PL199212B1 - Chimerowe glikozylowane białko rozpuszczalny receptor interleukiny-6 - interleukina-6 i jego biologicznie aktywne analogi, ich zastosowanie i sposób wytwarzania, kodująca je sekwencja DNA, wektor DNA, transformowane komórki oraz kompozycja farmaceutyczna - Google Patents

Chimerowe glikozylowane białko rozpuszczalny receptor interleukiny-6 - interleukina-6 i jego biologicznie aktywne analogi, ich zastosowanie i sposób wytwarzania, kodująca je sekwencja DNA, wektor DNA, transformowane komórki oraz kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number
PL199212B1
PL199212B1 PL338002A PL33800298A PL199212B1 PL 199212 B1 PL199212 B1 PL 199212B1 PL 338002 A PL338002 A PL 338002A PL 33800298 A PL33800298 A PL 33800298A PL 199212 B1 PL199212 B1 PL 199212B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
sil
cells
chimeric protein
protein
sequence
Prior art date
Application number
PL338002A
Other languages
English (en)
Other versions
PL338002A1 (en
Inventor
Michel Revel
Judith Chebath
Tsvee Lapidot
Orit Kollet
Original Assignee
Yeda Res & Dev
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26323470&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL199212(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from IL12128497A external-priority patent/IL121284A0/xx
Application filed by Yeda Res & Dev filed Critical Yeda Res & Dev
Publication of PL338002A1 publication Critical patent/PL338002A1/xx
Publication of PL199212B1 publication Critical patent/PL199212B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5412—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Dostarczono w szczególno sci chimerowe bia lka skonstruowane z fuzji naturalnie wyst epuj acych postaci rozpuszczalnego receptora IL-6 i IL-6, które s a po zyteczne w leczeniu nowotworów i zaburze n w atroby, polepszaniu transplantacji szpiku kostnego i leczeniu innych stanów zwi azanych z IL-6. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest chimerowe glikozylowane białko rozpuszczalny receptor interleukiny-6-interleukina-6 i jego biologicznie aktywne analogi, ich zastosowania i sposób wytwarzania, kodująca je sekwencja DNA, wektor DNA, transformowane komórki oraz kompozycja farmaceutyczna.
Niniejszy wynalazek należy ogólnie do nurtu badań nad aktywnością biologiczną interleukiny-6 (IL-6), która jest zależna od agonistycznego działania rozpuszczalnego receptora IL-6 (sIL-6R). Bardziej konkretnie niniejszy wynalazek dotyczy nowych chimerowych białek sIL-6R/IL-6 złożonych z fuzji zasadniczo naturalnie występujących postaci sIL-6R i IL-6 i ich biologicznie aktywnych analogów, które są szczególnie korzystne do leczenia nowotworów poprzez hamowanie wzrostu komórek nowotworowych, do polepszania transplantacji szpiku kostnego, do leczenia chorób wątroby i innych stanów związanych z IL-6.
Interleukina-6 (IL-6) jest dobrze znaną cytokiną, w biologicznej aktywności, której pośredniczy błonowy system receptora zawierający dwa różne białka - jedno z nich nazywane jest receptorem IL-6 (IL-6R lub gp80), a drugie gp130 (praca przeglądowa Hirano i wsp., 1994). Rozpuszczalne postacie IL-6R (sIL-6R) odpowiadające zewnątrzkomórkowej domenie gp80 są naturalnymi produktami ciała ludzkiego, których obecność jako glikoprotein można stwierdzić we krwi i moczu (Novick i wsp., 1990, 1992). Wyjątkową właściwością cząsteczek sIL-6R jest to, że działają jako silni agoniści IL-6 na wielu typach komórek, w tym komórkach ludzkich (Taga i wsp., 1989; Novick i wsp., 1992). Wynika to z faktu, że nawet bez wewną trzcytoplazmatycznej domeny gp80, sIL-6R jest nadal zdolny do wywoływania dimeryzacji gp130 w odpowiedzi na IL-6, co z kolei bierze udział w dalszej transdukcji sygnału i efektach biologicznych specyficznych dla IL-6 (Murakami i wsp., 1993). Aktywny kompleks receptora IL-6 jest faktycznie heksamerową strukturą tworzoną przez dwa łańcuchy gp130 dwa IL-6R i dwa ligandy IL-6 (Ward i wsp., 1994; Panoessa i wsp., 1995), w którym sIL-6R ma dwa rodzaje interakcji z gp130, z których obie są niezbę dne dla aktywnoś ci biologicznych specyficznych wobec IL-6 (Halimi i wsp., 1995).
Działanie sIL-6R powoduje zwiększenie aktywności biologicznych IL-6 w wielu typach komórek. Przykładem są komórki nowotworów, których wzrost jest hamowany w większym stopniu przez IL-6, gdy dodany jest sIL-6R, takie jak komórki białaczki szpikowej M1 myszy (Taga i wsp., 1989), ludzkie komórki raka sutka T47D (Novick i wsp., 1992) lub ludzkie komórki niedrobnokomórkowego raka płuca (Ganapathi i wsp., 1996). IL-6 ma działanie antymetastatyczne in vivo (Katz i wsp., 1995), sIL-6R może też zwiększyć takie efekty przeciwnowotworowe IL-6 in vivo (Mackiewicz i wsp. 1995).
Inną aktywnością IL-6, która jest wzmagana przez dodanie sIL-6R, jest stymulacja komórek hematopoetycznych z wytworzeniem wieloliniowych kolonii (Sui i wsp., 1995). Obecni twórcy zaobserwowali także, że przeżycie pierwotnych hodowli komórek oligodendrocytów mózgu jest wspierane przez kombinację sIL-6R i IL-6 (Oh, 1997), podczas gdy sam IL-6 ma słabą aktywność w takich hodowlach (Kahn i De Vellis, 1994). To ujawnienie wskazuje, że IL-6, gdy jest połączona z sIL-6R, może imitować aktywność innych neurotropowych cytokin, takich jak rzęskowy czynnik neurotropowy (CNTF, ciliary neurotropic factor) lub czynnik hamujący białaczki (LIF, leukemia inhibitory factor), które też działają poprzez gp130, jak to ma miejsce dla IL-11 i Onkostatyny M (Hirano i wsp., 1994).
W próbie dostarczenia cz ą steczki, która moż e łączyć powyż sze wskazane funkcje IL-6 i sIL-6R niedawno donoszono o wytwarzaniu w zrekombinowanych komórkach drożdży fuzji białkowej między obciętym odcinkiem ludzkiej sekwencji IL-6R i IL-6, połączonych przez bogaty w glicynę łącznik (Fischer i wsp., 1997). Ta fuzja białkowa obejmuje zasadniczo tylko domenę N-końcową receptora cytokiny IL-6R i domenę C-końcową receptora cytokiny. Tak więc, pozbawiona jest zasadniczo całej domeny IL-6R podobnej do immunoglobuliny (Ig) i regionu pre-błonowego receptora (region między domeną C-końcową i domeną transbłonową). Jako taki odpowiada on obciętej postaci sIL-6R, przy czym obcięty sIL-6R w fuzji białkowej jest połączony przez opisany powyżej bogaty w glicynę łącznik do zasadniczo całej dojrzałej postaci IL-6. Poza tym, że nie posiada ona części naturalnego sIL-6R, fuzja białkowa w wyniku wytwarzania przez komórki drożdży nie ma wzoru glikozylacji takiego, jaki miałaby fuzja białkowa, gdyby była wytwarzana w komórkach ssaków, w szczególności np. komórkach ludzkich. W istocie, ta wytworzona przez drożdże fuzja białkowa ma masę cząsteczkową wynoszącą tylko około 57 kDa w odróżnieniu od produktu fuzji zawierającego zasadniczo wszystkie reszty aminokwasowe naturalnych sIL-6R i IL-6, który jest w pełni glikozylowany w komórkach ssaczych (np. ludzkich), i ma oczekiwaną masę cząsteczkową około 85 kDa (patrz przykład 2 poniżej).
PL 199 212 B1
Powszechne doświadczenie w opracowywaniu zrekombinowanych białek, które mogą być stosowane do leczenia ludzi wykazało, że jest ważne aby pozostawać możliwie najbliżej naturalnych postaci białek, które występują w ciele ludzkim, aby uniknąć wywołania przeciwciał i innych efektów ubocznych obserwowanych z niewystępującymi naturalnie zrekombinowanymi produktami. Dlatego też było korzystne stosowanie układów zrekombinowanych komórek ssaczych, aby produkowały glikozylowane białka, takie jak interferon-β lub czynnik stymulujący kolonie granulocytów (Chernajovsky i wsp., 1984, Holloway, 1994) w postaci chemicznej możliwie najbardziej podobnej do naturalnego ludzkiego produktu. Bakterie lub mikroorganizmy, takie jak na przykład drożdże, które nie przeprowadzają właściwej glikozylacji, także powodują błędne składanie łańcuchów białkowych, prowadząc do reakcji immunogennych. Jest to szczególnie ważne w odniesieniu do IL-6, która jest sILnie modyfikowana potranslacyjnie przez N- i O- glikozylację, jak i przez fosforylację (przegląd w Revel, 1989) oraz w odniesieniu do naturalnego sIL-6R z ludzkiej krwi i moczu, który jest glikoproteiną, której aminokwasy N-i C- końcowe są stałe i zostały określone (Novick i wsp., 1990 i patenty, których współwłaścicielami są obecni twórcy Nr US 5,216,128 i odpowiadający mu EP 413908 B1).
Tak więc wydaje się, że wskazany powyżej produkt fuzji między częściami sIL-6R i IL-6 ma pewną liczbę potencjalnych wad, szczególnie odnośnie jego zastosowania do leczenia ludzi i to ze względu na fakt, że brak mu części sIL-6R, jak i że jest wytwarzany w drożdżach, które mogą powodować nieprawidłową glikozylację białka.
Dotychczas nie jest opisana cząsteczka fuzyjna zawierająca naturalny sIL-6R obecny w ludzkich płynach ustrojowych i naturalną IL-6, i która jest wytwarzana w komórkach ludzkich lub innych komórkach ssaków.
Jest więc celem niniejszego wynalazku dostarczenie takiej cząsteczki fuzyjnej zawierającej naturalny sIL-6R i naturalną IL-6 (w dowolnej kolejności), która jest wytwarzana w komórkach ssaka, zastosowanie takiego białka fuzyjnego (chimery sIL-6R/IL-6) przy bardzo niskich dawkach do hamowania wzrostu wysoce metastatycznych komórek czerniaka, które są oporne na samą IL-6 lub sIL-6R, lub do zasiedlania in vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych w protokołach transplantacji szpiku, oraz zastosowanie takiej fuzji białkowej w innych zaburzeniach związanych z IL-6, np. chorobach wątroby lub neurologicznych. Niniejszym ujawnione zostały również farmaceutyczne kompozycje, które zawierają fuzję białkową sIL-6R-naturalna IL-6 (chimerę sIL-6R/IL-6) do leczenia nowotworów i innych zaburzeń związanych z IL-6, np. chorób wątroby i neurologicznych, oraz do stosowania w procedurach transplantacji szpiku.
Aspekty niniejszego wynalazku będą przedstawione lub wynikną z następującego ujawnienia.
Twórcy wynalazku wytworzyli pewną liczbę białek fuzyjnych (chimer), z których każde zawiera zasadniczo cały naturalnie występujący sIL-6R z ludzkich płynów ustrojowych i zasadniczo całą dojrzałą postać naturalnie występującej ludzkiej IL-6, połączone przez krótkie peptydy łącznikowe, które mogą być tak krótkie, że będą miały długość 3 reszt aminokwasowych, lub dłuższe, na przykład składające się z 13 reszt aminokwasowych (patrz poniżej i przykłady 1 i 2). Należy podkreślić, że jednak w tych białkach peptydy łącznikowe mogą zostać pominięte i reszta sIL-6R może być bezpośrednio połączona z resztą IL-6. Ponieważ łączniki przedstawiające niewystępujące naturalnie sekwencje aminokwasów mogą być immunogennymi epitopami wywołującymi przeciwciała u pacjentów, pożądana jest chimera z bezpośrednio połączonych sIL-6R/IL-6, która ma pożądaną aktywność biologiczną i przy podawaniu której minimalizowane jest ryzyko tworzenia takich potencjalnie szkodliwych przeciwciał.
