DK174598B1 - Glycosyleret eller ikke glycosyleret rekombinant polypeptid med aktivitet som human granulocyt/makrofag og eosinofil cellevækstfaktor, fremgangsmåde til fremstilling af polypeptidet, nucleotidsekvens kodende for polypeptidet, ..... - Google Patents

Description

i DK 174598 B1

Opfindelsen angår et glycosyleret eller ikke gly-cosyleret polypeptid, hvor dette vil opvise aktivitet som kolonistimulerende faktor på humane, neutrofile gra-nulocyter, makrofager og eosinofile. Opfindelsen angår 5 endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et omhandlet rekombinant polypeptid samt i en i forbindelse med en sådan fremgangsmåde relevant nucleotidsekvens, en vektor indeholdende denne og en hermed transformeret mikroorganisme eller celle.

10 Rekombinant DNA-teknologi refererer i almindelig hed til teknikken, hvorved man indforer genetisk information fra en donorkilde i vektorer med påfølgende bearbejdning såsom ved indførsel i en vært, hvor den overførte genetiske information bliver kopieret og/eller 15 eksprimeret i de nye omgivelser. Normalt eksisterer den genetiske information i form af komplementær DNA (cDNA) afledt fra messenger RNA (mRNA), der koder for et ønsket proteinprodukt. Bæreren er ofte et plasmid, der er i stand til at inkorporere cDNA og senere undergå repli-20 kation i en vært og i visse tilfælde faktisk at kontrollere eksprimering af cDNA og derved styre syntesen af det produkt, man har kodet værten til at fremstille.

Denne teknik er gået overordentlig hurtig frem i de senere år og en række exogene proteiner er blevet 25 eksprimeret i en række værter, men det er stadig usikkert, hvordan man kan tilvejebringe en hvilken som helst ny cDNA klon. F.eks. omfatter nogle af de eukaryotiske proteiner fremstillet ved rekombinant DNA-teknologi: proinsulin (Naber, S. et al.. Gene 21: 95-104 ([1983]); 30 interferoner (Simon, L. et al., Proc. Nat. Acad. Sci.

U.S.A, 80: 2059-2062 [1983] og Derynck, R. et al., Nucl.

Acids Res. 1: 1819-1837 [1983]); væksthormon (Goeddel, D., et al., Nature 281: 544-548 [1979]); og vækstfaktor 2 DK 174598 B1 for mastceller ( Yokota, T. et al., Proc. Nat. Acad.

Sci. U.S.A., 81: 1070-1074 [1984] ).

Det har i nogen tid været fastslået som et dogma at immunresponsen hos pattedyr først of fremmest skyld-5 tes en serie komplicerede vekselvirkninger mellem celler kaldet "immun netværket". Skønt det stadig er tydeligt, at meget af responsen finder sted omkring de netværksag-tige vekselvirkninger mellem lymfocytter, macrofager, granulocytter og andre celler, mener immunologer i al-10 mindelighed nu, at opløselige proteiner (f.eks. de såkaldte lymfokiner) spiller en kritisk rolle ved kontrol af disse cellulære vekselvirkninger.

Lymfokiner styrer åbenbart celleaktiviteter på forskellige måder. Man har vist, at de kan fremme vækst-15 udbredelsen og væksten af forskellige hæmatopoietiske celler og man tror, at de spiller en central rolle i grunddifferentieringen af pluripotentielle hæmatopoietiske stamceller til den store mængde af deres afkom i de forskellige cellelinier, der er ansvarlig for immun-20 responset. Cellelinier, der er vigtige i denne sammenhæng, omfatter to klasser lymfocytter: B-celler, som kan producere og udskille immunoglobuliner (proteiner, der er i stand til at genkende og binde sig til fremmed stof, hvorved det kan fjernes), og τ-celler af forskel-25 lige undergrupper, der gennem forskellige mekanismer fremmer eller hæmmer B-celler og nogle af de andre celler omfattende andre T-celler, hvoraf immunnetværket dannes.

En anden vigtig hvid blodcelletype er fagocytten, 30 især de polymorfnucleære og mononucleære leukocytter.

Disse celler, mener man, specialiserer sig i at fortære døde celler, hvilket er meget vigtigt, nar invaderende organismer skal elimineres og døde celler og ekstracel-lulært affald skal fjernes.

3 DK 174598 B1

Omfattet af disse leukocytcelletyper er granulo-cytter deriblandt neutrofile og eosinofile. Man kan finde neutrofile i kredsløbsblod i mange vævsarter og i de fleste dele af kroppen, der er i direkte kontakt med omgivelserne (f.eks. mundhulen, bronkieforgreningerne og 5 cervixkanalen). Deres respons som fagocytter på mikrobeinvasion er studeret grundigt (Klebanoff, S. og Clark, R., The Neutrophil: Function and Clinical Disorders,

Elsevier/North Holland Biomedical Prep., Amsterdam

[1978]), idet ødelæggelsen af de angribende organismer i 10 hovedsagen udføres gennem kontrolleret frigørelse af forskellig antimikrobemidler i små hulrum (f.eks. oxygenradikaler, H202 og halogenidioner) . Man ved meget mindre om eosinofile, skønt man let kan identificere dem ved et meget karakteristisk granuleringsmønster, og det 15 er dokumenteret, at de har forbindelse med allergiske sygdomme og visse parasitsygdomme såsom trichinose.

Forskellen på makrofager og granolucytter er, at de første udvikler karakteristika, der afhænger af de væv de er omgivet af. Således inkluderer vævsmakrofager 20 histiocyter i bindevæv, Kupffer-celler i leveren, alveolære makrofager i lungerne, osteoklaster i knoglerne, mikrobeceller i nervesystemet, Langerhaus-celler i huden såvel som frie eller fastsiddende celler i andre organer. Makrofager besidder fagocytiske egenskaber, men 25 kan også udskille mange meget vigtige biologisk aktive substanser, såsom lysozym, plasminogenaktivator, collagenase, elastase, syrehydrolaser, komplementære komponenter, prostaglandiner, endogene pyrogener, visse lym-fokiner og oxygenmetabolitter. Man tror også, at makro-30 fager regulerer tilførslen og overførslen af antigener til B- og T-lymfocytter (Cline, M., The white Cell, Harvard University Press, Cambridge, Mass. [1975]).

DK 174598 B1 4

Forskningen for bedre at forstå {og herved i fremtiden af behandle terapeutisk) neutropeni, lymfope-ni, monocytopeni, leukæmi eller leukæmiagtig reaktion såvel som andre immunforsvarssygdomme ved studiet af 5 makrofager, granulocytter, T-celler og andre celler involveret i immunforsvaret er blevet hæmmet af, at man normalt ikke kan opretholde disse celler in vitro. Imidlertid har mange immunologer for nylig opdaget, at mange sådanne celler kan isoleres og i visse tilfælde opkulti-10 veres, hvis man lader dem gro i sekretet fra andre celler, f.eks. et vækstmedium fra lymfocytter fra milten stimuleret med Concanavalin A (ConA). Fra dette arbejde er det nu blevet klart, at dannelsen af cellekloner afhænger af specifikke faktorer, såsom lymfokiner.

15 Næsten alle typer af blodceller dannes tilsyne ladende kontinuert hos voksne pattedyr i knoglemarven ved væksten og differentieringen af en række af hæma-topoietiske celleforfædre. Øverst i dette hierarki står den mangepotente stammecelle, som kan sørge for, at et 20 dyr, der har været udsat for dødelig bestråling, kan gendanne de fleste, hvis ikke alle hæmatologiske celletyper, f.eks. røde celler, blodplader, lymfocytter, forskellige granulocytter og monocytter/makrofager. Den mangepotente celle har ikke alene evnen til at regene-25 rere en beholdning af sin egen type (selvfornyelse), men skaffer også forfaderceller, ud fra hvilke forskellige specielle cellelinier kan udvikles. Efterkommerne af en speciel stammecelle med bestemte egenskaber synes i deres linie at besidde de samme egenskaber som cellefor-30 faderen (Metcalf, D., Hemopoietic Colonies, Springer Publishing Co., New York, N.Y. [1977]).

Studier in vitro over hæmatopoiese har vist, at et antal opløselige faktorer kan regulere væksten og 5 DK 174598 B1 differentieringen af disse forskellige forfaderceller og celler med bestemte egenskaber. Visse sådanne faktorer er blevet oprenset, og man har vist, at de især påvirker stammeceller, der tilhører en bestemt cellelinie. F.eks.

5 stimulerer erythropoietin, der hovedsagelig frembringes i nyrerne, mere differentierede medlemmer af erythroid-hierarkiet (Miyake, T., et al., J. Biol. Chem. 252: 5558 [l977]), og kolonistimulerende aktivitet frembragt i T-celler og makrofager stimulerer fortrinsvis granulocyt-10 og makrofagvækst i halvfaste kulturer af knoglemarvsceller (Stanley, E., og Heard, P., J. Biol. Chem. 252: 4305

[1977]). En anden type vækstfaktor synes at være i stand til at stimulere hæmatopoietiske kolonier, der består af enkelte celletyper og blandinger af celler. På grund af, 15 at der er så mange celler, f.eks. præerythrocytter, me-gakaryocytter, granulocytter, mastceller og monocyt/ma-krofager, der tilsyneladende reagerer på en faktor af denne type har man kaldt den en mangel iniecellulær vækstfaktor (Iscove, N. et al., J. Celle. Physiol.

20 Suppl. 1: 65-78 [1982]), hvorved man angiver dens evne til at påvirke et antal celler med bestemte egenskaber længere nede i hierarkiet såvel som pluripotentielle stammeceller.

Man ved, at den kolonistimulerende aktivitet ek-25 sisterer på mange molekylformer, som kendes samlet som kolonistimulerende faktorer (CSP). CSF er en familie glycoproteiner med molekylvægte fra ca. 20.000-70.000 daltons og kan findes i blodcirkulationen og i urin.

Sættet af faktorer, der kan stimulere både kolonidannel-30 sen hos granulocytter og makrofager i halvfaste kulturer (se Metcalf, D. , Hematopoietic Colonies; In Vitro Cloning of Normal and Leukemic Cells; Springer Publishing Co., New York [1977]), kendes som "GM-CSF".

