KR100448021B1

KR100448021B1 - 마우스 과립구 대식세포 콜로니 촉진인자 발현벡터 ｐＧＭ-ＣＳＦ로 형질전환된 대장균 및 상기 마우스 과립구 대식세포 콜로니 촉진인자의 대량생산방법

Info

Publication number: KR100448021B1
Application number: KR10-2001-0086575A
Authority: KR
Inventors: 오해근; 김창현; 전춘주; 배용수
Original assignee: 크레아젠 주식회사
Priority date: 2001-12-28
Filing date: 2001-12-28
Publication date: 2004-09-08
Also published as: KR20030056371A

Abstract

본 발명은 마우스 과립구 대식세포 콜로니 촉진인자 발현벡터 pGM-CSF 및 이에 의해 형질전환된 대장균BL21(DE3)/pGM-CSF에 관한 것으로, 본 발명에 의한 형질전환체는 재조합 마우스 과립구 대식세포 촉진인자를 대량 발현하며, 정제수율 및 구조회복 수율도 높고, 생화학적 활성도 우수한 효과가 있다.

Description

마우스 과립구 대식세포 콜로니 촉진인자 발현벡터 ｐＧＭ-ＣＳＦ로 형질전환된 대장균 및 상기 마우스 과립구 대식세포 콜로니 촉진인자의 대량생산방법{Transgenic Escherichia coli transformed with pGM-CSF vector expressing recombinant mouse granulocyte-macrophage colony stimulating factor and method for mass production of the recombinant protein}

본 발명은 마우스 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 발현벡터 pGM-CSF 및 이에 의해 형질전환된 대장균에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 마우스 과립구 대식세포 콜로니 촉진인자가 대장균에서 고발현되고, 정제도 용이하도록 제작된 발현벡터 pGM-CSF 및 이에 의해 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pGM-SF 그리고 상기 형질전환체를 이용하여 재조합 마우스 과립구 대식세포 콜로니-촉진인자의 제조방법에 관한 것이다.

인체의 조혈작용은 주로 골수에서 이루어지며 복잡하고 다양한 경로를 통해 여러 종류의 혈구가 만들어진다. 이러한 혈구 형성은 특정한 당단백질군에 의해 조절되는 것으로, 조혈작용의 경로와 단계에 따라 특이한 당단백질이 조절인자로 작용한다.

조혈작용에 관여하는 당단백질을 총칭하여 콜로니 촉진인자 (colony stimulating factor, CSF)라 하는데, 이들은 조혈작용의 단계와 경로에 따라 4종류로 분류된다. 조혈작용의 단계에서 과립백혈구의 형성에 관여하는 과립구 콜로니 촉진인자 (granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), 대식세포의 형성에 관여하는 대식세포 콜로니 촉진인자 (macrophage colony stimulating factor, M-CSF), 광범위한 조절작용의 경로와 단계를 조절하는 과립구 대식세포 콜로니 촉진인자 (granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 그리고 인터루킨-3 (interleukin-3, multilineage colony stimulating factor, Multi-CSF)으로 구분된다.

과립구 대식세포 콜로니 촉진인자(이하 GM-CSF라 한다)는 조혈작용 경로의 모세포의 성장을 촉진시키고 최종 혈구들의 기능을 활성화시키며, 일반적으로 골수 백혈구의 형성과 활성화에 기여할 뿐만 아니라 임파구의 활성화에도 관여한다. 이와 같이 GM-CSF는 조혈작용의 조절인자로 작용하기 때문에 백혈구 감소증, 재생불량성 빈혈, 백혈병 등의 혈구와 관련된 인간의 각종 생리적 결함에 약리 효과를 나타낼 수 있다 (Morstyn, G. 등 Tips 10. 154∼159 (1988)).

일반적으로 상기 GM-CSF를 분리, 정제하기 위하여 진핵 세포주 발현 시스템을 이용하지만 유지비용이 많이 들고 대량발현과 분리·정제의 어려움이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위해서 대장균의 재조합 기술을 이용하여 대량발현 및 생물학적인 활성을 가지는 당단백질을 분리 정제하는 기술이 도입되었다.