Zachowanie całej sekwencji sIL-6R, w tym całej domeny Ig-podobnej, takiej jaka jest obecna w naturalnie występującej cząsteczce, jak i odpowiednia glikozylacja i inne potranslacyjne modyfikacje wprowadzane przez komórki ludzkie lub ssacze, gdy powyższa chimera jest wytwarzana w takich komórkach, są również ważne dla zmniejszenia potencjalnej immunogenności chimerowego produktu białkowego.
Jednak możliwe jest stosowanie bardzo krótkiego łącznika z około trzech aminokwasów w punkcie połączenia między ugrupowaniami sIL-6R i IL-6 chimerowego białka. Taki krótki łącznik nie byłby immunogennym epitopem. Jest też oczywiście możliwe stosowanie dłuższych łączników do około 30 aminokwasów, aby zapewnić rozdzielenie między dwoma ugrupowaniami, ale należy dołożyć starań i wykonać doświadczenia badające skuteczność i bezpieczeństwo biologiczne, aby zapewnić, że chimerowe cząsteczki z takimi łącznikami nie są immunogenne.
Faktycznie, nieoczekiwanie wykazano, że takie dłuższe łączniki nie są niezbędne do działania chimerowego białka wskazując, że właściwe składanie chimery nie wymaga dłuższego łącznika, szczególnie gdy zasadniczo całe naturalnie występujące sekwencje reszt sIL-6R i IL6 są włączone
PL 199 212 B1 do cząsteczki chimerowej (patrz przykład 3 i fig. 5, które także dotyczą porównania między chimerą sIL-6R/IL-6 mającą bardzo krótki łącznik (3 aminokwasy) i podobną chimerą mającą dłuższy łącznik z 30 aminokwasów).
Te fuzje białkowe albo chimery sIL-6R/IL-6 były skutecznie wytwarzane sposobem według wynalazku, w układach ekspresyjnych ssaków, w którym uzyskano glikozylowane produkty mające silną aktywność w stosunku do komórek nowotworów, które na ogół nie reagują na samą IL-6 lub sam sIL-6R, i które były bardzo skuteczne w zapewnianiu powodzenia zasiedlania transplantowanych komórek ludzkiego szpiku (patrz poniżej i przykłady 1-4). Faktycznie, w takich przeszczepach szpiku chimery sIL-6R/IL-6 były niezbędne do przeżycia i proliferacji transplantowanych niezdeterminowanych pluripotentnych macierzystych komórek hematopoetycznych. Co więcej, z wyników doświadczeń przedstawionych poniżej, jak i z innych analiz okazuje się, że można przygotować różne analogi chimerowego białka sIL-6R/IL-6 według wynalazku, które mają zasadniczo taką samą aktywność biologiczną jak chimery sIL-6R/IL-6; analogi te są chimerami sIL-6R/IL-6, w których usunięto, dodano lub zastąpiono jedną lub więcej reszt aminokwasowych, a jedynym ograniczeniem dla takich analogów jest zachowanie większości naturalnie występującej sekwencji sIL-6R i IL-6. Na przykład, dodanie aminokwasów do naturalnie występujących sekwencji sIL-6R i IL-6 jest korzystnie ograniczone do około 20 aminokwasów, i korzystnie te addycje są w miejscu połączenia między sIL-6R i IL-6, tzn. w czą steczce łącznika. Podobnie, delecje z sekwencji sIL-6R i IL-6 są korzystnie ograniczone do około 20-30 aminokwasów i substytucje reszt aminokwasowych w sekwencjach sIL-6R i IL-6 przez inne reszty aminokwasowe są korzystnie też ograniczone do około 20-30 aminokwasów. Wszystkie z uprzednio wymienionych delecji, addycji i podstawień są akceptowalne zgodnie z niniejszym wynalazkiem, gdy tak zmodyfikowane analogi zasadniczo zachowują biologiczną aktywność chimery sIL-6R/IL-6 złożonej zasadniczo z naturalnie występujących sekwencji, i gdy są wyrażane w komórkach ssaków, zachowują zasadniczo ten sam wzór glikozylacji chimery złożonej z zasadniczo naturalnie występujących sekwencji.
Tak więc według wynalazku chimerowe glikozylowane białko rozpuszczalny receptor interleukiny-6 (sIL-6R) - interleukina-6 (IL-6) (s-IL-6R/IL-6) i jego biologicznie aktywne analogi, zawierają produkt fuzji białkowej między sIL-6R i IL-6, przy czym s-IL-6R/IL-6 i jego analogi zachowują ten sam wzór glikozylacji co naturalnie występujące sekwencje, gdy są wyrażane w komórkach ssaków, sIL-6R i IL-6 s ą naturalnie wystę pują cymi postaciami lub charakteryzują się aminokwasowymi addycjami do 20 aminokwasów, delecjami do 30 aminokwasów i/lub substytucjami do 30 aminokwasów w sekwencji naturalnie występującej, a sIL-6R jest połączony z IL-6 bezpośrednio lub przez cząsteczkę łącznika peptydowego, który jest trójpeptydera o sekwencji E-F-M (Glu-Phe-Met) lub peptydem złożonym z 13 reszt aminokwasowych o sekwencji E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-LeuGly-Gly-Gln-Phe-Met).
Chimerowe białko sIL-SR/IL-6 według wynalazku, określane jako sIL-6R8Val/IL-6, korzystnie zawiera łącznik trójpeptydowy o sekwencji E-F-M pomiędzy C-końcową Val-356 sIL-SR i N-końcową Pro-29 IL-6, oraz ma sekwencję przedstawioną na fig. 3. Chimerowe białko sIL-6R/IL-6 według wynalazku, określane jako sIL-6R8Val/L/IL-6, korzystnie zawiera 13 aminokwasowy łącznik peptydowy o sekwencji E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M pomiędzy C-końcową Val-356 sIL-6R i N-końcową Pro-29 IL-6 i ma sekwencję przedstawioną na fig. 3, przy czym trójpeptyd o sekwencji E-F-M między pozycjami 357-359 na fig. 3 jest zastąpiony przez wskazaną 13-aminokwasową sekwencję peptydu.
Korzystniej chimerowe białko sIL-6R/IL-6 według wynalazku jest otrzymywane in vitro w komórkach ssaków w postaci po całkowitej obróbce, a najkorzystniej jest otrzymywane w komórkach ludzkich. Chimerowe białko sIL-SR/IL-6 i jego biologicznie aktywne analogi według wynalazku są korzystnie zdolne do hamowania wzrostu wysoce złośliwych komórek nowotworowych, w szczególności złośliwych komórek czerniaka, do wywołania in vivo zasiedlania ludzkich komórek hematopoetycznych w przeszczepach szpiku kostnego lub do ochrony wątroby przed czynnikami hepatotoksycznymi.
Przedmiotem wynalazku jest również sekwencja DNA kodująca chimerowe białko sIL-6R/IL-6 i jego biologicznie aktywne analogi według wynalazku.
Dodatkowo, niniejszy wynalazek dotyczy wektora DNA zawierającego sekwencję DNA według wynalazku, który jest odpowiedni do ekspresji kodowanego przez nią chimerowego białka w komórkach ssaków, korzystnie w komórkach ludzkich. Również korzystnie wektor DNA według wynalazku, charakteryzuje się tym, że kiedy ulega ekspresji we wskazanych komórkach, wyrażane chimerowe białko ma sekwencję, która pozwala na jego pełną obróbkę przez te komórki i wydzielanie chimerowego, poddanego całkowitej obróbce białka z komórek do pożywki hodowlanej, w której są hodowane te komórki.
PL 199 212 B1
Opisany niniejszym wektor może być plazmidem oznaczonym jako pcDNA sIL-6R/IL-6, który zawiera wektor pcDNA3 obejmujący sekwencję DNA kodującą chimerowe białko sIL-6R/IL-6 pod kontrolą promotora wirusa cytomegalii (CMV). Ponadto wektor DNA może być plazmidem oznaczonym jako pcDNA sIL-6R/L/IL-6, który zawiera wektor pcDNAB obejmujący sekwencję DNA kodującą chimerowe białko sIL-6R/IL-6 pod kontrolą promotora wirusa cytomegalii (CMV), przy czym w sekwencję DNA kodującą chimerowe białko sIL-6R/IL-6 wstawiona jest sekwencja łącznika kodująca peptyd łącznikowy w miejscu EcoRI umieszczonym między sekwencją kodującą część sIL-6R i sekwencją kodującą część IL-6 białka.
Ponadto przedmiotem wynalazku są transformowane komórki ssaka zawierające wektor DNA według wynalazku, które są zdolne do ekspresji sekwencji chimerowego białka sIL-6R/IL-6 niesionej przez ten wektor i do całkowitej obróbki wyrażanego białka i wydzielenia go do pożywki hodowlanej, w której hodowane są te komórki.
Opisane niniejszym komórki mogą być komórkami nerki zarodka ludzkiego 293 (HEK 293) transfekowanymi wektorem pcDNA sIL-6R/IL-6, przy czym komórki te są zdolne do ekspresji chimerowego białka sIL-6R/IL-6, całkowitej obróbki tego białka i wydzielenia go w postaci około 85 kDa glikoproteiny do pożywki, w której hodowane są te komórki. Inną postacią wykonania transformowanych komórek są opisane niniejszym komórki CHO (jajnik chomika chińskiego) transfekowane wektorem pcDNA sIL-6R/IL-6, przy czym komórki te są zdolne do ekspresji chimerowego białka sIL-6R/IL-6, całkowitej obróbki tego białka i wydzielenia go w postaci glikoproteiny około 85 kDa do pożywki, w której hodowane są te komórki.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania chimerowego białka lub jego biologicznie aktywnych analogów według wynalazku, w którym hoduje się transformowane komórki według wynalazku w warunkach odpowiednich do ekspresji, obróbki i wydzielania białka lub analogów do pożywki hodowlanej, w której hodowane są komórki; oraz oczyszcza się białka lub analogi z pożywki hodowlanej. Korzystnie oczyszczanie w sposobie według wynalazku prowadzi się przez chromatografię immunopowinowactwa z zastosowaniem monoklonalnych przeciwciał specyficznych wobec sIL-6R.
Chimerowe białko według wynalazku ma szereg zastosowań, w tym:
(i) zastosowanie chimerowego białka sIL-6R/IL-6 lub analogów, soli dowolnego z nich i ich mieszanin jako inhibitorów komórek nowotworowych;
(ii) zastosowanie jak w (i) powyżej jako inhibitora wysoce złośliwych komórek czerniaka;
(iii) zastosowanie chimerowego białka sIL-6R/IL-6 lub analogów, soli dowolnego z nich i ich mieszanin jako składnika czynnego do wywoływania zasiedlenia ludzkich komórek hematopoetycznych w przeszczepach szpiku kostnego;
(iv) zastosowanie chimerowego białka sIL-6R/IL-6 lub analogów, soli dowolnego z nich i ich mieszanin jako składnika czynnego do zwiększenia hematopoezy, leczenia chorób wątroby lub neurologicznych lub do innych zastosowań, w których stosowane są IL-6 lub sIL-6R.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie chimerowego białka sIL-6R/IL-6 lub analogów według wynalazku, soli dowolnego z nich i ich mieszanin jako inhibitora komórek nowotworowych ex vivo. Korzystnie komórkami nowotworowymi są złośliwe komórki czerniaka.
Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania chimerowego białka sIL-6R/IL-6 lub jego analogu według wynalazku, soli dowolnego z nich i ich mieszanin lub sekwencji DNA według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia raka u ssaków przez hamowanie komórek rakowych ssaka, korzystnie wysoce złośliwych komórek czerniaka, do wspomagania przeszczepu szpiku kostnego przez wywoływanie zasiedlenia ludzkich komórek hematopoetycznych w przeszczepach szpiku kostnego, do zwiększenia hematopoezy, do leczenia chorób wątroby lub chorób neurologicznych, lub do innych zastosowań, w których stosowane są IL-6 lub sIL-6R.