DK 174598 B1 6

Man har i det mindste delvis renset og biokemisk karakteriseret GM-CSF fra mus og fra mennesker, men der er rapporteret store forskelle i både molekylvægt og omfang af aktiviteterne - selv inden for samme typer 5(Metcalf, D., "Hematopoietic Colony Stimulating Factors" i Handbook of Experimental Pharmacology, 57: 343-384,

Springer-Verlag, New York [1978]). Successen med kloning af cDNA, der koder for en muse GM-CSF-aktivitet (Gough, N. et al., Nature 309: 763-767 [l984j, skulle hjælpe med lOsvaret på mange af de spørgsmål man for tiden har vedrørende muse GM-CSF, men problemet med humane systemer eksisterer stadig. Der er i det mindste to grupper af forskere, der har berettet om to humane GM-CSF-systemer (Das, S. et al., Blood 58: 630-641 [l98l] og Nicola, N.

15 et al., Blood 54: 614-627 [1979]). Men selv med in vitro translatering af mRNA (isoleret fra en T-lymfocytcellelinie, ATCC nr. CRL8066; se US patent 4.438.032), der koder for human GM-CSF og angivelig fører til biologisk aktivt protein (Lusis, A. et al·., Nature 298: 75-77 20 [1982]), er usikkerhederne omkring human CSF meget store (se Burgess, A., Growth Factors and Stem Cells, kapitel 4, s. 93-124, Academic Press, New York [l984]), og forekomsten af mRNA for GM-CSF i en angivet human T-lymfo-blastcellelinie er så lav, at den af ovennævnte US pa-25 tent omhandlede kloningsfremgangsmåde næppe er teknisk fremkommelig.

Man kan måske forklare forskelle i molekylvægte med forskellig grad af glycosylering, men opklaringen af dette problem, og af hvilke aktiviteter et bestemt mole-30 kyle udviser, kræver yderligere strukturdata, dvs. i det store og hele en fuldstændig sekvensanalyse for de omtalte molekyler. Det er selvfølgelig muligt at benytte proteinsekvensering til at løse problemet, men det er 7 DK 174598 B1 meget besværlig eksperimentelt arbejde og kan ofte hverken give fuldstændige eller fuldstændig komplette amino-syresekvenser. Hvis man desuden har muligheder for at fremstille større mængder af et polypeptid, der udviser 5 human GM-CSF aktivitet, vil det være meget lettere at studere biologien for granulocytter, makrofager og andre celler, der er involveret i immunforsvaret, f.eks. ved at minimisere nødvendigheden for at benytte ConA-behand-lede medier til at stimulere cellevækst. Nøjagtige og 10 fuldstændige sekvensdata for et hvilket som helst humant CSF vil også gøre eftersøgningen af andre immunologiske faktorer lettere. Endelig vil ekstra oplysning om et hvilket som helst lymfokin hjælpe til at opklare, hvilke roller de forskellige vækstfaktorer og celler i immun-15 netværket har, og derved give indsigt i hele immunsystemet med de deraf følgende terapeutiske fordele.

Der er altså et betydelig behov for omfattende nucleotidsekvensdata for de DNA-molekyler, der koder for, og også selve aminosyresekvensen i, proteiner med 20 human GM-CSF aktivitet såvel som en simpel og økonomisk måde til at fremstille større i det væsentlige rene mængder af sådanne materialer. Ved opfindelsen opfyldes dette behov af et glycosyleret eller ikke glycosyleret rekombinant polypeptid, der er ejendommeligt ved, at det 25 opviser aktivitet som kolonistimulerende faktor på humane neutrofile granulocyter, makrofager og eosinofile, og at det besidder strukturen DK 174598 B1 8

Met Trp Leu dn Ser Leu Leu Leu Leu Cly Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr

Gin Pro Trp Glu Eis Val Asn Ala Ile Gin Glu Ala Ars Ars Leu Leu Asn Leu ^ Ser Arj Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Me c

Phe Asp Leu Gin Glu Pro Thr Cys Leu Gin Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gin

Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser

His Tyr Lys Gin Eis Cys Pro Fro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gin Ile

Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro ?he A.sp Cvs Trp Glu Fro Val Gir. Glu.

10 idet polypeptidet ikke omfatter en del af et menneske.

Især tilvejebringer opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid med human GM-CSF aktivitet, fremgangsmåden er ejendommelig ved, at man: 15 a) danner en vektor, der indeholder en nucleotid- sekvens, der koder for dette polypeptid, og hvori nucleotidsekvensen kan eksprimeres af en vært, der indeholder vektoren; b) inkorporerer vektoren i værten; og 20 c) opretholder værten med vektoren under sådanne betingelser, som er egnede for eksprimering af nucleotidsekvensen i dette polypeptid.

Den ved fremgangsmåden anvendte nucleotidsekvens, vektor og vært på form af en mikroorganisme eller celler 25 er hver ejdendommelig ved det i den kendetegnende del af henholdsvis krav 7, 9 og 10 angivne.

Det foretrækkes at aflede cDNA-sekvenserne fra en ikke transformeret human T-celles mRNA-sekvens, der koder for polypeptiderne, og at værten er en organisme så-30 som en eukaryotisk celle, dvs. en pattedyrcelle, der er transficeret eller transformeret med vektoren. Ydermere foretrækkes det, at vektoren også indeholder en anden nucleotidsekvens, der kan kontrollere eksprimering af 9 DK 174598 B1 nucleotidsekvensen, der koder for polypeptidet. Denne anden sekvenskodning kan omfatte en promotorsekvens, en eller flere intronsekvenser og en polyadenyleringsse-kvens, så der herved tillades henholdsvis transkrip-5 tion, splejsning og polyadenylering af nucleotidsekvensen, der koder for polypeptidet. Især når værten er en celle fra et pattedyr såsom en COS-7 abe (nyre)celle indeholder vektoren promotorsekvensen fra simian virus 40 (SV40) tidlig regionpromotor og polyadenyleringsse-10 kvensen fra SV40 sen region polyadenyleringssekvens.

Den humane cDNA-sekvens i fig. 1 (se nedenfor) kan hybridisere med andre DNA-sekvenser, såsom DNA, der koder for andre vækstfaktorer i pattedyr fra cDNA eller et genbibliotek. Man har bemærket, at de beskrevne cDNA-15 sekvenser tilsyneladende indeholder oplysning om en leader sekvens.

Polypeptiderne ifølge opfindelsen er i stand til at forstærke væksten af humane neutrofile granulocytter, makrofager og andre celler (f.eks. eosinofile), især i 20 in vitro kulturer. Man kan fremstille passende farmaceutiske kompositioner ved at sætte polypeptiderne (i præparater som i det væsentlige er fri for andre humane vækstfaktorer) til terapeutisk egnede bærestoffer.

Andre træk og fordele ved opfindelsen kan ses fra 25 den følgende detaljerede beskrivelse som må læses sammen med tegningerne og eksemplerne. På tegningerne skal: fig. 1 illustrere nucleotidsekvensen og den an-tagne tilsvarende aminosyresekvens for en cDNA-klon, der udviser human GM-CSF aktivitet; 30 fig. 2A illustrere pcD-human-GM-CSP, et plasmid der bærer en cDNA-klon, der udviser human GM-CSP aktivitet; DK 174598 B1 10 fig. 2B være et restriktionsendonucleaseopskæ-ringskort for cDNA-indsætningsstykket i fig. 2A; og fig. 3 repræsentere en sammenligning mellem an-tagne muse og humane GM-CSF aminosyresekvenser.

5 Ifølge opfindelsen tilvejebringer man polypep- tider, der udviser human GM-CSF aktivitet. Når herfor kodende cDNA-sekvenser er blevet inkorporerede i repli-kationsdygtige ekspressionsvektorer, og vektorerne er transficerede til en egnet vært (f.eks. en kultur af 10 pattedyrsceller), har det eksprimerede polypeptid eller polypeptiderne evnen til at tillade væksten af neutrofi-le granulocytter, makrofager og andre hæmatopoietiske linier af celler (f.eks. eosinofile).

Som sagt vises et eksempel på en antaget amino-15 syresekvens baseret på den isolerede nucleotidsekvens i fig. 1. Human GM-CSF's cDNA indholder en enkel åben læseramme, der består af 144 codoner. Efter det antagne indledningscodon er der en region rig på hydrofobe aminosyrer. Det er derfor sandsynligt, at den færdige form 20 for udskilt human GM-CSF begynder med en serinrest, og at de foregående 23 aminosyrer udgør en leader region, som kan fjernes ved proteolyse. Således vil i én udførelsesform human GM-CSF bestå af ca. 121 aminosyrer, med en beregnet molekylvægt på ca. 13500 dalton (ikke 25 glycosyleret). Der synes at være to mulige N-glycosyle-ringssteder (Asn-X-Ser/Thr) (Neuberger, A, et al., Glycoproteins 5, 450-490, Elsevier Publishing Co., U.S.A.

[1972]) ved positionerne 44-46 og 54-56, som kunne forklare forskellene i molekylvægt i litteraturen.

30 Når de fundne cDNA-kloner transficeres i COS-7 abeceller eller andre passende eksprimeringssystemer kan de dirigere syntesen af biologisk aktiv humant GM-CSF.

Hvis man sætter dette eksprimerede klonede genprodukt DK 174598 B1 11 til kulturer af hæmatopoietiske forfaderceller, kan man opnå, at der fremvokser afledte celler og/ellet de opretholdes i kulturen. De eksprimerede polypeptider kan udvise de andre forskellige aktiviteter, som man forbin-5 der med human GM-CSF.

Man kan benytte forskellige måder til at fremstille cDNA ifølge opfindelsen. Eksempelvis kan man ekstrahere total mRNA (f.eks. som rapporteret af Berger, S. et al., Biochemistry 18: 5143-5149 [ 197 9 ]) fra cel-lOler (f.eks. en ikke transformeret human τ-cellekilde), der producerer polypeptider med human GM-CSF aktivitet.

De dobbeltstrengede cDNA-molekyler kan konstrueres ud fra dette totale mRNA ved benyttelse af primer-initieret omvendt transkription (Verma, X., Biochim. Biophys.

15 Acta, 473: 1-38 [l977]), idet man først fremstiller komplementet til hver mRNA-sekvens og derefter primer og syntetiserer den anden streng. (Land, H. et al., Nucleic Acids Res. 9: 2251-2266 [19663)- Man kan derefter klone cDNA ved at indføre disse i passende plasmid eller bak-20teriofagvektorer (Rougeon, F. et al.. Nucleic Acids Res., 2, 2365-2378 [l975], Scherer, G. et al., Dev,

Biol. 86, 438-447 [1981]) ved hjælp af komplementære homopolymere halestykker (Efstratiadis, A. et al., Cell, 10, 571-585 [l977]) eller klæbende ender, som man har 25indført ved hjælp af sammenbindende segmenter, der indeholder passende restriktionssteder (Seeburg, P. et al.,

Nature, 270, 486-494 [l977], Shine, J. et al., Nature, 270, 494-499 [1977]), og derefter transformere en passende vært. (Se generelt Efstratiadis, A., og Villa-30Kormaroff, L., "Cloning of double stranded cDNA" i Set-low J. og Hollaender, A. (eds.) Genetic Engineering, vol. 1, Plenum Publishing Corp., N.Y., U.S.A. [1982].).

