved 65°C i 0,2M NaOH. Basen blev neutraliseret ved tilsætning af 20 yl 2M Tris, pH 7,4. Reaktionsblandingen blev derefter ekstraheret med phenoi/chloroform, tilbageekstraheret med 50 yl 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA (TE), og de vandige faser blev 20 samlet i pulje. Enkeltstrenget cDNA blev omdannet til dobbeltstrenget cDNA ved inkubation i 12 timer ved 16°C med 40 enheder af Kle-now-fragmentet af DNA-polymerase I i en 100 yl’s reaktionsblanding indeholdende 50 mM kaliumphosphat, pH 7,4, 2,3 mM DTT, 2-mercap-toethanol, 10 mM MgC^, 150 ymol af hver af de fire deoxynucleotid- 32 25 triphosphater og 25 yCi P dCTP. Reaktionen blev standset ved ekstraktion med phenoi/chloroform, og de ikke-inkorporerede triphosphater blev fjernet ved at lede den vandige fase gennem 1 ml’s Se-phadex® G-50-søjle. De ekskluderede fraktioner blev samlet i pulje og ethanoludfældet.

30 cDNA-Pelleten blev vasket med kold ethanol og derefter resuspenderet i 200 yl 20 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, 80 ymol S-adenosylmethio-nin og 300 enheder CcoRI-methylase i 60 minutter ved 37°C. Reaktionen blev standset ved ekstraktion med phenoi/chloroform, og det methylerede cDNA blev indsamlet ved ethanoludfældning.

28 DK 172679 B1 cDNA-Pelleten blev vasket med 70%’s ethanol og derefter resuspende-ret i 200 vi SI-puffer (Maniatis et al.) og inkuberet med 200 enheder SI-nuclease ved 30°C i 30 minutter. Reaktionen blev standset ved ekstraktion med phenol/chloroform, og cDNA'et blev indsamlet ved 5 ethanoludfældning.

Det dobbeltstrengede cDNA blev gjort stumpendet ved inkubation i 100 pi 20 mM Tris, pH 7,4, 50 mM NaCI, 10 mM 2 mercaptoethanol og 500 vmol af alle de fire deoxynucleotidtriphosphater med 25 enheder Kienow-fragment ved stuetemperatur i 30 minutter. Reaktionen blev 10 standset ved ekstraktion med phenol/chloroform, og cDNA'et blev indsamlet ved ethanoludfældning.

cDNA'et blev ligeret i 50 vi T4-ligasepuffer (Maniatis et al.) med 500 pmol RI-linkere, som forhandles af New England Biolabs (sekvens: pCGGAATTCCG) under anvendelse af 2000 enheder T4-ligase natten 15 over ved 16°C. Reaktionen blev standset ved inkubation ved 70°C i 20 minutter og blev derefter fortyndet til 300 vU saledes at den endelige saltkoncentration var 0,1M NaCI, 10 mM, MgC^, 50 mM Tris-Cf, pH 7,4. cDNA'et blev derefter spaltet i 2 minutter ved 37°C med 700 enheder EcoRI. Reaktionen blev standset ved ekstraktion med 20 phenol/chloroform, og cDNA'et blev indsamlet ved ethanoludfældning.

Pelleten blev resuspenderet i 50 pi TE og lodes passere gennem en 5 ml's C1-4B-spjle. De ekskluderede fraktioner blev samlet i pulje og ethanoludfældet. Det udfældede cDNA blev underkastet elektroforese gennem en 1%'s saccharosegel i Tris-acetatpuffer i nærværelse af 1 25 vg/ml ethidiumbromid. cDNA i størrelsesområdet 500-4000 basepar blev isoleret fra gelen under anvendelse af glaspulver-standardproceduren.

Det eluerede cDNA blev ekstraheret med phenol/chloroform, og ethanoludfældet, og pelleten blev efter en ethanolvask resuspenderet i 30 vl TE. Slutudbyttet var 100-500 ng cDNA.

. =, 30 Fremstillingen af ekspressionsvektoren p91023(B) er beskrevet oven for. Den med EcoRI spaltede og phosphatasebehandlede vektor (500 ng) blev natten over ved 16°C ligeret med 100 ng cDNA i en 100 vl's ‘ reaktionsblanding (standard T4-ligasereaktionsblanding). Reaktionen blev standset ved ekstraktion med phenol/chloroform, og derefter blev 29 DK 172679 B1 de ligerede cDNA indsamlet ved ethanoludfældning efter tilsætning af 5 yg tRNA som bærer.

Det ethanoludfældede DNA blev vasket med 70%'s ethanol og derefter resuspenderet i 100 yl TE. Dette DNA blev anvendt j 4 yl’s alikvoter 5 til transformation af E. coli MC1061 (4 yl i en 100 yl's transformationsblanding). Hver af de 25 transformationer blev spredt ud på en 150 mm petri-skåi med 1% agar, L-væske og 10 yg/ml tetracyclin (Tet-plade) og inkuberet natten over ved 37°C. Der voksede ca. 2000 kolonier på hver plade, hvilket gav et samlet antal på ca. 50.000 10 kolonier. Efter at have nået ca. 0,5 mm i diameter, blev kolonierne overført til nitrocelluloseplader (137 mm) ved forsigtigt, at anbringe et tørt filter på pladens overflade og derefter tage filteret af i en jævn bevægelse. Alle kolonierne på pladen blev overført til filteret, som derefter blev anbragt (med kolonisiden opad) på en frisk Tet-plade.

15 Efter at have ladet kolonierne vokse i flere timer, blev der fremstillet et replika fra hver af filtrene ved at anbringe et friskt befugtet filter nøjagtigt hen over det originale filter, presse dem sammen, skille dem ad og derefter returnere hvert filter til en frisk Tet-plade og inkubere pladerne natten over ved 37°C. Hvert replika blev omhyggeligt 20 mærket, således at det kunne sammenlignes med det originale filter.

Trin 5. Fremstilling af plasmid DNA-pulje

Hvert af de 25 replikafiltre blev derefter forsigtigt delt i 8 lige store stykker under anvendelse af en skalpel, og orienteringen af hvert af disse 8 stykker i forhold til det originale master-filter blev noteret.

25 Kolonierne blev skrabet fra hvert stykke i 10 ml L-væske. Bakterier ne blev indsamlet ved centrifugering (3000 omdr./minut, 10 minutter,

Beckman J-6-centrifuge), resuspenderet i 0,6 ml 25%'s saccharose, 50M Tris-HCI, pH 8,0 og omdannet til protoplaster ved tilsætning af 0,12 ml af 5 mg/ml lysozym og inkubering på is i 5-10 minutter.

