NO318435B1 - Isolert DNA-sekvens fra IL-15, isolert DNA-sekvens som koder for et forloperpolypeptid til det biologisk aktive IL-15 polypeptid, rekombinant ekspresjonsvektor, vertcelle, fremgangsmate for fremstilling av et IL-15 polypeptid, isolert biologisk aktivt IL-15 polypeptidpreparat, farmasoytisk preparat for stimmulering av proliferasjon av T-lymfocytter, samt anvendelse av et polypeptid ifolge oppfinnelsen for fremstilling av et middel for behandling eller forebyggelse av spesifikt angitte sykdommer. - Google Patents

Abstract

Det er beskrevet et pattedyrepitelavledet T-cellefaktorpolypeptid ("ETT") her henvist til som interleukin-15 ("IL-15"), derivater derav, DNA-sekvenser, rekombinante DNA-molekyler og transformerte vertsceller som produserer IL-15-polypeptider. Nærmere bestemt tilveiebringer denne oppfinnelsen isolerte pattedyr-IL-15-polypeptider og derivater derav som regulerer hendelser ved T-lymfocyttproliferasjon.

Description

Oppfinnelsens område

Isolert DNA-sekvens fra IL-15, isolert DNA-sekvens som koder for et forløperpolypeptid til det biologisk aktive IL-15-polypeptid, rekombinant ekspresjonsvektor, vertscelle, fremgangsmåte for fremstilling av et IL-15-polypeptid, isolert,

biologisk aktivt IL-15-polypeptidpreparat, farmasøytisk preparat for stimulering av proliferasjon av T-lymfocytter, samt anvendelse av et polypeptid ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et middel forbehandling eller forebyggelse av spesifikt angitte sykdommer.

Oppfinnelsens bakgrunn

T-celler, også kjent som T-lymfocytter, er en klasse immuneffektorceller. I perifert vev kan T-celler deles i to generelle grupper basert på deres gjensidig utelukkende ekspresjon av CD4- og CD8-celleoverflatemolekyler. Typiske CD8<+->T-celler blir cytotoksiske T-celler etter aktivering og ødeleg-

ger antigenbærende målceller gjennom direkte cellekontakt. Aktiverte CD4<*->T-celler gir generelt positive signaler, f.eks. "hjelper"-funksjon for B-celler (det gjør det mulig for B-

celler å differensiere til antistoffdannende celler), og kal-

les derfor hjelper-T-celler.

Seks T-cellevekstfaktorer er tidligere blitt identifisert. De seks er: interleukin (IL) -2, -4, -7, -9, -12 og kofaktor IL-10. lL-2's åpne leseramme koder for et 15 kDa stort 153 aminosyrers polypeptid. IL-2 fremstilles av visse T-celler og av store, granulære lymfocytter. IL-2 ble opprinne-

lig oppdaget som en faktor som ville understøtte langvarig vekst av humane T-celler. I tillegg til T-cellevekst omfatter dets virkninger aktivering av naturlige dreperceller (NK-

celler) og lymfocyttaktiverte dreperceller (LAK-celler), samt cytotoksiske T-celler ("CTL"), makrofager og fremming av B-cellevekst.

IL-4 er et 15-20 kDa stort protein fremstilt av aktiverte T-celler, benmargsstromaceller og masteeller. Den åpne IL-4-ieseramme koder for 140 aminosyrers murint IL-4 og 153 aminosyrers humant IL-4. Opprinnelig ble IL-4 definert som en faktor som aktiverte B-cellevekst og -differensiering. Dens virkninger omfatter også makrofagaktivering og induksjon av MHC-molekyler av klasse II, vekst av noen T-celle- og mastcel-lelinjer, proliferasjon og CTL-generering fra T-celler fra humant, perifert blod, økning av immunglobulinproduksjon av B-celler og en kofaktor i vekst av hematopoeseceller fra stam-celler. IL-4 spiller en viktig rolle i nedreguleringen av IL-2-induserte NK-celle- og LAK-celleaktiviteter. Humant IL-4 er ikke aktivt på murine celler.

IL-7 er et 20-25 kDa stort, 177 aminosyrers polypeptid fremstilt av benmarg og thymusstromaceller. Selv om det opprinnelig ble beskrevet som en pre-B-cellevekstfaktor, understøtter IL-7 veksten av pro-B-celler samt pre-B-celler. IL-7 induserer også proliferasjon og CTL-generering fra T-celler fra humant, perifert blod, IL-2-reseptorekspresjon, IL-2-produksjon og -proliferasjon i CD4<*-> og CD8<+->celler. IL-7 gir også synergi med IL-2 og øker thymisk T-celleproliferasjon og induserer proliferasjon av CD4"- og CD8"-thymocytter. IL-9 er et 30-40 kDa stort, 144 aminosyrers polypeptid fremstilt av aktiverte T-lymfocytter. IL-9 ble først identifisert som en hjelper-T-cellevekstfaktor. IL-9 stimulerer erytroid utvikling og øker IL-3-indusert proliferasjon i ben-margsavledede mastceller. Det modulerer også IgE- og igG-produksjon av B-celler i nærvær av IL-4. Murint IL-9 er aktivt på menneskeceller, mens humant IL-9 ikke virker på murine celler.

Humant IL-10 er et 16-20 kDa stort, 178 aminosyrers polypeptid fremstilt av makrofager og TH2, men ikke av TH1-T-hjelperceller. På samme måte som IL-2, IL-4 og IL-7 har IL-10 flere forskjellige biologiske aktiviteter. IL-10 ble oppdaget på grunnlag av dets evne til å inhibere cytokinproduksjon av aktiverte T-celler. Både humant og murint IL-10 er vekststimu-latorkofaktorer for thymocytter og T-celler i kombinasjon med IL-7 eller IL-2 pluss IL-4. IL-10 stimulerer mastcellelevedyk-tighet og -vekst i kombinasjon med IL-4 eller IL-3 pluss IL-4. IL-10 induserer også IgG-utskillelsen og ekspresjonen av MHC-molekyler av klasse II på B-celler og øker deres levedyktighet i kultur. IL-12 er konstitutivt eller induseres av forbolester og kalsiumionofor - i lymfoblastoidcellelinjer og fremstilles ved hjelp av LPS-stimulerte makrofager. IL-12 har en molekylvekt på 70 kDa og en uvanlig heterodimerstruktur, idet det er dannet av to disulfidbundne glykoproteiner. Den største av de to glykoproteinunderenhetene er et 40 kDa stort 328 aminosyrers polypeptid. Den mindre glykoproteinunderenheten er et 35 kDa stort 253 aminosyrers polypeptid. Begge glykoproteinunderenhetene er nødvendige for bioaktivitet. IL-12 induserer proliferasjonen av aktiverte T-celler i både CD4<+-> og CD8<+->undersettene, uavhengig av IL-2. IL-12 aktiverer også NK-cel-leformidlet cytotoksisitet og gir synergi med IL-2, hvorved det frembringes LAK-celler. I motsetning til IL-2 og IL-7, men på samme måte som IL-4, forårsaker IL-12 liten eller ingen proliferasjon av gjenværende mononukleære celler i perifert blod.

O ppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter isolert DNA-sekvens, kjennetegnet ved at sekvensen omfatter,

(a) DNA-sekvenser som koder for polypeptidene ifølge sekvensen, hvor aminosyre 52 er Leu eller His, aminosyre 57 er Ala eller Thr, aminosyre 58 er Ser eller Asp, aminosyre 73 er Ser eller Ile og aminosyre 80 er Val eller Ile, (b) varianter av sekvensene i (a) som koder for et protein med tilsvarende biologisk aktivitet, og (c) DNA-sekvenser sin påvisbart hybridiserer til DNA-sekvensene ifølge (a) eller (b), eller deres komplementære tråder, under svært strenge betingelser omfattende hybridisering og vask etter hybridisering ved 55 °C eller høyere og ved en saltkonsentrasjon på 0,5 x SSC eller lavere, og som etter ekspresjon koder for et polypeptid med tilsvarende biologisk aktivitet som sekvensene ifølge SEKV. ID NR. 3 eller SEKV. ID NR. 6.

Oppfinnelsen omfatter også isolert DNA-sekvens som koder for et forløperpolypeptid til det biologisk aktive IL-15-polypeptid, kjennetegnet ved at DNA-sekvensen er valgt fra gruppen bestående av: en DNA-sekvens som etter ekspresjon koder for polypeptidet definert ved SEKV. ID NR. 2, og

en DNA-sekvens som etter ekspresjon koder for polypeptid definert ved

SEKV. ID NR. 5.

En ny T-cellevekstfaktor, heretter henvist til som "interleukin-15" ("IL-15"), er blitt isolert og renset. En cDNA-sekvens som koder for et ape-IL-15-polypeptid, ble isolert og har et 483 bp stort 5'-ikke-kodende område forut for en åpen leseramme med 489 bp og et 303 bp stort 3'-ikke-kodende område. En cDNA-sekvens som koder for et humant IL-15-polypeptid, har et 316 bp stort 5'-ikke-kodende område som går forut for en åpen leseramme med 489 bp og et 397 bp stort 31 - ikke-kodende område. Nukleotidsekvensene og de utledede aminosyresekvenser for åpne leser ammer fra ape og menneske er beskrevet i SEKV.ID NR. 1 og 4. De åpne leserammene både fra ape og menneske koder for et forløperpolypeptid (SEKV.ID NR. 2 og 5). Forløperpolypeptidene omfatter hver en 48 aminosyrers ledersekvens og en sekvens som koder for modne ape- eller menneske-IL-15-polypeptider. De aktive ape- og menneske-IL-15-polypeptider er beskrevet i henholdsvis SEKV.ID NR. 3 og 6.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre andre IL-15-polypeptider som kodes for av nukleotidsekvenser som hybridiserer under middels til svært sterke betingelser til prober definert ved nukleotidene 145-489 i SEKV.ID NR. 1 eller 4, eller til deres komplementære DNA- eller RNA-tråder, og som etter ekspresjon koder for polypeptider som stimulerer T-lymfocytter til å proliferere og differensiere. Oppfinnelsen omfatter videre nukleotidsekvenser som, på grunn av den genetiske kodes degenerasjon, koder for IL-15-polypeptider kodet for av nukleotidsekvensene beskrevet ovenfor og sekvenser som er komplementære til dem.

