DK168709B1 - Vektorer omfattende et gen, der koder for et primat-GM-CSF-protein, værtsceller transformeret med vektoren, fremgangsmåde til fremstilling af primat-GM-CSF-protein, og cDNA, der svarer til det CFS-kodende gen - Google Patents

Description

DK 168709 Bl

Den foreliggende opfindelse angår fremstilling af et protein, som er i stand til at stimulere væksten og differentieringen af primaters hæmatopoietiske forældreceller, især den koloni-stimulerende faktor (CSF). Opfindelsen angår vektorer om-5 fattende et gen, der koder for et primat-GM-CSF-protein, værtsceller transformeret med en sådan vektor, en fremgangsmåde til fremstilling af primat-GM-CSF-protein, og cDNA, der svarer til det CSF-kodende gen.

De mange forskellige celletyper, som findes i blod, stammer 10 alle fra pluripotente hæmatopoietiske stamceller. Stamceller har to funktioner: 1) de reproducerer sig selv, hvorved der opretholdes en stamcellepopulation i legemet, og 2) de tilve-jebringer forældreceller, som er er bestemt til at differentiere til en hvilken som helst af de modne blodcelletyper.

15 Den celle, som er bestemt til at differentiere ad en bestemt hæmatopoietisk vej, betegnes en forældrecelle. Forældreceller for T-lymfocyter, B-lymfocyter, granulocyter, røde blodlegemer, blodplader og eosinofiler samt tidligere forældreceller, som individuelt kan føre til flere af de modne celletyper, er 20 blevet undersøgt eksperimentelt både in vivo og in vitro (T.M. Dexter, ϋ\_ Pathology 141. 1983, s. 415-433) . Det er blevet bestemt in vitro, at formering og/eller differentiering af hver forældrecelletype afhænger af specifikke "faktorer", som stammer fra forskellige kilder. Fx kræver de senere 25 forældreceller for røde blodlegemer en faktor, som kaldes erythropoietin. De faktorer, som kræves for overlevelse, formering og differentiering af de myeloide forældreceller, som er bestemt til at danne modne neutrofile granulocyter, monocyter og modne makrophager, kaldes kolonistimulerende 30 faktorer (CSF'er).

CSF-Aktivitet er blevet grundigt undersøgt i musen. De fleste voksne museorganer danner CSF-aktivitet. Imidlertid er kompositioner, som indeholder CSF-aktivitet, der er vundet fra forskelligt væv og ved forskellige metoder, tilsyneladende 35 forskellige i deres biokemiske karakteristika. Således forbliver de strukturelle forhold mellem de forskellige faktorer 2 DK 168709 B1 ukendte. Endvidere synes CSF-aktivitet at virke i mere end ét trin af granulocyt- og makrophagudviklingen, og det har igen været uvist, om en enkelt faktor er ansvarlig for alle de iagttagne aktiviteter, eller om en forskellig faktor virker 5 ved hvert trin. (A. Burgess og D. Metcalf, Blood 56. 1980, s. 947-957.)

Human CSF-aktivitet er vundet fra placenta, visse fostervæv, makrophager og stimulerede T-celler. En T-cellelinje (Mo), der danner én eller flere stærke CSF-aktiviteter, er blevet 10 etableret fra en patient med en T-cellevariant af hårcelle-leukæmi (leukæmisk retikuloendoteliose) (Golde et al., Blood 52, 1978, S. 1068-1072).

CSF-Aktivitetens evne til at stimulere granulocyt- og makro-phagdannelse indikerer, at farmaceutiske præparater med CSF-15 aktivitet er klinisk anvendelige i situationer, hvor forøget dannelse af disse (myeloide) celletyper er påkrævet. Flere patienter med ekstremt høje niveauer af tilsyneladende normale cirkulerende granulocyter har vist sig at have tumorer, som overproducerer CSF. I ét tilfælde faldt granulocyttallet 20 ved kirurgisk fjernelse af tumoren henimod et normalt niveau, hvilket kraftigt antyder, at CSF kan være nyttigt til at regulere antallet af cirkulerende granulocyter (W. Hocking, J. Goodman og D. Golde, Blood 61. 1983, s. 600). Især er CSF-præparater klinisk anvendelige til behandling af myeolo-sup-25 pression forårsaget af kemoterapeutisk eller strålingsbehandling af cancer. Endvidere er CSF-præparater nyttige til behandling af alvorlige infektioner, fordi CSF kan forøge og/eller aktivere antallet af granulocyter og/eller monocy-ter.

30 Der findes forskellige typer kendte CSF-aktiviteter, herunder granulocyt-CSF (G-CSF), makrophag-CSF (M-CSF), granulocyt/-makrophag-CSF (GM-CSF) og multi-CSF. Den foreliggende opfindelse angår GM-CSF. CSF-Proteiner kendes fra forskellige animalske kilder. Den foreliggende opfindelse angår primat-35 CSF, navnlig humant CSF og abe-CSF.

3 DK 168709 B1

Biologisk og biokemisk karakterisering af præparater med CSF-aktivitet og undersøgelse af disse præparater inden for klinikken er til dato blevet hæmmet af den ringe mængde og urenhed af de humane og/eller andre primat-CSF-præparater.

5 Det er klart, at det ville være ønskeligt at identificere det protein eller de proteiner, som er ansvarlig for CSF-aktivi-tet. Det ville endvidere være ønskeligt at have en primat-, fortrinsvis human kilde til sådant CSF, som let ville kunne tilvejebringe disse proteiner i mængder og i en renhed, som 10 er tilstrækkelige til biologisk og biokemisk karakterisering og til anvendelse som terapeutiske midler.

For nylig udviklede teknikker til molekylær kloning gør det muligt at klone en nucleotidsekvens, som indkoder et protein, og fremstille dette protein i større mængder under anvendelse 15 af et hensigtsmæssigt vært-vektorsystem, jfr. T. Maniatis. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982. Proteinet kan derefter isoleres ved kendte separations- og oprensningsteknikker. Hidtil anvendte kloningsmetoder kan grupperes i tre 20 generelle kategorier: l) metoder, som er baseret på kendskab til proteinstrukturen, fx dets aminosyresekvens, 2) metoder, som er baseret på identifikation af det protein, som udtrykkes af det klonede gen, under anvendelse af et antistof, som er specifikt for dette protein, og 3) metoder, som er baseret 25 på identifikation af en RNA-art, som kan translateres til dannelse af det protein eller den aktivitet, som indkodes af det gen, som har interesse.

Hver af disse klasser af metoder er vanskelige at anvende, når det protein, som har interesse, såsom CSF-protein kun 30 foreligger i meget små mængder. Hvis det er vanskeligt at få en tilstrækkelig mængde oprenset protein, er det således vanskeligt at bestemme aminosyresekvensen eller endog delsekvenser af proteinet. Tilsvarende udføres identifikation af et udtrykt protein ved antistofbinding fortrinsvis under 35 anvendelse af et monospecifikt, polyklonalt antiserum, som foreligger i højt titer. Et sådant antiserum kan ikke fås i 4 DK 168709 B1 fraværelse af tilstrækkelige mængder af det rene protein (antigen). Et monoklonalt antistof giver en alternativ mulighed, men det fornødne antistof kan også være vanskeligt at opnå i fraværelse af et hensigtsmæssigt antigen, og et sådant 5 monoklonalt antistof reagerer eventuelt ikke med proteinet i den form, i hvilken proteinet udtrykkes af tilgængelige rekombinante vært-vektorsystemer. Endelig kræver translation af en RNA-art til dannelse af et identificerbart protein eller aktivitet, at det pågældende RNA er til stede i RNA-10 kilden i tilstrækkelig mængde til at give et pålideligt protein eller aktivitetssignal. Den relative mængde af et RNA, som indkoder et bestemt protein, er sædvanligvis parallelt med mængden af proteinet, således at et sjældent protein sædvanligvis indkodes af et sjældent mRNA.

15 Mo-Cellelinjen er blevet anvendt både som udgangsmateriale til oprensning af humane CSF'er og til identifikation af tilsvarende messenger RNA'er. Selv med denne relativt gode kilde til CSF-aktivitet har det imidlertid vist sig at være ekstremt vanskeligt at isolere en tilstrækkelig mængde af 20 proteinet til strukturelle undersøgelser.

US patent nr. 4.438.032 beskriver den delvise oprensning af et CSF-protein og i generelle vendinger en rekombinant fremgangsmåde, som påstås at producere dette. Det oprensende materiale angives imidlertid at indeholde sandsynligvis 25 mindre end 40% CSF, og den påståede rekombinante fremgangsmåde er baseret på strukturoplysninger, som ikke var tilgængelige, inden den foreliggende opfindelse. GB offentliggørelsesskrift nr. 2.092.159 angår en fremgangsmåde til oprensning af et humant CSF fra hybridomceller. Det er imid-30 lertid uklart, hvilket CSF ansøgningen angår, og hybridom-cellerne blev ikke deponeret, således at dette ikke kan kontrolleres.

For at overvinde de problemer, som er indbygget i kloningen af den nucleotidsekvens, som indkoder et sjældent protein 35 såsom CSF ved de ovennævnte metoder, blev der udviklet en 5 DK 168709 B1 hidtil ukendt metode. Denne metode kræver blot, at genproduktet eller dets aktivitet kan måles pålideligt. Hensigtsmæssige CSF-assaymetoder er beskrevet i eksempel 2 nedenfor.

I et første aspekt overvinder den foreliggende opfindelse den 5 kendte tekniks problemer og tilvejebringer en let tilgængelig kilde til protein med CSF-aktivitet under anvendelse af rekombinant DNA-teknologi. I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse udnyttes en hidtil ukendt kloningsteknik, som kun kræver et assay for CSF-aktivitet, til at klone cDNA, 10 som koder for et protein med CSF-aktivitet. Således tilvejebringer den foreliggende opfindelse et cDNA, som koder for et protein med CSF-aktivitet (dvs. CSF/cDNA), en mikroorganisme eller cellelinje, der er transformeret med en rekombinant vektor, som indeholder dette CSF/cDNA, og en fremgangsmåde 15 til fremstilling af CSF-protein ved at udtrykke CSF/cDNA7et ved dyrkning af en mikroorganisme eller cellelinje. Da CSF-proteinet dannes fra en klon ifølge den foreliggende opfindelse, kan man være sikker på, at det er et protein med CSF-aktivitet. En fremgangsmåde til fremstilling og isolering af 20 en transformationsvektor, som indeholder CSF/cDNA, omfatter fremstilling af RNA fra en celle, som danner CSF, fremstilling af polyadenyleret messenger RNA fra dette RNA, fremstilling af enkeltstrenget cDNA fra messenger RNA'et, 25 omdannelse af det enkeltstrengede cDNA til dobbelt strenget cDNA, indsætning af det dobbeltstrengede cDNA i transformationsvektorer og transformation af bakterier med denne vektor til dannelse af kolonier, 30 udtagning af puljer på hver 200-500 kolonier og isolering af plasmid-DNA fra hver pulje, transfektion af plasmid DNA'et til hensigtsmæssige værtsceller til ekspression af CSF-protein, dyrkning af transficerede celler og analyse af superna-35 tanten for CSF-aktivitet, og 6 DK 168709 B1 selektion af CSF-positive puljer og screening af de kolonier, der anvendes til at udgøre puljen, til identifikation af en koloni med CSF-aktivitet.

CSF-Proteinerne ifølge opfindelsen er vækst- og differentie-5 ringshormoner for cellerne i det myeloide system. De indikeres fx til klinisk anvendelse til behandling af myelo-sup-pression, især (symptomatisk) granulocytopeni efter kemoterapeutisk eller strålingsbehandling af cancer.

Opfindelsen belyses nærmere under henvisning til tegningen, 10 hvor fig. 1 viser DNA-sekvenser, som koder for et CSF-protein ifølge den foreliggende opfindelsen. Den DNA-sekvens, som er fuldstændigt angivet, koder for én variation af humant CSF, som betegnes CSF- Thr. En anden allel koder for et identisk 15 produkt med undtagelse af, at Thr i stilling 100 er erstattet med Ile (CSF-Ile). De forandringer, som er vist oven over den humane sekvens, er forskelle i den DNA- sekvens, som koder for Gibbon-CSF (CSF fra Gibbon-aben) (CSF-G). Afledte amino-syresekvenser er også vist.

20 Fig. 2 viser skematisk fremstillingen af plasmidet pTPL ud fra plasmidet pAdD26SVpA(3).

Fig. 3 er en skematisk fortsættelse af fig. 2 og viser fremstillingen af plasmidet p91023 ud fra plasmidet pTPL.

Fig. 4 er en skematisk fortsættelse af fig. 3 og viser plas-25 midet p91023(B).

Fig. 6 viser skematisk vektoren pTALC-185R.

Fig. 7 viser skematisk vektoren AJ-14.

De nedenstående definitioner er angivet for at lette forståelsen af den foreliggende opfindelse. I det omfang, at defi-30 nitionerne afviger fra den betydning, der verserer inden for 7 DK 168709 B1 teknikken, skal nedenstående definitioner befordre den rette forståelse.

Amplifikation betegner den proces, hvorved celler danner gengentagelser inden for deres chromosomale DNA.

5 CSP er en biologisk aktivitet, som defineres ved de i nærværende beskrivelse beskrevne assays.

CSF-Protein er et protein fra en primat kilde, hvilket protein udviser CSF-aktivitet. Til nærværende opfindelses fonnål omfatter udtrykket CSF-protein modificeret CSF-protein, 10 allelle varianter af CSF-protein og CSF-protein, som indledes med en MET-rest.

Nedenfor betegner retningen mod 3'-enden af en nucleotid-sekvens.

En forstærker er en nucleotidsekvens, som kan forstærke 15 transkriptionen af et gen uafhængig af forstærkerens stilling i forhold til genet eller sekvensens orientering.

Et gen er en deoxyribonucleotidsekvens, som koder for et givet protein. Til nærværende formål omfatter et gen ikke utranslaterede tilstødende områder såsom RNA-transkriptions-20 initieringssignaler, polyadenyleringstilsætningssteder, promotorer eller forstærkere.

Ligation er processen til dannelse af en phosphordiesterbin-ding mellem 5'- og 3'-enderne på to DNA-strenge. Dette kan udføres ved adskillige velkendte enzymatiske teknikker, 25 herunder stumpendeligation ved hjælp af T4-ligase.

Orientering betegner rækkefølgen af nucleotider i en DNA-sekvens. En inverteret orientering af en DNA-sekvens er en orientering, hvor 5' til 3'-rækkefølgen af sekvensen i forhold til en anden sekvens er omvendt sammenlignet med et 30 referencepunkt i det DNA, hvorfra sekvensen blev vundet.

8 DK 168709 B1 Sådanne referencepunkter kan omfatte transkriptionsretningen af andre specificerede DNA-sekvenser i kilde- DNA'et eller replikationsinitieringsstedet i replikerbare vektorer, som indeholder sekvensen.

5 Transkription betegner syntesen af RNA fra en DNA-skabelon.

Transformation betegner forandring af en celles genotype ved optagelse i cellen af exogent DNA. Transformation kan i visse tilfælde detekteres ved en ændring i cellens fænotype. Transformerede celler kaldes transformanter. Celler før transfor-10 mation betegnes forældreceller.

Translation betegner syntesen af et polypeptid fra mRNA.

Kolonistimulerende faktor-aktivitet (CSF) kan fås fra flere cellekilder, herunder kontidioneret medium fra mononucleare perifere blodlegemer, lunge- og placentavæv, knoglemarv, urin 15 fra anæmiske patienter, serum og normale og neoplastiske celler af T-lymfocyt- og mononuclear phagocyt afstamning. Én cellelinje, som danner CSF, er Mo-cellelinjen, som er deponeret hos og tilgængelig fra ATCC under deponeringsnummeret CRL8066. Det CSF, som dannes af denne cellelinje, kendes som 20 granulocyt-makrophag CSF (eller GM-CSF) og er naturligvis et humant CSF. Én kilde til Gibbon CSF er den T-cellelinje, som betegnes UCD MLA-144, og som er deponeret hos og tilgængeligt fra ATCC under deponeringsnummeret HB 9370, deponeret den 29. september 1983.

25 For at isolere en CFS-klon i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse er der anvendt en hidtil ukendt fremgangsmåde, som kun kræver en assay-teknik for CSF-aktivitet. Først identificeres en celle, som danner CSF-aktivitet såsom T-lymfocytceller (eller andre kilder som angivet ovenfor).

30 Herefter høstes cellens mRNA. Der anvendes fortrinsvis T- lymfocytceller. I dette tilfælde adskilles det membranbundne mRNA, som indeholder mRNA'et for lymfokiner, fra frit mRNA i cellerne. Denne separering formodes at berige det indsamlede 9 DK 168709 B1 mRNA 5-10 gange med lymfokinsekvenser og nedsætter således besværet med at identificere den ønskede CSF-klon. Polyadeny-leret mRNA fremstilles derefter ved chromatografi på oligo-dT-cellulose.