En foretrukken fremgangsmåde til at opnå de klonede cDNA-molkyler i fuld længde er DK 174598 B1 12 fremgangsmåden, der er udviklet af H. Okayama og P. Berg (Mol. and Cell. Biol., 2: 161-170 [1982]). Denne fremgangsmåde har den fordel, at man anbringer cDNA-indsæt-ningsstykkerne i en bakterieklonende vektor på en posi-5 tion, hvor cDNA også kan direkte translateres og bearbejdes i celler for pattedyr. Udtrykt kort primer man første cDNA-streng ved hjælp af polydesoxythymidylsyre, som er forbundet kovalent til den ene ende af en lineær plasmidvektor DNA. Man ringslutter derefter plasmidvek-10 toren med et sammenbindende DNA-segment, der danner en bro fra den ene ende af plasmidet til 5'-enden af cDNA-kodesekvensen. Idet man benytter et DNA-fragment, der indeholder Simian Virus 40 (SV40) tidlig regionpromotor og et sammenbindende element, der indeholder en modifi-15 ceret SV40 sen regionintron kan man eksprimere CDNA in vitro i COS-7 musenyreceller uden yderligere modifikation. (Se generelt Okayama, H. og Berg, P., Mol. and Cell. Biol., 3: 280-289 [l983] og Jolly, D. et al.,

Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 80: 477-481 [1983].) 20 Når man først har fremstillet et fuldstændigt cDNA-bibliotek af Okayama/Berg-plasmidvektoren kan man indsamle cDNA-klonerne og kontrollere tilfældige grupper for tilstedeværelsen af de ønskede cDNA-molkyler ved hybridudvælgelse, translatering og assay (f.eks. ved at 25 måle human GM-CSF aktivitet på cellekulturer ved at påvise eksistensen af antigene determinanter eller ved andre biologiske aktiviteter. Grupper, der ved hjælp af disse kriterier viser sig positive, kan derefter undersøges med en passende specialsonde, f.eks. cDNA fra en 30 B-cellelinie og/eller ikke-induceret T-cellelinie. Derefter opdeler man de positive kontrollerede grupper op i individuelle kloner, som prøves ved transficering i en passende vært (såsom en kultur af pattedyrsceller) og DK 174598 B1 13 væsken over værten kontrolleres for den ønskede aktivitet. Derefter kan man sekvensere positive kloner.

De ønskede cDNA-kloner kan også påvises og isoleres ved hjælp af hybridiseringskontrol med passende 5 prøver af mRNA (Heindelle, H. et al., Cell, 15: 43-54

[1978]). Man kan alternativt gennemsøge cDNA-biblioteker ved hybridudvælgelse (Harpold, M. et al., Nucleic Acid Res., 5: 2039-2053 [ 1978 ], Parnes, J. et al., Proc.

Nat. Acad. Sci. U.S.A., 78: 2253-2257 [1981 ]) eller i 10 Xenopus-oocyter (Aurdon, J., Nature, 233: 177-182

[1971]). (Se generelt Villa-Komaroff, L. et al., Proc.

Nat. Acad. Sci. U.S.A., 75: 3727-3731 [1978 ] . ) I den følgende beskrivelse af fremgangsmåder i forbindelse med fremstilling af de for opfindelsen rele-15 vante cDNA-kloner vil vi først betragte cellekilden og andre linier først, hvorefter der følger en almindelig beskrivelse af fremgangsmåderne til isolering af mRNA, der koder for et protein, der udviser human GM-CSF aktivitet; konstruktionen af et cDNA-bibliotek, der indehol-20der cDNA-sekvenserne; isolering af cDNA-kloner i fuld længde i en plasmidvektor og følgende eksprimering i pattedyrsceller; underkloning og eksprimering i bakterier og gær; og rensning og formulering. Derefter vil følge en mere detaljeret beskrivelse af hele den ekspri-25menteile fremgangsmåde.

T-Celler og andre linier

Man kan benytte et stort antal forskellige celler som kilder for human GM-CSF aktivitet og i assays til 30 påvisningen af denne (se f.eks. Burgess, A., Growth Factors and Stem Cells, Academic Press, siderne 43-124, New York [ 1984 ]). En foretrukken kilde er en T-cellehjælpe-linie, men humant blod fra kredsløbet (Verma, D. et al., DK 174598 B1 14

Brit. J. of Haemat. 57: 505-520 [1984] og Hasketh, P. et al., Blood 63: 1141-1146 [1984]), makrofager og andre celler, der producerer human GM-CSP aktivitet (Bodeker, B. et al., Immunobiol. 166: 12-23 [1984]) kan accepte-5 tes. Dette inkluderer hybridomer og transformerede cellelinier (Gasson, J. et al., "Lymphokines and Hematopoiesis", Normal and Neoplastic Hematopoiesis, Alan R.

Liss, New York [1983]).

En foretrukken kilde i forbindelse med assays for 10 human GM-CSF aktivitet er human knoglemarv fra donorer, der ikke lider af hæmatologiske sygdomme. Imidlertid er humant corda-blod og milt også egnede kilder, hvis de benyttes indenfor ca. 12-48 timer efter ekstraktion.

Når man skal bestemme CSF aktivitet, omdanner man 15 den haemapoietiske cellekilde til en suspension af enkelceller. Derefter immobiliserer man de enkelte celler i et halvfast medium (agar) eller viskøst medium (methyl-cellulose), der indeholder vækstmidler og sædvanligvis serum fra kalvefostre. Hvis en pasende stimulerende fak-20 tor er til stede, vil de enkelte celler dele sig og differentiere. Siden de oprindelige celler er immobilisere-de vil der udvikles kolonier, mens cellerne deler sig og modnes. Disse kolonier kan indsamles efter 7-14 dage. (Burgess, A., Growth Factors and Stem Cells, siderne 2552-55, Academic Press, New York [l984]). (For speciel anvendelse på væksten af granulocytter og makrofager, se Bradely, T. og Metcalf, D. , Aust. J. Exp. Biol. Med.

Sci. 44: 287-300 [l966], og generelt Metcalf, H., Hemopoietic Colonies, Springer.Verlag, Berlin [1977]). Man 30 kan om ønsket ekstrahere enkelte kolonier, anbringe dem på mikroskopglas, fiksere dem og farve dem med Wright/

Geimsa (Todd-Sanford, Clinical Diagnosis by Laboratory Methods, 15th Edition, Eds. Davidson and Henry [1974]).

DK 174598 B1 15

Derefter kan man udføre morfologisk analyse af, hvilke celletyper, der findes i de enkelte kolonier.

Isolering af mRNA og fremstilling af et cDNA-bibliotek 5 Man kan isolere total cellulær mRNA ved et antal velkendte fremgangsmåder, (f.eks. Przybla, A. et al., J.

Biol. Chem. 254: 2154-2158 [1979]), men den foretrukne metode er guanidinium-thiocyanat-ekstraktionsfremgangs-måden ifølge Chirgwin et al. (Biochemistry, 18: 5294- 10 5299 [1979]). Hvis man benytter denne fremgangsmåde opnår man ca. 10 yg af polyA+ mRNA udvalgt på søjler af oligo (dT) cellulose fra 1-2 x 108 aktiverede humane hjælper T-celler.

cDNA-Biblioteket ud fra polyA+ mRNA kan bedst 15 fremstilles ved hjælp af pcDVl vektor-primeren og pLl sammenbindingsfragmentet [fås hos Pp-L Biochemicals Inc, Milwaukee, Wl] ifølge fremgangsmåder, som medfører meget berigede kopier i fuld længde af mRNA-transkripter (f.eks. Okayama, H. og Berg, P., Mol. Cell Biol., 2, 20161-170 [1982] og Mol. Cell Biol., 3, 280-289 [1983]). Plasmidvektoren, som indeholder SV40 tidlig promotor og SV40 RNA-fremstillingssignaler er fremstillet, så den promoverer eksprimering af det klonede cDNA-segment i celler fra pattedyr.

25 Ved hjælp af Okayama og Berg fremgangsmåden transformerer man den ringsluttede vektor cDNA-præpara-tion til en anvendelig bakteriecelle, såsom E. coli MCl06l-celler (Casadaban, M. og Cohen, S., J. Mol.

Biol., 138: 179-207 [1080]) ved hjælp af calciumchlorid 30 (Cohen, S. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 69: 2110-2114 [i972]). Idet man udgår fra 5 yg polyA+ RNA fra ConA-stimulerede T-celler kan man opnå ca. 1,5 x 108 uafhængige transformanter. Man opsamler normalt ca. 104 DK 174598 B1 16 kloner individuelt og inoculerer dem i fordybninger på mikrotiterplader (Flow Laboratories Inc., McLean, virginia), der indeholder 200 yl L-urt, 50 yg pr. ml ampicillin og 7% DMSO. Hvis man ønsker det, kan man 5 fremstille variantbiblioteker baseret på størrelsen af cDNA-indsætningsstykket ud fra hele cDNA-biblioteket som beskrevet af Okayama H. og Berg, P. (Mol. Cell Biol., 3, 280-289 [19 8 3]>. Kort fortalt fordøj er man plasmid DNA med Sall, Clal og Hindllll efter tur og udfører elektro-10 forese på 1% agarosegel. Efter farvning med ethidium-bromid skærer man gelen i 7 sektioner, der svarer til størrelse for cDNA-indsætningsstykket på 0-1, 1-2, 1-3, 3-4, 4-5, 5-6 og over 6 kilobaser (kb). Man ekstraherer DNA fra hver skive, ringslutter igen med T4 DNA-ligase 15 og benytter dette til at transformere MC1061. Hele nu-cleotidsekventeringen kan udføres ifølge fremgangsmåden af Maxam, A. og Gilbert, W. (Methods Enzymol., 65: 499-560 [1980 ] ) .

20 DNÅ-Transficerinq i abeceller:

Omtrent 1 x 106 COS-7-abenyreceller udspredes på 60 mm plader dagen før transficeringen skal foregå. Man udfører bedst transficeringer med 15 yg plasmid DNA i 1,5 ml DNA, der indeholder 50 mm Tris.HCl, pH 7,4 og 400 25 yg pr. ml DEAE-dextran (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige). Man fjerner denne opløsning efter 4 timer, erstatter den med 2,0 ml DME + 4% kalvefosterserum. Mediet indsamles efter 72 timer og undersøges for human GM-CSF IL-2 aktivitet som beskrevet ovenfor. Man kan ud-30 føre DNA-transficeringer på L-celler og et antal andre cellekilder (se nedenfor).