Co więcej, przedmiotem wynalazku jest też kompozycja farmaceutyczna zawierająca jako składnik czynny chimerowe białko sIL-6R/IL-6 lub jego analog według wynalazku, sole dowolnego z nich i ich mieszaniny lub sekwencję DNA według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę.
Niniejszym opisane zostały:
(i) kompozycja farmaceutyczna do leczenia nowotworów u ssaków;
(ii) kompozycja farmaceutyczna do wspomagania transplantacji szpiku kostnego;
(iii) kompozycja farmaceutyczna do leczenia chorób wątroby lub neurologicznych, lub do zwiększenia hematopoezy lub do innych zastosowań, w których stosowane są IL-6 lub sIL-6R.
PL 199 212 B1
Niniejszym opisano również sposoby leczenia nowotworów u ssaków, sposoby wspomagania transplantacji i sposoby leczenia chorób wątroby lub neurologicznych, oraz sposoby zwiększenia hematopoezy, które obejmują podanie pacjentowi kompozycji farmaceutycznej według wynalazku w odpowiedniej postaci dawkowania i odpowiednią drogą podania.
Niniejszym opisane zostały chimery między IL-6 i sIL-6R w dowolnym porządku, tzn. N-końcowe i C-końcowe części mogą być odwrócone i chimera jest wówczas białkiem IL-6-sIL-6R, choć wszędzie tu jest określana jako białko sIL-6R/IL-6.
Inne aspekty i postacie niniejszego wynalazku są podane lub wynikają z następującego szczegółowego ujawnienia wynalazku.
Krótki opis figur
Figura 1 (A, B) przedstawia schematycznie różne wektory, odczynniki i etapy procesów, które były stosowane w konstrukcji chimerowej cząsteczki DNA kodującej chimerowe białko, w którym zakonserwowana jest struktura naturalnej postaci sIL-6R kończąca się na reszcie Val 356, po której następuje sekwencja naturalnej, dojrzałej, obrobionej postaci IL-6, jak podano szczegółowo w przykładzie 1.
Figura 2 (A, B) przedstawia wyniki uzyskane z analizy wykonanej, aby zidentyfikować chimerę sIL-6RδVal/IL-6 p86 za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (A) i przez profile bioaktywności (B), gdzie na fig. 2A przedstawiono obraz barwionego błękitem Coomassie żelu, na którym poddano elektroforezie immunooczyszczone frakcje eluowane z kolumn do chromatografii powinowactwa naładowanych wydzieloną próbką białka, uzyskaną z hodowli komórek transfekowanych wektorem kodującym chimerowe białko, a na fig. 2B przedstawiono graficznie aktywność biologiczną (hamowanie wzrostu komórek czerniaka F10.9) każdej z powyższych wymienionych frakcji eluowanych z kolumn do chromatografii powinowactwa, jak podano szczegółowo w przykładach 2 i 3.
Figura 3 przedstawia sekwencję aminokwasów (kod jednoliterowy) chimery sIL-6RδVal/IL-6, na której pokazano różne domeny cząsteczki, w tym N-końcowy peptyd sygnałowy (linia nad sekwencją), domenę immunoglobulino-podobną (Ig-podobną), domenę N-końcową receptora cytokiny (podkreślona), domenę C-końcową cytokiny (linia nad sekwencją) i region przedbłonowy receptora (obszar między domeną C-końcową i domeną transbłonową), całą część sIL-SR chimery; jak i dojrzałą resztę IL-6 (podkreślona) chimery, jak opisano w przykładach 1 i 2.
Figura 4 (A, B) przedstawia fotografie komórek czerniaka F10.9 w hodowli bez (A) i z (B) działaniem chimerowym białkiem sIL-6R/IL-6 przez 4 dni, przy czym na fig. 4B widoczne są morfologiczne zmiany indukowane w takich metastatycznych komórkach czerniaka (komórkach F10.9) przez działanie chimerą sIL-6R/IL-6 jak opisano w przykładzie 3.
Figura 5 jest graficznym przedstawieniem pokazującym zahamowanie wzrostu komórek czerniaka F10.9 przez chimerowe białko sIL-6R/IL-6 przy różnych stężeniach chimery w zakresie od około 0,12 ng/ml do około 150 ng/ml, przy czym chimera z łącznikiem z tylko 3 aminokwasami IL-6RIL-6, jak opisano w przykładzie 3, jest porównywana z chimerą z długim trzynastoaminokwasowym łącznikiem z (IL-6RLIL6).
Figura 6 jest graficznym przedstawieniem wyników pokazujących brak efektów hamowania wzrostu komórek czerniaka F10.9 albo przez sam wyizolowany IL-6 (kropkowana górna krzywa z pustymi kwadratami) przy stężeniach IL-6 w zakresie od 0-40 ng/ml i sam sIL-6R (punkt zbieżności wszystkich krzywych na osi pionowej, gdzie stężenie IL-6 wynosi zero); jak i obserwowane efekty hamowania wzrostu, gdy IL-6 i sIL-6R są dodawane razem w różnych stężeniach każdego, gdzie stężenie IL-6 jest w zakresie od 10 ng/ml do 40 ng/ml, a sIL-6R jest dodawany w trzech stężeniach 100 ng/ml, 200 ng/ml i 400 ng/ml dla każdego stężenia IL-6, jak zilustrowano przez trzy dolne krzywe (dwie kropkowane krzywe z pustymi trójkątami i kółkami i pełna krzywa z zaciemnionymi kwadratami) jak opisano w przykładzie 3.
Figura 7 jest reprodukcją autoradiogramu hybrydyzacji Southern przedstawiającą wymóg obecności chimerowego białka sIL-6R/IL-6 do udanego zasiedlenia ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych podczas transplantacji komórek szpiku kostnego w myszach SCID-NOD (dwie ścieżki z prawej strony przedstawiają myszy, które otrzymały chimerowe białko sIL-6R/IL-6 oprócz innych potrzebnych czynników, SCF, FLT-3 i odmiennie od trzech ścieżek z lewej, które przedstawiają myszy, które otrzymały tylko SCF i FLT-3 i SCF, FLT-3 jak i oddzielne, tzn. niepołączone IL-6 i sIL-GR) jak opisano w przykładzie 4.
PL 199 212 B1
Figura 8 jest wykresem typu Scatchard właściwości powinowactwa chimery sIL-6R/IL-6 w porównaniu z mieszaniną IL-6 i sIL-6R; wartości dla chimery są przedstawione przez wypełnione kwadraty a dla mieszaniny przez zaciemnione romby, stosunek nachyleń wynosi 4 do 1.
Figura 9 przedstawia wyższą aktywność chimery sIL-6R/IL-6 w stosunku do komórek czerniaka F10.9 w porównaniu z mieszaniną sIL-6R + IL-6 lub z sIL-6R (bez IL-6).
Figura 10 przedstawia ochronę przez chimerę sIL-6R/IL-6 przeciwko toksyczności wobec wątroby, wartości przedstawiają średnią z 4 eksperymentów, zaciemnione kwadraty przedstawiają myszy IL-6-/-, zaciemnione romby przedstawiają myszy IL-6-/- otrzymujące IL-6 i zaciemnione gwiazdy przedstawiają myszy IL-6-/- otrzymujące chimerę.
Figura 11 przedstawia sekwencję aminokwasów (kod jednoliterowy) chimery 3e IL-6-sIL-6RδVal, łącznik podkreślono.
Figura 12 pokazuje biologiczną aktywność chimery 3e w stosunku do komórek czerniaka z fig. 9 (zaciemnione gwiazdy) w porównaniu z chimerą sIL-6R/IL-6 (zaciemnione kwadraty) i dwoma mutantami (Mutt 39 (HD) - zaciemnione romby i Mutt NHD - puste gwiazdy) jak opisano w przykładzie 9.
Niniejszy wynalazek dotyczy chimerowego białka sIL-6R/IL-6 i jego biologicznie czynnych analogów, które zawierają zasadniczo całe naturalnie występujące postacie sIL-6R i zasadniczo całą dojrzałą postać naturalnie występującej ludzkiej IL-6 połączone razem, których połączenie może mieć miejsce poprzez peptydy łącznikowe, które mogą być tak krótkie jak 3 reszty aminokwasowe, i które to chimerowe białko sIL-6R/IL-6 lub analogi mają podobną ilość i wzór glikozylacji jak naturalnie występujący sIL-6R i IL-6. Okazało się, że takie chimerowe białko sIL-6R/IL-6 wytworzone zgodnie z niniejszym wynalazkiem w komórkach ssaczych, w szczególności komórkach ludzkich (patrz przykłady 1-4 poniżej) lub komórkach CHO (patrz przykład 6 poniżej) jest skutecznie wyrażane w takich komórkach, jest wysoce glikozylowane i ma silną aktywność w stosunku do komórek guza, które nie wykazują żadnej odpowiedzi na sam IL-6 lub sIL-6R.
Bardziej szczegółowo, zgodnie z niniejszym wynalazkiem zaobserwowano (patrz przykłady 1-3 poniżej), że wymienione uprzednio chimerowe białko sIL-6R/IL-6 według wynalazku powoduje zatrzymanie wzrostu wysoce złośliwych komórek ssaków, takich jak komórki czerniaka F10.9 w stężeniach niższych niż potrzebne, gdy stosowana jest mieszanina niepołączonych sIL-6R i IL-6. Jest to szczególnie znaczący wynik w świetle faktu, że takie komórki czerniaka F10.9 nadal rosną normalnie, gdy są poddane działaniu tylko IL-6 lub tylko sIL-6R oddzielnie i przechodzą zatrzymanie wzrostu tylko, gdy są eksponowane na stosunkowo wysokie dawki kombinacji niepołączonych IL-6 i sIL-6R. Tak więc chimerowe białko sIL-6R/IL-6 według wynalazku jest zadziwiająco silniejszym inhibitorem tych wysoce złośliwych komórek czerniaka niż mieszanina jego oddzielnych części tzn. mieszanina niepołączonych IL-6 i sIL-6R. Chimerowe białko według wynalazku jest więc szczególnie pożyteczne jako aktywny czynnik w leczeniu różnych rodzajów nowotworów.
Wyższa aktywność chimerowego białka sIL-6R/IL-6 jest tłumaczona przez jego wyższe powinowactwo do gp130 niż mieszaniny niepołączonych IL-6 i sIL-6R (przykład 7).
Co więcej, stwierdzono także zgodnie z tym wynalazkiem (patrz przykład 4 poniżej), że chimerowa cząsteczka sIL-6R/IL-6 według tego wynalazku jest szczególnie pożyteczna dla wspomagania przeszczepu szpiku. Faktycznie, stosując znany protokół dla zasiedlenia ludzkich komórek szpiku kostnego do myszy ze złożonym surowym niedoborem odporności (SCID), u których czynnik komórek macierzystych (SCF) i ligand Flt3 są stosowane do umożliwienia przeżycia i proliferacji najbardziej prymitywnych pluripotencjalnych hematopoetycznych komórek macierzystych zdolnych do długoterminowego zasiedlenia szpiku kostnego biorcy, stwierdzono, że te dwa czynniki, SCF i ligand Flt3 były niewystarczające, aby promować zasiedlenie ludzkich komórek u myszy-biorcy szpiku kostnego i że zasiedlenie było tylko udane, gdy dodawano także chimerowe białko sIL-6R/IL-6. Ten wynik wskazuje, że chimerowe białko może być niezbędne w takich protokołach zasiedlenia. W tych samych doświadczeniach, gdy dodawano oddzielnie niepołączone IL-6 i sIL-6R, były one niewystarczające do promowania udanego przeszczepu szpiku kostnego i gdy były dodane razem, były znacznie mniej aktywne niż chimerowe białko sIL-6R/IL-6, tzn. w efektywnym stężeniu 100 ng/ml chimerowe białko sIL-6R/IL-6 promowało skuteczne przeszczepienie szpiku, podczas gdy dwa oddzielne niepołączone sIL-6R i IL-6, gdy były dodane razem w jeszcze wyższych dawkach (sIL-6R od 125-1250 ng/ml, IL-6 od 50-200 ng/ml), były znacznie mniej aktywne w promowaniu takiego przeszczepu.