그러나 대장균의 재조합 기술을 이용하는 경우에도, 전사효율이 낮거나 번역효율이 낮은 등의 이유로 유전자의 발현 수율 자체가 낮아서 폴리펩티드가 적게 생기거나 폴리펩티드가 일단은 많이 생산되지만 안정한 3차 구조를 이루지 못하여 분해될 수 있는 문제와 폴리펩티드가 많이 생성되어 축적되더라도 활성이 없는 형태로 응집되어 세포내에서 봉입체(inclusion body) 상태로 존재하게 된다(Williams 등, Science, 제215권, 687페이지, 1982년 : Marston,Biochem.J., 240권, 1페이지, 1986년)는 문제가 있다.

한편, 재조합 단백질이 단백질 과립 형태로 생산될 때에는 대체로 발현수율이 높다는(경우에 따라서는 총세포단백질의 50％ 이상) 장점이 있지만, 응집이 된 단백질을 구조회복(refolding)시켜야 한다. 이때, 단백질 구조회복 조건은 단백질마다 다르며 그 수율도 예측할 수 없으며 수율이 아주 낮은 경우에는 대량 생산의 효과를 기대할 수 없다는 문제점이 있다.

또 다른 한 가지의 문제점은 재조합 단백질의 활성이 있는 형태로 숙주세포 내에서 다량으로 생성된다고 할지라도 정제단계가 너무 복잡하게 되면 최종으로 수거되는 수율이 낮게 되며 단백질 활성도 감소될 수 있고 정제비용이 많이 들어 대량 생산화(Scale-up)하는데 문제가 된다. 결국, 발현대상 단백질을 최대의 수율로 최대의 활성이 있는 형태로 생성하기 위해서는 상기한 여러 가지의 요인들이 동시에 고려되어야 하며, 이를 효율적으로 생산하기 위해서는 매우 많은 연구가 필요하다.

따라서, 본 발명자들은 마우스의 GM-CSF를 대량 생산할 수 있는 효과적인 고발현 시스템을 구축하고자 연구 노력하던 중, 유전자 조작에 의해 마우스의 GM-CSF 발현벡터인 플라스미드 pGM-CSF를 제조하고 이를 이용하여 대장균에 형질전환시켜 마우스 GM-CSF를 대량 발현시키고 정제 및 구조회복(refolding) 수율, 생화학적 활성 등을 측정하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 마우스 과립구 대식세포 콜로니-촉진인자 단백질이 대장균에서 고 발현되도록 연결된 DNA 서열을 함유하는 재조합 DNA 발현벡터 pGM-CSF를 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 상기 플라스미드 pGM-CSF에 의해 형질전환된 대장균BL21(DE3)/pGM-CSF(KCTC10123BP)을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 과립구 대식세포 콜로니-촉진인자 단백질을 유전자 조작에 의해 형질전환체로부터 제조하는 방법에 있어서, 상기 BL21 (DE3)/pGM-CSF(KCTC10123BP)를 배양시키고, 배양물로부터 과립구 대식세포 콜로니-자극인자 단백질을 회수하여 과립구 대식세포 콜로니-촉진인자를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

도 1은 마우스 비장세포로부터 RT-PCR로 증폭된 rmGM-CSF를 도시한 것이다.

M : 100bp ladder

1∼4 레인 : rmGM-CSF의 RT-PCR 증폭 산물

도 2는 pTAT-HA 발현벡터의 개열지도를 도시한 것이다.

도 3은 본 발명의 pGM-CSF 제조과정을 도시한 개략도이다.

도 4는 본 발명의 pGM-CSF의 개열지도를 도시한 것이다.

도 5는 pGM-CSF 발현 벡터에 rmGM-CSF 유전자가 정상적으로 도입되었는 지 확인하기 위하여 SDS-PAGE 한 결과를 도시한 것이다.

M : 100bp ladder

1∼3 레인 : pGM-CSF 후보군

도 6은 마우스 GM-CSF와 rmGM-CSF의 염기서열의 상동성을 분석한 결과를 도시한 것이다.

도 7은 대장균 BL21 (DE3)에서 LB 배지에서 rmGM-CSF의 발현 여부를 확인한전기영동 사진이다.

M : Prestain marker (NEB)

1 : rmGM-CSF (0.5mM IPTG 유도)

2 : rmGM-CSF (0.5mM IPTG 유도하지 않음)

도 8은 형질전환 BL21(DE3)/pGM-CSF가 발현하는 rmGM-CSF를 정제한 결과이다.