DK 174598 B1 17

Isolering af beslægtede gener

De ovenfor nævnte cDNA-kloner kan benyttes til at identificere og isolere nucleinsyresekvenser, der koder for beslægtede gener. Da der ofte er en lav grad af 5 homologi mellem homologe gener, må man tilpasse strengheden af hydridiseringsbetingelserne, så man tillader krydshybridisering mellem sekvenser, der måske kun er 70-80% homologe.

Der er benyttet adskillige forskellige eksperi-10 menteile fremgangsmåder til at lokalisere de beslægtede gener. Man har f.eks. isoleret genet for human Ck-immu-noglobin let kæde ved hjælp af det tilsvarende muse Ck-gen som sonde (Heiter, P. et al., Cell 22: 197-207 [1981 ], og man har isoleret gener for musetransplanta-15 tionsantigen ved hybridisering med DNA-kloner, der koder for deres humane paralleller (Steinnetz, T. et al.. Cell 24: 125-134 [1981]).

For DNA fra gener omfatter en foretrukket fremgangsmåde udspredning af fag-kloner fra et DNA-biblio-20 tek, der indeholder de homologe gener (Maniatis, T. et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, U.S.A. [1982]) med en densitet på 2-5 x 104 pletter pr. 150 mm plade på en passende stamme af en vært, såsom E^_ coli LE392. 10-20 plader er 25 almindeligvis nok.

Efter 10-12 timers inkubering ved 37°C nedfryser man pladerne i 2 timer og påsætter derefter et 132 mm nitrocellulosefilter på agaroverfladen af hver plade.

Man lader filteret blive i kontakt med pladen i det 30mindste 5 minutter, og samtidig fæster man filtrene til pladerne ved at gennemprikke med en blækfyldt kaliber 22 nål. Man piller derefter filtrene af pladerne og inkuberer i rækkefølge i i det mindste 2 minutter først i 1Θ DK 174598 B1 250 ml 0,1 N NaOH, 0,5 M NaCl; så i 250 ml 0,5 M Tris.HCl; så i 250 ml 0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 1,5 M NaCl.

Man tørrer filtrene på sugende papir og bager dem derefter ved 80°C i 4-8 timer.

5 Ved hybridiseringen væder man filtrene i 1 x SET

(0,15 M NaCl, 30 mM Tris.HCl pH 8,0, 1 mM Na2EDTA), og inkuberer derefter en opløsning af 3 x SET, 5 x Denhardt's (Denhardt, D.T.,B.B.R.C. 23: 641-646 [1966]), 10% dextransulfat, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS) og 5 10pg pr. ml af hver af poly (rA), poly (rC) og poly (rG) ved 65°C i 2 timer (1,5-2 ml pr. filter) under konstant omrøring. Man kaster opløsningen bort og hybridiserer filtrene med 0,5 yg (£l08 cpm) af en haktranslateret sonde fremstillet ud fra GM-CSF CDNA i samme opløsninger 15 (frisk), 1,5-2 ml pr. filter ved 65°C i 1 time og derefter ved 55°C i 12-20 timer. Derefter vasker man filtrene i rækkefølge med 3 x SET, 1 x Denhardt's; 0,1% SDS; og 1 x SET 0,1% SDS (10-15 ml pr. filter) ved 55°0 i 1 time under forsigtig omrøring. Man tørrer filtrene 20 på sugende papir og autoradiograferer i 12-24 timer med passende film og med en forstærkende skærm. Man piller de hybridiserende småplader fra agarpladerne med sterile pasteurpipetter og anbringer hver i 1 ml 0,1 M NaCl, 0,01 M Tris.HCl pH 7,5, 10 mm MgCl2, 100 yg pr. ml gela-25 tine, med 50 yg CHCI3 tilsat. Efter i det mindste 4-8 timer koldt undersøger man fagerne fra hver lille plade igen ved lav tæthed (2000-4000 småplader pr. 15ο mm plade ved en fremgangsmåde, der er identisk med fremgangsmåden beskrevet ovenfor.

DK 174598 B1 19

Eksprimering 1 E. coli, 1 gær og 1 cellekultur

Prokaryoter, såsom E. coli, er meget egnet til eksprimering af polypeptiderne ifølge opfindelsen (se f.eks. U.S. patent 4.338.397 og 4.411.994), forudsat at 5 man ikke ønsker glycosylering.

Hvis man ønsker et højt niveau for eksprimering, bør man benytte promotorer, såsom β-laktamase (penicillinase) og lactosepromotorsystemer (Chang et al., Nature, 275: 615 [1978]; Itakura et al., Science, 198: 1056 10 [l977]; Goeddel et al., Nature 281: 544 [ 1979]) eller et tryptophan (trp) promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 [l980]) i forbindelse med Shine-Del-garno-sekvenser.

Fagmanden vil kunne indse, at man ikke blot kan 15 anvende prokaryoter, men også eukaryotiske mikrober, såsom gær ved fremstilling af protein. Saccharomyces cerevisiae er en foretrukket eukaryotisk mikroorganisme. Passende promotorsekvenser i gærvektorer omfatter promotorer for 3-phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., 20 J. Biol. Chem., 255: 12073-12080 [l980]) eller andre glycolyseenzymer (Hess et al., Adv. Enzyme Reg., 7: 149-167 [1969]; Holland et al., Biochemistry, 17: 4900-4907 [1978]). Man kan anvende andre promotorer, hvor man yderligere har fordelen af, at transkriptionen kontrol-25 leres af vækstbetingelserne. Grundlæggende kan man anvende en hvilken som helst plasmidvektor, der indeholder en promotor, der kan forliges med gær, en replikations-enhed og terminerende sekvenser.

En foretrukken fremgangsmåde til fremstilling af 30 humant GM-CSF, idet man benytter cDNA ifølge opfindelsen, benytter mating yeast pheromon α-faktor for udskillelse af sekreter (Julius, D. et al., Cell 32: 839-852 [1983]). cerevisiae udskiller mating-type sped- DK 174598 B1 20 fikke oligopeptidpheromoner. ΜΑΤα-Celler udskiller a-faktor, som fører til standsning af vækst af MATa-celler i Gl-trinnet af cellecyklus (Thorner, J., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor 5 Laboratory, New York [1981]; se især side 143-180). Man begynder med at syntetisere α-faktoren som et større precursormolekyle, der består af en N^-terminal signal-sekvens på ca. 20 aminosyrer, fulgt af en leader-sekvens på 60 aminosyrer og som slutter med fire identiske tan-10 demgentagelser af den udviklede α-faktorsekvens. Gentagelserne er adskilt fra hinanden ved hjælp af seks eller otte aminosyrermellemstykker (Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala og Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-[eller Asp-]-Ala-Glu-Ala). Denne præpro-a-faktor spaltes ved adskillige specifikke posi-15 tioner. Først spalter man på COOH-terminalsiden af Lys-Arg-parret af mellemsekvensen, idet man katalyserer med KEX2-produktet (Julius et al., Cell 37: 1075-1089

[1984]). Et enzym, der ligner carboxypepsidase-B, kløver på NH2-terminalsiden af Lys-Arg-parret. Sluttrinnet er fjernelse af Glu-Ala eller Asp-Ala-parrene ved hjælp 20 af diaminopeptidase, for hvilken man koder ved hjælp af STE13. Brake, J. et al., (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.

81: 4642-4646 [1984]) har vist, at sammensmeltningen af den sekvens, der koder for udviklede humane proteiner med det første "Processing site" tillod udskillelse af 25 sådanne proteiner.

En generel gæreksprimeringsvektor betegnet pMF-a-8, som indeholder a-faktorpromotor og den følgende lea-dersekvens sammen med andre elementer er blevet deponeret hos ATCC som nr. 40140. Den kan konstrueres på føl-30 gende måde:

Et 1,7 kb EcoRI-fragment, der bærer MFal-genet (Kurjan, J. og Hershowitz, I., Cell. 30: 933-943 [1982]) DK 174598 B1 21 klones på EcoRI-gennemskæringspositIonen i M13mp8 (Viera, J. og Messing, J., Gene 19: 259-268 [1982]). Man ønsker at introducere et Hindlll-gennemskæringssted efter lysincodonet i den første mellemregion og hybridi-5 serer derfor det syntetiske oligonucleotid TCTTTTATCCAAAGATACCC til enkeltstrengs M13-MFal DNA og oligonucleotidprimeren forlænget med DNA-polymerase I Klenow-fragmentet. Efter behandling med Sl-nuclease kløver man DNA med EcoRI og kloner fragmentet, der inde-10 holder MFal-promotoren og leader-sekvensen på EcoRI og det opfyldte Hindlll-gennemskæringssted i pUC8 (Viera, J. Og Messing, J. ovenfor). Man kan isolere et plasmid med den ønskede struktur (betegnet pMFct4Al). Man kløver pMFa4Al med Hindlll og opfylder delvis med DNA-polymera-15 se I Klenow-fragment under tilstedeværelse af dATP og dGTP. Man behandler DNA med mung-bønnenuclease og påhæfter oligonucleotidsammenbindingsstykket GCCTCGAGGC.

Det resulterende plasmid (betegnet pMFa5) vil besidde et Stul-gennemskæringssted umiddelbart efter arginincodonet 20 fulgt af Xhol-gennemskærlngsstedet. Man kan konstruere en SL cerevlslae-E. coli-overføringsvektor (pTRP584) som følger: Man kloner Pstl-xbal-fragmentet, der bærer et 2 ym plasmidreplikationsudgangsstykke (Broach, J. ovenfor) på Clai-gennemskærlngsstedet i pTRP56 (Miyajima et 25 al.. Mol. Cell. Biol. 4: 407-414 [1984]) og på Stul-gen-nemskæringsstedet i TRPl-ARSl-fragmentet, som er omdannet til et PvuII-gennemskeeringssted ved indsætning af et PvuII af et PvuII-forbindelsesstykke. Man omdanner Kpnl-gennemskæringsstedet i det oprindelige pTRP56 til Xhol 30 ved at indsætte Xhol-forblndelsesstykket. Derefter opnår man den almene sekretionsvektor pMFa8 ved at indsætte Bglll-Xhol-fragmentet fra pMFa5 på MabHI-xhoI-gennem-skæringsstedet i pTRP584.

