FI103986B - cDNA-kloonit, jotka koodaavat polypeptidejä, joilla on humaani sellulaarinen granulosyyttimakrofaagi- ja eosinofiili-kasvutekijäaktiivisuus - Google Patents

Description

103986 cDNA-kloonit, jotka koodaavat polypeptidejä, joilla on humaani sellulaarinen granulosyyttimakrofaagi-ja eosinofiili-kasvutekijäaktiivisuus - cDNA-kloner, som kodar polypeptider, som har human cellularisk granulosytmakrofag- och eosinofil-växtfaktoraktivitet 5 Tämän keksinnön kohteena on yleisesti rekombinantti-DNA-teknologian soveltaminen selvitettäessä nisäkkäiden immuunireaktion säätömekanismia ja erityisesti sellaisten nukleiinihappokloonien eristäminen, jotka koodaavat polypeptidejä, joilla on humaani granulosyytti/makrofaagi-kasvutekijäaktiivisuus, mu-10 kaan lukien eosinofiili-kasvutekijäaktiivisuus.

Rekombinantti-DNA-teknologia viittaa yleisesti tekniikkaan, jolla liitetään lahjoittavasta lähteestä saatu geneettinen informaatio vektoreihin myöhempää prosessointia varten, kuten isäntään viemistä varten, jolloin siirretty geneettinen 15 informaatio kopioituu ja/tai ekspressoituu uudessa ympäristössä. Geneettinen informaatio on yleensä komplementäärisenä DNA:na (cDNA), joka on peräisin haluttua proteiinituotetta koodaavasta lähetti-RNA:sta (mRNA). Kantaja on usein plasmidi, joka kykenee viemään cDNA:n isäntään myöhempää replikointia varten ja eräissä tapauksissa todella kontrolloimaan cDNA:n ekspressiota ja 20 näin ohjaamaan koodatun tuotteen synteesiä isännässä.

Tämä teknologia on edennyt viime vuosina äärimmäisen nopeasti ja monia erilaisia eksogeenisiä proteiineja on ekspressoitu monissa erilaisissa isännissä, mutta jonkin tietyn halutun uuden cDNA-kloonin saaminen on yhä epävarmaa.

25 Esimerkkinä mainittakoon eräitä rekombinantti-DNA-teknologialla tuotettuja eukaryoottisia proteiineja: proinsuliini (Naber, S. et ai. Gene 21: 95-104/1983/); interferonit (Simon, L. et ai.. Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 80: 2059-2062 /1983/ ja Derynck, R. et ai.. Nucl. Acids. Res. 1: 1819-1837 /1983/); kasvuhormoni ' (Goeddel, D., et ai.. Nature 281: 544-548 /1979/); ja syöttösolu-kasvutekijä ; 30 (Yokota, T. et ai.. Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 81: 1070-1074/1984/). Näiden mukaan otettujen julkaisujen ja muun jäljempänä mainitun viitemateriaalin tarkoituksena on antaa lisää yksityiskohtia kyseisen alan taustaan ja erityistapauksissa keksinnön toteuttamiselle; kaikki ne on mainittu tässä yhteydessä viitteenä.) 103986 2

Jonkin aikaa on ollut opinkappaleena, että nisäkkäiden immuunireaktio johtui pääasiallisesti joukosta monimutkaisia solujen välisiä vuorovaikutuksia, nk. “immuuniverkostosta”. Vaikkakin edelleen on selvää, että suuri osa reaktiosta todella tapahtuu lymfosyyttien, makrofaagien, granulosyyttien ja muiden solu-5 jen verkostomaisten vuorovaikutusten ympärillä, immunologit ovat nykyään sitä mieltä, että näiden solujen välisten vuorovaikutusten ohjaamisessa on kriittinen rooli liukoisilla proteiineilla (esimerkiksi nk. lymfokiineilla).

Lymfokiinit ilmeisesti välittävät sellulaarisia aktiivisuuksia monin eri tavoin.

10 Niiden on osoitettu kykenevän tukemaan erilaisten verta muodostavien solujen lisääntymistä ja kasvua, ja itse asiassa niillä uskotaan olevan ratkaiseva osuus monipotentiaalisten verta muodostavien kantasolujen perustason erikoistumisessa valtavaksi määräksi immuunireaktiosta vastaavien erilaisten solulinjojen kantamuotoja. Tässä reaktiossa tärkeisiin solulinjoihin kuuluu kaksi lymfosyyt-15 tiluokkaa: B-solut, jotka voivat tuottaa ja erittää immunoglobuliineja (proteiineja, jotka kykenevät tunnistamaan vieraan aineen ja sitoutumaan siihen sen poistamiseksi), ja T-solut (joilla on eri alaryhmiä), jotka erilaisten mekanismien kautta indusoivat tai tukahduttavat B-soluja ja eräitä muita soluja (mukaan lukien muita T-soluja), jotka muodostavat immuuniverkoston.

20

Toinen tärkeä valkoisten verisolujen tyyppi on fagosyytti, erityisesti liuskatumaiset ja yksitumaiset leukosyytit. Näiden solujen uskotaan erikoistuneen siivoamiseen, mikä kyky oleellisesti auttaa poistamaan vieraat organismit ja poistamaan toimimattomat solut ja ekstrasellulaariset jätteet.

25 Näihin leukosyyttisolutyyppeihin kuuluvia ovat granulosyytit mukaan lukien neutrofiilit ja eosinofiilit. Neutrofiileja voidaan löytää periferiaverestä, monista kudoksista ja useimmista kehon alueista, jotka ovat suorassa kosketuksessa ympäristön kanssa (esimerkiksi suuontelo, keuhkoputken ja kurkkutorven haa-30 rautumat, kohdunkaulakanava). Niiden fagosyyttireaktiota mikrobien hyökkäykseen on paljon tutkittu (Klebanoff, S. ja Clark, R., The Neutrophil: Function and '= clinical Disorders. Elsevier/North Holland Biomedical Prep., Amsterdam ] /1978/). Sisään päässeet organismit tuhotaan pääasiallisesti vapauttamalla j kontrolloidusti vakuoleihin erilaisia mikrobien vastaisia aineita (esimerkiksi 3 103986 happoradikaaleja, vetyperoksidia ja halogenidi-ioneja). Paljon vähemmän tiedetään eosinofiileista, vaikkakin ne voidaan helposti tunnistaa hyvin luonteenomaisesta jyväskuviosta, ja niiden on dokumentoitu liittyneen allergeenisiin tauteihin ja tiettyihin parasiittisiin tauteihin, kuten trikinoosiin.

5

Makrofaagit eroavat granulosyyteistä siten, että ne aiheuttavat selvästi havaittavia ominaisuuksia riippuen ympäröivästä kudoksesta. Kudosmakrofaageihin sisältyvät siten histiosyytit sidekudoksessa. Kupffer'in solut maksassa, keuhko-rakkulamakrofaagit keuhkoissa, osteoklastit luussa, mikrobisolut hermostossa, 10 Langerhaus’in solut ihossa sekä vapaat tai kiinnitetyt solut muissa elimissä. Fagosyyttisen kyvyn lisäksi makrofaagit voivat erittää monia hyvin tärkeitä biologisesti aktiivisia aineita, kuten lysotsyymiä, plasminogeeniaktivaattoria, kolla-genaasia, elastaasia, happamia hydrolaaseja, komplementtikomponentteja, prostaglandiineja, endogeenista pyrogeenia, joitakin lymfokiineja ja happimeta-15 boliitteja. Makrofaagien uskotaan myös säätelevän B-ja T-lymfosyyttien antigeenien muodostumista ja esiintymistä (Cline, M., The White Cell. Harvard University Press, Cambridge, Mass. /1975/).

Yleinen kyvyttömyys ylläpitää näitä soluja in vitro on haitannut tutkimusta, jonka 20 tavoitteena on ollut ymmärtää paremmin (ja siten mahdollisesti hoitaa terapeuttisesti) neutrofeniaa, lymfopeniaa, monosytopeniaa, leukemiaa tai leukemoidi-reaktiota sekä muita immuunitauteja tutkimalla makrofaageja, granulosyyttejä, T-soluja ja muita immuunireaktioon liittyviä soluja. Useat immunologit ovat äskettäin kuitenkin havainneet, että monia tällaisia soluja voitaisiin eristää ja 25 eräissä tapauksissa viljellä kasvattamalla niitä muiden solujen eritteillä, esimerkiksi pernan lymfosyyteistä saaduilla käsitellyillä alustoilla, joita on stimuloitu konkanavaliini A:lla (ConA). Tämän työn perusteella on nyttemmin selvää, että solukloonien muodostuminen riippuu spesifisistä tekijöistä, kuten lymfokiineis-ta.

: 30

Ilmeisesti lähes kaikkia verisolutyyppejä muodostuu koko ajan aikuisen selkärankaisen luuytimessä verta muodostavien kantasolujen hierarkian kasvun ja erikoistumisen kautta. Tämän hierarkian huipulla on monitehoinen kantasolu, joka voi muodostaa kuolettavasti säteilytetyssä eläimessä uudelleen useimmat 4 103986 ja mahdollisesti kaikki hematologiset solutyypit (esimerkiksi punasolut, verihiutaleet, lymfosyytit, erilaiset granulosyytit ja monosyytit/makrofaagit). Tämä monitehoinen solu ei ainoastaan kykene regeneroimaan monitehoisten kanta-solujen kammiot (itseuudistuminen), vaan se myös muodostaa kantasoluja, 5 joiden tehtävänä on kehittyä pitkin jotakin tiettyä linjaa. Jonkin tietyn asiaan liittyvän kantasolun jälkeläisillä näyttää olevan sama linjasitoutuminen kuin isäntäsolulla (Mecalf, D., Hemopoietic Colonies. Springer Publishing Co.,

New York, N. Y./1977/).

10 Veren muodostuksen in vitro-tutkimukset ovat osoittaneet, että moni liukoinen tekijä voi säädellä näiden erilaisten isäntäsolujen ja asiaan liittyneiden solujen kasvua ja erikoistumista. Eräät näistä tekijöistä on osittain puhdistettu ja niiden on osoitettu vaikuttavan spesifisesti johonkin tiettyyn solulinjaan kuuluviin kantasoluihin. Esimerkiksi erytropoietiini, jota muodostuu pääasiallisesti 15 munuaisissa, stimuloi erytroidihierarkian enemmän differentioituneita jäseniä (Miyake., T., et ai.. J. Biol. Chem. 252: 5558 /1977/), ja T-soluissa ja makrofaa-geissa tuotettu CS-aktiivisuus (colony stimulating activity) stimuloi ensi sijassa granulosyyttien ja makrofaagien kasvua luuydinsolujen puolikiinteissä viljelmissä (Stanley, E. ja Heard, P., J. Biol. Chem. 252: 4305 /1977/). Toisen tyyp-20 pinen kasvutekijä näyttää taas stimuloivan hematopoeettisia pesäkkeitä, jotka muodostuvat yksittäisistä solutyypeistä ja solujen seoksista. Niiden solujen erilaisuus, esimerkiksi pre-erytrosyytit, megakaryosyytit, granulosyytit, syöttösolut ja monosyytti/makrofaagit, jotka näyttävät reagoivan yhteen tämän tyyppiseen tekijään, on saanut antamaan sille nimeksi monilinjainen solujen kasvutekijä 25 (Iscove, N. et ai., J. Cell. Physiol. Suppl., 1: 65-78/1982/). Nimi viittaa sen l kykyyn vaikuttaa sekä moniin asiaan liittyneisiin isäntäsoluihin että monitehoi- siin kantasoluihin.

i “* « I* ' CS-aktiivisuuden tiedetään esiintyvän useassa molekyylimuodossa, jotka 30 kollektiivisesti tunnetaan myös nimellä CSF-tekijät (colony stimulating factors). CSF-tekijät ovat joukko glykoproteiineja, joiden molekyylipainot ovat välillä noin 20.000 - 70.000 daltonia ja joita on löydetty kiertävän veressä ja virtsassa.

