ES2271999T3 - Proteina quimerica de receptor soluble de interleucina-6/ligando, sus analogos y sus usos. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a proteínas quiméricas producidas mediante la fusión de la forma de origen natural del receptor de IL-6 soluble y el IL-6 que son útiles para el tratamiento de cáncer y trastornos del hígado, mejora en el transplante de médula ósea y tratamiento de otros estados relacionados con el IL-6.

Description

Proteína quimérica de receptor soluble de interleucina-6/ligando, sus análogos y sus usos.

El presente invento está, en general, en el campo de las actividades biológicas de la interleucina 6 (IL-6) que son dependientes de la acción agonista del receptor soluble de IL-6 (sIL-6R). Más específicamente, el presente invento se refiere a nuevas proteínas quiméricas sIL-6R/IL-6 construidas esencialmente mediante la fusión de las formas de sIL-6R e IL-6 presentes en la naturaleza, y a compuestos análogos biológicamente activos de las mismas, que son particularmente útiles para tratar el cáncer, a través de la inhibición del desarrollo de las células cancerosas, para potenciar el trasplante de médula ósea, y para tratar trastornos hepáticos y otros estados relacionados con IL-6.

La interleucina 6 (IL-6) es una citocina bien conocida cuyas actividades biológicas son mediadas por un sistema receptor de membrana que comprende dos diferentes proteínas, una denominada receptor de IL-6 (IL-6R o gp80) y la otra gp130 (revisión de Hirano et al., 1.994). Las formas solubles de IL-6R (sIL-6R), que corresponden al dominio extracelular de gp80, son productos naturales del organismo humano hallados como glicoproteínas en la sangre y la orina (Novick et al., 1.990, 1.992). Una propiedad excepcional de las moléculas sIL-6R es que actúan como potentes agonistas de IL-6 sobre muchos tipos celulares, incluyendo las células humanas (Taga et al., 1.989; Novick et al., 1.992). Esto se debe al hecho de que, incluso sin el dominio intracitoplásmico de gp80, sIL-6R es aún capaz de desencadenar la dimerización de gp130 en respuesta a IL-6, lo cual, a su vez, media en la subsiguiente transducción de señales específica de IL-6 y los subsiguientes efectos biológicos (Murakami et al., 1.993). De hecho, el complejo activo del receptor de IL-6 es una estructura hexámera formada por dos cadenas de gp130, dos IL-6R y dos ligandos de IL-6 (Ward et al., 1.994; Paonessa et al., 1.995), en la que sIL-6R tiene dos tipos de interacción con gp130 que son esenciales, ambos, para las actividades biológicas específicas de IL-6 (Halimi et al., 1.995).

El tratamiento con sIL-6R da lugar a una potenciación de las actividades biológicas de IL-6 en muchos tipos celulares. Un ejemplo es el de las células tumorales cuyo crecimiento resulta inhibido en mayor grado por IL-6 cuando se añade sIL-6R, tales como las células mieloleucémicas murinas M1 (Taga et al., 1.989), las células del carcinoma de mama humano T47D (Novick et al., 1.992) o las células del carcinoma pulmonar de células no pequeñas humano (Ganapathi et al., 1.996). La IL-6 tiene actividades antimetastásicas in vivo (Katz et al., 1.995), y la sIL-6R puede potenciar además dichos efectos antitumorales in vivo de IL-6 (Mackiewicz et al., 1.995). Otra actividad de IL-6 que es potenciada por la adición de sIL-6R es la estimulación de células madre hematopoyéticas para producir colonias de múltiples linajes (Sui et al., 1.995). Los presentes inventores han observado también que la supervivencia de cultivos primarios de oligodendrocitos cerebrales es sustentada por la combinación de sIL-6R e IL-6 (Oh, 1.997), mientras que la IL-6 sola es poco activa en dichos cultivos (Kahn y De Vellis, 1.994). Este hallazgo indica que IL-6, cuando se combina con sIL-6R, puede remedar la actividad de otras citocinas neurotrópicas, tales como el factor neurotrófico ciliar (CNTF; del inglés, ciliary neurotropic factor) y el factor inhibidor de la leucemia (LIF; del inglés, leukemia inhibitory factor), que también actúan a través de gp130, como es también el caso para la IL-11 y la oncostatina M (Hirano et al., 1.994).

En un intento para proporcionar una molécula que pueda combinar las anteriormente indicadas funciones de IL-6 y sIL-6R, se ha informado recientemente de la producción, en células de levadura recombinantes, de una proteína de fusión entre un segmento truncado de la secuencia de IL-6R humano e IL-6, ligados por un conector rico en glicocolas (Fischer et al., 1.997). Esta proteína de fusión sólo incluye esencialmente el dominio N del receptor citocínico IL-6R y el dominio C del receptor citocínico y, por lo tanto, carece esencialmente de todo el dominio de tipo inmunoglobulina (Ig) de IL-6R, y la región premembranal del receptor (la región entre el dominio C y el dominio transmembranal). Como tal, representa una forma truncada del sIL-6R, estando esencialmente ligado este sIL-6R truncado en la proteína de fusión a la forma madura completa de IL-6 a través del anteriormente indicado conector rico en glicocolas. Además de carecer de partes del sIL-6R natural, esta proteína de fusión, al ser producida en células de levadura, no tiene el patrón de glicosilación que debería tener dicha proteína de fusión si se produjera en células de mamífero, en particular, por ejemplo, en células humanas. De hecho, esta proteína de fusión producida en levadura sólo tiene un peso molecular de aproximadamente 57 kDa, mientras que un producto de fusión que contuviera esencialmente todos los restos de aminoácido de IL-6 y sIL-6R naturales y se hubiera glicosilado totalmente en células de mamífero (por ejemplo, células humanas) tendría el esperado peso molecular de aproximadamente 85 kDa (véase más adelante el Ejemplo 2).

La experiencia común en el desarrollo de proteínas recombinantes que puedan ser usadas para tratar pacientes humanos ha mostrado que es importante permanecer lo más cerca posible de las formas naturales de las proteínas, como se encuentran en el cuerpo humano, con objeto de evitar el desencadenamiento de anticuerpos y otros efectos secundarios observados con productos recombinantes no naturales. Por esta razón, ha sido ventajoso usar sistemas celulares recombinantes de mamífero para producir proteínas glicosiladas, tales como el interferón \beta y el factor estimulador de colonias de granulocitos (Chernajovsky et al., 1.984; Holloway, 1.994), en una forma química lo más similar posible a la del producto humano natural. Las bacterias o microorganismos tales como, por ejemplo, las levaduras, que no glicosilan apropiadamente, también causan una plegadura incorrecta de las cadenas proteicas, lo que conduce a reacciones inmunogénicas. Esto es particularmente importante en relación con la IL-6, que es muy modificada postraduccionalmente por N- y O-glicosilación así como por fosforilación (véase Revel, 1.989, para una revisión), y en relación con el sIL-6R natural de sangre y orina humanas que es una glicoproteína cuyos aminoácidos del extremo N y del extremo C son constantes y han sido determinados (Novick et al., 1.990, y las patentes en propiedad conjunta de los presentes inventores nº US 5.216.128 y su correspondiente EP 413908 B1).

En consecuencia, parece que el anteriormente indicado producto de fusión previo entre parte del sIL-6R e IL-6 presenta un número de posibles inconvenientes, especialmente en cuanto a su uso para el tratamiento de seres humanos, y esto se debe al hecho de que carece de parte del sIL-6R y también a su producción en levaduras, lo que puede proporcionar una incorrecta glicosilación de la proteína.

Hasta ahora no se ha descrito una molécula de fusión que comprenda el sIL-6R natural hallado en fluidos del cuerpo humano y la IL-6 natural y que se produzca en células humanas o en otras células de mamífero.

Por lo tanto, una finalidad del presente invento es proporcionar dicha molécula de fusión que comprende el sIL-6R natural y la IL-6 natural (en cualquier orden), que se produzca en células de mamífero.

Otra finalidad del presente invento es usar dicha proteína de fusión (quimera sIL-6R/IL-6) en concentraciones muy bajas para inhibir el desarrollo de células de melanoma muy metastásicas, células que son resistentes a IL-6 o sIL-6R solos.

Aún otra finalidad es utilizar dicha proteína de fusión (la quimera sIL-6R/IL-6) para el injerto in vivo de células madre hematopoyéticas humanas en protocolos de trasplante de médula ósea.

Aún otra finalidad del presente invento es utilizar dicha proteína de fusión en otros trastornos relacionados con IL-6, tales como, por ejemplo, estados hepáticos y estados neurológicos.

Una finalidad más del invento es proporcionar composiciones farmacéuticas que contengan la antes mencionada proteína de fusión sIL-6R natural-IL-6 natural (quimera sIL-6R/IL-6) para el tratamiento del cáncer, para uso en procedimientos de trasplantes de médula ósea y para otros trastornos relacionados con IL-6, tales como, por ejemplo, estados hepáticos y estados neurológicos.

Otras finalidades y otros aspectos del presente invento se expondrán en, o surgirán de, la siguiente descripción del presente invento.

De acuerdo con el presente invento se han producido una proteína quimérica glicosilada del receptor soluble de la interleucina 6 (sIL-6R)-interleucina 6 (IL-6) (sIL-6R/IL-6) y compuestos análogos biológicamente activos de la misma que comprenden un producto proteico de fusión entre sIL-6R e IL-6, conservando dicha sIL-6R/IL-6 y dichos compuestos análogos de la misma el mismo patrón de glicosilación del compuesto quimérico de las secuencias presentes en la naturaleza cuando se expresan en células de mamífero, en que sIL-6R y sIL-6 son las formas presentes en la naturaleza o se caracterizan por adiciones de aminoácido de hasta 20 aminoácidos, supresiones de hasta 30 aminoácidos y/o sustituciones de hasta 30 aminoácidos con respecto a las secuencias presentes en la naturaleza y en que dicho sIL-6R está fusionado a IL-6 directamente o a través de una molécula conectora peptídica que es un tripéptido con la secuencia E-F-M (Glu-Phe-Met) o un péptido de 13 restos de aminoácido con la secuencia E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met). Puesto que los conectores que representan secuencias de aminoácidos no naturales pueden ser epítopos inmunogénicos que provoquen anticuerpos en los pacientes, es preferible tener una quimera sIL-6R/IL-6 directamente fusionada que tenga la actividad biológica deseada mientras se minimiza al mismo tiempo el riesgo de inducir dicha formación de anticuerpos potencialmente deletéreos cuando se administra dicha quimera.

La conservación de la secuencia completa de sIL-6R que incluye el dominio de tipo Ig como el hallado en la molécula presente en la naturaleza, así como la apropiada glicosilación y otras modificaciones postraduccionales introducidas por las células de ser humano o mamífero cuando la anterior quimera se produce en dichas células, son también importantes para reducir la potencial inmunogenicidad del producto proteico quimérico.