DK 174598 B1 22

Fagmanden vil kunne indse, at cDNA-klonerne, der koder for human GM-CSF, uden videre kan indsættes i pMFa8-vektoren og derefter transformeres i gær med det formål at producere human GM-CSF. Eksempelvis kan man 5 klone et 1,0 kb Barn Hl-fragment, der indeholder den fuldstændige humane GM-CSF cDNA på Barn Hl-gennemskæ-ringsstedet i M13mp8 (Viera, J. og Messing, J., Gene 19: 259-268 [1982]). For at fremstille et dobbeltstrenget fragment, der bærer kodesekvensen for det udviklede pro-10 tein, konstruerer man en oligonucleotidprimer AGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCAT. Denne primer hybridiserer man derefter med en enkeltstrenget Ml3mp8, der bærer den humane GM-CSF cDNA og udvider den ved hjælp af DNA-poly-merase I Klenow-fragmentet. Man kløver den dobbeltstren-15 gede DNA med Bam Hl og fjerner den enkeltstrengede region ved mung-bønnenuclease. Derefter isolerer man det dobbeltstrengede fragment, der bærer kodesekvensen for humant GM-CSF udviklet protein og kloner det på Stul-gennemskæringsstedet i den almindelige sekretionsvektor 20 pMFx8. Dette plasmid DNA (der bærer TRPl-genet) kan indføres i gærceller ved lithiumacetatfremgangsmåden (Ito, H. et al., J. Bacteriol. 153: 163-168 [1983]), og man kan udvælge transformanter i et syntetisk medium, der mangler tryptophan. Man lader derefter transformanterne 25 gro i almindeligt medium supplementeret med 0,5% casami-nosyrer. Når man skal indsamle gærcellerne, udsuspenderer man dem først igen i phosphatpufret saltopløsning (PBS), der indeholder 1 mM PMSF og slår dem derefter i stykker ved kraftig rystning med glaskugler, der er vas-30 leet i syre. Man opnår en klar væske over dem ved centrifugering ved 10.000 rpm i 15 minutter.

Man kan foruden mikroorganismer også benytte cellekulturer ud fra multicellulære organismer, specielt DK 174598 B1 23 celler fra pattedyr som værter. Eksempler på sådanne nyttige cellelinier som værter er HeLa-celler,, kinesisk hamsterlivmodercellelinier og babyhamsternyrecelleli-nier. Ekspressionsvektorer for sådanne celler indeholder 5 normalt, som det er nødvendigt, et replikationssted, en promotor, der sidder foran det gen, der skal eksprimeres sammen med eventuelt nødvendige bindingssteder for ribosom, RNA-splejsningssteder, polyadenyleringssteder og transkriptionserminatorsekvenser. Når ekspressionsvekto-10 rerne benyttes i celler fra pattedyr, har de ofte kontrolfunktioner, der indføres fra virusmateriale. F.eks. udvinder man normal anvendte promotorer fra polyoma,

Adenovirus 2 og oftest fra SV40 (se f.eks. U.S. patent nr. 4.399.216 og Gheysen, D. og Fiers, W., J. of Mol.

15 and Appl. Genetics 1: 385-394 [l982]).

Rensning og formuleringer

De humane GM-CSF-polypeptider, som er eksprimere-de i L coli i gær eller i andre celler, kan renses ved 20 fremgangsmåder kendt af fagmanden, deriblandt ammonium-sulfatudfældning, adskillelse ved søjlechromatografi (f.eks. ionbytter, gelfiltrering, elektroforese, affini-tetschromatografi osv.) og endelig ved krystallisering (se generelt "Enzyme purification and Related Tech-25 niques", Methods in Enzymology, 22: 233-577 [1977] og

Scopes, R., Protein Purification: Frlclples and Prac.

tice, Springer-Verlag, New York [1982]). Når polypepti-derne først er helt eller delvist renset, kan de benyttes til forskningsformål, f.eks. som supplement til 30 vækstmedier for celler (f.eks. minimum nødvendigt medium Eagle, Iscove's modificeret Dulbecco Medium eller RPMI 1640, fås fra Sigma Chemical Company, St.Louis, Missouri og GIBCO Division, Chargin Falls, Ohio) og som antigen- DK 174598 B1 24 middel ved frembringelse af specielle immunoglobuliner som er nyttige ved immunoassays, immuno-fluorescente farvninger osv. (se generelt Immunological Methods,

Vols. I & II, Eds. Lefkovits, I, og Pernis, B., Academic 5 Press, New York, N.Y. [1979 & 198l]; og Handbook of Experimental Immunology, ed. Weir, D., Blackwell Scientific Publications, St. Louis, MO [1978]).

Polypeptiderne ifølge opfindelsen kan også anvendes i farmaceutiske kompositioner, f.eks. som en for-10 stærkelse af det naturlige forsvar mod forskellige neo-plastiske og infektiøse sygdomme eller i forbindelse kemoterapi for at overvinde myelosuppression (se, Gas-son, J. et al., "Lymphokines and Hematopoiesis1' i Normal and Neoplastic Hematopoisesis, siderne 129-139, 15 Alan R. Liss, Inc. New York [1983]).

Når man skal fremstille farmaceutiske kompositioner, der indeholder polypeptiderne ifølge opfindelsen, blander man disse polypeptider med foretrukne inerte farmaceutisk acceptable bærere. Passende bærere 20 og fremgangsmåder til deres fremstilling kendes af fagmanden (se f.eks. Remington's Pharmaceutical Science og U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA [l980]). Det foretrækkes at tilføre præparaterne parenteralt, og man kan også benytte meka-25 niske tilføringssystemer.

Det foretrækkes, at en farmaceutisk komposition foreligger som enhedsdosis. På en sådan form opdeler man præparationen i enhedsdoser, der indeholder passemde mængder af den aktive komponent. Mængden af aktiv kompo-30 nent i en enhedsdosis kan ligge mellem l pg til 100 pg, alt efter anvendelse og styrken af det aktive indhold. Kompositionerne kan om ønsket også indeholde andre terapeutiske midler.

DK 174598 B1 25

Man kan variere dosis efter patientens krav, efter sygdommens alvor og efter hvilken forbindelse man benytter. Bestemmelse af dosisstørrelse for en bestemt situation tilhører fagmanden. Man begynder almindeligvis 5 en behandling med små doser, mindre end den optimale dosis. Derefter forøges dosis i små portioner, indtil man opnår den bedste effekt efter omstændighederne. Man kan af bekvemmelighedsgrunde opdele den totale daglige dosis og indgive den i portioner i løbet af dagen.

10 De følgende eksperimenter skal ikke anses som be grænsende .

EKSPERIMENTER

A. Klonede humane hjælpe T-celler 15 1) Man isolerede en klon af humane T-celler be tegnet T-7 ifølge fremgangsmåden beskrevet i kapitel 36 og 37 af Isolation, Characterization, and Utilization of T Lymphocyte Clones, Eds. Fathman, C. og Fitch, F. , Acade-20 mic Press, New York (1982). Cellelinien blev opretholdt med en konstant koncentration på ca. 0,5 x 105 celler pr. ml i Dulbecco's modificerede Eagle (DME) medium med 10% varme-de-aktiveret kalvefosterserum, 5 x 10“® Μ 2-ME, 2 25 mM glutamin, ikke livsnødvendige aminosyrer og livsnødvendige vitaminer præpareret med 30% væske stående over humane periferale leuko-cytter stimuleret med phytohæmaglutinin (PHA).

30 2) PHA-Aktivering af T-7 celler: Man dyrkede cel

lerne ved 5 x 105 pr. ml i DME med 4% varmedeaktiveret kalveforsterserum, 5 x 10“5 M

2-ME, 2 mM glutamin, ikke livsnødvendige ami- DK 174598 B1 26 nosyrer, livsnødvendige vitaminer og 4 pg pr. ml ConA, Efter 4-6 timers inkubering ved 37°C i 10% CO2 centrifugerede man cellesuspensionen ved 1500 o/m i 10 minutter. Det klumpede bund-5 fald af celler blev øjeblikkelig nedfrosset til -70°C. Centrifugatet blev filtreret (Nal-gen-0,22 y) og opbevaret ved -80°C som kilde for vækstfaktorer. Lige store mængder af centrifugatet blev undersøgt for CSF aktivitet 10 (se nedenfor) så man kunne bekræfte, at celle linien var blevet induceret ved PHA-behandlin-gen.

B. Knoglemarv og cordablod-assays 15 Knoglemarvsceller fra patienter uden hæmato- logiske sygdomme blev anbragt i lag på Ficoll (type 400, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), centrifugeret (2.000 o/m, 20 minutter, og cellerne ved fasegraensen blev fjernet. Disse 20 celler blev to gange vasket med "iscove’s Mo dified Dulbeccos' Medium" med indhold af 10% kalvefosterserum (FCS), udsuspenderet i samme medium, og de celler, der klæbede til plastik Petri-skåle blev fjernet. De celler, der ikke 25 klæbede, blev med en koncentration på 105 cel ler pr. ml sat til Iscove's Medium, der indeholdt 20% FCS, 50 ym 2-mercaptoethanol, 0,9% methylcellulose og diverse koncentrationer af enten centrifugater med kendt indhold af ko-30 lonistimulerende aktivitet eller centrifu gater, der skulle prøves. Man anbragte ens portioner på 1 ml i 35 ml Petri-skåle og op-kultiverede ved 37°C i en fuldstændig fugtig DK 174598 B1 27 atmosfære, der indeholdt 6% C02 i luft. Tre dage efter kulturens initiering satte man en enhed erythropoietin (Eaves, A. British Columbia Cancer Research Center, Vancover, B.C.) 5 til hver plade. Efter 10-14 dage indsamlede man granulocyt-makrofagkolonier og udbrud af erythroider, idet man benyttede et omvendt mikroskop.

Cordablodceller i heparin blev centrifu-10 geret ved 2.000 o/m i 6 minutter. De hvide blodceller ved fasegrænsen mellem plasma og de røde blodceller blev overført til et glas, der indeholdt 0,17 N ammoniumchlorid og 6% FCS.

Efter 5 minutter på is tilsatte man 4 ml FCS 15 til suspensionen og centrifugerede i 6 minut ter ved 2.000 o/m. Klumpen af celler blev vasket med Dulbecco's phosphatpufrede saltopløsning og behandlet med klæbning til Ficoll og plast som beskrevet ovenfor for knogle-20 marvscellerne. De ikke-klæbende celler med lav tæthed blev indsamlet og anbragt med 105 cel-ler/kultur i det halvfaste agarsystem som beskrevet ovenfor.