30 Protoplasterne blev derefter inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter efterfulgt af tilsætning af 0,125 ml 0,5M EDTA og lyse ved tilsætning af 0,12 ml 10% SDS i 50 mM Tris-HCI, pH 8,0. Lysatet blev blandet nænsomt og inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter, hvorefter protein og chromosomal DNA blev udfældet ved tilsætning af 35 0,3 ml 5M NaCI. Efter inkubation på is i 15 minutter blev lysatet 30 DK 172679 B1 centrifugeret koldt i en Eppendorf-centrifuge i 30 minutter. Superna-tanten blev forsigtigt fjernet, hvilket efterlod en viskos DNA-protein-pellet, som blev fortyndet ved tilsætning af 0,5 ml vand. Blandingen blev ekstraheret med 1 ml phenol, faserne blev adskilt ved centrifu-5 gering (Ί0Κ i 10 minutter i Sorvall SS-34-rotoren), og den vandige fase blev overført til et frisk rør. DNA blev udfældet ved tilsætning af 0,5 ml 5M NaCI og 7,5 ml kold ethanol og frysning af blandingen adskillige gange i et tøris/ethanolbad. Bundfaldet blev indsamlet ved centrifugering (10K, 15 minutter i Sorvall SS-34-rotoren), resuspen-10 deret i 0,3 ml af 0,3M natriumacetat og genudfældet (i et Eppendorf-rør) ved tilsætning af 1 ml ethanol. Efter 10-15 minutter i et tøris/-ethanolbad, blev det udfældede DNA indsamlet ved centrifugering (5 minutter i Eppendorf-centrifugen), og den endelige pellet blev resu-spenderet i 100 μΙ sterilt TE (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA). Ud fra 15 en typisk præparation fås 5-10 ug plasmid DNA. Hvert præparat indeholdt DNA fra 200-500 kolonier på det oprindelige filter. Et samlet antal af 200 DNA-prøver blev fremstillet ud fra de 25 filtre.

Trin 6. Isolering af CSF-klonen

Hver af de i trin 5 fremstillede DNA-prøver blev hver for sig transfi-20 ceret i M6 COS-abeceller som beskrevet nedenfor.

M6-Cellerne blev rutinemæssigt dyrket i Dulbecco’s modificerede

Eagle's medium (DME, forhandles af Gibco), som indeholdt 10% varme-inaktiveret føtalt kalveserum (HIFCS), delt to gange om ugen ved 1:6-fortynding. 24 timer efter opdeling i 1:6 er M6-cellerne parat til 25 transfektion. 24 timer før transfektion podes 1,2 x 10 M6-celler (fordelt 1:6) i en "Cell Factory” (forhandles af Nunc) i 1,5 liter DME * 10% HIFCS. Umiddelbart før transfektion aspireres plader og vaskes to gange med 7 ml serumfrit (SF) DME. DNA'et opløses i 0,1M Tris (pH 7,3) og sættes til DME-mediet indeholdende 2 mM glutamin,

; 30 100 ug/mt streptomycin, 100 U/ml penicillin og 0,25 mg/ml DEAE

; dextran, hvilket giver 4 ml sammen med Tris-DNA-opløsningen. De 4 ml medium indeholdende opløst DNA sættes til pladen, som indeholder M6 COS-celier og inkuberes i 12 timer.

31 DK 172679 B1

Efter inkubation vaskes cellerne én eller to gange med 7 ml SF DME.

Derefter tilsættes 5 ml DME med 10%'s HIFCS, 100 U/ml penicillin, 100 yg/ml streptomycin, 2 mM glutamin og 0,1 mM chlorquin, og cellerne blev inkuberet i 2 1/2 time.

5 Efter 2 1/2 time blev cellerne vasket én gang med SF DME, og der tilsattes 10 ml DME og 10%'s HIFCS/plade. Efter 30 timer blev mediet aspireret, og der tilsattes 4 ml/plade DME og 10%'s HIFCS: Cellerne blev høstet ved at fjerne det konditionerede medium efter 24-26 timers yderligere inkubation.

10 Det konditionerede medium fra hver transfektion blev analyseret for CSF-aktivitet under anvendelse af KG-1 -assayet. For hver prøve, der var positiv for CSF-aktivitet, skulle klonen på det oprindelige master-filter, som var ansvarlig for CSF-aktiviteten, identificeres. For én transfektion, der var positiv for CSF-aktivitet, blev fx alle kolo-15 nierne fra den sektion på den originale master-filter, hvorfra trans-fektions-DNA-prøven stammede, udtaget. Ca. 320 af disse kolonier blev anbragt i 3 ml L-væske plus 10 vg/ml tetracyclin. Kulturerne blev dyrket natten over. 320 kolonier blev anbragt i en 18 x 18 matrix. Der blev fremstillet puljer fra hver horisontal og vertikal 20 række på matrixen (36 puljer i alt) (bemærk: den sidste horisontale række havde kun 14 kloner). DNA-Prøver blev fremstillet ud fra hver i pulje samlet kultur og blev derefter anvendt til at transficere COS-celler. Supernatanterne fra disse transfektioner blev analyseret under anvendelse af KG-l-koloniassayet. To positive kloner vandtes fra 25 dette transfektionsforsøg: én i en vertikal række, den anden i en horisontal række. Den kultur, som var fælles for disse puljer, indeholdt CSF-klonen.

Tolv individuelle kloner fra denne kultur blev isoleret, og en DNA-minipræparation blev fremstillet ud fra 10 ml's kulturer i L-væske som 30 beskrevet ovenfor. 10 pl's prøver af DNA fra disse præparationer blev spaltet med EcoRI, og de resulterende DNA-fragmenter blev analyseret ved agarosegelelektroforese. Ni af de tolv kloner havde en fælles indsætning på ca. 750 basepar. DNA'et fra fire af disse kloner og de resterende tre kloner blev indfort i M6 COS-ce!ler som beskre- 32 DK 172679 B1 vet ovenfor. Supernatanterne fra disse transfektioner blev analyseret under anvendelse af KG-l-assayet samt knoglemarvsassayet for CSF.

De fire kloner, som hver indeholdt de 750 basepar lange fragment, foranledigede alle M6 COS-cellernes ekspression af høje niveauer af 5 CSF-aktivitet som detekteret i hvert assay, hvorimpd de andre tre kloner ikke gjorde det. Det kodende område for CSF må derfor være lokaliseret inden for den 750 basepar lange indsætning.

Den DNA-sekvens, der koder for CSF, blev fjernet fra transformationsvektoren i den positive klon ved spaltning med FcoRI og sekven-10 teret under anvendelse af standard dideoxysekventeringsmetoder efter subkloning af fragmenter i M13-vektorer til opnåelse af den i fig. 1 viste sekvens. Plasmidet p91023(B) - CSF, som først viste sig at foranledige CSF-ekspression i COS-celler, har fået betegnelsen pCSF-1. Dette plasmid er den 2. juli, 1984 blevet deponeret i Ameri-15 can Type Culture Collection i en stamme af E. co/i MC1061 under deponeringsnummeret ATCC 39754.

Trin 7. Ekspression af CSF-protein MS COS-abeceller transformeret med vektoren p91023(B) indeholdende CSF/cDNA som isoleret i trin 6 dyrkes som beskrevet i trin 6 til 20 dannelse af CSF-protein i dyrkningsmediet.