De hecho, se ha mostrado sorprendentemente de acuerdo con el presente invento que los conectores más largos no son esenciales para la actividad de la proteína quimérica, lo que indica que la apropiada plegadura de la quimera no requiere un conector más largo, especialmente cuando esencialmente todas las secuencias presentes en la naturaleza de los restos sIL-6R e IL-6 están incorporadas a la molécula quimérica [véanse el Ejemplo 3 y la Figura 5, que se refieren también a una comparación entre una quimera sIL-6R/IL-6 que tiene un conector muy corto (3 aminoácidos) y una quimera similar que tiene un conector más largo, de 30 aminoácidos].

Estas proteínas de fusión o quimeras sIL-6R/IL-6 han sido producidas eficazmente, de acuerdo con el presente invento, en sistemas de expresión celulares de mamífero para obtener productos glicosilados que tienen una potente actividad sobre células tumorales que no son normalmente sensibles a IL-6 o sIL-6R solos, y que fueron muy eficaces para asegurar el éxito del injerto de células trasplantadas de médula ósea humana (véanse más adelante y los Ejemplos 1-4). En realidad, en dichos trasplantes de médula ósea, las quimeras sIL-6R/IL-6 fueron esenciales para la supervivencia y la proliferación de las células madre hematopoyéticas, pluripotenciales y no comprometidas trasplantadas. Además, a partir de los resultados experimentales presentados más adelante y también de otros análisis, se plantea que pueden prepararse diversos compuestos análogos de la proteína quimérica sIL-6R/IL-6 del invento que tengan esencialmente la misma actividad biológica que la quimera sIL-6R/IL-6, compuestos análogos que son quimeras sIL-6R/IL-6 en las que uno o más restos de aminoácido han sido suprimidos, añadidos o sustituidos por otros, como se definió anteriormente.

Las realizaciones de la anterior proteína quimérica del invento incluyen:

(i) Una proteína sIL-6R/IL-6 quimérica, que es la aquí denominada sIL-6R\deltaVal/IL-6 que tiene un conector tripeptídico de secuencia E-F-M entre la Val-356 C-terminal de sIL-6R y la Pro-29 N-terminal de IL-6, proteína quimérica que tiene la secuencia expuesta en la Figura 3.

(ii) Una proteína sIL-6R/IL-6 quimérica, que es la aquí denominada sIL-6R\deltaVal/L/IL-6 que tiene un conector peptídico de 13 aminoácidos de secuencia E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M entre la Val-356 C-terminal de sIL-6R y la Pro-29 N-terminal de IL-6, proteína quimérica que tiene la secuencia expuesta en la Figura 3 en que el tripéptido de secuencia E-F-M entre las posiciones 357-359 de la Figura 3 está sustituido por dicha secuencia peptídica de 13 aminoácidos.

(iii) Una proteína sIL-6R/IL-6 quimérica, como la anterior, en que dicha proteína es producida en células de mamífero en una forma totalmente procesada.

(iv) Una proteína sIL-6R/IL-6 quimérica, como la anterior, en que dicha proteína es producida en células humanas.

(v) Una proteína sIL-6R/IL-6 quimérica y compuestos análogos biológicamente activos de la misma, como los anteriores, en que dicha proteína quimérica y dichos compuestos análogos se caracterizan por ser capaces de inhibir el crecimiento de células cancerosas muy malignas.

(vi) Una proteína sIL-6R/IL-6 quimérica y compuestos análogos biológicamente activos de la misma, como los anteriores, en que dicha proteína quimérica y dichos compuestos análogos se caracterizan por ser capaces de inhibir el crecimiento de células de melanoma muy malignas.

(vii) Una proteína sIL-6R/IL-6 quimérica y compuestos análogos biológicamente activos de la misma, como los anteriores, en que dicha proteína quimérica y dichos compuestos análogos se caracterizan por ser capaces de provocar el injerto in vivo de células hematopoyéticas humanas en trasplantes de médula ósea.

(viii) Una proteína sIL-6R/IL-6 quimérica y compuestos análogos biológicamente activos de la misma, como los anteriores, en que dicha proteína quimérica y dichos compuestos análogos se caracterizan por ser capaces de proteger al hígado frente a agentes hepatotóxicos.

El presente invento también proporciona una secuencia de DNA que codifica una proteína sIL-6R/IL-6 quimérica y compuestos análogos biológicamente activos de la misma como los anteriormente indicados de acuerdo con el invento.

Además, el presente invento también proporciona un vector de DNA que comprende una secuencia de DNA que codifica una proteína sIL-6R/IL-6 quimérica y compuestos análogos biológicamente activos de la misma del invento, como los anteriormente indicados, vector que es adecuado para la expresión de dicha proteína quimérica en células de mamífero.

Las realizaciones del vector de DNA del invento incluyen:

(i) Un vector de DNA, en el que dicho vector es adecuado para la expresión de dicha proteína quimérica en células humanas.

(ii) Un vector de DNA en el que, cuando dicho vector se expresa en células de mamífero o ser humano, la proteína quimérica expresada tiene una secuencia que permite el procesamiento completo de la proteína quimérica por la célula de mamífero o ser humano y la secreción de la proteína quimérica totalmente procesada desde las células al medio de cultivo en que se desarrollan dichas células.

(iii) un vector de DNA, como el anterior, en el que dicho vector es el aquí denominado plásmido pcDNA sIL-6R/IL-6 que comprende un vector pcDNA3 que contiene la secuencia de DNA que codifica la proteína sIL-6R/IL-6 quimérica, bajo el control de un promotor de citomegalovirus (CMV).

(iv) un vector de DNA, como el anterior, en el que dicho vector es el aquí denominado plásmido pcDNA sIL-6R/L/IL-6 que comprende un vector pcDNA3 que contiene la secuencia de DNA que codifica la proteína sIL-6R/IL-6 quimérica, bajo el control de un promotor de citomegalovirus (CMV), y en el que, en dicha secuencia de DNA que codifica dicha proteína sIL-6R/IL-6 quimérica, hay insertada una secuencia conectora que codifica un péptido conector en el sitio EcoRI situado entre la secuencia que codifica la parte sIL-6R y la secuencia que codifica la parte IL-6 de la proteína.

Asimismo, el presente invento también proporciona células de mamífero transformadas que contienen un vector de DNA como el anterior, que son capaces de expresar la secuencia de proteína quimérica sIL-6R/IL-6 portada por dicho vector y de procesar totalmente la proteína expresada y secretarla al medio de cultivo en que se desarrollan dichas células.

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Una realización de estas células transformadas son las aquí descritas células 293 de riñón embrionario humano (HEK293; del inglés, human embryonal kidney) transfectadas por el vector pcDNA sIL-6R/IL-6, células que son capaces de expresar la proteína quimérica sIL-6R/IL-6, procesar totalmente dicha proteína y secretar dicha proteína en forma de una glicoproteína de aproximadamente 85 kDa al medio de cultivo en que se desarrollan dichas células.

El presente invento también proporciona un método para producir una proteína quimérica o compuestos análogos biológicamente activos de la misma, como los anteriores, que comprende cultivar las susodichas células transformadas bajo unas condiciones adecuadas para la expresión, el procesamiento y la secreción de dicha proteína o dichos compuestos análogos al medio de cultivo en que se cultivan dichas células; y purificar dicha proteína o dichos compuestos análogos de dicho medio de cultivo por cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales específicos para sIL-6R.

La proteína quimérica del presente invento tiene diversos usos, que incluyen:

(i) Uso de una proteína sIL-6R/IL-6 quimérica o compuestos análogos, sales de cualquiera de los mismos, y mezclas de los mismos, como un inhibidor de células cancerosas.

(ii) Uso como en el punto (i) anterior, como un inhibidor de células de melanoma muy malignas.

(iii) Uso de una proteína sIL-6R/IL-6 quimérica o compuestos análogos, sales de cualquiera de los mismos, y mezclas de los mismos, como un ingrediente activo para provocar el injerto de células hematopoyéticas humanas en un trasplante de médula ósea.

(iv) Uso de una proteína sIL-6R/IL-6 quimérica o compuestos análogos, sales de cualquiera de los mismos, y mezclas de los mismos, como un ingrediente activo para aumentar la hematopoyesis, para tratar estados hepáticos y neurológicos o para otras aplicaciones en que se usa IL-6 o sIL-6R.

Similarmente, la proteína quimérica del presente invento puede usarse para preparar medicamentos para diversas indicaciones médicas, es decir, una proteína sIL-6R/IL-6 quimérica o compuestos análogos, sales de cualquiera de los mismos y mezclas de los mismos, para uso en la preparación de un medicamento para tratar cánceres por medio de la inhibición de las células cancerosas, o en la preparación de un medicamento para la potenciación del trasplante de médula ósea por medio de la provocación del injerto de células hematopoyéticas humanas en un trasplante de médula ósea, o en la preparación de un medicamento para aumentar la hematopoyesis, o en la preparación de un medicamento para tratar trastornos neurológicos, o en la preparación de un medicamento para otras aplicaciones en que se utiliza IL-6 o sIL-6R.

Además, el presente invento también proporciona una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, una proteína sIL-6R/IL-6 quimérica o un compuesto análogo de la misma como los anteriormente descritos, y un vehículo, agente diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Las realizaciones de esta composición farmacéutica del invento incluyen:

(i) Una composición farmacéutica para el tratamiento de cánceres de mamíferos.

(ii) Una composición farmacéutica para la potenciación del trasplante de médula ósea.

(iii) Una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos hepáticos y neurológicos, o para aumentar la hematopoyesis o para otras aplicaciones en que se usa IL-6 o sIL-6R.

