BG64680B1

BG64680B1 - Химерен протеин на интерлевкин-6 разтворим рецептор/ лиганд, негови аналози и тяхното използване

Info

Publication number: BG64680B1
Application number: BG104070A
Authority: BG
Inventors: Michel Revel; Judith Chebath; Tsvee Lapidot; Orit Kollet
Original assignee: Yeda Research And Development Co. Ltd.
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 2000-01-10
Publication date: 2005-11-30
Also published as: CA2295936C; BG104070A; PT991661E; DE69836217D1; EP0991661A2; NO327397B1; EA200000109A1; JP4402288B2; PL338002A1; HK1031895A1; AU8127198A; IL122818A0; BR9812096A; IL133972A; WO1999002552A2; NZ502139A; AU758161B2; HU225855B1; HUP0002426A2; US7374912B2

Abstract

Изобретението се отнася до химерни протеини, конструирани чрез сливане на естествено срещани в природата форми на разтворимия IL-6 рецептор, и до IL-6. Те се прилагат за лечение на рак и заболявания на черния дроб, за улесняване на трансплантирането на костен мозък и за лечение на други състояния, свързани с IL-6.

Description

Област на техниката

Изобретението най-общо се отнася до областта на интерлевкин-6 (IL-6) биологичните активности, които зависят от агонистичното действие на разтворимия IL-6 рецептор (sIL6R). Настоящото изобретение се отнася поспециално до нови химерни SIL-6R/IL-6 протеини, конструирани при сливането главно на естествено срещани в природата форми на sIL6R и IL-6, и техните биологично активни аналози, които са изключително полезни при третирането на рак, чрез инхибиране на растежа на раковите клетки, за засилване на трансплантирането на костния мозък, за третиране на нарушения на черния дроб и други, свързани с IL-6 състояния.

Предшестващо състояние на техниката

Интерлевкин-6 (IL-6) е добре известен цитокин, чиито биологични активности се медиират чрез мембранна рецепторна система, включваща два различни протеина, единият наречен IL-6 Рецептор (IL-6R или gp8O), а другият - gp 130 (разглеждан от Hirano et al., 1994). Разтворимите форми на IL-6 (sIL-6R), съответстващи на извънклетъчния домен gp80, са естествени продукти на човешкото тяло, открити като гликопротеини в кръв и урина (Novick et al., 1990, 1992). Едно изключително качество на sIL-6R молекулите е това, че те действат като силни агонисти на IL-6 върху много типове клетки, включително човешки клетки (Taga et al., 1989; Novick et al., 1992). Това се дължи на факта, че даже и без вътрецитоплазмения домен на gp80, sIL-6R е все пак способен да отпуши димеризирането на gp 130 като отговор на IL-6, който на свой ред медиира последващата трансдукция на IL-6-специфичния сигнал и биологичните ефекти (Murakami et al., 1993). Активният IL-6 рецепторен комплекс е в действителност хексамерна структура, образувана от две gp 130 вериги, два IL-6 лиганда (Ward et al., 1994; Paonesa et al., 1995), в който sIL-6R има два вида взаимодействия с gpl30, като и двата са основни за IL-6-специфичните биологични активности (Halimi et al., 1995).

Третирането с sIL-6R води до засилване на биологичните действия на IL-6 в много типове клетки. Пример за туморни клетки, чийто растеж се инхибира до голяма степен от IL6 , когато се прибави sIL-6R, така както миши миелолевкимични Ml клетки (Taga et al.,

1989), T47D клетки от човешка карцинома на гърдата (Novick et al., 1992) или клетки от човешка He-малка карцинома на белите дробове (Ganapathi et al., 1996). IL-6 има противометастазно действие in vivo (Katz et al., 1995), sIL-6R и може също да засили in vivo такива противометастазни действия на IL-6 (Mackiewicz et al., 1995), Друго действие на IL-6, което се засилва от прибавянето на sIL6R е стимулирането на хематопоетичните стволови клетки да продуцират мултилинейни колонии (Sui et al., 1995). Изобретателите на настоящето изобретение са наблюдавали, също така, че преживяемоста на първични култури на мозъчни олигодендроцити се поддържа от комбинацията на sIL-6R и IL-6 (Oh, 1997), докато IL-6 самостоятелно е слабо активен в такива култури (Kahan and De Vellis, 1994). Това откритие показва, че IL-6, когато се комбинира с sIL-6R може да маскира активността на други невротропични цитокини, като Ресничестия Невротропичен фактор (Ciliary Neutropic Facter CNTF) или Инхибиращ Левкемията фактор (Leukemia Inhibitory Factor - LIF), който също действа чрез gpl30, както е също случая за IL-11 и за Онкостатин М (Oncostatin М) (Hirano et al., 1994).

В опит да се предостави молекула, която да може да комбинира споменатите функции на IL-6 и sIL-6R, наскоро бе докладвано за получаването на рекомбинантни дрождеви клетки от слят протеин между скъсени сегменти от последователност на човешки IL-6, свързани чрез богат на глицин линкер (Fisher et al., 1997). Този слят протеин включва по същество единствено N-домен на рецептора на IL6R цитокин и С-домена на рецептора на цитокин, като по този начин му липсват по същество всички IL-6 имуноглобулин (Ig)-noflo6eH домен, и рецепторната пре-мембранна област (област между С-домена и трансмембранния домен). Като такъв, той представлява скъсена форма на sIL-6R, като тази скъсена форма на sIL-6R в слетия протеин е свързана чрез спо менатия богат на глицин линкер към по същество цялата зряла форма на IL-6. Освен липсващи части на естествения sIL-6R, този слят протеин, като е продуциран в дрождеви клетки, няма гликокозилираща матрица, като такъв протеин би имал, ако се продуцира в клетки на бозайник, по-специално например в човешки клетки. Всъщност, този продуциран в дрожди слят протеин е с молекулно тегло от приблизително 57 kDa, в контраст със слетия протеин, съдържащ по същество всички от естествените аминокиселинни остатъци на sIL6R и IL-6, и който напълно се гликозилира в клетки от бозайници (например, човешки), който е с очакваното молекулно тегло от приблизително 85 kDa (пример 2).

Общата практика в развитието на рекомбинантните протеини, които могат да се използват за лечение на хора е показала, че е важно да се остане колкото се може по-близо до естествените форми на протеините, така както се намират в човешкото тяло, с цел да се избегне създаването на антитела и други странични ефекти, наблюдавани при прилагане на неестествени рекомбинантни продукти. Поради тази причина, предимство е да се използват системи на рекомбинантни клетки от бозайници за продуциране на гликозилирани протеини като интерферон- или фактор стимулиращ гранулоцитни колонии (Chemajovsky et al., 1984, Holloway, 1994) в химична форма, доколкото е възможно по-подобна на естествения човешки продукт. Бактерии и микроорганизми, например дрожди, които не гликозилират правилно, също причиняват погрешно нагъване на протеиновите вериги, което води до имуногенни реакции. Това е изключително важно с оглед на IL-6, който силно се модифицира посттранслационно чрез N- и О-гликозилиране, така както и чрез фосфорилиране (Revel, 1989 за преглед), и с оглед на естествения sIL-6R от човешка кръв и урина, който е гликопротеин, чиито N-терминални и С-терминални аминокиселини са постоянни и са определени (Novick et al., 1990 и в съсобственост на патенти на настоящите изобретатели US5216128 и съответния ЕР 413 908 В1).

В съответствие, изглежда, че посоченият предходен продукт на сливане между sIL6R и IL-6 притежава известен брой откази, поспециално по отношение на използването му за лечение на хора и това, поради факта, че му липсват части от sIL-6R, така както и неговото продуциране в дрожди, което може да допринесе за некоректното гликозилиране на протеина.

До този момент не са описани слятата молекула, притежаваща естествения sIL-6R открит в човешка кръв и естествения IL-6, който се продуцира в човешки клетки и клетки на други бозайници.

Това следователно е цел за настоящото изобретение - да предостави една слята молекула, съдържаща естествен sIL-6R и естествен IL-6 (в какъвто и да е ред), която се продуцира в клетки на бозайници.

Друга цел на настоящото изобретение е да се използва един такъв слят протеин (sIL6R/IL-6 химера) за инхибиране растежа на силно метастатични меланомни клетки при много ниска концентрация, като тези клетки са резистентни на sIL-6R или IL-6 самостоятелно.

Друга цел на изобретението е да се използва такъв слят протеин (sIL-6R/IL-6 химера) за in vivo присаждане на човешки хематопо етични стволови клетки в протоколите за трансплантиране на костен мозък.

Друга цел на изобретението е да се използва такъв слят протеин при други свързани с IL-6 разстройства, например състояния на черния дроб или неврологични състояния.

Друга цел на изобретението е да се предоставят фармацевтични състави, които съдържат споменатия естествен sIL-6R-ecrecTBeH IL6 слят протеин (sIL-6R/IL-6 химера) за третиране на рак, за използване при процедури на транспланиране на костен мозък и при други IL-6-свързани нарушения, например неврологични състояния и състояния на черния дроб.

Други цели и аспекти на изобретението ще се поставят или ще възникнат от следващото описание.

Техническа същност на изобретението

Съгласно изобретението се продуцират известен брой слети протеини (химери), като всеки съдържа по същество всички от естествено съществуващите sIL-6R от човешки телесни течности и по същество всички от зрелите форми на естествено съществуващия в природата човешки IL-6, като всеки е придружен от къси линкерни пептиди, които могат да са толкова къси чак до 3 амнокиселинни остатъка дължина или по-дълги, например 13 аминокиселинни остатъка дължина (виж примери 1 и 2). Все пак трябва да се отбележи, че в тези слети протеини линкерните пептиди могат да са пропуснати и sIL-6R частта може директно да е свързана към IL-6 частта. Тъй като линкерите, представляващи неестествени аминокиселинни последователности, могат да са имуногенни епитопи, предизвикващи изработването на антитела, то за предпочитане е да се разполага с директно слята SIL-6R/IL-6 химера, която притежава желаната биологична активност, докато в това време това намалява до минимум риска от индуциране на такова потенциално вредно образуване на антитяло, когато се прилага такава химера.

Запазването на цялата sIL-6R последователност, включваща Ig-подобен домен, както се открива в естествено срещаните в природата молекули, така както и правилно гликозилиране и други посттранслационни модификации, въведени чрез човешки клети или клетки на бозайници, когато горната химера се продуцира в такива клетки, са също толкова важни да се намали потенциалната имуногенност на химерния протеинов продукт.

Все пак е възможно да се използва съвсем къс линкер от приблизително три аминокиселини при точката на свързване между sIL6R и IL-6 частите на химерния протеин. Такъв къс линкер няма да е имуногенен епитоп. Възможно е също така да се използват линкери от до 30 аминокиселини, за да допринесат за разделянето между двете части, но тук трябва да се внимава и трябва да се проведат експерименти за биологична ефикасност и сигурност, за да се подсигури, че химерните молекули с такива линкери не са имуногенни.