1 mg af dette DNA (pCSF-1) blev opløst i 1 ml 0,1M Tris, pH 7,3 og sat til 600 mi DME indeholdende 2 mM glutamin, 100 U/ml streptomycin, 100 pg/ml penicillin (P/S) og 0,25 mg/ml DEAE-dextran (molekylvægt 500.000 fra Pharmacia). De 600 mi DNA/DEAE-dextranopløs-25 ning sættes til M6 COS-cellerne i "Cell Factory” og inkuberes ved

37°C i 12 timer. Efter inkubation vaskes cellerne én gang med 900 ml SF DME og Inkuberes derefter 2 1/2 time med 600 ml DME indeholdende 0,1 mM chlorquin, 10%'s HIFCS, 2 mM glutamin og P/S. Efter : aspirering af det chlorquinholdige medium vaskes cellerne med SF DME

30 og tilføres 1500 ml DME med 10%'s HIFCS. Efter 30 timer vaskes ' cellerne med SF DME, mediet erstattes med 800 ml SF DME, og de transficerede celler lades konditionere mediet i 24 timer ved 37°C. Det konditionerede medium lades aspirere og erstattes med yderligere 800 ml SF DME. Cellerne lades konditionere dette medium i 24 timer,

i hI

' 31 33 DK 172679 B1 hvorefter det konditionerede medium indsamles. Så hurtigt som muligt efter høst koncentreres den konditionerede medieprøve 20 gange ved ultrafiltrering under tryk under anvendelse af Amicon's 2,5 liters kammer med YN5-membranen (molekylvægtgrænse 5000).

5 Trin 8. Oprensning af rekombinant CSF

200 ml koncentreret konditioneret medium (ud fra 4 liter udgangsmateriale, jfr. trin 7) blev bragt op på 30%'s mætning med ammoniumsulfat ved tilsætning af fast ammoniumsulfat, og det udfældede protein blev fjernet ved centrifugering. Supernatanten blev bragt op på 80%'s 10 mætning med ammoniumsulfat ved tilsætning af yderligere fast ammoniumsulfat, og det udfældede protein blev indsamlet ved centrifugering.

Pelleten blev resuspenderet i 5 ml 20 mM natriumcitrat, pH 6,1, indeholdende 1M NaCI. Det opløste protein blev anbragt på en 1,6 x 100 cm’s søjle af ultrogel AcA54 ækviiibreret i den samme puffer.

15 CSF-Aktiviteten eluerede fra søjlen med en tilsyneladende molekylvægt på 19 kdaltons eller efter ca. 90 ml. Det er blevet iagttaget, at hvis gelfiltreringen udføres ved lav ionstyrke, eluerer CSF-aktiviteten fra søjlen i 2 positioner med tilsyneladende molekylvægte på ca. 19 kdaltons og 38 kdaltons, hvilket antyder, at GM-CSF let kan danne dime-20 rer. De aktive fraktioner blev samlet i pulje og bragt op på 0,15% TFA (ved tilsætning af 10% TFA) og anbragt på en Vydac C4-søjle (0,46 x 25 cm) ækviiibreret i 0,1% TFA. Søjlen blev elueret med lineær gradient af 0-90% acetonitril (1 ml/minut, 340 ml i alt) i 0,1% TFA. CSF-Aktiviteten eluerede mellem 39 og 43% acetonitril (fraktion 25 16-20). En 20 pl's prøve af fraktion 19 blev analyseret ved SDS-poly- acrylamidgelelektroforese (13,5% gel som beskrevet af Lammli, Nature 227, 1970, s. 680). Der blev iagttaget et enkelt bredt proteinbånd med en tilsyneladende molekylvægt på 18-26 kdaltons. Det temmelig brede størrelsesområde for CSF er et fælles træk ved glycoproteiner 30 og formodes at afspejle en omfattende, men variabel tilsætning af carbonhydrat. Protein fra fraktion 19 blev underkastet Edman-ned-brydning under anvendelse af Applied Biosystems gasfase-mikrosek-venteringsapparat. Ud fra ca. 20 vg anbragt protein fik man sekvensen af de første 16 aminosyrer (A-P-A-R-S-P-S-P-S-T-Q-P-W-E-H).

35 Det høje udbytte af denne enkelte proteinsekvens pegede kraftigt i 34 DK 172679 B1 retning af, at CSF-proteinet i fraktion 19 var blevet oprenset til homogenitet. Bioassay viste, at fraktion 19 havde 3 x 10^ enheder pr.

280 A absorbansenheder. Da typiske proteiner i vandig opløsning 280 ° udviser et ekstinktionskoefficientområde på 0,8-1,2 A absorbansen-5 heder pr. mg protein, er den specifikke aktivitet af det oprensede CSF mellem ca. 1 x 10^ og ca. 4 x 10^ enheder/mg, når det analyseres ved det humane knoglemarvscelleassay.

EKSEMPEL B (Reference-eksempel)

Kloning af Gibbon-CSF

10 Trin 1. Fremstilling af mRNA ud fra Gibbon-T-celler

En prøve af Gibbon-T-cellelinjen med betegnelsen UCD-MLA 144 blev dyrket i flere uger i RPMI 1640 (forhandles af Gibco) og 20% føtalt 9 kalveserum (FCS), indtil man fik et samlet antal celler på 1 x 10 .

Cellerne blev induceret til at danne høje niveauer af CSF ved aktive-15 ring i 24 timer i nærværelse af 10 ng pr. ml 12-O-tetradecanoylphor-bol-13-acetat (TPA) i RPMI 1640 plus 1% føtalt kalveserum. Cellerne blev høstet ved centrifugering (1000 omdr./minut i 5 minutter), vasket én gang med phosphatpufret saltopløsning (PBS) og derefter indsamlet ved centrifugering.

20 Membranbundet polysom (MBP) mRNA blev fremstillet ud fra disse celler ved samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel A til fremstilling af Mo-celle RNA.

Trin 2. Enkeltstrenget cDNA-reaktion 6 μ g MBP mRNA (fra trin 1) blev fortyndet i en 50 pl's cDNA-syn-25 tesereaktionsblanding (jfr. eksempel A, trin 4), og reaktionen blev startet ved tilsætning af revers transkriptase. Efter inkubation i 30 minutter ved 42°C blev reaktionen standset ved tilsætning af EDTA op til 50 mM og fortyndet med vand til 100 pi. Blandingen blev ekstrahe- Ί 35 DK 172679 B1 ret med phenoi/chloroform og yderligere ekstraheret med chloroform. cDNA/RNA-Hybriderne blev skilt fra ikke-inkorporerede triphosphater ved chromatografi på en 2 ml’s Sepharose® CL-4B-s®jle. De eksklude-rede fraktioner blev samlet i pulje, og hybriderne blev indsamlet ved 5 ethanoludfældninger. Slutudbyttet var 570 ng.

Trin 3. Dobbeltstrenget cDNA-reaktion

Enkeltstrenget cDNA-pelleten (trin 2) blev resuspenderet i 50 ml vand, og dobbeltstrengssyntese blev udført i en standardreaktions-blanding med E. co/z-polymerase I, E. coli-ligase og RNAse H. Reak-10 tionsblandingen blev inkuberet natten over ved 16°C og derefter i 1 time ved 37°C. Reaktionen blev standset ved tilsætning af EDTA, og reaktionsblandingen blev ekstraheret med phenoi/chloroform. cDNA'et blev skilt fra ikke-inkorporerede triphosphater ved chromatografi på en Cepharose® CL-4B-søjle, de ekskluderede fraktioner blev samlet i 15 pulje og cDNA'et blev indsamlet ved ethanoludfældning.