Nimellä “GM-CSF” tunnetaan joukko tekijöitä, jotka kykenevät stimuloimaan sekä granulosyyttien että makrofaagien pesäkkeen muodostumista puolikiin- 5 103986 teissä viljelmissä (kts. Metcalf, D., Hematopoietic Colonies: In Vitro Cloning of Normal and Leukemic-Cells: Springer Publishing Co., New York /1977/).

Vaikkakin sekä hiiren että ihmisen GM-CSF-tekijöitä on ainakin osittain puhdis-5 tettu ja karakterisoitu biokemiallisesti, sekä molekyylipainojen että aktiivisuus-kirjojen suhteen on ilmoitettu suuria eroja - jopa lajienkin välillä (Metcalf, D., “Hematopoietic Colony Stimulating Factors", Handbook of Experimental Pharmacology. 57: 343-384, Springer-Verlag, New York/1978/). Hiiren GM-CSFaktiivisuutta koodaavan cDNA:n onnistuneen kloonauksen (Cough, N.

10 etal., Nature 309: 763-767 /1984/) uskoisi auttavan vastaamaan moneen avoimeen hiiren GM-CSF-aktiivisuutta ympäröivään kysymykseen, mutta ihmissys-teemissä ongelmat ovat yhä jäljellä. Ainakin kaksi tutkijaryhmää on raportoinut kaksi humaania GM-CSF-aktiivisuutta (Das, S. et ai.. Blood 58: 630-641 /1981/). Itse asiassa, vaikkakin humaania GM-CSF-aktiivisuutta koodaava 15 mRNA on translatoitu in vitro (eristetty T-lymfosyyttisolulinjasta, ATCC-tallen-nusnumero CRL8066; kts. US-patentti 4,438,032), jolloin on raportoitu saatavan biologisesti aktiivista proteiinia (Lusis, A. et ai.. Nature 298: 75-77 /1982/) humaania CSF-aktiivisuutta ympäröivä epävarmuus säilyy valtavana (kts.

Burgess, A., Growth Factors and Stem Cells, luku 4, sivut 93-124, Academic 20 Press, New York /1984/).

Vaikkakin molekyylipainojen erot voitaisiin ehkä osittain selittää erilaisilla glyko-sylointimäärillä, tämän kysymyksen selvittäminen ja yhden molekyylin omaa-vien aktiivisuuksien kirjo edellyttää lisää rakennetietoa, esimerkiksi tarvitaan 25 kyseessä olevien molekyylien oleellisesti täysimittainen sekvenssianalyysi. Proteiinin sekvenssointi antaa luonnollisesti mahdollisen keinon ongelman ratkaisemiseen, mutta se on kokeellisesti hyvin vaikea työ ja se voi usein antaa joko epätäydellisen tarkkoja tai ei-täysipituisia aminohapposekvenssejä. Lisäk-si, jos kyetään valmistamaan suuria määriä polypeptidiä, jolla on humaani 30 GM-CSF-aktiivisuus, tämä suuresti helpottaa granulosyyttien, makrofaagien ja muiden immuunireaktioon liittyvien solujen biologian tutkimista; esimerkiksi tarve luottaa ConA-käsiteltyihin alustoihin solun kasvun stimuloinnissa jää minimiinsä. Jokaisen humaanin CSF-tekijän tarkka ja täydellinen sekvenssitieto myös osaltaan yksinkertaistaa muiden immunologisten tekijöiden etsimistä.

6 103986

Lopuksi lisätieto mistä tahansa lymfokiinista auttaa arvioimaan immuuniverkos-ton eri kasvutekijöiden ja solujen tehtäviä ja auttaa näin ymmärtämään koko immuunijärjestelmää - tuoden samalla terapeuttisia etuja.

5 Siten on olemassa merkittävä tarve saada laajaa nukleotidisekvenssitietoa DNA-lajeista, jotka koodaavat proteiineja, joilla on humaani GM-CSF-aktiivi-suus, sekä näiden proteiinien aminohapposekvensseistä. Samoin on olemassa tarve löytää yksinkertainen ja taloudellinen menetelmä, jolla valmistetaan oleellisia määriä tällaisia aineita oleellisesti puhtaassa muodossa. Esillä oleva 10 keksintö täyttää nämä tarpeet.

Esillä oleva keksintö tuo esiin cDNA-kloonit, jotka koodaavat polypeptidejä, joilla on humaani GM-CSFaktiivisuus. Kuviossa 1 on esitetty nukleotidisek-venssi cDNA:lle ja ehdotettu aminohapposekvenssi siihen liittyvälle polypepti-15 dille. cDNA-sekvenssi voidaan integroida erilaisiin vektoreihin, jotka vuorostaan voivat ohjata vastaavien polypeptidien synteesiä eri isännissä, mukaan lukien eukaryoottisoluissa, kuten nisäkässoluissa viljelmässä.

Tarkemmin sanoen keksintö tuo esiin menetelmän, jolla valmistetaan polypep-20 tidiä, jolla on humaani GM-CSF-aktiivisuus, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa: a) muodostetaan vektori, joka sisältää mainittua polypeptidiä koodaavan nuk-leotidisekvenssin, jonka vektorin sisältävä isäntä kykenee ekspressoimaan; 25 b) liitetään vektori isäntään; ja c) pidetään vektorin sisältävä isäntä olosuhteissa, jotka sopivat nukleotidisek-venssin ekspressoimiseen mainituksi polypeptidiksi.

30 cDNA-sekvenssit ovat parhaiten peräisin polypeptidejä koodaavasta transfor-moimattomasta humaanin T-solun mRNAsekvenssistä, ja isäntä on organismi, kuten eukaryoottinen solu, esimerkiksi nisäkässolu., joka on transfektoitu tai transformoitu vektorilla. Vektori sisältää lisäksi myös parhaiten toisen nukleoti- 7 103986 disekvenssin, joka kykenee kontrolloimaan polypeptidiä koodaavan nukleoti-disekvenssin ekspressiota. Tämätoinen koodaava sekvenssi voi sisältää pro-moottorisekvenssin, yhden tai useamman intronisekvenssin ja polyadelynointi-sekvenssin, jotta vastaavasti olisi mahdollista transkriptoida, katkaista ja. poly-5 adenyloida polypeptidiä koodaava nukleotidisekvenssi. Erityisesti, kun isäntä on nisäkässolu, kuten COS-7 apina (munuais)-solu. vektori sisältää SV40 (simian virus 40) alkualueen promoottorin promoottorisekvenssin ja SV40 jälkialueen polyadenylointisekvenssin polyadelyointisekvenssin.

10 Kuvion 1 mukainen humaani cDNA-sekvenssi (kts. jäljempänä) kykenee hybri-disoitumaan muiden DNA-sekvenssien kanssa, kuten DNA:n kanssa, joka koodaa muita nisäkkään kasvutekijöitä cDNA- tai genomikirjastosta. Huomattakoon, että kuvatut cDNA-sekvenssit näyttävät sisältävän informaation johtosek-venssille.

15

Esillä olevan keksinnön mukaiset polypeptidit kykenevät parantamaan ihmisen neutrofiilisten granulosyyttien, makrofaagien ja muiden solujen kasvua (esimerkiksi eosinofiilit), erityisesti in vitro-vilielmissä. Sopivia farmaseuttisia seoksia voidaan valmistaa lisäämällä terapeuttisesti yhteensopiviin kantajiin polypepti-20 dejä (joiden valmisteet eivät oleellisesti sisällä muita humaaneja kasvutekijöitä.

Keksinnön muut tunnusmerkit ja edut ovat ilmeisiä seuraavasta yksityiskohtaisesta kuvauksesta, joka mukaan liitettyjen piirustusten avulla ja esimerkkimäi-sesti kuvaa esillä olevaa keksintöä.

25

Piirustuksissa:

Kuvio 1 havainnollistaa cDNA-kloonin, jolla on humaani GM-CSF-aktiivisuus, nukleotidisekvenssiä ja oletettua vastaavaa aminohapposekvenssiä.

, 30

Kuvia 2A havainnollistaa pcD-humaani-GM-CSF-plasmidia, jossa on cDNA-klooni, jolla on humaani GM-CSFaktiivisuus.

Kuvio 2B on restriktioendonukleaasikartta kuvion 2A cDNA-insertistä.

8 103986

Kuvio 3 esittää ehdotettujen hiiren ja humaanin GM-CSF aminohapposekvenssien välistä vertailua.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti tuodaan esiin cDNA-kloonit, jotka koodaa-5 vat polypeptidejä, joilla on humaani GM-CSF-aktiivisuus. Sen jälkeen, kun cDNA-sekvenssit on liitetty replikoituviin ekspressiovektoreihin ja vektorit trans-fektoitu sopivaan isäntään (esimerkiksi nisäkässoluviljelmään), ekspressoidulla polypeptidillä tai polypeptideillä on kyky mahdollistaa neutrofiilisten granylosyyt-tien, makrofaagien ja muiden hematopoeettisten linjojen (esimerkiksi eosino-10 fiilien) laajentaminen.

Esimerkiksi kuviossa 1 on esitetty oletettu aminohapposekvenssi perustuen eristettyyn nukleotidisekvenssiin. Humaani GM-CSF-cDNA sisältää yhden ainoan avoimen lukukehyksen, joka muodostuu 144 kodonista. Oletetun aloi-15 tuskodonin alapuolella on runsaasti hydrofobisia aminohappoja sisältävä alue.

Sen vuoksi on todennäköistä, että eritetyn humaanin GM-CSF:n valmis muoto alkaa seriiniryhmällä, ja seuraavat 23 aminohappoa muodostavat johtoalueen, joka voidaan poistaa proteolyyttisen käsittelyn avulla. Yhdessä suoritusmuodossa humaani GM-CSF voi siten muodostua noin 121 aminohaposta, jonka 20 laskettu molekyylipaino on noin 13.500 daltonia (glykosyloimattomana). Paikoissa 44-46 ja 54-56 näyttää olevan kaksi potentiaalista N-glykolaatiokohtaa (Asn-X-Ser/Thr) (Neuberger, A. et ai.. Glycoproteins 5, 450-490, Elsevier Publishing Co., U.S.A. /1972/), mikä voisi selittää molekyylipainoerot kirjallisuudessa.