M : Prestain marker (NEB)

1 : 세포 파쇄 후 수용성 분획

2 : 세포 파쇄 후 불용성 분획

3 : 용출 분획 #A (5ml)

4 : 용출 분획 #B (5ml)

5 : 용출 분획 #C (5ml)

도 9는 구조회복 및 농축된 rmGM-CSF의 전기영동 사진이다.

M : Prestain marker (NEB)

1 : 구조회복 및 농축된 rmGM-CSF

도 10은 rmGM-CSF의 생화학적 활성 측정을 위한 MTT 분석 결과를 도시한 것이다.

1 : high glucose DMEM-10 (음성대조구)

2 : high DMEM-10 50% + WEHI-3 세포주 배양액 50% (양성대조구)

3 : high glucose DMEM-10 + rmGM-CSF (10ng/ml)

4 : high glucose DMEM-10 + rmGM-CSF (20ng/ml)

도 11은 FDC-P1 세포주의 세포수 변화에 의한 rmGM-CSF의 활성을 측정한 결과를 도시한 것이다.

배지 : high glucose DMEM-10

WEHI : high DMEM-10 50% + WEHI-3 세포주 배양액 50%

GM-CSF 10 : high glucose DMEM-10 + rmGM-CSF (10ng/ml)

GM-CSF 20 : high glucose DMEM-10 + rmGM-CSF (20ng/ml)

도 12는 마우스 골수세포를 추출하여 WEHI-3 세포주 배양액 (GM-CSF source)과 본 발명의 rmGM-CSF를 배지에 첨가하여 수지상 세포로 분화를 유도한 후 세포표면항원 발현을 FACS로 분석한 결과를 도시한 것이다.

본 발명은 마우스 과립구 대식세포 콜로니-촉진인자 단백질이 대장균에서 고 발현되도록 연결된 DNA 서열을 함유하는 재조합 DNA 발현벡터 pGM-CSF를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 플라스미드 pGM-CSF에 의해 형질전환된 대장균BL21(DE3)/pGM-CSF(KCTC10123BP)를 제공한다.

또한 본 발명은 과립구 대식세포 콜로니-촉진인자 단백질을 유전자 조작에 의해 형질전환체로부터 제조하는 방법에 있어서, 상기 BL21 (DE3)/pGM-CSF(KCTC10123BP)를 배양시키고, 배양물로부터 과립구 대식세포 콜로니-촉진인자 단백질을 회수하여 과립구 대식세포 콜로니-촉진인자 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 마우스의 비장세포에서 RNA를 추출하여 재조합 마우스 과립구 대식세포 콜로니 촉진인자(이하 rmGM-CSF라 한다)를 증폭하기 위한 주형으로 사용하고 마우스 GM-CSF (GeneBank Accession Number : X02333)를 참고하여 합성된 서열번호 1과 2의 프라이머를 사용하였으며, pfu DNA 중합효소를 이용하여 RT-PCR로 증폭된 rmGM-CSF와 Washington 대학의 S. Dowdey 박사로부터 분양받은 pTAT-HA 발현 벡터를 제한효소 BamHI/XhoI로 각각 절단한 후 라이게이션(T4 DNA ligase, NEB)하여 새로운 재조합 DNA 발현벡터를 제조하는 것이다.

상기와 같이 재조합된 DNA 발현벡터를 대장균 균주에 형질전환시키고, rmGM-CSF 활성을 나타내는 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리하여 이를 pGM-CSF라 명명하였다.

상기 신규한 플라스미드 pGM-CSF에 의해 코드되는 rmGM-CSF를 발현시키기 위해 플라스미드를 대장균에 형질전환시켜 BL21 (DE3)/pGM-CSF로 명명하였으며, 이를 대한민국 균주기탁 기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 내 유전자은행에 2001년 11월 27일에 기탁하고 수탁번호 KCTC10123BP를 부여받았다.

상기 형질 전환된 대장균을 유전자 발현 및 유도에 적절한 LB 배지에 배양한 다음 0.5mM IPTG를 가하지 않아도 rmGM-CSF가 고 발현이 되는 특징이 있으며, 정제도 용이하다.