Con objeto de evitar dudas, el presente invento se refiere a una quimera entre IL-6 y sIL-6R en cualquier orden; es decir, pueden invertirse las porciones N-terminal y C-terminal y la quimera es entonces una proteína IL-6-sIL-6R, aunque aquí es referida como una proteína sIL-6R/IL-6 desde el principio hasta el final.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 (A, B) describe una representación esquemática de los diversos vectores, reactivos y operaciones de procesamiento utilizados en la construcción de la molécula quimérica de DNA que codifica una proteína quimérica en que se conserva la estructura de la forma natural de sIL-6R que acaba en el resto Val 356, seguida de la secuencia de la forma natural, madura y procesada de IL-6, como se detalla en el Ejemplo 1;

La Figura 2 (A, B) muestra los resultados obtenidos del análisis llevado a cabo para identificar la quimera sIL-6R\deltaVal/IL-6 p86 mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (A) y mediante el perfil de bioactividad (B): en la Figura 2A se muestra una reproducción de un gel teñido con Coomasie sobre el cual se habían sometido a electroforesis fracciones inmunopurificadas eluidas de columnas de cromatografía de afinidad cargadas con una muestra de proteínas secretadas obtenida de cultivos celulares transfectados con un vector que codificaba la proteína quimérica; y en la Figura 2B se muestra una representación gráfica de la actividad biológica (inhibición del crecimiento de células de melanoma F10.9) de cada una de las anteriormente indicadas fracciones eluidas de las columnas de cromatografía de afinidad, todo como se detalla en los Ejemplos 2 y 3;

La Figura 3 representa la secuencia de aminoácidos (código de una letra) de la quimera sIL-6R\deltaVal/IL-6, en que se muestran los diferentes dominios de la molécula, incluyendo el péptido señal N-terminal (línea en la parte superior de la secuencia), el dominio de tipo inmunoglobulina (tipo Ig), el dominio N del receptor citocínico (subrayado), el dominio C citocínico (línea en la parte superior de la secuencia) y la región premembranal del receptor (la región entre el dominio C y el dominio transmembranal), todo de la parte sIL-6R de la quimera; así como el resto IL-6 maduro (subrayado más abajo) de la quimera, como se describe en los Ejemplos 1 y 2;

La Figura 4 (A, B) muestra fotografías de células de melanoma F10.9 en cultivo sin (A) y con (B) tratamiento con la proteína quimérica sIL-6R/IL-6 durante 4 días; en la Figura 4B son evidentes los cambios morfológicos inducidos en dichas células metastásicas de melanoma (células F10.9) por el tratamiento con la quimera sIL-6R/IL-6, como se describe en el Ejemplo 3;

La Figura 5 es una representación gráfica de los resultados que describen la inhibición del crecimiento de células de melanoma F10.9 por la proteína quimérica sIL-6R/IL-6, estando la quimera en diversas concentraciones que variaban de aproximadamente 0,12 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml, en la que la quimera con un conector de sólo tres aminoácidos (IL-6RIL-6), como se describe en el Ejemplo 3, es comparada con una quimera con un conector que tiene una longitud de 13 aminoácidos (IL-6RLIL-6);

La Figura 6 es una representación gráfica de los resultados que describen la ausencia de efectos inhibidores del crecimiento, sobre células de melanoma F10.9, de la IL-6 aislada sola (curva superior discontinua con cuadrados blancos) en concentraciones que variaban de 0 a 40 ng/ml de IL-6, y del sIL-6R solo (el punto de convergencia de todas las curvas en el eje vertical, donde la concentración de IL-6 es cero); así como los observados efectos inhibidores del crecimiento cuando se añaden IL-6 y sIL-6R juntos en diversas concentraciones de cada uno, variando la concentración de IL-6 de 10 ng/ml a 40 ng/ml, y añadiéndose el sIL-6R en tres concentraciones de 100 ng/ml, 200 ng/ml y 400 ng/ml para cada concentración de IL-6, según se ilustra en las tres curvas inferiores (dos curvas discontinuas con triángulos y círculos blancos y una curva continua con cuadrados negros), como se describe en el Ejemplo 3;

La Figura 7 es una reproducción de un autorradiograma de una transferencia Southern, que muestra la necesidad de la proteína quimérica sIL-6R/IL-6 para un injerto exitoso de células madre hematopoyéticas humanas durante un trasplante de médula ósea a ratones SCID-NOD (los dos carriles de la derecha representan los ratones que recibieron la proteína quimérica sIL-6R/IL-6 además de los demás factores necesarios, SCF y FLT-3; y esto en contraste con los tres carriles de la izquierda que representan ratones que habían recibido sólo SCF y FLT-3, o SCF, FLT-3 y también IL-6 y sIL-6R aislados, es decir, no fusionados), como se describe en el Ejemplo 4;

La Figura 8 es una representación de Scatchard sobre las características de afinidad de la quimera sIL-6R/IL-6 en comparación con las de una mezcla de IL-6 y sIL-6R, representándose los valores de la quimera por cuadrados negros y los de la mezcla por rombos negros, y siendo 4 a 1 la relación de las pendientes;

La Figura 9 muestra la mayor actividad de la quimera sIL-6R/IL-6 sobre células de melanoma F10.9 en comparación con la de la mezcla de sIL-6R + IL-6 y con la de sIL-6R (sin IL-6);

La Figura 10 muestra la protección de la quimera sIL-6R/IL-6 frente a la toxicidad hepática; los valores representan una media de 4 experimentos, los cuadrados negros representan ratones IL-6-/-, los rombos negros representan ratones IL-6-/- que habían recibido IL-6, y las estrellas negras representan ratones IL-6-/- que habían recibido la
quimera;

La Figura 11 describe la secuencia de aminoácidos (código de una letra) de la quimera IL-6-sIL-6R\deltaVal 3e, estando subrayado el conector; y

La Figura 12 muestra la actividad biológica de la quimera 3e (estrellas oscuras) sobre células de melanoma F10.9, en comparación con la de la quimera sIL-6R/IL-6 (cuadrados negros) y la de dos mutantes [Mutt 39 (HD) (rombos negros) y Mutt NHD (estrellas claras)], como se describe en el Ejemplo 9.

El presente invento se refiere a una proteína sIL-6R/IL-6 quimérica y a compuestos análogos biológicamente activos de la misma, como se definieron anteriormente. Se ha hallado que dicha proteína sIL-6R/IL-6 quimérica producida de acuerdo con el presente invento en células de mamífero, en particular en células humanas (véanse más adelante los Ejemplos 1-4), se expresa eficazmente en dichas células, está muy glicosilada y presenta una potente actividad sobre células tumorales que no responden en absoluto a IL-6 o sIL-6R solos.

Más particularmente, de acuerdo con el presente invento se ha observado (véanse más adelante los Ejemplos 1-3) que la susodicha proteína sIL-6R/IL-6 quimérica del invento causa la detención del crecimiento de células de mamífero muy malignas, tales como las células de melanoma F10.9, en concentraciones menores que las necesarias cuando se usa una mezcla de sIL-6R e IL-6 no fusionados. Esto es un resultado particularmente significativo a la vista del hecho de que dichas células de melanoma F10.9 continúan creciendo normalmente cuando se tratan sólo con IL-6 o sólo con sIL-6R separadamente y sólo experimentan la detención del crecimiento cuando son expuestas a dosis relativamente elevadas de una combinación de IL-6 y sIL-6R no fusionados. En consecuencia, la proteína sIL-6R/IL-6 quimérica del presente invento es sorprendentemente un inhibidor más potente de estas células de melanoma muy malignas que una mezcla de sus partes separadas, es decir, una mezcla de IL-6 y sIL-6R no fusionados. Por lo tanto, la proteína quimérica del presente invento es particularmente útil como un ingrediente activo para tratar diversas clases de cánceres.

La mayor actividad de la proteína sIL-6R/IL-6 quimérica se explica por su mayor afinidad por gp130 que la mezcla de IL-6 y sIL-6R no fusionados (Ejemplo 7).

Además, también se ha hallado de acuerdo con el presente invento (véase más adelante el Ejemplo 4) que una molécula sIL-6R/IL-6 quimérica del presente invento es particularmente útil para potenciar el trasplante de médula ósea. De hecho, utilizando un conocido protocolo para el injerto de células de médula ósea humana en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID; del inglés, severe combined immunodeficient), en el que se utilizan factor de células madre (SCF; del inglés, stem-cell factor) y ligando de Flt3 para permitir la supervivencia y la proliferación de las células madre hematopoyéticas y pluripotenciales más primitivas, capaces de un injerto de larga duración en la médula ósea receptora, se halló que estos dos factores, SCF y ligando de Flt3, resultaban insuficientes para provocar el injerto de células humanas en la médula ósea receptora de ratón y que el injerto sólo resultaba exitoso cuando también se añadía la proteína sIL-6R/IL-6 quimérica. Este hallazgo indica que la proteína quimérica puede ser esencial en dichos protocolos de injerto. En los mismos experimentos, la IL-6 y el sIL-6R no fusionados, cuando se añadían separadamente, resultaban insuficientes para provocar un trasplante exitoso de médula ósea y, cuando se añadían juntos, resultaban mucho menos activos que la proteína sIL-6R/IL-6 quimérica; es decir, en una concentración eficaz de 100 ng/ml, la proteína quimérica sIL-6R/IL-6 provocaba un trasplante exitoso de médula ósea, mientras que el sIL-6R y la IL-6 no fusionados, cuando se añadían juntos, eran mucho menos activos en la provocación de dicho trasplante incluso en concentraciones superiores (sIL-6R de 125-1.250 ng/ml, IL-6 de 50-200 ng/ml).

La anterior proteína sIL-6R/IL-6 quimérica del invento es preferiblemente una quimera sIL-6R/IL-6 glicosilada recombinante, producida en células humanas o en cualquier otro sistema adecuado de expresión celular de mamífero que sea capaz de glicosilar proteínas como lo hacen las células humanas y que introduzca las mismas modificaciones postraduccionales que las células humanas. Una característica importante es que la glicoproteína quimérica así producida es procesada y modificada como lo son las moléculas originarias sIL-6R e IL-6 naturales halladas en el cuerpo humano, sin truncamiento y sin adición de secuencias polipeptídicas antinaturales extrañas, con la excepción del cortísimo tripéptido o cuando se incorpora un péptido conector más largo entre los restos sIL-6R e IL-6 de la proteína quimérica.

Para preparar la anteriormente preferida proteína quimérica del invento, se tuvieron en consideración las siguientes características del sIL-6R y la IL-6 presentes en la naturaleza: se sabe que el IL-6R presente en las membranas celulares humanas es producido por un cDNA que codifica 468 aminoácidos que comprenden un péptido señal, un dominio de tipo inmunoglobulina (Ig), un dominio de unión a citocinas, una región transmembranal y un dominio citoplásmico (Yamasaki et al., 1.988). En fluidos corporales se halla una forma soluble de sIL-6R que tiene, como el IL-6R maduro de las membranas, un extremo N que corresponde a Leu-20 (Novick et al., 1.990) y un extremo C que corresponde a Val-356 justo antes de la región trasmembranal de IL-6R (véanse la Patente de EE.UU. en propiedad conjunta nº 5.216.128 y EP 413908 B1). Con objeto de fusionar esta secuencia de sIL-6R con IL-6, se introdujo un sitio de restricción EcoRI detrás de Val-356. Detrás de este sitio EcoRI se introdujo la secuencia de la IL-6 madura comenzando en Pro-29 del cDNA de IL-6 y acabando en Met-212 (Zilberstein et al., 1.986; Hirano et al., 1.986). En este sitio EcoRI también podría introducirse, aunque no necesariamente, un péptido conector de la longitud deseada para alejar el resto sIL-6R del resto IL-6 en la proteína quimérica. Como se expone en los ejemplos posteriores, se produjeron dos proteínas quiméricas diferentes como ejemplos de dichas posibles proteínas quiméricas, una que tenía un conector tripeptídico y otra que tenía un conector de 13 restos de aminoácido en este sitio EcoRI, siendo ambas esencial e igualmente activas biológicamente.