25 COS-7 apinasoluihin tai muihin sopiviin ekspressiosysteemeihin transfektoitui-na tämän keksinnön mukaiset cDNA-kloonit voivat ohjata biologisesti aktiivisen humaanin GM-CSF-tekijän synteesiä. Tämän ekspressoidun kloonatun geeni-tuotteen lisääminen hematopoeettisten isäntäsolujen viljelmiin mahdollistaa 30 vastaanottosolujen laajentamisen ja/tai niiden ylläpidon viljelmässä. Ekspres-soiduilla polypeptideillä voi olla humaaniin GM-CSF-aktiivisuuteen liittyviä valikoituja aktiivisuuksia.

j 9 103986

Esillä olevan keksinnön mukaisten cDNA-lajien valmistamiseen voidaan käyttää monia erilaisia menetelmiä. Esimerkiksi totaali-mRNA uutetaan (esim. 5. Berger’in et ai. mukaisesti, Biochemistry 18: 5143-5149 /1979/) soluista (esimerkiksi transformoimaton humaani-T-solulähde), jotka tuottavat polypeptidejä, 5 joilla on humaani GM-CSF-aktiivisuus. Tästä totaali-mRNA:sta voidaan konstruoida kaksisäikeisiä cDNA-lajeja käyttämällä primeerillä aloitettua käänteis-transkriptiota (Verma, I., Biochim. Biophys. Acta, 473: 1-38 /1977/), jolla tehdään ensin kunkin mRNA-sekvenssin komplementti, ja sen jälkeen suorittamalla priimaus toisen säikeen synteesiä varten (Land, H. et ai.. Nucleic Acids Res., 10 9: 2251-2266 /1981/). Tämän jälkeen cDNA-lajit voidaan kloonata liittämällä ne sopiviin plasmidi- tai bakteerifaagivektoreihin.(Rougeon, F. et ai.. Nucleic Acids Res, 2, 2365-2378 /1975/ tai Scherer, G. et ai.. Dev. Biol. 86, 438-447 /1981/) komplementtisten homopolymeerihäntien avulla (Efstratiadis, A. et ai.. Cell, 10, 571-585 /1977/) tai koheesiopäiden avulla, jotka on muodostettu 15 sopivia restriktiokohtia sisältävien linkkerisegmenttien avulla (Seeburg, P. et ai.. Nature, 270, 486-494/1977/tai Shine, J. etal·, Nature, 270, 494-499/1977/), ja sen jälkeen transformoimalla sopiva isäntä. (Kts. yl., Efstratiadis, A., ja Villa-Kormaroff, L., "Cloning of double stranded cDNA”, Setlow, J. ja Hollaender, A. (toim.) Genetic Engineering, Voi. 1, Plenum Publishing Corp., N.Y., U S..A.

20 /1982/).

H. Okayama’n ja P. Berg’in (Mol. and Cell. Biol. 2: 161-170/1982/) kehittämää tapaa pidetään parhaimpana menetelmänä, jolla saadaan tämän keksinnön mukaisia täyspitkiä kloonattuja cDNA-lajeja. Tämän menetelmän etuna on, että 25 siinä laitetaan cDNA-insertit bakteeriperäiseen kloonausvektoriin sellaiseen paikkaan, että cDNA voidaan myös suoraan translatoida ja prosessoida nisä-kässoluissa. Tarkemmin sanoen ensimmäinen cDNA-säie priimataan polyde-oksitymidyylihapolla, joka on kovalenttisesti liitetty suoran plasmidivektori-DNA:n toiseen päähän. Sen jälkeen plasmidivektori syklisoidaan linkkeri-DNA-30 segmentillä, joka muodostaa sillan plasmidin toisesta päästä cDNA-koodaus-sekvenssin.5'-päähän. Käyttämällä DNA-fragmenttia, joka sisältää SV40 (simian virus 40) alkualueen promoottorin, ja linkkeriä, joka sisältää modifioidun SV40-jälkialueen intronin, cDNA voidaan ekspressoida in vitro COS-7 hiiri (munuais)-soluissa ilman enempää modifiointia. (Kts. yl. Okayama, H., ja 10 103986

Berg., P., Mol. ja Cell. Biol., 3: 280-289 /1983/ ja Joylly, D. et ai.. Proc. Nat.

Acad. Sei. USA., 80: 477-481 /1983/.

Heti, kun eDNA-kirjasto Okayama/Berg’in plasmidivektorissa on tehty valmiiksi, 5 cDNA-kloonit otetaan talteen ja satunnaispooleista tarkistetaan haluttujen cDNA-lajien läsnäolo hybridiselektion, translatoinnin ja määrityksen avulla (esimerkiksi mittaamalla humaani GM-CSF-aktiivisuus soluviljelmissä, antigee-nideterminanttien läsnäolo tai muut biologiset aktiivisuudet). Näiden kriteerien perusteella positiiviset poolit voidaan sen jälkeen koetinkäsitellä sopivalla 10 lyhennetyllä koettimella, esimerkiksi B-solulinjasta ja/tai indusoimattomasta T-solulinjasta saadulla cDNAMIa. Tämän jälkeen positiiviset, koettimella tutkitut poolit jaetaan yksittäisiin klooneihin, jotka testataan trasfektoimalla sopivaan isäntään (kuten nisäkässoluviljelmään) ja isännän supernatantista määritetään haluttu aktiivisuus. Sen jälkeen sekvenssoidaan positiiviset kloonit.

15

Halutut cDNA-kloonit voidaan myös havaita ja eristää hybridisointiseulonnan avulla käyttämällä sopivia mRNA-näytteitä (Heindell, H. et ai.. Cell, 15: 43-54 /1978/). cDNA-kirjastot voidaan vaihtoehtoisesti seuloa hybridiselektion avulla (Harpold, M. et ai.. Nucleic Acid Res., 5: 2039-2053 /1978/ tai Parnes, J. et ai..

20 Proc Nat. Acad. Sei. U.S.A., 78: 2253-2257 /1981/) tai Xenopusoosvvteissä (Aurdon, J. Nature, 233: 177-182 /1971/). (Kts. yl. Villa-Komaroff, L. et ai..

Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 75: 3727-3731 /1978/).

*

Kun seuraavassa kuvataan edelleen menetelmiä, jotka liittyvät keksinnön mu-25 kaisten cDNA-kloonien valmistamiseen, käsitellään ensin solulähdettä ja muita linjoja, minkä jälkeen kuvataan yleisesti menetelmiä, joilla eristetään proteiinia, | jolla on humaani GM-CSF-aktiivisuus, koodaava mRNA; rakennetaan cDNA- sekvenssit sisältävä cDNA-kirjasto; eristetään täyspitkät cDNA-kloonit plasmi- divektorissa ja sen jälkeen ekspressoidaan nisäkässoluissa; alikloonataan ja 30 ekspressoidaan bakteerissa ja hiivassa; ja puhdistetaan ja formuloidaan. Tämän jälkeen seuraa yksityiskohtaisempi kuvaus koko kokeellisesta menetelmästä.

11 103986 T-solu- ia muut -linjat

Humaanin GM-CSF-aktiivisuuden lähteinä ja sen määrityksessä voidaan käyttää mitä tahansa monista erilaisista soluista (kts. esim. Burgess, A., Growth 5 Factors and Stem Cells. Academic Press, sivut 43-124, New York /1984/.

Eräs hyvänä pidetty lähde on T-solu-auttajalinja, mutta hyväksyttäviä ovat ihmisen periferiaveri (Verma, D. et ai.. Brit. J. of Haemat. 57: 505-520 /1984/ ja Hasketh, P. et ai.. Blood 63: 1141-1146 /1984/), makrofaagit tai muut solut, jotka tuottavat humaania GM-CSF-aktiivisuutta (Bodeker, B. et ai.. Immunobiol.

10 166: 12-23 /1984/). Tämä sisältää hybridomat ja transformoidut solulinjat (Gasson, J. et ai.. “Lymphokines and hematopoiesi” Normal and Neoolastic-Hematopoiesis. Alan R. Liss, Inc., New York/1983/).

Eräs hyvänä pidetty lähde, jota käytetään humaanin GM-CSF-aktiivisuuden 15 määrityksissä, on ihmisen luuydin, joka on saatu lahjoittajilta, joilla ei ole veritauteja. Sopivia lähteitä ovat myös kuitenkin ihmisen "cord"-veri ja haima edellyttäen, että ne käytetään noin 12-48 tunnin sisällä ottamisen jälkeen.

CSF-aktiivisuuden määrittämiseksi hemopoeettisten solujen lähde tehdään 20 yksittäisten solujen suspensioksi. Yksittäiset solut immobilisoidaan sen jälkeen puolikiinteän (agar) tai viskoosisen (metyyliselluloosa) alustaan, joka sisältää ravinteita ja tavallisesti vasikansikiöseerumia. Sopivan stimulointitekijän läsnä-; ollessa yksittäiset solut lisääntyvät ja erikoistuvat. Koska lähtösolut ovat immo- bilisoituja, solujen lisääntyessä ja kypsyessä muodostuu pesäkkeitä. Nämä 25 pesäkkeet voidaan laskea 7-14 päivän kuluttua. (Burgess, A., Growth Factors and Stem Cells, sivut 52-55, Academic Press, New York/1964/.) (Haluttaessa erityisesti soveltaa tekniikkaa granulosyyttien ja makrofaagien kanssa, kts.

Bradely, T. ja Metcalf, D., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sei. 44: 287-300 /1966/, ja kts. yl. Metcalf, D., Hemopoietic.Colonies. Springer-Verlag, Berlin /1977/).

30 Yksittäiset pesäkkeet voidaan haluttaessa poistaa, laittaa mikroskooppilevyille, kiinnittää ja värjätä Wight/Geimsa-väri!!ä (Todd-Sanford, Clinical Diagnosis bv Laboratory Methods. 15. painos, toim. Davidson ja Henry/1974/). Yhdessä pesäkkeessä olevien solutyyppien morfologinen analyysi voidaan tällöin määrittää.

12 103986 mRNA:n eristäminen ia cDNA-kiriaston rakentaminen

Solun totaali-mRNA voidaan eristää monilla yleisesti tunnetuilla menetelmillä (esim. Przybla, A. et ai.. J. Biol. Chem. 254: 2154-2158/1979/), mutta parhaa-5 na pidetty menetelmä on Chirgwin’in et ai. quanidinium tiosyanaatti-uuttomene- telmä (Biochemistry, 18: 5294-5299 /1979/). Jos tätä menetelmää käytetään,

8 + 1-2x10 aktivoidusta humaanista auttaja-T-solusta saadaan noin 10 pg polyA

mRNA:ta selektoituna aligo(dT)-selluloosapylväissä.

10 PolyA+ mRNA:sta voidaan cDNA-kirjasto rakentaa parhaiten käyttämällä pcDV1 -vektori-primeeriä ja pH -linkkerifragmenttia (saatavissa P-L Bio-chemicals Inc,yhtiöstä, Milwaukee, Wl) menetelmillä, joilla saadaan suuresti rikastuneita täyspitkiä mRNA-transkriptien kopioita (esim. Okayama, H. ja Berg, P., Mol. Cell Biol., 2, 161-170 /1982/ja Mol. Cell Biol., 3, 280-289 /1963/).

15 Plasmidivektorin, joka sisältää SV40 alkupromoottorin ja SV40 RNA-proses-sointisignaalit, on tehty edistämään kloonatun cDNA-segmentin ekspressoitu-mista nisäkässoluissa.

Okayama’n ja Berg’in menetelmää käyttämällä transformoidaan syklisoitu 20 vektori-cDNA-preparaatti kompetenttien bakteerisoluun, kuten E. coli MC1061-soluihin (Casadaban, M. ja Cohen, S., J. Mol. Biol., 138: 179-207 /1980/) käyttämällä kalsiumkloridia.(Cohen, S. et ai.. Proc. Nat. Acad. Sei.. U.S.A., 69: 2110-2114/1972/). Kun käytetään 5 pg polyA+ RNA:ta ConA-stimuloiduista T-soluista, voidaan saada noin 1,5x106 itsenäistä transformanttia. Tavallisesti 25 poimitaan yksitellen noin 104 kloonia ja siirrostetaan mikrotiitterilevyjen kaivoihin (Flow Laboratories Inc., McLean, Virginia), jotka sisältävät 200 pl L-lientä, 50 pg/ml ampisilliinia ja 7 % DMSO:ta. H. Okayama’n ja P. Berg’in kuvaamalla tavalla (Mol. Cell Biol., 3, 280-289 /1983/) valmistetaan haluttaessa totaali-cDNA-kirjastosta alikirjastoja perustuen cDNA-insertin kokoon. Tarkemmin 30 sanoen plasmidi-DNA pilkotaan erikseen Sali, Clal ja Hindlll-entsvvmeillä ja elektroforeesikäsitellään 1-prosenttisessa agaroosigeelissä. Etidiumbromidilla , värjäämisen jälkeen geeli leikataan 7 osaan, jotka vastaavat cDNA-inserttiko- i koja 0-1,1 - 2, 2 - 3, 3 - 4, 4 - 5, 5 - 6 ja yli 6 kiloemästä (kb). Jokaisesta i 13 103986 leikkeestä uutetaan DNA, syklisoidaan uudelleen T4 DNA-ligaasilla ja tällä transformoidaan MC1061. Koko nukleotidisekvenssointi voidaan suorittaa A. Maxam’in ja W. Gilbertin menetelmällä (Methods Enzymol., 65 499-560 /1980/).