Ved slutningen af prøverne bestemte man 25 den cellulare sammensætning, idet man anbragte de enkelte kolonier på glas og farvede med Wright/Giemsa. Man bestemte eosinofile ved farvning med Luxol Fast Blue (Johnson, G. og Metcalf, D., Exp. Hematol. 8: 549-561 [1980]).

DK 174598 B1 28 C. Isolering af mRNA fra humane celler.

1) Man isolerede total cellulær rna fra celler ved hjælp af guanidinisothiocyanatfremgangsmåden ifølge Chirgwin, J. et al., (Biochemi-5 stry, 18: 5294-5299 [1979 ]).

Man udsuspenderede frosne celleklumper fra ikke-inducerede eller ConA-inducerede humane hjælpeceller (4 timer efter stimulering) i guanidinisothiocyanatlyseringsopløsning. Man benyttede 20 ml lyseringsopløsning til 1,5 x 108 celler. Celleklumperne blev udsuspenderet ved hjælp af pipettering, og DNA blev så udsat for fysisk belastning ved 4 gange at passere gennem en sprøjte med kaliber 16 nål.

15 Man anbragte lysatet ovenpå 20 ml 5,7 M CsCl, 10 mM EDTA i 40 ml polyallomercentrifugerør. Opløsningen blev centrifugeret ved 25.000 o/m i en Beckman SW28 rotor (Beckman Instruments,

Inc., Palo Alto, CA) i 40 timer ved 15°C. Gua-2° nidinisothiocyanatfasen, der indeholdt DNA

blev afpipetteret fra toppen ned til fasegrænsen. Væggene af røret og fasegrænsen blev vasket med 2-3 ml guanidinisothiocyanatlyse-ringsopløsning. Røret blev klippet over under 25 fasegrænsen med en saks, og CsCl-opløsningen dekanteret fra. Man vaskede RNA-klumperne to gange med kold 70% ethanol. De blev derefter udsuspenderet i 500 yl 10 mM Tris.HCl pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,05% SDS, 50 yl 3 M natriumacetat 50 blev tilsat, og man udfældede RNA med 1 ml ethanol. Ved centrifugering indsamlede man ca.

0,3 mg total RNA og vaskede bundfaldet en gang med kold ethanol.

DK 174598 B1 29 2) Isolering af polyA+ mRNA:

Det vaskede og tørrede bundfald af total RNA blev udsuspenderet i 900 yl oligo (dT) elu-eringspuffer (10 mM Tris.HCl, pH 7,4, 1 mM

5 edta, 0,5% SDS). RNA blev i 3 minutter ophedet til 68°C og derefter afkølet på is. Man tilsatte 100 yl 5 mM NaCl. RNA-Prøven blev anbragt på en 1,0 ml oligo (dT) i cellulosesøjle (type 3, Collaborative Research, Waltman,

10 MA) bragt i ligevægt med bindingspuffer (10 mM

Tris.HCl pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 0,5% SDS). Gennemløbet fra kolonnen blev påsat kolonnen to gange mere. Derefter vaskedes man søjlen med 20 ml bindingspuffer. Man indsamle-15 de polyA+ mRNA ved at vaske med elueringspuf- fer. RNA blev i det store og hele elueret med de første 2 ml elueringspuffer. Man udfældede RNA med 0,1 rumfang 3 M natriumacetat (pH 6) og 2 rumfang ethanol. Man centrifugerede RNA 20 fra og vaskede bundfaldet to gange med kold ethanol og tørrede det. Derefter udsuspenderede man bundfaldet i vand. Man fortyndede lige store portioner og bestemte absorbansen ved 260 nm.

25 D. Fremstilling af et cDNA-bibliotek: 1) Fremstilling af vektorprimer og sammenbindende DNA med oligo dG-hale:

Man benyttede fremgangsmåden ifølge 30 Okayama & Berg (Mol. & Cell. Biol. 2: 161-170

[1982] med små ændringer og tilpasset pcDVl-og pLl-plasmiderne beskrevet af Okayama & Berg (Mol. & Cell. Biol. 3: 380-389 [1983]) .

DK 174598 B1 30

Man fordøjede en 80 yg prøve af pcDVl DNA ved 30°C med 20 enheder Kpnl endonuclease i en reaktionsblanding på 450 μΐ, der indeholdt 6 mM Tris.HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 6 mM NaCl, 6 5 mM 2-ME og 0,1 mg serumalbumin fra køer (BSA) pr. ml. Efter 16 timer afsluttede man fordøj -ningen med 40 yl 0,25 M EDTA (pH 8,0) og 20 yl 10% natriumdodecylsulfat (SDS); man udvandt DNA ved at ekstrahere med vandmættet 1:1 phe-10 nol-CHClj (herefter kaldet phenol-CHCl3) og udfældning med ethanol. Homopolymere endestykker med i gennemsnit 60, men ikke mere end 80 desoxythymidylat (dT) residuer pr. endestykke på sat endepositioner genereret med Kpnl endo-15 nuclease ved hjælp af kalvebrisselterminal transferase som følger: Reaktionsblandingen (38 yl) indeholdt natriumcacodylat-30 mM Tris-HCl, pH 6,8 som puffer med 1 mM CoCl2, 0,1 mM dithiothreitol, 0,25 mM dTTP DNA fordøjet med 20 Kpnl-endonuclease og 68 enheder af terminal desoxynucleotidyltransferase (P-L Biochemi-cals, Inc. Milwaukee, WI). Efter 30 minutter ved 37°C standsedes reaktionen med 20 yl 0,25 M EDTA (pH 8,0) og 10 yl 10% SDS, og man gen-25 vandt DNA efter adskillige ekstraktioner med phenolCHCl3 og ethanoludfældning. Derefter fordøjede man DNA med 15 enheder EcoRl-endonu-clease i 50 yl, der indeholdt 10 mM Tris.HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol og 30 0,1 mg BSA pr. ml i 5 timer ved 37°C. Det sto re fragment, der indeholdt SV40 polyadenyle-ringspositionen og pBR322 replikationsenheden og genet for modstand mod ampicillin blev ren- DK 174598 B1 31 set ved hjælp af agarose (1%) gelelektroforese og genudvundet fra gelen ved en modifikation af glaspulverfremgangsmåden (Vogelstein, B. & Gillespie, D., Proc. Nat. Acad. Sci. 76: 615-5 619 [l979]). DNA med dT-endestykket blev yder ligere renset ved absorption og eluering fra oligo (dA)-cellulosesøjle som følger: DNA blev opløst i 1 ml mM Tris.HCl pH 7,3 puffer, der indeholdt 1 mM EDTA og 1 M NaCl, kølet til 0°C 10 og påsat en oligo (dA)-cellulosesøjle (0,6 x 2,5 cm), der var bragt i ligevægt med samme puffer ved 0°C. Søjlen blev vasket med samme puffer ved 0°C og elueret med vand ved stuetemperatur. Det eluerede DNA blev udfældet med 15 ethanol og opløst i 10 mM Tris-HCl pH 7,3 med 1 mM EDTA.

Sammenbindings DNA med oligo (dG) endestykke blev fremstillet, idet man fordøjede 7 5 pg pLl DNA med 20 enheder Pstl endonuclease 20 i 450 pi, der indeholdt 6 mM Tris.HCl pH 7,4, 6mM MgCl2# ® mM 2-ME, 50 mM NaCl og 0,01 mg BSA pr. ml. Efter 16 timer ved 30°C ekstraherede man reaktionsblandingen med phenol-CHCl3 og udfældede DNA med alkohol. Derefter tilsat-25 te man endestykker på 10 til 15 desoxyguanylat (dG) residuer pr. ende med 46 enheder terminal desoxynucleotidyltransferase i den samme reaktionsblanding (38 pi) som beskrevet ovenfor, bortset fra, at dTTP blev erstattet med 0,1 mM 30 dGTP. Efter 20 minutter ved 37°C ekstraherede man blandingen med phenol-CHCl3, derefter udfældede man DNA med ethanol og fordøjede med 35 enheder HindiII endonuclease i 50 pi, der DK 174598 B1 32 indeholder 20 mM Tris.HCl pH 7,4, 7 mM MgCl2, 6 0 mM NaCl og 0,1 mg BSA ved 37°C i 4 timer.

Det lille sammenbindings DNA med oligo (dG)-endestykke blev renset ved agarosegel (1,8%) 5 elektroforese og genudvundet som beskrevet ovenfor.

2) Fremstilling af cDNA bibliotek:

Trin 1: cDNA-syntese. Reaktionsblandingen 10 (10 yl) indeholdt 50 mM Tris.HCl pH 8,3, 8 mM

MgCl2, 30 mM KC1, 0,3 mM dithiothreitol, 2 mM af hver af dATP, dTTP, dGTP og dCTP, 20 yCi ^2P-dCTP (3000 Ci/mmol), 3 yg polyA+ RNA fra Con-A inducerede T-celler, 60 enheder RNasin 15 (Biotec, Inc., Madison, Wl), og 2 yg vektor primer DNA (15 pmol af primerenden) og 45 enheder revers transkriptase. Reaktionen blev inkuberet 60 minutter ved 42°C og derefter standset ved tilsætning af 1 yl 0,25 M EDTA 20 (pH 8,0) og 0,5 yl 10% SDS; man tilsatte 40 yl phenol-CHCl3 og blandede opløsningen kraftigt med en vortex-blander, hvorefter man centrifugerede. Efter tilsætning af 40 yl 4 M ammoniumacetat og 160 yl ethanol til den vandige 25 fase afkølede man opløsningen med tøris i 15 minutter, opvarmede til stuetemperatur under mild omrystning med det formål at opløse ikke reagerede desoxynucleosidtriphosphater som var udskilt under afkølingen og centrifugerede i 20 10 minutter i en Eppendorf-mikrocentrifuge.

Bundfaldet blev opløst i 10 yl 10 mM Tris.HCl pH 7,3 og 1 mM EDTA blandet med 10 yl 4 M ammoniumacetat og genudfældet med 40 yl ethanol, en fremgangsmåde, der fjerner mere end 99% DK 174598 B1 33 ikke reagerede desoxynucleotidtriphosphater. Bundfaldet blev derefter renset med ethanol.

Trin 2: Addition af oligodesoxycytidylat [oligo (dC)]. Bundfaldet, der indeholdt plas-5 mid-cDNA:mRNA blev opløst i 20 μΐ 140 mM na- triumcacodylat-30 mM Tris-HCl pH 6,8 puffer, der indeholdt 1 mM CoCl2, 0,1 mM dithiothrei-tol, 0,2 pg poly(A), 70 μΜ dCTP, 5 yCi 32p-dCTP, 3000 3000 Ci/mmol og 60 enheder termi-10 nalt desoxynucleotidyltransferase. Man udfør te reaktionen ved 37 °C i 5 minutter for at tillade additionen af 10-15 residuer dCMP pr. endestykke og afsluttede den derefter med 2 μΐ 0,25 M EDTA (pH 8,0) og 1 μΐ 10% SDS. Efter 15 ekstraktion med 20 μΐ phenol-CHCl3, blandede man den vandige fase med 20 μΐ 4 M ammoniumacetat, udfældede DNA og genudfældede den med 80 yl ethanol og rensede endelig bundfaldet med ethanol.