Enda ytterligere sørger oppfinnelsen for rekombinante DNA-molekyler som omfatter nukleotidsekvensene ovenfor, f.eks. ekspresjonsvektorer eller plasmider og transformerte vertsceller som kan anvendes ved fremstilling av IL-15-polypeptider, og fremgangsmåter for fremstilling av rekombinante IL-15-polypeptider under anvendelse av slike molekyler.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser nukleotidsekvensen og den utledede aminosyresekvens til den aktive apeart av IL-15. Figur 2 viser nukleotidsekvensen og den utledede aminosyresekvens til den aktive humanart av IL-15. Figur 3 viser et rense- og proteinsekvenseringsskjerna som kan anvendes ved isolering av IL-15-polypeptider. Figur 4 viser homologien mellom nukleotidsekvenser som koder for human- og apearter av IL-15. Humansekvensen er vist over apesekvensen. Figur 5 viser homologien mellom aminosyresekvenser til human- og apeartene av IL-15. Humansekvensen er vist over apesekvensen. I begge artene spaltes ledersekvensen (aminosyrene 1-48) fra forløperpolypeptidet, hvorved det modne polypeptid dannes (aminosyrene 49-162). Figur 6 viser den biologiske aktivitet av rekombinant IL-15, IL-2 og IL-4 in vltro under anvendelse av CTLL-2-celler. Den proliferatlve respons ln vltro av CTLL-2-celler ble målt ved økende konsentrasjoner av rekombinant cytokin (uttrykt som ng/ml). Dataene er uttrykt som cpm av <3>H-tymidin inkorporert (X IO"<3>). Figur 7 viser induksjonen av lytisk CTL-aktivitet ved hjelp av rIL-15 og IL-2. Antigenspesifikke, cytolytiske T-lymfocytter (CTL) ble frembrakt in vltro. Enkjernede celler fra humant, perifert blod (PBL) fra én donor ble stimulert med bestrålt PBL fra en allogen donor i kulturer som inneholder forskjellige konsentrasjoner av enten IL-2 eller humant rIL-15. Kulturer ble analysert med hensyn på cytolytisk aktivitet mot <51>Cr-merkede mål avledet fra den opprinnelige stimulerende donor. Lytiske enheter ble beregnet som inverstallet av den fraksjon av kulturen som ga respons, som er påkrevet for å frembringe 50% av den maksimale, spesifikke <51>Cr-frigjørelse. Figur 8 viser induksjonen av LAK-cellers lytiske aktivitet ved hjelp av rIL-15 og IL-2. Lymfokinaktiverte dreperceller (LAK) ble frembrakt in vi tro. Humant PBL ble stimulert med bestrålt, autologt PBL,' og cytolytisk aktivitet ble målt mot Daudi-lymfoblastoidcellelinjen. Lytiske enheter ble beregnet som det omvendte tall av den fraksjon av kulturen som ga respons, som er påkrevet for å frembringe 30% av den maksimale, spesifikke 51Cr-frigjørelse. Figur 9 viser induksjonen av NK-cellelytisk aktivitet ved hjelp av rIL-15 og IL-2. Naturlige dreperceller (NK-celler) ble isolert fra helt, human PBL isolert ved hjelp av antistoffaffinitet mot paramagnetiske mikrosfærer under anvendelse av monoklonale antistoffer mot CD16. De rensede NK-celler ble dyrket i 3 dager, og cytolytisk aktivitet ble målt mot K562-erytroleukemicellelinjen.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

"Interleukin-15" eller "IL-15" henviser til pattedyr-polypeptider som er strukturelt like med polypeptidene beskrevet her, og som stimulerer T-lymfocytter til å proliferere og differensiere. IL-15 kan skjelnes fra IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-10 og IL-12 i struktur og cellulær opprinnelse (tabell

1). Hos primater produseres IL-15-polypeptid til å begynne med av epitelceller som et 162 aminosyrers forløper-IL-15-polypeptid. Denne forløperen inneholder en 48 aminosyrers ledersekvens som fjernes fra forløperpolypeptidet slik at det modne polypeptid dannes. Det modne IL-15-polypeptid er i stand til å signalisere proliferasjon og/eller differensiering av for-løper- eller modne T-celler. Proteinet kan derfor anvendes til å fremme langvarig dyrking in vitro av T-lymfocytter og T-cellelinjer.

"sIL-15" henviser til en apeart av IL-15. "hIL-15" henviser til en humanart av IL-15. "rIL-15" henviser til rekombinant IL-15. Både renset sIL-15 og rIL-15 vil stimulere proliferasjon av CTLL-2-celler (Gillis og Smith, Nature 268:154 (1977); ATCC TIB 214). Ved CTLL-2-proliferasjonsana-lysene induserte supernatanter av celler transfektert med rekombinant uttrykt forløper og fusjoner i ramme av modne former av sIL-15, CTLL-2-celleproliferasjon. For andre analyser ble det isolert T-celler fra perifert blod ("PBT") og enkjernede leukocytter fra perifert blod ("PBL") fra humant, perifert blod. Vi fant at rIL-15 stimulerte proliferasjon av PBT og PBL som på forhånd var blitt dyrket med fytohemagglu-tinin ("PHA"). rIL-15 stimulerte også proliferasjon av PHA-aktiverte CD4<+-> og CD8<*->celler. rIL-15 stimulerte proliferasjon av hvilende, humane T-celler eller hvilende, murine T-celle-kloner i nærvær av antistoffer mot anti-CD3 (T-cellereseptor). Forsøk med PHA-aktivert PBT viser at rIL-15 utøver sine vekst-stimulatoreffekter uavhengig av IL-2 ved at antistoffer mot IL-2 eller mot IL-2-reseptoren ikke inhiberer IL-15.

Uttrykkene IL-15, sIL-15 og hIL-15 inkluderer analoger eller underenheter av naturlig forekommende pattedyr-poly pep tider som kodes for av nukleinsyrer som bindes til nuk-leinsyresekvensene i figurene 1 og 2 (nukleotidene fra og med 145 til og med 489 i SEKV.ID NR. 1 og 4) under spesifiserte, strenge betingelser og som induserer proliferasjon og differensiering av T-lymfocytter, og stimulerer proliferasjon av T-cellelinjer og isolert PBT.

"Teknikk med rekombinant DNA" eller "rekombinant" henviser, slik det her er brukt, til teknikker og fremgangsmåter for fremstilling av bestemte polypeptider fra mikrobe-(f.eks. bakterie-, sopp- eller gjær-) eller pattedyrceller eller -organismer (f.eks. transgene organismer) som er blitt transformert eller transfektert med klonede eller syntetiske DNA-sekvenser for å muliggjøre biosyntese av heterologe pep-tider. Naturlig forekommende glykosyleringsmønstre vil bare bli oppnådd med pattedyrcelleekspresjonssystemer. Gjær gir et distinkt glykosyleringsmønster. Prokaryot celleekspresjon (f.eks. E. coli) vil generelt gi polypeptider uten glykosyler-

ing.

"Biologisk aktiv" betyr at et bestemt IL-15-polypeptid er i stand til å stimulere T-lymfocyttproliferasjon og/eller -differensiering. I tilfellet med sIL-15 og hIL-15 tilsvarer denne biologiske aktivitet også stimulering av proliferasjonen av murin- eller primat-, f.eks. huraan-T-cellelinjer eller PBT.

En "nuklebtidsekvens" henviser til et polynukleotid i form av et separat fragment eller som en komponent i en større DNA-konstruksjon som er blitt avledet fra DNA isolert minst én gang i hovedsakelig ren form (dvs. fri for forurensende, endo-gene materialer) og i en mengde eller konsentrasjon som mulig-gjør identifikasjon, manipulasjon og utvinning av dens kom-ponentnukleotidsekvenser ved hjelp av standard biokjemiske metoder (slik som de som er skissert i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)), slik som en kloningsvektor. Slike sekvenser tilveiebringes fortrinnsvis i form av en åpen leseramme som er uavbrutt av interne, ikke-translaterte sekvenser, eller introner, som vanligvis er til stede i eukaryote gener. Sekvenser av ikke-translatert DNA kan være til stede 5' eller 3' fra en åpen leseramme hvor den samme ikke virker inn på manipulasjon eller ekspresjon av de kodende områder.

"Rekombinant ekspresjonsvektor" henviser til et plasmid som omfatter en transkripsjonen enhet omfattende en sam-mensetning av (1) et genetisk element eller elementer som har en regulatorrolle ved genekspresjon, f.eks. promoterer eller enhancere, (2) en strukturell eller kodende sekvens som transkriberes til mRNA og translateres til et polypeptid med biologisk lL-15-aktivitet, og (3) passende transkripsjons- og tr anslås jonsinitierings- og termineringssekvenser. De forskjellige regulatorelementene som kan anvendes, er omtalt nedenunder (se teknikker med rekombinant DNA). Strukturelle elementer ment for anvendelse i gjærekspresjonssystemer, omfatter fortrinnsvis en ledersekvens som muliggjør ekstracellulær utskillelse av translatert polypeptid ved hjelp av en gjærvertscelle. Alternativt kan det rekombinante polypeptid i et bakterielt ekspresjonssystem omfattet en N-terminal met-

ioninrest. Den N-terminale metioninrest kan deretter spaltes fra det uttrykte, rekombinante polypeptid, hvorved man får et produkt som er egnet for videre rensing.

"Rekombinant, mikrobielt ekspresjonssystem" henviser til en i det vesentlige homogen monokultur av egnede verts-mikroorganismer, f .eks. bakterier, slik som E. coil, eller gjær, slik som S. cerevisiae, som har fått integrert stabilt en rekombinant transkripsjonsenhet i kromosom-DNA, eller som bærer den rekombinante transkripsjonsenhet som en komponent i et iboende plasmid. Generelt er vertsceller som utgjør et rekombinant, mikrobielt ekspresjonssystem, opphavet til en enkelt transformert stamcelle. Rekombinante, mikrobielle eks-presjonssystemer vil uttrykke heterologe polypeptider etter induksjon av regulatorelementene bundet til en strukturell nukleotidsekvens som skal uttrykkes.

Transformerte vertsceller er celler som er blitt transformert eller transfektert med en rekombinant ekspresjonsvektor. Uttrykt pattedyr-IL-15 vil være lokalisert i vertscellen og/eller utskilles i kultursupernatant, avhengig av typen av vertscellen og genkonstruksjonen som er innføyet i vertscellen.

Middels strenge hybridiseringsbetingelser refererer seg, slik de her er definert og slik de er kjent for fagfolk innen teknikken, til betingelser beskrevet f.eks. i Sambrook et al., supra, vol. 2, s. 8.46-8.49 og 9.47-9.55. Middels strenge betingelser som definert av Sambrook et al., omfatter f.eks. hybridisering over natten og etterhybridiseringsvask-inger ved 55 °C, 5 x SSC, 0,5% SDS. Svært strenge betingelser omfatter høyere hybridiseringstemperaturer og etterhybridiser-ingsvaskinger, eller lavere saltkonsentrasjoner.