5 Der fremstilles et cDNA-bibliotek fra mRNA'et under anvendelse af en vektor, som egner sig til transfektion til en vært til ekspression af et ønsket protein med CSF-aktivitet.

Enkeltstrenget cDNA fremstilles under anvendelse af standardmetoder ved hjælp af det ovenfor fremstillede mRNA. RNA/cDNA-10 Hybriden omdannes derefter til dobbeltstrenget cDNA-form. cDNA'et kan derefter indsættes i en egnet vektor.

Det foretrukne vært-vektorsystem til isolering af en CSF-klon er baseret på ekspression af CSF-cDNA'et i en hensigtsmæssig transformationsvektor. En hensigtsmæssig transformations-15 vektor kan bero på den forbigående indføring af DNA i pattedyrceller (P. Mellon, V. Parker, Y. Gluzman, T. Maniatis,

Cell. 27, 1981, s. 279-288). For at isolere de ønskede CSF-transformanter kræves det ikke, at alle celler i populationen stabilt indeholder exogene gener, der udtrykker det ønskede 20 CSF-produkt. Det er muligt forbigående af indføre exogene gener i en subpopulation af celler, således at subpolulationen udtrykker det ønskede produkt over flere dage. Da en selekterbar markør ikke kræves i transformationsvektoren til DNA-transfektions- og ekspressionssystemet ifølge opfindel-25 sen, kan det exogene DNA blive tabt efter vækst af cellerne i et tidsrum på 1-2 uger. Imidlertid viser de ønskede produkter 2-3 dage efter transfektion af egnede pattedyrceller at blive syntetiseret og kan detekteres.

Det valgte vært-vektorsystem er baseret på udviklingen af CV-30 1-abecellelinjer transformeret med et SV40 DNA-molekyle, der mangler replikationsinitieringsstedet (Y. Gluzman, Cell 23., 1981, s. 175-182). De transformerede CV-l-abeceller, som indeholder defekt SV40 DNA, betegnet COS (CV-1, mangler replikationsinitieringssted, SV40), indeholder ikke en komp-35 let kopi af SV40-genomet, men danner høje niveauer af T- 10 DK 168709 B1 antigen og tillader SV40 DNA replikation. De understøtter også effektivt replikation af SV40, som indeholder sletninger i det tidlige område, og af bakterieplasmider, som indeholder SV40's replikationsinitieringssted (R.M. Myers og R. Tjian, 5 PNAS 77, 1980. s. 6491-6495). Således udgør dette system et middel til amplificering af transficeret exogent DNA via SV40-medieret DNA-replikation for at forøge niveauet af mRNA og protein udtrykt fra det exogene DNA. Imidlertid kan der også anvendes andre tilsvarende systemer.

10 Vektorer, der anvendes til CSF-ekspression, indeholder typisk forskellige elementer såsom forstærkere, promotorer, intro-ner, polyadenyleringssteder, 3'-ikke-kodende områder og translationsaktivatorer som beskrevet nedenfor.

De her beskrevne vektorer kan indeholde forstærkere. Forstær-15 kere adskiller sig funktionelt fra promotorer, men virker tilsyneladende sammen med promotorer. Deres funktion på celleniveau er ikke særlig velopklaret, men deres unikke egenskab er evnen til at aktivere eller potentiere transkrip-tion uden at være positions- eller orienteringsafhængig.

20 Promotorer skal være ovenfor genet, medens forstærkere kan være til stede ovenfor eller 5' fra promotoren, inden i genet som en intron eller nedenfor genet mellem genet og et poly-adenyleringssted eller 3' fra polyadenyleringsstedet. Inverterede promotorer er ikke funktionelle, men det er invertere-25 de forstærkere. Forstærkere virker i cis, dvs. indvirker kun på promotorer, hvis de er til stede på samme DNA-streng. For en generel diskussion af forstærkere se Khoury et al., Cell 33, 1983, S. 313-314.

Foretrukne forstærkere til anvendelse i pattedyrceller fås 30 fra animalske vira såsom simianvirus 40, polyomavirus, bovint papillomavirus, retrovirus eller adenovirus. Ideelt skal forstærkeren være fra et virus, for hvilken værtscellen er permissiv, dvs. som normalt inficerer celler af værtstypen.

Virusforstærkere kan let fås fra almindeligt tilgængelige 35 vira. Forstærkerområderne fra flere vira, fx Rous-sarcoma- 11 DK 168709 B1 virus og simianvirus 40, er velkendte, jfr. Luciw et al.,

Cell 33, 1983, s. 705-716. Det er et spørgsmål om rutinemæssig molekylærbiologi at udtage disse områder på grundlag af offentliggjorte restriktionskort for de pågældende vira, 5 og om nødvendigt modificere stederne for at muliggøre den ønskede splejsning af forstærkeren i vektoren, jfr. fx Kaufman et al., jL Mol. Biol.. 159. 1982, s. 601-621, og Mol.

Cell Biol. 2(11), 1982, s. 1304-1319. Alternativt kan forstærkeren syntetiseres ud fra sekvensdata; størrelsen på 10 virale forstærkere (sædvanligvis mindre end 150 bp) er tilstrækkeligt lille til, at dette ville kunne gøres i praksis.

Et andet element, som skal være til stede i vektorsammensætningen, er et polyadenyleringssplejsnings-(eller tilsætnings) sted. Dette er en DNA-sekvens, som er anbragt nedenfor 15 de translaterede områder af et gen, idet der kort nedenfor dette tilføjes transkriptionsstopsignaler og adeninribonucle-otider til dannelse af en polyadeninnucleotidhale ved 3'-enden af messenger RNA'et.

Polyadenylering er vigtigt til stabilisering af messenger RNA 20 mod nedbrydning i cellen, hvilket er en begivenhed, som nedsætter niveauet af messenger RNA og således niveauet af proteinprodukt.

Eukaryote polyadenyleringssteder er velkendte. Der findes en samstemmende sekvens for eukaryote gener: hexanucleotidet 5'-25 AAUAAA-3' findes 11-30 nucleotider fra det punkt, hvor poly-adenyleringen begynder. DNA-sekvenser, der indeholder polyadenyleringssteder, kan fås fra vira i overensstemmelse med offentliggjorte rapporter. Eksempler på polyadenylerings-sekvenser kan fås fra muse-/3-globin og simian-virus 40 gener 30 for sent eller tidligt område, men virale polyadenyleringssteder er foretrukne. Da disse sekvenser er kendte, kan de syntetiseres in vitro og ligeres til vektorerne på kendt måde.

12 DK 168709 B1

Den sekvens, som adskiller polyadenyleringsstedet fra trans-lationsstopkodonen, er fortrinsvis en utranslateret DNA-sekvens såsom et upromoveret eukaryot gen. Da sådanne sekvenser og gener ikke er forsynet med promotorer, bliver de ikke 5 udtrykt. Sekvensen bør strække sig i en betydelig længde, i størrelsesordenen op til ca. 1000 baser, fra stopkodonen til polyadenyleringsstedet. Denne 37-utranslaterede sekvens medfører sædvanligvis et forøget produktudbytte. Vektoren kan terminere fra ca. 30 bp nedenfor denne sammenstemmende poly-10 adenyleringssekvens, men det foretrækkes at bevare de 3'- sekvenser, som findes nedenfor polyadenyleringsstedet i deres vildtypeomgivelser. Disse sekvenser strækker sig typisk ca. 200-600 basepar nedenfor polyadenyleringsstedet.

Tilstedeværelsen af introner i den utranslaterede transkribe-15 rede del af vektoren kan forøge produktudbyttet. Sådanne introner kan fås fra andre kilder end værtscellerne eller genkilderne. Fx medfører en hybrid intron, som omfatter et 5'-splejsningssted fra den anden intron i den fra adenovirus stammende tredelte ledersekvens og et 3'-splejsningssted fra 20 et immunoglobulingen indsat nedenfor transkriptionsstarts-stedet i den fra adenovirus stammende sene hovedpromotor, et forøget produktudbytte.

I den foretrukne udførelsesform for CSF-klonings- og ekspressionsvektoren findes der et translationsaktiverende gen. 25 Translationsaktivatorer er gener, der indkoder enten proteineller RNA-produkter, der påvirker translationen af et ønsket mRNA. Det bedste eksempel er det fra adenovirus stammende virus-forbundne (VA)-gen (VAI), der transkriberes til en kort RNA-art, som samvirker med sekvenser i det 5'-utranslaterede 30 område i de fra adenovirus stammende sene hoved- mRNA'er (Thimmappaya et al., Cell 3., 1982, s. 543). De nødvendige sekvenser til translationsaktivering ved hjælp af VA-RNA ligger inden for den fra adenovirus stammende mRNA tredelte sene 1edersekvens. Den fra adenovirus stammende tredelte 35 ledersekvens splejses sammen fra de ikke-tilstødende områder i adenovirus-genomet og findes på 5'-enden af fra adenovirus 13 DK 168709 B1 stammende sene hovedtranskriptor. VA-RNA kan samvirke til aktivering af translation af inRNA, som indeholder den tredelte ledersekvens. Således omfatter den foretrukne cDNA-klonings- og ekspressionsvektor den splejsede form af den tre-5 delte ledersekvens og adenovirus-VA-generne.

Disse vektorer kan syntetiseres ved teknikker, som er velkendte for fagfolk. Vektorernes bestanddele såsom forstærkere, promotorer og lignende kan fås fra naturlige kilder eller syntetiseres som ovenfor beskrevet. Hvis bestanddelene 10 findes i DNA, som er tilgængeligt i store mængder, fx bestanddele såsom virusfunktioner, eller hvis de kan syntetiseres, fx polyadenyleringssteder, kan der ved hensigtsmæssig anvendelse af restriktionsenzymer fås store mængder vektor ved simpelt hen at dyrke kildeorganismen, spalte dets DNA med 15 en hensigtsmæssig endonuclease, adskille DNA-fragmenterne, identificere det DNA, som indeholder det element, som har interesse, og udvinde dette. Sædvanligvis vil en transformationsvektor blive samlet i små mængder og derefter blive ligeret til en hensigtsmæssig autonomt replikerende syntese-20 vektor såsom et prokaryot plasmid eller phag. I de fleste tilfælde kan anvendes pBR322 plasmidet, jfr. Kaufman et al., op. cit.

Syntesevektorerne anvendes til at klone de ligerede transformationsvektorer på sædvanlig måde, fx ved transfektion af en 25 permissiv prokaryot organisme, replikation af syntesevektoren til et højt kopital og isolering af syntesevektoren ved cellelyse og separation af syntesevektoren fra celleresterne.

De vektorer, som indeholder cDNA fremstillet ud fra en celle, der producerer CSF-aktivitet, transficeres derefter til 30 E. coli og udplades på petriskåle med ca. 2000 kolonier pr. skål. Kolonierne løftes over på et nitrocellulosefilter, og filteret overføres til en ny plade, som beholdes som master. Efter dyrkning af disse kolonier fremstilles replika, der sammenlignes med originalen ved omhyggelig markering, således 14 DK 168709 B1 at sektioner af replikafiltrene kan identificeres med den tilsvarende del af master-pladen.

Hvert replikafilter skæres i sektioner, som indeholder et forudbestemt antal kolonier pr. sektion, fortrinsvis ca. 200-5 500 kolonier pr. sektion. Kolonierne fra hver sektion skrabes ud i medium såsom L-væske, bakterierne indsamles ved centrifugering, og plasmid-DNA'et separeres. Plasmid-DNA'et fra hver sektion transficeres i en hensigtsmæssig vært til proteinekspression. Den i nærværende sammenhæng foretrukne 10 syntesevektor er en mutant af E. coli-plasmidet pBR322, hvorfra sekvenser, som er skadelige for eukaryote celler, er blevet slettet, jfr. Kaufman et al., op. cit. Anvendelse af denne mutant imødegår ethvert behov for at slette plasmidre-sten før transfektion. Efter dyrkning af de transficerede 15 celler analyseres mediet for CSF- aktivitet. Et positivt assay viser, at en koloni, der indeholder CSF/cDNA findes på en bestemt sektion af et filter.

For at bestemme hvilken af klonerne på sektionen af det oprindelige master-filter, som indeholder CSF/cDNA, udtages 20 og dyrkes hver klon på filtersektionen. Kulturerne anbringes derefter i en matrix. Der fremstilles puljer fra hver horisontal række og vertikal søjle af matrixen. DNA-Prøver fremstilles ud fra hver i pulje samlet kultur og transficeres i værtscellerne til ekspression. Supernatanter fra disse puljer 25 analyseres for CSF-aktivitet. Én pulje fra en vertikal række og én pulje fra en horisontal række bør danne CSF-aktivitet. Den klon, som er fælles for disse puljer, vil indeholde CSF/cDNA. Hvis matrixen indeholder mere end én positiv klon, vil mere end én horisontal og vertikal række være positive. I 30 et sådant tilfælde kan yderligere screening af et lille antal kloner være nødvendig.

CSF/cDNA'et udtages fra klonerne med restriktionsenzymer og kan sekventeres ved kendte teknikker. Det vil forstås, at den her beskrevne procedure kan anvendes til opnåelse af et 35 CSF/cDNA fra en hvilken som helst kilde. Den komplette DNA- 15 DK 168709 B1 sekvens af et CSF/cDNA ifølge opfindelsen er vist i fig. 1 sammen med den forventede aminosyresekvens af det transla-terede CSF-protein.

Den DNA-sekvens, der koder for et protein med CSF-aktivitet 5 ifølge opfindelsen såsom det, der er vist i fig. 1, kan modificeres ved sædvanlige teknikker til frembringelse af variationer i det færdige CSF-protein, som stadigvæk vil have CSF-aktivitet i de i nærværende beskrivelse beskrevne assay-tests. Således kan fx én, to, tre, fire eller fem aminosyrer 10 erstattes med andre aminosyrer. I belgisk patentskrift nr. 898,016, hvortil der henvises, beskrives en sådan typisk teknik til erstatning af cystein med fx serin.

CSF/cDNA ifølge opfindelsen omfatter det modne CSF/cDNA-gen, som indledes med en ATG-kodon, og CSF/cDNA, som koder for 15 allelle variationer af CSF-protein. Én allel er vist i fig.

1. En anden allel, som er fundet af nærværende opfindere, har en thymidinrest i stilling 365 i stedet for den i fig. 1 viste cytosinrest. CSF-proteinet ifølge opfindelsen omfatter 1-methioninderivatet af CSF-protein (Met-CSF) og allelle 20 variationer af CSF-protein. Det modne CSF-protein, som er vist ved sekvensen i fig. 1, begynder med sekvensen Ala.Pro.Ala.Arg..., hvis begyndelse er angivet med en pil efter nucleotid nr. 59 i fig. 1. Met-CSF'en begynder med sekvensen Met .Ala.Pro.Ala.Arg.... Den i fig. 1 viste allelle 25 variation har en Thr ved aminosyrerest nr. 100 (begyndende ved Ala efter pilen) og kan betegnes som CSF (Thr) . En anden variation har en Ile-rest i stilling 100 og kan betegnes CSF (Ile). Oprenset CSF-protein ifølge opfindelsen udviser en specifik aktivitet på mindst 107 enheder/mg protein og for-30 trinsvis mindst 4 x 107 enheder/mg protein, når det analyseres med humane knoglemarvsceller.

Vært-vektorsystemer til ekspression af CSF kan være prokaryote eller eukaryote, men CSF's kompleksitet kan gøre, at et pattedyrekspressionssystem foretrækkes. Ekspression udføres 35 let ved transformation af prokaryote eller eukaryote celler 16 DK 168709 B1 med en hensigtsmæssig CSF-vektor. Den DNA-sekvens, som fås ved ovennævnte fremgangsmåde, kan udtrykkes direkte i pattedyrceller under kontrol af en hensigtsmæssig promotor. Heterologe promotorer, som er velkendte for fagfolk, kan anven-5 des. For at udtrykke CSF i prokaryote celler eller gærceller, må ledersekvensen (eller sekretionssekvensen) fjernes. Positionen af kodonen for N-terminalen af det modne CSF-protein er vist i fig. 1. Dette kan gøres under anvendelse af standardteknikker, som er velkendte for fagfolk. Når først den 10 ønskede CSF/cDNA-klon er vundet, anvendes kendte og hensigtsmæssige midler til udtrykkelse af CSF-proteinet, fx indsætning i en hensigtsmæssig vektor og transfektion af vektoren til en hensigtsmæssig værtscelle, udvælgelse af transformerede celler og dyrkning af disse transformanter til udtrykkelse 15 af CSF-aktivitet. Egnede værtsceller omfatter bakterier, fx E. coli. gær, pattedyrceller, fx CHO-celler, og insektceller. Det således dannede CSF-protein kan have en methioningruppe ved N-terminalen af proteinet (i nærværende sammenhæng betegnet Met-CSF). Det modne protein, der dannes af prokaryote og 20 eukaryote celler, vil i øvrigt være identisk i aminosyrese-kvens, men det eukaryote produkt kan være glycosyleret i samme eller et andet omfang end i det naturlige produkt. Forskellige metoder til fremstilling af CSF-protein ifølge opfindelsen er vist i nedenstående eksempler. Andre metoder 25 eller materialer, fx vektorer, vil være åbenlyse for fagfolk på grundlag af eksemplerne og den indledende beskrivelse.