5 DNA: n transfektoinnit apinasoluihin:

Noin 1x106 COS-7 apinan munuaissolua siirrostetaan 60 mm maljoille päivä ennen transfektointia. Transfektoinnit suoritetaan parhaiten käyttämällä 15 pg 10 plasmidi-DNA:ta 1,5 ml:ssa DME:tä, joka sisältää 50 mM Tris.HCI, pH 7,4-pus-kuria, ja 400 pg/ml DEAE-dekstraania (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi). Sen jälkeen tämä liuos poistetaan 4 tunnin kuluttua ja korvataan seoksella, jossa on 2,0 ml DME + 4 % vasikansikiöseerumia. Medium otetaan talteen 72 tunnin kuluttua ja siitä määritetään edellä kuvatulla tavalla humaani 15 GM-CSF-IL-2-aktiivisuus. DNA-transfektoinnit voidaan suorittaa L-soluissa sekä monissa erilaisissa muissa solulähteissä (kts. jäljempänä).

Lähisukuisten geenien eristäminen 20 Esillä olevan keksinnön mukaisia cDNA-klooneja voidaan käyttää tunnistamaan ja eristämään lähisukuisia geenejä koodaavia nukleiinihapposekvens-sejä. Homologisten geenien välisen usein alhaisen homologia-asteen vuoksi hybridisointiolosuhteet on säädettävä stringenteiksi, jotta ristihybridisoituminen olisi mahdollista sekvenssien Välillä, jotka voivat olla vain 70-80-prosenttisesti 25 homologisia.

Lähisukuisten geenien paikallistamiseen voidaan käyttää useita erilaisia koe-menettelyjä. Esimerkiksi ihmisen Ck-immunoglobuliinin kevyen ketjun geeni on eristetty käyttämällä koettimena vastaavaa hiiren Ck-geeniä (Heiter, P. et ai..

30 Cell 22: 197-207 /1981/) ja hiiren kudossiirron antigeenigeenit on eristetty hyb-ridisoimalla ne DNA-klooneihin, jotka koodaavat niiden humaaneja vastineita (Steinnetz, T. etal., Cell 24.. 125-134 /1981/).

14 103986

Genomi-DNA:lle parhaana pidetyssä menetelmässä maljataan faagiklooneja DNA-kirjastosta, joka sisältävät homologiset geenit (Maniatis, T. et ai..

"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, U.S.A. /1982/) tiheydellä 2x104 - 5x104 plakkia 150 mm maljaa kohti käyttämäl-5 lä sopivaa isäntäkantaa. kuten E. coli LE392-kantaa. Yleensä riittää 10-20 maljaa.

Maljoja inkuboidaan 10-12 tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen niitä pidetään jääkaapissa 2 tuntia ja sen jälkeen kunkin maljan agarpinnalle laitetaan 132 mm 10 nitroselluloosasuodatin. Suodattimen annetaan pysyä kosketuksessa maljan kanssa vähintään 5 minuuttia, jona aikana suodattimet merkitään maljoihin lävistämällä musteella täytetyllä neulalla (22-gauge). Sen jälkeen suodattimet irrotetaan maljoilta ja inkuboidaan peräkkäin vähintään 2 minuuttia ensin 250 ml:ssa liuosta, jonka koostumus on 0,1 N NaOH, 0,5 M NaCI; sen jälkeen 15 250 ml:ssa 0,5 M Tris.HCI, pH 7,5, 1,5 M NaCI-puskuria. Suodattimet kuiva taan paperipyyhkeiden päällä ja sen jälkeen paistetaan 4-8 tuntia 80°C:ssa.

Hybridisointia varten suodattimet kostutetaan 1 x SET liuoksessa (0,15 M NaCI, 30 mM Tris.HCI pH 8,0, 1 mM Na2 EDTA), minkä jälkeen inkuboidaan 20 koko ajan sekoittaen 2 tuntia 65°C:ssa (1,5-2 ml/suodatin) liuoksessa, jonka koostumus on: 3 x SET, 5 x Denhardt’in liuos (Denhardt, D.T., B.B.R.C. 23: 641-646/1966/), 10 % dekstraanisulfaatti, 0,1 % natriumdodekyylisulfaatti (SDS), ja poly (rA), poly (rC) ja poly (rG) 50 P pg/ml kutakin. Sen jälkeen tämä liuos heitetään pois ja suodattimet hybridisoidaan 0,5 pg:n kanssa (>108 cpm) 25 nick-translatoitua koetinta, joka on valmistettu GM-CSF cDNA:sta samassa liuottimessa (tuore), 1,5-2 ml/suodatin 65°C:ssa 1 tunnin ajan ja sen jälkeen 55°C:ssa 12-20 tunnin ajan. Sen jälkeen suodattimet pestään peräkkäin seu-raavissa liuoksissa: 3 x SET, 1x Denhardt'in liuos; 0,1 % SDS; ja 1x SET, 0,1 % SDS (10-15 ml/suodatin), 55°C:ssa 1 tunnin ajan varovasti sekoittaen.

30 Suodattimet kuivataan paperipyyhkeiden päällä, sen jälkeen autoradiografoi-daan 12-24 tuntia käyttämällä sopivaa filmiä ja vahvistusristikkoa. Hybridisoin-tiplakit poimitaan agarmaljoilta steriileillä pasteur-pipeteillä ja kukin plakki pois-t tetaan 1 ml:aan seosta, jonka koostumus on: 0,1 M NaCI, 0,01 M Tris.HCI

1 pH 7,5, 10 mm MgCI2 V 100 pg/ml gelatiini, johon lisätty 50 μΙ CHCI3:a. Sen i i 15 103986 jälkeen, kun on pidetty vähintään 4-8 tuntia kylmässä, kunkin plakin faagit seulotaan uudelleen alhaisella tiheydellä (2000-4000 plakkia/150 mm malja) edellä kuvatun menetelmän kanssa identtisellä menetelmällä.

5 Ekspressio E. colissa, hiivassa ia soluviljelmässä

Prokaryootit, kuten E. coli. sopivat erittäin hyvin esillä olevan keksinnön mukaisten polypeptidien ekspressoimiseen, (kts. esim. US-patenti 4,338,397 ja 4,411,994) edellyttäen, että glykolysointia ei haluta.

10

Korkeiden ekspressiotasojen saavuttamiseksi tulisi käyttää promoottoreita, kuten β-laktamaasi- (penisillinaasi) ja laktoosi-promoottorijärjestelmiä (Chang et ai.. Nature, 175: 615/1978/; Itakura et ai.. Science, 198: 1056/1977/;

Goeddel et ai., Nature.281: 544 /1979/) tai tryptofaani (trp)-promoottorijärjestel-15 mää (Goeddel et ai.. Nucleic Acids Res., 8: 4057 /1980/) yhdessä Shine-Delgarno-sekvenssien kanssa.

Alan ammattimiehet ymmärtävät, että proteiinien tuotossa voidaan käyttää myös prokaryoottien lisäksi eukaryoottisia mikrobeja, kuten hiivaa. Parhaana 20 pidetty eukaryoottinen mikro-organismi on Saccharomvces cerevisiae. Sopivia promoottorisekvenssejä hiivan vektoreissa ovat promoottorit 3-fosfoglyseraatti-kinaasille (Hitzeman et ai., J. Biol. Chem., 255: 12073-12080 /1980/ tai muille glykolyyttisille entsyymeille (Hess et ai.. Biochemistry, 17. 4900-4907 /1978/). Voidaan käyttää muitakin promoottoreita, joilla on lisäetuna kasvuolosuhteiden 25 säätelemä transkriptio. Periaatteessa sopiva on mikä tahansa plasmidivektori, joka sisältää hiivan kanssa sopivan promoottorin, replikaation aloituskohdan ja terminaatiosekvenssit.

* «

Eräässä hyvänä pidetyssä menetelmässä, jolla valmistetaan humaania 30 GM-CSF-tekijää ja käytetään esillä olevan keksinnön mukaista cDNA:ta, käytetään hyödyksi hiivan MP α-tekijää (mating pheromone α-factor) erittäviä teitä (Julius, et ai., Cell 32: 839-852 /1983/). S. cerevisiae erittää mating-tyyppisiä spesifisiä oligopeptidiferomoneja. ΑΤα-solut erittävät α-tekijää, joka indusoi ΜΑΤα-soluien kasvun pysähtymisen solusyklin G1 -vaiheessa fThorner. J., 16 103986

The Molecular Biology of the Yeast Sacchharomvces. Gold Spring Harbor Laboratory., New York/1981/; kts. erityisesti sivut 143-180). α-tekijä syntetisoidaan aluksi suurempana prekursorimolekyylinä, joka muodostuu noin 20 aminohapon pituisesta NH2-terminaalisesta signaalisekvenssistä, jota seuraa vielä 5 60 aminohapon pituinen johtosekvenssi ja joka päättyy valmiin a-tekijäsek- venssin neljään identtiseen tandem-toisto-osaan. Toisto-osia erottaa toisistaan kuuden tai kahdeksan aminohapon pituiset väliosat (Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala ja Lys-Arg-Glu-Ala-Glu- /tai Asp-/-Ala-Glu-Ala). Tämä prepro-a-tekijä katkaistaan useassa spesifisessä kohdassa. Ensimmäinen käsittely on väliosasekvenssin 10 Lys-Arg-parin COOH-terminaalisen puolen katkaiseminen, jota katalysoi KEX2-tuote (Julius et ai.. Cell 37: 1075-1089 /1984/). Karboksipeptidaasi-B:n tapainen entsyymi katkaisee Lys-Arg-parin NH2-terminaalisen puolen. Viimeinen vaihe on Glu-Ala- tai Asp-Ala-parien poistaminen diaminopeptidaasilla, jota enkoodaa STE13. J. Brake, et ai. (Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 81: 4642:4646 15 /1984/) ovat osoittaneet, että valmiita humaaniproteiineja koodaavan sekvens sin fuusiointi ensimmäiseen prosessointikohtaan mahdollistaa tällaisten proteiinien erittymisen.