IL- 15- polvpeptider

Vi har renset en apeart av IL-15 (sIL-15) og sekvensert det N-terminale peptid i modent sIL-15. Ved å anvende den N-terminale aminosyresekvens og PCR isolerte vi en cDNA som koder for sIL-15, og bestemte nukleotidsekvensen og den utledede aminosyresekvens for modent sIL-15 (figur 1), og nukleotidsekvensen og den utledede aminosyresekvens for en forløper til sIL-15-polypeptid (SEKV.ID NR. 1 og SEKV.ID NR. 2). For-løper-lL-15-polypeptidsekvens hos apearten omfatter et modent, aktivt protein (SEKV.ID NR. 3) som følger etter en 48 aminosyrers leder sekvens. Ledersekvensen er aminosyrene 1-48 i SEKV.ID NR. 2. Primat-IL-15 stimulerer proliferasjon av murine T-cellelinjer (f.eks. CTLL-2) og stimulerer proliferasjon og differensiering av humane PBT-celler.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også andre pattedyr-IL-15, inkludert menneske-lL-15, som har biologisk IL-15-aktivitet og kodes for av nukleotidsekvenser som hybridiserer under middels til svært strenge betingelser til prober definert ved SEKV.ID NR. 5. Et plasmid som inneholder en rekombinant klon av human IL-15-cDNA, ble deponert ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA ("ATCC") i overensstemmelse med Budapestkonvensjonen om internasjonal anerkjennelse av deponeringer av mikroorganismer i forbindelse med behandling av patentsaker, 19. februar 1993, under deponeringsnr. ATCC 69245. Deponeringen ble kalt "141-hETF" og omfattet en E. coli-stamme inneholdende plasmid hETF/pDC406 som inneholdt et 316 bp stort 5<1->ikke-kodende område foran en åpen leseramme med 489 bp og et 397 bp stort 31 - ikke-kodende område flankert av Sal I-adapterne vist i SEKV.ID NR. 7 og 8. Alle restriksjoner vedrørende tilgjengeligheten for allmennheten av det deponerte materiale, vil bli ugjenkal-lelig fjernet etter bevilgningen av et patent.

Aminosyrestrukturen til IL-15-polypeptider som her er beskrevet, kan modifiseres ved å danne kovalente eller aggregatkonjugater med andre kjemiske rester, slik som glykosyl-grupper, lipider, fosfat, acetylgrupper og lignende, ved å . danne aminosyresekvensmutanter. Kovalente derivater av pattedyr-IL-15 fremstilles ved å binde bestemte, funksjonelle grupper til pattedyr-IL-15-aminosyresidekjeder eller til N-enden eller C-enden av et pattedyr-IL-15-polypeptid. Andre derivater av pattedyr-IL-15 innenfor omfanget av denne oppfinnelsen omfatter kovalente eller aggregatkonjugater av pattedyr-lL-15 eller dets fragmenter med andre proteiner eller polypeptider, slik som ved syntese i rekombinant kultur som N-terminale eller C-terminale fusjoner. For eksempel kan det konjugerte polypeptid være en signalpolypeptidsekvens (eller lederpoly-peptidsekvens) i det N-terminale område av et pattedyr-IL-15-polypeptid for transport fra dets syntesested til et sted innenfor eller utenfor cellemembranen eller -veggen (f.eks. gjær-a-faktorlederen). Ved å anvende vanlige teknikker kan videre IL-15-polypeptider uttrykkes som polypeptidfusjoner som omfatter ytterligere polypeptidsekvenser, slik som Fc- eller andre immunglobulinsekvenser, linkersekvenser eller andre sekvenser som letter rensing og identifikasjon av IL-15-polypeptider. Enda ytterligere kan IL-15-polypeptidfusjoner omfatte fusjoner med andre cytokiner for å tilveiebringe nye, poly-funksjonelle enheter. Andre cytokiner omfatter f.eks. hvilke som helst av interleukinene 1-13, tumornekrosefaktor (TNF), granulocyttmakrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF), granu-locyttkolonistimulerende faktor (G-CSF), mastcellevekstfaktor (MGF) og andre cytokiner som påvirker immuncellevekst, -differensiering eller -funksjon.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre IL-15-polypeptider med endret glykosylering. IL-15-polypeptider uttrykt i gjær- eller pattedyrekspresjonssystemer (f.eks^ C0S-7-celler (ATCC CRL 1651)) kan i molekylvekt og glykosyleringsmønster være like med eller signifikant forskjellige fra et naturlig forekommende IL-15-polypeptid. Dette avhenger av valget av ekspresjonssystem. Ekspresjon av IL-15-polypeptider i bak-terieekspresjonssystemer, slik som E. coli, gir ikke-glykosyl-erte molekyler.

Funksjonelle mutantanaloger av humant eller annet pattedyr-IL-15 kan syntetiseres, f.eks. med inaktiverte N-gly-kosyleringsseter ved hjelp av oligonukleotidsyntese og liger-ing, eller ved setespesifikke mutageneseteknikker. IL-15-poly-peptidderivater kan uttrykkes i homogen, redusert karbohydrat-form under anvendelse av gjærekspresjonssysterner. N-glykosyl-eringsseter i eukaryote polypeptider er kjennetegnet ved en aminosyretriplett Asn-*-£J hvor * er hvilken som helst aminosyre bortsett fra Pro, og £1 er Ser eller Thr. Et IL-15-mutant-derivat som her henvist til, er et polypeptid som er i det vesentlige homologt til en sekvens i et naturlig forekommende pattedyr-IL-15, men som har en aminosyresekvens som er for-skjellig fra et naturlig forekommende pattedyr-IL-15-polypeptid på grunn av en delesjon, innføyelse eller substitusjon.

Bioekvivalente analoger av IL-15-polypeptider i IL-15-muteiner kan konstrueres ved å lage forskjellige substitusjoner av aminosyrerester eller -sekvenser, eller ved å delere terminale eller interne rester eller sekvenser som ikke trengs for biologisk aktivitet. For eksempel kan Cys-rester deleres eller erstattes med andre aminosyrer for å forhindre dannelse av ukorrekte, intramolekylære disulfidbroer etter renaturer-ing. Andre fremgangsmåter for mutagenese omfatter modifikasjon av tobasiske aminosyrerester for å øke ekspresjon i gjærsys-temer hvor KEX2-proteaseaktivitet er til stede. Generelt lages substitusjoner konservativt ved å substituere med en aminosyre som har fysiokjemiske karakteristika som ligner karakteristi-kaene til den naturlig forekommende rest.

Antisense- eller sense-oligonukleotider omfatter enkelttrådede nukleinsyresekvenser (enten RNA eller DNA) som er i stand til å binde til sense-IL-15-mRNA- eller antisense-lL-15-cDNA-sekvenser. Et antisense- eller sense-oligonukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et fragment av nukleotidsekvensene i figurene 1 eller 2, eller et DNA- eller RNA-komplement til nukleotidsekvensene i figurene 1 og 2. Et slikt fragment omfatter minst ca. 14 nukleotider og er i stand til å binde til IL-15-DNA. Evnen til å danne et antisense-eller et sense-oligonukleotid basert på en cDNA-sekvens for IL-15, er beskrevet f.eks. i Stein .and Cohen, Cancer Res. 48:2659 (1988), og van der Krol et al., BioTechnigues 6:958

(1988).

Isolering og karakterisering av IL-15 fra ikke-rekombinante cellekilder krever en pattedyrcellelinje som produserer IL-15 og en responscellelinje som prolifererer som respons på IL-15-stimulering. En biologisk analyse med hensyn på pattedyr-IL-15 kan gjøre bruk av en vekstfaktoravhengig T-cellelinje som en detektor for faktorer som Induserer lymfoidcel-leproliferasjon. T-celler isolert fra blodprøver tatt fra men-nesker eller fra andre pattedyr, kan også anvendes til å ana-lysere pattedyr-IL-15-polypeptider.

En IL-15-avhengig cellelinje kan avledes fra murine

CTLL-2-celler. Denne cellelinjen gir respons på renset, humant, murint og rekombinant IL-2 og murint IL-4, men ikke på IL-1, IL-3, .humant IL-4 eller noen av de andre kjente vekst-faktorene .

Man kan utnytte ape- eller human-IL-15-cDNA-sekvensene som her er beskrevet, til å oppnå cDNA-er som koder for andre pattedyrhomologer av ape- eller human-IL-15, ved hjelp av artskrysningshybridiseringsteknikker. I korte trekk dannes en oligonukleotidprobe fra nukleotidsekvensen i det protein-kodende område i sIL-15-cDNA som beskrevet i figur 1, eller SEKV. ID NR. 1, eller hIL-15-cDNA som beskrevet i figur 2 eller SEKV.ID NR. 4. Denne proben kan lages ved hjelp av standardteknikker, slik som de som er beskrevet i Sambrook et al., supra. Ape- eller humanproben brukes til å screene et pattedyr-cDNA-bibliotek eller genom-DNA-bibliotek under middels Strenge betingelser. Pattedyr-cDNA-biblioteker kan lages fra mRNA-er isolert fra f.eks. murine, perifere blodlymfocytter. Alternativt kan andre cDNA-biblioteker eller mRNA-er isolert fra forskjellige vev eller cellelinjer, screenes ved hjelp av Northern-hybridisering for å bestemme en egnet kilde for pattedyr-IL-15-DNA eller -mRNA.

CV- 1/ EBNA IL- 15- renslng

Vi har renset IL-15 for å tilveiebringe et isolert polypeptidpreparat fra en ikke-homogen proteinoppløsning, slik som kondisjonert medium samlet opp fra celler som uttrykker IL-15. IL-15-aktivitet i urensede prøver av kondisjonert medium er ikke alltid påvisbar under anvendelse av for tiden tilgjengelige IL-15-bioanalyseteknikker. Det er vanligvis påkrevet med minst ett rensetrinn før biologisk IL-15-aktivitet er påvisbar under anvendelse av biologiske analyseteknikker som her er beskrevet.

En ikke-homogen proteinoppløsning, f.eks. kondisjonert medium, fremstilles ved å dyrke CV-l/EBNA-linjen (C.J. McMahan et al., EMBO J-, 10(10):2821-2832 (1991); ATCC CRL 10478) av nyreceller fra afrikansk grønnape i et vevsdyrk-ningsmedium. Mediet er fortrinnsvis Dulbeccos modifiserte, essensielle medium med høyt glukoseinnhold ("DMEM", Gibco). Helst anvendes det et dyrkningsmedium og et produksjonsmedium. Dyrknlngsmediet som anvendes ved Isolering av sIL-15 slik som her beskrevet, var DMEM med høyt glukoseinnhold (4 500 mg/l) supplert med 7,5% bovint fosterserum, 50 u/ml penicillin, 50 pg/ml streptomycin, 3-4,0 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer og 10 mM N-[2-hydroksyetyl]piperazin-N'-[2-etansulfonsyre] ("HEPES")-buffer. Et serumfritt produksjonsmedium av DMEM uten fenolrødt supplert med 50 u/ml penicillin, 50 ug/ml streptomycin, 3-4,0 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer og 10 mM HEPES-buffer ble utviklet for IL-15-produksjon og -rensing. CV-l/EBNA-cellene var festeavhengige og kunne dyrkes i skåler, kolber, rulleflasker eller mikrobærere.