Trin 4. Fremstilling af rekombinant cDNA

cDNA-Pelleten (trin 3) blev resuspenderet i 75 μΙ vand. Homopolymere C ''haler" blev tilføjet til enderne af cDNA'et ved tilsætning af 10 μΙ cDNA-opløsning til en 25 pl's standardreaktionsblanding indeholdende 20 terminal transferase, og inkubation ved 30°C i 5 minutter. Reaktionen blev standset ved tilsætning af EDTA op til 40 mM og varmeinaktive-ring ved 68°C i 10 minutter. 10 ng af dette med hale forsynet cDNA blev sammenføjet med 50 ng af med G-hale forsynet pBR322 (forhandles af NEN) i 10 μ! 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA og 100 mM NaCI.

25 Sammenføjningsreaktionsblandingen blev inkuberet i 10 minutter ved 68°C og derefter i 2 timer ved 57°C.

Trin 5. Bakterietransformation E. co/f-stamme MC1061 blev dyrket i L-væske, afkølet på is, høstet ved centrifugering og behandlet med CaCI^ for at præparere dem til 30 transformation. 5 μΙ af cDNA-sammenføjningsreaktionsblandingen blev derefter inkuberet med 200 yl af de med CaClj behandlede bakterier.

36 DK 172679 B1

Der foretoges 15 sådanne transformationer, idet alt det sammenføjede cDNA blev opbrugt, og cellerne blev udpladet på 15 cm, 1% agar L-væskeplader indeholdende 10 yg/ml tetracyclin. Der voksede ca.

1000 kolonier på hver plade.

5 Trin 6. Replikaudpladning 10.000 kolonier fra transformationen blev hver især udtaget med en tandstikker, overført til friske plader (500 pr. plade i et gitterværk) og dyrket natten over ved 37°C. Kolonierne blev derefter løftet fra hver plade ved at presse et tørt nitrocellulosefilter fast nedover 10 pladens overflade. Der blev fremstillet to replikafiltre fra hver af disse master-filtre. Masterfiltrene blev opbevaret ved 4°C, og repli-kafiltrene blev behandlet med base og bagt for at blive præpareret til hybridisering.

32

Trin 7. Fremstilling af P-mærkede hybridiseringsprober 15 cDNA-Indsætningen fra pCSF-1 blev isoleret ved spaltning med re striktionsenzymet FcoRI og elektroforese i en agarosegel med Trisacetat og ethidiumbromid. Det bånd, som indeholder cDNA-fragmentet, blev udskåret fra gelen og oprenset ved glaspulverteknikken.

300 ng af cDNA-fragmentet sattes derefter til 1 yl af 10 x T4 DNA-20 polymerasepuffer (0,33M Tris-acetat, pH 7,9, 0,66M kaliumacetat, 0,1M magnesiumacetat og 10 mM dithiothreitol) og 3 enheder T4 DNA-polymerase (New England Biolabs) og fortyndet med vand til 10 yl.

Efter inkubation i 5-10 minutter ved 37°C blev denne blanding kombineret med 1 pi 10 x T4 DNA-polymerasepuffer, 1 yl af en 2 mM opløs-25 ning af hver af dCTP, dTTP, dGTP, 10 yl 32PdATP (10 yCi/yl, 3000 Ci/millimol), og 3 enheder T4 DNA-polymerase. Reaktionsblandingen j blev inkuberet i 20 minutter ved 37°C. Derefter tilsattes 1 yl 2 mM

I dATP, og reaktionsblandingen blev inkuberet i yderligere 10 minutter I ved 37°C.

30 De ikke-inkorporerede triphosphater blev skilt fra det mærkede cDNA i ved chromatografi på en Sephadex® GlOO-søjle. Der blev fremstillet en 37 DK 172679 B1 anden probe ud fra et syntetisk oligonucleotid med sekvensen ATC TGG CTG CAC AG, som er komplementær med det CSF-kodende områdes aminoterminal. Dette oligonucleotid blev mærket med P dATP ved dets 5'-ende under anvendelse af en standardpolynucleo-5 tidkinasereaktion.

Trin 8. Isolering af CSF cDNA-kloner I en standardhybridiserings-screeningsprocedure hybridiserede ca. 45 kloner med det med T4 mærkede pCSF-1 cDNA. Af disse hybridiserede ca. 20 også til den mærkede oligonucleotidprobe. Én af disse 10 kloners kodende område er blevet sekventeret, og sekvensdataene afslørede flere basesubstitutioner, hvoraf nogle medfører aminosyre-forskelle i det udtrykte protein. Disse forskelle er vist i fig. 1 ovenover DNA-sekvensen af det i eksempel A klonede humane CSF-gen.

EKSEMPEL C (Reference-eksempel)

15 Kloning af CSF ud fra perifert blodlymfocyt mRNA

Trin 1. Fremstilling af mRNA ud fra perifere blodlymfocyter

Perifere blodlymfocyter blev fremstillet ud fra fire plasmaferese-bipro-dukter (forhandles af Røde Kors) ved fraktionering på en Ficoll-Hy-paque-gradient. Ved ringe tæthed i RPMI-1640 i nærværelse af 5% 20 føtalt kalveserum, 0,17% phytohæmaglutinin og 10 ng/ml phorbol-my- ristatacetat (PMA) ved en tæthed på 2 x 10^ celler/ml fik man i g alt 6 x 10 celler. Cellerne blev høstet ved centrifugering (1000 omdr./minut i 5 minutter), vasket én gang med phosphatpufret saltopløsning (PBS) og derefter indsamlet ved centrifugering. Der blev 25 fremstillet cytoplasma-RNA ved en skånsom lyseprocedure, i hvilken cellerne blev resuspenderet i 50 ml kold Triton®-lysepuffer (140 mM NaCI, 1,5 mM MgCI2, 10 mM Tris, pH 8,6, 0,5% Triton® X-100) med 10 mM dithiothreitol (DTT) og 50 enheder/ml RNAsin (forhandles af Biotec). Dette lysat blev delt i to lige store dele, og hver del blev 30 anbragt over en 10 mfs pude af lysepuffer indeholdende 20% saccha- 38 DK 172679 B1 rose. Cellekernerne blev fjernet ved kold centrifugering (4°C, 400 omdr./minut i 5 minutter). Den øverste fase (cytoplasmaekstrakt) blev forsigtigt fjernet, og der tilsattes natriumdodecylsulfat (SDS) til en slutkoncentration på 1%. Denne opløsning blev ekstraheret to gange 5 med et lige så stort volumen phenol/chloroform (1:1 blanding), og RNA’et blev udfældet ved tilsætning af 2,5 volumen kold ethanol. Det udfældede RNA blev indsamlet ved centrifugering (4000 omdr./minut i 15 minutter) og resuspenderet i 0,01M Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,25M NaCI (TE-puffer plus 0,25M NaCI) og genudfældet ved tilsæt -10 ning af 2,5 volumen kold ethanol. Derefter blev RNA'et indsamlet ved centrifugering og resuspenderet i 5 ml vand. Slutudbyttet var 7,5 mg.

Messenger-RNA blev isoleret fra det totale cytoplasma-RNA ved selektion på oligo-dT-cellulose. 2,5 mg totalt RNA blev opvarmet til 65°C i 15 5 minutter. Der tilsattes NaCI op til 0,5M, og RNA'et lodes afkøle til stuetemperatur. Dette RNA blev ledt gennem en 1 ml's søjle af oligo-dT-cellulose ækvilibreret i TE * 0,5M NaCI (bindingspuffer). Ubundet RNA blev fjernet ved grundig vask af søjlen med bindingspuffer.