Всъщност бе показано съгласно изобретението, че такива дълги линкери не са основни за активността на химерния протеин, като това означава, че правилното нагъване на химерата не се нуждае от дълъг линкер, а по-специално когато всички по същество от естествено срещаните в природата последователности на sIL-6R и IL-6 частите са инкорпорирани (включени) в химерната молекула (пример 3 и фиг. 5), които се отнасят до сравнение между SIL-6R/IL-6 химера, притежаваща много къс (3 аминокиселини) линкер и подобна химера, притежаваща по-дълъг лиикер от 30 аминокиселини.

Тези слети протеини или SIL-6R/IL-6 химери се продуцират ефикасно съгласно изобретението в експресионни системи на клетки от бозайници за добив на гликолизирани продукти, притежаващи силна активност върху туморни клетки, които обикновено не отговарят на IL-6 или sIL-6R самостоятелно, и които са високо ефективни за осигуряване на успеха на присаждането на трансплантирани клетки от човешки костен мозък (примери 1-4). Всъщност, в такива трансплантанти от костен мозък, SIL-6R/IL-6 химерите са основни за преживяването и пролиферацията на трансплантираните неангажирани плурипотеитии хемопоетични стволови клетки. Освен това, от експерименталните резултати, представени в описанието, така както и от други анализи, става ясно, че могат да се приготвят различни аналози на SIL-6R/IL-6 химерния протеин от изобретението, които имат по същество същата биологична активност на SIL-6R/IL-6 химера, като тези аналози са SIL-6R/IL-6 химери, в които един или повече аминокиселинни остатъци са били делетирани, прибавени или заместени от други, като единственото ограничение за такива аналози е те да запазват повечето от естествено срещаните в природата sIL-6R и IL-6 последователности. Например, прибавянето на аминокиселини към срещаните в природата sIL-6R и IL-6 последователности за предпочитане се ограничава до между 20 аминокиселини и за предпочитане тези прибавяния са в сайта на свързване между sIL-6R и IL-6, т.е. линкерната молекула. Също така, делециите от sIL-6R и IL-6 последователностите за предпочитане се ограничават до между 20-30 аминокиселини; а заместванията на аминокиселинни остатъци в sIL-6R и IL-6 последователностите от други аминокиселинни остатъци също за предпочитане се ограничават до между 20-30 аминокиселини. Всички споменати делеции, прибавяния и замествания са приемливи съгласно изобретението, когато така модифицираните аналози, които са получени, запазват основно биологичната активност на т sIL-6R и IL-6 химерата, съставена от основно естествено съществуващи в природата последователности, и запазват основно същия модел на гликозилиране на химерата, съставена от основно естествено съществуващи в природата последователности, ко4 гато се експресират в клетки на бозайници.

В съгласие с това изобретението предоставя химерен гликозилиран разтворим интерлевкин-6 рецептор (81Ь-6Я)-интерлевкин-6 (IL-

6) протеин (sIL-6R/IL-6) и техни биологично активни аналози, включващи продукт на слят протеин между по същество всички естествено съществуващи в природата форми на sIL6R и по същество всички естествено съществуващи в природата форми на IL-6, като посоченият SIL-6R/IL-6 и техните аналози са гликозилирани по подобен начин на гликозилирането на естествено съществуващи в природата форми на sIL-6R и IL-6R.

Варианти за изпълнение на изобретението на горния химерен протеин от изобретението включват:

(i) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози, като посоченият SIL-6R е слят с IL-6 чрез пептидна линкерна молекула, (ii) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози, както е посочено в (i), като посоченият линкер е много къс, неимуногенен линкер от приблизително

3-4 аминокиселинни остатъка.

(iii) Химерен sIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози, както в (ii) по-горе, като посоченият линкер е трипептид на последователността E-F-M (Glu-Phe-Met).

(iv) Химерен sIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози, както погоре в (i), като посоченият линкер е пептид от 13 аминокиселинни остатъка на последователност E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-PheGly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met) (SEQ ID: No 1).

(v) Химерен sIL-6R/IL-6 протеин, който е горепосочения sil-6R6Val/IL-6 трипептиден линкер на последователноста E-F-M между Стерминалния Val-356 на sil-6R и N-крайния Рго29 на IL-6, като посоченият химерен протеин притежава последователността, посочена погоре на фиг. 3.

(vi) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин, който е горепосочения sIL-6R5Val/IL-6 притежаващ 13 аминокиселинен пептиден линкер на последователността E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-QF-M между С-терминалния Val-356 на sIL-6R и N-крайния Рго-29 на IL-6, като посоченият химерен протеин притежава последователността, посочена по-горе на фиг. 3, където три пептидът на последователност E-F-M между позиции 357-359 на фиг. 3 са заместени от посочената 13 аминокиселинна пептидна последователност.

(vii) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин, при който посоченият протеин се продуцира в клетки на бозайници в напълно завършена форма.

(viii) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин, при който посоченият протеин се продуцира в клетки на човек.

(ix) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин, при който посоченият протеин се продуцира в СНО клетки.

(x) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и неговите биологично активни аналози, както погоре, като посоченият химерен протеин и аналози се характеризират с това, че са способни да инхибират растежа на силно злокачествени ракови клетки.

(xi) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и неговите биологично активни аналози, както погоре, като посоченият химерен протеин и аналози се характеризират с това, че са способни да инхибират растежа на силно злокачествени меланомни клетки.

(хй) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и неговите биологично активни аналози, както погоре, като посоченият химерен протеин и аналози се характеризират с това, че са способни да инхибират растежа на силно злокачествени ракови клетки.

(xiii) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и неговите биологично активни аналози, както погоре, като посоченият химерен протеин и аналози се характеризират с това, че са способни да предпазват черния дроб от хепатотоксични средства.

Изобретението предоставя, също така, ДНК последователност, кодираща химерен sIL6R/IL-6 протеин и неговите биологично активни аналози, както е отбелязано по-горе.

Освен това, изобретението предоставя, също така, ДНК-ов вектор, съдържащ ДНК последователност, кодираща химерен sIL-6R/ IL-6 протеин и неговите биологично активни аналози от изобретението, както е отбелязано по-горе, подходящи за експресиране на посочения химерен протеин в клетки от бозайници.

Варианти за изпълнение на ДНК-ов вектор на изобретението, които включват:

(i) ДНК-ов вектор, като посоченият вектор е подходящ за експресиране на посочения химерен протеин в човешки клетки.

(ii) ДНК-ов вектор, като когато посоченият вектор се експресира в човешки клетки, експресираният химерен протеин притежава последователност, която позволява пълно завършване на химерния протеин чрез бозайниковите или човешки клетки и секретиране на напълно завършения химерен протеин от клетките в културалната среда, в която се култивират посочените клетки.

(iii) ДНК-ов вектор, както по-горе, като посоченият вектор е посоченият тук плазмид рсДНК SIL-6R/IL-6, включващ рсДНКЗ вектор, съдържащ ДНК последователността, кодираща химерния SIL-6R/IL-6 протеин под контрола на промотора на цитомегаловирус (CMV).

(iv) ДНК-ов вектор, както по—горе, като посоченият вектор е посоченият тук плазмид рсДНК SIL-6R/IL-6, включващ рсДНКЗ вектор, съдържащ ДНК последователността, кодираща химерния SIL-6R/IL-6 протеин под контрола на промотора на цитомегаловирус (CMV), и при който посочената ДНК последователност, кодираща посочения химерен sIL6R/IL-6 протеин, инсерира там линкерна последователност, кодираща линкерен пептид при EcoRI сайта, разположен между последователността, кодираща SIL-6R частта и последователността, кодираща IL-6 частта на протеина.

Също така, изобретението предоставя трансформирани клетки от бозайници, съдържащи ДНК-ов вектор, както по-горе, който е способен да експресира sIL-6R/IL-6 последователността на химерния протеин, пренасяна от посочения вектор и напълно завършващ експресирания протеин и секретиращ в културалната среда, в която се култивират посочените клетки.

Един вариант за изпълнение на тези трансформирани клетки са описаните клетки 293 от ембрионален човешки бъбрек (НЕК293), трансфектирани чрез рсДНК SIL-6R/IL-6 вектор, като посочените клетки са способни да експресират SIL-6R/IL-6 химерен протеин, напълно завършване на посочения протеин и секретиране на посочения протеин в културалната среда, в която се култивират посочените клетки под формата на около 85 kDa гликопротеин.

Друг вариант за изпълнение на трансформирани клетки са описаните СНО (Chinese Hamster Ovary) клетки, трансфектирани чрез рсДНК SIL-6R/IL-6 вектор, като посочените клетки са способни да експресират SIL-6R/IL6 химерния протеин, напълно да завършат посочения протеин в културалната среда, в която се култивират посочените клетки, под формата на около 85 kDa гликопротеин.

Изобретението предоставя, също така, метод за получаване на химерен протеин или негови биологични аналози, както по-горе, включващ култивиране на посочените трансформирани клетки при условия, подходящи за експресиране, процесинг и секретиране на посочения протеин или негови аналози в културалната среда, в която се култивират посочените клетки, и пречистване на посочения протеин или негови аналози от посочената културална среда чрез имуноафинитетна хроматография, при използване на моноклонални антитела, специфични за SIL-6R.

Химерният протеин от изобретението притежава голям брой приложения, включващи:

(i) използване на SIL-6R/IL-6 химерен протеин или негови аналози, соли на който и да е от тях, и техни смеси, като инхибитори на ракови клетки;

(ii) използване, както в (i), като инхибитор на силно злокачествени меланомни клетки;

(iii) използване на химерен sIL-6R/IL-6 протеин или на негови аналози, соли на който и да е от тях, и техни смеси, като активна съставка за предизвикване на присаждане на човешки хематопоетични клетки при присаждане на костен мозък;

(iv) използване на химерен sIL-6R/IL-6 протеин или на негови аналози, соли на който и да е от тях, и техни смеси, като активни съставки за увеличаване на хематопоезата, за третиране на хепатични и неврологични състояния, или за други приложения, в които се използват SIL-6R/IL-6.

Подобно, химерният протеин от изобретението може да се използва за приготвяне на лекарствени средства за голям брой медицински предписания, а по-точно химерен sIL-6R/ IL-6 протеин или аналози, соли на който и да е от тях и техни смеси, за използване при приготвянето на лекарствено средство за третиране на рак чрез инхибиране на раковите клетки, или при приготвянето на лекарствено средство за засилване на трансплантацията на костен мозък чрез предизвикване на присаждане на човешки хематопоетични клетки при трансплантация на костен мозък, или при приготвяне на лекарствено средство за повишаване на хематопоезата, или при приготвяне на лекарствено средство за третиране на неврологични нарушения, или при приготвяне на лекарствено средство за други приложения, в които се използват SIL-6R/IL-6.

Освен това, изобретението предоставя, също така, фармацевтичен състав, съдържащ като активна съставка химерен sIL-6R/IL-6 протеин или негов аналог, както по-горе, и фармацевтично приемлив носител, разредител или пълнител.

Един вариант за изпълнение на този фармацевтичен състав съгласно изобретението включва:

(i) фармацевтичен състав за лечение на рак при бозайници.

(ii) фармацевтичен състав за засилване на трансплантацията на костен мозък.

(iii) фармацевтичен състав за третиране на черен дроб и неврологични нарушения или за засилване на хематопоезата или за други приложения, в които се използват IL-6 или SIL-6R.