Powyższe chimerowe białko sIL-6R/IL-6 według wynalazku jest korzystnie zrekombinowaną chimerą sIL-6R/IL-6 wytwarzaną w komórkach ludzkich lub dowolnym innym odpowiednim układzie ekspresji komórek ssaków, takim jak komórki CHO chomika, które są zdolne do glikozylacji białek, tak jak
PL 199 212 B1 to robią komórki ludzkie, i który wprowadza te same potranslacyjne modyfikacje jak komórki ludzkie. Ważną cechą jest, że chimerowa glikoproteina tak wytworzona jest obrabiana i modyfikowana tak, jak są naturalne wyjściowe cząsteczki sIL-6R i IL-6 spotykane w ludzkim ciele, bez skrócenia i bez przyłączania dodatkowych niewystępujących naturalnie sekwencji peptydowych, z wyjątkiem bardzo krótkiego trójpeptydu lub gdy dłuższy peptyd łącznikowy jest włączony między resztami sIL-6R i IL-6 chimerowego białka.
Aby przygotować powyższe korzystne chimerowe białko według wynalazku uwzględniono następujące cechy naturalnie występującego sIL-6R i IL-6. Wiadomo, że IL-6R obecny w ludzkich błonach komórkowych jest wytwarzany przez cDNA kodujący 468 aminokwasów zawierających peptyd sygnałowy, domenę immunoglobulino(Ig)-podobną, domenę wiązania cytokiny, region transbłonowy i domenę cytoplazmatyczną (Yamasaki i wsp., 1988). W płynach ustrojowych znajduje się rozpuszczalną postać sIL-6R, która podobnie jak dojrzały IL-6R z błon, ma N-koniec odpowiadający Leu-20 (Novick i wsp., 1990) i C-koniec odpowiadający Val-356 tuż przed regionem transbłonowym IL-6R (zob. US Pat. Nr 5216128 i EP 413908 B1, których współwłaścicielami są autorzy wynalazku). Aby połączyć tę sekwencję sIL-6R do IL-6, wprowadzono miejsce restrykcyjne EcoRI po Val-356. Sekwencja dojrzałego IL-6 rozpoczynająca się od Pro-29 cDNA kodującego IL-6 i kończąca się na Met-212 (Zilberstein i wsp., 1986; Hirano i wsp., 1986) została wprowadzona po tym miejscu EcoRI. W tym miejscu EcoRI można też było, choć niekoniecznie, wstawić peptyd łącznikowy o pożądanej długości, aby oddzielić reszty sIL-SR i IL-6 od siebie w chimerowym białku. Jak przedstawiono w przykładach poniżej, wytworzono dwa różne białka chimerowe jako przykłady takich możliwych białek chimerowych, jedno miało łącznik trójpeptydowy a drugie miało łącznik z 13 reszt aminokwasów w tym miejscu EcoRI, przy czym oba były zasadniczo równie aktywne biologicznie.
Niniejszy wynalazek też dotyczy analogów powyższego chimerowego białka sIL-6R/IL-6 według wynalazku, które to analogi zachowują zasadniczo tę samą aktywność biologiczną chimerowego białka, mając zasadniczo tylko naturalnie występujące sekwencje sIL-6R i IL-6. Takie analogi mogą być takimi, w których do około 30 reszt aminokwasów uległo delecji, dodaniu lub podstawieniu przez inne w ugrupowaniu sIL-6R i/lub IL-6 białka chimerowego, tak że modyfikacje tego typu zasadniczo nie zmieniają biologicznej aktywności analogu chimerowego białka odnośnie samego chimerowego białka i w których ugrupowanie sIL-6R zasadniczo zachowuje naturalnie występującą strukturę (przed obróbką - zob. fig. 3) peptydu sygnałowego, domeny Ig-podobnej, domeny N-końcowej receptora cytokin, domeny C-końcowej receptora cytokin, i domeny przedbłonowej receptora. Podobnie, takie analogi chimerowych białek powinny zachować zasadniczo naturalnie występującą dojrzałą formę ugrupowania IL-6. Rozmaite analogi mogą różnić się najbardziej między sobą i od podstawowej cząsteczki białka chimerowego (tej z zasadniczo tylko naturalnie występującymi sekwencjami sIL-6R i IL-6) w miejscu peptydu łącznikowego, który łączy reszty sIL-6R i IL-6 w chimerowym białku. Taki łącznik może mieć do 30 aminokwasów długości i służy do rozdzielenia reszt sIL-6R i IL-6 od siebie w chimerowym białku. O ile chodzi o łącznik, należy ostrożnie dobrać jego sekwencję (i stąd też przebadać biologicznie w odpowiednich standardowych oznaczeniach każdy taki analog), tak żeby nie powodował on, na przykład, niewłaściwego fałdowania chimerowego białka, które może uczynić je nieczynnym, lub nie nadał analogowi chimerowego białka immunogenności, która wywoła powstanie przeciwciał przeciw niemu u pacjenta, który ma być tym leczony, z wynikiem takim, że analog będzie nieskuteczny przynajmniej jako lek średnio-lub długoterminowy.
W analogach chimerowych białek według wynalazku, jedną lub więcej do około 30 reszt aminokwasów podstawowego białka chimerowego według wynalazku zastąpiono przez inne reszty aminokwasowe lub usunięto, lub jedną lub więcej reszt aminokwasów dodano do oryginalnej sekwencji chimerowego białka według wynalazku (takiego, które zawiera zasadniczo tylko naturalnie występujące sekwencje sIL-6R i IL-6) bez znacznego zmieniania aktywności wynikających produktów w porównaniu z podstawowym białkiem chimerowym według wynalazku. Te analogi przygotowuje się za pomocą znanych technik syntezy i/lub przez mutagenezę ukierunkowaną, lub dowolnymi innymi znanymi odpowiednimi do tego technikami.
Dowolny taki analog korzystnie ma sekwencję aminokwasową na tyle odtwarzającą chimerę podstawową sIL-6R/IL-6, że ma zasadniczo podobną do niej aktywność. Tak więc można określić, czy dowolny dany analog ma zasadniczo tę samą aktywność jak podstawowe białko chimerowe według wynalazku, za pomocą rutynowych eksperymentów obejmujących poddanie takiego analogu testom aktywności biologicznej przestawionym w przykładach 2-4 poniżej.
PL 199 212 B1
Analogi chimerowego białka, które mogą być stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem, lub kodujące go kwasy nukleinowe, obejmują skończony zestaw zasadniczo odpowiadających sobie sekwencji jako substytucyjne polipeptydy lub polinukleotydy, które mogą być rutynowo uzyskane przez osobę o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie bez nadmiernej pracy eksperymentalnej, w oparciu o wskazówki i wytyczne tu przedstawione. Szczegółowy opis chemii i budowy białek został przedstawiony w Schulz, G.E., i wsp., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, Nowy Jork, 1978; i Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, które są tu włączone na drodze odniesienia. Substytucje sekwencji nukleotydów, takie jak preferencje kodonów, przedstawiono w Ausubel i wsp., powyżej, w części A.1.1-A.1.24 i Sambrook i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, Interscience N.Y., część 6.3 i 6.4 (1987, 1992) w dodatkach C i D.
Korzystne zmiany wprowadzane do analogów zgodnie z niniejszym wynalazkiem to tak zwane substytucje „konserwatywne. Konserwatywne substytucje aminokwasów w chimerowym białku mającym zasadniczo naturalnie występujące sekwencje sIL-6R i IL-6, mogą zawierać synonimowe aminokwasy w obrębie grupy, które mają dostatecznie podobne właściwości fizykochemiczne, tak że podstawienie między członkami grupy zachowa biologiczną funkcję cząsteczki, Grantham, Science, tom 185, str. 862-864 (1974). Jest jasne, że insercje i delecje aminokwasów mogą być też zrobione w zdefiniowanych powyżej sekwencjach bez zmiany ich funkcji, szczególnie jeśli insercje lub delecje dotyczą tylko kilku aminokwasów, np. poniżej trzydziestu, i korzystnie poniżej dziesięciu, i nie usuwają ani nie przesuwają aminokwasów, które mają decydujące znaczenie dla funkcjonalnej konformacji, np. reszt cysteiny, Anfinsen „Principles That Govern The Folding of Protein Chains”, Science, tom 181, str. 223-230 (1973). Analogi wytworzone przez takie delecje i/lub insercje wchodzą w zakres niniejszego wynalazku.
Korzystne grupy synonimowych aminokwasów są zdefiniowane w tabeli 1. Bardziej korzystne grupy synonimowych aminokwasów są zdefiniowane w tabeli 2 i najbardziej korzystnie grupy synonimowych aminokwasów są zdefiniowane w tabeli 3.
T a b e l a 1
Korzystne grupy synonimowych aminokwasów
Aminokwas Grupa synonimowa
Ser Ser, Thr, Gly, Asn
Arg Arg, Gin, Lys, Glu, His
Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro Gly, Ala, Thr, Pro
Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala Gly, Thr, Pro, Ala
Val Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys Ser, Thr, Cys
His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn Gln, Asp, Ser, Asn
Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp Glu, Asn, Asp
Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
Met Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp Trp
T a b e l a 2
Korzystniejsze grupy synonimowych aminokwasów Aminokwas Grupa synonimowa
Ser Ser
Arg His, Lys, Arg
Leu Leu, Ile, Phe, Met
PL 199 212 B1
Pro Ala, Pro
Thr Thr
Ala Pro, Ala
Val Val, Met, Ile
Gly Gly
Ile Ile, Met, Phe, Val,
Phe Met, Tyr, Ile, Leu,
Tyr Phe, Tyr
Cys Cys, Ser
His His, Gln, Arg
Gln Glu, Gln, His
Asn Asp, Asn
Lys Lys, Arg
Asp Asp, Asn
Glu Glu, Gln
Met Met, Phe, Ile, Val,
Trp Trp
T a b e l a 3
Najkorzystniejsze grupy synonimowych aminokwasów
Grupa synonimowa
Leu
Phe
Leu
Aminokwas
Ser Ser
Arg Arg
Leu Leu, Ile,
Pro Pro
Thr Thr
Ala Ala
Val Val
Gly Gly
Ile Ile, Met,
Phe Phe
Cys Cys, Ser
His His
Gln Gln
Asn Asn
Lys Lys
Asp Asp
Glu Glu
Met Met, Ile,
Trp Met
Met
Leu
Leu
Przykłady otrzymywania substytucji aminokwasowych w białkach, które mogą być zastosowane do uzyskania analogów chimerowego białka do stosowania w rozwiązaniach według wynalazku, obejmują etapy dowolnych znanych sposobów, takich jak przedstawiono w patentach US RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585 i 4,737,462, dla Mark i wsp.; 5,116,943 dla Koths i wsp., 4,965,195 dla Namen i wsp.; 4,879,111 dla Chong i wsp.; i 5,017,691 dla Lee i wsp.; i podstawione lizyną biał ka przedstawione w patencie US nr 4,904,584 (Shaw i wsp.).
W innym korzystnym wykonaniu wynalazku, dowolny analog chimerowego białka do stosowania w rozwią zaniach według wynalazku ma sekwencję aminokwasową zasadniczo odpowiadają c ą sekwencji podanego powyżej podstawowego białka chimerowego wynalazku. Określenie „zasadniczo odpowiadająca ma na celu objęcie analogów z małymi zmianami w sekwencji podstawowego białka chimerowego, które nie wpływają na jego podstawowe cechy, w szczególności o ile chodzi, na przykład, o jego zdolność do hamowania proliferacji komórek nowotworowych lub promowania transplantacji szpiku kostnego. Typ zmian, które na ogół uważa się za będące w zakresie określenia „zasadniczo odpowiadająca obejmuje takie zmiany, które powstałyby z konwencjonalnych technik mutagenezy DNA kodującego chimerowe białko, dając kilka małych modyfikacji, i testowania pod kątem pożądanej aktywności w sposób opisany powyżej.