Bundet messenger-RNA blev elueret med 3 ml vand og udfældet ved 20 tilsætning af 0,2 ml 4M NaCI og 2,5 volumen koldt ethanol. Det udfældede mRNA blev indsamlet ved centrifugering (30 minutter ved 25.000 omdr ./minut). Slutpelleten (ca. 100 ug) blev resuspenderet i 50 vi vand.

Trin 2. Enkeltstrenget cDNA-reaktion 25 20 vg PBL mRNA blev fortyndet i en 50 yl's cDNA-syntesereakti- onsblanding, der indeholdt 100 mM Tris, pH 8,4, 140 mM KCI, 10 mM 1 MgC^/ 10 mM 2-mercaptoethanol, 400 μΜ af hver af dATP, dGTP, dCTP og dTTP, 5 vg oligo-dT (gennemsnitsstørrelse 12-18) som primer, 25 yCi "^PdCTP (400 vCi/millimol) og 20 enheder af ribonu-30 cleaseinhibitoren RNAsin. Reaktionen blev startet ved tilsætning af 60 enheder af revers transkriptase ved 37°C, og reaktionsblandingen blev inkuberet i 30 minutter ved 42°C. Reaktionen blev standset ved tilsætning af EDTA op til 40 mM og ekstraheret med et lige så stort Volumen vandmættet phenol. Phenolfasen blev tilbageekstraheret med «α 39 DK 172679 B1 50 μΙ TE-puffer. De vandige faser blev samlet i pulje. cDNA/RNA-Hybriderne blev skilt fra ikke-inkorporerede triphosphater ved at lede den i pulje samlede vandige fase gennem en 5 ml's Sepharose® CL-4B-søjle (forhandles af Sigma), der var ækvilibreret med TE.

5 Fraktionerne, som blev ekskluderet fra søjlen, blev samlet I pulje, bragt op på 250 mM NaCI, og nucleinsyrerne blev udfældet ved tilsætning af 2,5 volumen koldt ethanol. Hybriderne blev indsamlet ved centrifugering i 30 minutter ved 40.000 omdr./minut. Slutpelleten (2,5 Vig cDNA) blev resuspenderet i 50 μΐ vand.

10 Trin 3. Dobbeltstrenget cDNA-reaktion

Dobbeltstrenget cDNA blev syntetiseret ved den kombinerede virkning af enzymerne E. co//-DNA-polymerase I, E. co(/-DNA-ligase og E. coli-RNAse H. Reaktionsblandingen (50 μΙ) indeholdt 20 mM Tris, pH

8,0, 4 mM MgCI2, 1,2 mM EDTA, 25 μΜ NAD, 10 μΜ af hver af dATP, 15 dGTP, dCTP og dTTP og 50 μΟϊ ^PdCTP (3000 Ci/millimol). Reaktionen blev udført ved tilsætning af 3 enheder DNA-polymerase I, 0,5 enheder DNA-ligase og 0,75 enheder RNAse H og inkubation ved 16°C i 18 timer og derefter ved 37°C i 1 time, hvorefter reaktionen blev standset ved tilsætning af EDTA op til 40 mM og ekstraheret med et 20 lige så stort volumen phenol. Phenolfasen blev tilbageekstraheret med 50 μΐ TE, de vandige faser blev samlet i pulje, og cDNA'et blev skilt fra de ikke-inkorporerede triphosphater ved chromatografi på en

Sepharose® CL-4B-søjle som beskrevet ovenfor for den enkeltstrenge- 32 de. Baseret på inkorporering af P blev det enkeltstrengede cDNA 25 kvantitativt omdannet til dobbeltstrenget form.

Trin 4. Fremstilling af rekombinant cDNA

Homopolymere C "haler" blev føjet til enderne af cDNA'et ved nænsom opvarmning af 400 ng cDNA i en 50 pl's reaktionsblanding, som indeholdt 1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM CoC^ og 9 enheder terminal 30 deoxynucleotidyltransferase ved 30°C i 5 minutter. Reaktionen blev standset ved tilsætning af EDTA op til 40 mM og opvarmning til 68°C i 10 minutter. 200 ng af dette med hale forsynede cDNA blev sammenfejet med 500 ng med G-hale forsynet pAT153 (forhandles af 40 DK 172679 B1

Amersham) i 100 μ| 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA og 100 mM NaCI. Sammenføjningsreaktionen blev udført ved 57°C i 2 timer efter 5 minutters præinkubation ved 68°C.

Trin 5. Bakterietransformation 5 cDNA-Sammenføjningsreaktionsproduktet blev anvendt direkte til transformation af E. co//-stamme MCI061. En frisk koloni af bakterieceller blev anvendt til at inokulere 50 ml L-væske og blev dyrket i flere timer, indtil den optiske densitet ved 500 nm var 0,25. Cellerne blev afkølet pi is og høstet ved centrifugering (2000 omdr./minut i 10 10 minutter). Pelleten blev resuspenderet i 10 ml koldt 0,1M CaClj og lodes henstå på is i 10 minutter. Cellerne blev indsamlet ved centrifugering (2000 omdr./minut i 5 minutter) og resuspenderet i 2,5 ml 0,1M CaClj. 10 μΙ af cDNA-sammenføjningsreaktionsblandingen blev derefter inkuberet med 200 μΙ CaC^-behandlede bakterier i 30 minut-15 ter på is og derefter i 2 minutter ved 37°C efterfulgt af tilsætning af 0,8 ml L-væske og en stutinkubation i 30 minutter ved 37°C.

Der blev udført 20 af disse transformationer, idet alt det sammenføjede cDNA blev anvendt. Hver transformationsblanding blev udpladet på 1% agar L-væskeplader (15 cm i diameter), som indeholdt 10 ug/ml 20 tetracyclin. Fra de 20 transformationer blev der fremstillet i alt 20 sådanne plader og inkuberet natten over ved 37°C. I gennemsnit voksede ca. 1500 bakteriekolonier på hver plade, hvilket gav i alt 30.000 kloner.

Trin 6. Replikaudpladning 25 De oprindelige kolonier, der voksede på hver plade, blev overført til 137 mm's nitrocellulosefiltre ved, at man pressede et tørt filter ovenpå kolonierne og løftede dem fra pladen. Der blev fremstillet to identiske replika fra hvert originalt filter ved standardreplikaudpladningsmeto-der, hvor hvert orginalt filter forsigtigt blev anbragt med kolonisiden 30 opad på en steril kvadrat af filterpapir (Whatman 3 MM), der hvilede på et kvadratisk stykke glas. Et nyt forinden befugtet nitrocellulosefilter blev forsigtigt anbragt ovenpå master-filteret, dækket med et andet sterilt kvadratisk stykke filterpapir, og hele sandwichen blev 41 DK 172679 B1 derefter presset fast sammen ved hjælp af et andet stykke glas. De sammenlagte filtre blev nummereret, og gennem dem blev der asymmetrisk prikket tre nåletynde huller, således at de på ny kan anbringes nøjagtigt over hinanden. Replikaet blev derefter fjernet fra masteren 5 og anbragt med kolonisiden opad på en ny tetracyclinholdig L-væske-agarplade. Et andet replika blev med det samme fremstillet på identisk måde. Hvert master-filter blev returneret til en plade, og alle pladerne blev inkuberet ved 37°C i flere timer, indtil bakteriekolonierne var blevet ca. 1 mm i diameter. De originale master-filtre blev opbevaret 10 ved 4°C, og replikaene blev præpareret til hybridisering som beskrevet nedenfor.