Изобретението предоставя, също така, метод за третиране на рак при бозайници или за засилване трансплантацията на костен мозък, или за третиране на хепатични или неврологични нарушения, или за засилване на хематопоезата, или за други приложения, при които се използват IL1-6 или SIL-6R, който метод включва прилагане върху пациент на фармацевтичен състав, както посочения, в подходящи форми на дозите и чрез подходящ път на прилагане.

С цел да се избегне всякакво съмнение, изобретението се отнася до химера между IL-6 и sIL-6R в какъвто и да е ред, т.е. N-терминални и С-терминални участъци, могат да се обърнат и химерата след това е IL-6-sIL-6R протеин, въпреки че се отнася до SIL-6R/IL-6 протеин.

Други аспекти на вариантите за изпълнение на изобретението са представени по-долу или възникват директно от подробното описание на изобретението.

Описание на приложените фигури

Фигура 1 (А, В) представлява схематично изображение на различните вектори, реагенти и етапи на процеси, използвани при кон струирането на химерната. ДНК молекула, кодираща химерния протеин, в която се запазва структурата на естествената форма на sIL-6R, която завършва, при Val 356 остатъка, следван от последователността на естествената, зряла, завършена форма на IL-6, както подробно е обяснено в пример 1.

Фигура 2 (А,В) показва резултатите, получени от анализа, проведен за идентифициране на Val-6R6Val/Il-6 р86 химера чрез полиакриламидна гел-електрофореза (А) и биоактивен профил (В), както на фиг. 2А е показана репродукция на гел, оцветен с Comassie, върху който се елюират електрофорезните имунопрофилирани фракции от колоните за афинитетна хроматография, заредени с проба от секретиран протеин, получена от клетъчни култури, трансфектирани с вектор кодиращ химерния протеин; и фиг. 2В, където се показва графично представяне на биологичната активност (инхибиране на растежа на F 10,9 меланомни клетки) на всеки от посочените фракции, елюирани от колоните за афинитетна хроматография, всички са както подробно е обяснено в примери 2 и 3;

фигура 3 изобразява аминокиселинна последователност (еднобуквен код) на sIL-6R 5Val/Il-6 р86 химера, на която са показани различните домени на молекулите, включително N-терминалния сигнален протеин (реда най-отгоре на последователността), имуноглобулинподобния (Ig-подобен) домен, N-домена на рецептора на цитокин (подчертан), С-домена на цитокина (реда на върха на последователността) и рецепторната пре-мембранна област (областта между С-домена и трансмембранния домен), всички SIL-6R части на химерата; така както и зрялата IL-6 част на химерата; така както и зрялата IL-6 част (подчертана по-долу) на химерата, както е описано в примери 1 и 2;

фигура 4 (А, В) показва фотографии на F10,9 меланомни клетки в култура без (А) и (В) третиране с SIL-6R/IL-6 химерен протеин в продължение на 4 дни, като на фигура 4В са явни морфологичните промени индуцирани в такива метастатични меланомни клетки (F10.9 клетки) чрез третиране с SIL-6R/IL-6 химера, както е описано в пример 3;

фигура 5 е графично представяне на резултатите, изобразяващи инхибирането на нарастването на F10.9 меланомни клетки чрез

SIL-6R/IL-6 химерен протеин в различни концентрации на химерата, вариращи в границите от приблизително 0,12 ng/ml до приблизително 150 ng/ml, където химерата, единствено с 3 аминокиселинен линкер SIL-6R/IL-6, както е описан в пример 3, се сравнява с химера с дълъг 13 аминокиселини линкер (sIL-6R/IL-6)];

фигура 6 е графично представяне на резултатите, изобразяващи липсата на инхибиращи растежа ефекти върху F10,9 меланомни клетки или на изолиран IL-6 самостоятелно (пунктираната горна линия с отворени квадратчета) при концентрации вариращи в граници от 0-40 ng/ml IL-6 самостоятелно и sIL-6R самостоятелно (точка на пресичане на всички криви върху вертикалната ос, където IL-6 концентрацията е нула); така, както и наблюдаваните инхибиращи растежа ефекти, когато IL-6 и sIL6R се добавят заедно при различни концентрации на всеки, при което концентрацията на IL-6 е в границите от 10 ng/ml до 40 ng/ml, a sIL-6R прибавен при три концентрации от 100 ng/ml, 200 ng/ml и 400 ng/ml за всяка IL-6 концентрация, както се илюстрира от трите по-долни криви (две пунктирни криви с отворени триъгълници и кръгове и плътна крива със затворени квадрати), както е описано в пример 3;

фигура 7 е репродукция на автодиаграма от Southern блот, показваща необходимостта от SIL-6R/IL-6 химерен протеин за успешно присаждане на човешки хематопоетични стволови клетки по време на трансплантация на костен мозък в SCID-NOD мишки (две десни ивици представляващи мишката, която получава SIL-6R/IL-6 химерния протеин в добавка към други необходими фактори, SCF, FLT3 и това в контраст на трите леви ивици, които представляват мишка, която е получила единствено SCF и FLT-3 и SCF, FLT-3 както и изолиран, т.е. неслят IL-6 и sIL-6R), както е описано в пример 4;

фигура 8 е диаграма на разсейване на афинитетните характеристики на SIL-6R/IL-6 химера при сравнение със смес от IL-6 и sIL6R, като стойностите на химерата са показани чрез запълнени квадратчета, а на сместа чрез запълнени многоъгълници, като съотношението на наклона е 4 към 1;

фигура 9 показва най-високата активност на SIL-6R/IL-6 химера върху F 10,9 меланомни клетки при сравнение със сместа от SIL-6R+IL6, или към sIL-6R (без IL-6);

фигура 10 показва sIL-6R/IL-6 химерното предпазване срещу чернодробната токсичност, стойностите представляващи средно от 4 експеримента, запълнените квадратчета представляват IL-6R-/-MHniKH, запълнените многоъгълници представляват IL-6-/-mhuikh, получаващи IL-6, а запълнените звездички представляват Ш-6-/-мишки, получаващи химера;

фигура 11 представлява аминокиселинна последователност (еднобуквен код) на sIL-6R6Val химера Зе, като линкерът е подчертан;

фигура 12 показва биологичната активност върху фигура 10.9 меланомни клетки на химера Зе (тъмни запълнени звездички) в сравнение с SIL-6R/IL-6 химера (запълнени квадратчета) и два мутанта (Mutt 39 (HD)-3aпълнени многоъгълници) и Mutt NHD-светли запълнени звездички), както е описано в пример 9.

Подробно описание на изобретението

Изобретението се отнася до химерен sIL6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози, които притежават по същество всички от естествено съществуващите в природата форми на sIL-6R и по същество всички естествено съществуващи в природата форми на IL-6, слети заедно, чийто сайт на сливане може да е като линкерен пептид, толкова къс, колкото 3 аминокиселини, и който химерен SIL-6R/IL-6 протеин или негови аналози притежават подобно количество и модел на гликозилиране като тези на естествено срещаните в природата SIL-6R и IL-6. За такъв химерен sIL-6R/IL-6 протеин, продуциран съгласно изобретението в клетки от бозайници, в човешки клетки (примери 1-4) или СНО клетки (пример 6) е открито, че се експресира ефикасно в такива клетки, че е силно гликозилиран и че притежава силна активност върху туморни клетки, които въобще не показват отговор на IL-6 или sIL-6K самостоятелно.

По-специално, съгласно изобретението, наблюдавано бе (примери 1-3), че горепосоченият SIL-6R/IL-6 протеин от изобретението причинява задържане на растежа на силно злокачествени клетки на бозайници, като F10,9 меланомни клетки при концентрации по-ниски от необходимите, когато се използва смес от sIL-6R и IL-6. Това е изключително значим резултат с оглед на факта, че такива Р10.9 меланомни клетки продължават да се развиват нормално при третиране единствено с IL-6 или с sIL-6R, поотделно, и преодоляват задържането на растежа единствено когато се подложат на сравнително високи дози от комбинация от неслети IL-6 и sIL-6R. В съответствие, химерният sIL-6R/IL-6 протеин на настоящето изобретение е по-силен инхибитор на тези силно злокачествени меланомни клетки, отколкото смес от техните отделни части, т.е., смес от неслети IL-6 и sIL-6R. Химерният протеин от изобретението е следователно изключително полезен като активна съставка за третиране на различни видове рак.

По-високата активност на химерния SIL-6R/IL-6 протеин се смята чрез неговия висок афинитет към gpl3O, отколкото от сместа от неслети IL-6 и SIL-6R (пример 7).

Освен това е открито също, съгласно изобретението (пример 4), че химерна sIL-6R/ IL-6 молекула от изобретението е изключително полезна за засилване на трансплантирането на костен мозък. Всъщност, при използване на известен протокол за присаждане на човешки клетки от костен мозък в строго комбинирана имунодефицитна (SCID) мишка, в която факторът на стволовите клетки (SCF) и Flt3-nHганда се използват да направят възможно преживяването и пролиферацията на най-примитивните плурипотенти хематопоетични стволови клетки, способни на дългосрочна трансплантация в костен мозък реципиент, бе открито, че тези два фактора, SCF и РкЗ-лиганда са недостатъчни да спомогнат в действието на трансплантирането на човешки клетки в реципиент миши костен мозък, и че единствено когато се прибави химерният SIL-6R/IL-6 протеин, може да е сполучливо присаждането. Това откритие означава, че химерният протеин SIL-6R/IL-6 е основен при такива протоколи за трансплантиране. В същите експерименти, неслети IL-6 и sIL-6R, когато се прибавят поотделно, когато е недостатъчно да се спомогне успешно трансплантиране на костен мозък и когато се добавят заедно, когато са много по-малко активни отколкото химерния sIL6R/IL-6 протеин, т.е., при една активна концентрация от 100 ng/ml sIL-6R/IL-6 химерен протеин, спомага на успешно трансплантиране на костен мозък, докато двете разделени IL-6 и sIL-6R, когато се добавят заедно при даже по-високи концентрации (sIL-6R от ng/ml, IL-6 от 50-200 ng/ml), е много по-малко активен при спомагането на такава трансплантация.

Горният SIL-6R/IL-6 химерен протеин от изобретението за предпочитане е рекомбинантен гликозилиран SIL-6R/IL-6 химера, продуциран в човешки клетки или в която и да е подходяща експресионна система от бозайник като СНО клетки от хамстер, които са способни на гликозилирани протеини, както правят човешките клетки и които въвеждат същите посттранслационни модификации, както правят и човешките. Една важна характеристика е, че химерният гликопротеин, получен по този начин, се завършва и модифицира както и естествените IL-6 и sIL-6R молекули открити в човешкото тяло, без скъсяване и без прибавяния на екзогенни неестествени полипептидни последователности, с изключение на много късия трипептид или когато се инкорпорира по-дълъг линкерен пептид между sIL-6R и IL-6 частите на химерния протеин.