CSF-Protein udtrykt i hensigtsmæssige prokaryote eller eukaryote celler kan isoleres ved oprensnings- og separeringsteknikker, som er kendte for fagfolk. Imidlertid angår den 30 foreliggende opfindelse som anført ovenfor også en oprensningsmetode, som gør det muligt at isolere CSF-protein fra både rekombinante og naturlige kilder med høj renhed og aktivitet.

Ved den foreliggende opfindelse overvindes problemerne med 35 den kendte teknik, og der tilvejebringes en fremgangsmåde til oprensning af protein med CSF-aktivitet. CSF-protein ifølge 17 DK 168709 B1 opfindelsen har en specifik aktivitet på mindst ca. 1 x 107 enheder pr. mg protein, fortrinsvis mindst 2 x 107 enheder pr. mg protein, især mindst ca. 4 x 107 enheder pr. mg protein, når det analyseres i humant knoglemarvs-assayet.

5 Ifølge opfindelsen omfatter en fremgangsmåde til oprensning af CSF- protein udfældning af proteinet med ammoniumsulfat ved 80%'s mætning til dannelse af en pellet, som indeholder CSF-proteinet, resuspension af pelleten i en pufret opløsning ved en pH i området fra ca. 6 til ca. 8, anbringelse af den 10 pufrede opløsning, som indeholder CSF, på en chromatografisk søjle, eluering med den pufrede opløsning, som indeholder natriumchlorid, og indsamling af fraktionerne med CSF-aktivi-tet, samling af de aktive fraktioner i pulje, anbringelse deraf på en C4-reversfasesøjle og eluering med en 0-90%'s 15 acetonitrilgradient til indsamling af den aktive fraktion.

Fig. 5 viser SDS-PAGE-analyse af det oprensede CSF-protein.

Det CSF-protein, som skal oprenses ifølge opfindelsen, kan fås fra en hvilken som helst af de naturlige kilder, som er beskrevet ovenfor som udgangskilder for den rekombinante DNA-20 proces, fx Mo-cellelinjen eller UCD MLA-144 Gibbon-cellelinjen.

Alternativt kan CSF-proteinet fremstilles under anvendelse af de rekombinante DNA-teknikker ifølge opfindelsen.

CSF'er fra en hvilken som helst kilde kan oprenses ved frem-25 gangsmåden ifølge opfindelsen. Det konditionerede medium fra en hvilken som helst kilde til CSF-protein koncentreres fortrinsvis ved ultrafiltrering til en proteinkoncentration på mindst ca. 0,1 mg protein pr. ml. Proteinet udfældes derefter ved tilsætning af ammoniumsulfat til 80%'s mætning.

30 Den resulterende pellet resuspenderes i en vandig opløsning pufret ved en pH i området fra ca. 6 til ca. 8. Eksempler på hensigtsmæssige puffere omfatter Tris-HCl, HEPES, natriumcitrat og lignende.

18 DK 168709 B1

Den pufrede opløsning fraktioneres ved søjlechromatografi. Egnede materialer til anvendelse i chromatografisøj len er octylsepharose, DEAE-ultrogel, AcA44-ultrogel, AcA-54-ultro-gel og lignende. Ét eller flere af disse materialer kan 5 anvendes sekventielt til opnåelse af højere renhed.

Fraktioner fra hver søjle indsamles og analyseres for CSF-aktivitet. De aktive fraktioner samles i pulje og fortyndes med trifluoreddikesyre (TFA), heptafluorsmørsyre (HFBA) eller lignende og anbringes på en C4-reversfasesøjle. CSF-Aktivite- 10 ten elueres derefter under anvendelse af en 0-90% acetoni-trilgradient i TFA eller HFBA, fortrinsvis ved en koncentration på henholdsvis 0,10% eller 0,15% (v/v) , afhængigt af hvilken syre blev anvendt til at anbringe de i pulje samlede fraktioner på søjlen.

15 Fraktionerne med CSF-aktivitet analyseres ved SDS-polyacryl-amidgelelektroforese (13,5% gel som beskrevet af U. Lammli, Nature 227. 1970, s. 680). Yderligere behandlinger under anvendelse af de ovennævnte chromatografisøjlematerialer kan oprense CSF-proteinet yderligere til homogenitet.

20 Oprenset CSF-protein fraktioneret ved SDS-PAGE afslørede et heterogent CSF-protein med en tilsyneladende molekylvægt i området fra ca. 15.000 til ca. 26.000 daltons. Denne tilsyneladende størrelsesheterogenitet skyldes den omfattende glyco-sylering af proteinet og er et almindeligt træk ved glycopro- 25 teiner. Fraktionering af mindre oprensede prøver fra Mo- cellekonditioneret medium ved SDS-PAGE (under ikke-reducerende betingelser) og analyse af protein elueret fra gelen afslørede tilstedeværelsen af et andet protein med CSF-aktivitet med en tilsyneladende molekylvægt på ca. 28.000-30.000.

30 CSF-Aktivitet binder og eluerer fra octylsepharose, DEAE-ultrogel og C4-reversfasesøjlen. Ca. 60% af CSF-aktiviteten binder til Con-A-sepharose (40%'s gennemløb) og kan elueres med a-methylmannosid.

19 DK 168709 B1

Molekylvægtanalyse af rekombinant CSF ved gelfiltrering i lav saltopløsning viste, at ca. 30% af aktiviteten eluerede med en skønnet molekylvægt på ca. 19.000, men 70% af materialet opførte sig som dimerer og eluerede ved en stilling svarende 5 til en molekylvægt på ca. 38.000. Hvis 1M NaCl inkorporeres i denne søjle, eluerer hele aktiviteten i en bred top ved ca.

19.000 daltons.

Det oprensede CSF er stabilt i mindst 16 timer ved inkubation ved 4°C (pH 7,4) i 4M guanidinhydrochlorid, i 10 mM EDTA, 10 10 mM 2- mercaptoethanol og i 30% (v/v) ethanol. CSF-Aktiviteten er også stabil i 0,1%'s trifluoreddikesyre (TFA) (pH 2,0) og 0,1%'s TFA plus 25% (v/v) acetonitril.

Som ovenfor anført indikeres CSF-proteinet ifølge opfindelsen til anvendelse i behandlingen af myelo-suppression såsom 15 (symptomatisk) granulocytopeni, der fx forårsages af kemoterapeutisk behandling eller strålingsbehandling af cancer. Endvidere indikeres CSF-proteinerne ifølge opfindelsen til anvendelse ved behandling af alvorlig infektion. Til en sådan anvendelse indikeres typisk en dosis på ca. 200-1000 μg pr.

20 patient. CSF-Proteinet injiceres fortrinsvis intravenøst i patienten i en egnet farmakologisk bærer. Eksempler på sådanne bærere omfatter farmakologisk saltopløsning og humant serumalbumin i saltopløsning.

Endvidere har CSF-proteinerne ifølge opfindelsen andre akti-25 viteter og anvendelser. Det har fx vist sig, at murine CSF'er aktiverer neutrofiler. Det forventes således, at primat-CSF'erne ifølge opfindelsen også vil aktivere neutrofiler. Derfor kan CSF's fysiologiske funktioner være mangfoldige. I knoglemarven kan denne lymfokin stimulere formering og dif-30 ferentiering af effektorceller til værtsforsvar, medens nye og eksisterende celler kan aktiveres i periferien. I et lokaliseret immunologisk respons kan CSF holde cirkulerende neutrofiler i eller væk fra inflammationsområder. Uhensigtsmæssig lokalisering og/eller aktivering af neutrofiler kan 20 DK 168709 B1 være involveret i patofysiologien af en række inimunmedierede lidelser såsom rheumatoid arthritis.

Opfindelsen beskrives nærmere ved nedenstående eksempler, der ikke skal anses for at begrænse opfindelsens sande omfang som 5 angivet i kravene.

I eksemplerne anvendes restriktionsendonucleaser under de betingelser og på den måde, som anbefales af forhandlerne.

Ligationsreaktioner udføres som beskrevet af Maniatis et al., supra s. 245-6, hvortil der henvises, under anvendelse af den 10 på side 246 beskrevne puffer og en DNA-koncentration på 1-100

μg/Inl ved en temperatur på 23°C til stumpendet DNA og 16°C

til "klæbeendet" DNA. Elektroforese udføres i 0,5-1,5%'s agarosegeler indeholdende 90 iriM Tris-borat, 10 mM EDTA. Alt 32 radiomærket DNA er mærket med P, uanset hvilken mærknings-15 teknik der anvendtes.

Ved udtrykket "hurtig præparation" forstås en hurtig produktion i lille målestok af bakteriophag- eller plasmid-DNA, fx som beskrevet i Maniatis et al., supra. s. 365-373.

EKSEMPEL A

20 Trin 1. Mo-Cellelinjekulturer

Mo-Celler (ATCC CRL 8066) blev rutinemæssigt dyrket i a-(6% C02) eller Iscove's (10% C02) medium indeholdende 20% føtalt kalveserum (FCS), 2 mM glutamin, 100 U/ml streptomycin og 100 fzg/ml penicillin. Cellerne bør subkultiveres hver 4-5 dage.

25 Cellerne tælles og podes i Falcon T-175-kolber i 100-150 ml medium ved en tæthed på 3-4 x 105 celler/ml. Celleantallet vil fordobles i 20%'s FCS hver 4-7 dage. Væksthastigheden er ikke konstant, og celler kan af og til tilsyneladende ophøre med at vokse og derefter gennemgå vækstspurter. Mo-Celler kan 30 dyrkes i serumfrit medium. Overlevelsen er meget bedre, når cellerne ikke vaskes, når de overføres fra FCS til serumfrit 21 DK 168709 B1 medium. Den optimale tæthed i serumfrit medium (SF) er 5 x 105 celler/ml. Cellerne vil vokse en smule (eller i det mindste opretholde et konstant antal) i 3 dage i serumfrit medium og bør derefter tilføres 20%'s FCS i mindst 4 dage.

5 Dette vækstprogram (3 dages SF, 4 dages 20%'s FCS) kan gentages hver uge, hvis der kræves SF-medium, uden at cellerne tilsyneladende tager skade i flere måneder.

Trin 2. Analyse af CSF-aktivitet A. Knoglemarvsassay 10 Der fås frisk knoglemarv, og spikelerne skilles ad ved at trække dem gennem en kanyle nr. 20, 22 og derefter 25. Der fortyndes 1:1 med steril phosphatpuffersaltopløsning (PBS) (stuetemperatur), og det fortyndede materiale lægges over Ficoll-Paque (ca. 30 ml BM-PBS over 6 ml Ficoll) . Der centri-15 fugeres ved 1500 omdr./minut i 40 minutter ved stuetemperatur. Fedt og PBS-fasen fjernes og kasseres. Fasen med ringe massefylde afpipetteres. Vaskes to gange med PBS og tælles. Cellerne udplades i RPMI (fås fra GIBCO som RPMI 1640) plus 10% HIFCS (varmeinaktiveret FCS) i 3 timer for at fjerne 20 adhærerende celler.

Udpladningsmedium (frisk fremstillet):

20% FCS

0,3% agar opløst i vand og afkølet til 40°C to gange Iscove's (1:1 v/v med agar) 25 1% P/S slutkoncentration på 100 U/ml streptomycin og 100 ^g/ml penicillin 10'4 M α-thioglycerol i to gange Iscove's fra en 10"2 M stamopløsning.

Agar afkøles til ca. 40°C og blandes med de øvrige bestandde-30 le. Blandingen afkøles i vandbad til 37-38°C og holdes ved denne temperatur.

22 DK 168709 B1

Efter 3 timer afpipetteres de ikke-adhærerende celler. Der centrifugeres og tælles. Der tilsættes 2 x 105 celler/ml udpladningsmedium, og de holdes i vandbad ved kontrolleret temperatur på 37-38°C. Prøverne tilsættes (fx medium fra 5 transficerede celler; sædvanligvis 10 μ1's prøver) til den første række af brønde i en mikrotiterplade in duplo. 100 μΐ cellesuspension tilsættes pr. brønd. Der tilsættes yderligere 50 μΐ cellesuspension til hver brønd i den første række. Der blandes grundigt og overføres 50 μΐ opløsning fra den første 10 række til den næste række, etc., og der fortsættes med 1:3 fortyndinger hen over pladen. Pladen pakkes ind i parafilm. Cellerne inkuberes i 10-14 dage ved 10% C02 og 37°C i fuldstændig fugtig atmosfære, og kolonierne tælles.

Til tælling af kolonierne tælles det totale antal kolonier, 15 som vokser i hver brønd. I hvert assay udplades adskillige brønde, uden at der inkluderes en prøve (kontrol) for at få en baggrunds-kolonitælling. Det gennemsnitlige antal kolonier, som vokser i kontrolbrøndene, trækkes fra antallet af kolonier, som findes i hver af de brønde, som indeholder 20 prøver. Én CSF-enhed er den mængde, som stimulerer dannelsen af én koloni over baggrundsniveauet pr. 105 humane knoglemarvsceller (udpladet ved 105 celler pr. ml) , når CSF-koncen-trationen er under mætning. Koncentrationen under mætning bestemmes ved fortynding og sammenligning af antallet af 25 kolonier ved forskellige fortyndinger for at finde koncentrationen lige under mætningsniveauet.

I dette assay tælles de kolonier, som indeholder granulocy-ter, monocyter eller begge typer celler. Celletyperne i kolonierne bestemmes ved at udtage kolonier og plette indivi-30 duelle celler.

B. KG-l-Celleassay KG-1-Celler (Blood, bind 56, nr. 3, 1980) dyrkes i Iscove's medium plus 10% føtalt kalveserum, som udskiftes to gange om ugen og udpodes ved hver udskiftning i 2 x 105 celler/ml.

23 DK 168709 B1

Cellerne anvendes kun til assay mellem udskiftning 30-35. Assayet er det samme som for knoglemarv som beskrevet ovenfor med undtagelse af, at KG-l-cellerne udplades i agarblandingen ved 4 x 103 celler/ml.

5 Antallet af kolonier, som vokser i hver brønd, bestemmes, og baggrundtællingen trækkes fra som i det ovenfor beskrevne knoglemarvsassay. Én KG-1 CSF-enhed/ml er den CSF-koncentration, som stimulerer halvdelen af maksimalantallet (mætning) KG-1-kolonier til vækst. Maksimalantallet opnås ved at inkor-10 porere et mætningsniveau af CSF i flere brønde.

Trin 3. Konstruktion af vektoren p91023(B)

Transformationsvektoren var pAdD26SVpA(3) beskrevet i Kaufman et al., Mol. Cell Biol. 2 (11), 1982, s. 1304-1319. Den har den i fig. 2 viste struktur. Kort fortalt indeholder dette 15 plasmid et muse-dihydrofolatreduktase (DHFR)-cDNA-gen, som er under transkriptionskontrol af adenovirus 2's (Ad2) sene hovedpromotor. Et 5'-splejsningssted er inkluderet i adeno-virus-DNA'et, og et 3'-splejsningssted, som stammer fra et immunoglobulingen, findes mellem den Ad2 sene hovedpromotor 20 og den DHFR-kodende sekvens. Det tidlige polyadenyleringssted fra SV40 findes nedenfor den DHFR-kodende sekvens. Den proka-ryotafledte sektion af pAdD26SVpA(3) stammer fra pSVOd (P. Mellon, V. Parker, Y. Gluzman og T. Maniatis, Cell 27, 1981, s. 279-288) og indeholder ikke de pBR322-sekvenser, som vides 25 at inhibere replikation i pattedyrceller (M. Lusky og M. Botchan, Nature (London) 293. 1981, s. 79-81).

pAdD26SVpA(3) omdannes til plasmidet pCVSVL2 som vist i fig.

2. pAdD26SVpA(3) omdannes til plasmidet pAdD26SVpA(3) (d) ved sletning af et af de to PstI-steder i pAdD26SVpA(3). Dette 30 udføres ved partiel spaltning med PstI (under anvendelse af et underskud af enzymaktivitet, således at der fås en subpopulation af lineariserede plasmider, hvor kun ét PstI-sted er spaltet), efterfulgt af behandling med Klenow-fragmentet, ligation til recirkularisering af plasmidet, transformation 24 DK 168709 B1 af EL. coli og screening for sletning af PstI-stedet, som findes 3' for SV40-polyadenyleringssekvensen.