PL 199 212 B1
Analogi zgodne z niniejszym wynalazkiem obejmują te kodowane przez kwas nukleinowy, taki jak DNA lub RNA, który w warunkach ostrych hybrydyzuje do DNA lub RNA kodujących chimerowe białko według wynalazku i który obejmuje zasadniczo całe naturalnie występujące sekwencje kodujące sIL-6R i IL-6. Na przykład, hybrydyzujący DNA lub RNA może być takim, który koduje to samo białko według wynalazku mające, na przykład, sekwencję przedstawioną na fig. 3, ale który różni się w swojej sekwencji nukleotydowej od naturalnej sekwencji nukleotydowej ze względu na degenerację kodu genetycznego, tzn. nieco inna sekwencja kwasu nukleinowego ze względu na degenerację może nadal kodować tę samą sekwencję aminokwasów. Co więcej, jak wskazano powyżej, ilość zmian aminokwasów (delecje, addycje, substytucje) jest ograniczona do około 30 aminokwasów, tak że nawet przy maksymalnej ilości zmian, analogi według niniejszego wynalazku będą to takie, które zasadniczo zachowują sekwencję liderową (przed obróbką), domenę Ig-podobną, domeny N- i C-końcowe receptora cytokin i obszar prebłonowy receptora (region między domeną C-końcową i domeną transbłonową) w ugrupowaniu sIL-6R i zasadniczo całe ugrupowanie IL-6. Taki kwas nukleinowy byłby pierwszorzędnym kandydatem do określenia, czy koduje on polipeptyd, który zachowuje aktywność funkcjonalną chimerowego białka według wynalazku. Określenie „warunki ostre” dotyczy warunków hybrydyzacji i następującego po nim płukania, które w tej dziedzinie określa się zwyczajowo jako „ostre”. Zobacz Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, powyżej, Interscience, N.Y., część 6.3 i 6.4 (1987, 1992) i Sambrook i wsp., powyżej. Bez ograniczenia, przykłady warunków ostrych obejmują warunki płukania 12-20°C poniżej wyliczonej Tm badanej hybrydy w, np., 2 x SSC i 0,5% SDS przez 5 minut, 2 x SSC i 0,1% SDS przez 15 minut; 0,1 x SSC i 0,5% SDS w 37°C przez 30-60 minut i następnie 0,1 x SSC i 0,5% SDS w 68°C przez 30-60 minut. Specjalista rozumie, że warunki ostrości także zależą od długości sekwencji DNA, sond oligonukleotydowych (takich jak 10-40 zasad) lub mieszanych sond oligonukleotydowych. Jeśli stosowane są mieszane sondy, jest korzystne stosowanie chlorku tetrametyloamoniowego (TMAC) zamiast SSC. Zobacz Ausubel, powyżej.
Określenie „sole” dotyczy zarówno soli grup karboksylowych i soli addycyjnych z kwasami grup aminowych białka chimerowego według wynalazku lub jego analogów. Sole grup karboksylowych mogą być wytworzone za pomocą sposobów znanych w technice i obejmują sole nieorganiczne, na przykład sole sodowe, wapniowe, amonowe, żelazowe lub cynkowe i tym podobne i sole z organicznymi zasadami, takie jak otrzymane na przykład z aminami, takimi jak trietanoloamina, arginina, lizyna, piperydyna, prokaina i tym podobne. Sole addycyjne z kwasami obejmują, na przykład, sole z kwasami mineralnymi, takimi jak, na przykład, kwas chlorowodorowy lub kwas siarkowy, i sole z kwasami organicznymi, takimi jak, na przykład, kwas octowy lub kwas szczawiowy. Oczywiście takie sole muszą mieć zasadniczo podobne aktywności do białka chimerowego według wynalazku lub jego analogów.
Niniejszy wynalazek dotyczy też sekwencji DNA kodujących powyższe chimerowe białko według wynalazku i jego analogi, jak i wektorów DNA niosących takie sekwencje DNA do ekspresji w odpowiednich ssaczych, korzystnie ludzkich komórkach. Postacią wykonania wektora według wynalazku jest plazmidowy DNA sIL-6R/IL-6 obejmujący wektor pcDNA3 (Invitrogen) zawierający połączone sekwencje sIL-6R/IL-6 pod kontrolą promotora wirusa cytomegalii (CMV).
Niniejszy wynalazek dotyczy też transformowanych komórek ssaków, korzystnie ludzkich, zdolnych do ekspresji powyższych białek według wynalazku. Postacią wykonania takich transformowanych komórek są komórki nerki ludzkiego zarodka 293 (HEK 293, ATCC CRL 1575) transfekowane przez pcDNA sIL-6R/IL-6, które wydzielają fuzję chimerową sIL-6R/IL-6 jako 85 kDA glikoproteinę.
Dalszą postacią wykonania jest plazmid pcDNA sIL-SR/IL-6, który różni się od powyższego pcDNA sIL-6R/IL-6 insercją w miejsce EcoRI krótkich łączników kodujących 10 dodatkowych aminokwasów. Szereg innych sekwencji różnych długości może być wprowadzony w celu optymalizacji odległości między sIL-6R i IL-6.
Wynalazek obejmuje też chimerowe białko, w którym reszta IL-6 jest przed sIL-6R (jak na fig. 11).
Niniejszy wynalazek dalej dotyczy sposobu wytwarzania i oczyszczania chimerowego białka według wynalazku lub jego analogów, który obejmuje hodowanie powyższych transformowanych komórek w warunkach odpowiednich do ekspresji i wydzielania chimerowego produktu białkowego do pożywki i następnie oczyszczenie wydzielonego białka za pomocą chromatografii immunopowinowactwa stosując monoklonalne przeciwciała anty-sIL-6R 34.4 jak wskazano w przykładzie 2 i 5 poniżej.
Wynalazek dotyczy także kompozycji farmaceutycznej zawierającej jako składnik czynny chimerę sIL-GR/IL-6 lub jej analogi lub mieszaniny i farmaceutycznie akceptowalny nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę. Postać wykonania kompozycji farmaceutycznych według wynalazku obejmuje kompozycję
PL 199 212 B1 farmaceutyczną do wzmagania aktywności typu IL-6, do leczenia nowotworów, do transplantacji szpiku kostnego, do zwiększenia hematopoezy, w szczególności trombopoezy, do leczenia stanów neurologicznych, do leczenia zaburzeń wątroby oraz innych zastosowań IL-6 lub pokrewnych cytokin.
Farmaceutyczne kompozycje według wynalazku są przygotowane do podania przez zmieszanie chimerowego białka lub jego analogów z fizjologicznie dopuszczalnymi nośnikami i/lub stabilizatorami i/lub zarobkami i przygotowane w dawkach np. za pomocą liofilizacji w fiolkach z dawkami. Sposób podania może być realizowany za pomocą dowolnej z przyjętych metod podawania dla podobnych środków, np. przez podanie dożylne, domięśniowe, podskórne, wstrzyknięcie lokalne lub miejscowe zastosowanie, lub wlew ciągły, i będzie zależeć od stanu leczonego. Skuteczna ilość związku, który ma być podany, będzie zależeć od drogi podawania, leczonej choroby i stanu pacjenta. Lokalne wstrzyknięcie, na przykład, będzie wymagało mniejszej ilości białka na daną masę ciała niż dożylny wlew.
Chimerowe białko według wynalazku lub jego analogi lub mieszaniny mogą być stosowane do leczenia nowotworów, do transplantacji szpiku kostnego, do zwiększenia hematopoezy, w szczególności trombopoezy, do leczenia stanów neurologicznych, do ochrony wątroby u pacjentów z chorobami nekrotycznymi wywołanymi przez związki chemiczne (np. czterochlorek węgla, alkohol, paracetamol) lub inne przyczyny (np. wirusowe, chirurgiczne) oraz mogą być wykorzystane w innych zastosowaniach IL-6 lub pokrewnych cytokin. Podobnie niniejszy wynalazek też dotyczy chimerowego białka lub jego analogów lub ich mieszanin do zastosowania w wytwarzaniu leków do wyżej wymienionych terapii chorób lub do stosowania w odnotowanych powyżej wskazaniach.
W dodatku do powyż ej wymienionych sposobów leczenia, rozważ ane są takż e procedury ex vivo i terapia genowa chimerą lub kodującym ją DNA.
Niniejszy wynalazek będzie obecnie opisany bardziej szczegółowo w następujących nieograniczających przykładach i w towarzyszących rysunkach.
P r z y k ł a d 1
Konstrukcja wektora ekspresyjnego do wytwarzania chimery sIL-6RδVal/IL-6.
Na fig. 1 pokazano schematycznie przebieg etapów przeprowadzonych w celu skonstruowania wektora ekspresyjnego niosącego sekwencję kodującą chimerowe białko sIL-6RδVal/IL-6, łącznie z wszystkimi wyjściowymi i pośrednimi wektorami, rozmaitymi odczynnikami i etapami reakcji. Przy konstrukcji zastosowano zasadniczo znane w tej dziedzinie techniki do konstruowania wybranych wektorów ekspresyjnych (patrz, na przykład, Sambrook i wsp., 1989). Procedura była pokrótce następująca:
Bibliotekę cDNA z komórek T47D ludzkiego raka sutka sklonowano w bakteriofagu lambda (λ) gtl1 i przeszukiwano przy użyciu sond oligonukleotydowych pochodzących z sekwencji IL-6R Yamasaki i wsp. (1988). Wyizolowano jeden klon cDNA na λgt11, który zawierał całą sekwencję kodującą ludzkiego IL-6R. Wstawkę wycięto z λgt11 przy użyciu EcoRI i sklonowano w obrębie zgrupowania miejsc do klonowania (MCS, ang. Multiple Cloning Site) fagemidu E. coli Blue Script pBS/SK (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, Kalifornia). Plazmid ten, pBS/SK-IL-6R (fig. 1), przecięto EcoRI, a następnie jego końce przekształcono w tępe i przecięto go EcoRV w celu wyizolowania fragmentu 5' IL-6R o długości 959 par zasad (bp), kończącego się w miejscu EcoRV IL-6R (pozycja 1203). Fragment ten wycięto z żelu agarozowego poprzez elektroforezę i sklonowano w nowym wektorze pBS/SK, otwartym w miejscu EcoRV MCS (pBS/SK-sIL-6R-RV na fig. 1).
Jak zaznaczono powyżej, otrzymany uprzednio DNA pBS/SK-IL-6R poddano reakcji łańcuchowej polimerazy (PGR, ang. Polymerase Chain Reaction) w celu powielenia fragmentu 368 bp pomiędzy starterem lewym 1137-1156 i starterem prawym 1505-1488. Starter prawy zsyntetyzowano z miejscem EcoRI bezpośrednio za kodonem waliny 356 IL-6R (patrz fig. 1), ponieważ wcześniej stwierdzono, że ta reszta walinowa stanowi koniec karboksylowy naturalnej postaci rozpuszczalnej sIL-6R wydalanej w ludzkim moczu (Novick i wsp., 1990; Oh i wsp., 1996; stanowiący wspólną własność patent USA nr 5,216,128 i patentu europejskiego nr EP 413908 B1). Produkt PGR przecięto następnie EcoRV i EcoRI i poddano ligacji z pBS/SK-sIL-6R-RV pomiędzy miejscem EcoRV IL-6R a miejscem EcoRI w MCS (fig. 1). Otrzymany rezultacie plazmid pBS-sIL-6R^Val-RI skrócono następnie w celu usunięcia niepodlegających translacji sekwencji 5' poprzez ligację miejsca Hindlll MCS z miejscem Ncol w pozycji nukleotydowej 410 IL-6R (oba miejsca wcześniej zmieniono na tępe), otrzymując pBS-sIL-6R^Val-RI-NcoI (fig. 1).