За получаването на горния предпочитан химерен протеин на изобретението се разглеждат следните характеристики на естествено срещания в природата SIL-6R и IL-6: Известно е, че IL-6, присъстващ в човешки клетъчни мембрани, се продуцира чрез сДНК кодираща 468 аминокиселини, включващи сигнален пептид, един имуноглобулин (Ig) подобен домен, цитокин-свързващ домен, трансмембранна област и цитоплазматичен домен (Yamasaki et al., 1983). Разтворима форма на sIL-6R е открита в телесните течности, които имат, както в зрелия IL-6 от мембрани, един N-край, отговарящ на Leu-20 (Novick et al.,

1990) и С-край, отговарящ на Val-356 точно преди трансмембранната област на IL-6 (US в сьпритежание 5,216,128 и ЕР 413 908 Bl). С цел да се слее тази sIL-6R последователност към IL-6, се въвежда EcoRI рестрикционен сайт след Val-356. Последователността на зрелия IL-6 започващ при Рго-29 на IL-6 сДНК и завършващ при Met-212 (Ziberstein et al., 1986; Hirano et al., 1986) се въвежда след този EcoRI сайт. При този EcoRI сайт би могло също така, но не е задължително, да се въведе линкерен пептид с желана дължина за раздалечаване на sIL-6R и IL-6 частите една от друга в химерния протеин. Както е посочено в примерите по-долу, продуцират се два различни химерни протеина като примери за такива въз можни химерни протеини, като единият притежава трипептиден линкер, а другият притежава линкер от 13 аминокиселинни остатъци при този EcoRI сайт, като и двата са по същество еднакво биологично активни.

Изобретението се отнася, също така, до аналози на горния химерен протеин SIL-6R/IL6 от изобретението, които аналози задържат по същество същата биологична активност на химерния протеин, притежавана по същество само от естествено срещаните в природата последователности на sIL-6R и IL-6. Такива анализи могат да бъдат тези, в които могат да се делегират до 30 аминокиселинни остатъка, да се добавят или да се заместят от други в sIL6R и/или IL-6 частите на химерния протеин, така че модификации от този вид не променят по същество биологичната активност на аналога на химерния протеин, като се има предвид самия химерен протеин и в който sIL-6R частта на такъв аналог по същество задържа структурата на естествено срещания в природата сигнален пептид (преди процесинг - фиг. 3), Igподобния домен, цитокин рецепторния С-домен и рецепторния пре-мембранен домен. Също така, аналози на такъв химерен протеин би трябвало да задържат по същество естествено съществуващата в природата зряла форма на IL6 частта. Различните аналози могат да се различават най-вече един от друг и от базовата химерна молекула на протеина (която е единствено с естествено срещани в природата sIL6R и IL-6 последователности) при сайта на линкерния протеин, който свързва sIL-6R и IL-6 частите в химерния протеин. Такъв линкер може да е с дължина до 30 аминокиселини и служи за разделяне на sIL-6R и IL-6 частите една от друга в химерния протеин. Доколкото се отнася до такъв линкер, трябва да се внимава да се избере неговата последователност (и следователно да се тества биологично в подходящо стандартно изследване всеки такъв аналог), така че той да не води, например, до неправилно нагъване на химерния протеин, което може да го направи неактивен, или да не направи от аналога на химерния протеин имуногенен протеин, който ще предизвика антитела срещу него в пациент, който трябва да се третира с него, с резултат, че такъв аналог би бил неефективен поне като средно или дългосрочно лекарствено средство.

По отношение на горните аналози на хи мерния протеин от изобретението, тези аналози са тези, в които са заместени, един или повече и до 30 аминокиселинни остатъци от базовия химерен протеин от изобретението, от различни аминокиселинни остатъци, или са делетирани или са прибавени повече аминокиселинни остатъци към първоначалната последователност на химерния протеин на изобретението (това е единствено, по същество, естествено съществуващите в природата sIL-6R и IL-6 последователности) без значително да се променя активността на получените продукти, при сравняване с основния химерен протеин от изобретението. Аналозите се получават по известни техники на синтез и/или на сайт - насочен мутагенез, или които и да са други известни техники, подходящи за това.

Всеки такъв аналог, за предпочитане, притежава последователност от аминокиселини в достатъчно повтори на тази на основната SIL-6R/IL-6 химера, така че да притежават по същество подобна активност. Следователно, може да се определи дали един даден аналог притежава по същество същата активност като основния химерен протеин на изобретението чрез средства на рутинно експериментиране, включващо подлагане на един такъв аналог на тестове за биологична активност, посочени в примери 2-4.

Аналози на химерния протеин, които могат да се използват съгласно изобретението, или нуклеинови киселини, които ги кодират, включват ограничен набор, съответстващи по същество последователности като заместени пептиди или полинуклеотиди, които могат рутинно да се получат от специалиста в областта, без излишно експериментиране, основаващо се на знанията и напътствията, представени тук. За пълно описание на химията на протеина и на структурата му, виж Schulz, G. Е. et al., Principles of Protein Stucture, SpingerVerlag, New York, 1978; и Creighton, T. E. Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, които са включени тук за справка. За представяне на заместванията на нуклеотидните последователности, предпочитания за един такъв кодон, виж Ausubel et al., по-горе, при && А. 1.1 А. 1.24, Sambrook et al., Current Protocols in Molecular Biology, Interscience Ν. Y. && 6.3 и

6.4 (1987, 1992), в притурки C и D.

Предпочитани замени на аналозите съг10 ласно изобретението са тези, известни като „консервативни” замествания. Консервативни аминокиселинни замествания на тези в химерния протеин, притежаващи по същество естествено съществуващи в природата IL-6 и sIL- 5 6R последователности, могат да включват синонимни аминокиселини от група, която притежава достатъчно подобни физикохимични свойства, като заместванията от членове на групата ще запазят биологичната функция на молекулата, Graham, Science, Vol. 185, рр. 862864 (1974). Ясно е, че инсерции и делеции на аминокиселини могат да се направят, също така, без да се променя тяхната функция, по-специално ако инсерциите или делециите включват единствено няколко аминокиселини, нап ример, под тридесет и за предпочитане под 10, и не отстраняват или не изместват аминокиселини, които са критични за функционалната конформация, например цистеиннови остатъци, Anfisen. “Principles That Govern The Folding of Protein Chains”, Science, Vol. 181, pp. 223230 (1973). Аналози, получени чрез такива делеции и/или инсерции, се включват в обхвата на изобретението.

За предпочитане синонимните аминокиселинни групи са тези, които са дефинирани в таблица I. По-предпочитано, синонимните аминокиселинни групи са тези, които са дефинирани в таблица II, и още по за предпочитане, синонимните аминокиселинни групи са тези, които са дефинирани в таблица III.

Таблица I. Предпочитани групи на синонимните аминокиселини

Аминокиселина	Синонимна група
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gin, Lys, Glu, His
leu	lie, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, lie, Leu, Val
Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
He	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lie
Phe	Trp, Met, Tyr, lie, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, lie, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Gin	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin
Asn	Gin, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gin, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu
Met	Phe, lie, Val, Leu, Met
Trp	Trp

ТАБЛИЦА II

По-предпочитани групи на синонимните аминокиселини^

Аминокиселина

Ser

Arg leu Pro Thr Ala Val Gly lie

Phe

Tyr Cys His Gin Asn Lys Asp Glu Met Trp

Синонимна група

Ser

His, Lys, Arg,

Leu, lie, Phe, Met,

Ala, Pro

Thr

Pro, Ala

Val, Met, lie,

Gly lie, Met, Phe, Val, Leu, Met, Tyr, lie, Leu, Phe Phe, Tyr

Cys, Ser

His, Gin, Arg,

Glu, Gin, His

Asp, Asn

Lys, Arg,

Asp, Asn,

Glu, Gin,

Met, Phe, lie, Val, Leu,

Trp

Таблица III

Най-предпочитани групи на синонимните аминокиселини

Аминокиселина

Ser

Arg leu. Pro Thr Ala Val Gly lie Phe Tyr Cys His Gin Asn Lys Asp Glu Met Trp

Примери за получаване на аминокиселинни замествания в протеини, които могат да се използват за получаване на аналози на химерния протеин за използване в изобретението, включват който и да е известен етап на метод, като този, представен в US RE 33,653, 4,959,314, 4,737,462 на Mark et al.; 5,116,943 на Koths et al.; 4,965,195 на Namen et al.; 4,879,111 на Chong et al.; и 5,017,691 на Lee et al.; и лизин-заместен протеин, представен в US 4,904,584 (Shaw et al.).

В друг предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, който и да е аналог на

Синонимна група

Ser

Arg,

Leu, lie, Met,

Pro

Thr

Ala

Val

Gly lie, Met, Leu,

Phe

Tyr

Cys, Ser

His

Gin

Asn

Lys

Asp

Glu

Met, lie, Leu,

Tro химерния протеин за използване в настоящото изобретение притежава аминокиселинна последователност, съответстваща по същество на тази на посочения основен химерен протеин на изобретението. Терминът „съответстващ по същество на” се разбира, че включва аналози с минимални промени на последователността на основния химерен протеин, които не засягат неговите основни характеристики, по-специално неговите способности да инхибира пролиферацията на ракови клетки или да спомагат трансплантацията на костен мозък, например. Видът промени, които обикновено се при ема, че попадат в „съответстваща по същество” терминологията, са тези, които биха били резултат на конвенционални техники на мутагенез на ДНК кодираща химерния протеин на изобретението, водещи до няколко малки модификации, и скриниращи за желаната активност, по описания начин.

Аналозите, съответстващи на настоящото изобретение, включват тези, кодирани от нуклеинова киселина като ДНК или РНК, която хибридизира към ДНК или РНК под строги условия, и която кодира химерен протеин, съгласно настоящото изобретение, включваща основно всички естествено съществуващи в природата последователности, кодиращи sIL-6R и IL-6. Например, такава хибридизационна ДНК може да е една такава кодираща същия протеин от изобретението, притежаваща например, последователността, посочена на фигура 3, но която се различава по своята нуклеотидна последователност от естествено срещаната в природата нуклеотидна последователност поради разпада на генетичния код, т.е. до известна степен различна нуклеотидна последователност може все още да кодира за същата аминокиселинна последователност, което се дължи на този разпад на кода. Освен това, както също бе споменато по-горе, количеството аминокиселинни промени (делеции, прибавяния, замествания) е ограничено до приблизително 30 аминокиселини, така че даже и с максималното количество промени, аналозите съгласно настоящото изобретение, ще бъдат тези, които съществено задържат лидерната последователност (преди процесинга), Ig-подобен домен, цитокинов рецептор N- и С-домени и рецепторна пре-мембранна област (областта между С-домена и трансмембранния домен) в SIL-6R частта и по същество всяка IL-6 област. Една такава нуклеинова киселина би била първия кандидат за определяне дали кодира полипептид, който запазва функционалната активност на химерния протеин от настоящото изобретение. Терминът „строги условия” се отнася до условията на хибридизиране и последващото промиване, които специалистите в областта конвенционално изразяват като „строги”. Виж Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, no-rope, Interscience, Ν. Y., ara. 6.3 и

6.4 (1989, 1992) и Sambrook et al., по-горе. Без ограничения, примери за строги условия включват условия на промиване 12-20°С пре ди изчисляването на Тт на хибрида, който се изучава в, например, 2 х SSC и 0,5% SDS в продължение на 5 min, 2 х SSC и 0,1% SDS в продължение на 15 min; 0,1 х SSC и 0,5% SDS при 37°С за 30-60 min и след това 0,1 х SSC и 0,5% SDS при 68°С за 30-60 min. Специалистите в областта разбират, че строгостта на условията зависи от дължината на ДНК последователностите, олигонуклеотидните проби (като 10-40 бази) или смесени олигонуклеотидни проби. Ако се използват смесени проби, се предпочита да се използва тетраметил амониев хлорид (ТМАС) вместо SSC, Виж Ausubel по-горе.