De fra adenovirus stammende tredelte leder- og virusforbundne gener (VA-gener) blev indsat i pAdD26SVpA(3) (d) som vist i 5 fig. 2. Først blev pAdD26SVpA(3) (d) spaltet med PVuII til dannelse af et lineært molekyle, som er åbnet i 3'-delen af det første af de tre elementer, som omfatter den tredelte ledersekvens. Derefter blev pJAW 43 (Zain et al., Cell 16. 1979, s. 851) spaltet med Xhol. behandlet med Klenow-fragmen-10 tet, spaltet med PyuII, og det 140 basepar lange fragment, som indeholdt den anden og en del af den tredje ledersekvens, blev isoleret ved elektroforese på en acrylamidgel (6% i Tris-boratpuffer; Maniatis et al., supra). Det 140 bp lange fragment blev derefter ligeret til det med PyuII spaltede 15 pAdD26SVpA(3) (d). Ligationsproduktet blev anvendt til transformation af EL. coli til tetracyclinresistens, og kolonier blev screenede ved Grunstein-Hogness-proceduren under anven-32 delse af en P-mærket probe, som hybridiserer til det 140 basepar lange fragment. Der blev fremstillet DNA fra positivt 20 hybridiserende kolonier for at teste, om det rekonstruerede PyuII- sted var 5' eller 3' af det indsatte 140 basepar lange DNA, som var specifikt for den anden og tredje fra adenovirus stammende sene ledersekvens. Den korrekte orientering af PvuII-stedet er på 5'-siden af den 140 basepar lange indsæt-25 ning. Dette plasmid betegnes pTPL i fig. 2.

Avail D-fragmentet fra SV40, som indeholder SV40 forstærkersekvensen, blev vundet ved spaltning af SV40 DNA med Avail. enderne blev gjort stumpe med Klenow-fragmentet af polymerase I, Xhol-linkere blev ligeret til fragmenterne, der blev 30 spaltet med Xhol for at åbne Xhol-stedet. og det fjerde største (D)-fragment blev isoleret ved gelelektroforese.

Dette fragment blev derefter ligeret til det med Xhol-soalte-de pTPL, hvilket gav plasmidet pCVSVL2-TPL. Orienteringen af SV40 D-fragmentet i pCVSVL2-TPL var en sådan, at den SV40 35 sene promotor er i samme orientering som den fra adenovirus stammende sene hovedpromotor.

25 DK 168709 B1

Til indføring af de fra adenovirus stammende virusforbundne (VA)-gener i pCVSVL2-TPL konstrueres først et plasmid pBR322, som indeholder adenovirus type 2 Hindi11 B-fragmentet. Adenovirus type 2 DNA spaltes med Hindlll, og B-fragmentet iso-5 leres efter gelelektroforese. Dette fragment indsættes derefter i pBR322, som forinden er blevet spaltet med Hindlll. Efter transformation af L. coli til ampicillinresistens, screenes rekombinanter for indsætning af Hindlll B-fragmentet, og den indsatte orientering bestemmes ved restriktions-10 enzymspaltning. pBR322-Ad Hindlll B indeholder adenovirus type 2 Hindlll B-fragmentet i den i fig. 3 viste orientering.

Som vist i fig. 3 fås VA-generne bekvemt fra plasmidet pBR322-Ad Hindlll B ved spaltning med Hpal, tilføjelse af EcoRI-linkere og spaltning med EcoRI og isolering af det 1,4 15 kb lange fragment. Fragmentet, som har EcoRI-klæbeender, ligeres derefter i EcoRI-stedet på pTPL (der forinden er blevet spaltet med EcoRI). Efter transformation af EL. coli HB101 og selektion for tetracyclinresistens screenes kolonier ved filterhybridisering til en DNA-probe, som er specifik for 20 VA-generne. Der fremstilles DNA fra positivt hybridiserende kloner, hvilket DNA karakteriseres ved restriktionsendonucle-asespaltning. Det resulterende plasmid betegnes p91023.

De to EcoRI-steder i p9l023 fjernes. p91023 spaltes helt med EcoRI. hvilket genererer to DNA-fragmenter, et med en længde 25 på ca. 7 Kb og et andet med en længde på ca. 1,3 kb, som indeholder VA-generne. Enderne på begge fragmenter udfyldes med Klenow-fragmentet af polymerase I, hvorefter begge fragmenter, dvs. 1,3 kb og 7 kb, på ny ligeres sammen. Der identificeres et plasmid p91023(A), som indeholder VA-generne, og 30 som svarer til p9l023, men hvor de to EcoRI- steder er slettet, ved Grunstein-Hogness-screening med VA-genfragmentet og ved konventionel restriktionsstedanalyse.

Derefter fjernes det enkelte Pstl-sted i p9l023(A) og erstattes med et EcoRI-sted. p91023(A) spaltes fuldstændigt med 35 PstI. og derefter behandles det med Klenow-fragmentet af 26 DK 168709 B1 polymerase I for at danne stumpe ender. EcoRI-linkere ligeres til det stumpendede Pstl-sted på p91023(A). Det lineære p91023 (A) , hvortil der i det stumpendede Pstl-sted er føjet EcoRI-linkere, adskilles fra uligerede linkere og spaltes 5 fuldstændigt med EcoRI. hvorefter det religeres. Der isoleres et plasmid p91023 (B), som identificeres til at have en tilsvarende struktur som p91023(A), men hvor et EcoRI-sted er anbragt i det tidligere Pstl-sted.

Trin 4. Fremstilling af et cDNA-bibliotek 10 Mo-Celler blev induceret i 16-20 timer med PHA og PMA for at forøge deres lymfokindannelse. Cellerne blev udpladet ved 5 x 105 celler/ml i Iscove's medium med 20% FCS, 0,3% (v/v)

PHA og 5 ng/ml TPA. Cellerne blev indsamlet ved centrifugering. De pelleterede celler blev resuspenderet i 20 ml is-15 koldt hypotonisk lysepuffer (RSB-puffer: 0,01M Tris-HCl, pH

7,4, 0,01M KC1, 0,0015M MgCl2, 1 rø/ml cycloheximid, 50 enheder/ml RNAsin og 5 iriM dithiothreitol). Cellerne lodes kvælde på is i 5 minutter og blev derefter sprængt mekanisk med 10 slag af en tætsluttende glashomogenisator. Homogenatet 20 blev centrifugeret ved lav hastighed (2000 omdr./minut i en Beckman J6-centrifuge) for at fjerne kerner og ikke-lyserede celler. Supematanten blev holdt på is, medens kemepelleten blev resuspenderet i 10 ml RSB og på ny centrifugeret ved lav hastighed. Denne anden supernatant blev samlet i pulje med 25 den første, og de kombinerede supernatanter blev centrifugeret ved lav hastighed for at fjerne resterende kontamination med kerner og ikke-lyserede celler. Supematanten fra denne centrifugering blev bragt op på 0,15M KC1 ved tilsætning af 2M KC1, hvorefter den blev centrifugeret ved høj hastighed 30 (25.000 omdr./minut, Beckman SW28-rotor i 30 minutter) for at pelletere membranerne. Membranpelleten blev omhyggeligt vasket med koldt RSB, hvorefter den blev resuspenderet i 12 ml RSB, som indeholde 2M saccharose og 1,15M KC1. Der blev fremstillet to diskontinuerlige gradienter i Beckman SW41-35 centrifugerør ved anbringelse af 6 ml membranopløsning i 2M saccharose over 2 ml RSB med 2,5M saccharose og 0,15M KC1.

' - 27 DK 168709 B1 Rørene blev fyldt til randen ved anbringelse af 2,5 ml RSB indeholdende 1,3M saccharose og 0,15M KC1 ovenover. Disse gradienter blev centrifugeret i 4 timer ved 27.000 omdr./minut (Beckman SW4l-rotor) ved 4°C. Membranfasen (ved 5 grænsefladen mellem 2,OM og 1,3M saccharose) blev forsigtigt fjernet fra siden under anvendelse af en kanyle nr. 18 og sprøjte. Membranfraktionerne fra de to gradienter blev samlet i pulje og fortyndet med ét volumen destilleret vand, hvorefter de blev bragt på 0,5% Triton® X-100 og 0,5% natriumde-10 oxycholat, hvorefter de blev ekstraheret med et lige så stort volumen phenol. Den vandige fase blev reekstraheret med en l:l-blanding af phenol og chloroform og derefter med et lige så stort volumen chloroform. Til slut blev membranbundet RNA udfældet ved tilsætning af NaCl op til 0,25M og 2,5 volumen 15 kold ethanol og inkuberet natten over ved- 20°C. Det udfældede RNA blevet indsamlet ved centrifugering (4000 omdr./minut i 10 minutter i Beckman J-6-centrifugen) og blev resuspende-ret i 1 ml destilleret vand. Pra 2 x 109 celler fås ca. 1 mg RNA. Messenger-RNA'et (mRNA) blev isoleret ud fra det totale 20 RNA ved chromatografi på en 0,5 ml oligo-dT-cellulosesøjle. Kort fortalt blev RNA'et opvarmet til 70°C i 5 minutter, hurtigt afkølet på is og derefter fortyndet fem gange med bindingspuffer (0,5M LiCl, 0,01M Tris-HCl, pH 7,4, 0,002M EDTA og 0,1% SDS) ved stuetemperatur. RNA'et i bindingspuf-25 feren blev passeret gennem oligo dT-cellulosesøj len ækvili-breret med bindingspuffer ved stuetemperatur. Søjlen blev vasket med 5 ml bindingspuffer og derefter med 5 μΐ 0,15M LiCl, 0,01M Tris-HCl, pH 7,4, 0,002M EDTA og 0,1% SDS. mRNA'et blev elueret med 2 ml 0,01M Tris-HCl, pH 7,4, 0,002M 30 EDTA og 0,1% SDS. mRNA'et blev udfældet ved tilsætning af

NaCl op til 0,25M og 2,5 volumen ethanol og inkubation natten over ved -20°C. Det udfældede mRNA blev indsamlet ved centrifugering (30.000 omdr./minut i 30 minutter i en Beckman SW55-rotor). Væsken blev forsigtigt fjernet fra røret, og mRNA-35 pelleten blev resuspenderet i 50 ml vand. Det resuspenderede mRNA blev bragt op på 0,25M NaCl og derefter ekstraheret i 1 time med en l:l-blanding af phenol og chloroform og derefter tre gange med chloroform. mRNA'et blev udfældet ved tilsæt- 28 DK 168709 B1 ning af 2,5 volumen ethanol. Blandingen blev frosset og optøet flere gange i et tøris/ethanolbad og derefter centrifugeret i 15 minutter i en Eppendorf-centrifuge. Væsken blev forsigtigt fjernet fra røret, og mRNA-pelleten blev resuspen-5 deret i 20 μΐ destilleret vand. Det endelige udbytte var ca. 30 μg mRNA.

Enkeltstrenget cDNA blev fremstillet ved standardmetoder.

Kort fortalt blev 10 μg membran-mRNA fortyndet i en 100 μΐ

cDNA-syntesereaktionsblanding indeholdende 300 rnM Tris, pH

10 8,4, 140 mM KC1, 10 mM MgCl2/ 10 mM B-mercaptoethanol, 500 μΜ hver af dATP, dGTP, dCTP og dTTP, 5 μg oligo-dT (phosphoryle- ret og med en gennemsnitsstørrelse på 12-18) som primer, 150 32

μΟΐ af P dCTP (400 Ci/millimol) og 20 enheder af ribonucle-aseinhibitoren RNAsin. Reaktionen blev startet ved tilsætning 15 af 100 enheder revers transkriptase og inkuberet i 30 minutter ved 42°C. Reaktionen blev standset ved tilsætning af EDTA til 40 mM, og RNA'et blev nedbrudt ved inkubation i 20 minutter ved 65°C i 0,2M NaOH. Basen blev neutraliseret ved tilsætning af 20 μΐ 2M Tris, pH 7,4. Reaktionsblandingen blev 20 derefter ekstraheret med phenol/chloroform, tilbageekstra-heret med 50 μΐ 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA (TE), og de vandige faser blev samlet i pulje. Enkeltstrenget cDNA blev omdannet til dobbeltstrenget cDNA ved inkubation i 12 timer ved 16°C med 40 enheder af Klenow-fragmentet af DNA-polymera-25 se I i en 100 μΐ’β reaktionsblanding indeholdende 50 mM

kaliumphosphat, pH 7,4, 2,3 mM DTT, 2-mercaptoethanol, 10 mM

MgCl2, 150 μιηοΐ af hver af de fire deoxynucleotidtriphospha-32 ter og 25 μΟΐ P dCTP. Reaktionen blev standset ved ekstraktion med phenol/chloroform, og de ikke-inkorporerede triphos-30 phater blev fjernet ved at lede den vandige fase gennem 1 ml's Sephadex® G-50-søjle. De ekskluderede fraktioner blev samlet i pulje og ethanoludfældet.

cDNA-Pelleten blev vasket med kold ethanol og derefter resus-penderet i 200 μΐ 20 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, 80 μιηοΐ S-35 adenosylmethionin og 300 enheder EcoRI-methylase i 60 minutter ved 37°C. Reaktionen blev standset ved ekstraktion med 29 DK 168709 B1 phenol/chloroform, og det methylerede cDNA blev indsamlet ved ethanoludfældning.

cDNA-Pelleten blev vasket med 70%'s ethanol og derefter resuspenderet i 200 /il Sl-puffer (Maniatis et al.) og inkube-5 ret med 200 enheder Sl-nuclease ved 30°C i 30 minutter.

Reaktionen blev standset ved ekstraktion med phenol/chloroform, og cDNA'et blev indsamlet ved ethanoludfældning.

Det dobbeltstrengede cDNA blev gjort stumpendet ved inkubation i 100 /il 20 mM Tris, pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM 2 mercap-10 toethanol og 500 /imol af alle de fire deoxynucleotidtriphos-phater med 25 enheder Klenow-fragment ved stuetemperatur i 30 minutter. Reaktionen blev standset ved ekstraktion med phenol /chloroform, og cDNA' et blev indsamlet ved ethanoludfældning.

15 cDNA'et blev ligeret i 50 μΐ T4-ligasepuffer (Maniatis et al.) med 500 pmol RI-linkere, som forhandles af New England Biolabs (sekvens: pCGGAATTCCG) under anvendelse af 2000 enheder T4-ligase natten over ved 16°C. Reaktionen blev standset ved inkubation ved 70°C i 20 minutter og blev der-20 efter fortyndet til 300 μΐ, således at den endelige saltkoncentration var 0,1M NaCl, 10 mM, MgCl2, 50 mM Tris-Cl, pH

7,4. cDNA'et blev derefter spaltet i 2 minutter ved 37°C med 700 enheder EcoRI. Reaktionen blev standset ved ekstraktion med phenol/chloroform, og cDNA'et blev indsamlet ved ethanol-25 udfældning. Pelleten blev resuspenderet i 50 /il TE og lodes passere gennem en 5 ml's Cl-4B-søjle. De ekskluderede fraktioner blev samlet i pulje og ethanoludfældet. Det udfældede cDNA blev underkastet elektroforese gennem en 1%'s saccharo-segel i Tris-acetatpuf f er i nærværelse af 1 /ig/ml ethidium-30 bromid. cDNA i størrelsesområdet 500-4000 basepar blev isoleret fra gelen under anvendelse af glaspulver-standardproceduren. Det eluerede cDNA blev ekstraheret med phenol/chloroform, og ethanoludfældet, og pelleten blev efter en ethanol-vask resuspenderet i 30 /il TE. Slutudbyttet var 100-500 ng 35 cDNA.

30 DK 168709 B1

Fremstillingen af ekspressionsvektoren p9l023(B) er beskrevet ovenfor. Den med EcoRI spaltede og phosphatasebehandlede vektor (500 ng) blev natten over ved 16°C ligeret med 100 ng cDNA i en 100 μ1's reaktionsblanding (standard T4-ligasereak-5 tionsblanding). Reaktionen blev standset ved ekstraktion med phenol/chloroform, og derefter blev de ligerede cDNA indsamlet ved ethanoludfældning efter tilsætning af 5 μg tRNA som bærer.

Det ethanoludfældede DNA blev vasket med 70%'s ethanol og 10 derefter resuspenderet i 100 μΐ TE. Dette DNA blev anvendt i 4 μ1's alikvoter til transformation af EL coli MC1061 (4 μΐ i en 100 μΐ'ε transformationsblanding). Hver af de 25 transformationer blev spredt ud på en 150 mm petri-skål med 1% agar, L-væske og 10 μg/ml tetracyclin (Tet-plade) og inkuberet 15 natten over ved 37°C. Der voksede ca. 2000 kolonier på hver plade, hvilket gav et samlet antal på ca. 50.000 kolonier. Efter at have nået ca. 0,5 mm i diameter, blev kolonierne overført til nitrocelluloseplader (137 mm) ved forsigtigt at anbringe et tørt filter på pladens overflade og derefter tage 20 filteret af i en jævn bevægelse. Alle kolonierne på pladen blev overført til filteret, som derefter blev anbragt (med kolonisiden opad) på en frisk Tet-plade. Efter at have ladet kolonierne vokse i flere timer, blev der fremstillet et replika fra hver af filtrene ved at anbringe et friskt be-25 fugtet filter nøjagtigt hen over det originale filter, presse dem sammen, skille dem ad og derefter returnere hvert filter til en frisk Tet-plade og inkubere pladerne natten over ved 37°C. Hvert replika blev omhyggeligt mærket, således at det kunne sammenlignes med det originale filter.