El presente invento también se refiere a compuestos análogos de la anterior proteína sIL-6R/IL-6 quimérica del invento, como los anteriormente definidos, que conservan esencialmente la misma actividad biológica que la proteína quimérica que sólo tiene esencialmente las secuencias de sIL-6R e IL-6 presentes en la naturaleza. Dichos compuestos análogos pueden ser unos en que hasta aproximadamente 30 restos de aminoácidos pueden ser suprimidos, añadidos o sustituidos por otros en los restos sIL-6R y/o IL-6 de la proteína quimérica, de modo que las modificaciones de esta clase no cambien sustancialmente la actividad biológica del compuesto análogo de proteína quimérica con respecto a la propia proteína quimérica, y en que el resto sIL-6R de dichos compuestos análogos conserve esencialmente la estructura presente en la naturaleza (antes del procesamiento, véase la Figura 3), de un péptido señal, un dominio de tipo Ig, un dominio N del receptor citocínico, un dominio C del receptor citocínico y un dominio premembranal del receptor. Asimismo, dichos compuestos análogos de la proteína quimérica deberían conservar esencialmente la forma madura del resto IL-6, presente en la naturaleza. Los diversos compuestos análogos pueden diferir mucho entre sí y de la molécula de proteína quimérica básica (aquélla con sólo esencialmente secuencias de sIL-6R e IL-6 presentes en la naturaleza) en el sitio del péptido conector que une los restos sIL-6R e IL-6 en la proteína
quimérica.

En cuanto a los anteriores compuestos análogos de la proteína quimérica del invento, los compuestos análogos son aquellos en que uno o más, y hasta aproximadamente 30, de los restos de aminoácido de la proteína quimérica básica del invento están sustituidos por restos de aminoácido diferentes, o están suprimidos, o uno o más, y hasta aproximadamente 20, restos de aminoácido son añadidos a la secuencia original de la proteína quimérica del invento (aquélla con sólo esencialmente las secuencias de sIL-6R e IL-6 presentes en la naturaleza) sin que cambie considerablemente la actividad de los productos resultantes en comparación con la actividad de la proteína quimérica básica del invento. Estos compuestos análogos son preparados mediante técnicas sintéticas conocidas y/o mediante técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, o mediante cualquier otra conocida técnica adecuada para ello.

Cualquiera de tales compuestos análogos tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos suficientemente duplicativa de la secuencia de la quimera sIL-6R/IL-6 básica como para que tenga una actividad sustancialmente similar a la de ésta. De este modo, puede determinarse si un compuesto análogo dado tiene sustancialmente la misma actividad que la proteína quimérica básica del invento por medio de una experimentación rutinaria que comprende someter a dicho compuesto análogo a los ensayos de actividad biológica expuestos más adelante en los Ejemplos 2-4.

Los compuestos análogos de la proteína quimérica que pueden ser utilizados de acuerdo con el presente invento, o los ácidos nucleicos que los codifican, incluyen un conjunto finito de secuencias sustancialmente correspondientes como péptidos o polinucleótidos de sustitución que pueden obtener rutinariamente quien tiene una experiencia normal en la técnica, sin una experimentación excesiva, basándose en las enseñanzas y la orientación aquí presentadas. Para una descripción detallada de la química y la estructura de las proteínas, véanse G. E. Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, EE.UU., 1.978, y T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, EE.UU., 1.983. Para una presentación de sustituciones de secuencias de nucleótidos, tales como preferencias de codones, véanse Ausubel et al., supra, Secciones A.1.1-A.1.24, y Sambrook et al., Current Protocols in Molecular Biology, Interscience N.Y., Secciones 6.3 y 6.4 (1.987, 1.992), en los Apéndices C y D.

Los cambios preferidos para los compuestos análogos de acuerdo con el presente invento son lo que se conoce como sustituciones "conservativas". Las sustituciones de aminoácidos conservativas en la proteína quimérica que tiene esencialmente las secuencias de sIL-6R e IL-6 presentes en la naturaleza pueden incluir aminoácidos sinónimos, dentro de un grupo, que tienen unas propiedades fisicoquímicas suficientemente similares para que la sustitución entre miembros del grupo conserve la función biológica de la molécula [Grantham, Science, Volumen 185, páginas 862-864 (1.974)]. Está claro que también pueden hacerse inserciones y supresiones de aminoácidos en las secuencias anteriormente definidas sin que se altere su función, particularmente si las inserciones o supresiones sólo afectan a unos pocos aminoácidos, por ejemplo, menos de treinta, y preferiblemente menos de diez, y no eliminan ni desplazan aminoácidos que son críticos para una conformación funcional, por ejemplo, restos de cisteína [Anfinsen, Principles that Govern the Folding of Protein Chains, Science, Volumen 181, páginas 223-230 (1.973)]. Los compuestos análogos producidos mediante dichas supresiones y/o inserciones entran en el alcance del presente invento.

Preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son los definidos en la Tabla I. Más preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son los definidos en la Tabla II; y muy preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son los definidos en la Tabla III.

TABLA I Grupos preferidos de aminoácidos sinónimos

Aminoácido	Grupo sinónimo
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gln, Lys, Glu, His
Leu	Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe	Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn	Gln, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
Met	Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp	Trp

TABLA II Grupos más preferidos de aminoácidos sinónimos

Aminoácido	Grupo sinónimo
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, Ile, Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Val, Met, Ile
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gln, Arg
Gln	Glu, Gln, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gln
Met	Met, Phe, Ile, Val, Leu
Trp	Trp

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TABLA III Grupos muy preferidos de aminoácidos sinónimos

Aminoácido	Grupo sinónimo
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, Ile, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gln	Gln
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, Ile, Leu
Trp	Trp

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Los ejemplos de producción de sustituciones de aminoácidos en proteínas que pueden utilizarse para obtener compuestos análogos de la proteína quimérica para uso en el presente invento incluyen cualesquier operaciones de método conocidas, tales como las presentadas en las Patentes de EE.UU. RE 33.653, 4.959.314, 4.588.585 y 4.737.462 concedidas a Mark et al.; 5.116.943 a Koths et al., 4.965.195 a Namen et al., 4.879.111 a Chong et al., y 5.017.691 a Lee et al.; y las proteínas sustituidas con lisina presentadas en la Patente de EE.UU. nº 4.904.584 (Shaw et al.).

En otro realización preferida del presente invento, cualquier compuesto análogo de la proteína quimérica para uso en el presente invento tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde esencialmente a la secuencia de la anteriormente indicada proteína quimérica básica del invento. Con la expresión "que corresponde esencialmente a" se pretende abarcar compuestos análogos con cambios menores, con respecto la secuencia de la proteína quimérica básica, que no afectan a las características básicas de la misma, particularmente en lo que se refiere a, por ejemplo, su capacidad para inhibir la proliferación de células cancerosas o para provocar trasplantes de médula ósea. Se considera generalmente que los tipos de cambios que entran en la expresión "que corresponde esencialmente a" son aquellos que resultarían de técnicas de mutagénesis convencionales del DNA que codifica la proteína quimérica del invento, para dar lugar a algunas modificaciones menores, y de la exploración de la actividad deseada de la manera anteriormente discutida.

Los compuestos análogos de acuerdo con el presente invento incluyen los codificados por un ácido nucleico, tal como DNA o RNA, que se híbrida con DNA o RNA bajo condiciones rigurosas y que codifica una proteína quimérica de acuerdo con el presente invento que comprende esencialmente todas las secuencias presentes en la naturaleza que codifican sIL-6R e IL-6. Por ejemplo, dicho DNA o RNA hibridante puede ser uno que codifique la misma proteína del invento que tiene, por ejemplo, la secuencia expuesta en la Figura 3, pero cuya secuencia de nucleótidos difiera de la secuencia de nucleótidos de origen natural en virtud de la degeneración del código genético; es decir, una secuencia de ácido nucleico algo diferente puede aún codificar la misma secuencia de aminoácidos a causa de esta degeneración. Además, como también se indicó anteriormente, la cantidad de cambios de aminoácidos (supresiones, adiciones y sustituciones) está limitada a hasta aproximadamente 30 aminoácidos, por lo que, incluso con la máxima cantidad de cambios, los compuestos análogos de acuerdo con el presente invento serán aquellos que conserven esencialmente la secuencia líder (antes del procesamiento), el dominio de tipo Ig, los dominios N y C del receptor citocínico y la región premembranal del receptor (la región entre el dominio C y el dominio transmembranal) en el resto sIL-6R y esencialmente todo el resto IL-6. Dicho ácido nucleico sería un candidato fundamental para determinar si codifica un polipéptido que conserva la actividad funcional de la proteína quimérica del presente invento. La expresión "condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones de la hibridación y del posterior lavado a las que quienes tienen una experiencia normal en la técnica se refieren convencionalmente como "rigurosas". Véanse Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, New York, EE.UU., párrafos 6.3 y 6.4 (1.987, 1.992), y Sambrook et al., supra. Sin limitación, los ejemplos de condiciones rigurosas incluyen unas condiciones de lavado de 12-20°C por debajo de la Tm calculada del híbrido bajo estudio en, por ejemplo, SSC 2x y SDS al 0,5% durante 5 minutos, SSC 2x y SDS al 0,1% durante 15 minutos, SSC 0,1x y SDS al 0,5% a 37°C durante 30-60 minutos, y luego SSC 0,1x y SDS al 0,5% a 68°C durante 30-60 minutos. Quienes tienen una experiencia normal en esta técnica entienden que las condiciones rigurosas también dependen de la longitud de las secuencias de DNA, las sondas oligonucleotídicas (tales como 10-40 bases) o las sondas oligonucleotídicas mixtas. Si se usan sondas mixtas, es preferible utilizar cloruro de tetrametilamonio (TMAC; del inglés, tetramethyl ammonium chloride) en lugar de SSC (véase Ausubel, supra).

El término "sales" se refiere aquí tanto a sales de grupos carboxilo como a sales, por adición de ácido, de grupos amino de la proteína quimérica del invento o de compuestos análogos de la misma. Las sales de un grupo carboxilo pueden ser formadas por medios conocidos en la técnica e incluyen sales inorgánicas, tales como, por ejemplo, sales sódicas, cálcicas, amónicas, férricas, zíncicas y similares, y sales con bases orgánicas como las formadas, por ejemplo, con aminas, tales como trietanolamina, arginina, lisina, piperidina, procaína y similares. Las sales por adición de ácido incluyen, por ejemplo, sales con ácidos minerales tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico y ácido sulfúrico, y sales con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético y ácido oxálico. Por supuesto, todas las citadas sales deben tener una actividad sustancialmente similar a la actividad de la proteína quimérica del invento o de sus compuestos análogos.