Trin 7. Præparering af filtre til hybridisering

Hvert replikafilter (trin 6) blev anbragt med kolonisiden opad på filterpapir (Whatman 3 MM), der var gennemvædet med 0,5M NaOH, 15 1,5M NaCI i 7 minutter. Filtrene blev overført til neutraliserings-fil terpapirer, gennemvædet med 1M Tris, pH 7,5, 1,5M NaCI i 2 minutter og derefter overført til et andet sæt neutraliseringsfiltre i 5-10 minutter. Derefter blev filtrene anbragt på filtre, der var gennemvædet med SSC-puffer (0,015M natriumcitrat, 0,15M NaCI, pH 7,4) i 5 20 minutter, lufttørret og bagt i vakuum ved 80°C i 1-2 timer.

Trin 8. Isolering af CSF cDNA-kloner

Duplikatfiltre blev forsynet med prober bestående af den radioaktivt mærkede pCSF-1 cDNA-indsætning, der var fremstillet som beskrevet i eksempel B. Ca. 20 kolonier hybridiserede med cDNA'et. 12 af disse 25 blev udtaget fra master-filteret og dyrket natten over i L-væske til yderligere analyse. Restriktionsenzymspaltninger (Psfl) af DNA-prø-ver (hurtig præparation) ud fra disse kloner viste, at 3 havde næsten fuld længde. Én af disse blev sekventeret. Sekvensen af denne klons CSF-kodende område var identisk med den tilsvarende sekvens 30 af pCSF-1 (dvs. den har et T ved stilling 365-CSF(lle)).

42 DK 172679 B1

EKSEMPEL D

Oprensning af CSF fra en Mo-celle!inje

Mo-Serumfrit konditioneret medium (40 liter) blev inkuberet ved 55°C i 30 minutter for at inaktivere det HTLV-I l-virus, som er forbundet 5 med cellelinien. Dette medium blev koncentreret ved ultrafiltrering under tryk under anvendelse af en Pellicon-kasette med membran PTGC (1393,50 cm^), som har en molekylvægtgrænse på 10.000. Dette protein blev yderligere koncentreret ved ammoniumsulfatudfældning (80%'s mætning). Den endelige proteinpellet (800 mg) blev resuspen-10 deret i 100 ml 20 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan-hydrochlorid (Tris-HCI), pH 7,4, og dialyseret mod samme puffer (3 gange med hver gang 4 liters skift). Det dialyserede protein blev anbragt på en

2,5 x 10 cm's sejle af DEAE (diethylaminoethyl)-ultrogel, der var ækvilibreret i den samme puffer. Søjlen blev vasket med 800 ml 20 mM 15 Tris-HCI, pH 7,4, hvorefter CSF-aktiviteten blev elueret med 800 ml 20 mM Tris-HCI, pH 7,4, som indeholdt 0,12M NaCI. 10 ml's fraktioner blev indsamlet og analyseret for CSF. De aktive fraktioner (3) blev samlet i pulje og koncentreret 6 gange (til 5 ml) ved ultrafiltrering under tryk (Amicon YM5-membran, molekylvægtgrænse 5000). Den 20 koncentrerede prøve fra DEAE-søjlen blev anbragt på en 1,6 x 100 cm's AcA44-uItrogelsøjle (en acrylamidagarose-ultrogel med en fraktionering på 10-130 kdalton), som var ækvilibreret i 20 mM N-2-hy-droxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsyre (HEPES), pH 7,4, 50 mM

NaCI og 0,01% polyethylenglyeol (PEG-8000). CSF-Aktivitet blev 25 elueret fra søjlen med en tilsyneladende molekylvægt på 30 kdalton.

De aktive fraktioner blev samlet i pulje og bragt op på 0,15% (v/v) trifluoreddikesyre (TFA) ved tilsætning af 10% TFA og anbragt på en Vydac C4-reversfasesøjle (1 x 25 cm). Søjlen blev elueret med en lineær gradient af 0-90% acetonitril i 0,1% TFA (v/v) ved 4 ml/minut 30 (1000 ml i alt). CSF-Aktiviteten eluerede ved ca. 47% (v/v) aceto nitril. De i pulje samlede aktive fraktioner blev bragt op pa 0,05% (v/v) heptafluorsmørsyre (HFBA) ved tilsætning af et halvt volumen 0,15% (v/v) HFBA og anbragt på en Vydac C4-søjle (0,46 x 25 cm), der var ækvilibreret i 0,15% (v/v) HFBA. Søjlen blev elueret med en 35 lineær gradient af 0-90% (v/v) acetonitril i 0,15% (v/v) HFBA ved 1 43 DK 172679 B1 ml/minut (i alt 340 ml). CSF-Aktiviteten eluerede ved ca. 53% (v/v) acetonitril. Fraktionerne 37-44 (1 ml hver) viste sig at være aktive.

0,15 ml af fraktion 40 blev koncentreret fire gange (under anvendelse af "SAVANT Speed Vac Concentrator"), og der tilsattes 40 μΙ 2 x 5 SDS-gelprøvepuffer (0,125M Tris-HCI, pH 6,8, 4% SDS, 20% glycerol og 0,004% bromphenolblat). Oisse prøver blev kogt i 2 minutter og anbragt på en 13,5%'s SDS-gel (jfr. fig. 2), U. Laemmli, Nature 227, 1970, s. 680. Det blev bestemt, at fraktion (nr. 40) havde 110.000 knoglemarvs-CSF-enheder/ml. Dette svarer til ca. 3,0 x 10^ enheder 10 pr. A280-absorbansenhed. Da typiske proteiner har ekstinktionskoefficienter, som er i området mellem 0,8 og 1,2 A280-enheder pr. mg, har det oprensede CSF en specifik aktivitet i området ca. 1 x 10^ - ca. 4 x 10^ enheder pr. mg i knoglemarvsassayet. En 1 yg's prøve af oprenset GM-CSF blev underkastet Edman-nedbrydning under anven-15 delse af et Applied Biosystems gasfase-mikrosekventeringsapparat.

Sekvensen af resterne 3-5 blev bestemt at være Ala-Arg-Ser.