30 Trin 5. Fremstilling af plasmid DNA-pulje

Hvert af de 25 replikafiltre blev derefter forsigtigt delt i 8 lige store stykker under anvendelse af en skalpel, og orienteringen af hvert af disse 8 stykker i forhold til det originale master-filter blev noteret. Kolonierne blev skrabet 35 fra hvert stykke i 10 ml L-væske. Bakterierne blev indsamlet 31 DK 168709 B1 ved centrifugering (3000 omdr./minut, 10 minutter, Beckman J- 6-centrifuge), resuspenderet i 0,6 ml 25%'s saccharose, 50M Tris-HCl, pH 8,0 og omdannet til protoplaster ved tilsætning af 0,12 ml af 5 mg/ml lysozym og inkubering på is i 5-10 5 minutter. Protoplasterne blev derefter inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter efterfulgt af tilsætning af 0,125 ml 0,5M EDTA og lyse ved tilsætning af 0,12 ml 10% SDS i 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. Lysatet blev blandet nænsomt og inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter, hvorefter protein og chro-10 mosomal DNA blev udfældet ved tilsætning af 0,3 ml 5M NaCl. Efter inkubation på is i 15 minutter blev lysatet centrifugeret koldt i en Eppendorf-centrifuge i 30 minutter. Superna-tanten blev forsigtigt fjernet, hvilket efterlod en viskos DNA-proteinpellet, som blev fortyndet ved tilsætning af 0,5 15 ml vand. Blandingen blev ekstraheret med 1 ml phenol, faserne blev adskilt ved centrifugering (10K i 10 minutter i Sorvall SS-34-rotoren), og den vandige fase blev overført til et frisk rør. DNA blev udfældet ved tilsætning af 0,5 ml 5M NaCl og 7,5 ml kold ethanol og frysning af blandingen adskillige 20 gange i et tøris/ethanolbad. Bundfaldet blev indsamlet ved centrifugering (10K, 15 minutter i Sorvall SS-34-rotoren), resuspenderet i 0,3 ml af 0,3M natriumacetat og genudfældet (i et Eppendorf- rør) ved tilsætning af 1 ml ethanol. Efter 10-15 minutter i et tøris/ethanolbad, blev det udfældede DNA 25 indsamlet ved centrifugering (5 minutter i Eppendorf- centri-fugen), og den endelige pellet blev resuspenderet i 100 μΐ sterilt TE (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA). Ud fra en typisk præparation fås 5-10 μg plasmid DNA. Hvert præparat indeholdt DNA fra 200-500 kolonier på det oprindelige filter. Et samlet 30 antal af 200 DNA-prøver blev fremstillet ud fra de 25 filtre.

Trin 6. Isolering af CSF-klonen

Hver af de i trin 5 fremstillede DNA-prøver blev hver for sig transficeret i M6 COS-abeceller som beskrevet nedenfor.

M6-Cellerne blev rutinemæssigt dyrket i Dulbecco's modifice-35 rede Eagle's medium (DME, forhandles af Gibco), som indeholdt 32 DK 168709 B1 10% varmeinaktiveret fatalt kalveserum (HIFCS), delt to gange om ugen ved 1:6-fortynding. 24 timer efter opdeling i 1:6 er M6-cellerne parat til transfektion. 24 timer før transfektion podes 1,2 x 108 M6-celler (fordelt 1:6) i en "Cell Factory" 5 (forhandles af Nunc) i 1,5 liter DME + 10% HIFCS. Umiddelbart før transfektion aspireres plader og vaskes to gange med 7 ml serumfrit (SF) DME. DNA'et opløses i 0,1M Tris (pH 7,3) og sættes til DME-mediet indeholdende 2 mM glutamin, 100 ^g/ml streptomycin, 100 U/ml penicillin og 0,25 mg/ml DEAE dextran, 10 hvilket giver 4 ml sammen med Tris-DNA-opløsningen. De 4 ml medium indeholdende opløst DNA sættes til pladen, som indeholder M6 COS-celler og inkuberes i 12 timer.

Efter inkubation vaskes cellerne én eller to gange med 7 ml SF DME. Derefter tilsættes 5 ml DME med 10%'s HIFCS, 100 U/ml 15 penicillin, 100 /jg/ml streptomycin, 2 mM glutamin og 0,1 mM chlorquin, og cellerne blev inkuberet i 2 1/2 time.

Efter 2 1/2 time blev cellerne vasket én gang med SF DME, og der tilsattes 10 ml DME og 10%'s HIFCS/plade. Efter 30 timer blev mediet aspireret, og der tilsattes 4 ml/plade DME og 20 10%'s HIFCS: Cellerne blev høstet ved at fjerne det konditio nerede medium efter 24-26 timers yderligere inkubation.

Det konditionerede medium fra hver transfektion blev analyseret for CSF-aktivitet under anvendelse af KG-l-assayet. For hver prøve, der var positiv for CSF-aktivitet, skulle klonen 25 på det oprindelige master-filter, som var ansvarlig for CSF-aktiviteten, identificeres. For én transfektion, der var positiv for CSF-aktivitet, blev fx alle kolonierne fra den sektion på den originale master-filter, hvorfra transfek-tions-DNA-prøven stammede, udtaget. Ca. 320 af disse kolonier 30 blev anbragt i 3 ml L-væske plus 10 /ig/ml tetracyclin. Kulturerne blev dyrket natten over. 320 kolonier blev anbragt i en 18 x 18 matrix. Der blev fremstillet puljer fra hver horisontal og vertikal række på matrixen (36 puljer i alt) (bemærk: den sidste horisontale række havde kun 14 kloner). DNA-Prøver 35 blev fremstillet ud fra hver i pulje samlet kultur og blev 33 DK 168709 B1 derefter anvendt til at transficere COS- celler. Supernatan-terne fra disse transfektioner blev analyseret under anvendelse af KG-1-koloniassayet. To positive kloner vandtes fra dette transfektionsforsøg: én i en vertikal række, den anden 5 i en horisontal række. Den kultur, som var fælles for disse puljer, indeholdt CSF-klonen.

Tolv individuelle kloner fra denne kultur blev isoleret, og en DNA- minipræparation blev fremstillet ud fra 10 ml's kulturer i L-væske som beskrevet ovenfor. 10 μΐ'β prøver af 10 DNA fra disse præparationer blev spaltet med EcoRI, og de resulterende DNA-fragmenter blev analyseret ved agarosegelel-ektroforese. Ni af de tolv kloner havde en fælles indsætning på ca. 750 basepar. DNA'et fra fire af disse kloner og de resterende tre kloner blev indført i M6 COS-celler som be-15 skrevet ovenfor. Supernatanterne fra disse transfektioner blev analyseret under anvendelse af KG-l-assayet samt knogle-marvsassayet for CSF. De fire kloner, som hver indeholdt de 750 basepar lange fragment, foranledigede alle M6 COS-cellernes ekspression af høje niveauer af CSF-aktivitet som detek-20 teret i hvert assay, hvorimod de andre tre kloner ikke gjorde det. Det kodende område for CSF må derfor være lokaliseret inden for den 750 basepar lange indsætning.

Den DNA-sekvens, der koder for CSF, blev fjernet fra transformationsvektoren i den positive klon ved spaltning med 25 EcoRI og sekventeret under anvendelse af standard dideoxyse-kventeringsmetoder efter subkloning af fragmenter i M13-vektorer til opnåelse af den i fig. 1 viste sekvens. Plasmi-det p91023(B) - CSF, som først viste sig at foranledige CSF-ekspression i COS-celler, har fået betegnelsen pCSF-1. Dette 30 plasmid er den 2. juli, 1984 blevet deponeret i American Type Culture Collection i en stamme af EL. coli MC1061 under deponeringsnummeret ATCC 39754.

34 DK 168709 B1

Trin 7. Ekspression af CSF-protein M6 COS-abeceller transformeret med vektoren p91023(B) indeholdende CSF/cDNA som isoleret i trin 6 dyrkes som beskrevet i trin 6 til dannelse af CSF-protein i dyrkningsmediet.

5 1 mg af dette DNA (pCSF-1) blev opløst i 1 ml 0,1M Tris, pH

7,3 og sat til 600 ml DME indeholdende 2 mM glutamin, 100 U/ml streptomycin, 100 μg/ml penicillin (P/S) og 0,25 mg/ml DEAE-dextran (molekylvægt 500.000 fra Pharmacia). De 600 ml DNA/DEAE-dextranopløsning sættes til M6 COS-cellerne i "Cell 10 Factory" og inkuberes ved 37°C i 12 timer. Efter inkubation vaskes cellerne én gang med 900 ml SF DME og inkuberes derefter 2 1/2 time med 600 ml DME indeholdende 0,1 mM chlor-quin, 10%'s HIFCS, 2 mM glutamin og P/S. Efter aspirering af det chlorquinholdige medium vaskes cellerne med SF DME og 15 tilføres 1500 ml DME med 10%'s HIFCS. Efter 30 timer vaskes cellerne med SF DME, mediet erstattes med 800 ml SF DME, og de transficerede celler lades konditionere mediet i 24 timer ved 37°C. Det konditionerede medium lades aspirere og erstattes med yderligere 800 ml SF DME. Cellerne lades konditionere 20 dette medium i 24 timer, hvorefter det konditionerede medium indsamles. Så hurtigt som muligt efter høst koncentreres den konditionerede medieprøve 20 gange ved ultrafiltrering mider tryk under anvendelse af Amicon's 2,5 liters kammer med YN5-membranen (molekylvægtgrænse 5000).

25 Trin 8. Oprensning af rekombinant CSF

200 ml koncentreret konditioneret medium (ud fra 4 liter udgangsmateriale, jfr. trin 7) blev bragt op på 30%'s mætning med ammoniumsulfat ved tilsætning af fast ammoniumsulfat, og det udfældede protein blev fjernet ved centrifugering. Super-30 natanten blev bragt op på 80%'s mætning med ammoniumsulfat ved tilsætning af yderligere fast ammoniumsulfat, og det udfældede protein blev indsamlet ved centrifugering. Pelleten blev resuspenderet i 5 ml 20 mM natriumcitrat, pH 6,1, indeholdende 1M NaCl. Det opløste protein blev anbragt på en 35 DK 168709 B1 1,6 x 100 cm's søjle af ultrogel AcA54 ækvilibreret i den samme puffer. CSF-Aktiviteten eluerede fra søjlen med en tilsyneladende molekylvægt på 19 kdaltons eller efter ca. 90 ml. Det er blevet iagttaget, at hvis gelfiltreringen udføres 5 ved lav ionstyrke, eluerer CSF-aktiviteten fra søjlen i 2 positioner med tilsyneladende molekylvægte på ca. 19 kdaltons og 38 kdaltons, hvilket antyder, at GM-CSF let kan danne dimerer. De aktive fraktioner blev samlet i pulje og bragt op på 0,15% TFA (ved tilsætning af 10% TFA) og anbragt på en 10 Vydac C4-søjle (0,46 x 25 cm) ækvilibreret i 0,1% TFA. Søjlen blev elueret med lineær gradient af 0-90% acetonitril (1 ml/minut, 340 ml i alt) i 0,1% TFA. CSF-Aktiviteten eluerede mellem 39 og 43% acetonitril (fraktion 16-20). En 20 μΐ's prøve af fraktion 19 blev analyseret ved SDS-polyacrylamid-15 gelelektroforese (13,5% gel som beskrevet af Lammli, Nature 227. 1970, s. 680). Der blev iagttaget et enkelt bredt proteinbånd med en tilsyneladende molekylvægt på 18-26 kdaltons. Det temmelig brede størrelsesområde for CSF er et fælles træk ved glycoproteiner og formodes at afspejle en omfattende, men 20 variabel tilsætning af carbonhydrat. Protein fra fraktion 19 blev underkastet Edman-nedbrydning under anvendelse af Applied Biosystems gasfase-mikrosekventeringsapparat. Ud fra ca. 20 /ig anbragt protein fik man sekvensen af de første 16 aminosyrer (A-P-A-R-S-P-S-P-S-T-Q-P-W-E-H). Det høje udbytte 25 af denne enkelte proteinsekvens pegede kraftigt i retning af, at CSF-proteinet i fraktion 19 var blevet oprenset til homogenitet. Bioassay viste, at fraktion 19 havde 3 x 107 enheder 280 pr. A absorbansenheder. Da typiske proteiner i vandig opløsning udviser et ekstinktionskoefficientområde på 0,8-1,2 280 30 A absorbansenheder pr. mg protein, er den specifikke aktivitet af det oprensede CSF mellem ca. 1 x 107 og ca.

4 x 107 enheder/mg, når det analyseres ved det humane knogle-marvscelleassay.

36 DK 168709 B1

EKSEMPEL B

Kloning af Gibbon-CSF

Trin 1. Fremstilling af mRNA ud fra Gibbon-T-celler

En prøve af Gibbon-T-cellelinjen med betegnelsen UCD-MLA 144 5 blev dyrket i flere uger i RPMI 1640 (forhandles af Gibco) og 20% føtalt kalveserum (FCS), indtil man fik et samlet antal celler på 1 x 109. Cellerne blev induceret til at danne høje niveauer af CSF ved aktivering i 24 timer i nærværelse af 10 ng pr. ml 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) i RPMI 10 1640 plus 1% føtalt kalveserum. Cellerne blev høstet ved centrifugering (1000 omdr./minut i 5 minutter), vasket én gang med phosphatpufret saltopløsning (PBS) og derefter indsamlet ved centrifugering.

Membranbundet polysom (MBP) mRNA blev fremstillet ud fra 15 disse celler ved samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel A til fremstilling af Mo-celle RNA.

Trin 2. Enkeltstrenget cDNA-reaktion 6 /ig MBP mRNA (fra trin 1) blev fortyndet i en 50 μ1's cDNA-syntesereaktionsblanding (jfr. eksempel A, trin 4), og reak-20 tionen blev startet ved tilsætning af revers transkriptase. Efter inkubation i 30 minutter ved 42°C blev reaktionen standset ved tilsætning af EDTA op til 50 mM og fortyndet med vand til 100 μΐ. Blandingen blev ekstraheret med phenol/chlo-roform og yderligere ekstraheret med chloroform. cDNA/RNA-25 Hybriderne blev skilt fra ikke-inkorporerede triphosphater ved chromatografi på en 2 ml's Sepharose® CL-4B-søjle. De ekskluderede fraktioner blev samlet i pulje, og hybriderne blev indsamlet ved ethanoludfældninger. Slutudbyttet var 570 ng.

Trin 3. Dobbeltstrenget cDNA-reaktion 37 DK 168709 B1

Enkeltstrenget cDNA-pelleten (trin 2) blev resuspenderet i 50 ml vand, og dobbeltstrengssyntese blev udført i en standardreaktionsblanding med EL. coli-polymerase I, EL. coli-ligase og 5 RNAse H. Reaktionsblandingen blev inkuberet natten over ved 16°C og derefter i 1 time ved 37°C. Reaktionen blev standset ved tilsætning af EDTA, og reaktionsblandingen blev ekstraheret med phenol/chloroform. cDNA'et blev skilt fra ikke-inkorporerede triphosphater ved chromatografi på en 10 Cepharose® CL-4B-søjle, de ekskluderede fraktioner blev samlet i pulje og cDNA'et blev indsamlet ved ethanoludfældning.

Trin 4. Fremstilling af rekombinant cDNA

cDNA-Pelleten (trin 3) blev resuspenderet i 75 μΐ vand.

15 Homopolymere C "haler" blev tilføjet til enderne af cDNA'et ved tilsætning af 10 μΐ cDNA-opløsning til en 25 μΐ’ε standardreaktionsblanding indeholdende terminal transferase, og inkubation ved 30°C i 5 minutter. Reaktionen blev standset ved tilsætning af EDTA op til 40 mM og varme inaktivering ved 20 68°C i 10 minutter. 10 ng af dette med hale forsynet cDNA

blev sammenføjet med 50 ng af med G-hale forsynet pBR322 (forhandles af NEN) i 10 μΐ 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA og 100 mM NaCl. Sammenføjningsreaktionsblandingen blev inkuberet i 10 minutter ved 68°C og derefter i 2 timer ved 57°C.

25 Trin 5. Bakterietransformation E. coli-stamme MC1061 blev dyrket i L-væske, afkølet på is, høstet ved centrifugering og behandlet med CaCl2 for at præparere dem til transformation. 5 μΐ af cDNA-sammenføjningsreaktionsblandingen blev derefter inkuberet med 200 μΐ af de 30 med CaCl2 behandlede bakterier. Der foretoges 15 sådanne transformationer, idet alt det sammenføjede cDNA blev opbrugt, og cellerne blev udpladet på 15 cm, 1% agar L-væske- 38 DK 168709 B1 plader indeholdende 10 ^g/ml tetracyclin. Der voksede ca.

1000 kolonier på hver plade.

Trin 6. Replikaudpladning 10.000 kolonier fra transformationen blev hver især udtaget 5 med en tandstikker, overført til friske plader (500 pr. plade i et gitterværk) og dyrket natten over ved 37°C. Kolonierne blev derefter løftet fra hver plade ved at presse et tørt nitrocellulosefilter fast nedover pladens overflade. Der blev fremstillet to replikafiltre fra hver af disse master-filtre. 10 Masterfiltrene blev opbevaret ved 4°C, og replikafiltrene blev behandlet med base og bagt for at blive præpareret til hybridisering.