El presente invento también se refiere a secuencias de DNA que codifican la anterior proteína quimérica del invento y sus compuestos análogos, así como a vectores de DNA que portan dichas secuencias de DNA para expresión en células adecuadas de mamífero, preferiblemente de ser humano. Una realización de un vector del invento es un plásmido pcDNA sIL-6R/IL-6 que comprende el vector pcDNA3 (Invitrogen) que contiene las secuencias fusionadas de sIL-6R/IL-6 bajo el control de un promotor de citomegalovirus (CMV).

El presente invento también se refiere a células transformadas de mamífero, preferiblemente de ser humano, capaces de expresar las anteriores proteínas del presente invento. Una realización de dichas células transformadas son las células renales embrionarias humanas 293 (HEK293; ATCC CRL 1573) transfectadas por pcDNA sIL-6R/IL-6, que secretan la proteína quimérica sIL-6R/IL-6 fusionada en forma de una glicoproteína de 85 kDa.

Una realización más es el plásmido pcDNA sIL-6R/L/IL-6, que difiere del anterior pcDNA sIL-6R/IL-6 por la inserción, en el sitio EcoRI, de conectores cortos que codifican 10 aminoácidos adicionales. Pueden introducirse varias secuencias diferentes, de diversas longitudes, para optimizar la distancia entre sIL-6R e IL-6.

El invento también incluye una proteína quimérica como la anteriormente definida, en que el resto IL-6 precede al sIL-6R (como en la Figura 11).

El presente invento se refiere además a un método para producir y purificar la proteína quimérica del invento o sus compuestos análogos, que comprende cultivar las células transformadas anteriores bajo unas condiciones adecuadas para la expresión y la secreción del producto proteico quimérico al medio de cultivo y purificar luego la proteína secretada por cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos monoclonales 34.4 anti-sIL-6R, como se indica más adelante en los Ejemplos 2 y 5.

El invento se refiere también a una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, una quimera sIL-6R/L/IL-6 o compuestos análogos de la misma o mezcla de los mismos o sales de los mismos, y un vehículo, agente diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Una realización de la composición farmacéutica del invento incluye una composición farmacéutica para una acción de tipo IL-6 potenciada, para el tratamiento de cánceres, para el trasplante de médula ósea, para un aumento de la hematopoyesis, en particular de la trombopoyesis, para el tratamiento de estados neurológicos, para el tratamiento de trastornos hepáticos, y para otras aplicaciones de IL-6 o citocinas relacionadas.

Las composiciones farmacéuticas del invento son preparadas para administración mezclando la proteína quimérica o sus compuestos análogos con vehículos y/o estabilizadores y/o excipientes fisiológicamente aceptables, y son preparadas en una forma de dosificación, tal como, por ejemplo, mediante liofilización en viales de dosificación. El método de administración puede ser mediante cualquiera de los modos aceptados de administración para agentes similares y dependerá del estado que se trata, por ejemplo, intravenosa, intramuscular o subcutáneamente, mediante inyección local o aplicación tópica, continuamente por infusión, etc. La cantidad de compuesto activo que se va a administrar dependerá de la vía de administración, la enfermedad que se trata y el estado del paciente. Por ejemplo, la inyección local requerirá una cantidad menor de la proteína, en relación con el peso corporal, que la infusión intravenosa.

El presente invento también se refiere a usos de la proteína quimérica del invento o sus compuestos análogos o mezclas de los mismos para el tratamiento de cánceres, para trasplantes de médula ósea, para aumentar la hematopoyesis, especialmente la trombopoyesis, para el tratamiento de estados neurológicos, para la protección de tejidos hepáticos en pacientes con enfermedades necróticas debidas a productos químicos (por ejemplo, tetracloruro de carbono, alcohol o paracetamol) u otras causas (por ejemplo, víricas o quirúrgicas) y para uso en otras aplicaciones de IL-6 o citocinas relacionadas. Asimismo, el presente invento también se refiere a la proteína quimérica o compuestos análogos de la misma o mezclas de los mismos para uso en la preparación de medicamentos para el tratamiento de las enfermedades anteriormente mencionadas o para uso en las indicaciones anteriormente expuestas.

Además de los métodos de tratamiento anteriormente mencionados, también se contemplan procedimientos ex-vivo y terapia génica con la quimera y/o el DNA que la codifica.

El presente invento será ahora descrito con mayor detalle en los ejemplos no restrictivos siguientes y los dibujos adjuntos.

Ejemplo 1 Construcción del vector de expresión de la quimera sIL-6R\deltaVal/IL-6

En la Figura 1 se muestra un diagrama operativo esquemático de las operaciones realizadas para construir el vector de expresión que porta la secuencia que codifica la proteína quimérica sIL-6R\deltaVal/IL-6, incluyendo todos los diversos vectores de partida e intermedios, los diversos reactivos y las etapas de reacción. Este procedimiento de construcción consistía esencialmente en la utilización de técnicas bien conocidas en este campo técnico para la construcción de los vectores de expresión elegidos (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1.989). En resumen, el procedimiento fue el siguiente:

Un banco de cDNAs de células de carcinoma de mama humano T47D fue clonado en el bacteriófago lambda (\lambda) gt11 y fue explorado con sondas oligonucleotídicas procedentes de la secuencia de IL-6R de Yamasaki et al. (1.988). Se aisló un clon de cDNA de \lambdagt11 que tenía la secuencia de codificación completa del IL-6R humano. El inserto fue escindido de \lambdagt11 por EcoRI y fue clonado en el sitio de clonación múltiple (MCS; del inglés, multiple cloning site) del fagómido BlueScript pBS/SK de E.coli (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California, EE.UU.). Este plásmido pBS/SK-IL-6R (Figura 1) fue cortado por EcoRI y fue luego limado por sus extremos y vuelto a cortar con EcoRV para aislar el fragmento 5' de IL-6R, de 959 pares de bases (bp; del inglés, base pairs), que finalizaba en el sitio EcoRV de IL-6R (coordenada 1.203). Este fragmento, extraído de una electroforesis en gel de agarosa, fue clonado en un nuevo vector pBS/SK abierto en el EcoRV del MCS (pBS/SK-sIL-6R-RV en la Figura 1).

El anteriormente indicado DNA pBS/SK-IL-6R previamente obtenido fue sometido a una reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction) para multiplicar un fragmento de 368 bp entre el cebador directo 1.137-1.156 y el cebador inverso 1.505-1.488. El cebador inverso fue sintetizado con un sitio EcoRI inmediatamente detrás del codón para la valina-356 del IL-6R (véase la Figura 1), ya que se había determinado previamente que este resto de valina era el aminoácido carboxi-terminal de la forma natural del sIL-6R soluble excretado en la orina humana (Novick et al., 1.990; Oh et al., 1.996; Patente de EE.UU. en propiedad conjunta nº 5.216.128 y Patente EP nº EP 413908 B1). El producto de PCR fue cortado por EcoRV y por EcoRI y fue ligado en pBS/SK-sIL-6R-RV entre el sitio EcoRV de IL-6R y el sitio EcoRI del MCS (Figura 1). El plásmido resultante pBS-sIL-6R-\deltaVal-RI fue luego acortado para eliminar secuencias 5' no traducidas, por ligación del sitio HindIII de MCS con el sitio NcoI en el par de bases 410 de IL-6R (habiéndose limado primero los extremos de ambos sitios), para producir pBS-sIL-6R-\deltaVal-RI-NcoI (Figura 1).

La secuencia de IL-6 procedía del plásmido pKK\beta2-7, el cual, como ha sido previamente descrito (Chen et al., 1.988), fue construido por inserción del cDNA de IFN-\beta2/IL-6 cortado con BstNI (Zilberstein et al., 1.986), en el sitio EcoRI del vector de expresión pKK223-3 de E. coli (Pharmacia, Uppsala, Suecia) usando un oligonucleótido sintético con un sitio EcoRI seguido de un codón de metionina y el codón para Prolina-29 de IL-6 y acabando en un sitio BstNI (EcoRII). El inserto de cDNA de IL-6 del plásmido pKK\beta2-7 acaba 7 pares de bases detrás del codón de terminación en un sitio NlaIV y va seguido 11 bp después por el sitio HindIII del vector pKK223-3 (Figura 1). El DNA de pKK\beta2-7 fue cortado con HindIII, limado por sus extremos y vuelto a cortar con EcoRI, y el cDNA de IL-6 fue insertado en pBS-sIL-6R\deltaVal-RI-NcoI con objeto de fusionar la secuencia madura de IL-6 (comenzando en la prolina-29) inmediatamente detrás de la valina-356 del IL-6R y separada por sólo 3 codones (Glu-Phe-Met). El plásmido resultante pBS/SK-sIL-6R/IL-6 (Figura 1) fue luego vuelto a cortar en los sitios SalI y NotI de su MCS, y el inserto fue clonado en el sitio EcoRV de pcDNA3 (Invitrogen Corporation, San Diego, California, EE.UU.). El plásmido resultante pCDNA3-sIL-6R/IL-6 (Figura 1) contiene el inserto cadena abajo del potente promotor de citomegalovirus (CMV) y seguido de un sitio de poliadenilación que asegura una eficaz transcripción de la quimera sIL-6R\deltaVal/IL-6. La conservación del extremo 5' del sIL-6R en la quimera asegura que, tras la expresión en células de mamífero, la función del péptido señal y el procesamiento del extremo N de la proteína quimérica serán como en el sIL-6R natural.

Como se indicó anteriormente, una característica ventajosa de la construcción sIL-6R\deltaVal/IL-6 es que es esencialmente la fusión de la forma natural de sIL-6R y la forma natural de IL-6 como existen en el cuerpo humano y sin secuencias polipeptídicas extrañas. Sin embargo, la conservación del sitio EcoRI en la construcción sIL-6R\deltaVal/IL-6 (Figura 1) permite introducir fácilmente segmentos polipeptídicos conectores entre los restos sIL-6R e IL-6. También se construyó una de tales construcciones (sIL-6R\deltaVal/L/IL-6) con la secuencia conectora de 13 aminoácidos Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met introducida entre Val-356 de sIL-6R y Pro-29 de IL-6.