Nærmere bestemt ble IL-15 produsert ved å dyrke CV-1/EBNA-celler på mikrobærere i en regulert bioreaktor. Celle-forråd ble oppbevart i rulleflaskekolber. For å starte en produksjonssyklus ble celler trypsinisert og inokulert i en spinnerkolbe inneholdende dyrknlngsmediet beskrevet ovenfor og 5 g/l "Cytodex" 3 mikrobærere (Pharmacia). Inokulasjonstetthet ved start varierte fra 1,5 til 3,5 x IO<5> celler/ml. For å sikre effektiv cellefesting til mikrobærerne ble cellene holdt i spinnerkolben i 2-24 timer. Spinnerkolbekulturer ble inkubert ved 37 'C og omrørt ved 25-40 RPM. Etter festeperioden ble kulturen overført til en regulert bioreaktor. Bioreaktortemp-eratur-, pH-, oksygen- og omrøringsinnstillingspunkter var henholdsvis 37 "C, 7,0, 20% metning (i forhold til luft) og 75-85 RPM. For rutineobservasjon av cellevekst og -tilstand ble prøver observert ved hjelp av lysfeltmikroskopi. Kvanti-fisering av cellevekst ble oppnådd ved å telle frigjorte kjerner etter behandling med en løsning av 100 mM sitronsyre og 0,1% krystallfiolett.

Kulturen ble supplert med ytterligere vekstmedium når ammoniumnivåer nådde 5,0 mM. Dette ble gjentatt inntil mikrobærerne var sammenflytende. Dyrknlngsmediet ble så byttet ut med det serumfrie produksjonsmedium beskrevet ovenfor. Denne fremgangsmåten ble utført ved å la mikrobærerne slå seg ned på bunnen av reaktoren, lufte dyrknlngsmediet og erstatte det med produksjonsmedium. Dette ble gjentatt inntil det var oppnådd en omtrent 3,125 gangers fortynning. 2 til 6 runder med produksjon kan forventes. I hver runde fikk celler produsere i 4 til 7 dager, hvoretter 80% av produksjonsmediet ble samlet opp. Dette ble gjentatt inntil cellene var fullstendig løsnet fra mikrobærerne.

Omtrent 64 liter CV-l/EBNA-kondisjonert medium ble brukt til å rense og tilveiebringe protein for N-aminosyresek-vensen til sIL-15. Som vist i figur 3, omfattet renseskjemaet ultrafiltrering, hydrofob kromatografi, anionbytterkromato-grafi, væskekromatografi i reversfase med høy yteevne (RP-HPLC) og natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Protein ble sekvensert ved å blotte SDS-gelen mot en polyvinylidenfluoridmembran ("PVDF"-membran) og bestemme en N-terminal aminosyresekvens ved hjelp av Edman-nedbrytning direkte fra PVDF-membranen. N-terminal aminosyresekvensering avslørte de første 33 aminosyrene vist i SEKV.ID NR. 3. Etter-følgende sekvensering av en cDNA-klon erholdt fra et CV-1/EBNA-cDNA-bibliotek, ga en DNA-sekvens som koder for polypeptidet ifølge SEKV.ID NR. 2. Denne klonen omfatter en for-holdsvis kort 48 aminosyrers ledersekvens fra SEKV.ID NR. 2 og et modent polypeptid representert ved SEKV.ID NR. 3.

Teknikker med rekombinant DNA

Human-, ape- og andre pattedyr-IL-15-polypeptider fremstilles fortrinnsvis ved hjelp av teknikker med rekombinant DNA. Slike teknikker omfatter lnnføyelse av en cDNA som koder for et human- eller annet pattedyr-IL-15-polypeptid, eller et derivat derav i en ekspresjonsvektor.

Rekombinant produksjon av pattedyr-IL-15-polypeptider eller derivater derav krever først isolering av en DNA-klon (dvs. cDNA) som ved ekspresjon koder for et pattedyr-IL-15-polypeptid eller et derivat derav. cDNA-kloner avledes fra primære celler eller cellelinjer som uttrykker pattedyr-IL-15-polypeptider. Først isoleres totalcelle-mRNA, så lages et cDNA-bibliotek fra mRNA-en ved hjelp av reverstranskripsjon. En cDNA-klon kan isoleres og identifiseres under anvendelse av DNA-sekvensinformasjonen som her er tilveiebrakt, for å utforme en artskrysningshybridiseringsprobe eller PCR-primer som beskrevet ovenfor.

Den isolerte cDNA er fortrinnsvis i form av en åpen leseramme uavbrutt av interne, ikke-trånslaterte sekvenser, eller introner. Genom-DNA som inneholder de relevante nukleotidsekvensene som koder for ekspresjon av pattedyr-IL-15-polypeptider, kan også anvendes som en kilde for genetisk infor-masjon som kan brukes ved konstruksjon av kodende sekvenser. Den isolerte cDNA kan muteres ved hjelp av teknikker som er kjent innen faget for å hjelpe frem IL-15-derivater eller analoger som utviser biologisk IL-15-aktivitet.

Rekombinante ekspresjonsvektorer omfatter syntetiske eller cDNA-avledede DNA-fragmenter som koder for IL-15 eller biologisk aktive derivater derav. Den DNA som koder for et IL-15 eller et derivat derav, er operativt bundet til en egnet transkripsjonen eller translasjonen regulator- eller struk-turnukleotidsekvens, slik som én avledet fra pattedyr-, mik-robe-, virus- eller insektsgener. Eksempler på regulatorsek-venser omfatter f.eks. en genetisk sekvens med en regulatorrolle ved genekspresjon (f.eks. transkripsjonene promoterer eller enhancere), en eventuell operatorsekvens for å regulere transkripsjon, en sekvens som koder for egnede, ribosomale mRNA-bindingsseter, og passende sekvenser som regulerer transkripsjons- og translåsjonsinitiering og -terminering. Nukleotidsekvenser er operativt bundet når regulatorsekvensen forholder seg funksjonelt til strukturgenet. For eksempel kan en DNA-sekvens for et signalpeptid (sekretorisk leder) være operativt bundet til en strukturgen-DNA-sekvens for et pattedyr-IL-15 eller derivat derav dersom signalpeptidet uttrykkes som del av en forløperaminosyresekvens og deltar i sekresjonen av et pattedyr-IL-15. Videre er en promoternukleotidsekvens operativt bundet til en kodende sekvens (f.eks. strukturgen-DNA) dersom promoternukleotidsekvensen regulerer transkripsjonen av strukturgennukleotidsekvensen. Enda ytterligere kan et ribosombindende sete være operativt bundet til en struktur-gennukleotidkodende sekvens (f.eks. pattedyr-IL-15) dersom det ribosombindende sete er plassert innenfor vektoren for å hjelpe frem translasjon.

Egnede vertsceller for ekspresjon av pattedyr-IL-15 eller derivater derav omfatter prokaryoter, gjær eller høyere eukaryote celler under kontroll av passende promoterer. Prokaryoter omfatter gramnegative eller grampositive organismer, f.eks. E. coli eller basiller. Egnede prokaryote vertsceller for transformasjon omfatter f.eks. E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhlmurium og forskjellige andre arter

innenfor slektene Pseudomonas, Streptomyces og Staphylococcus. Som omtalt nærmere nedenunder, omfatter eksempler på egnede vertsceller også gjær, slik som S. cerevisiae, en pattedyrcellelinje, slik som ovarleceller fra kinesisk hamster (CHO) eller insektsceller. Cellefrie translasjonssystemer kan også anvendes til å fremstille pattedyr-IL-15 eller derivater derav under anvendelse av RNA-er avledet fra DNA-konstruksjonene som her er beskrevet. Passende klonings- og ekspresjonsvektorer for anvendelse med bakterie-, sopp-, gjær- og pattedyrcelle-verter er beskrevet f.eks. i Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985.

Når" et pattedyr-IL-15 eller derivat derav uttrykkes i en gjærvertscelle, kan nukleotidsekvensen (f.eks. strukturgenet) som etter ekspresjon koder for et pattedyr-IL-15 eller derivat derav, omfatte en ledersekvens. Ledersekvensen kan muliggjøre forbedret, ekstracellulær utskillelse av translatert polypeptid ved hjelp av en gjærvertscelle.

Pattedyr-IL-15 kan uttrykkes i gjærvertsceller, fortrinnsvis fra Saccharontyces-slekten (f.eks. S. cerevisiae). Andre gjærslekter, slik som Pichla eller Kluyveromyces, kan også anvendes. Gjærvektorer vil ofte inneholde en replika-sjonsopprinnelsessekvens fra et 2 u gjærplasmid, en autonomt replikerende sekvens (ARS), et promoterområde, sekvenser for polyadenylering og sekvenser for transkripsjonsterminering. Fortrinnsvis omfatter gjærvektorer en replikasjonsopprinnel-sessekvens og selekterbar markør. Egnede promotersekvenser for gjærvektorer omfatter promoterer for metallotionein, 3-fosfo-glyseratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) eller andre glykolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; og Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), slik som enolase, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, heksokinase, pyruvatdekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyseratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomérase, fosfoglukoseisomerase og glukokinase. Andre egnede vektorer og promoterer for anvendelse i gjæreks-presjon er nærmere beskrevet i Hitzeman, EP-A-73 657.

Gjærvektorer kan settes sammen f.eks. ved å anvende DNA-sekvenser fra pBR322 for utvelgelse og replikasjon i E. coli (Amp<r->gen og replikasjonsopprinnelsessted). Andre gjær-DNA-sekvenser som kan inkluderes i en gjærekspresjonskonstruk-sjon, omfatter en glukoseundertrykkbar ADH2-promoter og en a-faktorsekresjonsleder. ADH2-promoteren er blitt beskrevet av Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) og Beier et al.