EKSEMPEL E (Reference-eksempel)

Cotransformation og amplifikation af CSF-sekvens i CHO-celler

Plasmidet p91023(B)-CSF blev indført i CHO DHFR-deficiente celler 20 DUKX-B11 (Chasin & Urlaub, PNAS 77, 1980, s. 4216) ved protoplast-fusion som beskrevet i Sandri-Goldin et al., Mol. Cell. Bio. J, 1981, s. 743-752. Væksten og opretholdelsen af CHO-cellerne er beskrevet i Kaufman & Sharp, J. Mol. Bio. 150, 1981, s. 601-621. Til protoplast-fusion blev p91023(B)-CSF-l indført i E. coli HB101, og bakterierne 25 blev dyrket i 50 ml m9-salte indeholdende 0,5% casaminosyrer, 0,4% glucose, 0,012% MgSO^, 5 ug/ml thiamin og 10 pg/ml tetracyclin til en absorbans på 0,6 ved 600 nm. Der tilsattes chloramphenicol til 250 ug/ml, og kulturen blev inkuberet ved 37°C i yderligere 16 timer for at amplificere plasmidkopitallet. Cellerne blev centrifugeret ved 30 3000 x g i 10 minutter ved 4°C og suspenderet i 2,5 ml afkølet 20%

saccharose i 50 mM Tris-CI, pH 8,0. Der tilsattes lysozym (0,5 ml af en 5 mg/ml opløsning i 0,25M Tris-CI, pH 8,0), og blandingen blev holdt på is i 5 minutter. Der tilsattes EDTA (1 ml 0,25M EDTA, pH

44 DK 172679 B1 8,0) i yderligere 5 minutter på is, og derefter tilsattes langsomt 1,0 ml 0,05M Tris-CI, pH 8,0. Suspensionen blev inkuberet i 15 minutter ved 37°C, indtil bakterierne blev omdannet til protoplaster. Suspensionen blev derefter langsomt fortyndet med 20 ml foropvarmet medium 5 indeholdende 10% saccharose og 10 mM MgC^ og holdt ved 37°C i 15 g minutter. Protoplastopløsningen (ca. 10 /ml) sattes til CHO, DHFR- £

deficiente DUKX-B11 -celler i en 6-brøndspIade (ca. 1 x 10 celler/-brønd) i en mængde på ca. 1-2 x 10 protoplaster/celle, og protopla-sterne blev pelleteret på cellerne ved centrifugering ved 2000 omdr./-10 minut i 8 minutter i en svingende mikrotiterplade-rotor på en IEC

model K-centrifuge. Efter centrifugering blev supernatanten fjernet ved aspiration. En 2 ml's mængde polyethylenglycolopløsning (50 g PEO - 1450, (Baker Chem. Co.) i 50 ml medium) sattes til hver brønd i 6-brøndspladen. Cellerne blev på ny centrifugeret ved 2000 omdr./-15 minut i 90 sekunder, polyethylenglycolopløsningen blev fjernet, og pladerne blev vasket tre gange med 4 ml medium pr. brønd. Cellerne blev derefter trypsiniserede, suspenderet i 10 ml medium indeholdende 10% føtalt kalveserum og centrifugeret i et konisk rør ved 500 omdr./-minut i en klinisk centrifuge. Pelleterede celler fra 3 brønde blev 20 samlet i pulje og udpladet i en 10 cm's vævskulturskål. Frisk medium indeholdende 100 yg/ml kanamycin, thymidin, adenoxin, deoxyadeno-sin, penicillin og streptomycin og 10%'s dialyseret føtalt kalveserum sattes til hver plade. Kanamycinet tilsattes for at forhindre vækst af eventuelle bakterier, der havde undgået omdannelse til protoplaster.

25 To dage senere blev cellerne subkultiveret 1:15 i α-medier med 10%'s dialyseret føtalt kalveserum, penicillin og streptomycin, men som manglede nucleosider. Cellerne tilførtes igen det samme selektive medium (der manglede nucleosider) efter 4-5 dage.

Der opstod kolonier 10-12 dage efter subkultivering i selektivt medi-30 um. Der er fulgt to procedurer for methotrexat (MTX)-udvælgelse og amplifikation. I den første procedure blev enkelte uafhængige klonede transformanter isoleret på basis af DHFR-ekspression, og derefter blev hver klon opformeret under betingelser "til amplifikation af kopitallet af det fremmede DNA, dvs. vækst i stigende koncentrationer af DK 172679 B1 45 methotrexat. I den anden procedure blev en pufje af flere uafhængige transformanter isoleret på basis af DHFR-ekspression og opformeret sammen under betingelser til amplifikation af det fremmede DNA, dvs. vækst i stigende koncentrationer af methotrexat. Derefter blev indivi-5 duelle kloner isoleret fra den masseselekterede population og analyseret for GM-CSF-ekspression. De kloner, der udviste de højeste niveauer af GM-CSF-ekspression, blev på ny dyrket under betingelser til yderligere amplifikation af det fremmede DNA (dvs. vækst i stigende koncentration af methotrexat i dyrkningsmediet).

♦ 10 I ét forsøg blev syv DHFR -transformanter samlet i pulje i e-medium, som manglede nucleosider. Disse celler blev derefter dyrket i trinvis stigende koncentrationer af MTX begyndende med 0,02 pm og derefter til 0,1, 0,5 og 2,0 pm MTX. Ved analyse for GM-CSF-aktivitet i KG-1-celleassayet dannede disse celler 3000-12.000 enheder pr. ml.

15 Den udvalgte population blev klonet i 0,5 pm MTX og i 2,0 pm MTX.

Kloner, som vandtes i 0,5 pm MTX (010, D2 og B6), blev derefter selekteret for vækst i 2,0 pm MTX. Ved analyse for GM-CSF-aktivitet i KG-1-celleassayet dannede de klonede cellelinjer 15.000-300.000 enheder pr. ml GM-CSF-aktivitet. Det ifølge dette eksempel fremstil-20 lede GM-CSF har den aminosyresekvens, som er angivet for CSF-Thr i fig. 1.

EKSEMPEL F (Reference-eksempel)

Ekspression af GM-CSF i E. coli GM-CSF blev udtrykt i E. coli fra vektoren pTALC-185R, der i dia-25 gramform er vist i fig. 6. Den GM-CSF-kodende sekvens begynder med den syntetiske sekvens ATG CCA CCA CCT CCT TCT CCA TCT CCA TCT ACT, som bestemmer de indledende 11 aminosyrerester i modent GM-CSF. Resten af den GM-CSF-kodende sekvens i pTALC-185R er identisk med pCSF-1, nucleotiderne 97-447, efterfulgt af 30 sekvensen TAR TAR TAG. Umiddelbart efter den tredobbelte terminator findes pUC-18-polylinkeren. Tetracyclinresistensgenet fra pBR322 er blevet indsat i modsat orientering i forhold til CSF-genet og 100 46 DK 172679 B1 baser neden for pUC-18-polylinkeren. Tetracyclinresistensgenet bærer sin egen promotor. Fortsættende i retning mod uret findes derefter genet for β-lactamase efterfulgt af pUC-18's (ColEl) replikationsiniti-eringssted.

5 Det sidste strukturelle træk ved plasmidet, for man kommer tilbage til CSF-sekvensen, er PL-promotoren. Denne promotor er i det væsentlige som beskrevet af A. Skatzman og M. Rosenberg (i Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, s.

419). CSF-Ekspression styres af PL-promotoren efter varmeinduktion i 10 en hensigtsmæssig E. co//-værtsstamme.

Den forældrestamme, som blev anvendt til alle stammekonstruktioner-ne, var V/3110 lacl°L8 (R. Brent og M. Ptashne, PNAS 78, 1981, s.

4204-4208).