Терминът „соли” се отнася в настоящото и до двете соли на карбоксилни групи и до соли на присъединителни киселини на аминогрупи на химерния протеин от настоящото изобретение или негови аналози. Соли на карбоксилни групи могат да се образуват по начини, известни от състоянето на техниката и включващи неорганични соли, например, натриеви, калциеви, амониеви, фери или цинкови соли и други подобни, и соли с органични основи като тези, образувани например с амини, като триетаноламин, аргииин или лизин, пиперидин, прокаин и подобни. Солите на присъединяване на киселини включват, например, соли с минерални киселини като, например, солна киселина (хлороводородна киселина) или сярна киселина, и соли с органични киселини като, например, оцетна киселина или оксалова киселина.

Естествено всяка една такава киселина трябва да има по същество подобна активност към химерния протеин на настоящото изобретение или към неговите аналози.

Изобретението се отнася, също така, до ДНК последователности, кодиращи посочения химерен протеин от изобретението и неговите аналози, така както и до ДНК-ови вектори, пренасящи такива ДНК последователности за експресиране в подходящи клетки от бозайници, за предпочитане клетки от човек. Един вариант за изпълнение на вектор от изобретението е плазмид рсДНК sIL-6R/ IL-6 включващ рсДНКЗ вектор (Invitrogen), включващ sIL-6R/ IL-6 сляти последователности под контрола на промотора на цитомегаловирус (CMV).

Изобретението се отнася, също така, до трансформирани клетки от бозайници, за пред14 почитане човешки клетки, клетки, способни да експресират горните протеини от изобретението. Един вариант за изпълнение на такива трансформирани клетки са човешки ембрионални бъбречни 293 (НЕК 293, ATCC CRL 1573) трансфектирани с рсДНК sIL-6R/ IL-6, който секретира слятия 6IL-6R/IL-6 химерен гликопротеии като 85 kDa.

Друг вариант за изпълнение на настоящото изобретение е плазмид рсДНК sIL-6R/ IL-6, който се различава от горния рсДНК sIL6R/ IL-6 чрез инсериране в EcoRI сайт на къси линкери, кодиращи 10 допълнителни аминокиселини. Могат да се въведат за оптимизиране на разстоянието между IL-6 и sIL-6R известен брой различни последователности с различни дължини.

Изобретението включва, също така, химерен протеин, в който IL-6 частта предхожда sIL-6B (както е на фигура 11).

Настоящото изобретение се отнася, също така, до метод за получаване и пречистване на химерния протеин на изобретението или неговите аналози, който включва култивиране на посочените трансформирани клетки при условия, подходящи за експресиране и секретиране на продукта химерен протеин в културалната среда и пречистване на секретирания протеин чрез имуноафинитетна хроматография при използване на aHTH-sIL-6R моноклоналио антитяло 34.4, както е посочено в пример 2 и пример 5.

Настоящото изобретение се отнася, също така, до фармацевтичен състав, включващ като активно средство една SIL-6R/IL-6 химера или нейни аналози или техни смеси или техни соли и фармацевтично приемлив носител, разредител или пълнител. Един вариант за изпълнение на фармацевтичния състав на изобретението включва фармацевтичен състав за засилване на IL-6 типа действие, за третиране на рак, за трансплантиране на костен мозък, за увеличаване на хематопоезата, в някои специфични тромбопоези, за третиране на неврологични състояния, за третиране на нарушения в черния дроб, и други приложения на IL-6 или свързани цитокини.

Фармацевтичните състави на изобретението са приготвени за прилагане чрез смесване на химерния протеин или на неговите аналози с физиологично приемливи носители, и/ или стабилизатори и/или пълнители, и се при готвят в дозирани форми, т.е. чрез лиофилизиране в ампула за дозиране. Методът на прилагане може да е по който и да е от приемливите методи за прилагане на подобни средства и ще зависи от състоянието, което трябва да се третира, т.е. интравенозно, интрамускулно, подкожно, чрез локално инжектиране или локално прилагане, или непрекъснато чрез вливане и др. Количеството активно съединение, което трябва да се приложи, ще зависи от пътя на прилагане, от заболяването, което трябва да се третира, и от състоянието на пациента. Локалното инжектиране, например, ще се нуждае от по-ниско количество от протеина на основа на телесното тегло, отколкото интревенозното вливане.

Настоящото изобретение се отнася, също така, до използване на химерния протеин от изобретението или на неговите аналози или на техни смеси за третиране на рак, за трансплантиране на костен мозък, за засилване на хематопоезата, за специално тромбопоезата, за третиране на неврологични състояния, за предпазване на тъканите на черния дроб на пациенти с некротични заболявания, дължащи се на химикали (например въглерод, тетрахлорид, алкохол, парацетамол) или други причини (например вирус, операция) и използване на други приложение на IL-6 или свързаните цитокини. Подобно, настоящото изобретение се отнася, също така, до химерен протеин или негови аналози или техни смеси за използване при приготвяне на лекарствени средства за третиране на посочените заболявания или за използване в посочените предписания.

Освен за горепосочените методи за лечение, се имат предвид и ex-vivo процедури и генна терапия с химера и/или кодираща я ДНК.

Настоящото изобретение ще бъде описано в повече детайли в следните неограничителни примери и приложените фигури.

Пример 1: Конструиране на sIL-6R5gal/ IL-6 химерен експресионен вектор

На фигура 1 е показана схематична поточна диаграма на етапите, необходими за конструиране на експресионен вектор, пренасящ последователносттац кодираща за sIL-6R&;Val/ IL-6 химерен протеин, включваща всички начални и междинни вектори, различни реагенти и реакционни етапи. Тази процедура на конструиране по същество използва техники, добре известни от състоянието на техниката за кон15 струиране на желани вектори (виж, например, Sambrook et al.,). Процедурата е следната.

сДНК библиотека от T47D клетки от човешка карцинома на гърдата се клоиират в ламбда (λ) gtl 1 бактериофаг и се скринира с олигонуклеотидни проби, произлизащи от IL-6 последователности Yamasaki et al.m, (1988). Изолира се един Xgtl 1 сДНК клон, който притежава пълната човешка IL-6 кодираща последователност. Инсертът се изрязва от Xgtl 1 чрез EcoRI и се клонира в Множествен Сайт на Клониране (MCS) на Е. coli фагемид Blue Script pBS/SK (Stratagene System, LaJollia, California). Този плазмид pBS/SK-IL-6R (фигура 1) се срязва от EcoRI, който след това се затъпява и отново се срязва с EcoRV за изолиране на 5' фрагмент на IL-6R от 959 базови двойки (Ьр), завършващ при EcoRV сайта на IL-6R (координата 1203). Този фрагмент, изолиран от един агарозен електрофоретичен гел, се клонира в нов pBS/SK вектор, отворен при EcoRV на MCS (pBS/pBS/SK-sIl-6R-RV на фигура 1).

Посочената, предварително получена ДНК на pBS/SK-sIL-6R, се подлага на полимеразна верижна реакция (PCR) за амплифициране на 368 Ьр фрагмент между предния праймер 1137-1156 и обратния праймер 1505-1488. Обратният праймер се синтезира с EcoRI сайт непосредствено след кодона за Валин-356 на IL-6R (виж фигура 1), щом този Валинов остатък преди това е бил определен като карбокси-терминалната аминокиселина на естествената, форма на разтворим sIL-6R екскретиран в човешката урина (Novick et al., 1990; Oh et al., 1996; US в съпритежание 5,216,128 и EP 413908 Bl). PCR продуктът се изрязва чрез EcoRV и EcoRI и се лигира в pBS/SK-sIL-6R-RV между EcoRI на сайта на IL-6R и EcoRI на MCS (фигура 1). Полученият плазмид pBS-sIL-6R- ValRI след това се скъсява за отстраняване на 5' нетранслирани последователности чрез лигиране на Hiddlll сайта на MCS с Ncol сайта при базова двойка 410 на IL-6R (като и двата сайта първо се привеждат с тъпи краища), за получаване на pBS-siL-6R-0Val-RI-Ncol (фигура 1).

IL6R последователността произлиза от плазмид рКК 2-7, който е както е описано погоре (Chen et al., 1988) се конструира чрез инсериране на BsNI-cut IFN-32/IL-6 сДНК (Zilberstein et al., 1986) в EcoRI сайта на E.coli експресионен вектор рКК 233-3 (Pharmacia, Uppsala. Sweden) при използване на синтети чен олигонуклеотид с Ecoli сайт следван от Метионинов кодон и кодона Пролин-29 на IL-6 и завършващ при Sali и Notl (ЕсоВН) сайта. IL-6 сДНК инсертът на ρΚΚβ2-7 завършва 7 базови двойки след терминалния кодон в NalalV сайта и е следван 11 Ьр след това от Hindu сайта на ρΚΚβ223.3 вектора (фигура 1). ρΚΚβ2-7 ДНК се срязва с Hindlll, прави се с тъпи краища и отново се срязва с EcoRI, след което IL-6 сДНК се инсерира в pBS-sIL-6R6Val-RI-Ncol, така че да се слее последователността на зрелия IL-6 (започваща от Пролин -29) непосредствено след Валин-356 на IL-6R и разделена от само 3 кодона (Glu-PheMet). Полученият плазмид pBS/SK-sIL/SK-sIL6R/IR-6 (фигура 1) след това отново се срязва при Sall и Notl сайтовете на неговия MCS и инсертът се клонира в EcoRV сайта на рсДНКЗ (Invitrgen Corporetion, San Diego California). Полученият плазмид рсДНКЗ- sIL6R/IL-6 (фигура 1) съдържа инсерта в посока downstream от силния промотор на цитомегаловирус (CMV) и следван от сайт за полиаденилиране осигуряващ ефикасна транскрипция на sIL-6R0Val/IL-6 химерата. Запазването на 5' края на sIL-6R в химерния пептид осигурява под експресията на клетки на бозайници сигналния пептид да функционира и процесията на N-края на химерния протеин да е както в естествения sIL-6R.

Както е посочено по-долу, една характеристика, представляваща предимство за sIL6R8Val/IL-6 структурата, е, че предимно се сливат естествената форма на SIL-6R и естествената форма на sL-б, както съществуват в човешкото тяло, без външни полипептидни последователности. Въпреки това, запазването на EcoRI сайта в sIL-6R Val/IL-6 структурата (фигура 1) позволява лесно да се въведат линкерни полипептидни сегменти между sIL-6R и IL-6 частите. Също се конструира, една такава структура с 13-аминокиселинна, линкерна последователност Glu-Phe-Gly-AlaGly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, въведена между Val-346 на SIL-6R и Рго-29 на IL-6, (sIL-6R5Val/L/IL-6).