(Nature 300:724, 1982). Gjær-a-faktorledersekvensen styrer utskillelse av heterologe polypeptider. a-faktorledersekvensen innføyes ofte mellom promotersekvensen og strukturgensekven-sen. Se f.eks. Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; og Bitter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:5330, 1984. En ledersekvens kan modifiseres nær sin 3<*->ende slik at den inneholder ett eller flere restriksjonsseter. Dette vil lette fusjon av ledersekvensen til strukturgenet. Gjærtransformasjonsfrem-gangsmåter er kjent for fagfolk innen teknikken. Én slik fremgangsmåte er beskrevet av Hinnen et al.. Proe. Nati. Acad. Sel. USA 75:1929, 1978. Fremgangsmåten ifølge Hinnen et al. selekterer med hensyn på Trp<+->transformanter i et selektivt medium hvor det selektive medium består av 0,67% gjærnitrogen-base, 0,5% kasaminosyrer, 2% glukose, 10 mg/ml adenin og 20 mg/ml uracil.

Gjærvertsceller transformert ved hjelp av vektorer som inneholder ADH2-promotersekvensen, kan dyrkes for å indusere ekspresjon i ét "rikt" medium. Et eksempel på et rikt medium er ett som består av 1% gjærekstrakt, 2% pepton og 1% glukose supplert med 80 mg/ml adenin og 80 mg/ml uracil. Opp-hevelse av undertrykkelsen av ADH2-promoteren inntrer når mediet er tømt for glukose.

Alternativt kan, hos en prokaryot vertscelle, slik som E. coli, pattedyr-IL-15 eller derivatet derav omfatte en N-terminal metioninrest for å lette ekspresjon av det rekombinante polypeptid i en prokaryot vertscelle. Det N-terminale Met kan spaltes fra det uttrykte, rekombinante pattedyr-IL-15.

De rekombinante ekspresjonsvektorene som bærer den rekombinante pattedyr-IL-15-strukturgennukleotidsekvens eller derivatet derav, transfekteres eller transformeres inn i en egnet vertsmikroorganisme eller pattedyrcellelinje.

Ekspresjonsvektorer transfektert 1 prokaryote vertsceller, omfatter generelt én eller flere fenotypeselekterbare markører. En fenotypeselekterbar markør er f.eks. et gen som koder for proteiner som gir antibiotisk resistens, eller som tilfører et autotroft behov, og et replikasjonsopprinnelsessted som gjenkjennes av verten, for å sikre amplifikasjon i verten. Andre anvendbare ekspresjonsvektorer for prokaryote vertsceller omfatter en selekterbar markør av bakterieopprin-nelse, avledet fra kommersielt tilgjengelige plasmider. Denne selekterbare markør kan omfatte genetiske elementer fra klon-ingsvektoren pBR322 (ATCC 37017). pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetrasyklinresistens og gir således enkle mid-ler for identifisering av transformerte celler. pBR322-"ryggrads"-avsnittene er kombinert med en passende promoter og en pattedyr-IL-15-strukturgensekvens. Andre kommersielt tilgjengelige vektorer omfatter f.eks. pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) og pGEMl (Promega Biotec, Madi-son, WI, USA).

Promotersekvenser anvendes vanligvis til rekombinante, prokaryote vertscelleekspresjonsvektorer. Vanlige promotersekvenser omfatter B-laktamase (penicillinase), laktose-promotersystem (Chang et al., Nature 275:615, 1978; og Goeddel et al.. Nature 281:544, 1979), tryptofan(trp)promotersystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; og EPA 36, 776) og tac-proraoter (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). Et særlig anvendbart, prokaryot vertscelleekspresjonssystem gjør bruk av en fag X PL-promoter og en varmelabil cl857ts-repres-sorsekvens. Plasmidvektorer tilgjengelige fra American Type Culture Collection som inkorporerer derivater av k PL-pro-moteren, omfatter plasmid pHUB2 (som befinner seg i E. coli-stamme JMB9 (ATCC 37092)) og pPLc28 (som befinner seg i E. coli RR1 (ATCC 53082)).

Pattedyr- eller insektsvertscellekultursystemer vil også kunne anvendes til å uttrykke rekombinant pattedyr-IL-15-polypeptid eller derivater derav. Eksempler på egnede patte-dyrvertscellelinjer omfatter C0S-7-linjene av apenyreceller

(Gluzman et al., Cell 23:175 (1981); ATCC CRL 1651), L-celler, C127-celler, 3T3-celler (ATCC CCL 163), CHO-celler, HeLa-celler (ATCC CCL 2) og BHK- (ATCC CRL 10) cellelinjer. Egnede pattedyrekspresjonsvektorer omfatter ikke-transkriberte elementer, slik som et replikasjonsopprinnelsessted, en promoter-sekvens, en enhancer bundet til strukturgenet, andre 5'- eller 3<1->flankerende, ikke-transkriberte sekvenser, slik som ribosombindende seter, et polyadenyleringssete, spleisedonor- og -akseptorseter, og transkripsjonstermineringssekvenser.

Transkripsjons- og translasjonskontrollsekvenser i pattedyrvertscelleekspresjonsvéktorer kan tilveiebringes ved hjelp av viruskilder. For eksempel utvinnes vanlig brukte pat-tedyrcellepromotersekvenser og -enhancersekvenser fra polyoraa, adenovirus 2, apevirus 40 (SV4Q) og humant cytomegalovirus. DNA-sekvenser avledet fra SV40-virusgenomet, f.eks. SV40-seter for opprinnelse, tidlig og sen promoter, enhancer, spleising og polyadenylering, kan anvendes for å tilveiebringe de øvrige genetiske elementene som er påkrevet for ekspresjon av en strukturgensekvens i en pattedyrvertscelle. Virale tidlig- og senpromoterer er særlig anvendbare ettersom begge lett oppnås fra et virusgenom som et fragment som også kan inneholde et viralt replikasjonsopprinnelsessted (Fiers et al.. Nature 273:113, 1978). Mindre eller større SV40-fragmenter kan også anvendes, forutsatt at den omtrent 250 store sekvens som strekker seg fra Hind 111-setet mot Bgl i-setet lokalisert i SV40-virusreplikasjonsopprinnelsesstedet, er inkludert.

Eksempelvise pattedyrekspresjonsvektorer kan konstrueres som beskrevet av Okayama og Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Ytterligere anvendbare pattedyrekspresjonsvektorer er beskrevet i US patentsøknad nr. 07/480 694 innlevert 14. februar 1990, og i US patentsøknad nr. 07/543 193 innlevert 5. juni 1990.

Rensing av rekombinant pattedvr- IL- 15

IL-15-polypeptider kan fremstilles ved å dyrke transformerte vertsceller under kulturbetingelser som er nødvendige for å uttrykke pattedyr-IL-15-polypeptider eller derivater derav. De resulterende, uttrykte polypeptider kan så renses fra kulturmedier eller celleekstrakter. Et pattedyr-IL-15-polypeptld eller derivat derav kan konsentreres ved å anvende et kommersielt tilgjengelig proteinkonsentreringsfilter, f.eks. en "Amicon" eller "Millipore Pellicon" ultrafiltrer-ingsenhet. Med eller uten konsentrasjonstrinnet kan kultur-mediet påføres en rensematriks, slik som et hydrofobt kromato-grafimedium. Fenyl-"Sepharose" CL-4B (Pharmacia) er det fore-trukne medium. Alternativt kan det anvendes en anionbytterhar-piks, f.eks. en matriks eller et substrat med fremstikkende dietylaminoetylgrupper (DEAE-grupper). Matriksene kan være akrylamid, agarose, dekstran, cellulose eller andre typer som vanligvis anvendes ved proteinrensing. Alternativt kan det anvendes gelfiltreringsmedium. Rekombinant IL-15 er stabilt i sure, vandige buffere, og det kan også anvendes en kationbyt-terharpiks.

Endelig kan det anvendes ett eller flere trinn med reversfasevæskekromatografi med høy yteevne (RP-HPLC) under anvendelse av hydrofobe RP-HPLC-medier, f.eks. silikagel med fremstikkende metyl- eller andre alifatiske grupper, for å rense IL-15 ytterligere. Noen av eller alle de forutgående rensetrinn kan i forskjellige kombinasjoner også anvendes for å tilveiebringe et i det vesentlige homogent, rekombinant protein. Alternativt kan det også anvendes noen av eller alle trinnene som brukes ved rensefremgangsmåten beskrevet ovenfor, for ape-IL-15.

Rekombinant protein fremstilt i bakteriekultur, isoleres vanligvis ved innledende oppbrytning av vertscellene, sentrifugering, ekstraksjon fra cellepellet dersom det er et uoppløselig polypeptid, eller fra supernatanten dersom det er et oppløselig polypeptid, etterfulgt av ett eller flere kon-sentrer ings-, utsaltings-, ionebytter- eller størrelsesuteluk-kelseskromatografitrinn. Endelig kan RP-HPLC anvendes til sluttrensetrinn. Mikrobeceller kan brytes opp ved hjelp av hvilken som helst passende metode, inkludert fryse-tine-sykluser, sonikering, mekanisk oppbrytning eller bruk av celle-lyseringsmidler.

Transformerte gjærvertsceller anvendes fortrinnsvis for å uttrykke IL-15 som et utskilt polypeptid. Dette for-enkler rensing. Utskilt, rekombinant polypeptid fra en gjær-vertscellerermeivtasjon kan renses ved hjelp av fremgangsmåter som er analoge med de som er beskrevet av Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171, 1984). Urdal et al. beskriver to sekvens-

vise, reversfase-HPLC-trinn for rensing av rekombinant, humant IL-2 på en preparativ HPLC-kolonne.

Administrering av pattedyr- IL- 15- polypeptid- oa derivatprepar-ater

Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av et polypeptid ifølge oppfinnelsen v for fremstilling av et middel for behandling eller forebyggelse av anemi, karsinom, melanom, sarkom, leukemi, lymfom eller for behandling eller forebyggelse av infeksjoner forårsaket av herpesvirus, inkludert cytomegalovirus, polyomavirus, retrovirus, inkludert HIV, influensavirus, hepatittvirus, deriblant hepatitt A, hepatitt B, hepatitt C, hepatitt 5 eller hepatitt D. For terapeutisk anvendelse administreres renset IL-15 eller et biologisk aktivt derivat derav til en pasient, fortrinnsvis et menneske, for behandling på en måte som passer til indika-

sjonen. Således kan f.eks. IL-15-preparater administrert for å undertrykke en form for anemi, gis ved hjelp av bolusinjek-

sjon, kontinuerlig innsprøyting, langvarig frigjørelse fra implantater eller annen egnet teknikk. Administrering kan være

ved intravenøs injeksjon, subkutan injeksjon eller parenteral eller intraperitoneal innsprøyting. Vanligvis vil et terapeut-

isk IL-15-middel bli administrert i form av et farmasøytisk preparat som omfatter renset polypeptid sammen med fysiologisk akseptable bærere, eksipienser eller fortynningsmidler. Slike bærere vil være ikke-toksiske for pasienter ved de doseringer og konsentrasjoner som anvendes. Vanligvis medfører fremstil-lingen av slike preparater blanding av et pattedyr-IL-15-polypeptid eller derivat derav med buffere, antioksidanter, slik

som askorbinsyre, polypeptider med lav molekylvekt (mindre enn

ca. 10 rester), proteiner, aminosyrer, karbohydrater inkludert glukose, sukrose eller dekstraner, slike chelateringsmidler

som EDTA, glutation og andre stabiliseringsmidler og eksipienser. Nøytralt bufret saltoppløsning eller saltoppiøsning blandet med konspesifikt serumalbumin, er eksempelvise, passende fortynningsmidler.