또한 정제된 rmGM-CSF를 구조회복을 실시한 결과 구조회복 수율이 92%가 되어 구조회복 수율이 높은 특징이 있다.

그리고, rmGM-CSF의 생화학적 활성을 측정한 결과, WEHI-3 세포주 배양액에서 얻은 양성 대조군에 비해서는 활성이 약 2/3 정도이나 음성 대조군인 정상 배지만 첨가한 경우에 비해서는 현저한 활성을 보여주어 구조가 회복된 본 발명에서 생산된 재조합 단백질인 rmGM-CSF는 생화학적 활성이 있는 것으로 나타났다.

또한 rmGM-CSF를 이용한 골수세포의 수지상 세포로의 분화 유도 실험에서 WEHI 세포주 배양액에서 얻은 GM-CSF와 본 발명에 의해 생산된 재조합 단백질 rmGM-CSF를 이용하여 수지상 세포로의 분화를 유도한 결과, 본 발명에 의해 생산된 재조합 단백질 rmGM-CSF가 WEHI-3 세포주가 발현하는 GM-CSF와 유사한 생화학적 활성을 나타내며 수지상 세포로의 분화과정에 효과적으로 작용함을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명에 의한 신규한 플라스미드 pGM-CSF 및 이에 의해 형질전환된대장균 BL21(DE3)/pGM-CSF(KCTC10123BP)은 재조합 마우스 과립구 대식세포 촉진인자를 대량 발현하며, 정제가 용이하며, 구조회복 수율도 높고, 생화학적 활성도 우수하다는 장점이 있다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 마우스 GM-CSF 유전자 및 이를 포함하는 재조합 벡터의 구축

Balb/c 마우스((주)대한바이오링크)로부터 비장을 무균적으로 분리하고 적혈구 분해 버퍼 (RBC lysis buffer, 9.8 g/ℓ NH₄Cl, 1 g/ℓ KHCO₃, 0.1 mM EDTA, pH 7.4)로 적혈구를 제거한다. PBS(phosphate buffered saline)으로 두 번 세척하고 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 포함된 RPMI1640 배지 (Gibco BRL)로 재현탁 한 후 37℃ CO₂배양기에서 배양하였다.

Balb/c 마우스 비장세포 (1.3×10⁷cell/well in 6-well plate)에 5㎍/ml의 콘카나발린 A (concanavalin A, Con-A)를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 트리졸(Trizol, Gibco BRL)로 RNA를 추출하고 rmGM-CSF를 증폭하기 위한 주형(template)으로 사용하였다. 첫 번째 cDNA 합성은 슈퍼스크립트(SuperScript)시스템 (Gibco BRL)으로 Oligo d(T)를 프라이머로 하여 합성하였다. PCR 증폭은 하기 표 1의 프라이머와 pfu DNA 중합효소 (Solgent 사, 한국)로 하였다.

RT-PCR을 위한 rmGM-CSF 프라이머

프라이머	염기서열	비고
GM-CSF forward	ggg GGA TCC gca ccc acc cgc tca ccc atc(서열번호 1)	BamHI
GM-CSF reverse	ggg CTC GAG tca ttt ttg gac tgg ttt ttt(서열번호 2)	XhoI

rmGM-CSF 프라이머는 마우스 GM-CSF (GeneBank Accession Number : X02333)를 참고하여 합성하였으며, 17개 시그날 펩타이드 (MWLQN LLFLG IVVYS LS)는 소포체로 트랜스포트(transportation)되는데 필요하므로 원핵생물의 시스템에서 필요가 없으므로 이를 제외하였다. 상기와 같은 조건으로 RT-PCR 증폭 결과 약 400bp의 PCR 산물을 얻을 수 있었다(도 1참조).