20 Trin 3: Fordøjelse med Hindlll-endonu-

clease. Man opløste bundfaldet i 30 μΐ puffer, der indeholdt 20 mM Tris.HCl pH 7,4, 7 mM

MgCl2, 60 mM NaCl og 0,1 mg BSA pr. ml og fordøjede derefter med 10 enheder Hindlll-endo-25 nuclease i 2 timer ved 37°C. Reaktionen blev standset med 3 μΐ 0,25 M EDTA (pH 8,0) og 1,5 μΐ 10% SDS og efter ekstraktion med phenol-CHCI3 fulgt af addition af 30 μΐ 4 M ammoniumacetat, udfældede man DNA med 120 yl ethanol.

30 Bundfaldet blev renset med ethanol og derefter opløst i 10 yl 10 mM Tris.HCl (pH 7,3) og 1 mM EDTA, og man tilsatte 3 yl ethanol for at forhindre frysning under opbevaring ved -20°C.

DK 174598 B1 34

Trin 4: Ringdannelse ved hjælp af sammenbindings DNA med oligo (dG)-endestykke. En 9 yl prøve af Hindlll endonuclease fordøjet oligo (dC)-endestykke forsynet cDNArmRNA-plasmid 5 (ca. 90% af prøven) blev inkuberet i en blan ding (90 yl), der indeholdt 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl og 1,8 pmol af sammenbindings DNA med oligo (dG)-endestykket ved 65°C i 5 minutter, temperaturen ændredes 10 til 42°C i 60 minutter, derefter kølede man til 0°C. Man forøgede rumfanget af blandingen (90 yl) til 900 yl med indhold af 20 mM Tris.HCl pH 7,5, 4 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2S04, 0,1 M KC1, 50 yg BSA pr. ml og 0,1 mM β-NAD; 15 derefter tilsatte man 6 yg L coli DNA-ligase og inkuberede opløsningen natten over ved 12°C.

Trin 5: Ombytning af RNA-streng med DNA.

Med det formål er at erstatte RNA-strengen i 20 indsætningsstykket, tilpassede man ligerings blandingen, så den indeholdt 40 ymol af hver af de fire desoxynucleosidtriphosphater, 0,15 mM b-NAD, 4 yg yderligere E_;_ coli DNA-ligase, 16 enheder coli NDA-polymerase I (Poll), og 25 9 enheder Ej_ coli RNase H. Denne blanding (960 yl) blev efter tur inkuberet ved 12°C og ved stuetemperatur hver gang i 1 time med det formål at opnå bedst mulig reparationssyntese og haktranslation ved Poll.

20 Trin 6: Transformation af coli. Man udførte transformationen ved med små ændringer at benytte fremgangsmåden beskrevet af Cohen et al., (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 69: DK 174598 B1 35 2110-2114 [1972]). Man opdyrkede coll K-12 type MC1061 (Casabadan, M. og Cohen, S., J.

Mol. Biol. 138: 179-207 [19803) til 0,5 absor-bansenheder ved 600 nm ved 37°C i 20 ml L-urt.

5 Man indsamlede cellerne ved centrifugering, udsuspenderede i 10 ml 10 mM Tris.HCl pH 7,3, der indeholdt 50 mM CaCl2 og centrifugerede ved 0°C i 5 minutter. Man udsuspenderede cellerne i 2 ml af den ovennævnte puffer og in-10 kuberede igen ved 0°C i 5 minutter, derefter blandede man 0,2 ml af cellesuspensionerne med 0,1 ml af DNA-opløsningen fra trin 5 og inkuberede ved 0°C i 15 minutter. Derefter holdt man cellerne ved 37°C i 2 minutter og derefter 15 ved stuetemperatur i 10 minutter; man tilsatte så 0,5 ml L-urt og inkuberede kulturen ved 37°C i 30 minutter, blandede med 2,5 ml L-urt blød agar ved 42°C og udspredte på L-urtagar, der indeholdt 50 yg ampicillln pr. ml. Efter 20 inkubering ved 37°C i 12-24 timer plukkede man individuelle kolonier ud med sterile tandstikkere. Man genererede i alt ca. 5 x 104 uafhængige cDNA-kloner.

25 e. Gennemsøgning af human T-celle cDNA-bibliotek ved hjælp af DNA-transficering:

Man udtog uafhængigt og tilfældigt en samling på 104 kloner fra T-celle cDNA-biblioteket og dyrkede dem individuelt i fordybninger i mikrotiterplader, der inde-30 holdt 200 yl L-urt med ampicillin, 50 yg pr. ml og di-methylsulfoxid, 7%. Samlinger, der indeholder 48 cDNA-kloner blev fremstilles ud fra mikrotiterkulturerne.

Man lod 40 sådanne samlinger gro i 1 liter kultur af L- DK 174598 B1 36 uct, der indeholdt 100 yg pr. ml ampicillin. Man isolerede plasmid DNA fra hver kultur, rensede to gange gennem CsCl-gradient. DNA, der repræsenterede hver samling, blev transficeret i COS-7-abeceller som følger.

5 Én dag før transf iceringen såede man ca. 106 COS-7-abeceller på individuelle 60 mm plader i DME, der indeholdt 10% kalvefosterserum og 2 M glutamin. For at udføre transficeringen sugede man mediet væk fra hver plade og erstattede med 1,5 ml DME, der indeholdt 50 mm 10 Trls.HCl pH 7,4, 400 pg pr. ml DEAE-dextran og 15 pg af det plasmid DNA, der skulle prøves. Man inkuberede pladerne 4 timer ved 37°C, fjernede så det DNA-holdige medium og vaskedes to gange pladerne med 2 ml serumfri DME. Derefter satte man DME, der indeholdt 150 pM chlo-15 roquin, på pladerne, og inkuberede dem yderligere 3 timer ved 37°C. Pladerne blev vasket én gang med DME og derefter tilsatte man DME, der indeholdt 4% kalvefosterserum, 2 mm glutamin, penicillin og streptomycin. Man inkuberede derefter cellerne 72 timer ved 37°C. Vækst-20 mediet blev samlet og undersøgt for human GM-CSF-aktivi-tet som beskrevet ovenfor.

Fire samlinger (grupperne 1A, 3B, 7A og 14A) udviste human GM-CSF-aktivitet (se tabel I nedenfor). Hver gruppe blev så opdelt i 6 samlinger, der hver indeholdt 258 af de originale kloner, der indgik i samlingerne. En lille samling fra hver af de første samlinger var positiv i tranficeringsassayet undtagen i tilfælde af 7A, hvor man fik to positive små samlinger. Hver af plasmi-derne i fire af de fem små samlinger blev individuelt 30transficeret på COS-7-celler. Fire enkeltkloner betegnet 3-8a, 7-la, 7-4d og 14-le var aktive med hensyn til at producere GM-CSF-aktivitet. Restriktionsendonucleaseana-lyse viste, at alle disse kloner i det væsentlige besidder den samme struktur.

37 DK 174598 B1 I Tabel I vises, hvor mange hæmopoietiske kolonier, der bliver stimuleret ved hver tranficeringsprøve i assays med cordablod udført to gange. En gruppe repræsenterer 20-50 celler, en lille koloni 51-150 celler 5 og en koloni mere end 150 celler.

DK 174598 B1 38

Tabel I

Assay for kolonistimulerende aktivitet fra transfice-ring ud fra plasmid DNA-samlinger, Første undersøgelse 40 samlinger med 48 kloner (1-20, 5 A + B)

Falsk inficeret COS-7: 7 + 12 grupper

Samling 1A: 29 + 25 grupper

Samling 3B: 38 + 20 grupper 10 Samling 7A: 22 + 19 grupper

Samling 14A: 26 + 32 grupper Alle andre samlinger: mindre end 20 grupper 15 Anden undersøgelse Småsamlinger på 8 kloner

Falsk inficeret COS-7: 9+15 grupper

Undersamling 1-5: 56 + 54 grupper Undersamling 3-8: 98 + 52 små 20 kolonier

Undersamling 7-1: 29 + 41 små kolonier

Undersamling 7-1: 100 + 93 små kolonier 25 Undersamling 14-1: 40 + 73 små kolonoer

Alle andre undersamlinger mindre end 20 grupper 30 Tredie undersøgelse Individuelle kloner

Klon 3-8a: 120 + 127 kolonier Klon 7-la: 198 + 164 kolonier DK 174598 B1 39

Klon 7-4a: 176 + 160 kolonier Klon 14-le: 62 + 67 kolonier Alle andre kloner: mindre end 20 grupper 5

Et plasmid (pcD-human-GM-CSF) med et cDNA-indsætningsstykke, der i det væsentlige er af fuld længde vises i fig. 2 og en E.coll bakterie (MC1061), der bærer plasmidet er blevet deponeret hos ATCC med nr. 39923.

10 i fig. 2 vises transkriptionen af det 776 pb lange cDNA-indsætningsstykke, der findes i pcD-ekspressions-vektoren fra SV40 tidlig promotoren ved hjælp af en pil.

Man viser placeringen af splejsningsdonoren og acceptor-positionerne. Der findes et polyadenyleringssignal, til-15 vejebragt fra SV40, ved 3'-enden i cDNA-indsætningsstyk-ket. Regionen, der koder for GM-CSF i cDNA-indsætnings-stykket er kraftigt skraveret, mens de ikke-kodende regioner er let skraveret. Resten af sekvenserne i vektoren er tilvejebragt fra pBR322 og omfatter a-lactama-20 segenet (AmpR) og replikationsenheden.

Man bestemte 3-8a sekvensen både ved hjælp af M13 didesoxykædetermineringsmetode {Sanger, F.,et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463-5467 [1977 ]) og den modificerede Maxam/Gilbert-teknik (Rubin, C. og Schmid, 25C., Nucleic Acid Res. 8: 4613-4619 [l98l]). cDNA-Indsæt-ningsstykket indeholder en enkelt åben læseramme. Det første ATG er fundet 33-35 nucleotider fra 51-enden og følges af 144 codoner før termineringstripletten (TGA) forekommer ved nucleotidpositionerne 465-467.