Пример 2 : Експресиране на sIL-6R5Val/

IL-6 химера в човешки клетки

При използване по същество на стандартни техники на култивиране на клетки от бозайници, клетъчно трансфектиране и анализ на трансфектираните клетки за експресия на новоиндуцираната ДНК последователност (за процедури, виж например, Sambrook et al., 1989), грната празмидна структура (пример 1) се използва за трансфектиране на човешки клетки и се определя тяхната експресия. Използва се следната процедура.

Човешки НЕК 293 клетки (АТСС СИВ 1573, първично трансформирани човешки ембрионални клетки от бъбрек) се трансфектират с плазматична структура рСОДНКЗ-яШ6R/IL-6 ДНК (посочена в пример 1). Култури в Log фаза на НЕК 293 се обработват с трипсин и се посяват в 9-cm Nunc блюда (2,5 х 10⁶клетки/блюдо). Един ден по-късно се провежда трансфектиране с 10 pg рСДНКЗ- sIL-6R/ IL-6 ДНК чрез СаРО₄ процедура на утаяване (Samborook et al., 1989) и един час по-късно средата се сменя с DMEM-10% FCS и култивирането продължава още допълнителни 16 h. След смяна на средата с DMEM-2% FCS, секретираните протеини се събират за два последователни периода от 48 h. Клетъчните отломки се отстраняват чрез центрофугиране при 1000 rpm в продължение на 10 min и супернатантата се тества на ELISA за sIL-6R, при използуване на поликлонално заешко анти- sIL6R и мише МсАВ 17.6 антитяло (Novick et al.,

1991). Открита бе концентрация от 1,2 pg/ml яШ-бВ-еквиваленти, която е показателна за много ефикасна експресия на химерния sIL6R/IL-6 протеин в трансфектираните човешки клетки.

Осъществява се имунопречистване на секретирания химерен протеин (sIL-6R/IL-6) с Моноклонално Антитяло 34,4 специфично за един епитоп на извънклетъчния домен на човешки sIL-6R(Novick et al., 1991; Halimi et al., 1995). 34.4 хибридомните клетки се култивират в миша перитонеална кухина и имуноглобулиновата (Ig) фракция се получава от асцитиата течност чрез утаяване с амониев сулфат. Използва се Affigel-10 (Bio-Rad Labs, Richmondq-Califomia) за имобилизиране на МсАВ 34,4 (15 mg Ig прикрепени към 1ml Affigel-10). Супернатантите, съдържащи секретираните протеини от НЕК 293 клетки, трансфектирани с рсДНКЗ- SIL-6R/IL-6 се адсорбират върху колони от МсАВ 34.4 (0,3 ml колона за 15 ml супернатанта). След промиване с PBS, свързващите протеини се елЬират чрез 25 тМ лимонена киселина pH 2,5, след което веднага се неутрализират с 1 М буфер на He pes pH 8,5 и се диализират през цялата нощ (приблизително 8-12 h) срещу PBS.

Анализът на имунепречистения протеин чрез полиакрилиа гел-електрофореза в SDS показва една единствена протеинова ивица при оцветяване с Comassie blue (фигура 2). Молекулярното тегло на протеина е 85 килодалтона, както се очаква от сливането на гликозилираните форми на sIL-6R6Val (60 kDa, както е показано в Oh еу al., 1996) и гликозилирания IL6 (23-26 kDa, както е показано от Zilberstone etal., 1986). Аминокиселинната последователност на. SIL-6R/IL-6 е от 543 аминокиселини, която след процесинг на сигналния протеин ще пред казва протеин от 524 аминокиселини или от приблизително 58 kDa (фигура 3). Много по-големият размер на SIL-6R/IL-6 химерата, продуцирана от рекомбинантна ДНК в човешки клетки, показва, че гликозилирането се изчислява от участък, който може да се изреже от молекулата.

Пример 3. SIL-6R/IL-6 химерата задържа растежа и индуцира диференциране на метастатични меланомни клетки

Клон F10.9, произлизащ от В16 меланомни клетки, образува силно метастатични тумори в С57В1аск/6 мишки, което убива животните от бeлogpoбни метастази до 2-3 месеца (Karz et al.., 1995). Прибавянето на sIL-6R/IL6 химерен протеин към F10.9 клетъчна култура води до дълбоки морфологични промени в клетките и задържане на техния растеж (фигура 4). F10.9 клетки, третирани с химера, ставата удължени, с изпъкнали дендритни удължения, като обединяват спиндлоидната диференциация на ембрионалните меланоцити или клетките на глията.

Растежът на клетките се определя количествено 4 дни след посяването на 3 х 10³ клетки в ямки на 96-ямкови микроблюда в 0,2 ml RPMI1640 среда с 10% PCS. Клетките се фиксират в 12,5% глутаралдехид за 30 min, промиват се с вода и се оцветяват с 0,1% кристал виолет за 30 min. След промиване и изсушаване, багрилото се екстрахира с 10% оцетна киселина и се определя оптичната плътност при 540 nm. Химерата продуцира зависещо от дозата инхибиране на растежа с пълно инхибиране на растежа при толкова ниски концентрации до 10 mg/ml от химерния (р85) протеин (фигура 5). И двата химерни протеина SIL 6R 5Val/IL-6 и sIl-6R5Val/ L/IL-6 (химера с по-дъл гия линкер между siL-6R и IL-6 частите, виж пример 1) са с подобна активност. Този резултат служи, също така, да покаже, че линкерният пептид между S1L-6R и IL-6 частите в химерата, не е основен за активността на химерата, щом горната sIL-6R8Val/IL-6 химера притежава само един много къс линкер от 3 аминокиселини, докато горният sIl-6R0Val/L/IL-6 притежава по-дълъг линкерен пептид от 13 аминокиселини, но и двата притежават по същество същата активност при инхибиране на рестежа на метастазните клетки в контраст, нито IL-6 самостоятелно, нито sIL-6R6Val самостоятелно инхибират растежа на тези меланомни клетки (фигура 6), като демонстрират единствената активност на sIL-6R/IL-6(p85) химерния протеин. За да се получи подобен ефект, е необходима смес от 200 - 400 mg/ml IL-6 и 123 ng/ml sIL-6R0Val (фигура 6). Когато се пресмята в молна концентрация, максималното инхибиране на F10-9 клетки изисква 7,5 nM IL-6 и 2 nM siL-6R6Val срещу само 0,12 пМ от sIL6R/IL-6 химерата.

Инхибиращата растежа активност на р85 sIL-6R/IL-6 химерен протеин се следи по време на имунопречистването върху МсАВ 34,4 колони (пример 2). Моделът на активност съответства на интензитета на р85 ивицата, която се вижда в различните фракции от SDS полиакрилната гел-електрофореза на фигура 2.

Пример 4. SIL-6R/IL-6 химерата е основна при Присаждане на трансплантирани клетки от човешки костен мозък присаждането на хематопоетични стволови клетки от човешки костен мозък може да се изучава след трансплантиране при строго комбинирани имунодефицитни (SCID) мишки (Vormoor et al., 1994). SCIDNOD мишки се подлагат на сублетанло облъчване и се инжектират в опашната вена с Зх10⁵клетки от костен мозък. Преди инжектирането, пречистените С034⁺ клетки се поддържат в продължение на 3 дни в течни култури с различни комбинации на цитокини. След един месец мишките се убиват и се взимат костите за събиране на клетките от костния мозък. Присаждането на човешки клетки в SCID-NOD мишки реципиенти се определя чрез Southern блот хибридизация към човешка повтаряема ДНК.

За фактора на стволовите клетки (SCF, steel фактор или ckit-лиганд) и РП13-лиганд (flt3/flt22 тирозин киназа рецепторен лиганд) бе открито, че е важен за преживяването и пролиферацията на повечето примитивни плурипотентни хематопоетични стволови клетки способни на дълготрайно присаждане в костен мозък на реципиент (McKenna et al., 1995). Както се вижда на фигура 7, тези два фактора са недостатъчни за спомагането на присаждането на човешки клетки в костен мозък на SCID-NOD мишки реципиенти. Прибавянето на sIL-6R/IL-6 химерен протеин е необходимо, за да може присаждането да бъде открито при значими нива. При 100 mg/ml ng/ml sIL6R/IL-6 е много по-активен, отколкото изолирания IL-6 (50-200 ng/ml) и SIL-6R (1251250 ng/ml) (фигура 7). Необходимостта от ILGR/IL химера означава, че този протеин е основен за преживяването и пролифепацията на неангажирани плурипотентни хематопоетични стволови клетки, които могат да се върнат вътре и отново да населят заобикалящата среда на костния мозък, което означава, че този протеин може да е полезен при клиничните протоколи за трансплантиране на костен мозък.

Това е първото демонстриране, че sIL6R/IL-6 химерата притежава най-малко две нови активности:

(i) Когато се добавят заедно с двата фактора FCF и Fit3-лиганд към човешки хематопоетични примитивни прогенитални (прародителски) клетки, предизвиква тяхното преживяване и пролиферация; и (й) Активна е (и явно основна) в in vivo модел на трансплантиране на човешки костен мозък в имунодефицитии мишки.

Пример 5. SIL-6R/IL-6 химерата е активна при силно пречистени примитивни хематопоетични стволови клетки

Мононуклеарни (моноядрени) клетки от кръв на човешка хорда се подлагат на фракциониране при ниска плътност на моноядрените клетки (NNC) върху Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), следвано от мини MACS комплект (Milttney Biotec, ergisch Gladbach, Germany) за приготвяне на 80% чиста популация от CD34⁺ клетки. Тези клетки след това се пасират над имобилизирано анTH-CD38 моноклонално антитяло или се сортират по флуоресцентно активираните клетки и по CD34⁺CD38 популация, което съответства, че приблизително 0,1% от първоначалните клетки са възстановени. Тези пречистени стволови клетки (20 000 клетки) се поставят в сус18 пензионна култура в 0,5 ml RPMI среда, 10% фетален телешки серум (FCS), 1% говежди серумен албумин, съдържащ 50 ng/ml фактор на стволови клетки (SCF) и 100 ng/ml (ИЗ-лиганд (FL) (и двата от R&D Systems, Mineapolis MN). 5 Половината от културите се допълват с 100 ng/ml sIL-6R/IL-6 химера, а другите се култивират без такава добавка. Инкубирането е при 37°С в 5% СО₂, в продължение на 6 дни. Броят на клетките отново популиращи костен мозък се определя чрез инжектиране (i.v.) на всички клетки от тези in vitro култури в сублетално облъчени NOD-SCID мишки. Мишките се поддържат при безбацилни условия. След 6 седмици мишките се убиват и костният мозък от техните дълги кости се отделя. Клетките от костен мозък (ВМ) се посяват върху полутвърди 0,9% метилцелулозни блюда с 30% FCS, 50 μΜ β-меркаптоетанол, 50 ng/ml IL-3,5 ng/ml (GMCSF, 6 u/ml еритропоетин (всички от (R&D Systems, Mineapolis, MN). Културите съдържат, също така, и човешки серум, условия, които предпазват от растеж на миши колонии. Резултатите (таблица IV) показват, че прибавяне на SIL-6R/IL-6 химера към суспензионни култури продуцира 30-50 пъти нарастване на броя на човешки колония образуващи клетки (CFU), получени от трансплантирани мишки, при сравнение с SCF и FL, самостоятелно. Това представлява голямо нарастване на броя на SCIDрепопулиращите столови клетки присъстващи в суспензионните култури на 6-ия ден, при сравнение с деня 0. При отсъствие на sIL-6R/ IL-6 химера, SCF и FL не водят до повишаване на броя на стволовите клетки, по време на

6-те дни на суспенсионно култивиране. ДНК на ВМ клетки, получени от трансплантирани MOD/SCID мишки се анализира чрез Southern болт, както е в пример 4. Количеството получена човешка ДНК е 10 пъти по-високо, когато мишките са получавали клетки култивирани с химера, при сравняване с мишки, получавали клетки, некултивирани с химера.