Sekwencja IL-6 pochodziła z plazmidu pKKe2-7, który, jak opisano wcześniej (Chen i wsp., 1988), skonstruowano poprzez wstawienie cDNA IFN-e2/IL-6, przeciętego BstNI (Zilberstein i wsp.,
PL 199 212 B1
1986) w miejscu EcoRI wektora ekspresyjnego E. coli pKK223-3 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja), przy zastosowaniu syntetycznego oligonukleotydu z miejscem EcoRI, po którym następował kodon metioninowy i kodon dla proliny 29 IL-6, a na końcu znajdowało się miejsce BstNI (EcoRII). Wstawka cDNA IL-6 w pKKe32-7 kończy się 7 par zasad za kodonem terminacyjnym w miejscu NlaIV, a 11 par zasad za nim DNA pKKe2-7 przecięto Hindlll, końce zmieniono na tępe i przecięto ponownie EcoRI, po czym wstawkę cDNA IL-6 wstawiono do pBS-sIL-6R^Val-RI-NcoI, tak, aby dołączyć dojrzałą sekwencję IL-6 (rozpoczynającą się od proliny 29) bezpośrednio za waliną 356 IL-6R, tak, że są one rozdzielone jedynie przez trzy kodony (Glu-Phe-Met). Otrzymany w rezultacie plazmid pBS/SK-sIL-6R/IL-6 (fig. 1) przecięto następnie w miejscach SalI i Notl w MCS i wstawkę sklonowano w miejscu EcoRV pcDNA3 (Invitrogen Corporation, San Diego, Kalifornia). Otrzymany w rezultacie plazmid pCDNA3-sIL-6R/IL-6 (fig. 1) zawiera wstawkę za silnym promotorem wirusa cytomegalii (CMV), a za nią znajduje się miejsce poliadenylacji zapewniające wydajną transkrypcję chimery sIL-6RδVal/IL-6. Konserwacja końca 5' sIL-6R w chimerze gwarantuje, że po ekspresji w komórkach ssaczych funkcja peptydu sygnałowego i obróbka końca N chimerowego białka będą takie, jak w naturalnym sIL-6R.
Jak wskazano powyżej, korzystną właściwością konstruktu sIL-6RδVal/IL-6 jest to, że jest on zasadniczo fuzją naturalnej formy sIL-GR z naturalną formą IL-6, takich jakie występują w ciele człowieka, bez obcych sekwencji polipeptydowych. Jednakże, konserwacja miejsca EcoRI w konstrukcie sIL-6RδVal/IL-6 (fig. 1) umożliwia łatwe wprowadzenie polipeptydowego fragmentu łącznikowego pomiędzy części sIL-6R i IL-6. Jeden z takich konstruktów, z 13-aminokwasową sekwencją łącznikową Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met wprowadzoną pomiędzy Val-356 sIL-6R i Pro-29 IL-6, został również skonstruowany (sIL-6RδVal/L/IL-6).
P r z y k ł a d 2: Ekspresja chimery sIL-6RδVa1/IL-6 w komórkach ludzkich.
Przy zastosowaniu zasadniczo standardowych technik hodowli komórek ssaczych, transfekcji komórek i analizy transfekowanych komórek pod kątem ekspresji nowo wprowadzonych sekwencji DNA, które mają podlegać ekspresji (w celu znalezienia procedur, patrz, na przykład, Sambrook i wsp., 1989), powyższy konstrukt plazmidowy (przykład 1) zastosowano do transfekcji komórek ludzkich i testowano w nich jego ekspresję. Pokrótce, zastosowano następujące procedury:
Ludzkie komórki HEK 293 (ATCC CRL 1573, transformowane pierwotne komórki embrionalne ludzkiej nerki) transfekowano konstruktem plazmidowym pCDNA3-sIL-6R/IL-6 DNA (przedstawionym powyżej w przykładzie 1). Hodowle HEK 293 w fazie wzrostu logarytmicznego poddawano działaniu trypsyny i wysiewano na płytki Nunc o średnicy 9 cm (2,5 x 106 komórek/płytkę). Jeden dzień później, przeprowadzono transfekcję przy użyciu 10 μg pCDNA3-sIL-6R/IL-6 DNA stosując metodę wytrącania CaPO4 (Sambrook i wsp., 1989), a po upływie 1 godziny pożywkę zmieniano na DMEM-10% FCS i hodowlę kontynuowano przez dodatkowe 16 godzin. Po zmianie pożywki na DMEM-2% FCS, wydzielane białka zbierano po dwóch następujących po sobie okresach 48 godzin. Szczątki usuwano poprzez wirowanie przy 1000 obr. na min. przez 10 min., a supernatant testowano pod kątem sIL-6R metodą ELISA przy zastosowaniu poliklonalnego króliczego anty-sIL-6R i mysiego McAB 17.6 (Novick i wsp., 1991). Stwierdzono, że stężenie sIL-6R odpowiada 1,2 μg/ml, co oznacza bardzo wydajną ekspresję chimerowego białka sIL-6R/IL-6 w stransfekowanych komórkach ludzkich.
Oczyszczanie z użyciem przeciwciał wydzielanego białka chimerowego (sIL-6R/IL-6) przeprowadzono stosując Monoklonalne Przeciwciało 34.4 swoiste wobec epitopu w zewnątrzkomórkowej domenie ludzkiej sIL-6R (Novick i wsp., 1991; Halimi i wsp., 1995). Komórki hybrydoma 34.4 hodowano w jamie otrzewnowej myszy i frakcję immunoglobulin (Ig) otrzymano z płynu puchlinowego poprzez wytrącanie siarczanem amonu. Affigel-10 (Bio-Rad Labs, Richmond, Kalifornia) zastosowano do unieruchomienia McAB 34.4 (15 mg Ig związanej z 1 ml Affigel-10). Supernatanty zawierające wydzielone białka z komórek HEK 293 transfekowanych pCDNA3-sIL-6R/IL-6 adsorbowano na kolumnach z McAB 34.4 (0,3 ml kolumny na 15 ml supernatantu). Po przepłukaniu PBS, związane białka wymywano 25 mM kwasem cytrynowym pH 2,5, a następnie natychmiast zobojętniano 1 M buforem Hepes pH 8,5 i dializowano przez noc (około 8-12 godz.) wobec PBS.
Analiza oczyszczonych przy użyciu przeciwciał białek poprzez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z SDS wykazała obecność pojedynczego prążka po barwieniu błękitem Coomassie (fig. 2). Ciężar cząsteczkowy białka wynosił 85 kilodaltonów, jak oczekiwano dla fuzji glikozylowanych postaci sIL-6RδVal (60 kDa, jak pokazano w Oh i wsp., 1996) i IL-6 (23-26, kDa jak pokazano u Zilberstein i wsp., 1986). Sekwencja aminokwasowa sIL-6R/IL-6 składa się z 543 aminokwasów, co po obróbce peptydów sygnałowych daje białko o długości 524 aminokwasów i masie około 58 kDa (fig. 3). Znacznie
PL 199 212 B1 większe rozmiary chimery sIL-6R/IL-6 wytworzonej ze zrekombinowanego DNA w komórkach ludzkich wskazują, że glikozylacja odpowiada za dużą część masy białka.
P r z y k ł a d 3: Chimera sIL-6R/IL-6 zatrzymuje wzrost i indukuje różnicowanie się metastatycznych komórek czerniaka.
Klon F10.9 pochodzący z komórek B16 czerniaka wytwarza wysoce metastatyczne guzy u myszy C57Black/6, które zabijają myszy na skutek przerzutów do płuc w przeciągu 2-3 miesięcy (Katz i wsp., 1995). Dodanie chimerowego biał ka sIL-6R/IL-6 do hodowli komórek F10.9 powoduje gruntowne zmiany morfologiczne komórek i zatrzymanie ich wzrostu (fig. 4). Komórki F10.9 traktowane białkiem chimerowym stają się wydłużone, z wystającymi wypustkami dendrytycznymi, przypominając wrzecionowate różnicowanie się zarodkowych melanocytów lub komórek glejowych.
Wzrost komórek oceniano ilościowo 4 dni po wysianiu 3 x 103 komórek na studzienkę w 96-studzienkowej mikropłytce w 0,2 ml pożywki RPMI 1640 z 10% FCS. Komórki utrwalano 12,5% aldehydem glutarowym przez 30 minut, przemywano wodą i barwiono 0,1% fioletem krystalicznym przez 30 minut. Po starannym przemyciu i wysuszeniu, barwnik ekstrahowano 10% kwasem octowym i określano gęstość optyczną przy 540 nm. Białko chimerowe wykazywało zależne od dawki hamowanie wzrostu z całkowitym zahamowaniem przy stężeniach tak niskich, jak 10 ng/ml białka chimerowego (p85) (fig. 5). Obydwa białka chimerowe, sIL-6RδVal/IL-6 i sIL-6RδVal/L/IL-6 (chimera z dłuższym łącznikiem między ugrupowaniami sIL-6R i IL-6, patrz przykład 1) , były aktywne w podobnym stopniu. Wynik ten pokazuje również, że peptyd łącznikowy pomiędzy częściami sIL-SR i IL-6 chimery nie jest istotny dla aktywności białka chimerowego, ponieważ chimera sIL-6RδVal/IL-6 ma jedynie bardzo krótki 3-aminokwasowy łącznik, podczas gdy sIL-6RδVal/L/Il-6 ma dłuższy 13-aminokwasowy łącznik, a obydwie mają zasadniczo taką samą aktywność w hamowaniu wzrostu komórek metastatycznych. W przeciwieństwie do tego, ani sama IL-6, ani sIL-6R0Val nie hamuje wzrostu tych komórek czerniaka (fig. 6), co wskazuje na swoistą aktywność chimerowego białka sIL-6R/IL-6 (p85). Aby uzyskać podobny efekt, wymagana jest mieszanina 200-400 ng/ml IL-6 i 125 ng/ml sIL-6RδVal (fig. 6). Po obliczeniu stężenia molowego, maksymalne hamowanie komórek F10.9 wymagało 75 nM IL-6 i 2 nM sIL-6RδVal, natomiast jedynie 0,12 nM chimery sIL-6R/IL-6.
Aktywność hamowania wzrostu przez chimerowe białko p85 sIL-SR/IL-6 śledzono w czasie oczyszczania z użyciem kolumn z przeciwciałem McAB 34.4 na (patrz przykład 2). Wzór aktywności odpowiada intensywności prążka p85 widocznego w różnych frakcjach po elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z SDS na fig. 2.
P r z y k ł a d 4: Chimera sIL-6R/IL-6 jest niezbędna do zasiedlania się transplantowanych komórek szpiku kostnego.
Zasiedlanie się hematopoetycznych komórek macierzystych z ludzkiego szpiku kostnego można badać po przeszczepie do myszy z ostrym złożonym niedoborem odpornościowym (SCID) (Vormoor i wsp., 1994). Myszy SCID-NOD poddawano subletalnej dawce napromieniowania i wstrzykiwano do żyły ogonowej 3 x 105 ludzkich komórek szpiku kostnego CD34+. Przed wstrzyknięciem oczyszczone komórki CD34+ utrzymywano przez 3 dni w hodowlach ciekłych z różnymi kombinacjami cytokin. Po miesiącu myszy uśmiercano i pobierano kości w celu otrzymania szpiku kostnego. Zasiedlanie się ludzkich komórek w myszach biorcy szacowano poprzez hybrydyzację Southerna do ludzkiego repetytywnego DNA.