Yleinen hiivaekspressiovektori, jolle on annettu nimeksi pMF-alfa-8 ja joka 20 sisältää alfa-tekijä-promoottorin ja myötäpuolella sijaitsevan johtosekvenssin yhdessä muiden elementtien kanssa, on tallennettu ATCC-kokoelmaan (tallen-nusnumero 40140). Se voidaan rakentaa seuraavasti: 1,7 kb EcoRI-pala, jossa on MF 1-geeni (Kurjan, J. ja Hershowitz, I., Cell. 30: 25 933-943 /1982/, kloonataan M13mp8 (Viera, J. ja Messing, J., Gene 19: 259-268 /1982/) EcoRI-restriktiokohtaan. Jotta Hindlll-kohta saataisiin ensimmäisen väliosa-alueen lysiinikodonin jälkeen, synteettinen oligonukleotidi TCUTTATCCAAAGATACCC hybridisoidaan yksisäikeiseen M13-MF 1-DNA:han ja oligonukleotidiprimeeriä jatketaan DNA-polymeraasi Ι-ΚΙβηοννΊη 30 fragmentilla. S1 nukleaasikäsittelyn jälkeen DNA katkaistaan EcoRI-entsyymillä ja fragmentti, jossa on MFa1 -promoottori ja johtosekvenssi, kloonataan pUC8-plasmidin EcoRI- ja filled-in Hindlll-restriktiokohtiin (Viera, J. ja Messing, J., edellä). Voidaan eristää yksi plasmidi, jolla on haluttu rakenne (nimeksi annetaan pMFa4A1). pMFa4A1 katkaistaan Hindlll-entsyymillä ja osittain täytetään 17 103986 DNA-polymeraasi I Klenow'in fragmentilla dATP.n ja dGTP:n läsnäollessa.

DNA käsitellään mung-pavun nukleaasilla ja kiinnitetään oligonukleotidilinkkeri GCCTCGAGGC. Saadussa plasmidissa 0'olle annetaan nimi pMFa5) on Stul-katkaisukohta välittömästi arginiinikodonin jälkeen ja sitä seuraa Xhol-restriktio-5 kohta. S. cerevisiae-E. coli-sukkulavektori (pTRP584) voidaan rakentaa seuraavasti:

Pstl-Xbal-fraamentti. jossa on 2 pm plasmidin replikaation alkukohta (Broach, J., edellä) kloonataan pTRP56-plasmidin (Miyajima et ai.. Mol. Cell. Biol. 4: 10 407-414 /1984/) Clal-restriktiokohtaan ja Stul-restriktiokohta TRP1-ARS1- frag mentissa muunnetaan Pyull-restriktiokohdaksi insertoimalla Pvull-linkkeri. Alkuperäisessä pTRP56-vektorissa oleva Kpnl-restriktiokohta muunnetaan Xhol-kohdaksi insertoimalla Xhol-linkkeri. Yleinen eritysvektori pMF 8 saadaan sen jälkeen insertoimalla pMF 5:n Bo1 ll-Xhol-fraamentti pTRP584-vektorin BarnHi-15 Xhol-restriktiokohtiin.

Alan ammattimiehille on selvää, että humaania GM-CSF-aktiivisuutta koodaa-vat cDNA-kloonit voidaan sen jälkeen helposti insertoida pMF 8-vektoriin ja sen jälkeen transformoida hiivassa humaanin GM-CSF-tekijän tuottamista varten.

20 1,0 kb Bam H1 -fragmentti, jossa on koka humaani GM-CSF-cDNA, kloonataan esimerkiksi M13mp8 Bam H1-restriktiokohtaan (Viera, J. ja Messing, J., Gene 19: 259-268 /1982/). Jotta voitaisiin valmistaa kaksisäikeinen fragmentti, jossa on valmista proteiinia koodaava sekvenssi, rakennetaan oligonukleotidiprimeeri AGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCAT. Tämä primeeri hybridisoidaan sen 25 jälkeen yksisäikeiseen M13mp8:aan, jossa on humaani GM-CSF-cDNA, ja tätä jatketaan DNA-polymeraasi I Klenow’in fragmentilla. Kaksisäikeinen DNA katkaistaan Bam H1-entsyymillä ja sen jälkeen yksisäikeinen alue poistetaan mung-pavun nukleaasilla. Sen jälkeen eristetään kaksi säikeinen fragmentti, jossa on valmista humaani GM-CSF-proteiinia koodaava sekvenssi, ja kloona-, 30 taan se yleisen eritysvektorin pMFX8 Stul-restriktiokohtaan. Tämä plasmidi DNA (jossa on TRP1 -geeni) voidaan liittää hiivasoluihin litiumasetaattimenetel-mällä (Ito, H. et ai.. J. Bacteriol. 153:163-168 /1983/ ja transformantit selektoi-da synteettisessä alustassa, jossa ei ole tryptofaania. Transformantteja kasvatetaan sen jälkeen yleisessä alustassa, joka on täydennetty 0,5 %:lla casami- 18 103986 nohappoja. Hiivasolujen keräämistä varten ne ensin suspendoidaan uudelleen fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS), joka sisältää 1 mM PMSF, ja sen jälkeen hajotetaan ravistelemalla voimakkaasti hapolla pestyjen lasihelmien kanssa. Sentrifugoimalla 15 minuuttia nopeudella 10.000 kierr./min. saadaan 5 kirkas supernatantti.

Mikro-organismien lisäksi isäntinä voidaan myös käyttää soluviljelmiä, jotka on saatu monisoluisista organismeista (erityisesti nisäkässoluja). Esimerkkejä tällaisista hyödyllisistä isäntäsolulinjoista ovat HeLa-solut, kiinalaisen hamsterin 10 munasarjasolulinjat ja hamsterinpoikasen munuaissolulinjat. Tällaisille soluille tarkoitetut ekspressiovektorit sisältävät tavallisesti tarpeen mukaan replikaation aloituskohdan, ekspressoituvan geenin edessä sijaitsevan promoottorin, sekä mahdollisesti tarvitut ribosomien sitoutumiskohdat, RNA-katkaisukohdat, poly-adenylaatiokohdat ja transkriptionaaliset terminaattorisekvenssit. Nisäkässo-15 luissa käytettäessä ekspressiovektorissa on usein virusmateriaalista saatuja säätelyfunktioita. Yleisesti käytetyt promoottorit ovat esimerkiksi peräisin poly-omasta, Adenovirus 2-viruksesta ja kaikkein useimmiten SV-40-viruksesta.

(Kts. esim. US-patentti 4,399,216 ja Gheysen, D. ja Fiers, W., J. of Mol. and Appi. Genetics 1: 385-394/1982/).

20

Puhdistus ia formulaatiot ; E. coli'ssa. hiivassa tai muissa soluissa ekspressoidut humaanit GM-CSF- polypeptidit voidaan puhdistaa alan vakiomenetelmillä, mukaan lukien saosta-25 maila ammoniumsulfaatilla, fraktioivalla pylväskromatografialla (esimerkiksi ioninvaihto-, geelisuodatus-, elektroforeesi-, affiniteettikromatografia jne.) ja lopulta kiteyttämällä (kts. yl. "Enzyme purification and Related Techniques", Methods in Enzymoloav. 22: 233-577 /1977/ ia Scopes. R. Protein Purification: Principles and Practic. Springer-Verlag, New York/1982/). Kun keksinnön 30 mukaiset polypeptidit on puhdistettu, joko osittain tai homogeeniseksi, niitä

voidaan käyttää tutkimustarkoituksiin, esimerkiksi solujen kasvualustojen lisäaineina (esim. minimum essential medium Eagle, Iscove's modified Dulbecco : Medium tai RPM11640; saatavissa: Sigma Chemical Company, St. Louis, MO

ja GIBCO Division, Chagrin Falls, OH) ja antigeenisenä aineena, jolla saadaan 19 103986 immunomäärityksissä, immuno-fluoresenssivärjäyksissä jne. hyödyllisiä spesifisiä immunoglobuliineja (kts. yl. Immunological Methods. Vois. I & II, toim. Lefkovits, I. ja Perm's, B., Academic Press, New York, N.Y. /1979 & 1981/; ja Handbook of Experiment! Immunology, toim. Weir, D., Blackwell Scientific 5 Publications, St. Louis, MO/1978/).

Esillä olevan keksinnön mukaisia polypeptidejä voidaan myös käyttää farmaseuttisissa seoksissa, esimerkiksi vahvistamaan luonnonmukaista puolustusta erilaisia neoplastisia tai infektio-tautitiloja vastaan tai apuaineena kemotera-10 piassa myelosuppression voittamiseen (kts. Gasson. J. et.al.. "Lymphokines and Hematopoiesis", Normal and Neoplastic Hematopoisesis. sivut 129-139, Alan R. Liss, Inc. New York /1933/).

Valmistettaessa farmaseuttisia seoksia, jotka sisältävät tämän keksinnön 15 mukaisia polypeptidejä, nämä polypeptidit tehdään seokseksi parhaiten inert-tien, farmaseuttisesti hyväksyttävien kantajien kanssa. Sopivat kantajat ja menetelmät niiden valmistamiseksi ovat alalla yleisesti tunnettuja (kts. esim. Remington's Pharmaceutical Sciences ja U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA/1980/). Parhaana pidetty 20 antamistie on parenteraalinen, ja siihen voi liittyä mekaanisten jakelujärjestelmien käyttäminen.

Farmaseuttinen seos on parhaiten yksikköannostusmuodossa. Tällaisessa muodossa valmiste jaetaan yksikköannoksiin, jotka sisältävät sopivia määriä 25 aktiivista komponenttia. Aktiivisen yhdisteen määrää valmisteen yksikköannok-sessa voidaan vaihdella tai säätää välillä 1 pg -100 mg, riippuen kulloisestakin applikointitavasta ja aktiivisen ainesosan tehosta. Seos voi haluttaessa sisältää myös muita terapeuttisia aineita.

. 30 Annostuksia voidaan vaihdella riippuen potilaan tarpeista, hoidettavan tilan vakavuudesta ja kulloinkin käytetystä yhdisteestä. Kussakin tilanteessa oikean annostuksen määrittäminen on alalla tunnettua. Hoito aletaan yleensä pienemmillä annostuksilla, jotka ovat pienempiä kuin yhdisteen optimaalinen annos. Tämän jälkeen annostusta lisätään pienin askelin, kunnes saavutetaan näissä 20 103986 olosuhteissa optimaalinen vaikutus. Käytön yksinkertaisuuden vuoksi päivittäinen kokonaisannostus voidaan jakaa ja antaa erittäin päivän aikana.

Seuraava kokeellinen informaatio ja tulokset on annettu esimerkkinä mutta ei 5 rajoittavana.

Kokeellinen osa A. Kloonatut humaanit auttaja-T-solut 10 1) Humaanien T-solujen klooni, jolle annettiin nimeksi T-7, eristettiin menetelmällä, joka on kuvattu seuraavan teoksen kappaleissa 36 ja 37: isolation. Characterization, and Utilization of T Lymphocyte Clones, toim. Fathman, C. ja Fitch, F., Academic Press, New York (1982). Solulinja ylläpidettiin jatkuvasti 15 konsentraatiossa noin 0,5 x 105 solua/ml DME-alustassa (Dulbeco's Modified Eagle), jolloin mukana oli 10 % lämmöllä inaktivoitua vasikansikiöseerumia, 5 x 105 M 2-ME, 2 mM glutamiinia, ei-välttämättömiä aminohappoja ja välttämättömiä vitamiineja ja alusta oli käsitelty 30 %:lla supernatantteja fytohema-glutiniinilla (PHA) stimuloiduista humaaneista perifeerisistä leukosyyteistä.

20 2) T-7-solujen PHA-aktivointi: Soluja viljeltiin konsentraatiossa 5 x 105/ml DME-aiustassa, joka sisälsi 4 % lämmöllä inaktivoitua vasikansikiöseerumia, 5 x 105 M 2-ME, 2 mM glutamiinia, ei-välttämättömiä aminohappoja, välttämättömiä vitamiineja ja 4 μΙ/ml ConA. Inkuboitiin 4-6 tuntia 37°C:ssa 10-prosenttisessa I 25 hiilidioksidissa, minkä jälkeen solususpensiota sentrifugoitiin 10 minuuttia nopeudella 1500 kierr./min. Solupelletit otettiin talteen ja jäähdytettiin välittömästi -70°C:ssa. Supernatantit suodatettiin (Nalgene-0,22 mikronia.) ja säilytet-- tiin -80°C:ssa kasvutekijöiden lähteenä. Supernatanttinäytteistä määritettiin CSF-aktiivisuus (kts. jäljempänä), jotta voitaisiin vahvistaa PHA-käsittelyn 30 aiheuttama linjan indusointi.