CFU родителски клетки от костен мозък на NOD/SCID мишки, както е в таблица IV, се приготвят срещу хематопоетични клетки от различни миелоидни линии (макрофаги и гранулоцити), така както еритроидна и лимфоидна линия (например, CD19⁺, CD56⁺), единствено когато човешките кръвни клетки са култивирани с SIL-6R/IL-6 химера преди трансплантирането.

Таблица IV.

Човешки стволови клетки, способни да репопулират (отново да населят) костен мозък от NOD/SCID мишки.

Прибавяне по време на суспензионното култивиране на CD34⁺CD38⁴ човешки клетки от кръв от хорда

Дни на култивиране

SCF + FL

SCF+FL+SCF+sILБрой на човешки хематопоетични колонии, образуван от ВМ от тренсплантирани NOD/SCID мишки 4

2-3

50-100

6R/IL-6

Допълнителни експерименти сравняват ефекта от SIL-6R/IL-6 върху CD34⁺CD38⁺ популация от кръв от хорда с тези върху силно пречистени CD34⁺CD38⁺ стволови клетки. In vitro експанзията на силно пречистени клетки е много по-силно засилена от sIL-6R/ IL-6, отколкото тази на пречистени клетки (таблица V). Това означава, че най-примитивните стволови клетки са предпочитани мишени за SIL/6R/IL6 ефекта върху клетъчната експанзия.

Таблица V. In vitro експанзията на хематопоетични стволови клетки

Посята клетъчна Брой кл<

популация (20 000 клетки) ия ден с експеримент 1

CD34⁴ CD38⁺ 780 000

CD34⁺CD38⁺ 42000 експеримент 2

CD34⁺ CD38⁺ 330 000

CD34⁺CD38⁺ 63000

In vitro поддържането на активността на репопулирането на костен мозък се измерва чрез нарастване продължителността на суспензионното култивиране на силно пречистени CD34⁺ CD38⁺ стволови клетки преди инжектиране на NOD/SCID мишки. Присаждането се 20 преценява чрез пропорцията на човешка ДНК в костен мозък на мишки реципиенти 6 седмици по-късно, т.е. инжектиране на култивираните клетки. Когато се добавя SIL-6R/IL-6 към SCF и FL по време на култивирането, се наб- 25 людава силно присаждане (> 1% човешка ДНК) след две седмици от култивирането, и присаждането е по-силно, отколкото при некултивираните клетки. В контраст, експерименти с култури, съдържащи SCF, FL, GM-SCF, IL-3, 30 показват, че 1 седмица след култивирането не остават SCID-репопулиращи клетки (Bhata, М. Et al., Exp. :ed. 186, 619-624, 1997).

Тези резултати показват, че SIL-6R/IL-6 позволява разсейването (експанзията) и под- 35 държането човешки примитивни стволови клетки, способни на присаждане в костен мозък реципиент. Стволовите клетки остават активни в недиференцирано състояние, докато се размножават. SIL-6R/IL-6 химерата предоста- 40 вя нов начин за култивиране на хематопоетични клетки за присаждане. Това може да позволи също да се използват ретровирусни вектори за въвеждане на гени в стволови клетки за присаждане, при протоколите за генна терапия. 45 До сега това не бе възможно с човешки стволови клетки, тъй като тези примитивни клетки на биха могли да се поддържат in vitro циклично състояние, както се изисква за интегриране на ретровирусна ДНК. SIL-6R/IL-6 химерата 50 разрешава този проблем.

Пример 6. Продуциране на SIL-6R/IL-6 :тки в 6- Брой клетки на 6-и

SC + FL ден с SC +FL + sIL,

6R/IL-6

675 000 (х 0,86)

153 000 (х 3,6)

507 000 (х 1,5)

000 (х 6,0) химера в СНО клетки

ДНК от плазмид SIL-6R/IL-6 рсДНКЗ, както на фигура 1, се ко-трансфектира в клетки от Shinese Hanster Ovary (СНО), заедно с ДНК на плазмид pDHFR, както е описано в Могу et al., (DNA 5, 181-193, 1986). Между трансфектантите, растящи в 50 пМ метотрексат, се изолира клон L12-[sIL-6R/IL-6].3a този клон е открито, че е стабилен при многобройни пасажи и полуслятите култури обикновено секретират в културалната среда количества от

1,2 gg/ml от SIL-6R/IL-6 химерата.

За пречистване на sIL-6R/IL-6xHMepaTa

3,25 1 среда от клон L12, култивиран в 2% говежди серумен албумин, се концентират до 200 ml. Количеството се адсорбира върху колона с обем 18 ml с античовешки sIL-6R Моноклонално Антитяло 34,4, прикрепено към Affigel 10 перли и се елюира, както е описано (Novick et al., Hybridoma, 10, 137-146, 1991). 25 mM елюат на лимонена киселина веднага се неутрализират с 1 Нерез буфер с pH 8,6. Протеините се концентрират върху 10 KDa cutoff мембрана от Amicon до крайна концентрация от 1 mg/ml. При провеждане на SDS-PAGE, се наблюдава единична ивица от 85 kDa, съответстваща на SIL-6R/IL-6 химерата. Гликозилирането се демонстрира чрез редуциране на размера след третиране с гликозидаза (Boehringer, Mannheim). Установено е, че биологичната активност на СНО продуциращи SIL-6R/IL-6 химера е стабилна поне за пет месеца при 4°С. Обикновено съхранението е при -70°С.

Пример 7 : Афинитет на SIL-6R/IL-6 химерата към gpl30 sIL-6R/IL-6 химера, продуцирана от

СНО и смес от IL-6 и sIL-6R се сравняват по тяхното свързване към разтворимата форма на gpl3O (sgpl3O), която е втората верига на рецепторната система за IL-6 (виж състояние на техниката). 96-ямково микротитърно блюдо (Nunc) се покрива с античовешко gpl3O моноклонално антитяло и се прибавят 50 ng/ml sgp 130 (и двете от R & D Systems, Mineapolis). След промиване с физиологичен разтвор с фосфатен буфер, се прибавя sIL-6R/IL-6 химера в различни ямки при различни концентрации, вариращи от 0,1 до 50 ng/ml. В отделни ямки се добавя ruhlL-6 (Ares-Serono, Geneva) при 500 ng/ml заедно с човешки sIL6R8Val при концентрация от 2 до 500 ng/ml. След инкубиране през цялата нощ при 4°С се прибавя заешко поликлонално aHTH-IL-6R (Oh et al., Cytokine, 401-409, 1996), следвано от кози антизаешки lg, конюгиран с пероксидаза от ряпа, която се установява чрез цветна реакция (Sigma, St. Louis). Фигура 8 показва диаграма на разсейване на резултатите. Открива се, че афинитетът на SIL-6R/IL-6 химера към gpl30 е над 4 пъти по-висок, отколкото този на двете части на прибавените поотделно молекули, съответно (6,3 х 10 М спрямо 2,6 10^|0М). Резултатът е линеен и обяснява високата активност на химерата при сравняване с IL-6+ sIL-6R комбинация върху меланома и върху хематопоетични клетки (фигура 9 и пример 4).

Пример 8. sIL-6R/IL-6 химерният протеин предпазва, от хепатотоксичност

Инжекция от въглероден тетрахлорид (СС1₄) върху мишка продуцира сериозна некроза на черния дроб, водеща до смърт на животното (Stater T.F. et al., Philos. Trans. R. Soc. Biol. Sci. 311, 633-645, 1985). Когато на мишки, които са генетично дефицитни на IL-6 (CLб'), се дават сравнително ниски дози СС1₄(2-3 ml/kg телесно тегло) чрез интерперитонеално инжектиране, степента на леталност за 24 h е около 70% (фигура 10). Инжектиране на продуцирана в СНО SIL-6R/IL-6 химера един час преди CCL₄, предпазва животните и не се установяват смъртни случаи за 24 h. В контраст, свободен rhulL-б, инжектиран по същия начин няма ефект (фигура 10). SIL-6R/IL-6 химера е ефективна при дози от 2-3 g за инжекция, което в моларно отношение е 10 пъти пониско от дозата на IL-6, която не е ефективна. При по-високи дози, CCL₄ (например, 3,5 ml/kg на фигура 10), химерата също предпазва, като смъртността е по-ниска с IL-6 или без цитокини. Разликата в смъртността между мишки, третирани с химера, и нетретирани мишки, и двата вида получаващи същото количество СС1₄ атака, е значителна при р<0,01. Хистологичните наблюдения на срезове от черен дроб оцветени с хематоксилинеозин потвърждават, че СС1₄ продуцира некроза на тъканта на черния дроб, и че 1L-6R/IL-6 химерата предпазва хепатоцитите от този токсичен ефект (непоказано).

Едно приложение на sIL-6R/IL-6 химера може да бъде за предпазване на тъканите на черния дроб при пациенти с некротично заболяване, дължащо се на химикали (например, алкохол, парацетамол) или други причини (например, вирусен хепатит).

Пример 9 : Конструиране и активност на IL-6/sIL-6R8Val химера

Конструира се химерна молекула, в която IL-6 частта е при N-края, докато SIL-6R частта е при С-края. Плазмид pBS-IL-б/ sIL6R5Val се срязва при Sau3a (bp 1086) и при Hindlll следващ стоп кодона след Val-356 (виж пример 1). Линкер, съдържащ три рестрикционни сайта : Spel, Smal и BamHl, се синтезира както следва:

Spel Smal BamHl

5' СТ AGT GGG CCC GGG GTG GCG GG

A CCC GGG CCC CAC CGC CCC TAG 5' (SEQ ID N0:2)

Този Sau3a сайт на sIL-6R се легира към BamHl на линкера и се клонира в множествения сайт на клониране на Bluescript pBS SK плазмида. IL-6 последователността се амплифицира чрез PCR от рКК 2-7 ДНК при използване на праймери (кодон на иницииране подчертан) :

Spel направо 5' GA СТА GTA GCT ATG ААС ТСС TTC ТС (SEQ ID:3)

НаеШ обратно 5' AG GGC CAT TTG CCG AAG AGC C (SEQ ID NO : 4)

PCR продуктът, срязан със Spel и Hindlll се въвежда между Spel и Smal сайта на горния линкер. Друг линкер BamHl -Ncol с вътрешен Smal се синтезира както следва :

Smal

5’ GAT CCG GGC GGC GGG GGA GGG GGG CCC GGG C [Ncol] [BamHIJGC CCG CCG CCC CCT CCT CCC GGG CCC GGT AC

5'(SEQ ID NO : 5)

Той се клонира между BamHl на предходния линкер и Ncol 1464 на sIL-6R последователността. Фрагмент от sIL-6R от SAmI 867 до Ncol 1464 се въвежда, след това между Smal на втория линкер и Ncol на SIL-6R. Получената химерна ДНК се секвенира и повторно се клонира в рсДНКЗ за експресиране в човешки НЕК 293 клетки. Аминокиселинната последователност на тази IL-6-IL-6R химера Зее показана на фигура 11 (линкерът е подчертан). Химера Зе се пречиства чрез афинитетна хроматография върху антиЛЬ-б моноклонално антитяло ( като при Novick et al., Hybridoma 8, 561-567, 1989). Върху SDS-PAGE се наблюдава ивица от 75 kDa.