워싱톤대학의 S.Dowdy 박사로부터 분양받은 pTAT-HA 발현 벡터(도 2참조)[PNAS 95, 10699-10704 (1997), Nature medicine 4, 1449-1452 (1998), Immunity 8, 57-65 (1998)] 와 PCR로 증폭된 rmGM-CSF를 제한효소 BamHI/XhoI로 각각 절단한 후 16℃에서 18시간 동안 라이게이션 (T4 DNA ligase, NEB) 하여 재조합 플라스미드를 제작하였다(도 3 및 도 4 참조). 재조합 플라스미드를E. coliJM109 (recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thi△(lac-proAB) F'[traD36 proAB+ lacIq lacZ △M15])로 형질전환(Inoue H., et al, Gene 96, 23-28 (1990))하여 LB·Amp (50㎍/ml) 배지에서 18시간 배양하여 형성된 콜로니 중 rmGM-CSF가 정상적으로 도입된 클론을 PCR 증폭으로 확인(도 5참조)한 결과 2번, 3번 레인에 클로닝 되었음이 확인되어 이를 선별하여 증식시키고 재조합 플라스미드 DNA를 추출하여, 이를 pGM-CSF라 명명하였다.

실시예 2 : pGM-CSF 의 염기서열 분석 및 상동성 비교

도 4에 도시된 개열지도를 가지는 본 발명에 의한 재조합 플라스미드 pGM-CSF의 도입부위 염기서열 분석은 SolGent사에 의뢰하였다. 본 발명에 의한 pGM-CSF의 도입부위의 염기서열과 NIH Blast에 올라있는 마우스 GM-CSF (GeneBank Accession Number : X02333) 서열을 SolGent사에 의뢰하여 분석한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 374/375 (99%)의 유사성을 보였고, 아미노산 서열은 100% 일치하였다.

실시예 3 : 형질전환체 E. coli BL21(DE3)/pGM-CSF의 제조 및 정제

pGM-CSF 재조합 플라스미드로E. coliBL21 (DE3)(Novagen)를 변형된 이노우에 방법으로 형질전환(Inoue H., et al, Gene 96, 23-28 (1990))하여 이를E. coliBL21 (DE3)/pGM-CSF로 명명하였다. 그리고 이를 대한민국 균주기탁 기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 내 유전자은행에 2001년 11월 27일에 기탁하고 수탁번호 KCTC10123BP를 부여받았다.

상기 형질전환된E. coliBL21 (DE3)/pGM-CSF를 500ml의 LB 배지에서 18시간동안 배양하였다. 대장균 증식이 OD₆₀₀=0.5에서 0.5mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalacto pyranoside)로 발현을 유도한 실험군과 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalacto pyranoside)로 유도하지 않은 실험군에서 각각 배양하여 SDS-PAGE를 하여 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, IPTG로 유도한 실험군(도 7의 1 레인)보다 IPTG로 유도하지 않은 실험군(도 7의 2 레인)에서 분자량이 약 16kDa인 rmGM-CSF가 더 많이 발현되었다. 그러므로 본 발명에 의한 pGM-CSF 발현 플라스미드는 LB 배지(1리터당 10g 트립톤 펩톤, 5g 효모추출물, 10g 염화나트륨)에 존재하는 미량의 유당(lactose)에 의해 목적 유전자가 대량 발현되는 특징이 있는 것으로 나타났다. 즉 본원발명의 벡터는 일반적으로 발현유도제로 사용되는 고가의 IPTG를 첨가하지 않아도 목적 유전자가 대량 발현되는 장점이 있다.

LB 배지에서 배양된 형질전환체를 수확하여 라이소자임(lysozyme) (1mg/ml)으로 얼음에서 30분 동안 반응한 다음, 5분 간격으로 5번 소니케이션(sonication) (40% duty, 6 output)하여 세포를 파쇄 하였다. 15,000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 수용성 (soluble)과 불용성 (insoluble) 분획을 각각 SDS-PAGE 전기영동 분석하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, rmGM-CSF(약 16.5 kDa)는 불용성 분획에 존재함이 확인되었다. 불용성 분획을 8M 우레아 완충액 (8M Urea, 100mM NaH₂PO₄, 10mM Tris, pH 8.0)에 재현탁 하였다. 미리 8M 우레아 완충액으로 평형 (equilibrium)이 수행된 Ni⁺-NTA 칼럼에 시료를 로딩 (loading)하고 8M 우레아 완충액으로 수회 세척한후 다시 pH 6.4의 우레아 완충액으로 세척하였다. 세척 후 pH 4.5의 우레아 완충액으로 용출하여 3개의 분획을 얻었다 (도 8의 3∼5번 레인). 용출 분획은 3번 레인의 A 분획과 4번 레인의 B 분획 (각각 5ml)에서만 검출되었으며, 5번 레인에서는 검출되지 않았다(도 8참조).