De følgende eksempler er for illustrasjonsformål og

ikke som begrensning.

Eksempel 1

Rensing og sekvensering for naturlig forekommende sIL- 15

Ultrafiltrering

Ultrafiltrering var ikke absolutt nødvendig for å rense IL-15. Fremgangsmåten fjerner imidlertid visse mindre forurensende proteiner og reduserer volumet, hvorved rensefremgangsmåten fremskyndes. Ultrafiltreringstrinnet kan ut-føres ved å anvende enten en YM10- eller YM30-spiralpatron, en hulfiberpatron eller en skivemembran i forskjellige typer av ultrafiltreringsapparat. Et "Amicon" ultrafiltreringssystem med en YM30-spiralpatron var imidlertid foretrukket. Det var ikke påkrevet med noen bufferutbytting før eller etter dette trinnet.

En ikke-homogen proteinoppløsning, dvs. kondisjonert medium, ble erholdt ved å dyrke CV-l/EBNA-cellekulturer i serumfritt, fenolrødt-fritt DMEM i bioreaktorer med 5 g/l "Cytodex" 3 mikrobærere. 8x8 liters bioreaktorer (totalt ca. 64 liter) ble innhøstet, sentrifugert for å fjerne celler og mikrobærere, filtrert gjennom et 0,22 pm celluloseacetatmembranfilter og så konsentrert inntil et sluttvolum på ca. 2 liter under anvendelse av en YM30-spiralpatron. Fortrinnsvis filtreres YM30-konsentratet før det gjennomgår hydrofob kromatografi. Dette trinnet vil minimalisere forurensning ved å fjerne bakterier og andre partikler. Ethvert filter med en porestørrelse fra 0,1 til 0,45 um som ikke binder protein, kan anvendes; et 0,22 um celluloseacetatmembranfilter var imidlertid foretrukket.

Hydrofob kromatoqrafi

Hydrofob kromatografi ga en hurtig måte for overfør-ing av proteinet til en buffer med lavt saltinnhold som kunne påføres anionbytterkolonner. I tillegg ga den tre til seks gangers rensing. Enda ytterligere var det ikke påkrevet med noen bufferutbytting før eller etter dette trinnet. Forskjellige hydrofobe kolonner er egnet. En fenyl-"Sepharose" CL-4B-kolonne (Pharmacia) var foretrukket. Som et alternativ til det hydrofobe kromatografitrinn som her er beskrevet, kan det anvendes et diafiltrerings- eller dialysetrinn.

Fortrinnsvis ble ammoniumsulfat tilsatt til ultrafiltreringskonsentratet inntil en sluttkonsentrasjon på ca.

0,2 M. Ultrafiltreringskonsentratet ble bufret med 1 M HEPES ved ca. pH 8,5 inntil en sluttkonsentrasjon på ca. 20 mM. Kon-sentratet ble så pumpet over på en fenyl-"Sepharose" CL-4B-kolonne og vasket med 0,2 M ammoniumsulf at, 10 mM HEPES, ved ca. pH 8,5 for å fjerne ubundet protein. Bundne proteiner ble eluert med 10 mM HEPES ved ca. pH 8,5. Toppen for eluert protein (inkludert IL-15) ble ført til en anionbytterkolonne.

Anionbytterkromatoqrafl

Anionbytterkromatografirensing muliggjorde ytterligere rensing uten å kreve dialyse eller bufferutbytting. Dette trinnet involverte fortrinnsvis to passeringer av fenyl-"Sepharose"-proteinblandingen over kolonner som inneholdt et anionbyttermedium. Etter hver passering ble de bundne proteiner eluert med NaCl i HEPES. Selv om forskjellige anionbyt-termedier og buf f ersys terner med en pH på ca. 8 til ca. 9 var egnet, muliggjorde DEAE-"Sephacel" (Pharmacia) etterfulgt av Mono Q, sekvensvise anionbyttertrinn uten bufferutbyttinger eller dialyse. DEAE-"Sephacel" ga fjerning av noen forurensende proteiner før påføring til en hurtigvirkende Mono Q-kromatografi med høyere oppløsning ("FPLC", Pharmacia). NaCl-kon-sentrasjonen som ble brukt, var avhengig av den utvalgte anionbytter og pH i den valgte buffer. Andre salter kunne byt-tes ut med NaCl for å eluere proteinet fra anionbyttergelen.

Mest foretrukket ble NaCl tilsatt til fenyl-"Sephar-ose"-blandingen inntil en sluttkonduktivitet på ca. 1,2 mil-liSiemens/centimeter ("mS/cm") (mindre enn ca. 0,1 M NaCl) og pumpet over på en DEAE-"Sephacel"-kolonne som var ekvilibrert med ca. 0,1 M NaCl i ca. 10 mM HEPES ved ca. pH 8,5. Bundne proteiner ble eluert med en lineær gradient fra ca. 0,1 til ca. 0,3 M NaCl i ca. 10 mM HEPES ved ca. pH 8,5. De aktive proteinfraksjoner som ble eluert (inkludert IL-15), ble slått sammen for tilførsel til eh Mono Q-anionbytterkolonne.

Den aktive DEAE-"Sephacel"-blanding ble fortynnet med ca. 10 mM HEPES inntil en sluttkonduktivitet som er mindre enn 1,6 mS/cm (mindre enn 0,14 M NaCl). Den fortynnede blanding ble så pumpet over på en Mono Q FPLC hurtigvirkende væske-kromatografikolonne som var ekvilibrert med ca. 0,14 M NaCl i ca. 10 mM HEPES ved ca. pH 8,5. Bundne proteiner ble eluert med en gradient fra ca. 0,14 M til ca. 0,5 M NaCl i ca. 10 mM HEPES ved ca. pH 8,5. De aktive fraksjoner (inkludert IL-15) ble slått sammen for tilførsel til reversfase-væskekromatografi med høy yteevne (RP-HPLC).

RP- HPLC

Det naturlig forekommende pattedyr-IL-15-polypeptid er stabilt fra ca. pH 7 til ca. 9 og ved ca. pH 2,5 i 0,1%

trifluoreddiksyre ("TFA") i acetonitril ("AcN"). lL-15-aktiviteten ble ikke gjenvunnet når det ble brukt sure, vandige buffere; mange HPLC-buffersystemer ble således eliminert, og kat-ionbytterkromatografi kunne ikke inkluderes i renseskjemaet. C4-RP-HPLC-kolonner ("Vydac" 0,46 x 25 cm, 5 pm) ga den største rensing. Andre reversfasekolonner (C8 eller C18) virket ikke; proteinet eluerte fra C4 ved en høy AcN-konsentrasjon og ble ikke utvunnet fra C8 eller C18 i det hele tatt. Andre buffersystemer som ble prøvd (dvs. ammoniumacetat/metanol, pH 7, og pyridinacetat/propanol), var ikke vellykket.

RP-HPLC-rensingen involverte fortrinnsvis to passeringer av den aktive Mono Q-blanding gjennom "Vydac" C4-matrik-sen. Ved den første passering ble den aktive Mono Q-blanding pumpet over på en C4-HPLC-kolonne ved ca. 1 ml/min. og eluert med en gradient av 0,1% TFA/H20 til 0,1% TFA/100% AcN ved den følgende gradient:

0 til 45% AcN, 1% AcN/minutt

45 til 60% AcN, 0,5% AcN/minutt

60 til 100% AcN, 2% AcN/minutt.

Aktive toppfraksjoner (inkludert IL-15) eluerer mellom ca. 48 og ca. 51% AcN. Aktive fraksjoner bestemt ved hjelp av biologisk analyse, ble slått sammen, fortynnet med 0,1% tfa/h20 for å redusere AcN-konsentrasjon, og tilført den samme C4-kolonne.

Den aktive, fortynnede blanding fra C4-TFA/AcN-for-søket ble pumpet tilbake til C4-kolonnen, vasket med 0,1% TFA/H20 og eluert med en lineær gradient av 0,1% TFA/H20 (buffer A) til 0,1% TFA/60% n-propanol (buffer B) ved ca.

0,5 ml/min. Gradienten ble kjørt ved ca. 0,5% buffer B/min. Fraksjoner ble biologisk analysert for å identifisere de IL-

15-holdige fraksjoner. IL-15-holdige fraksjoner ble slått sammen.

SDS- PAGE

- Renset IL-15 kan visualiseres ved hjelp av sølvfarget SDS-PAGE. Bånd med renset pattedyr-IL-15-protein isolert ved hjelp av SDS-PAGE, kan elektroblottes og analyseres for å bestemme deres N-terminale aminosyresekvenser. IL-15-proteinbåndet kan identifiseres ved hjelp av biologisk analyse.

Fraksjoner med renset IL-15-protein fra C4-TFA/n-propanol-HPLC-forsøket ble hurtig satt under vakuum inntil tørr-het, på nytt oppslemmet i reduserende SDS-prøvebuffer og kjørt på en polyakrylamid-SDS-gel. Fortrinnsvis ble HPLC-renset IL-15 kjørt på'SDS-PAGE ("Phastgel" 8-25%, Pharmacia) i to til-grensende felt. Før fiksering og farging ble omtrent 1 mm stykker gel kuttet fra ett felt i "Phastgel" og puttet direkte inn i biologiske analyser. Den gjenværende gel ble fremkalt og de sølvfargede bånd sammenlignet med stykker ført til biologiske analyser. IL-15-aktiviteten tilsvarte 15-17 kDa. For spesifikk aktivitetsbestemmelse ble renset IL-15 på nytt oppslemmet i reduserende SDS-prøvebuffer, kjørt på 14% polyakrylamid-SDS-gel (Novex) og sølvfarget. Renheten til sIL-15-polypeptidene som tilsvarer 15-17 kDa, var omtrent 222 000 ganger større enn sIL-15-polypeptidrenheten i det CV-l/EBNA-kondi-sjonerte medium ved begynnelsen av renseskjemaet (tabell 2). I tillegg til renhet og proteindata viser tabell 2 aktiviteten av det naturlig forekommende sIL-15-polypeptid i en biologisk CTLL-2-analyse (beskrevet nedenunder i eksempel 2) utført etter hvert trinn i renseprosessen.