Ejemplo 2 Expresión de la quimera sIL-6R\deltaVal/IL-6 en células humanas

Utilizando esencialmente técnicas estándares de cultivo de células de mamífero, transfección celular y análisis de las células transfectadas en cuanto a la expresión de la recién introducida secuencia de DNA que se va a expresar (para los procedimientos, véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1.989), se usó la anterior construcción plasmídica (Ejemplo 1) para transfectar células humanas y se evaluó su expresión en ellas. En resumen, se emplearon los procedimientos siguientes:

Se transfectaron células HEK 293 humanas (ATCC CRL 1573, células primarias transformadas de riñón embrionario humano) con el DNA de la construcción plasmídica pCDNA3-sIL-6R/IL-6 (expuesto en el Ejemplo 1 anterior). Los cultivos de HEK 293 en fase logarítmica fueron tratados con tripsina y sembrados en placas Nunc de 9 cm (2,5x10^{6} células/placa). Un día más tarde, se llevó la transfección a cabo con 10 \mug de DNA de pCDNA3-sIL-6R/IL-6 mediante el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico (Sambrook et al., 1.989) y, 1 hora más tarde, se cambió el medio por DMEM-suero de ternera fetal (FCS; del inglés, fetal calf serum) al 10% y se continuó el cultivo durante 16 horas más. Después de cambiar el medio por DMEM-FCS al 2%, las proteínas secretadas fueron recogidas durante dos periodos consecutivos de 48 horas. Se eliminaron los fragmentos celulares por centrifugación a 1.000 rpm durante 10 minutos y se analizó el sobrenadante mediante un ensayo ELISA para sIL-6R usando anti-sIL-6R policlonal de conejo y el anticuerpo monoclonal (McAB; del inglés, monoclonal antibody) 17.6 de ratón (Novick et al., 1.991). Se halló una concentración de 1,2 \mug/ml de equivalentes de sIL-6R, lo que resulta indicativo de una expresión muy eficaz de la proteína quimérica sIL-6R/IL-6 en las células humanas transfectadas.

La inmunopurificación de la proteína quimérica (sIL-6R/IL-6) secretada fue llevada a cabo con el anticuerpo monoclonal 34.4, específico para un epítopo del dominio extracelular del sIL-6R humano (Novick et al., 1.991; Halimi et al., 1.995). Se cultivaron los hibridomas 34.4 en la cavidad peritoneal de ratones y se obtuvo la fracción inmunoglobulínica (Ig) del fluido ascítico mediante precipitación con sulfato amónico. Se utilizó Affigel-10 (Bio-Rad Labs, Richmond, California, EE.UU.) para inmovilizar el McAB 34.4 (15 mg de Ig copulados con 1 ml de Affigel-10). Los sobrenadantes que contenían las proteínas secretadas de las células HEK 293 transfectadas mediante pCDNA3-sIL-6R/IL-6 fueron dejados adsorber por columnas de McAB 34.4 (0,3 ml de columna para 15 ml de sobrenadante). Después de un lavado con PBS, las proteínas unidas fueron eluidas con ácido cítrico 25 mM, pH de 2,5, y fueron luego inmediatamente neutralizadas con tampón Hepes 1 M, pH de 8,5, y sometidas a diálisis durante la noche (aproximadamente 8-12 horas) frente a PBS.

El análisis, por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE; del inglés, polyacrylamide gel electrophoresis) con SDS, de la proteína inmunopurificada mostró una sola banda proteica teñida por azul de Coomasie (Figura 2). El peso molecular de la proteína era 85 kilodáltones, como se esperaba de la fusión de las formas glicosiladas de sIL-6R\deltaVal (60 kDa, como mostraron Oh et al., 1.996) e IL-6 glicosilada (23-26 kDa, como mostraron Zilberstein et al., 1.986). La secuencia de aminoácidos de sIL-6R/IL-6 tiene 543 aminoácidos, lo cual, después del procesamiento de los péptidos señal, permite predecir una proteína de 524 aminoácidos o aproximadamente 58 kDa (Figura 3). El tamaño mucho mayor de la quimera sIL-6R/IL-6 producida a partir del DNA recombinante en células humanas indica que la glicosilación representa una porción considerable de la molécula.

Ejemplo 3 La quimera sIL-6R/IL-6 detiene el crecimiento e induce la diferenciación de células de melanoma metastásicas

El clon F10.9 derivado de células de melanoma B16 forma tumores muy metastásicos en ratones C57Black/6, muriendo los animales en 2-3 meses por metástasis pulmonares (Katz et al., 1.995). La adición de la proteína quimérica sIL-6R/IL-6 al cultivo de células F10.9 produce un cambio morfológico profundo en las células y una detención de su crecimiento (Figura 4). Las células F10.9 tratadas con la quimera se vuelven alargadas, con prolongaciones dendríticas salientes, lo que hace recordar a la diferenciación de tipo fusiforme de células gliales o melanocitos embrionarios.

El crecimiento de las células fue cuantificado 4 días después de la siembra de 3x10^{3} células en los pocillos de una microplaca de 96 pocillos, en 0,2 ml de medio RPMI 1640 con FCS al 10%. Las células fueron fijadas con glutaraldehído al 12,5% durante 30 minutos, lavadas con agua y teñidas con violeta cristal al 0,1% durante 30 minutos. Después de un lavado y un secado a fondo, se extrajo el colorante con ácido acético al 10% y se determinó la densidad óptica a 540 nm. La quimera producía una inhibición del crecimiento, dependiente de la dosis, con una inhibición completa del crecimiento para concentraciones tan bajas como 10 ng/ml de la proteína quimérica (p85) (Figura 5). Tanto la proteína quimérica sIL-6R\deltaVal/IL-6 como la sIL-6R\deltaVal/L/IL-6 (quimera con el conector más largo entre los restos sIL-6R e IL-6; véase el Ejemplo 1) eran similarmente activas. Este resultado también sirve para mostrar que el péptido conector entre los restos sIL-6R e IL-6 de la quimera no es esencial para la actividad de la quimera ya que la anterior quimera sIL-6R\deltaVal/IL-6 tiene sólo un cortísimo conector de 3 aminoácidos mientras que la anterior quimera sIL-6R\deltaVal/L/IL-6 tiene un péptido conector más largo, de 13 aminoácidos, pero ambas tienen esencialmente la misma actividad para inhibir el crecimiento de las células metastásicas. Por contraste, ni la IL-6 sola ni el sIL-6R\deltaVal solo inhiben el crecimiento de estas células de melanoma (Figura 6), lo que demuestra la actividad excepcional de la proteína quimérica sIL-6R/IL-6 (p85). Para obtener un efecto similar, se requiere una mezcla de 200-400 ng/ml de IL-6 y 125 ng/ml de sIL-6R\deltaVal (Figura 6). Cuando se calcula en concentraciones molares, la inhibición máxima de células F10.9 requería 7,5 nM de IL-6 y 2 nM de sIL-6R\deltaVal frente a sólo 0,12 nM de la quimera sIL-6R/IL-6.

La actividad de la proteína quimérica p85 sIL-6R/IL-6 en cuanto a inhibir el crecimiento fue seguida durante la inmunopurificación en columnas de McAB 34.4 (véase el Ejemplo 2). El patrón de actividad se correspondía con la intensidad de la banda p85 vista en las diferentes fracciones de la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la Figura 2.

Ejemplo 4 La quimera sIL-6R/IL-6 es esencial para el injerto de células trasplantadas de médula ósea humana

El injerto de células madre hematopoyéticas procedentes de médula ósea humana puede ser estudiado después del trasplante a ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) (Vormoor et al., 1.994). Se sometieron ratones SCID-NOD a una irradiación subletal y se les inyectaron 3x10^{5} células CD34^{+} humanas de médula ósea en la vena de la cola. Antes de la inyección, las células CD34^{+} purificadas fueron mantenidas durante 3 días en cultivos líquidos con diferentes combinaciones de citocinas. Después de un mes, se sacrificaron los ratones y se extrajeron sus huesos para recoger las células de médula ósea. El injerto de células humanas en los ratones SCID-NOD receptores fue evaluado mediante hibridación por transferencia Southern con DNA repetitivo humano.

Se ha hallado que el factor de células madre (SCF, factor steel o ligando de ckit) y el ligando de Flt3 (ligando del receptor de tirosina cinasa flt3/flk2) son importantes para la supervivencia y la proliferación de las células madre hematopoyéticas y pluripotenciales más primitivas, capaces de un injerto de larga duración en la médula ósea receptora (McKenna et al., 1.995). Como se ve en la Figura 7, estos dos factores, por sí mismos, eran insuficientes para provocar el injerto de células humanas en la médula ósea de los ratones SCID-NOD receptores. Se requería la adición de la proteína quimérica sIL-6R/IL-6 para que se detectara el injerto con niveles significativos. En una concentración de 100 ng/ml, la quimera sIL-6R/IL-6 era mucho más activa que la IL-6 (50-200 ng/ml) y el sIL-6R (125-1.250 ng/ml) aislados (Figura 7). La necesidad de la quimera sIL-6R/IL-6 indica que esta proteína es esencial para la supervivencia y la proliferación de las células madre hematopoyéticas y pluripotenciales no comprometidas, que pueden asentarse en, y repoblar, el ambiente de la médula ósea, lo que indica que esta proteína puede ser útil en protocolos clínicos para trasplantes de médula ósea.

Ésta es la primera demostración de que la quimera sIL-6R/IL-6 tiene las al menos dos actividades recién halladas siguientes:

(i) Cuando se añade junto con los factores SCF y ligando de Flt3 a células progenitoras primitivas hematopoyéticas humanas, promueve su supervivencia y su proliferación; y

(ii) Es activa (y aparentemente esencial) en un modelo in vivo de un trasplante de médula ósea humana a ratones inmunodeficientes.

Ejemplo 5 La quimera sIL-6R/IL-6 es activa sobre células madre hematopoyéticas primitivas muy purificadas

Se sometieron células mononucleares de sangre de cordón umbilical humano al fraccionamiento de células mononucleares de baja densidad (NMC) en Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) seguido de un sistema mini-MACS (Miltney Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania), para preparar una población de células CD34^{+} con una pureza del 80%. Estas células fueron luego hechas pasar sobre anticuerpo monoclonal anti-CD38 inmovilizado o fueron separadas mediante un separador de células activadas por fluorescencia, y la población CD34^{+}CD38^{-}, que correspondía a aproximadamente el 0,1% de las células originales, fue recuperada. Estas células madre purificadas (20.000 células) fueron dispuestas en cultivos en suspensión en 0,5 ml de medio RPMI, suero de ternera fetal (FCS) al 10%, albúmina sérica bovina al 1%, que contenía 50 ng/ml de factor de células madre (SCF) y 100 ng/ml de ligando de flt3 (FL; del inglés, flt3-ligand) (ambos de R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, EE.UU.). La mitad de los cultivos fueron complementados con 100 ng/ml de quimera sIL-6R/IL-6 y los otros fueron cultivados sin ella. La incubación fue a 37°C en CO_{2} al 5% durante 6 días. El número de células repobladoras de médula ósea fue evaluado mediante la inyección intravenosa de todas las células de estos cultivos in vitro a ratones NOD-SCID subletalmente irradiados. Los ratones fueron mantenidos en condiciones exentas de gérmenes. Después de 6 semanas, se sacrificaron los ratones y se recuperó la médula de sus huesos largos. Estas células de médula ósea (BM; del inglés, bone marrow) fueron sembradas en placas de metilcelulosa semisólida al 0,9% con FCS al 30%, \beta-mercaptoetanol 50 \muM, 50 ng/ml de SCF, 5 ng/ml de IL-3, 5 ng/ml de factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF; del inglés, granulocyte macrophage colony-stimulating factor) y 6 u/ml de eritropoyetina (todos de R&D Systems). Los cultivos también contenían suero humano, condiciones que evitan el crecimiento de colonias de ratón. Los resultados (Tabla IV) indicaron que la adición de quimera sIL-6R/IL-6 a los cultivos en suspensión produce un aumento de 30-50 veces en el número de células formadoras de colonias (CFU) humanas recuperadas de los ratones trasplantados en comparación con el SCF y el FL solos. Esto representa un gran aumento del número de células madre repobladoras de SCID presentes en los cultivos en suspensión el día 6 en comparación con el día 0. En ausencia de la quimera sIL-6R/IL-6, el SCF y el FL no produjeron aumento alguno del número de células madre durante los 6 días de cultivo en suspensión. El DNA de las células de BM recuperadas de los ratones NOD/SCID que habían recibido el trasplante fue analizado por transferencia Southern como en el Ejemplo 4. La cantidad de DNA humano recuperado fue 10 veces mayor cuando los ratones recibieron las células cultivadas con la quimera en comparación con la recepción sin
quimera.