Биологичната активност на IL-6-IL-6R химерата Зе за инхибиране на растежа на F10,9 меланомни клетки е показана на фигура 12. Тя е явно активна, при сравняване с SIL-6R/IL-6 химера (препарат 1-3) в същия експеримент, въпреки че е необходимо повече за 50% инхибиране на растежа.

Правят се два мутанта на SIL-6R/IL-6, в които аминокиселините His-280 и Asp-281 от IL-6 частта от SIL-6R/IL-6 (фигура 3) се променят на Ser и Val, съответно, чрез PCR мутагенеза (Мутант 39 или HD), или при които Asn230 допълнително се променя на Asp (Мутант NHD). Както може да се види от фигура 12, тези два мутанта почти не притежават активност, при сравняване с IL-6RIL-6 и IL-6-IL-6R химери. Щом като в IL-6R, тези аминокиселини реагират с gpl30, както е показано чрез молекулярно моделиране (Halimi rt al., 1995), това демнонстрира, че SIL-6R/IL-6 химерата запазва този основен сайт на взаимодействие.

В IL-6-IL-6R химера Зе липсва имуноглобулин-подобния домен на IL-6R, който присъства в SIL-6R/IL-6. Въпреки това, отстраняването само на този Ig-подобен домен от sIL6R/IL-6 не намалява биологичната активност върху F10,9 клетки. Свързването на IL-6-IL6R химера Зе към gpl30 е приблизително 30% от това на друга IL-6R/IL-6 химера (не е показано). Това ниско ниво на свързване е в съответствие с ниската активност върху растежа на меланомни клетки.

Тези резултати демонстрират, че блоки рането на IL-6 карбокситерминуса чрез сливане посредством линкер към sIL-6R, запазва добра биологична активност в такава нова химера.

Claims

Патентни претенции

1. Химерен гликозилиран разтворим интерлевкин-6 рецептор (sIL-6R)-HHTepneBKHH6 (IL-6) протеин (sIL-6R/IL-6) и негови биологично активни аналози, включващ продукт на слят протеин между по същество всички от естествено съществуващите в природата форми на sIL-6R и естествено съществуващите в природата форми на IL-6, наречен SIL-6R/ IL-6 и негови аналози, които са гликозилирани по подобен начин на гликозилирането на естествено срещаните в природата sIL-6R и IL-6.
2. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченият SIL-6R се слива към IL-6 посредством пептидна линкерна молекула.
3. Химерен sIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че посоченият линкер е много къс, неимуногенен линкер от приблизително 3 аминокиселинни остатъка.
4. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че посоченият линкер е трипептид с последователност E-F-M (Clu-Phe-Met).
5. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че посоченият линкер е пептид от 13 аминокиселинни остатъка с последователност E-F-G-AG-L-V-L-G-G-Q-F-M (G1 u-Phe-Gly- Ala-Gly-Leu- Val-Leu-GlyGly-Gly-Phe-Met).
6. Химерен sIL-6R/IL-6 протеин съгласно която и да е претенция от 1 до 4, който е проектирания в настоящото sIL-6R6Val/IL-6, притежаващ трипептиден линкер с последователност E-F-M между С-терминалния Val356 от sIL-6R и N-терминалния Рго-29 от IL6, характеризиращ се с това, че посоченият протеин притежава последователността, посочена на фигура 3.
7. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин съглас но която и да е претенция от 1, 2 и 5, който е проектирания в настоящето sIL-6R5Val/IL-6, притежаващ 13 аминокиселинен пептиден линкер с последователност E-F-G-A-G-L-V-L-GG-Q-F-M, между С-терминалния Val-356 от sIL6R и N-терминалния Рго-29 от IL-6, характеризиращ се с това, че посоченият протеин притежава последователността, посочена на фигура 3, където трипептидът от последователността E-F-M, между позиции 357-359 от фигура 3 се замества от посочената 13 аминокиселинна пептидна, последователност.
8. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин съгласно претенция 1, който е проектирания в настоящето IL-6/sIL-6R, притежаващ пълната последователност на IL-6, предхождаща sIL-6R последователността с 14 аминокиселинен пептиден линкер с последователност G-G- G-GD-P-G-G-G-G-G-G-P-G (SEQ ID NO: 6) между С- терминалния Met-212 на IL-6 и Val-112 на sIL-6R_p характеризиращ се с това, че посоченият химерен протеин притежава последователност, посочена на фигура 11.
9. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин съгласно която и да е претенция от 1 до 8, характеризиращ се с това, че посоченият протеин се продуцира в клетки на бозайници в напълно завършена форма.
10. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че посоченият протеин се продуцира в човешки клетки.
11. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че посоченият протеин се продуцира в СНО клетки.
12. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози съгласно която и да е претенция от 1 до 10, характеризиращи се с това, че посоченият химерен протеин и аналози са способни да инхибират растежа на силно злокачествени ракови клетки.
13. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози съгласно претенция 12, характеризиращи се с това, че посоченият химерен протеин и аналози са способни да инхибират растежа на силно злокачествени меланомни клетки.
14. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози съгласно която и да е претенция от 1 до 11, характеризиращи се с това, че посоченият химерен проте ин и аналози са способни да предизвикат in vitro присаждане на човешки хематопоетични клетки при трансплантиране на костен мозък.
15. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози съгласно която и да е претенция от 1 до 11, характеризиращи се с това, че посоченият химерен протеин и аналози са способни да предпазват черния дроб от хепатотоксични средства.
16. ДНК последователност, кодираща химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози, съгласно която и да е претенция от 1 до 11.
17. ДНК-ов вектор, включващ ДНК последователност, кодираща химерен SIL-6R/IL6 протеин и негови биологично активни аналози, съгласно която и да е претенция от 1 до 11, характеризиращ се с това, че посоченият вектор е подходящ за експресия на посочения химерен протеин в клетки на бозайници.
18. ДНК-ов вектор съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че посоченият вектор е подходящ за експресия на посочения химерен протеин в човешки клетки.
19. ДНК-ов вектор съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че посоченият вектор е подходящ за експресия на посочения химерен протеин в СНО клетки.
20. ДНК-ов вектор съгласно претенции 17-19, характеризиращ се с това, че посоченият вектор се експресира в клетки на бозайници или човешки клетки, като експресираният химерен протеин притежава последователност, която позволява пълния процесинг на химерния протеин от клетките на бозайници или човешките клетки и секретирането на напълно завършения химерен протеин от клетките в културалната среда, в която се култивират посочените клетки.
21. Трансформирани клетки на бозайници съдържащи ДНК-ов вектор, съгласно която и да е претенция от 17 до 20, които са способни да експресират последователността на sIL-6R/ IL-6 химерния протеин, пренасяна от посочения вектор и напълно да завършва експресирания протеин и да секретира в културалната среда, в която се култивират посочените клетки.
22. Трансформирани клетки съгласно претенция 21, характеризиращи се с това, че посочените клетки са описаните в настоящото човешки ембрионални бъбречни клетки 293 (НЕК293), трансфектирани с рсДНК SIL-6R/IL6 вектор, като посочените клетки са способни да експресират sIL-6R/ IL-6 химерния протеин, напълно да завършват посочения протеин и да секретират посочения протеин в културалната среда, в която се култивират посочените клетки под формата на приблизително 85 kDa гликопротеин.
23. Метод за продуциране на химерен протеин или на негови биологично активни аналози, съгласно която и да е претенция от 1 до 14, характеризиращ се с това, че се култивират трансформираните клетки, съгласно претенции 21 или 22, при условия, подходящи за експресиране, процесинг и секретиране на посочения протеин или аналози в културална среда, в която се култивират посочените клетки, и се пречиства посоченият протеин или неговите аналози от културалната среда.
24. Метод съгласно претенция 23, характеризиращ се с това, че пречистването се провежда чрез имуноафинитетна хроматография, при използване на моноклонални антитела, специфични за SIL-6R/IL-6.
25. Използване на химерен SIL-6R/IL-6 протеин или на негови аналози съгласно която и да е претенция от 1 до 11, соли на който и да е от тях, и техни смеси, като инхибитори на ракови клетки.
26. Използване на химерен протеин или на негов аналог съгласно претенция 25, като инхибитор на силно злокачествени меланомни клетки.
27. Използване на химерен SIL-6R/IL-6 протеин или на негови аналози съгласно която и да е претенция от 1 до 11, соли на който и да е от тях, и техни смеси, като активнасъставка за предизвикване на присаждане на човешки хематопоетични клетки при трансплантация на костен мозък .
28. Използване на химерен SIL-6R/IL-6 протеин или на негови аналози съгласно която и да е претенция от 1 до 11, соли на който и да е от тях, и техни смеси, като активна съставка за предпазване на черния дроб срещу хепато тиксични средства.
29. Използване на химерен SIL-6R/IL-6 протеин или на негови аналози съгласно която и да е претенция от 1 до 11, соли на който и да е от тях, и техни смеси, като активна съставка за увеличаване на хематопоезата, за третиране на черния дроб или неврологични състояния, или за други, приложения, в които се използват IL-6 или sIL-6R.
30. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин или негови аналози съгласно която и да е претенция от 1 до 11, соли на който и да е от тях, и техни смеси за използване при приготвянето на лекарствено средство за третиране на рак при бозайници за инхибиране на ракови клетки при бозайници или за приготвяне на лекарствено средство за засилване трансплантацията на костен мозък за предизвикване на присаждане на човешки хематопоетични клетки при трансплантиране на костен мозък, или за приготвяне на лекарствено средство за засилване на хематопоезата, или за приготвяне на лекарствено средство за третиране на чернодробни или неврологични нарушения, или за приготвяне на лекарствено средство за други приложения, при които се използват IL-6 или SIL-6R.
31. Фармацевтичен състав съгласно която и да е претенция от 1 до 11, характеризиращ се това, че включва като активна съставка химерен SIL-6R/IL-6 протеин или негов аналог, и фармацевтично приемлив носител, разредител или пълнител.
32. Фармацевтичен състав съгласно претенция 31, характеризиращ се това, че се прилага за третиране на рак.
33. Фармацевтичен състав съгласно претенция 31, характеризиращ се това, че се прилага за засилване на трансплантацията на костен мозък.
34. Фармацевтичен състав съгласно претенция 31, характеризиращ се с това, че се прилага за третиране на неврологични нарушения и нарушения на черния дроб, или за увеличаване на хематопоезата или за групи приложения, при които се използват IL-6 или SIL-6R.