PVDF- blottincr

14% polyakrylamid- SDS -gelen ble blottet på en PVDF-membran ("ProBlot" fra Applied Biosystems) under anvendelse av konstant strømstyrke, ved ca. 60 V innstilling i ca. 1 time. Proteinbånd ble visualisert ved farging av PVDF-membranen med Coomassie-blått (0,1% i 10% eddiksyre, 50% metanol). Membranen kan avfarges ved å bruke den samme oppløsning uten Coomassie-blåfargen for å fremheve proteinbåndene. Proteinbåndet som tilsvarer IL-15-aktiviteten, ble kuttet ut, og N-terminal pro-teinsekvensbestemmelse ble utført direkte fra PVDF-membranen.

sIL- 15- polvpeptidsekvenserinq

lL-15-preparatet som skriver seg fra det forutgående RP-HPLC-trinn, ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE. Hver gel ble sølvfarget for å indikere tilstedeværelsen av proteinbånd. Biologisk analyse av ufargede gelstykker som tilsvarer synlige bånd, Indikerte at lL-15-aktiviteten var forbundet med proteiner med molekylvekter i området 15-17 kDa. N-enden av 15-17 kDa-polypeptidet, blottet på en PVDF-membran, ble sekvensert ved hjelp av Edman-nedbrytning i et Applied Biosystems proteinsekvenseringsapparat. Resultatene indikerte identiteten til de første 33 aminosyrene vist i SEKV.ID NR. 3. Etterføl-gende sekvensering av en cDNA-klon erholdt fra et apebiblio-tek, ga en sekvens som koder for polypeptidet ifølge SEKV.ID NR. 2. Polypeptidet ifølge SEKV.ID NR. 2 omfatter en forholds-vis kort 48 aminosyrers ledersekvens og et modent polypeptid representert ved SEKV.ID NR. 3. 1

Eksempel 2

Biologisk analyse

CTLL-2-celler ga en hurtig og følsom biologisk analyse for påvisning av IL-15-polypeptider. Andre cellelinjer som også prolifererer som respons på IL-15 med varierende føl-somhet, er CTLL-2.4 (Valentine et al., Eur. J. Immunol, 21(4):913 (1991)), 32D (Greenberger, Federation Proceedings 42:2762 (1983)), BAF-B03 (Hatakeyama et al., Cell, 59:837

(1989)), M07e (Avanzi et al., Br. J. Haematol. 69:359 (1988)) og TF1 (Kitamura et al., J. Cell. Physiol., 140:323 (1989)). Fortrinnsvis ble CTLL-2-celler dyrket i DMEM med høyt glukoseinnhold supplert med ca. 30 ng/ml IL-2, 5% bovint fosterserum {FBS), 5 x 10-<5> M 2-merkaptoetanol, 50 u/ml penicillin, 50 ug/ml streptomycin og 3-4,0 mM L-glutamin ved 37 "C, 10% C02 og 97% fuktighet. CTLL-2 er en faktoravhengig cellelinje som krever IL-2 for vekst. For analyse ble følgelig CTLL-2-celler vasket to ganger med DMEM med høyt glukoseinnhold supplert med 5% FBS, 5 x 10"s M 2-merkaptoetanol, 50 u/ml penicillin, 50 ug/ml streptomycin, 3-4,0 mM L-glutamin for å fjerne IL-2. IL-15-prøver som skulle analyseres, ble titrert i DMEM 5% FBS i 96-brønners flatbunnede mikrotiterplater. Vas-kede CTLL-2-celler ble tilsatt (sluttanalysevolum 100 ul, 2 000 celler/brønn), og platene ble inkubert i ca. 24 timer ved 37 °C og 10% C02. Platene ble pulset med <3>H-tymidin (25 Ci/mMol) ved 0,5 uCi/brønn i ca. 5 timer, så innhøstet ("Inotech" 96-brønners celleinnhøster) og CPM-tellet ("Packard Matrix" 96 "gas proportional counting system). Enheter ble beregnet fra CPM hvor 1 enhet er lik antallet mikroliter som gir 50% maksimal stimulering.

Eksempel 3

Fremstilling av sIL- 15- cDNA- klon

Sekvensen til de N-terminale 31 aminosyrene i renset slL-15-polypeptid (aminosyrene 1-31 i SEKV.ID NR. 3) ble brukt til å utforme syntetiske oligonukleotidprimere for PCR-amplifikasjon av lL-15-spesifikke DNA-sekvenser. De første seks aminosyrene i N-enden (Asn-Trp-Val-Asn-Val-Ile) ble brukt til å utforme én primer, en degenerert blanding som koder for alle mulige kodonanvendelser i de første seks aminosyrerestene:

som vist i SEKV.ID NR. 9 hvor Y er T eller C; H er A, T eller C; og N er A, C, G eller T. Aminosyresekvensene til den modne ape-N-enden 26-31 (Tyr-Thr-Glu-Ser-Asp-Val) ble brukt til å utforme en andre primer, en degenerert blanding som koder for et komplement av alle mulige kodonanvendelser av aminosyrene 26-31 hvor 3-stilling for Val unngås: som vist henholdsvis i SEKV.ID NR. 10 og 11, hvor Y og N er som definert ovenfor, og R er A eller G. Polyadenylerte RNA-er fra CV-l/EBNA-celler stimulert i 24 timer, 37 timer og 72 timer med 10 ng/ml forbol 12-myri-stat 13-acetat ("PMA"), ble brukt som separate templater for førstetråds cDNA-syntese. En porsjon av førstetråds reaksjonsblandinger ble tilsatt til kommersielt tilgjengelige PCR-reaksjonsblandinger som inneholder oligonukleotidprimerne. Denne blanding ble underkastet 31 sykluser med PCR-amplifikasjon i 100 ul reaksjonsblandinger i standardbuffer med primere ved 1 uM konsentrasjon. Syklusene ble programmert på følgende måte: denaturering ved 94 °C i 0,5 minutt, annealeringstrinn i 0,5 minutt og forlengelsestrinn ved 72 °C i 0,75 minutt. To sykluser med annealering ved hver av 55, 53 og 51 °C ble etterfulgt av 25 sykluser med en annealeringstemperatur på 49 °C.

Etter amplifikasjon ble prøver renset og underkastet agarosegelelektroforese. Dette ga et 92-basepars DNA-fragment som ble skåret ut fra gelfelter fra to separate reaksjonsblandinger som involverte CV-l/EBNA-celler. 92-basepars-DNA-frag-mentet ble renset ved å bruke en "Elutip-D"-kolonne (Schleicher & Schuell, Keene, NH), klonet i "pBluescript SK""

(Stratagene, La Jolla, CA) og brukt til dideoksy-DNA-sekvensering .

En hybridiseringsprobe ble fremstilt ved hjelp av vilkårlig primemerking av det underklonede 92-basepars DNA-fragment. Hybridiseringsproben ble brukt til å screene en del av et plasmidbibliotek som inneholder cDNA-innføyelser fremstilt fra CV-l/EBNA-polyadenylert RNA. Dette resulterte i isolering av klon C85.SIL-15 som har en åpen leseramme omfattende nukleotidsekvensen vist i SEKV.ID NR. 1.

Nukleotidsekvensen til det polypeptidkodende område i sIL-15 er illustrert i SEKV.ID NR. 1. Denne sekvensen ble avledet fra innføyd C85.SIL-15 som var Sal I-bundet i Sal I-setet i ekspresjonsvektor pDC406 (C.J. McMahan et al., EMBO J., 10(10):2821-2832 (1991)). Polyadenylert mRNA ble fremstilt fra en CV-l/EBNA-cellelinje, og cDNA-er ble fremstilt ved å anvende standardteknikker. CV-l/EBNA-linjen er en produsent av sIL-15. cDNA-ender ble tilpasset med Sal I-adaptere (Haymerle et al., Nucleic Acid Res., 14:8615-24 (1986)):

(henholdsvis SEKV.ID NR. 7 og 8) og klonet i vektor pDC406. En blanding bestående av omtrent 500 individuelle plasmidholdige isolater, ble platet ut og screenet ved hybridisering mot et DNA-probefragment. DNA-probefragmentet ble fremstilt ved å anvende PCR-ampiifikasjon av slL-15-sekvenser fra CV-1/EBNA-cellelinj e-cDNA.

Eksempel 4

Kloning av humant IL- 15

En sIL-15-probe ble fremstilt fra et isolert, renset og radioaktivt merket Sal I-fragment (ca. 1,37 kb) inneholdende sIL-15-cDNA ved vilkårlig primemerking. Den spesifikke aktivitet til proben var omtrent 1 x 10<6> cpm/ng. Etter Northern-blottinger ble proben hybridisert mot humane RNA-er fra forskjellige kilder, inkludert en IMTLH-cellelinje. IMTLH-cellelinjen var avledet fra en stabil transformasjon av en human benmargstromacellekultur med pSV3Neo. Proben ble hybridisert til humane RNA-er ved ca. 42 °C i ca. 40% formamid i ca. 18 timer. Hybridisering ble etterfulgt av vasking i 6 x SSC i ca. 10 minutter ved 22 "C, etterfulgt av vasking i 2 x SSC ved 42 'C i ca. 30 minutter. Autoradiografi avslørte et positivt signal i IMTLH-feltet.

Vi probet Southern-blottinger av Sal i-fordøyde bibliotekblandinger av iMTLH-cDNA-biblioteket for å identifisere en blanding som inneholder en human IL-15-cDNA. Ved å anvende metoden til Haymerle et al., Nucleic Acid Res., 14:8615-24 (1986) ovenfor brukt for CV-l/EBNA-biblioteket, ble IMTLH-biblioteket konstruert i ekspresjonsvektor pDC406. Blanding "141", en blanding av omtrent 1 000 forskjellige cDNA-kloner, ble identifisert som positiv. Omtrent 4 000 kolonier av "141" ble så platet ut og probet ved hjelp av vanlige kolonihybridiseringsmetoder for å identifisere en klon som inneholder den humane IL-15-cDNA. Bare en enkeltklon, l41.hETF, ble påvist å kode for humant IL-15. Det er omtrent 96% nukleotidsekvensidentitet og omtrent 96% aminosyresekvens-identitet mellom humane og ape-IL-15-sekvenser for åpen leseramme {figurene 4 og 5).