32

Trin 7. Fremstilling af P-mærkede hybridisenngsprober cDNA-Indsætningen fra pCSF-1 blev isoleret ved spaltning med 15 restriktionsenzymet EcoRI og elektroforese i en agarosegel med Tris- acetat og ethidiumbromid. Det bånd, som indeholder cDNA-fragmentet, blev udskåret fra gelen og oprenset ved glaspulverteknikken.

300 ng af cDNA-fragmentet sattes derefter til 1 μΐ af 10 x T4 20 DNA- polymerasepuffer (0,33M Tris-acetat, pH 7,9, 0,66M

kaliumacetat, 0,1M magnesiumacetat og 10 mM dithiothreitol) og 3 enheder T4 DNA- polymerase (New England Biolabs) og fortyndet med vand til 10 μΐ. Efter inkubation i 5-10 minutter ved 37°C blev denne blanding kombineret med 1 /il 10 x T4 25 DNA-polymerasepuffer, 1 /il af en 2 DM opløsning af hver af dCTP, dTTP, dGTP, 10 μΐ 32PdATP (10 μα/μΐ, 3000 Ci/milli-mol), og 3 enheder T4 DNA-polymerase. Reaktionsblandingen blev inkuberet i 20 minutter ved 37°C. Derefter tilsattes 1 μΐ 2 mM dATP, og reaktionsblandingen blev inkuberet i yderli-30 gere 10 minutter ved 37°C.

De ikke-inkorporerede triphosphater blev skilt fra det mærkede cDNA ved chromatografi på en Sephadex® GlOO-søjle. Der 39 DK 168709 B1 blev fremstillet en anden probe ud fra et syntetisk oligonuc- leotid med sekvensen ATC TGG CTG CAC AG, som er komplementær med det CSF-kodende områdes aminoterminal. Dette oligonucleo- 32 tid blev mærket med P dATP ved dets 5'-ende under anvendel-5 se af en standardpolynucleotidkinasereaktion.

Trin 8. Isolering af CSF cDNA-kloner I en standardhybridiserings-screeningsprocedure hybridiserede ca. 45 kloner med det med T4 mærkede pCSF-l cDNA. Af disse hybridiserede ca. 20 også til den mærkede oligonucleotidpro-10 be. Én af disse kloners kodende område er blevet sekventeret, og sekvensdataene afslørede flere basesubstitutioner, hvoraf nogle medfører aminosyreforskelle i det udtrykte protein. Disse forskelle er vist i fig. l ovenover DNA-sekvensen af det i eksempel A klonede humane CSF-gen.

15 EKSEMPEL C

Kloning af CSF ud fra perifert blodlymfocyt mRNA

Trin 1. Fremstilling af mRNA ud fra perifere blodlymfocyter

Perifere blodlymfocyter blev fremstillet ud fra fire plasma-ferese-biprodukter (forhandles af Røde Kors) ved fraktione-20 ring på en Ficoll-Hypaque-gradient. Ved ringe tæthed i RPMI-1640 i nærværelse af 5% føtalt kalveserum, 0,17% phytohæma-glutinin og 10 ng/ml phorbol-myristatacetat (PMA) ved en tæthed på 2 x 106 celler/ml fik man i alt 6 x 109 celler. Cellerne blev høstet ved centrifugering (1000 omdr./minut i 5 25 minutter), vasket én gang med phosphatpufret saltopløsning (PBS) og derefter indsamlet ved centrifugering. Der blev fremstillet cytoplasma-RNA ved en skånsom lyseprocedure, i hvilken cellerne blev resuspenderet i 50 ml kold Triton®-lysepuffer (140 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris, pH 8,6, 30 0,5% Triton® X-100) med 10 mM dithiothreitol (DTT) og 50 enheder/ml RNAsin (forhandles af Biotec). Dette lysat blev 40 DK 168709 B1 delt i to lige store dele, og hver del blev anbragt over en 10 ml's pude af lysepuffer indeholdende 20% saccharose. Cellekernerne blev fjernet ved kold centrifugering (4°C, 400 omdr. /minut i 5 minutter) . Den øverste fase (cytoplasmaeks-5 trakt) blev forsigtigt fjernet, og der tilsattes natriumdode-cylsulfat (SDS) til en slutkoncentration på 1%. Denne opløsning blev ekstraheret to gange med et lige så stort volumen phenol/chloroform (1:1 blanding), og RNA'et blev udfældet ved tilsætning af 2,5 volumen kold ethanol. Det udfældede RNA 10 blev indsamlet ved centrifugering (4000 omdr./minut i 15 minutter) og resuspenderet i 0,01M Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,25M NaCl (TE-puffer plus 0,25M NaCl) og genudfældet ved tilsætning af 2,5 volumen kold ethanol. Derefter blev RNA'et indsamlet ved centrifugering og resuspenderet i 5 ml vand.

15 Slutudbyttet var 7,5 mg.

Messenger-RNA blev isoleret fra det totale cytoplasma-RNA ved selektion på oligo-dT-cellulose. 2,5 mg totalt RNA blev opvarmet til 65°C i 5 minutter. Der tilsattes NaCl op til 0,5M, og RNA'et lodes afkøle til stuetemperatur. Dette RNA 20 blev ledt gennem en 1 ml's søjle af oligo-dT-cellulose ækvi-libreret i TE + 0,5M NaCl (bindingspuffer). Ubundet RNA blev fjernet ved grundig vask af søjlen med bindingspuffer. Bundet messenger-RNA blev elueret med 3 ml vand og udfældet ved tilsætning af 0,2 ml 4M NaCl og 2,5 volumen koldt ethanol.

25 Det udfældede mRNA blev indsamlet ved centrifugering (30 minutter ved 25.000 omdr./minut). Slutpelleten (ca. 100 ^g) blev resuspenderet i 50 μΐ vand.

Trin 2. Enkeltstrenget cDNA-reaktion 20 jug PBL mRNA blev fortyndet i en 50 μΐ' s cDNA-syntesereak-30 tionsblanding, der indeholdt 100 mM Tris, pH 8,4, 140 mM KC1, 10 mM MgCl2, 10 mM 2-mercaptoethanol, 400 μΜ af hver af dATP, dGTP, dCTP og dTTP, 5 μg oligo-dT (gennemsnitsstørrelse 12- 18) som primer, 25 μΰχ 22PdCTP (400 μ^/ιηχίΐχπιοί) og 20 enheder af ribonucleaseinhibitoren RNAsin. Reaktionen blev 35 startet ved tilsætning af 60 enheder af revers transkriptase 41 DK 168709 B1 ved 37°C, og reaktionsblandingen blev inkuberet i 30 minutter ved 42°C. Reaktionen blev standset ved tilsætning af EDTA op til 40 mM og ekstraheret med et lige så stort volumen vandmættet phenol. Phenolfasen blev tilbageekstraheret med 50 μΐ 5 TE-puffer. De vandige faser blev samlet i pulje. cDNA/RNA-Hybriderne blev skilt fra ikke-inkorporerede triphosphater ved at lede den i pulje samlede vandige fase gennem en 5 ml's Sepharose® CL-4B-søjle (forhandles af Sigma), der var ækvili-breret med TE. Fraktionerne, som blev ekskluderet fra søjlen, 10 blev samlet i pulje, bragt op på 250 mM NaCl, og nuclein-syrerne blev udfældet ved tilsætning af 2,5 volumen koldt ethanol. Hybriderne blev indsamlet ved centrifugering i 30 minutter ved 40.000 omdr./minut. Slutpelleten (2,5 ^g cDNA) blev resuspenderet i 50 μΐ vand.

15 Trin 3. Dobbeltstrenget cDNA-reaktion

Dobbeltstrenget cDNA blev syntetiseret ved den kombinerede virkning af enzymerne EL. coli-DNA-polymerase I, EL. coli-DNA-ligase og EL. coli-RNAse H. Reaktionsblandingen (50 μΐ) indeholdt 20 mM Tris, pH 8,0, 4 mM MgCl2, 1,2 mM EDTA, 25 μΜ NAD, 20 10 μΜ af hver af dATP, dGTP, dCTP og dTTP og 50 μΟΐ 32PdCTP

(3000 Ci/millimol). Reaktionen blev udført ved tilsætning af 3 enheder DNA-polymerase I, 0,5 enheder DNA-ligase og 0,75 enheder RNAse H og inkubation ved 16°C i 18 timer og derefter ved 37°C i 1 time, hvorefter reaktionen blev standset ved 25 tilsætning af EDTA op til 40 mM og ekstraheret med et lige så stort volumen phenol. Phenolfasen blev tilbageekstraheret med 50 μΐ TE, de vandige faser blev samlet i pulje, og cDNA'et blev skilt fra de ikke-inkorporerede triphosphater ved chro-matografi på en Sepharose® CL-4B-søjle som beskrevet ovenfor 30 for den enkeltstrengede. Baseret på inkorporering af P blev det enkeltstrengede cDNA kvantitativt omdannet til dobbeltstrenget form.

Trin 4. Fremstilling af rekombinant cDNA

42 DK 168709 B1

Homopolymere C "haler" blev føjet til enderne af cDNA'et ved nænsom opvarmning af 400 ng cDNA i en 50 μ1’s reaktionsblanding, som indeholdt 1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM CoCl2 og 9 5 enheder terminal deoxynucleotidyltransferase ved 30°C i 5 minutter. Reaktionen blev standset ved tilsætning af EDTA op til 40 mM og opvarmning til 68°C i 10 minutter. 200 ng af dette med hale forsynede cDNA blev sammenføjet med 500 ng med G-hale forsynet pAT153 (forhandles af Amersham) i 100 μΐ 10 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA og 100 mM NaCl. Sammenføjnings-reaktionen blev udført ved 57°C i 2 timer efter 5 minutters præinkubation ved 68°C.

Trin 5. Bakterietransformation cDNA-Sammenføjningsreaktionsproduktet blev anvendt direkte 15 til transformation af Eh. coli-stamme MC1061. En frisk koloni af bakterieceller blev anvendt til at inokulere 50 ml L-væske og blev dyrket i flere timer, indtil den optiske densitet ved 500 nm var 0,25. Cellerne blev afkølet på is og høstet ved centrifugering (2000 omdr./minut i 10 minutter). Pelleten 20 blev resuspenderet i 10 ml koldt 0,1M CaCl2 og lodes henstå på is i 10 minutter. Cellerne blev indsamlet ved centrifugering (2000 omdr./minut i 5 minutter) og resuspenderet i 2,5 ml 0,1M CaCl2. 10 μΐ af cDNA-sammenføjningsreaktionsblandingen blev derefter inkuberet med 200 μΐ CaCl2-behandlede 25 bakterier i 30 minutter på is og derefter i 2 minutter ved 37°C efterfulgt af tilsætning af 0,8 ml L-væske og en slutin-kubation i 30 minutter ved 37°C.

Der blev udført 20 af disse transformationer, idet alt det sammenføjede cDNA blev anvendt. Hver transf omationsblanding 30 blev udpladet på 1% agar L-væskeplader (15 cm i diameter) , som indeholdt 10 μg/ml tetracyclin. Fra de 20 transformationer blev der fremstillet i alt 20 sådanne plader og inkuberet natten over ved 37°C. I gennemsnit voksede ca. 1500 bakterie-kolonier på hver plade, hvilket gav i alt 30.000 kloner.

Trin 6. Replikaudpladning 43 DK 168709 B1

De oprindelige kolonier, der voksede på hver plade, blev overført til 137 mm's nitrocellulosefiltre ved, at man pressede et tørt filter ovenpå kolonierne og løftede dem fra 5 pladen. Der blev fremstillet to identiske replika fra hvert originalt filter ved standardreplikaudpladningsmetoder, hvor hvert orginalt filter forsigtigt blev anbragt med kolonisiden opad på en steril kvadrat af filterpapir (Whatman 3 MM), der hvilede på et kvadratisk stykke glas. Et nyt forinden be-10 fugtet nitrocellulosefilter blev forsigtigt anbragt ovenpå master-filteret, dækket med et andet sterilt kvadratisk stykke filterpapir, og hele sandwichen blev derefter presset fast sammen ved hjælp af et andet stykke glas. De sammenlagte filtre blev nummereret, og gennem dem blev der asymmetrisk 15 prikket tre nåletynde huller, således at de på ny kan anbringes nøjagtigt over hinanden. Replikaet blev derefter fjernet fra masteren og anbragt med kolonisiden opad på en ny tetracyclinholdig L-væskeagarplade. Et andet replika blev med det samme fremstillet på identisk måde. Hvert master-filter 20 blev returneret til en plade, og alle pladerne blev inkuberet ved 37°C i flere timer, indtil bakteriekolonierne var blevet ca. 1 mm i diameter. De originale master-filtre blev opbevaret ved 4°C, og replikaene blev præpareret til hybridise-ring som beskrevet nedenfor.

25 Trin 7. Præparering af filtre til hybridisering

Hvert replikafilter (trin 6) blev anbragt med kolonisiden opad på filterpapir (Whatman 3 MM), der var gennemvædet med 0,5M NaOH, 1,5M NaCl i 7 minutter. Filtrene blev overført til neutraliserings-filterpapirer, gennemvædet med 1M Tris, pH 30 7,5, 1,5M NaCl i 2 minutter og derefter overført til et andet sæt neutraliseringsfiltre i 5-10 minutter. Derefter blev filtrene anbragt på filtre, der var gennemvædet med SSC-puffer (0,015M natriumcitrat, 0,15M NaCl, pH 7,4) i 5 minutter, lufttørret og bagt i vakuum ved 80°C i 1-2 timer.

Trin 8. Isolering af CSF cDNA-kloner 44 DK 168709 B1

Duplikatfiltre blev forsynet med prober bestående af den radioaktivt mærkede pCSF-1 cDNA-indsætning, der var fremstillet som beskrevet i eksempel B. Ca. 20 kolonier hybridi-5 serede med cDNA'et. 12 af disse blev udtaget fra masterfilteret og dyrket natten over i L-væske til yderligere analyse. Restriktionsenzymspaltninger (PstI) af DNA-prøver (hurtig præparation) ud fra disse kloner viste, at 3 havde næsten fuld længde. Én af disse blev sekventeret. Sekvensen 10 af denne klons CSF-kodende område var identisk med den tilsvarende sekvens af pCSF-1 (dvs. den har et T ved stilling 365-CSF(Ile)).

EKSEMPEL D

Oprensning af CSF fra en Mo-cellelinje 15 Mo-Serumfrit konditioneret medium (40 liter) blev inkuberet ved 55°C i 30 minutter for at inaktivere det HTLV-II-virus, som er forbundet med cellelinjen. Dette medium blev koncentreret ved ultrafiltrering under tryk under anvendelse af en Pellicon-kasette med membran PTGC (1393,50 cm2), som har en 20 molekylvægtgrænse på 10.000. Dette protein blev yderligere koncentreret ved ammoniumsulfatudfældning (80%'s mætning).

Den endelige proteinpellet (800 mg) blev resuspenderet i 100 ml 20 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan-hydrochlorid (Tris-HC1), pH 7,4, og dialyseret mod samme puffer (3 gange med 25 hver gang 4 liters skift). Det dialyserede protein blev anbragt på en 2,5 x 10 cm's søjle af DEAE (diethylamino-ethyl)-ultrogel, der var ækvilibreret i den samme puffer. Søjlen blev vasket med 800 ml 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, hvorefter CSF-aktiviteten blev elueret med 800 ml 20 mM Tris-HCl, 30 pH 7,4, som indeholdt 0,12M NaCl. 10 ml's fraktioner blev indsamlet og analyseret for CSF. De aktive fraktioner (3) blev samlet i pulje og koncentreret 6 gange (til 5 ml) ved ultrafiltrering under tryk (Amicon YM5-membran, molekylvægt- 45 DK 168709 B1 grænse 5000). Den koncentrerede prøve fra DEAE-søjlen blev anbragt på en 1,6 x 100 cm's AcA44-ultrogelsøjle (en acryl-amidagarose-ultrogel med en fraktionering på 10-130 kdalton), som var ækvilibreret i 20 iriM N-2-hydroxyethylpiperazin-N-2-5 ethansulfonsyre (HEPES), pH 7,4, 50 mM NaCl og 0,01% poly-ethylenglycol (PEG-8000). CSF-Aktivitet blev elueret fra søjlen med en tilsyneladende molekylvægt på 30 kdalton. De aktive fraktioner blev samlet i pulje og bragt op på 0,15% (v/v) trifluoreddikesyre (TFA) ved tilsætning af 10% TFA og 10 anbragt på en Vydac C4-reversfasesøjle (1 x 25 cm). Søjlen blev elueret med en lineær gradient af 0-90% acetonitril i 0,1% TFA (v/v) ved 4 ml/minut (1000 ml i alt). CSF-Aktivite-ten eluerede ved ca. 47% (v/v) acetonitril. De i pulje samlede aktive fraktioner blev bragt op på 0,05% (v/v) hepta-15 fluorsmørsyre (HFBA) ved tilsætning af et halvt volumen 0,15% (v/v) HFBA og anbragt på en Vydac C4-søjle (0,46 x 25 cm), der var ækvilibreret i 0,15% (v/v) HFBA. Søjlen blev elueret med en lineær gradient af 0-90% (v/v) acetonitril i 0,15% (v/v) HFBA ved 1 ml/minut (i alt 340 ml). CSF-Aktiviteten 20 eluerede ved ca. 53% (v/v) acetonitril. Fraktionerne 37-44 (1 ml hver) viste sig at være aktive. 0,15 ml af fraktion 40 blev koncentreret fire gange (under anvendelse af "SAVANT Speed Vac Concentrator"), og der tilsattes 40 /il 2 x SDS-gelprøvepuffer (0,125M Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 20% glycerol 25 og 0,004% bromphenolblåt). Disse prøver blev kogt i 2 minutter og anbragt på en 13,5%'s SDS-gel (jfr. fig. 2), U.