Stwierdzono, że czynnik komórek macierzystych (SCF, czynnik steel lub ligand ckit) oraz ligand Flt3 (ligand receptora kinazy tyrozynowej flt3/flk2) są ważne dla przeżywalności i namnażania się najbardziej prymitywnych pluripotencjalnych macierzystych komórek hematopoetycznych zdolnych do długotrwałego zasiedlania się w szpiku kostnym biorcy (McKenna i wsp., 1995). Jak widać na fig. 7, te dwa czynniki same są niewystarczające do promowania zasiedlania się ludzkich komórek w szpiku kostnym myszy SCID-NOD będących biorcą. Aby uzyskać wykrywalny poziom zasiedlania, wymagane było dodanie chimerowego białka sIL-6R/IL-6. W stężeniu 100 ng/ml, chimera sIL-6R/IL-6 była znacznie bardziej aktywna niż izolowana IL-6 (50-200 ng/ml) i sIL-6R (125-1250 ng/ml) (fig. 7). Wymaganie obecności chimery sIL-6R/IL-6 wskazuje, że białko to jest niezbędne dla przeżycia i namnażania się niepredestynowanych pluriopotencjalnych macierzystych komórek hematopoetycznych, które mogą wejść i zasiedlić środowisko szpiku kostnego, wskazując że białko to może być użyteczne w klinicznych protokołach przeszczepu szpiku kostnego.
Pokazano zatem po raz pierwszy, że chimera sIL-6R/IL-6 ma co najmniej dwie nowo znalezione aktywności:
PL 199 212 B1 (i) kiedy dodaje się ją razem z czynnikami SCF i ligandem Flt3 do ludzkich prymitywnych macierzystych komórek hematopoetycznych, promuje ona ich przeżycie i namnażanie; oraz (ii) jest aktywna (i widocznie niezbędna) w modelu in vivo przeszczepu ludzkiego szpiku kostnego do myszy z niedoborem odporności.
P r z y k ł a d 5: Białko chimerowe sIL-6R/IL-6 jest aktywne względem wysoko oczyszczonych prymitywnych hematopoetycznych komórek macierzystych.
W celu uzyskania jednojądrowych komórek o niskiej gęstości (NMC) ludzkie jednojądrzaste komórki krwi pępowinowej poddano frakcjonowaniu na gradiencie Ficoll-Paque (Pharmcia Biotech, Uppsala, Szwecja), a następnie użyto zestawu mini MACS (Miltney Biotec, Bergish Gladbach, Niemcy) i otrzymano populację komórek, w której było 80% czystych komórek CD34+. Komórki te przepuszczano przez unieruchamiane monoklonalne przeciwciała przeciwko CD38 lub sortowano komórki aktywowane fluorescencyjnie, otrzymując populację komórek CD34+CD38-, odpowiadającą 0,1% wyjściowej liczby komórek. Tak oczyszczone komórki macierzyste (20 000 komórek) hodowano w hodowli zawiesinowej, w 0,5 ml pożywki RPMI, 10% cielęcej surowicy płodowej (ang. Fetal Calf Serum - FCS), 1% albuminie z surowicy bydlęcej, zawierającej 50 ng/ml czynnika komórek macierzystych (ang. Stem Cell Factor - SCF) oraz 100 ng/ml liganda flt3 (FL) (obydwa z R&D Systems, Minneapolis, MN). Do połowy komórek dodano 100 ng/ml białka chimerowego sIL-6R/IL-6, natomiast drugą połowę hodowano bez białka chimerowego. Komórki inkubowano w 37°C w 5% CO2 przez sześć dni. Liczbę namnożonych komórek szpiku kostnego wyznaczono przez dożylne wstrzyknięcie wszystkich komórek z powyższych hodowli in vitro myszy NOD-SCID poddanych subletalnej dawce promieniowania. Myszy utrzymywano w sterylnych warunkach. Po sześciu tygodniach myszy uśmiercono, a z ich kości długich wyizolowano szpik kostny. Wyizolowane komórki szpiku kostnego wysiano na 0,9% metylocelulozowe podłoże półpłynne z 30% cielęcą surowicą płodową (FCS), 50 mM b-merkaptoetanolem, czynnikem komórek macierzystych (SCF) w stężeniu 50 ng/ml, 5 ng/ml IL-3, 5 ng/ml GM-CSF, 6 U/ml erytropoiny (wszystko z R&D Systems). Aby nie dopuścić do tworzenia się kolonii mysich komórek do hodowli dodawano ludzką surowicę. Wyniki przedstawione w tabeli IV pokazują, że dodanie białka chimerowego sIL-6R/IL-6 do hodowli powoduje zwiększenie liczby (30-50 razy) ludzkich komórek wyizolowanych z myszy, zdolnych do tworzenia kolonii (ang. Colony Forming Cells, CFU), w porównaniu z hodowlami, zawierającymi tylko czynnik komórek macierzystych (SCF) i ligand flt3 (FL). To pozostaje w związku z dużym wzrostem liczby komórek macierzystych, które zasiedliły myszy SCID, obecnych w hodowlach zawiesinowych po sześciu dniach w porównaniu z dniem 0. Przy braku białka chimerowego sIL-6R/IL-6, SCF i FL nie powodują wzrostu liczby komórek macierzystych po sześciodniowej hodowli. DNA z komórek szpiku kostnego wyizolowanych z myszy NOD-SCID, w których dokonano przeszczepu, poddano analizie typu Southern tak, jak opisano w przykładzie 4. Ilość ludzkiego DNA otrzymanego z komórek szpiku była dziesięć razy większa w komórkach hodowanych z białkiem chimerowym w porównaniu do hodowli bez sIL-6R/IL-6.
Komórki wyjściowe dla CFU ze szpiku kostnego myszy NOD-SCID, jak pokazano w tabeli IV, zapoczątkowały komórki hematopoetyczne różnych linii szpikowych (makrofagi i granulocyty), jak również linii erytroidalnych i limfoidalnych (np. CD19+, CD56+) wyłącznie wtedy, gdy ludzkie komórki krwi przed przeszczepem, hodowano z białkiem chimerowym sIL-6R/IL-6.
T a b e l a IV
Ludzkie komórki macierzyste zdolne do zasiedlania szpiku kostnego myszy NOD-SCID.
Uzupełnienia hodowli ludzkich komórek CD34+CD38 pępowinowej Dni hodowli Liczba ludzkich koloni komórek hematopoetycznych ze szpiku kostnego myszy NOD-SCID, którym dokonano przeszczepu
0 4
SCF + FL 6 2-3
SCF + FL + sIL-6R/IL-6 6 50-100
Dodatkowe eksperymenty porównały działanie białka chimerowego sIL-6R/IL-6 na populację komórek CD34+CD38+ z krwi pępowinowej w stosunku do wysoko oczyszczonych komórek macierzystych CD34+CD38-. Namnażanie in vitro wysoce oczyszczonych komórek było silniej stymulowane przez sIL-6R/IL-6 w porównaniu z mniej oczyszczonymi komórkami (tabela V). To pozwala wnioskować,
PL 199 212 B1 że bardziej prymitywne komórki macierzyste są lepszym celem dla białka chimerowego sIL-6R/IL-6, jeżeli chodzi o efekt namnażania komórek.
T a b e l a V
Namnażanie in vitro hematopoetyćznych komórek macierzystych.
Wysiana populacja komórek (20 000) Liczba komórek po 6 dniach hodowli w obecności SCF + FL Liczba komórek po 6 dniach hodowli w obecności ScF + FL + sIL-6R/IL-6
Eksperyment 1 CD34+CD38+ 780000 675000 (x0,86)
CD34+CD38- 42000 153000 (x3,6)
Eksperyment 2 CD34+CD38+ 330000 507000 (x1,5)
CD34+CD38- 3000 18000 (x6,0)
Utrzymywanie in vitro aktywności do zasiedlania szpiku kostnego szacowano przez przedłużanie hodowli oczyszczonych komórek macierzystych CD34+CD38- przed wstrzyknięciem do myszy NOD-SCID. Zasiedlanie oceniano badając proporcję ludzkiego DNA w szpiku kostnym myszy biorców sześć tygodni po dożylnym wstrzyknięciu hodowanych komórek. Po dodaniu sIL-6R/IL-6 do SCF i FL w trakcie hodowli, obserwowano wysoki stopień zasiedlania (>1% ludzkiego DNA) po dwóch tygodniach i był on wyższy niż w niehodowanych komórkach. Dla porównania, eksperymenty z hodowlami zawierającymi SCF, FL, GM-CSF i IL-3 pokazały, że komórki zasiedlane w myszach SCID nie utrzymywały się dłużej niż tydzień (Bhata, M. i wsp., J. Exp. Med. 186, 619-624, 1997).
Powyższe wyniki pokazują, że białko chimerowe sIL-6R/IL-6 umożliwia namnażanie i utrzymanie ludzkich prymitywnych komórek macierzystych, zdolnych do zasiedlania szpiku kostnego biorcy. Komórki macierzyste pozostają aktywne w stanie niezróżnicowanym podczas namnażania. Zatem, białko chimerowe sIL-6R/IL-6 umożliwia nowy sposób zasiedlania hodowli przez komórki hematopoetyczne. Właściwość ta pozwala na wykorzystywanie wektorów retrowirusowych do wprowadzania genów do zasiedlonych komórek macierzystych w terapii genowej. Do tej pory, w przypadku ludzkich komórek macierzystych było to niemożliwe, ponieważ te prymitywne komórki nie utrzymywały się in vitro w stanie cyklicznym, a taki stan jest niezbędny przy retrowirusowej integracji DNA. Białko chimerowe sIL-6R/IL-6 rozwiązało ten problem.
P r z y k ł a d 6: Wytwarzanie białka chimerowego IL-6R/IL-6 w komórkach CHO.
DNA plazmidowy sIL-6R/IL-6 pcDNA3, przedstawiony na fig. 1, użyto do transfekcji komórek jajnika chomika (ang. Chinise Hamster Ovary - CHO) razem z plazmidem pDHFR, tak jak opisano w Mory i wsp. (DNA 5, 181-193, 1986). Spośród transfekowanych komórek, rosnących na 50 nM metotreksenie, wyizolowano klon L12- [IL-6R/IL-6]. Klon ten był stabilny po kilku pasażach, a półkonfluentne hodowle wydzielały do pożywki 2,5 mg/ml białka chimerowego IL-6R/IL-6.
W celu oczyszczenia białka chimerowego IL-6R/IL-6, 3,25 litrów pożywki z hodowli klonu L12 w 2% surowicy bydlęcej zagęszczono do 200 ml. Zagęszczoną pożywkę adsorbowano na 18 ml kolumnie z monoklonalnym przeciwciałem 34.4 przeciwko ludzkiemu sIL-6R związanym z kulkami Affigel 10, a następnie wymywano tak, jak opisano przez Novick i wsp. (Hybridoma, 10 137-146, 1991). Eluat, zawierający 25 mM kwas octowy zneutralizowano buforem Hepes o pH 8,6. Białka zagęszczono na filtrze Amicon o wartości odcięcia 10 kDa, ostateczne stężenie wynosiło 1 mg/ml. Na żelu SDS-PAGE obserwowano pojedynczy prążek o masie cząsteczkowej 85 kDa, odpowiadający białku chimerowemu IL-6R/IL-6. Glikozylację wykazano poprzez zmniejszenie wielkości białka po zadziałaniu glikozydazą (Boehringer, Mannheim). Białko chimerowe IL-6R/IL-6 zachowywało aktywność przez 5 miesięcy w 4°C (zwykle przetrzymuje się je w -70°C).
P r z y k ł a d 7: Powinowactwo białka chimerowego IL-6R/IL-6 do gp130.