30 Tabel II viser en procentisk fordeling af sammen sætningen af celler i ca. 60 humane knoglemarvs- og cor-dablodkolonier dyrket under indflydelse af de individuelle kloner 3-8a, 7-la, 7-4d og 14-le. Eksistensen af DK 174598 B1 40 blandede kolonier af eosinofile og de andre celletyper kan skyldes, at nogle kolonier er groet ind i hinanden.

Tabel II

5 Cellesammensætningen af human knoglemarvskolonier.

Neu ΜΘ Eos Neu/MØ Μθ/Eos Neu/MØ/Eos 15% 30% 7% 37% 2% 9% 10 Man har isoleret et stykke cDNA med fuld længde (inkluderende en signalsekvens), der koder for muse-GM-CSF-aktivitet og en E.coli bakterie (MC1061), der bærer et pcD-plasmid med muse-cDNA er blevet deponeret hos ATTC med nr. 39924. En 32P-mærket sonde fra PST I/Ala 15 in fragmentet fra muse-cDNA hybridiserede under ikke stringente betingelser (42°C) med en af de humane GM-CSF-cDNA ifølge opfindelsen (se Maniatis, T. et al.,

Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbos Laboratory [1982]).

20 Fig. 3 er en sammenligning mellem den antagne mu se og den antagne humane GM-CSF-proteinsekvens. Identiske residuer er understreget (efter man har bragt dem på linie), mens residuer, der kun findes i humanprotein men ikke i museprotein, betegnes med en asterisk, og residu-25 er der kun findes i museprotein (dvs. Ser+Asn på positionerne 57-58 og Lys-Lys ved position 65) betegnes med en kort lodret linie. Homologien mellem CDNA fra muse-og human GM-CSF er overraskende stor. Der er alt i alt ca. 70% homologi mellem de to CM-CSF-sekvenser (Brutlag, 30D. et al., Nucleic Acids Res. 10: 279-294 [l98l]). Det humane GM-CSF ifølge opfindelsen stimulerer imidlertid ikke væksten af musehæmapoietiske stammeceller in vitro i særlig høj grad.

DK 174598 B1 41

Klonbiblioteket med pcD-eksprimeringsvektoren tillod identifikation af fuldstændige cDNA-kloner ved direkte eksprimering i celler fra pattedyr. Man kunne specielt direkte identificere komplette humane GM-CSF 5 cDNA-koloner ved at transficere C0S-7-celler med tilfældig udvalgte cDNA-kloner og måle GM-CSF-aktiviteten i væsken over cellerne. Disse resultater bekræfter, at identifikationen af fuld længde cDNA-kloner af lymfoki-ner eller hormoner alene kan opnås på basis af påvisnin-10 gen af et funktionelt polypeptid i eukaryotiske celler.

Man kan af de foregående se, at cDNA-klonerne ifølge opfindelsen tilvejebringer nøjagtige og fuldstændige sekvensdata for et humant GM-CSF. Opfindelsen tilvej ebringer også fagmanden midler til at fremstille sig-15 nifikante mængder af den faktor (som i det væsentlige er fri for andre hæmatopoietiske faktorer), der sørger for forbedret in vitro opretholdelse af neutrofile granulo-cyter og makrofager såvel som andre hæmatopoietiske celler (f.eks. eosinofile). Den oplysning man har fået fra 20 cDNA-klonerne forbedrer desuden forståelsen af immunresponset hos pattedyr og forstræker muligheden for fremtidig forskning.

Claims (10)

1. Glycosyleret eller ikke glycosyleret rekombi-nant polypeptid, kendetegnet ved, at det opviser aktivitet som kolonistimulerende faktor på humane neutrofile granulocyter, makrofager og eosinofile, og at 5 det besidder strukturen Mec Trp Leu Gin Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg· Ser Pro Ser Pro Ser Tir Gin Pro Trp Glu Eis Val Asn Ala Ile Gin Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Xet 10 Phe Asp Leu Gin Glu Pro Thr Cys Leu Gin Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gin 'Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Ihr Met Met Ala Ser Kis Tyr Lys Gin Kis Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gin Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gin Glu, 15 idet polypeptidet ikke omfatter en del af et menneske.

2. Polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det mangler en signalsekvens.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af et rekombi-20 nant polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man (a) danner en vektor omfattende en nucleotidsekvens, der koder for polypeptidet, og hvor nucleotidse-kvenen kan eksprimeres af en vært, der indeholder 25 vektoren; (b) inkorporerer vektoren i værten; og (c) opretholder værten under betingelser, der er egnede for eksprimering af nucleotidsekvensen til polypeptidet.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at polypeptidet er uden en signalsekvens. 43 DK 174598 B1

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3 eller 4, kendetegnet ved, at polypeptidet er glycosyleret.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3 eller 4, kendetegnet ved, at polypeptidet er ikke glycosyle- 5 ret.

7. Nucleotidsekvens, kendetegnet ved, at de koder for et polypeptid, der kan opnås ved en fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 3 til 6. 1°

8· Nucleotidsekvens ifølge krav 7, kende tegnet ved, at den omfatter nucleotidsekvensen ATG TGC CTG CAG AGC CTG CTG CTC TTG OCK ACT GTG CCC ICC AGC ATC TCT GCA CCC GCC CGC TCG CCC AGC CCC AGC ACG ^ CAG CCC TGG GAG CAT GTG AAT GCC ATC CAG GAG GCC CGG CGT CTC CTG AAC CTG AGT AGA GAC ACT GCT GCT GAG ATG AAT GAA ACA GTA GAA GTC ATC TCA GAA ATG TIT GAC CTC CAG GAG CCG ACC TGC CIA CAG ACC CGC CTG GAG CTG TAC AAG CAG GGC CTG CGG GGC AGC CTC ACC AAG CTC AAG GGC CCC TTG ACC ATG ATG GCC AGC CAC TAC AAG CAG CAC TGC CCT CCA ACC CCG GAA ACT TCC TGT GCA ACC CAG ATT ATC ACC TTT GAA AGT TTC AAA GAG AAC CTG AAG GAC TTT CTG CTT CTC ATC CCC 20 TTT GAC TGC TGG GAG CCA GTC CAG GAG.

9. vektor, kendetegnet ved, at den indeholder en DNA-sekvens ifølge krav 7 eller 8.

10. Mikroorganisme eller celle, kendeteg-25 n e t ved, at den er transformeret eller transficeret med en vektor ifølge krav 9. DK 174598 B1 BOHAN GM-CSP 10 20 30 47 ACACAGAGAG AAAGGCTAAA GTTCTCTGGA GG ATG TGG CTG CAG AGC CTG CTG CTC TTG HET Trp Lea Gin Ser Len Lea Len Len 62 77 92 107 GGC ACT GTG GCC TGC AGC ATC TCT GCA CCC GCC CGC TCG CCC AGC CCC AGC ACG Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser pro Ser Thr 122 137 152 167 CAG CCC TGG GAG CAT GTG AAT GCC ATC CAG GAG GCC CGG CGT CTC CTG AAC CTG Gin Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gin Glu Ala Arg Arg Len Len Asn Leu 182 197 212 AGT AGA GAC ACT GCT GCT GAG ATG AAT GAA ACA GTA GAA GTC ATC TCA GAA ATG Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Het Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Het 227 242 257 272 TTT GAC CTC CAG CAG CCG ACC TGC CTA CAG ACC CGC CTG GAG CTG TAC AAG CAG Phe Asp Leu Gin Glu Pro Thr Cys Leu Glo Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gin 287 302 317 GGC CTG CGG GGC AGC CTC ACC AAG CTC AAG GGC CCC TTG ACC ATG ATG GCC AGC Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser 332 347 362 377 CAC TAC AAG CAG CAC TGC CCT CCA ACC CCG GAA ACT TCC TGT GCA ACC CAG ATT His Tyr Lys Gin His Cys Pro pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gin Ile 392 407 422 437 ATC ACC TTT GAA AGT TTC AAA GAG AAC CTG AAG GAC TTT CTG CTT GTC ATC CCC Ile Thr Pbe Glu Ser Pbe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Pbe Leu Leu Val iTe Pro 452 467 477 487 497 TTT CAC TCC TGG GAG CCA GTC CAG GAG TGA GACCGGCCAG ATGAGGCTGC CCAAGCCGGG Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Glo Glu 507 517 527 537 547 5S7 567 GAGCTGCTCT CTCATGAAAC AAGAGCTAGA AACTCAGGAT GGTCATCTTG GAGGGACCAA GGGGTGGGCC 577 587 597 607 617 627 637 ACAGCCATGG TGGGAGTGGC CAGGACCTGC CCTGGGCACA CTGACCCTGA TACAGGCATG GCAGAAGAAT 647 6S7 667 677 687 697 707 GGGAATATTT TATACTGACA GAAATCAGTA ATATTTATAT ATTTATATTT TTAAAATATT TATTTATTTA 717 727 737 747 757 767 777 TTTATTTAAG TTCATATTCC ATATTTATTC AAGATGTTTT ACCGTAATAA TTATTATTAA AAATATGCTT 1 CTAAAAAAAA F1GUP 2 DK 174598 B1 HindJJL SV40 ori I iioil iq, ' r" 5p! e)s n i ncssieol ^Sk7 Xhol^tyfr/ pst I iTG'c endeS'iyk’Ke tøji— pc/ T pcD-HumGM-CSF T S cDNA iJ ||i inclf<t>\n\nc l! Jhsg/i PBR322 >v Xhol <y Nco1 ^ΐίπππίαΐίφ^Δ-Τ I A I e^ciesYi/kke i poly A B. G-C ^pal enplg-S^kke ^________i PstI Bgll NcoX AhaJK I--1 100bp DK 174598 B1 H urn an versps muse &M-CSF~ 10 MET Trp Leu Gin Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys ser ile Ser Ala Asn Phe ' ile Val Tyr Leu 20 · 30 Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gin Pro Tro Glu His Val Asn Ala Ile Thr Ile Thr Val Arg Lys Glu 40 50 Gin Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Lys Lev Asn Asp Asp Met Pro Val Leu Asn Glu Val *60 ** * ***7Q Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gin Glu Pro Thr Cvs Leu Vai I Phe I — — val Ser IAsn Lys|Lys 80 90 Gin Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gin Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lvs Leu Lys Ile Phe Glu Asn Phe 100 Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gin Bis Cvs Pro Pro Thr Aia Asn Thr Tyr Gin Thr Tyr ~~~ 110 120 £££ ίϋΗ Thr ser Cys Ala Thr Gin Ile ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Asp Glu Val Thr Tyr Ala Asp Ile Asp Ser 130 140 Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gin Glu Thr Thr Asp Glu Lys Lys Ser Lys