Laemmli, Nature 227, 1970, s. 680. Det blev bestemt, at fraktion (nr. 40) havde 110.000 knoglemarvs-CSF-enheder/ml. Dette svarer til ca. 3,0 x 107 enheder pr. A280-absorbansen-30 hed. Da typiske proteiner har ekstinktionskoefficienter, som er i området mellem 0,8 og 1,2 A280-enheder pr. mg, har det oprensede CSF en specifik aktivitet i området ca. 1 x 107 -ca. 4 x 107 enheder pr. mg i knoglemarvsassayet. En 1 pg's prøve af oprenset GM-CSF blev underkastet Edman-nedbrydning 35 under anvendelse af et Applied Biosystems gasfase-mikrose- kventeringsapparat. Sekvensen af resterne 3-5 blev bestemt at være Ala-Arg-Ser.

46 DK 168709 B1

EKSEMPEL E

Cotransformation og amplifikation af CSF-sekvens i CH0-celler

Plasmidet p91023(B)-CSF blev indført i CHO DHFR-deficiente celler DUKX-B11 (Chasin & Urlaub, PNAS 77. 1980, s. 4216) ved 5 protoplastfusion som beskrevet i Sandri-Goldin et al., Mol. Cell. Bio. 1, 1981, s. 743-752. Væksten og opretholdelsen af CHO-cellerne er beskrevet i Kaufman & Sharp, Mol. Bio.

150. 1981, s. 601-621. Til protoplastfusion blev p91023(B)-CSF-1 indført i EL. coli HB101, og bakterierne blev dyrket i 10 50 ml m9-salte indeholdende 0,5% casaminosyrer, 0,4% glucose, 0,012% MgS04, 5 μg/ml thiamin og 10 ^g/ml tetracyclin til en absorbans på 0,6 ved 600 nm. Der tilsattes chloramphenicol til 250 ^g/ml, og kulturen blev inkuberet ved 37°C i yderligere 16 timer for at amplificere plasmidkopitallet. Cellerne 15 blev centrifugeret ved 3000 x g i 10 minutter ved 4°C og suspenderet i 2,5 ml afkølet 20% saccharose i 50 mM Tris-Cl, pH 8,0. Der tilsattes lysozym (0,5 ml af en 5 mg/ml opløsning i 0,25M Tris-Cl, pH 8,0), og blandingen blev holdt på is i 5 minutter. Der tilsattes EDTA (1 ml 0,25M EDTA, pH 8,0) i 20 yderligere 5 minutter på is, og derefter tilsattes langsomt 1,0 ml 0,05M Tris-Cl, pH 8,0. Suspensionen blev inkuberet i 15 minutter ved 37°C, indtil bakterierne blev omdannet til protoplaster. Suspensionen blev derefter langsomt fortyndet med 20 ml foropvarmet medium indeholdende 10% saccharose og 25 10 mM MgCl2 og holdt ved 37°C i 15 minutter. Protoplastopløs- ningen (ca. 109/ml) sattes til CHO, DHFR- deficiente DUKX-Bll-celler i en 6-brøndsplade (ca. 1 x 106 celler/brønd) i en mængde på ca. 1-2 x 104 protoplaster/celle, og protoplasterne blev pelleteret på cellerne ved centrifugering ved 2000 30 omdr./minut i 8 minutter i en svingende mikrotiterplade-rotor på en IEC model K-centrifuge. Efter centrifugering blev supernatanten fjernet ved aspiration. En 2 ml's mængde poly-ethylenglycolopløsning (50 g PEO - 1450, (Baker Chem. Co.) i 50 ml medium) sattes til hver brønd i 6-brøndspladen. Celler-35 ne blev på ny centrifugeret ved 2000 omdr./minut i 90 sekunder, polyethylenglycolopløsningen blev fjernet, og pladerne 47 DK 168709 B1 blev vasket tre gange med 4 ml medium pr. brønd. Cellerne blev derefter trypsiniserede, suspenderet i 10 ml medium indeholdende 10% føtalt kalveserum og centrifugeret i et konisk rør ved 500 omdr./minut i en klinisk centrifuge.

5 Pelleterede celler fra 3 brønde blev samlet i pulje og udpla-det i en 10 cm's vævskulturskål. Frisk medium indeholdende 100 jug/ml kanamycin, thymidin, adenoxin, deoxyadenosin, penicillin og streptomycin og 10%'s dialyseret føtalt kalveserum sattes til hver plade. Kanamycinet tilsattes for at 10 forhindre vækst af eventuelle bakterier, der havde undgået omdannelse til protoplaster.

To dage senere blev cellerne subkultiveret 1:15 i a-medier med 10%'s dialyseret føtalt kalveserum, penicillin og streptomycin, men som manglede nucleosider. Cellerne tilførtes 15 igen det samme selektive medium (der manglede nucleosider) efter 4-5 dage.

Der opstod kolonier 10-12 dage efter subkultivering i selektivt medium. Der er fulgt to procedurer for methotrexat (MTX)-udvælgelse og amplifikation. I den første procedure 20 blev enkelte uafhængige klonede transformanter isoleret på basis af DHFR-ekspression, og derefter blev hver klon opformeret under betingelser til amplifikation af kopitallet af det fremmede DNA, dvs. vækst i stigende koncentrationer af methotrexat. I den anden procedure blev en pulje af flere 25 uafhængige transformanter isoleret på basis af DHFR-ekspression og opformeret sammen under betingelser til amplifikation af det fremmede DNA, dvs. vækst i stigende koncentrationer af methotrexat. Derefter blev individuelle kloner isoleret fra den masseselekterede population og analyseret for GM-CSF-30 ekspression. De kloner, der udviste de højeste niveauer af GM-CSF-ekspression, blev på ny dyrket under betingelser til yderligere amplifikation af det fremmede DNA (dvs. vækst i stigende koncentration af methotrexat i dyrkningsmediet).

I ét forsøg blev syv DHFR+-transformanter samlet i pulje i a-35 medium, som manglede nucleosider. Disse celler blev derefter 48 DK 168709 B1 dyrket i trinvis stigende koncentrationer af MTX begyndende med 0,02 μπι og derefter til 0,1, 0,5 og 2,0 μιη MTX. Ved analyse for GM-CSF-aktivitet i KG-l-celleassayet dannede disse celler 3000-12.000 enheder pr. ml. Den udvalgte popula-5 tion blev klonet i 0,5 μπι MTX og i 2,0 μπι MTX. Kloner, som vandtes i 0,5 μιη MTX (010, D2 og B6), blev derefter selekteret for vækst i 2,0 μπι MTX. Ved analyse for GM-CSF-aktivitet i KG-l-celleassayet dannede de klonede cellelinjer 15.000-300.000 enheder pr. ml GM-CSF-aktivitet. Det ifølge 10 dette eksempel fremstillede GM-CSF har den aminosyresekvens, som er angivet for CSF-Thr i fig. 1.

EKSEMPEL F

Ekspression af GM-CSF i JL_ coli GM-CSF blev udtrykt i JL_ coli fra vektoren pTALC-185R, der i 15 diagramf om er vist i fig. 6. Den GM-CSF-kodende sekvens begynder med den syntetiske sekvens ATG CCA CCA CCT CCT TCT CCA TCT CCA TCT ACT, som bestemmer de indledende 11 amino-syrerester i modent GM-CSF. Resten af den GM-CSF-kodende sekvens i pTALC- 185R er identisk med pCSF-1, nucleotideme 20 97-447, efterfulgt af sekvensen TAR TAR TAG. Umiddelbart efter den tredobbelte terminator findes pUC-18-polylinkeren. Tetracyclinresistensgenet fra pBR322 er blevet indsat i modsat orientering i forhold til CSF-genet og 100 baser neden for pUC-18-polylinkeren. Tetracyclinresistensgenet bærer sin 25 egen promotor. Fortsættende i retning mod uret findes derefter genet for jS-lactamase efterfulgt af pUC-18's (ColEl) replikationsinitieringssted.

Det sidste strukturelle træk ved plasmidet, før man kommer tilbage til CSF-sekvensen, er PL-promotoren. Denne promotor 30 er i det væsentlige som beskrevet af A. Skatzman og M. Rosenberg (i Molecular Cloning. a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, s. 419). CSF-Ekspression styres af 49 DK 168709 B1 PL-promotoren efter varmeinduktion i en hensigtsmæssig E. coli-værtsstamme.

Den forældrestamme, som blev anvendt til alle stammekonstruktionerne, var W3110 lacI°L8 (R. Brent og M. Ptashne, PNAS 78, 5 1981, S. 4204-4208).

Et fragment af X-DNA (X-nucleotiderne 34499-38214) blev integreret i chromosomet af W3110 lacI°L8 ved lacZ's placering. Integrationen blev udført under anvendelse af en integrationsvektor bestående af pBR325-sekvenser, der bar 10 generne for chloramphenicol- og ampicillinresistens samt pBR322's replikationsinitieringssted (F. Bolivar, Gene 4, 1978, s. 121-136). λ-DNA-Fragmentet indsættes i lacZ-genet, der i sig selv findes på plasmidet som et fragment, som strækker sig fra BstEil-stedet i LacI til et Tthilll-sted 15 neden for lacZ.

Integration af X-DNA'et i den chromosomale kopi af lacZ blev opnået ved homolog rekombination, og der blev fundet lac+, ampicillinfølsomme, chloramphenicolresistente kolonier. Der blev screenet for en anden rekombinationsbegivenhed, som 20 medførte fjernelse af alle ekstra plasmidsekvenser, men som efterlod X-DNA-fragmentet integreret, på MacConkey-lactose- plader. Efter den anden rekombinationsbegivenhed blev den indledende lac+, amps, camR-fænotype forandret til en lac , amps, cams-fænotype. Den resulterende stamme blev kaldt GL400 25 og var XR ved 3 0°C og Xs ved 42°C. Denne fænotype viser 857 eksistensen af en funktionel chromosomkopi af Cl -allelen.

GL400 blev Ion’ ved PL-transduktion fra et lysat dyrket på stamme SG20252 (lacAu!69. araAl39. rpsl. ΙοηΔίΟΟ::Tnl0). TnlO blev fjernet ved screening for Tets på selektive medier (S.

30 Maloy, W. Nunn, J. Bacteriol. 145. 1981, s. 1110-1112).

Den endelige værtsstamme kaldtes GI413 (lacI°L8, LacZA (XCI, REX, N), ΙοηΔίΟΟ).

50 DK 168709 B1 pTALC-185R blev transformeret til GI413. En overnatskultur af denne stamme blev dyrket ved 30°C i 5 ml's induktionsmedium indeholdende 7 μg/ml‘1 tetracyclin. Induktionsmediet indeholder pr. liter: 5 20 g casaminosyrer

6 g Na2HP047H20 3 g KH2P04 0,5 g NaCI

1 g NH4CI

10 1% glycerol 2 mg Bl-vitamin 2 mg CaCl2»2H20 0,2 g MgCl2·6H20

Dette medium (25 ml) indeholdende 7 /ig/ml"1 tetracyclin blev 15 inokuleret med 125 μΐ af overnatskulturen og rystet ved 30°C

1 vandbad, indtil kulturen nåede en densitet på A55q0,5. Derefter blev den hurtigt overført til et 40°C varmt vandbad og rystet i yderligere 2 timer for at forårsage syntese af GM-CSF. Celler blev høstet og kontrolleret for deres indhold 20 af CSF ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Under disse betingelser akkumulerer GM-CSF til ca. 5% af celleproteinet.

EKSEMPEL G

Ekspression af GM-CSF i Saccharomyces cerevisiae A. Vektorkonstruktion 25 Der blev konstrueret et plasmid, som indeholdt genet for et enzym i uracilbiosyntesevejen (URA3) som selektionsgen og 2 μ's replikationsinitieringssted. Dette plasmid stammede fra Ylp5 (Botstein et al., Gene 8., 1979, s. 17-24) med tilføjelse af et fragment, som indeholdt gærplasmidet 2 μ's replika- 30 tionsinitieringssted.

DK 168709 B1

SI

B. Isolering af genet for glyceraldehydphosphat-dehy drogenase (GPDH)

To gener for GPDH er blevet isoleret fra gær (Holland og Holland, Journal of Biological Chemistry 255. 1980, s. 2596-5 2605). En oligonucleotidprobe, som var syntetiseret fra den publicerede sekvens, blev anvendt til at isolere et GPDH-gen fra et plasmidbibliotek af gærgenom-DNA ved standardmetoder. Et plasmid, som indeholdt hele GAP491-genet, er tidligere blevet deponeret (ATCC nr. 39777).

10 C. Fremstilling af glyceraldehydphosphat-dehydrogena- sepromotoren til heterolog genekspression

Der blev konstrueret et plasmid, som tager højde for den naturlige afstand mellem GPDH-promotoren og starten af det ønskede heterologe strukturgen. Dette blev udført ved at 15 indføre et KpnI-sted umiddelbart ved siden af den indledende methioninkodon på GPDH-strukturgenet. Promotor-"kassetten" blev derefter indsat i gærekspressionsvektoren YOpl.

D. Isolering af genet for a-faktor

Et gen for α-faktor-parringspheromonet er blevet isoleret fra 20 gær (Kurjan og Herskowitz, Cell 30. 1982, s. 933-943). En oligonucleotidprobe syntetiseret fra denne sekvens blev anvendt til at isolere genet fra et plasmidbibliotek af gærgenom-DNA ved standardmetoder.

E. Fremstilling af CSF-ekspressionsplasmidet 25 Ud fra de ovenfor beskrevne elementer og det humane CSF-gen blev der konstrueret en ekspressionvektor (AJ14, fig. 7) ved standardmetoder. I denne vektor er CSF's naturlige ledersekvens blevet fjernet, og den sekvens, der koder for modent CSF, er blevet indsat ved siden af α-faktorens præ-pro-se-30 kvens. Sammenføjningerne mellem GPDH-promotoren, a-faktorens præ-pro-sekvens og den modne CSF- sekvens er præciseret 52 DK 168709 B1 nedenfor og er blevet bekræftet ved dideoxynucleotidsekvente-

ring til at være AAATÅAACAAAATG. CGTTTTCCTTCA......AAA AGA

GAG GCG GAA GCT.GCA CCC GCC CGC TCG...

P. Ekspression af GM-CSF

5 Plasmidet AJ14 blev transformeret til en stamme af Saccharo-myces cerevisiae. Cellerne blev dyrket til dannelse af CSF.

Under henvisning til ovenstående beskrivelse kan opfindelsen endvidere beskrives i følgende punkter.

1. Fremgangsmåde til fremstilling og isolering af en transit) formationsvektor, som indeholder CSF/cDNA, hvor RNA fremstilles ud fra en celle, som danner CSF, polyadenyleret mRNA fremstilles ud fra dette RNA, enkeltstrenget cDNA fremstilles ud fra mRNA'et, det enkeltstrengede cDNA omdannes til dobbeltstrenget 15 CDNA, det dobbeltstrengede cDNA indsættes i transformationsvektorer, og bakterier transformeres med disse vektorer til dannelse af kolonier, puljer på hver 200-500 kolonier udtages, og plasmid 20 DNA'et isoleres fra hver pulje, plasmid DNA'et transficeres til hensigtsmæssige værtsceller til ekspression af CSF-protein, de transficerede celler dyrkes, og supernatanten analyseres for CSF-aktivitet, og 25 - CSF-positive puljer udvælges, og de kolonier, der er anvendt til at udgøre puljen, screenes for at identificere en koloni med CSF-aktivitet.

2. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor den celle, som danner CSF, er en T-lymfocytcelle.

53 DK 168709 B1 3. Eukaryot celle, som udskiller protein, idet cellen er transformeret med den ifølge punkt 1 fremstillede ekspressionsvektor.

4. Celle ifølge punkt 5, hvor cellen er en pattedyrscelle.

5 5. Fremgangsmåden ifølge punkt 1, hvor DNA, der koder for CSF- protein, endvidere isoleres fra kolonien med CSF-aktivitet, og dette DNA, der koder for CSF, indsættes i en ekspressionsvektor, som har en promotor, der er heterolog med CSF-DNA'et.