Los progenitores de CFU de la médula ósea de ratones NOD/SCID, como se muestra en la Tabla IV, dieron lugar a células hematopoyéticas de diferentes linajes mieloides (macrófagos y granulocitos) así como de linajes eritroides y linfoides (por ejemplo, CD19^{+}, CD56^{+}) sólo cuando las células sanguíneas humanas habían sido cultivadas con la quimera sIL-6R/IL-6 antes del trasplante.

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TABLA IV Células madre humanas capaces de repoblar la médula ósea de ratones NOD/SCID

\begin{minipage}[t]{60mm} Adiciones durante el cultivo en suspensión de células CD34^{+}CD38^{-} humanas de sangre de cordón umbilical \end{minipage}	Días de cultivo	\begin{minipage}[t]{60mm} Número de colonias hematopoyéticas humanas formadas a partir de BM de ratones NOD/SCID trasplantados \end{minipage}
	0	4
SCF + FL	6	2-3
SCF + FL + sIL-6R/IL-6	6	50-100

En experimentos adicionales se comparó el efecto de sIL-6R/IL-6 sobre la población CD34^{+}CD38^{+} de sangre de cordón umbilical con el efecto sobre las células madre CD34^{+}CD38^{-} muy purificadas. La expansión in vitro de las células muy purificadas fue mucho más intensamente potenciada por sIL-6R/IL-6 que la de las células menos purificadas (Tabla V). Esto indica que las células madre más primitivas son la diana preferente del efecto de sIL-6R/IL-6 sobre la expansión celular.

TABLA V Expansión in vitro de células madre hematopoyéticas

Población celular sembrada	Número de células el día 6	Número de células el día 6
(20.000 células)	con SC + FL	con SC + FL + sIL-6R/IL-6
Experimento 1
CD34^{+}CD38^{+}	780.000	675.000 (x 0,86)
CD34^{+}CD38^{-}	42.000	153.000 (x 3,6)
Experimento 2
CD34^{+}CD38^{+}	330.000	507.000 (x 1,5)
CD34^{+}CD38^{-}	3.000	18.000 (x 6,0)

Se midió el mantenimiento in vitro de la actividad repobladora de médula ósea aumentando la duración de la suspensión de los cultivos de células madre CD34^{+}CD38^{-} muy purificadas antes de la inyección a los ratones NOD/SCID. El injerto fue evaluado por la proporción de DNA humano en la médula ósea de los ratones receptores 6 semanas después de la inyección intravenosa de las células cultivadas. Cuando se añadió sIL-6R/IL-6 a SCF y FL durante los cultivos, aún se observó un elevado injerto (> 1% de DNA humano) después de dos semanas de cultivo, y el injerto era mayor que con las células no cultivadas. Por contraste con esto, experimentos con cultivos que contenían SCF, FL, GM-CSF e IL-3 han mostrado que no quedan células repobladoras de SCID después de una semana de cultivo (M. Bhata et al., J. Exp. Med. 186, 619-624, 1.997).

Estos resultados muestran que sIL-6R/IL-6 permite la expansión y el mantenimiento de células madre primitivas humanas, capaces de injertarse en médula ósea receptora. Las células madre permanecen activas en un estado indiferenciado mientras se multiplican. La quimera sIL-6R/IL-6 proporciona un nuevo medio para cultivar células hematopoyéticas para injertos. Esto también puede permitir, en protocolos de terapia génica, usar vectores retrovíricos para introducir genes en células madre para injertos. Hasta ahora, esto no ha sido posible con células madre humanas porque no se podían mantener in vitro estas células primitivas en un estado cíclico, como se requiere para la integración de DNA retrovírico. La quimera sIL-6R/IL-6 resuelve este problema.

Ejemplo 6 Producción de la quimera IL-6R/IL-6 en células CHO

Se cotransfectaron células de ovario de hámster chino (CHO; del inglés, chinese hamster ovary) con DNA del plásmido sIL-6R/IL-6 pcDNA3, como en la Figura 1, junto con DNA del plásmido pDHFR del modo descrito por Mory et al. (DNA 5, 181-193, 1.986). Entre los transfectantes que crecían en metotrexato 50 nM, se aisló el clon L12-[IL-6R/IL-6]. Se halló que este clon era estable durante muchas pasadas y que los cultivos semiconfluentes secretaban rutinarimente cantidades de 2,5 \mug/ml de la quimera IL-6R/IL-6 al medio de cultivo.

Para la purificación de la quimera IL-6R/IL-6, se concentraron 3,25 litros del medio de cultivos del clon L12 en suero bovino al 2%, hasta 200 ml. Se dejó que este concentrado fuera adsorbido por una columna de anticuerpo monoclonal 34.4 anti-sIL-6R humano copulado a glóbulos de Affigel 10, de 18 ml de capacidad, y se realizó la elución del modo descrito (Novick et al., Hybridoma 10, 137-146, 1.991). El producto de elución con ácido cítrico 25 mM fue inmediatamente neutralizado con tampón Hepes 1 M, pH de 8,6. Las proteínas fueron concentradas hasta una concentración final de 1 mg/ml usando una membrana Amicon con un corte de exclusión de 10 kDa. Tras una SDS-PAGE, se observó una sola banda de 85 kDa que correspondía a la quimera IL-6R/IL-6. Se demostró la glicosilación por la reducción del tamaño después de un tratamiento con glicosidasa (Boehringer, Mannheim). Se halló que la actividad biológica de la quimera IL-6R/IL-6 producida en células CHO era estable durante al menos 5 meses a 4°C. Rutinariamente, el almacenamiento es a -70°C.

Ejemplo 7 Afinidad de la quimera IL-6R/IL-6 por gp130

Se compararon la quimera IL-6R/IL-6 producida en células CHO y una mezcla de IL-6 y sIL-6R humanos en cuanto a su unión a la forma soluble de gp130 (sgp130), que es la segunda cadena del sistema receptor para IL-6 (véase la introducción). Se revistió una placa de microtitulación de 96 pocillos (Nunc) con anticuerpo monoclonal anti-gp130 humano y se añadieron 50 ng/ml de sgp130 (ambos de R&D Systems, Minneapolis, EE.UU.). Después de un lavado en disolución salina tamponada con fosfato, se añadió la quimera IL-6R/IL-6 a diferentes pocillos en diferentes concentraciones que variaban de 0,1 a 50 ng/ml. A pocillos distintos se añadió rhuIL-6 (Ares-Serono, Ginebra) en una concentración de 500 ng/ml, junto con sIL-6R\deltaVal humano en concentraciones de 2 a 500 ng/ml. Después de una incubación durante la noche a 4°C, se añadió un anti-IL-6R policlonal de conejo (Oh et al., Cytokine 8, 401-409, 1.996) seguido de Ig anti-conejo generada en cabra y conjugada con peroxidasa de rábano picante que permitía la detección por una reacción coloreada (Sigma, St. Louis). La Figura 8 muestra una representación de Scatchard de los resultados. Se halló que la afinidad de la quimera IL-6R/IL-6 por gp130 era más de 4 veces mayor que la de las dos partes de la molécula añadidas separadamente (6,3x10^{-11} M frente a 2,6x10^{-10} M). Este resultado está de acuerdo con, y explica, la mayor actividad de la quimera en comparación con la combinación IL-6 + sIL-6R sobre el melanoma y sobre células hematopoyéticas (Figura 9 y Ejemplo 4).

Ejemplo 8 La quimera IL-6R/IL-6 protege de la hepatotoxicidad

La inyección de tetracloruro de carbono (CCl_{4}) a ratones produce una grave necrosis del hígado que conduce a la muerte de los animales (T. F. Slater et al., Philos. Trans. R. Soc. Biol. Sci. 311, 633-645, 1.985). Cuando ratones que son genéticamente deficientes en IL-6 (IL-6^{-/-}) reciben dosis relativamente pequeñas de CCl_{4} (2-3 ml/kg de peso corporal) por inyección intraperitoneal, los índices de mortalidad a las 24 horas se aproximan al 70% (Figura 10). La inyección de la quimera IL-6R/IL-6, producida en células CHO, una hora antes de la inyección de CCl_{4} y de nuevo 4 horas después de la inyección de CCl_{4} protege a los animales y no se ven muertes a las 24 horas. Por contraste, la rhuIL-6 libre inyectada similarmente no ejerce efecto alguno (Figura 10). La quimera IL-6R/IL-6 era eficaz en dosis de 2-3 \mug por inyección, dosis que, en relación molar, es 10 veces menor que la dosis de IL-6, que no era eficaz. Con dosis mayores de CCl_{4} (por ejemplo, 3,5 ml/kg en la Figura 10), la quimera también resultó protectora, siendo la mortalidad menor que con IL-6 o sin citocina. La diferencia de mortalidad entre los ratones tratados con quimera y los ratones no tratados, habiendo recibido ambos la misma estimulación de CCl_{4}, fue significativa para p < 0,01. La observación histológica de secciones hepáticas teñidas con hematoxilina-eosina confirmó que el CCl_{4} producía necrosis de tejido hepático y que la quimera IL-6R/IL-6 protege a los hepatocitos de este efecto tóxico químico
(no mostrado).

Una aplicación de la quimera IL-6R/IL-6 puede ser la protección del tejido hepático de pacientes con enfermedades necróticas debidas a productos químicos (por ejemplo, alcohol y paracetamol) u otras causas (por ejemplo, hepatitis vírica).