Eksempel 5

rIL- 15- stimulerina av CTLL- 2- proliferasion

cDNA-er som koder for modne former av IL-15 (nukleotidene fra og med 145 til og med 489 i SEKV. ID NR. 1 og 4) ble innføyet nedstrøms for et heterologt patted<y>rsekresjonssignal for å skape rIL-15-ekspresjonsplasmid for sIL-15 og hIL-15. Sekresjonssignalet er en stort sett hydrofob strekning av aminosyrer (vanligvis i N-enden av et polypeptid) som styrer utskillelse og spalting av polypeptidet mellom C-enden av signalpeptidet og N-enden av det modne, utskilte protein (von Heijne, Eur. J. Biochem., 116:419 (1981)). Sekresjonssignal-sekvensen som ble brukt, var en murin IL-7-signalsekvens. De dannede plasmider ble transfektert inn i C0S-7-celler. Supernatanter av de transfekterte cellekulturer stimulerte CTLL-2-proliferasjon. I tillegg ble det kodende område for forløper-formen av hIL-15 (SEKV.ID NR. 3) innføyet i pDC406 og transfektert i CV-l/EBNA-celler. Supernatanter fra celler transfektert med pDC406:hlL-15 (dvs. hETF/pDC406), men ikke de som var transfektert med tom vektor, stimulerte CTLL-2-proliferasjon.

Eksempel 6

Induksjon av CTLL- 2- proliferas- ion ved hjelp av rIL- 15

Rekombinant ape-IL-15 (ape-rIL-15) ble renset fra supernatant av gjær som uttrykker sIL-15-cDNA-en ved en modifikasjon av rensemetoden beskrevet ovenfor i eksempel 1, hvor ultrafiltrerings- og ionebyttertrinnene ble utelatt. Det rensede ape-riL-15 ble sammenlignet med renset, rekombinant IL-2 og IL-4 med hensyn på biologisk aktivitet. Renheten til hvert av de tre proteinene ble bekreftet ved hjelp av aminosyreana-lyse. Hvert av de tre rensede, rekombinante proteinene ble analysert med hensyn på biologisk aktivitet in vltro ved å anvende CTLL-2-celler. CTLL-2-kulturer inneholdt det angitte cytokin med 2 000 celler/kultur i 100 ul supplert dyrkningsmedium. CTLL-2-kulturene ble pulset med 0,5 uCi [3H]tymidin/- kultur i minst 4 timer av en 24-timers dyrkningsperiode, inn-høstet på glassfiberfilter, og radioaktivitet ble målt ved hjelp av skredgassionisering. Den proliferative respons in vltro av CTLL-2-celler ble målt ved økende konsentrasjoner av rekombinant cytokin (uttrykt som ng/ml). Dataene er uttrykt som cpm av <3>H-tymidin inkorporert (X IO"<3>) i figur 6.

Eksempel 7

Induksjon av CTL-. LAK- og NK- lvtisk aktivitet av rIL- 15

Antigenspesifikke, cytolytiske T-lymfocytter (CTL) ble frembrakt in vltro. Mononuklesre celler fra humant, perifert blod (PBL) fra én donor (5 x 10<5>/kultur) ble stimulert med bestrålt PBL (5 x 10<5>/kultur) fra en allogen donor i kulturer som inneholder forskjellige konsentrasjoner av enten IL-2 eller humant rIL-15 eller ikke noe cytokin. Dyrkninger ble utført som beskrevet av M.B. Widmer et al. i J. Exp. Med., 166:1447 (1987), innhøstet etter 7 dager og analysert med hensyn på cytolytisk aktivitet mot <51>Cr-merkede mål avledet fra den opprinnelige stimulerende donor. Lyseanalysen inneholdt forskjellige antall av de PBL som ga respons, dyrket med 1 000 merkede mål i 200 ul medium i V-bunnede brønner, og super-natantene ble samlet opp etter 4 timers inkubasjon. Lytiske enheter ble beregnet som inverstallet av fraksjonen av den kultur som ga respons, som var påkrevet for å frembringe 50% av den maksimale, spesifikke <51>Cr-frigjørelse. Dataene for de cytokinbehandlede CTL er oppsummert i figur 7.

Lymfokinaktiverte dreperceller (LAK-celler) ble frembrakt under identiske dyrkningsbestemmelser som de ovenfor beskrevne CTL, bortsett fra at de humane PBL ikke ble stimulert med bestrålte PBL fra en allogen donor. I stedet ble det byttet ut med bestrålte, autologe PBL, og cytolytisk aktivitet ble målt mot Daudi-lymfoblastoidcellelinjen. For LAK-analysen ble lytiske enheter beregnet som inverstallet av fraksjonen av kulturen som ga respons, og som var påkrevet for å frembringe 30% av den maksimale, spesifikke <51>Cr-frigjørelse. Dataene for de cytokinbehandlede LAK-celler er oppsummert i figur 8.

Naturlige dreperceller (NK-celler) ble isolert fra hele, humane PBL isolert ved hjelp av antistoffaffinitet mot paramagnetiske mikrokuler med MACS (Miltenyi Biotec, Sunny-vale, CA) under anvendelse av monoklonale antistoffer mot CD16. De rensede NK-celler ble dyrket i 3 dager, og cytolytisk aktivitet ble målt mot K562 erytroleukemicellelinjen. For NK-analysen ble lytiske enheter beregnet som inverstallet av fraksjonen av kulturen som ga respons, og som var påkrevet for å frembringe 30% av den maksimale, spesifikke <51>Cr-frigjørelse. Dataene for de cytokinbehandlede NK-celler er oppsummert i figur 9.

På grunn av likheten i aktivitet mellom IL-2 og IL-15 i eksemplene 6 og 7, ville fagfolk innen teknikken forventet at IL-15 stimulerer aktiviteten av CTL-, LAK- og NK-celler og ekspanderer populasjonen av T-celler som kan ødelegge tumor-celler og virusinfiserte celler. Som beskrevet ovenfor i av-snittet om administrering av IL-15-polypeptidet, kan en effektiv mengde av IL-15 i en egnet fortynner eller bærer administreres til pasienter med karsinomer, melanomer, leukemisar-komer eller lymfomer, eller pasienter smittet med herpesvirus, inkludert cytomegalovirus, polyomavirus, retrovirus. Inkludert HIV, influensavirus, hepadnavirus, hepatitt A, hepatitt B, hepatitt C, hepatitt delta eller hepatitt D.

Claims (15)

1. Isolert DNA-sekvens, karakterisert ved at sekvensen omfatter, (a) DNA-sekvenser som koder for polypeptidene ifølge sekvensen: shvor aminosyre 52 er Leu eller His, aminosyre 57 er Ala eller Thr, aminosyre 58 er Ser eller Asp, aminosyre 73 er Ser eller Ile og aminosyre 80 er Val eller Ile, (b) varianter av sekvensene i (a) som koder for proteiner med tilsvarende biologisk aktivitet, og (c) DNA-sekvenser sin påvisbart hybridiserer til DNA-sekvensene ifølge (a) eller (b), eller deres komplementære tråder, under svært strenge betingelser omfattende hybridisering og vask etter hybridisering ved 55 °C eller høyere og ved en saltkonsentrasjon på 0,5 x SSC eller lavere, og som etter ekspresjon koder for et polypeptid med tilsvarende biologisk aktivitet som sekvensene ifølge SEKV. ID NR. 3 eller SEKV. ID NR. 6.

2. Isolert DNA-sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at sekvensen omfatter, (a) nukleotidene 145 - 489 i DNA-sekvensen ifølge SEKV. ID NR. 1 eller SEKV. ID NR. 4, (b) DNA-sekvenser som påvisbart hybridiserer til DNA-sekvensene ifølge (a) eller deres komplementære tråder under svært strenge betingelser, omfattende hybridisering og vask etter hybridisering ved 55 °C eller høyere, og ved en saltkonsentrasjon på 0,5 x SSC eller lavere, og som etter ekspresjon koder for et polypeptid med tilsvarende biologisk aktivitet som sekvensene ifølge SEKV. ID NR. 3 eller SEKV. ID NR. 6, og (c) DNA-sekvenser som på grunn av den genetiske kodes degenerasjon, koder for et polypeptid som kodes for av hvilken som helst av DNA-sekvensene under (a) og (b).

3. Isolert DNA-sekvens som koder for et forløperpolypeptid til det biologisk aktive IL-15-polypeptid, karakterisert ved at DNA-sekvensen er valgt fra gruppen bestående av: en DNA-sekvens som etter ekspresjon koder for polypeptidet definert ved SEKV. ID NR. 2, og en DNA-sekvens som etter ekspresjon koder for polypeptid definert ved SEKV. ID NR. 5.

4. Isolert DNA-sekvens ifølge krav 3, karakterisert ved at DNA-sekvensen som koder for et forløperpolypeptid til det bioligisk aktive IL-15-polypeptid, er valgt fra gruppen bestående av: DNA-sekvensen ifølge SEKV. ID NR. 1, og DNA-sekvensen ifølge SEKV. ID NR. 4.

5. Rekombinant ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter DNA-sekvensene ifølge hvilket som helst av kravene 1-2.

6. Vertscelle, karakterisert ved at den er transformert eller transfektert med en ekspresjonsvektor ifølge krav 5.

7. Vertscelle ifølge krav 6, karakterisert ved at vertscellen er valgt fra gruppen bestående av E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptromyces, gjær, sopp, innsektsceller og pattedyrceller.

8. Vertscelle ifølge krav 7, karakterisert ved at vertscellen er Saccharomyces cerevisiae.

9. Vertscelle ifølge krav 7, karakterisert ved at vertscellen er en ovariecelle fra kinesisk hamster.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av et IL-15-polypeptid, karakterisert ved at den omfatter dyrking av en vertscelle ifølge krav 6 under betingelser som fremmer ekspresjon, og utvinning av et polypeptid som oppviser biologisk-IL-15-aktivitet, fra kulturen.

11. Isolert, biologisk aktivt IL-15-polypeptidpreparat, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens som kodes for av en isolert DNA-sekvens ifølge krav 1.

12. Isolert polypeptid av det biologisk aktive IL-15-polypeptid ifølge krav 11, karakterisert ved at det omfatter polypeptidet definert ved SEKV. ID NR. 2.

13. Isolert polypeptid av det biologisk aktive IL-15-polypeptid ifølge krav 11, karakterisert ved at det omfatter polypeptidet definert ved hjelp av SEKV. ID NR. 5.

14. Farmasøytisk preparat for stimulering av proliferasjon av T-lymfocytter, karakterisert ved at det omfatter det isolerte IL-15-polypeptid iøflge krav 11, og en fysiologisk akseptable bærere, eksipienser eller fortynningsmidler.

15. Anvendelse av et polypeptid ifølge krav 11 -13 for fremstilling av et middel for behandling eller forebyggelse av anemi, karsinom, melanom, sarkom, leukemi, lymfom eller forbehandling eller forebyggelse av infeksjoner forårsaket av herpesvirus, inkludert cytomegalovirus, polyomavirus, retrovirus, inkludert HIV, influensavirus, hepatittvirus, deriblant hepatitt A, hepatitt B, hepatitt C, hepatitt 5 eller hepatitt D.