10 6. Celle, som er transformeret med den ved fremgangsmåden ifølge punkt 5 fremstillede ekspressionsvektor.

7. Celle ifølge punkt 6, hvilken celle er prokaryot.

8. Celle ifølge punkt 6, hvilken celle er eukaryot.

9. cDNA, som koder for CSF.

15 10. cDNA med den i fig. 1 viste nucleotidsekvens.

11. Ekspressionsvektor, som omfatter cDNA, der koder for CSF.

12. Ekspressionsvektor, som omfatter en i fig. 1 vist nucleotidsekvens .

13. Transformeret celle, som omfatter den i punkt li anførte 20 ekspressionsvektor eller en allel variant deraf.

14. Transformeret celle, som omfatter den i punkt 12 anførte ekspressionsvektor.

15. Celle ifølge punkt 13, hvilken celle er prokaryot.

16. Celle ifølge punkt 14, hvilken celle er prokaryot.

54 DK 168709 B1 17. Celle ifølge punkt 13, hvilken celle er eukaryot.

18. Celle ifølge punkt 14, hvilken celle er eukaryot.

19. Celle ifølge punkt 17, hvilken celle er en gærcelle.

20. Celle ifølge punkt 18, hvilken celle er en gærcelle.

5 21. Celle ifølge punkt 17, hvilken celle er en pattedyrcelle.

22. Celle ifølge punkt 18, hvilken celle er en pattedyrcelle.

23. Celle ifølge punkt 17, hvilken celle er en insektcelle.

24. Celle ifølge punkt 18, hvilken celle er en insektcelle.

25. CSF-Protein, som fremstilles ved at udtrykke cDNA, der 10 koder for CSF, i en transformeret celle.

26. Protein ifølge punkt 25, hvor cellen er en prokaryot celle.

27. Protein ifølge punkt 25, hvor cellen er en eukaryot celle.

15 28. Protein ifølge punkt 27, hvor cellen er en gærcelle.

29. Protein ifølge punkt 27, hvor cellen er en pattedyrcelle.

30. Protein ifølge punkt 27, hvor cellen er en insektcelle.

31. CSF-Protein, som er i det væsentlige fri for protein af nativ oprindelse.

20 32. CSF-Protein ifølge punkt 31, som er i det væsentlige fri for protein af human oprindelse.

55 DK 168709 B1 33. CSF-Protein, som er i det væsentlige fri for glycosyle-ring.

34. CSF-Protein, som er glycosyleret ved ekspression af cDNA, der koder for CSF-protein, i en transformeret eukaryot celle.

5 35. CSF-Protein ifølge punkt 34, hvor den eukaryote celle er en pattedyrcelle eller en insektcelle.

36. CSF-Protein, der er fremstillet ved at udtrykke cDNA med den i fig. 1 viste nucleotidsekvens.

37. Protein ifølge punkt 36, hvor cellen er en prokaryot 10 celle.

38. Protein ifølge punkt 36, hvor cellen er en eukaryot celle.

39. Protein ifølge punkt 38, hvor cellen er en gærcelle.

40. Protein ifølge punkt 38, hvor cellen er en pattedyrcelle.

15 41. Protein ifølge punkt 38, hvor cellen er en insektcelle.

42. Humant CSF-protein med i det væsentlige den i fig. 1 viste aminosyresekvens eller en allel variant deraf.

43. CSF-Protein ifølge punkt 42, hvor CSF er CSF(Thr).

44. CSF-Protein ifølge punkt 42, hvor CSF er CSF(Ile).

20 45. CSF-Protein ifølge punkt 42, hvor CSF er Met-CSF.

46. CSF-Protein ifølge punkt 42, hvor CSF er en blanding af CSF og Met-CSF.

56 DK 168709 B1 47. Terapeutisk præparat til behandling af myelosuppression, hvilket præparat omfatter en til myelosuppressionsbehandling tilstrækkelig mængde CSF-protein i en farmakologisk bærer.

48. Fremgangsmåde til behandling af pattedyr med myelosup- 5 pression, hvilken fremgangsmåde omfatter behandling af pattedyret med CSF- protein.

49. Fremgangsmåde ifølge punkt 48, hvor behandlingstrinnet omfatter intravenøs injektion i pattedyret af et terapeutisk præparat, som omfatter CSF-protein i en farmakologisk bærer.

10 50. Fremgangsmåde til behandling af pattedyr for at forøge antallet af cirkulerende granulocyter, hvilken fremgangsmåde omfatter behandling af pattedyret med en effektiv mængde CSF-protein.

51. Gibbon-CSF med i det væsentlige den i fig. 1 viste amino-15 syresekvens eller en allel variant deraf.

52. CSF-Protein ifølge punkt 51, hvor CSF er CSF(Thr).

53. CSF-Protein ifølge punkt 51, hvor CSF er CSF(Ile).

54. CSF-Protein ifølge punkt 51, hvor CSF er Met-CSF.

55. CSF-Protein ifølge punkt 51, hvor CSF er en blanding af 20 CSF og Met-CSF.

56. Fremgangsmåde til oprensning af CSF-protein fra en blanding af proteiner, der er suspenderet i vandigt medium, ved hvilken fremgangsmåde proteinet udfældes med ammoniumsulfat ved 80%'s 25 mætning til dannelse af en pellet indeholdende CSF- proteinet, pelleten resuspenderes i en pufret opløsning ved en pH i området fra ca. 6 til ca. 8, 57 DK 168709 B1 den pufrede opløsning, som indeholder CSF, anbringes på en chromatografisk søjle, CSF-aktiviteten elueres med den pufrede opløsning indholdende natriumchlorid, og fraktionerne med CSF-aktivitet indsamles, og 5 de aktive fraktioner samles i pulje, de i pulje samlede fraktioner anbringes på en C4-reversfasesøj-le, og CSF-aktiviteten elueres med en 0-90% acetoni-trilgradient til indsamling af de fraktioner, som indeholder CSF-aktivitet.

10 57. Fremgangsmåde ifølge punkt 56, hvor pufferen er valgt blandt

Tris(hydroxymethyl)aminomethan-hydrochlorid, N-2-hydroxy-ethylpiperazin-N-2-ethansulfonsyre og natriumcitrat.

58. Fremgangsmåde ifølge punkt 56, hvor den chromatografiske 15 søjle fyldes med octylsepharose, diethylaminoethyl-ultrogel eller acrylamidagarose-ultrogel.

59. Fremgangsmåde ifølge punkt 56, hvor de i pulje samlede fraktioner før anbringelse på C4-søjlen behandles med aceto-nitrilgradienten i en trifluoreddikesyreopløsning eller en 20 heptafluorsmørsyreopløsning.

60. Fremgangsmåde ifølge punkt 59, hvor koncentrationen af trifluoreddikesyre eller heptafluorsmørsyre i elueringsop-løsningen er henholdsvis 0,10% og 0,15% (v/v).

61. Fremgangsmåde ifølge punkt 56, hvor det vandige medium, 25 som indeholder CSF-protein, først behandles med ammoniumsulfat ved 30%'s mætning for at udfælde protein og supernatanten til de efterfølgende trin.

62. Fremgangsmåde ifølge punkt 56, hvor man efter trinnet med udfældning af proteinet med ammoniumsulfat til dannelse af en 30 pellet 58 DK 168709 B1 resuspenderer pelleten i en opløsning af Tris-HCl og dialyserer den resulterende opløsning, anbringer den dialyserede opløsning på en søjle af DEAE-ultrogel, 5 - eluerer søjlen med en opløsning af Tris-HCl, der indeholder mindst 0,1M NaCl, og indsamler fraktionerne med CSF-aktivitet,

samler de aktive fraktioner i pulje og anbringer de i pulje samlede fraktioner på en søjle indeholdende 10 AcA44-ultrogel ækvilibreret med en opløsning af HEPES

indeholdende NaCl og polyethylenglycol, eluerer søjlen med en opløsning af HEPES med NaCl og polyethylenglycol og indsamler fraktionerne med CSF-aktivitet, 15 - samler de fraktioner, som indeholder CSF-aktivitet, i pulje og behandler de i pulje samlede fraktioner med trifluoreddikesyre, anbringer den med trifluoreddikesyre behandlede pulje på en C4-reversfasesøjle, eluerer med en 0-90% aceto-20 nitrilgradient i en trifluoreddikesyreopløsning og indsamler fraktionerne med CSF-aktivitet, samler fraktionerne med CSF-aktivitet i pulje, behandler de i pulje samlede fraktioner med heptafluor-smørsyre og anbringer den behandlede opløsning på en 25 anden C4-reversfasesøjle, og eluerer den anden C4-reversfasesøjle med en 0-90% acetonitrilgradient i en heptafluorsmørsyreopløsning for at indsamle de fraktioner, som har CSF-aktivitet.

63. Fremgangsmåde ifølge punkt 56, hvor man efter trinnet med 30 udfældning af proteinet med ammoniumsulfat til dannelse af en pellet resuspenderer pelleten i en natriumcitratopløsning indholdende NaCl og anbringer opløsningen på en søjle, som indeholder acrylamidagarose-ultrogel 35 ækvilibreret i den samme puffer, 59 DK 168709 B1 eluerer søjlen med en opløsning af natriumcitrat og NaCl og indsamler fraktionerne med CSF-aktivitet, samler fraktionerne med CSF-aktivitet i pulje, behandler med trifluoreddikesyre og anbringer den 5 behandlede opløsning på en C4-reversfasesøj le, og eluerer søjlen med en 0-90% acetonitrilgradient i en trifluoreddikesyreopløsning til indsamling af fraktionerne med CSF- aktivitet.

64. CSF-Protein med en specifik aktivitet på mindst ca.

10 1 x 107 enheder/mg i knogl emarvsas sayet.

65. CSF-Protein ifølge punkt 64, som har en molekylvægt i området fra ca. 15.000 til ca. 26.000 daltons.

66. CSF-Protein ifølge punkt 64, hvilket protein har en specifik aktivitet på mindst ca. 4 x 107 enheder/mg protein i 15 knoglemarvsassayet.

67. Fremgangsmåde ifølge punkt 56, hvor CSF'et oprenses fra et Mo-cellekonditioneret medium.

68. Fremgangsmåde ifølge punkt 56, hvor CSF'et oprenses fra et medium, som fås ved dyrkning af celler, der er transfice- 20 ret med en rekombinant vektor indeholdende et ekspresserbart CSF-gen.

69. Fremgangsmåde ifølge punkt 56, hvor CSF'et oprenses fra et medium, som fås ved dyrkning af COS-celler, som er trans-ficeret med ρ91023(B)-CSF.

25 70. Fremgangsmåde til fremstilling af et kolonistimulerende faktor (CSF)-protein af primatoprindelse, ved hvilken et gen, der koder for et sådant protein, indsættes i en hensigtsmæssig vektor, vektoren, der indeholder genet, transformeres til eukaryote eller prokaryote værtsceller, og CSF-proteinet 30 udtrykkes og isoleres.

60 DK 168709 B1 71. Fremgangsmåde ifølge punkt 70, hvor CSF-proteinet er humant granulocyt-makrophag CSF.

72. Fremgangsmåde ifølge punkt 70, hvor CSF-proteinet har den i fig. 1 viste aminosyresekvens for CSF-Thr.

5 73. Fremgangsmåde ifølge punkt 70, hvor CSF-proteinet har den for CSF-Ile i fig. 1 viste aminosyresekvens.

74. Fremgangsmåde ifølge punkt 70, hvor CSF-proteinet er Gibbon- abe-granulocyt-makrophag CSF.

75. Fremgangsmåde ifølge punkt 70, hvor CSF-proteinet har den 10 i fig. 1 viste aminosyresekvens for CSF-G.

76. Fremgangsmåde ifølge punkt 70, hvor CSF-proteinet er et protein, der i aminosyresekvens svarer til et naturligt forekommende CSF med undtagelse af, at én eller flere aminosyrer er blevet tilføjet, erstattet eller fjernet uden i det 15 væsentlige at påvirke det naturlige CSF's biologiske aktivitet.

77. Fremgangsmåde ifølge punkt 76, hvor CSF-proteinet i aminosyresekvens svarer til et naturligt CSF-protein med undtagelse af, at én eller flere cysteinrester er blevet 20 erstattet med andre aminosyrerester.

78. Fremgangsmåde ifølge punkt 77, hvor CSF-proteinet har et naturligt CSF's aminosyresekvens med undtagelse af, at det indledes med en methioninrest.

79. CSF-Protein ifølge punkt 42, 43, 45 og 46 i moden form.

25 80. CSF-Protein ifølge punkt 42, 43, 45 og 46, som indeholder et signalpotentiator-startområde.

81. CSF-Protein med 127 aminosyrer.

Claims (22)

61 DK 168709 B1 82. CSF-Protein, som fås ved ekspression af EL. coll MC1061, der er deponeret i ATCC under deponeringsnummeret ATCC 39754, eller det 127 aminosyre lange CSF, der indkodes af det deponerede plasmid p91023(B)-CSF's nucleotidsekvens.

1. Vektor, kendetegnet ved, at den omfatter et gen, der koder for et primat-GM-CSF-protein, som har den efter pilen i fig. l viste aminosyresekvens for CSF-Thr, CSF-Ile eller CSF-G 10 eller allele eller andre funktionelt ækvivalente variationer deraf, hvor en eller flere aminosyrer er blevet tilføjet, substitueret eller fjernet uden i det væsentlige at påvirke aktiviteten af primat-GM-CSF i human-knoglemarvsassayet.

2. Vektor ifølge krav 1, 15 kendetegnet ved, at genet koder for et protein, som har den efter pilen i fig. 1 viste aminosyresekvens for CSF-Thr eller CSF-Ile eller allele eller andre funktionelt ækvivalente variationer deraf som defineret i krav 1.

3. Vektor ifølge krav 1 eller 2, 20 kendetegnet ved, at de funktionelt ækvivalente variationer af primat-GM-CSF, når de er oprensede, har en aktivitet på mindst l x 107 enheder/mg protein i human-knog-1emarvsassayet.

4. Vektor ifølge krav 1 eller 2, 25 kendetegnet ved, at genet koder for et protein, som har den efter pilen i fig. 1 viste aminosyresekvens for CSF-Thr.

5. Vektor ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at genet koder for et protein, 30 som har den efter pilen i fig. 1 viste aminosyresekvens for CSF-Ile. 62 DK 168709 B1

5 PATENTKRAV

6. Vektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at genet koder for et protein, som har den efter pilen i fig. 1 viste aminosyresekvens for CSF-G.

7. Vektor ifølge et hvilket som helst af kravene 4, 5 eller 6, kendetegnet ved, at aminosyresekvensen af det protein, som genet koder for, yderligere ved N-terminalen omfatter den signalsekvens, der går forud for pilen i fig. 1.

8. Vektor ifølge et hvilket som helst af kravene 4, 5 eller 6, kendetegnet ved, at aminosyresekvensen af det protein, som genet koder for, yderligere omfatter en methionin-rest ved N-terminalen.

9. Vektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at genet omfatter en sekvens som vist i fig. 1, hvilken sekvens starter efter pilen og slutter ved den codon, der svarer til aminosyre 127 for CSF-Thr eller CSF-Ile.

10. Vektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at genet er det kodende DNA af plasmid p 91023B, som er deponeret under ATCC 39754.

11. Plasmid p 91023B, som er deponeret under ATCC 39754.

12. Værtscelle, 25 kendetegnet ved, at den er transformeret med en vektor ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11. 63 DK 168709 B1

13. Værtscelle, kendetegnet ved, at den er transformeret med en vektor ifølge et hvilket som helst af kravene 2, 3 (under henvisning til krav 2), 4, 5 og 9-11. 5

14. Værtscelle ifølge krav 12 eller 13, kendetegnet ved, at den er prokaryotisk.

15. Værtscelle ifølge krav 14, kendetegnet ved, at den er E. coli.

16. Værtscelle ifølge krav 12 eller 13, 10 kendetegnet ved, at den er eukaryotisk.

17. Værtscelle ifølge krav 16, kendetegnet ved, at den er en gærcelle.

18. Værtscelle ifølge krav 16, kendetegnet ved, at den er en pattedyrscelle. 15

19. Værtscelle ifølge krav 18, kendetegnet ved, at den er en ovariecelle fra en kinesisk hamster.

20. Fremgangsmåde til fremstilling af et primat-GM-CSF-protein, 20 kendetegnet ved, at en celle ifølge et hvilket som helst af kravene 12-19 dyrkes, og at GM-CSF-proteinet isoleres .

21. Fremgangsmåde til fremstilling af et primat-GM-CSF-protein, 25 kendetegnet ved, at en celle ifølge krav 13 eller et hvilket som helst af kravene 14-19 under henvisning til krav 13 dyrkes, og at GM-CSF-proteinet isoleres.

22. cDNA, der svarer til genet ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10. 64 DK 168709 B1 23. cDNA, der svarer til genet ifølge et hvilket som helst af kravene 2, 3 (som er afhængigt af krav 2), 4, 5, 9 og 10. 24. cDNA af plasmid p 91023B, som er deponeret under ATCC 39754.