Ejemplo 9 Construcción y actividad de la quimera IL-6/sIL-6R\deltaVal

Se construyó una molécula quimérica en que el resto IL-6 está en el extremo N mientras que el resto sIL-6R está en el extremo C. Se cortó el plásmido pBS-sIL-6R\deltaVal en Sau3a (bp 1.086) y en el HindIII que sigue al codón de terminación después de Val-356 (véase el Ejemplo 1). Se sintetizó un conector que contenía tres sitios de restricción: SpeI, SmaI y BamHI, del modo siguiente:

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100

Este sitio Sau3a de sIL-6R fue ligado al BamHI del conector y fue clonado en el sitio de clonación múltiple de un plásmido Bluescript pBS SK. La secuencia de IL-6 fue multiplicada por PCR del DNA de pKK\beta2-7 utilizando los cebadores (codón de iniciación subrayado):

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101

\newpage

El producto de PCR cortado con SpeI y HaeIII fue introducido entre los sitios SpeI y SmaI del anterior conector. Se sintetizó otro conector BamHI-NcoI con un SmaI interno, del modo siguiente:

102

Éste fue clonado entre el BamHI del conector previo y el NcoI 1.464 de la secuencia de IL-6R. Luego se introdujo un fragmento de IL-6R, de SmaI 867 a NcoI 1.464, entre el SmaI del segundo conector y el NcoI de IL-6R. El DNA quimérico resultante fue secuenciado y vuelto a clonar en pCDNA3 para la expresión en células HEK 293 humanas. La secuencia de aminoácidos de esta quimera IL-6-IL-6R 3e se muestra en la Figura 11 (conector subrayado). La quimera 3e fue purificada por cromatografía de afinidad sobre un anticuerpo monoclonal anti-IL-6 (como en Novick et al., Hybridoma 8, 561-567, 1.989). En SDS-PAGE se observó una banda de 75 kDa.

La actividad biológica de la quimera IL-6-IL-6R 3e para inhibir el crecimiento de células de melanoma F10.9 se muestra en la Figura 12. Es claramente activa en comparación con la quimera IL-6R/IL-6 (preparación 1-3) en el mismo experimento, aunque se requiere más para una inhibición del crecimiento del 50%.

Se prepararon dos mutantes de IL-6R/IL-6 en que los aminoácidos His-280 y Asp-281 del resto IL-6R de IL-6R/IL-6 (Figura 3) estaban cambiados por Ser y Val, respectivamente, mediante mutagénesis por PCR (Mutante 39 o HD) y en que, además, Asn-230 estaba cambiado por Asp (Mutante NHD). Como puede verse en la Figura 12, estos dos mutantes casi no tenían actividad en comparación con las quimeras IL-6R/IL-6 e IL-6-IL-6R. Puesto que, en IL-6R, estos aminoácidos interaccionan con gp130, como se muestra por modelado molecular (Halimi et al., 1.995), esto demuestra que la quimera sIL-6R/IL-6 conserva este sitio esencial de interacción.

La quimera IL-6-IL-6R 3e carece del dominio de tipo inmunoglobulina de IL-6R que está presente en IL-6R/IL-6. Sin embargo, la sola eliminación de este dominio Ig de IL-6R/IL-6 no reducía su actividad biológica sobre células F10.9. La unión de la quimera IL-6-IL-6R 3e a gp130 era aproximadamente el 30% de la unión de otra quimera IL-6R/IL-6 (no mostrado). Esta menor unión está de acuerdo con la menor actividad sobre el crecimiento de células de melanoma.

Estos resultados demuestran que el bloqueo del extremo carboxílico de IL-6 por fusión con sIL-6R por medio de un conector conserva una buena actividad biológica en dichas nuevas quimeras.

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K. Yamasaki, T. Taga, Y. Hirata, H. Yawata, Y. Kawanishi, B. Seed, T. Taniguchi, T. Hirano y T. Kishimoto. Cloning and expression of the human Interleukin-6 (BSF-2/Interferon beta-2) receptor. Science, 241: 825-828, 1.988.

A. Zilberstein, R. Ruggieri, H. J. Korn y M. Revel. Structure and expression of cDNA and genes for human interferon-beta-2, a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines. EMBO J., 5: 2.529-2.537, 1.986.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Yeda Research and Development Co. Ltd.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Weizmann Institute of Science, P. O. B. 95

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Rehovot

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Israel

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 76100

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: 972-8-9344093

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: 972-8-9470739

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: REVEL, Michael

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Beit Brazil 5, Weizmann Institute of Science

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Rehovot

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Israel

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 76100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: CHEBATH, Judith

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Rehov Miller 13

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Rehovot

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Israel

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 76284

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: LAPIDOT, Tsvee

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Rehov Boxer 6

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Ness-Ziona

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Israel

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 74046

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: KOLLET, Orit

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Rehov Ramat Chen 14

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Ramat Gan

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Israel

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 52232

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DEL INVENTO: Proteína quimérica de ligando/receptor soluble de interleucina 6, compuestos análogos

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

de la misma y usos de los mismos

\hfill

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Compatible con ordenador personal IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn, emisión nº 1.0, versión nº 1.30 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: IL 121284

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 10 de Julio de 1.997

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: IL 122818

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 30 de Diciembre de 1.997

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Phe Gly Ala Gly Leu Val Leu Gly Gly Gln Phe Met}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGTGGGCC CGGGGTGGCG GGACCCGGGC CCCACCGCCC CTAG

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACTAGTAGC TATGAACTCC TTCTC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGGCCATTT GCCGAAGAGC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 62 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 5:

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gly Gly Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 543 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 471 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

7

Claims (19)

1. Una proteína quimérica glicosilada (sIL-6R/IL-6) de receptor soluble de interleucina 6 (sIL-6R)-interleucina 6 (IL-6) y compuestos análogos biológicamente activos de la misma que comprenden un producto proteico de fusión entre sIL-6R e IL-6, conservando dicha sIL-6R/IL-6 y dichos compuestos análogos de la misma el mismo patrón de glicosilación que las secuencias presentes en la naturaleza cuando se expresan en células de mamífero, en que sIL-6R e IL-6 son las formas presentes en la naturaleza o se caracterizan por adiciones de aminoácido de hasta 20 aminoácidos, supresiones de hasta 30 aminoácidos y/o sustituciones de hasta 30 aminoácidos con respecto a las secuencias presentes en la naturaleza y en que dicho sIL-6R está fusionado a IL-6 directamente o a través de una molécula conectora peptídica que es un tripéptido con la secuencia E-F-M (Glu-Phe-Met) o un péptido de 13 restos de aminoácido con la secuencia E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met).

2. La proteína sIL-6R/IL-6 quimérica de acuerdo con la Reivindicación 1, que es la aquí denominada sIL-6R\deltaVal/
IL-6 que tiene un tripéptido de secuencia E-F-M entre la Val-356 C-terminal de sIL-6R y la Pro-29 N-terminal de IL-6, teniendo dicha proteína quimérica la secuencia expuesta en la Figura 3.

3. La proteína sIL-6R/IL-6 quimérica de acuerdo con la Reivindicación 1, que es la aquí denominada sIL-6R\delta
Val/L/IL-6 que tiene un conector peptídico de 13 aminoácidos, de secuencia E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M, entre la Val-356 C-terminal de sIL-6R y la Pro-29 N-terminal de IL-6, teniendo dicha proteína quimérica la secuencia expuesta en la Figura 3 en que el tripéptido de secuencia E-F-M entre las posiciones 357-359 de la Figura 3 está sustituido por dicha secuencia peptídica de 13 aminoácidos.

4. La proteína sIL-6R/IL-6 quimérica de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, en que dicha proteína es producida in vitro en células de mamífero en una forma totalmente procesada.

5. La proteína sIL-6R/IL-6 quimérica de acuerdo con la Reivindicación 4, en que dicha proteína es producida en células humanas.

6. La proteína sIL-6R/IL-6 quimérica y compuestos análogos biológicamente activos de la misma de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, en que dicha proteína quimérica y dichos compuestos análogos se caracterizan por ser capaces de inhibir el crecimiento de células cancerosas muy malignas, provocar el injerto in vivo de células hematopoyéticas humanas en trasplantes de médula ósea o proteger al hígado de agentes hepatotóxicos.

7. La proteína sIL-6R/IL-6 quimérica y compuestos análogos biológicamente activos de la misma de acuerdo con la Reivindicación 6, en que dichas células cancerosas malignas son células de melanoma malignas.

8. Una secuencia de DNA que codifica una proteína sIL-6R/IL-6 quimérica y compuestos análogos biológicamente activos de la misma de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5.

9. Un vector de DNA que comprende la secuencia de DNA de acuerdo con la Reivindicación 8, siendo dicho vector adecuado para la expresión de dicha proteína quimérica en células de mamífero.

10. El vector de DNA de acuerdo con la Reivindicación 9, en que dicho vector es adecuado para la expresión de dicha proteína quimérica en células humanas.

11. El vector de DNA de acuerdo con la Reivindicación 9 ó 10, en el que, cuando dicho vector se expresa en dichas células, la proteína quimérica expresada tiene una secuencia que permite el procesamiento completo de la proteína quimérica por dichas células y la secreción de la proteína quimérica totalmente procesada desde las células al medio de cultivo en que se desarrollan dichas células.

12. Células de mamífero transformadas que contienen el vector de DNA de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 9 a 11, que son capaces de expresar la secuencia de proteína quimérica sIL-6R/IL-6 portada por dicho vector y de procesar totalmente la proteína expresada y secretarla al medio de cultivo en que se desarrollan dichas células.

13. Un método para producir una proteína quimérica o compuestos análogos biológicamente activos de la misma de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, que comprende cultivar las células transformadas de acuerdo con la Reivindicación 12 bajo unas condiciones adecuadas para la expresión, el procesamiento y la secreción de dicha proteína o dichos compuestos análogos al medio de cultivo en que se desarrollan dichas células; y purificar dicha proteína o dichos compuestos análogos de dicho medio de cultivo.

14. El método de acuerdo con la Reivindicación 13, en el que la purificación es llevada a cabo por cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales específicos para sIL-6R.

15. Uso de la proteína sIL-6R/IL-6 quimérica o compuestos análogos de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, sales de cualquiera de los mismos, y mezclas de los mismos, como un inhibidor de células cancerosas ex vivo.

16. El uso de acuerdo con la Reivindicación 15, en el que las células cancerosas son células de melanoma muy malignas.

17. Una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, la proteína sIL-6R/IL-6 quimérica o un compuesto análogo de la misma de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, sales de cualquiera de los mismos y mezclas de los mismos, o la secuencia de DNA de acuerdo con la Reivindicación 8, y un vehículo, agente diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

18. Uso de la proteína sIL-6R/IL-6 quimérica o un compuesto análogo de la misma de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, sales de cualquiera de los mismos y mezclas de los mismos, o la secuencia de DNA de acuerdo con la Reivindicación 8, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar cánceres de mamífero por medio de la inhibición de las células cancerosas de mamífero, para la potenciación del trasplante de médula ósea por medio de la provocación del injerto de células hematopoyéticas humanas en un trasplante de médula ósea, para aumentar la hematopoyesis, para tratar trastornos hepáticos o neurológicos, o para otras aplicaciones en que se utiliza IL-6 o sIL-6R.

19. El uso de la Reivindicación 18, en el que las células cancerosas de mamífero son células de melanoma muy malignas.