Et fragment af X-DNA (X-nucleotiderne 34499-38214) blev integreret i 15 chromosomet af W3110 lacl°L8 ved lacZ's placering. Integrationen blev udfort under anvendelse af en integrationsvektor bestående af pBR325-sekvenser, der bar generne for chloramphenicol- og ampicil-linresistens samt pBR322’s replikationsinitieringssted (F· Bolivar,

Gene 4, 1978, s. 121-136). λ-DNA-Fragmentet indsættes i lacZ-genet, 20 der i sig selv findes på plasmidet som et fragment, som strækker sig fra BstEil-stedet i Lacl tij et Tthilll-sted neden for lacZ.

Integration af X-DNA’et i den chromosomale kopi af lacZ blev opnået * ved homolog rekombination, og der blev fundet lac , ampicillinfølsom- me, chloramphenicolresistente kolonier. Der blev screenet for en 25 anden rekombinationsbegivenhed, som medførte fjernelse af alle ekstra plasmidsekvenser, men som efterlod X-DNA-fragmentet integreret, på

MacConkey-lactoseplader. Efter den anden rekombinationsbegivenhed

♦ S R

blev den indledende lac , amp , cam -fænotype forandret til en lac ,

S S

amp , cam -fænotype. Den resulterende stamme blev kaldt GL400 og R S

30 var X ved 30°C og X ved 42°C. Denne fænotype viser eksistensen 857 af en funktionel chromosomkopi af Cl -allelen.

47 DK 172679 B1 GL400 blev Ion ved Pl_-transduktion fra et lysat dyrket på stamme SG20252 (/ocMi 169, araL· 139, rp*l, ΙοηΔίΟΟ: :Tn10). TnIO blev fjernet 5 ved screening for Tet på selektive medier (S. Mafoy, W. Nunn, J.

Bocteriol. 745, 1981, s. 1110-1112).

5 Den endelige værtsstamme kaldtes GI413 (lacl°L8, LacZA (XCI, REX, N), ΙοηΔίΟΟ).

pTALC-185R blev transformeret tit G1413. En overnatskultur af denne stamme blev dyrket ved 30eC i 5 ml's induktionsmedium indeholdende 7 yg/ml ^ tetracyclin. Induktionsmediet indeholder pr. liter: 10 20 g casaminosyrer

6 g Na2HP047H20 3 g KH2P04 0,5 g NaCI

1 g NH4CI

15 1% glycerol 2 mg B1-vitamin 2 mg CaCI2*2H20 0,2 g MgCI2»6H20

Dette medium C25 ml) indeholdende 7 vg/ml ^ tetracyclin blev inoku-20 leret med 125 yl af overnatskulturen og rystet ved 30°C i vandbad, indtil kulturen nåede en densitet på A^g0,5. Derefter blev den hurtigt overført til et 40°C varmt vandbad og rystet i yderligere 2 timer for at forårsage syntese af GM-CSF. Celler blev høstet og kontrolleret for deres indhold af CSF ved SDS-polyacrylamidgelelek-25 troforese. Under disse betingelser akkumulerer GM-CSF til ca. 5% af celleproteinet.

48 DK 172679 B1 EKSEMPEL G (Reference-eksempel)

Ekspression af GM-CSF i Saccharomyces cerevlsiae A. Vektorkonstruktion

Der blev konstrueret et plasmid, som indeholdt genet for et enzym i 5 uracilbiosyntesevejen WRA3) som selektionsgen og 2 y's replikations-initieringssted. Dette plasmid stammede fra Ylp5 (Botstein et al..

Gene 8, 1979, s. 17-24) med tilføjelse af et fragment, som indeholdt gærplasmidet 2 p's replikationsinitieringssted.

B. Isolering af genet for glyceraldehydphosphat-dehydrogenase 10 (GPDH)

To gener for GPDH er blevet isoleret fra gær (Holland og Holland,

Journal of Biological Chemistry 255, 1980, s. 2596-2605). En oligonu-cleotidprobe, som var syntetiseret fra den publicerede sekvens, blev anvendt til at isolere et GPDH-gen fra et plasmidbibliotek af gaerge-15 nom-DNA ved standardmetoder. Et plasmid, som indeholdt hele GAP491-genet, er tidligere blevet deponeret (ATCC nr. 39777).

C. Fremstilling af glyceraldehydphosphat-dehydrogenasepromotoren til heterolog genekspression

Der blev konstrueret et plasmid, som tager højde for den naturlige 20 afstand mellem GPDH-promotoren og starten af det ønskede heterologe strukturgen. Dette blev udført ved at indføre et kpnl-sted umiddelbart ved siden af den indledende methioninkodon på GPDH-struktur-genet. Promotor-"kassetten” blev derefter indsat i gaerekspressions-vektoren YOpI.

25 D. Isolering af genet for a-faktor

Et gen for a-faktor-parringspheromonet er blevet isoleret fra gær (Kurjan og Herskowitz, Cell 30, 1982, s. 933-943). En oligonucleotid-probe syntetiseret fra denne sekvens blev anvendt til at isolere genet fra et plasmidbibliotek af gærgenom-DNA ved standardmetoder.

' i 49 DK 172679 B1 . E. Fremstilling af CSF-ekspressionspIasmidet

Ud fra de ovenfor beskrevne elementer og det humane CSF-gen blev der konstrueret en ekspressionvektor (AJ14, fig- 7) ved standardme-5 toder. I denne vektor er CSF's naturlige ledersekvens blevet fjernet, og den sekvens, der koder for modent CSF, er blevet indsat ved siden af α-faktorens præ-pro-sekvens. Sammenfejningerne mellem GPDH-promotoren, ο-faktorens præ-pro-sekvens og den modne CSF-sekvens er præciseret nedenfor og er blevet bekræftet ved dideoxy-’ nucleotidsekventering til at være AAATAAACAAA,47’C.CGTTTTCCT-

TCA...... AAA AGA GAG GCG GAA GCT.GCA CCC GCC CGC

TCG...

F. Ekspression af GM-CSF

15 Plasmidet AJ14 blev transformeret til en stamme af Saccharomyces cerevisfoe. Cellerne blev dyrket til dannelse af CSF.

Claims (6)

50 DK 172679 B1

1. CSF-protein med en specifik aktivitet på mindst 1*101 enheder /mg i knoglemarvsassay.

2. CSF-protein ifelge krav 1, 5 kendetegnet ved, at det er rekombinant CSF-protein.

3. CSF-protein ifølge krav l, kendetegnet ved, at det er humant granulocyt-makrophag CSF.

4. CSF-protein ifølge krav l, kendetegnet ved, at det har den i fig. 1 viste aminosyresekvens for CSF-Thr, CSF-Ile eller CSF-G.

5. CSF-protein ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det indeholder den i fig. 1 15 viste aminosyresekvens, som starter med Ala Pro..., eller hvor den aminosyresekvens, som starter med Ala Pro..., indledes med en methioninrest.

6. CSF-protein ifølge krav i, kendetegnet ved, at det er et CSF-protein, som i 20 aminosyresekvens svarer til en naturligt forekommende CSF med undtagelse af, at én eller flere aminosyrer er blevet tilføjet, erstattet eller fjernet uden i det væsentlige at påvirke den naturlige CSF's biologiske aktivitet. CSF-protein ifølge krav 6, 25 kendetegnet ved, at det er et CSF-protein med en naturlig CSF's aminosyresekvens med undtagelse af, at det -i indledes med en methioninrest.