21 103986 B. Luuydin-ja MCord"-verimääritykset

Luuydinsoluja, jotka oli saatu ei-veritautia kärsiviltä potilailta, kerrostettiin Ficoll'in päälle (tyyppi 400, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), sentrifugoitiin 5 (2.000 kierr./min., 20 minuuttia) ja välipinnalla olevat solut poistettiin. Nämä so lut pestiin kaksi kertaa IMD-alustassa (Iscove's Modified Dulbeccos' Medium), joka sisälsi 10 % vasikansikiöseerumia (FCS), suspendoitiin uudelleen samaan alustaan ja kiinnittyneet solut poistettiin kiinnittämällä ne muovisiin petrimal-joihin. Kiinnittymättömät solut lisättiin konsentraatiossa 105 solua/ml Iscove’n 10 alustaan, joka sisälsi 20 % vasikansikiöseerumia, 50 μΜ 2-merkaptoetanolia, 0,9 % metyyliselluloosaa ja eri konsentraatioita joko supernatantteja, joiden tiedetään sisältävän CS-aktiivisuutta (colony stimulating activity), tai testattavia supernatantteja. 1 ml näytteet laitettiin 35 mm petrimaljoille ja viljeltiin 37°C:ssa täysin kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 6 % hiilidioksidia. 3 päivän kulut-15 tua viljelmän aloittamisesta jokaiseen maljaan lisättiin yksi yksikkö erytropoietii-niä (Eaves, A. British Columbia Cancer Research Center, Vancover. B.C.). Granulosyytti-makrofaagipesäkkeet ja erytroidipurkaumat arvioitiin päivinä 10-14 käyttämällä invertoitua mikroskooppia.

20 Hepariiniin otettuja "cord"-verisoluja sentrifugoitiin 6 minuuttia nopeudella 2.000 kierr./min. Valkoiset verisolut, jotka olivat plasman ja punaisten verisolujen huipun välillä, siirrettiin koeputkeen, joka sisälsi 0,17 N ammoniumkloridia ja 6 % vasikansikiöseerumia. Suspensio pidettiin 5 minuuttia jäillä, minkä jälkeen sen päälle laitettiin 4 ml vasikansikiöseerumia ja sentrifugoitiin 6 minuuttia 25 nopeudella 2.000 kierr./min. Solupelletti pestiin Dulbecco’n fosfaattipuskuroi-dulla suolaliuoksella ja vietiin Ficoll-ja muoviinkiinnitysvaiheiden läpi, joita edellä on kuvattu luuydinsolujen yhteydessä. Pienitiheyksiset kiinnittymättömät solut otettiin talteen ja ne laitettiin 105 solua/viljelmä konsentraatiossa puolikiin- V · v teään agarjärjestelmään, kuten edellä on kuvattu.

30 Määritysten lopussa määritettiin solukoostumus levittämällä yksittäiset pesäkkeet lasilevyille ja värjäämällä VVright-Giemsa-värillä. Eosinofiilit määritettiin värjäämällä Luxol Fast Blue-värillä. (Johnson. G. ja Metcalf, D., Exp. Hematol.

8: 549-561 /1980/).

22 103986 C. mRNA:n eristäminen ihmissoluista.

1) Solun totaali-RNA eristettiin soluista käyttämällä J. Chirgwin'in et ai. quanidiini-isotiosyanaattimenetelmää (Biochemistry, 18: 5294-5299/1979/).

5

Pakastetut solupelletit, jotka oli saatu indusoimattomista ConA-indusoiduista humaaneista auttajasoluista (4 tuntia stimuloinnin jälkeen), suspendoitiin quani-diini-isotiosyanaatti-lyysausliuokseen. 1,5 x.108 solua kohti käytettiin 20 ml lyysausliuosta. Pelletit suspendoitiin uudelleen pipetoimalla, minkä jälkeen 10 DNA hajotettiin johtamalla neljä kertaa ruiskun läpi käyttämällä 16-gauge neulaa. 40 ml:n polyallomeerisentrifuugiputkessa lysaatti laitettiin kerrokseksi seoksen päälle, jonka koostumus oli 20 ml 5,7 M CsCI, 20 mM.,EDTA. Tätä liuosta sentrifugoitiin nopeudella 25.000 kierr./min. Beckman SW28-roottorissa (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA) 40 tuntia 15°C:ssa. DNA:ta sisältä-15 vä guanidiini-isotiosyanaattifaasi poistettiin pipetillä yläosasta aina välipintaan asti. Putken seinämät ja välipinta pestiin 2-3 ml. lla guanidiini-isotiosyanaatti-lyysaus-liuosta. Koeputki katkaistiin saksilla välipinnan alapuolelta ja CsCI-liuos dekantoitiin. RNA-pelletit pestiin kaksi kertaa kylmällä 70-prosenttisella etanolilla. Sen jälkeen pelletit suspendoitiin uudelleen 500 pl:aan liuosta, jonka koos-20 tumus oli: 10 mM.TrisHCI pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,05 % SDS. Lisättiin 50 μΙ 3M natriumasetaattia ja RNA saostettiin 1 ml:lla etanolia. Sentrifugoimalla saatiin noin 0,3 mg totaali-RNA:ta ja pelletit pestiin kerran kylmällä etanolilla.

< 2) PolyA+ mRNA:n eristiminen: 25

Pesty ja kuivattu totaali-RNA-pelletti suspendoitiin uudelleen 900 pl:aan oligo (dT)-eluointipuskuria (10 mM Tris.HCI, pH.7,4, 1 m EDTA, 0,5 % SDS). RNA:ta kuumennettiin 3 minuuttia 68°C:ssa ja sen jälkeen jäähdytettiin jäillä. Lisättiin 100 μΙ 5 M natriumkloridia. RNA-näyte vietiin 1,0 ml:n oligo (dT)-selluloosapyl- 30 vääseen (tyyppi 3, Collaborative Research, Waltham, MA), joka oli tasapaino- I tettu sidepuskurilla (10 mM Tris..HCI pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,5 M NaCI, 0,5 % : SDS). Pylvään läpi virrannut aine johdettiin pylvään läpi vielä kaksi kertaa. Sen I + jälkeen pylväs pestiin 20 ml:ila sidepuskuria. PolyA mRNA otettiin talteen pesemällä eluointipuskurilla. RNA eluoitui tavallisesti ensimmäisessä 2 ml:ssa 23 103986 eluointipuskuria. RNA saostettiin 0,1 voluumilla 3 M natriumasetaattia (pH 6) ja 2 tilavuudella etanolia. RNA-pelletti otettiin talteen sentrifugoimalla, pestiin kaksi kertaa kylmällä etanolilla ja kuivattiin. Sen jälkeen pelletti suspendoitiin uudelleen veteen. Näytteet laimennettiin ja määritettiin absorbanssi aallonpi-5 tuudella 260 nm.

D. cDNA-kirjaston rakentaminen: 1) Vektoriprimeeri-ja oligo dG-häntäisen linkkeri-DNA:n valmistaminen: 10 Käytettiin Okayama & Berg'in menetelmää (Mol. & Cell. Biol. 2: 161-170 /1982/) vain pienin muunnoksin ja sovitettuna Okayama & Berg'in kuvaamille pcDV1-ja pL1-plasmideille (Mol. & Cell. Biol. 3: 380-389/1983/).

15 80 pg:n näyte pcDV1-DNA:.ta pilkottiin 30°C:ssa 20 yksiköllä Konl-endonukle- aasia 450 pl:ssa reaktioseosta, jonka koostumus oli: 6 mM Tris.HCI (pH 7,5), 6 mM MgCI2, 6 mM NaCI, 6 mM 2-ME ja,0,1 mg naudanseerumialbumiini (BSA) ml:ssa. 16 tunnin jälkeen pilkkominen pysäytettiin 40 pl:lla 0,25 M EDTA:ta (pH 8,0) ja 20 pl.lla 10% natriumdodekyylisulfaattia (SDS); DNA.otet-20 tiin talteen sen jälkeen, kun oli uutettu vedellä kyllästetyllä 1:1 fenoli-klorafor-milla (jäljempänä käytetään nimitystä fenoli-kloroformi) ja saostettu etanolilla. Vasikan thymuksen terminaalisen transferaasin avulla lisättiin Kpnl-endonukle-aasilla muodostettuihin päihin homopolymeerihännät, joissa oli keskimäärin 60, mutta enintään 80, deoksitymidylaatti (dT) ryhmää päätä kohti. Reaktioseoksen 25 (38 pl) koostumus oli: natriumkakodylaatti-30 mM Tris.HCI pH 6,8 puskurina, 1 mM CoCI2, 0,1 mM ditiotreitoli, 0,25 mM dTTP, Kpnl-endonukleaasi-pilkottu DNA, ja 68 U terminaalinen deioksinukleotidyylitransferaasi (P-L Biochemicals, Inc., Milwaukee, Wl). Pidettiin 30 minuuttia 37°C:ssa, minkä jälkeen reaktio pysäytettiin 20 pl.lla 0,25 M EDTA.ta. (pH 8,0) ja 10 pl.lla 10 prosenttista nat-30 riumdodekyylisulfaattia, ja DNA otettiin talteen seostamalla etanolilla sen jälkeen, kun oli useita kertoja uutettu fenoli-kloroformilla. DNA pilkottiin sen jälkeen 37°C:ssa 5 minuutin ajan 15 U:lla EcoRI-endonukleaasia 50 pl:ssa seosta, jonka koostumus oli: 10 mM Tris.HCI pH 7,4, 10 mM MgCI2, 1 mM ditiotreitoli ja 0,1 mg BSA m!:.ssa. Suuri fragmentti, joka sisälsi SV40-polyade- 24 103986 nylaatiokohdan ja pBR322-replikaation aloituskohdan ja ampisilliiniresistens-siysgeenin, puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesilla (1 %) ja otettiin talteen geelistä lasijauhemenetelmän muunnelmalla (Vogelstein, B. & Gillespie, D.,

Prot.. Nat. Acad, Sei. 76: 615-619/1979/). dT-häntäinen DNA puhdistettiin 5 edelleen absorboimalla ja eluoimalla oligo (dA)-selluloosapylväästä seuraavalla tavalla: DNA liuotettiin 1 ml.aan 10 mM Tris.HCI, pH 7,3, puskuria, joka sisälsi 1 mM EDTA:ta ja 1 M natriumkloridia, jäähdytettiin 0°C:.een ja vietiin oligo (dA)-selluloosapylvääseen (0,6 x 2,5 cm), joka oli tasapainotettu samalla puskurilla 0°C:ssa. Pylväs pestiin samalla puskurilla 0°C:ssa ja eluoitiin vedellä 10 huoneen lämpötilassa. Eluoitunut DNA seostettiin etanolilla ja liuotettiin 1 mM EDTA:n avulla 10 mM Tris.HCI, pH 7,3, puskurilla.