실시예 4 : rmGM-CSF의 구조회복(refolding) 및 농축

변성 (denaturation)된 rmGM-CSF를 활성을 가진 단백질로 바꾸기 위하여 구조회복을 실시하였다. 상기 실시예 3에서 불용성 분획을 재현탁하여 용출된 분획인 도 8의 3번 레인의 A 분획과 4번 레인의 B 분획 (각각 5ml)을 투석막에 넣고 구조회복 완충액 (50mM Tris, 50mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.4)에 6M 우레아를 첨가하였다. 우레아 완충액의 농도를 1/10씩 단계적으로 희석하여 최종적으로 우레아 농도가 제거될 때까지 구조회복을 실시하였다. 모든 단계는 4℃에서 실시되었고, 구조가 회복된 rmGM-CSF는 50mM Tris, 50mM NaCl, pH 7.4 완충액에 재현탁하여 SDS-PAGE 전기영동 분석을 해서 그 결과를 도 9에 나타내었다. 구조회복(refolding)된 rmGM-CSF를 CentriPrep(10K)으로 농축하여 브래포드 분석법(Bradford assay)으로 단백질을 정량하였다. 그 결과 최종 농도 0.5㎍/㎕의 rmGM-CSF를 2.2 ml 얻었으며 이로 보아 구조회복 과정에서 수율이 92%로 매우 높음을 알 수 있다 (변성된 rmGM-CSF 1.2mg으로 구조회복을 실시한 결과 1.1mg의 구조 회복 rmGM-CSF를 얻음).

실시예 5 : rmGM-CSF의 생화학적 활성 측정

rmGM-CSF의 생확학적 활성을 측정하기 위하여 GM-CSF 생산 세포주인 WEHI-3 세포주(ACTC)와 GM-CSF 의존 세포주인 FDC-P1 세포주(ACTC)를 사용하였다. 일반적으로 FDC-P1 세포주는 WEHI-3 세포주 배양액 50%와 high glucose DMEM-10(Gibco BRL) 50%을 혼합하여 2일 동안 배양하였다. 본 실험에서는 FDC-P1 세포주를 배양하는 동안 세포 분화를 분석하여 rmGM-CSF의 생화학적 활성을 측정하였다.

rmGM-CSF의 생화학적 활성을 세포 분화 분석법으로 측정하기 위하여 FDC-P1 세포주를 96-well plate에 1×10⁵cell/well을 배양하였다. high glucose DMEM-10 배지를 음성대조군으로 사용하였고, WEHI-3 세포주 배양액 50%와 high glucose DMEM-10 50%를 혼합하한 것은 양성 대조군으로 사용하였다. 각각을 44시간 배양한 후 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액 10㎕ (7.5mg/ml)을 각 well에 첨가한 후 4시간 더 배양하였다(MTT 분석법은 MTT가 살아있는 모든 세포 안에 존재하는 활성 미토콘드리아 디하이드로게네이즈 (dehydrogenase)를 푸른색의 포마젠 (blue formazan)으로 전환시켜 나타나는 화학변화로 블루 포마젠의 농도와 세포의 생존율이 비례하함을 이용한 측정법임). 각 well로부터 30㎕ 정도만 남기고 모두 제거한 후 DMSO 150㎕를 첨가한 다음 실온에서 15분 동안 진탕하여 ELISA reader로 570nm에서 흡광도를 측정하였다 (도 10참조).

도 10에 나타낸 바와 같이 본 발명에서 생산된 재조합 단백질인 rmGM-CSF는 WEHI-3 세포주 배양액에서 얻은 양성 대조군에 비해서는 활성이 약 2/3 정도이나음성 대조군인 정상 배지만 첨가한 경우에 비해서는 현저한 활성을 보여주고 있다. 이로 보아 구조가 회복된 본 발명에서 생산된 재조합 단백질인 rmGM-CSF는 생화학적 활성이 있는 것으로 나타났다.

한편 보다 상세한 방법으로 FDC-P1 세포주의 세포수 변화를 측정하였다. 상기 도 10의 방법으로 24시간, 48시간 배양하여 증식된 세포수를 헤마사이토메터(Haemacytometer)(Superior)로 측정하여 그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 세포수 변화에 의한 본 발명에서 생산된 재조합 단백질인 rmGM-CSF의 활성은 대조군과 거의 동일한 결과가 나타났을 뿐만 아니라 보다 적은 농도 (10mg/ml)에서도 동일한 활성을 보였다.