Oligo (dG)-häntäinen linkkeri-DNA valmistettiin digestoimalla 75 pg pL1-DNA:ta 20 yksiköllä Pstl-endonukleaasia 450 pl:ssa seosta, jonka koostumus oli: 6 mM 15 Tris.HCI pH 7,4, 6 mM MgCI2, 6 mM 2-ME, 50 mM NaCI, ja 0,01 mg BSA ml:ssa. Kun reaktioseosta oli pidetty 16 tuntia 30 C:ssa, se uutettiin fenoli-kloroformilla ja DNA saostettiin alkoholilla. Sen jälkeen lisättiin, hännät, joissa oli 10 -15 deoksiguanylaatti (dG)-ryhmää, häntää kohti käyttämällä 46 yksikköä terminaal ista deoksinukleotidyylitransferaasia edellä kuvatussa samassa 20 reaktioseoksessa (38 pl) paitsi, että dTTP korvattiin 0,1 mM dGTP:llä. Pidettiin 20 minuuttia 37°C:ssa, minkä jälkeen seos uutettiin fenoli-kloraformilla, DNA-saostettiin etanolilla ja sen jälkeen digestoitiin 4 tuntia 37°C:ssa 35 yksiköllä Hlndlll-endonukleaasia 50 pl.ssa seosta, jonka koostumus oli: 20 mM Tris.HCI pH 7,4 7 mM MgCI2, 60 mM NaCI ja 0,1 mg BSA. Pieni oligo (dG) häntäinen 25 linkkeri-DNA puhdistettiin agaroosigeeli-elektroforeesilla (1,8 %) ja otettiin talteen edellä kuvatulla tavalla.

2) cDNA-kirjaston valmistaminen: *

30 Vaihe 1: cDNA-synteesi. Reaktioseoksen (10 μΙ) koostumus oli: 50 mM

Tris.HCI pH 8,3, 8 mM MgCI2, 30 mM KCI, 0,3 mM ditiotreitoli, dATP, dTTP, ; dGTP ja dCTP 2 mM kutakin, 20 pCi 32p-dCTP (3000 Ci/mmol), 3 pg polyA+ j RNA Con-A:lla indusoiduista T-soluista, 60 yksikköä RNasin (Biotec, Inc.,

I Madison, Wl), ja 2 pg, vektoriprimeeri-DNA (15 pmol primeeripäätä), ja 45 U

25 103986 käänteistranskriptaasi. Reaktioseosta inkuboitiin 60 minuuttia 42°C:ssa ja sen jälkeen reaktio pysäytettiin lisäämällä 1 μΙ 0,25 M EDTA:ta (pH 8,0) ja 0,5 μΙ 10-prosenttista SDS; lisättiin 40 μΙ fenoli-kloroformia ja liuosta sekoitettiin voimakkaasti Vortex-sekoittimessa, ja sen jälkeen sentrifugoitiin. Vesifaasiin lisät-• 5 tiin 40 μΙ 4 M ammoniumasetaattia ja 160 μΙ etanolia, minkä jälkeen liuos jääh- dytettiinl 5 minuutin aikana, jäähdyttämisen aikana saostuneet reagoimattomat deoksinukleosidi- trifosfaatit liuotettiin lämmittämällä huoneen lämpötilaan ja varovasti sekoittamalla, ja sentrifugoitiin 10 minuuttia Eppendorf-mikrofuugissa. Pelletti liuotettiin seokseen, jossa oli 10 μ110 mM Tris.HCI, pH 7,3, puskuria, ja 10 1 mM EDTA:ta, sekoitettiin 10 μΙ:η kanssa 4 M ammoniumasetaattia ja saostet- tiin 40 pl:lla etanolia. Tämä menettely poistaa yli 99 % reagoimattomista deok-sinukleotiditrifosfaateista. Pelletti huuhdeltiin etanolilla.

Vaihe 2: Oligodeoksisytidylaatin /oligo (dC)/ lisääminen. Pelletti, joka sisälsi 15 plasmidi-cDNA:mRNA:n, liuotettiin 20 pl:aan 140 mM natriumkakodylaatti.-30 mM Tris.HCI, pH 6,8, -puskuria, jossa oli: 1 mM CoCI2, 0,1 mM ditiotreitoli, 0,2 pg poly(A), 70 μΜ dCTP, 5 uCi 32p-dCTP, 3000 Ci/mmol ja 60 U terminaalinen deoksinukleotidyylitransferaasi. Reaktio suoritettiin 5 minuutin aikana 37°C:ssa, millä voitiin lisätä 10-15 ryhmää DCMPitä päätä kohti, ja sen jäl-20 keen pysäytettiin lisäämällä 2 μΙ 0,25 M EDTAita (pH 8,0) ja 1 μΜΟ % SDS. Uutettiin 20 piillä fenoli-kloroformia, minkä jälkeen vesifaasin kanssa sekoitettiin 20 μΙ 4 M ammoniumasetaattia, DNA saostettiin ja saostettiin uudelleen 80 piillä etanolia ja lopullinen pelletti huuhdeltiin etanolilla.

25 Vaihe 3: Pilkkominen Hindlll-endonukleaasilla. Pelletti liuotettiin 30 pl:aan puskuria, jonka koostumus oli: 20 mM Tris.HCI pH 7,4, 7 mM MgCI2, 60 mM NaCI ja 0,1 mg BSA ml:ssa ja sen jälkeen digestoitiin 2 tuntia 37°C:ssa 10 yksiköllä Hindlll-endonukleaasia. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 3 μΙ 0,25 M EDTA (pH 8,0) ja, 1,5 μΙ 10 % SDS. Uutettiin fenoli-kloroformilla, minkä jälkeen lisättiin 30 30 μΙ 4 M ammoniumasetaattia. Tämän jälkeen DNA saostettiin 120 piillä eta nolia. Pelletti huuhdeltiin etanolilla ja sen jälkeen liuotettiin 10 pl.aan seosta, joka sisälsi 10 mM Tris.HCI (pH 7,3)-puskuria ja 1 mM EDTAita, ja lisättiin 3 μΙ etanolia estämään jäätyminen -20pC, säilyttämisen aikana.

26 103986

Vaihe 4: Syklisointi oligo (dG)-häntäisen linkkeri-DNA:n avulla. 9 μΙ:η suuruista näytettä Hindlll-endonukleaasi pilkottua oligo (dC)-häntäistä cDNA:mRNA-plasmidia (näytteestä noin 90 %) inkuboitiin 5 minuuttia 65°C:ssa seoksessa (90 μΙ), jonka koostumus oli: 10 mM Tris.HCI pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 M NaCI 5 ja 1,8 pmol oligo (dG)-häntäinen linkkeri-DNA, siirrettiin 60 minuutiksi 42°C:een ja sen jälkeen jäähdytettiin 0°C:een. Seos (90 μΙ) säädettiin 900 Ml:ksi seoksella, jonka koostumus oli: 20 mM Tris.HCI pH 7,5, 4 mM MgCI2, 10 mM (NH4)2S04, 0,1 M KCI, 50 pg BSA ml:ssa, ja 0,1 mM b-NAD; lisättiin 6 pg E. coli DNA-ligaasia ja sen jälkeen liuosta inkuboitiin yön yli 12°C:ssa.

10

Vaihe 5: RNA-säikeen korvaaminen DNA:lla. Insertin RNA-säikeen korvaamista varten ligaatioseos säädettiin niin, että se sisälsi 40 μΜ kutakin neljästä deoksinukleosiditrifosfaatista, 0,15 mM b-NAD, 4 pg uutta E. coli DNA-ligaasia, 16 yksikköä E. coli DNA-polymeraasia I (Poli) ja 9 yksikköä E. coli RNaasi H.

15 Tätä seosta (960 μΙ) inkuboitiin peräkkäin 1 tunti 12°C:ssa ja 1 tunti huoneen lämpötilassa tarkoituksena edistää optimaalista korjaussynteesiä ja suorittaa nick-translaatio Poll-entsyymillä.

Vaihe 6: E. coli'in transformointi. Transformointi suoritettiin Cohen'in et'al. ku-20 vaarnalla menetelmällä (Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 69: 2110-2114 /1972/) pienin muunnelmin. E. coli K-12 kantaa MC1061 (Casadaban, M. ja Cohen, S., J. Mol. Biol. 138: 179-207 /1980/) kasvatettiin 0,5 absorptioyksikön tiheyteen allonpituudella 600 nm 37°C:ssa 20 ml:ssa L-lientä. Solut otettiin talteen sent-rifugoimalla, suspendoitiin 10 ml:aan 10 mM Tris.HCI, pH 7,3, puskuria, joka 25 sisälsi 50 mM kalsiumkloridia, ja sentrifugoitiin 5 minuuttia 0°C:ssa. Solut suspendoitiin takaisin 2 ml: aan edellä mainittua puskuria ja inkuboitiin jälleen 5 minuuttia 0°C:ssa; sen jälkeen sekoitettiin 0,2 ml solususpensiota 0,1 ml:n kanssa DNA-liuosta (vaihe 5) ja inkuboitiin 15 minuuttia 0°C:ssa. Seuraavaksi soluja pidettiin 2 minuuttia 37°C:ssa ja tämän jälkeen huoneen lämpötilassa 30 10 minuuttia; tämän jälkeen lisättiin 0,5 ml L-lientä ja viljelmää inkuboitiin | 30 minuuttia, 37°C:ssa, sekoitettiin 2,5 ml:n kanssa L-liemi-pehmytagaria 42°C:ssa, ja levitettiin L-liemiagarille, joka sisälsi 50 pg ampisilliinia ml:ssa. Inkuboitiin 37°C:ssa 12-24 tuntia, minkä jälkeen yksittäiset pesäkkeet poi- 27 103986 niittiin steriileillä hammastikuilla. Kaikkiaan muodostui noin 5 x 104 itsenäistä cDNA-kloonia.

E. Humaani-T-Solu-cDNA-kirjaston seulanta DNA-transfektoinneilla: 5 104 riippumattoman kloonin kokoelma poimittiin mielivaltaisesti T-solu-cDNA-kirjastosta ja kasvatettiin yksitellen mikrotiitterimaljojen kaivoissa, jotka sisälsivät 200 pg L-lientä ja ampisilliinia konsentraatiossa 50 μΙ/ml ja dimetyylisulf-oksidia 7 % konsentraatiossa. Mikrotiitteriviljelmistä valmistettiin poolit, jotka 10 sisälsivät 48 cDNA-kloonia. 40 tällaista poolia kasvatettiin 1 litran viljelmissä L-lientä, joka sisälsi 100 pg/ml ampisilliinia. Jokaisesta viljelmästä eristettiin plasmidi-DNA ja puhdistettiin kaksi kertaa muodostamalla vyöhykkeet CsCI-gradienteissa. Kutakin poolia vastaava cDNA transfektoitiin seuraavalla tavalla COS-7 apinasoluihin.

15

Yksi päivä ennen transfektointia siirrostettiin noin 106 COS-7 apinasolua yksittäisille 60 mm maljoille DME-alustassa, joka sisälsi 10 % vasikansikiöseerumia ja 2 M glutamiinia. Transfektoinnin suorittamista varten alusta imettiin kustakin levystä ja korvattiin 1,5 ml:lla DME-alustaa, joka sisälsi 50 mM Tris..HCI, pH 20 7,4, -puskuria, 400 pg/ml DEAE-dekstraania ja 15 pg testattavaa plasmidi- DNA.ta. Maljoja inkuboitiin 4 tuntia 37°C:ssa, sen jälkeen poistettiin DNA-pitoi-nen alusta ja maljat pestiin kaksi kertaa 2 ml:Ha seerumivapaata DME-alustaa. DME-alustaa, joka sisälsi 150 pM klorokiinia, lisättiin takaisin maljoille, joita sen jälkeen inkuboitiin vielä 3 tuntia 37°C:ssa. Maljat pestiin kerran DME-alustalla 25 ja sen jälkeen lisättiin DME-alustaa, jokia sisälsi 4 % vasikansikiöseerumia, 2 mM glutamiinia, penisilliiniä ja streptomysiiniä. Sen jälkeen soluja inkuboitiin 72 tuntia 37°C:ssa. Kasvualusta otettiin talteen ja siitä määritettiin seuraavassa kuvatulla tavalla humaani-GM-CSF-aktiivisuus.