실시예 6 : rmGM-CSF를 이용한 골수세포 유래의 수지상 세포(BM-DC)분화 유도

마우스를 마취하여 안락사 시킨 후, 70% 알코올로 전신을 소독하고 좌우의 대퇴골 및 경골 부분을 무균적으로 축출하고 주위의 근조직을 제거한 후 2ml의 RPMI-1640 배지(Gibco BRL)가 든 35 mm 배양 디쉬에 모았다. 양측 골단부를 절단하고 1 ml의 PRMI-1640으로 채운 주사기를 골단부에 삽입 주사하여 골수세포를 용기 안으로 추출하였다. 세포 메쉬 (mess)로 여과한 세포를 적혈구 용해 버퍼로 적혈구를 제거하고 단세포 부유액을 얻었다. PRMI-1640 + 10% FBS(Fetal bovine serum)로 희석하여 세포농도를 2X10⁶cell/ml/well (in 6 well plate)이 되게 배양 접시에 분주하고 상기 사이토카인이 첨가된 배지에서 배양하였다. 본 발명에 의하여 생산된rmGM-CSF (20ng/ml)가 첨가된 배지에서 배양하면서 이틀마다 동일한 사이토카인이 첨가된 새 배지로 갈아주면서 7일간 배양한 후, FACS로 BM-DC의 분화 정도를 측정하였다(도 12 참조). FACS 분석은 항체(FITC-conjugate anti-mouse I-A/I-E (ClassII), FITC-conjugate anti-mouse CDllb, PE-conjugate anti-mouse CD11c, FITC-conjugate anti-mouse CD54 (ICAM-1), FITC-conjugate anti-mouse CD86)로 20 분간 염색하고 FACS buffer (5% BSA, 1% Sodium azide in PBS)로 세척하여 수행하였다.

rmGM-CSF를 이용한 골수세포의 수지상 세포로의 분화 유도 실험에서 WEHI 세포주 배양액에서 얻은 GM-CSF와 본 발명에 의해 생산된 재조합 단백질 rmGM-CSF를 이용하여 수지상 세포로의 분화를 유도한 결과, 본 발명에 의해 생산된 재조합 단백질 rmGM-CSF가 WEHI-3 세포주가 발현하는 GM-CSF와 유사한 생화학적 활성을 나타나며 수지상 세포로의 분화과정에 효과적으로 작용함을 확인하였다(도 12참조).

상기 실시예에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 마우스 과립구 대식세포 콜로니 촉진인자 발현벡터 pGM-CSF 및 이에 의해 형질전환된 대장균BL21(DE3)/pGM-CSF(KCTC10123BP)는 재조합 마우스 과립구 대식세포 촉진인자를 대량 발현하며, 정제가 용이하며 구조회복 수율도 높고, 생화학적 활성도 우수한 장점이 있다.

<110> creagene co.ltd <120> Vector for expression of mouse granulocyte-macrophage colony stimulating factor and a transformant transformed with the vector <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplifying murine mRNA for granulocyte macrophage colony stimulating factor <400> 1 gggggatccg cacccacccg ctcacccatc 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplifying murine mRNA for granulocyte-macrophage colony stimulating factor <400> 2 gggctcgagt catttttgga ctggtttttt 30

Claims

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마우스 과립구 대식세포 촉진인자를 과발현하며, 도 4의 개열지도를 갖는 재조합 벡터 pGM-CSF로 형질전환됨을 특징으로 하는 대장균 형질전환체 BL21 (DE3)/pGM-CSF KCTC 10123BP.
마우스 과립구 대식세포 촉진인자의 생산방법에 있어서,

IPTG를 첨가하지 않은 배양배지에서 제2항 기재의 대장균 형질전환체 BL21 (DE3)/pGM-CSF KCTC 10123BP를 배양하고, 상기 균주의 배양액으로부터 과립구 대식세포 콜로니-촉진인자 단백질을 회수하여 구조회복(refolding)을 실시하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 마우스 과립구 대식세포 콜로니 촉진인자의 대량생산방법.