30 Neljästä poolista (ryhmätlA, 3B, 7A ja 14A) saatiin humaani-GM-CSF-aktiivi-suutta (seuraava taulukko I). Jokainen ryhmä jaettiin sen jälkeen 6 pooliin, joista jokainen sisälsi kahdeksan alkuperäisesti poolatuista klooneista. Kustakin alkupoolista.oli yksi alapooli positiivinen transfektointimäärityksessä lukuunottamatta alkupoolia 7A, josta saatiin kaksi positiivista alapoolia. Jokainen 28 103986 plasmidi neljässä viidestä alapoolista transfektoitiin yksitellen COS-7-soluihin. Neljä yksittäistä kloonia, joille annettiin nimiksi 3-8a, 7-1 a, 7-4d ja 14-1 e, olivat aktiivisia tuottaen GM-CSF-aktiivisuutta. Restriktioendonukleaasianalyysi osoitti, että kaikilla näillä klooneilla oli oleellisesti sama rakenne.

5

Taulukossa I on esitetty niiden hemopoeettisten pesäkkeiden lukumäärä, joita kukin transfektionäyte on stimuloinut kaksinkertaisesti suoritetuissa "cord"-veri-määrityksissä. Ryhmä merkitsee 20 - 50 solua, pieni pesäke oli 51 -150 solua ja pesäke oli yli 150 solua.

10

TAULUKKO I

CS-aktiivisuuden (Colony Stimulating Activity) määritys plasmidi-DNA-pooli transfektoinneista 15

Ensimmäinen seulonta 48 kloonin 40 poolia (1-20, A + B)

Vale-infektoitu COS-7: 7 + 12 ryhmää 20

Pooli 1A: 29 + 25 ryhmää . Pooli 3B: 38 + 20 ryhmää 25 Pooli 7A: 22 + 19 ryhmää

Pooli 14A:26 + 32 ryhmää

Kaikki muut poolit: alle 20 ryhmää 30 j 29 103986

Toinen seulonta 8 kloonin alapoolit

Vale-infektoitu COS-7: 9 + 15 ryhmää 5 Alapooli 1-5: 56 + 54 ryhmää

Alapooli 3-8: 98 + 52 pientä pesäkettä

Alapooli 7-1: 29 + 41 pientä pesäkettä 10

Alapooli 7-4: 100 + 93 pientä pesäkettä Alapooli 14-1: 40 + 73 pientä pesäkettä 15 Kaikki muut alapoolit: alle 20 ryhmää

Kolmas seulonta Yksittäiset kloonit 20 Klooni 3-8a: 120 + 127 pesäkettä

Klooni 7 - 1a: 198 + 164 pesäkettä

Klooni 7 - 4a: 176+ 160 pesäkettä 25

Klooni 14 - 1e: 62 + 67 pesäkettä . Kaikki muut kloonit: alle 20 ryhmää w * 30 Kuviossa 2 on esitetty plasmidi (pcD-humaani-GM-CSF), jossa on oleellisesti täyspitkä cDNA-insertti. E. coli-bakteeri (MC 1061), jossa on tämä plasmidi, on tallennettu ATCC-kokoelmaan (tallennusnumero 39923). Kuviossa 2 on osoitettu nuolella 776 bp cDNA-insertin, joka sisälsi pcD-ekspressiovektorin, transkriptio SV40-alkupromoottorista. Katkaisun donori- ja akseptorikohtien sijainnit on 30 103986 annettu SV40-viruksesta peräisin oleva polyadenylointisignaali sijaitsee cDNA-insertin 3'-päässä. GM-CSF-koodaava alue cDNA-insertissä on voimakkaasti varjostettu, kun taas ei-koodaavat alueet on varjostettu vähemmän. Vektorise-kvenssien loppuosat ovat peräisin pBR322-plasmidista, mukaanlukien β-lakta-5 maasigeeni (AmpR) ja replikaation aloituskohta.

3-8a-sekvenssi määritettiin käyttämällä M13-dideoksi-ketjunpäättämismenete-Imää (Sanger, F. et ai.. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74: 5463-5467 /1977/) ja modifioitua Maxam'in ja Gilbertin tekniikkaa (Rubin, C. ja Schmid, C. Nucleic 10 Acid Res. 8: 4613-4619 /1981/).

cDNA-insertti sisältää yhden ainoan avoimen lukukehyksen. Ensimmäinen ATG löydetään 33-35 nukleotidin päässä 5'-päästä ja sitä seuraa 144 kodonia ennen päättämis-triplettiä (TGA) nukleotidipaikoissa 465-467.

15

Taulukossa II on esitetty noin 60 humaanin luuydin-ja "cord"-veripesäkkeen, joita on kasvatettu yksittäisten pesäkkeiden 3-8a, 7-1 a, 7-4ä ja 14-1 e vaikutuksen alaisena, solukoostumuksen prosentuaalinen jakautuminen. Eosinofiilien ja muiden solutyyppien sekapesäkkeiden mukanaolo voi johtua yhdessä kasva-20 vista pesäkkeistä.

TAULUKKO II

Humaanien luuydinpesäkkeiden solukoostumus 25

Neu MO Eos Neu/MQ MO/Eos Neu/M9/E0s 15% 30% 7% 37% 2% 9% «« j * Hiiren GM-CSF-aktiivisuutta koodaava täyspitkä cDNA (mukaanlukien signaali- 30 sekvenssi) on myös eristetty, ja ATCC-kokoelmaan (tallennusmerolla 39924) I on tallennettu E.coli-bakteeri (MC1061), jossa on hiiren cDNA:n sisältävä I pcD-plasmidi. Hiiren cDNk:sta saatu PST I/A1 a lll-fragmentin 32P-leimattu koetin hybridisoitui alhaisissa stringenttiysolosuhteissa (42°C) yhden esillä ; 31 103986 olevan keksinnön mukaisen humaanin GM-CSF-cDNA'n kanssa (kts. Maniatis, T. et ai,. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory /1981/).

’ 5 Kuviossa 3 on verrattu oletettuja hiiren ja ihmisen GM-CSF-proteiinisekvens- sejä. Identtiset jäännökset (yhdenmukaistamisen jälkeen) on alleviivattu, kun taas ryhmät, jotka ovat mukana Ihmisproteiinissa, mutta ei hiiren proteiinissa, on osoitettu tähdellä, ja ryhmät, joita on vain hiiressä (so.,.Ser+Asn paikoissa 57-58 ja Lys-Lys paikassa 65) on osoitettu lyhyellä pystyviivalla. Hiiren ja ihmi-10 sen GM-CSF-eDNA'n väliset homologiat ovat yllättäviä. Kaikkien näiden kahden CM-CSF-sekvenssin välillä on noin 70% homologia (Brutlag, D. et ai..

Nucleic Acids Res. 10. 279-294 /1981/). Esillä olevan keksinnön mukainen humaani GM-CSF ei kuitenkaan merkittävästi stimuloi hiiren verta muodostavien kantasolujen kasvua in vitro.

15

Kloonkirjasto pcD-ekspressiovektorissa mahdollisti täydellisten cDNA-kloonien tunnistamisen ekspressoimalla suorasti nisäkässoluissa. Tarkemmin sanoen täydelliset humaanit GM-CSF-cDNA-kloonit identifioitiin suoraan transfektoi-malla COS-7-solut mielivaltaisesti poimituilla cDNA-klooneilla ja mittaamalla 20 solusuperenatanttiin erittynyt GM-CSF-aktiivisuus. Nämä tulokset vahvistavat, että lymfokiinien tai hormoonien täyspitkät cDNA-kloonit voidaan identifioida pelkästään detektoimalla funktionaalinen polypeptidi eukaruoottisissa soluissa.

« «

Edellä olevasta on huomattava, että esillä olevan keksinnön mukaiset cDNA-25 kloonit tuottavat täsmällistä ja täydellistä sekvenssitietoa humaani-GM- CSF:stä. Keksintö antaa myös alan ammattimiehille keinon tuottaa merkittäviä määriä tekijää (oleellisesti ilman muita hematopoeettisia tekijöitä), joilla voidaan . parantaa neutrofiilisten granulosyyttien ja makrofaagien sekä muiden hemato- T · ' poeettisten solujen (esim. eosinofiilien) in vitro ylläpitoa cDNA-klooneista kerät- , 30 ty tieto lisää myös nisäkkäiden immuunireaktion ymmärtämistä ja parantaa kokeellisen tutkimuksen mahdollisuuksia.

Claims (6)

32 103986

1. Menetelmä valmistaa polypeptidi, jolla on pesäkkeitä stimuloiva tekijä-aktiivisuus humaaneihin granulosyytteihin, makrofaageihin ja eosinofiileihin, jonka 5 rakenne mukaanlukien johtosekvenssi on Met Trp Leu Gin Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Vai Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gin Pro Trp Glu His Vai Asn Ala Ile Gin Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu

10 Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Vai Glu Vai Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gin Glu Pro Thr Cys Leu Gin Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gin Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gin His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gin Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Vai Ile Pro

15 Phe Asp Cys Trp Glu Pro Vai Gin Glu tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet, joissa: a) muodostetaan vektori, joka sisältää mainittua polypeptidiä koodaavan nuk-leotidisekvenssin, jonka vektorin sisältävä isäntä kykenee ekspressoimaan; 20 b) liitetään vektori isäntään; ja c) pidetään vektorin sisältävä isäntä olosuhteissa, jotka sopivat nukleotidisek-venssin ekspressoimiseen mainituksi polypeptidiksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että poly-25 peptidi eristetään ilman johtosekvenssiä.

3. Nukleiinihapposekvenssi, joka koodaa patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisel- j le menetelmälle saadun polypeptidin. : 30

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen nukleiinihapposekvenssi, tunnettu siitä, että se sisältää nukleotidisekvenssin 35 33 103986 ATG TGG CTG CAG AGC CTG CTG CTC TTG GGC ACT GTG GCC TGC AGC ATC TCT GCA CCC GCC CGC TCG CCC AGC CCC AGC ACG CAG CCC TGG GAG CAT GTG AAT GCC ATC CAG GAG GCC CGG CGT CTC CTG AAC CTG AGT AGA GAC ACT GCT GCT GAG ATG AAT GAA ACA GTA GAA GTC ATC TCA GAA ATG

5. Vektori, joka sisältää patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukaisesta DNA-sekvens-sistä.

5 TTT GAC CTC CAG GAG CCG ACC TGC CTA CAG ACC CGC CTG GAG CTG TAC AAG CAG GGC CTG CGG GGC AGC CTC ACC AAG CTC AAG GGC CCC TTG ACC ATG ATG GCC AGC CAC TAC AAG CAG CAC TGC CCT CCA ACC CCG GAA ACT TCC TGT GCA ACC CAG ATT ATC ACC TTT GAA AGT TTC AAA GAG AAC CTG AAG GAC TTT CTG CTT GTC ATC CCC TTT GAC TGC TGG GAG CCA GTC CAG GAG 10

6. Mikro-organismi tai nisäkässolu, joka on transformoitu tai transfektoitu 15 patenttivaatimuksen 5 mukaisella vektorilla. t t I « 34 103986