Porównano zdolności wiązania się białka chimerowego IL-6R/IL-6, syntetyzowanego przez komórki CHO, i mieszaniny ludzkich IL-6 i sIL-6R z rozpuszczalną formą białka gp130 (sgp130), które jest drugim łańcuchem systemu receptora dla IL-6 (zobacz wstęp). Na płytkę mikrotitracyjną (96 studzienek) (Nunc) naniesiono przeciwciała monoklonalne przeciw ludzkiemu gp130, następnie dodano 50 ng/ml sgp130 (oba R&D Systems, Minneapollis). Po przepłukaniu w buforze PBS (ang. Phosphate Buffered Saline) do studzienek dodano białko chimerowe IL-6R/IL-6 w różnych stężeniach, wahających się od 0,1 do 50 ng/ml. Do oddzielnych studzienek dodano rhuIL-6 (Ares-Serano, Geneva) w stężeniu 500 ng/ml razem z ludzkim sIL-6RδVal w stężeniach od 2 do 500 ng/ml. Po całonocnej
PL 199 212 B1 inkubacji w 4°C, dodano królicze poliklonalne przeciwciało przeciw IL-6R (Oh i wsp., Cytokine, 8, 401-409, 1996), a następnie, wykrywane w reakcji barwnej, kozie przeciwciała przeciw króliczym Ig, skoniugowane z peroksydazą chrzanową (Sigma, St. Louis). Na fig. 8 pokazano wynik eksperymentu w postaci wykresu Scatchard. Powinowactwo białka chimerowego IL-6R/IL-6 do gp130 było 4 razy wyższe niż powinowactwo ludzkich białek IL-6 i sIL-6R dodanych oddzielanie (6,3 x 10-11 M w stosunku do 2,6 x 10-10 M). Wynik ten potwierdza i wyjaśnia wyższą aktywność białka chimerowego porównując z kombinacją białek IL-6 i sIL-6R w komórkach czerniaka i w przypadku komórek hematopoetycznych (fig. 9 i przykład 4).
P r z y k ł a d 8: Białko chimerowe IL-6R/IL-6 chroni przed hepatotoksycznością.
Podanie myszom czterochlorku węgla (CCl4) powoduje ciężką nekrozę wątroby prowadzącą do śmierci (Slater T.F. i wsp. Philos. Trans. R. Soc. Biol. Sci. 311, 633-645, 1985). Po podaniu myszom pozbawionym genu IL-6 (IL-6-/-) małych dawek CCl4 (2-3 ml/kg masy ciała) dootrzewnowo, współczynnik śmiertelności w ciągu 24 godz. wynosił 70% (fig. 10). Podanie białka chimerowego IL-6R/IL-6, wytwarzanego przez komórki CHO na godzinę przed i 4 godz. po podaniu CCl4 chroni zwierzęta przed zabójczym działaniem CCl4 (nie obserwowano zgonów przez 24 godz.). Dodatkowo, po wstrzyknięciu wolnego rhu-IL-6 w podobny sposób, nie zaobserwowano podobnego efektu (fig. 10). Białko chimerowe IL-6R/IL-6 dawało wymieniony efekt w dawkach wynoszących 2-3 μg na wstrzykniecie, co w przeliczeniu na stosunek molarny było 10 razy mniejsze niż niewywołujące żadnych efektów dawki IL-6. Przy większych dawkach CCl4 (np. 3,5 ml/kg masy ciała, fig. 10), białko chimerowe również miało ochronne działanie, śmiertelność była niższa niż w przypadku podania IL-6 lub bez cytokiny. Różnice w śmiertelności pomiędzy myszami, którym podawano lub nie podawano białka chimerowego IL-6R/IL-6, przy jednakowych dawkach CCl4 były znaczące przy p<0,01. Analiza histologiczna sekcji wątroby zabarwionej hematoksyliną-eozyną potwierdziła fakt, że CCl4 wywołuje nekrozę oraz, że białko chimerowe IL-6R/IL-6 chroni hepatocyty przed toksycznym wpływem CCl4 (nie pokazane).
Białko chimerowe IL-6R/IL-6 może znaleźć zastosowanie przy ochronie tkanki wątrobowej pacjentów w przypadku nekroz wątroby wywołanych związkami chemicznymi (np. alkoholem, paracetamolem) i innymi (np. wirusowe zapalenia wątroby).
P r z y k ł a d 9: Konstrukcja oraz badanie aktywności białka chimerowego IL-6/sIL-6RδVal.
Stworzono chimerową cząsteczkę, w której część IL-6 znajduje się końcu N, zaś sIL-6R na końcu C białka chimerowego. Plazmid pBS-sIL-6RδVal cięto w miejscu Sau3a (pozycja nukleotydowa 1086) i w miejscu Hindlll za kodonem stop Val-356 (patrz przykład 1). Zsyntetyzowano następujący łącznik zawierający miejsca cięcia dla enzymów: Spel, Smal i BamHI:
Spel Smal BamHI
5' CT AGT GGG CCC GGG GTG GCG GG
A CCC GGG CCC CAC CGC CCC TAG 5' (SEK NR ID: 2)
Lepkie końce po cięciu enzymem Sau3a połączono przez ligację z lepkimi końcami po BamHI w łączniku i wklonowano do MCS plazmidu pBS SK Bluescript. Sekwencję IL- 6 powielono w reakcji PCR, gdzie jako matrycy użyto DNA pKKb2-7 oraz następujących starterów (kodon inicjacyjny podkreślony):
SpeI
Lewy: 5' GA CTA GTA GCT ATG AAC TCC TTC TC (SEK NR ID: 3)
Haelll
Prawy: 5' AG GGC CAT TTG CCG AAG AGC C (SEK NR ID: 4)
Produkt PCR, cięty enzymami Spel i Haelll wstawiono pomiędzy miejsca Spel i Smal w łączniku. Zsyntetyzowano kolejny łącznik BamHI-Ncol z wewnętrznym miejscem cięcia dla Smal:
Smal
5' GAT CCG GGC GGC GGG GGA GGG GGG CCC GGG C [Ncol]
[BamHI ] GC CCG CCG CCC CCT CCC CCT GGG CCC GGT AC 5' (SEK NR ID: 5)
Łącznik został wklonowany pomiędzy miejsce BamHI poprzedniego łącznika oraz Ncol w pozycji 1464 sekwencji IL-6R. Fragment sekwencji IL-6R od miejsca Smal w pozycji 867 do Ncol 1464 wklonowano pomiędzy miejsce Smal drugiego łącznika, a Ncol w sekwencji IL-6R. Powstały chimerowy fragment DNA zsekwencjonowano i przeklonowano do pCDNA3, aby umożliwić ekspresję w ludzkich komórkach HEK 293. Sekwencję aminokwasową powstałego białka chimerowego IL-6-IL-6R 3e przedstawiono na fig. 11 (łącznik podkreślono). Białko chimerowe 3e oczyszczono przez chromatografię
PL 199 212 B1 powinowactwa z użyciem monoklonalnych przeciwciał przeciwko IL-6 (tak jak w Novick i wsp., Hybridoma 8, 561-567, 1989). Otrzymano prążek o wielkości 75 kDa w żelu SDS-PAGE.
Biologiczną aktywność białka chimerowego IL-6-IL-6R 3e do hamowania wzrostu komórek czerniaka F10.9 jest przedstawiona na fig. 12. Białko jest aktywne w sposób wyraźny, w porównaniu z białkiem chimerowym IL-6R/IL-6 (preparaty 1-3) w tym samym eksperymencie, aczkolwiek więcej białka potrzeba do 50% hamowania wzrostu.
Otrzymano dwa mutanty białka IL-6R/IL-6. W przypadku pierwszego z nich, aminokwasy His w pozycji 280 i Asp w pozycji 281 w części IL-6 białka zmieniono odpowiednio na Ser i Val, stosując mutagenezę PGR (mutant 39 lub HD). W drugim mutancie, oprócz wymienionych podstawień, zmieniono Asn w pozycji 230 na Asp (mutant NHD). Jak pokazano na fig. 12, te dwa mutanty prawie nie wykazują aktywności w porównaniu z białkami chimerowymi IL-6R/IL-6 i IL-6-IL-6R. Jak pokazano przez modelowanie molekularne, w IL-6 powyższe aminokwasy oddziałują z gp130 (Halimi i wsp., 1995), czyli zgodnie z tym białko chimerowe sIL-6R/IL-6 zachowuje te ważne miejsca oddziaływania.
Białko chimerowe IL-6-IL-6R 3e nie zawiera domeny immunoglobulinopodobnej z IL-6, obecnej w białku IL-6R/IL-6. Jednakże, usunięcie tylko tej domeny z białka chimerowego IL-6R/IL-6 nie powoduje utraty aktywności względem komórek F10.9. Białko IL-6-IL-6R 3e wiązało się do gp130 z 30% efektywnością w porównaniu z białkiem chimerowym IL-6R/IL-6 (nie przedstawiono). Słabsze wiązanie jest odpowiada słabszemu wpływowi tego białka na wzrost komórek czerniaka.
Przytoczone wyniki pokazują, że zablokowanie końca C przez fuzję z sIL-6R poprzez łącznik, nie powoduje zmian w aktywności biologicznej opisywanych białek chimerowych.
Literatura
Chen L, Mory Y, Zilberstein A i Revel M. Growth inhibition of human breast carcinoma and leukemia/lymphoma cell lines by recombinant interferon-beta 2/IL-6. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8037-8041, 1988.
Chernajovsky Y, Mory Y, Chen L, Marks Z, Novick D, Rubinstein M i Revel M. Efficient constitutive production of human fibroblast interferon by hamster cells transformed with the IFN- l 1 gene fused to an SV40 early promoter. DNA, 3: 297-308, 1984.
Fischer M, Goldschmitt J, Peschel C, Brakenhoff JPG, Kallen K-J, Wollmer A, Grotzinger J i Rose-John S. A bioactive designer cytokine for human hematopoietic progenitor cell expansion. Nature Biotechnology 15: 142-145, 1997.
Ganapathi MK, Weizer AK, Borsellino S, Bukowski RM, Ganapathi S, Rice T, Casey G i Kawamura K. Resistance to Interleukin-6 in human Non-small cell lung carcinoma cell lines: Role of receptor components. Cell Growth and Differentiation, 7: 923-929, 1996.
Halimi H, Eisenstein M, Oh J, Revel M i Chebath J. Epitope peptides from interleukin-6 receptor which inhibit the growth of human myeloma cells. Eur. Cytokine Netw., 6:135-143, 1995.
Hirano T, Yasukawa K, Harada H, Taga T, Watanabe Y, Matsuda T, Kashimura S, Nakajima K, Koyama K, Iwamatsu K, Tsunasawa S, Sakiyama F, Matsui H, Takahara Y, Taniguchi T i Kishimoto T. Complementary DNA for a novel interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulins. Nature, 234: 73-76, 1986.
Hirano T, Matsuda T i Nakajima K. Signal transduction throughgyp 130 that is shared among the receptors for the interleukin 6 related cytokine subfamily. Stem cells, 12:262-277, 1994.
Holloway CJ. Applications of recombinant DNA technology in the production of glycosylated recombinant human granulocyte colony stimulating factor. Eur. J. Cancer, 30: S2-6, 1994.
Kahn MA i De Vellis J. Regulation of an oligodendrocyte progenitor cell line by the interleukin-6 family of cytokines. Glia, 12: 87-98, 1994.
Katz A, Shulman LM, Porgador A, Revel M, Feldman M i Eisenbach L. Abrogation of B16 melanoma metastases by longterm low-dose Interleukin-6 therapy. J. Immunother. 13: 98-109, 1993.
Mackiewicz A, Wiznerowicz M, Roeb E, Nowak J, Pawlowski T, Baumann H, Heinrich P i RoseJohn S. Interleukin-6-type cytokines and their receptors for gene therapy of melanoma. Ann. New York Acad. Sci., 762: 361-374, 1995.
McKenna HJ, de Vries P, Brasel K, Lyman SD i Williams DE. Effect of flt3 ligand on the ex vivo expansion of human CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood 86: 3413-3420, 1995.
PL 199 212 B1
Murakami M, Hibi M, Nakagawa N, Nagakawa T, Yasukawa K, Yamanishi K, Taga T i Kishimoto T. IL-6 induced homodimerization of gp130 and associated activation of a tyrosine kinase. Science, 260: 1808-1810, 1993.
Novick D, Englemann H, Waliach D, Leitner 0, Revel M i Rubinstein M. Purification of soluble cytokine receptors from normal urine by ligand-affinity and immunoaffinity chromatography. J. Chromatogr., 510: 331-337, 1990.
Novick D, Engelmann H, Ravel M, Leitner O i Rubinstein M. Monoclonal antibodies to the soluble IL-6 receptor: affinity purification, ELISA and inhibition of ligand binding. Hybridoma, 10: 137-146, 1991.
Novick D, Shulman LM, Chen L i Revel M. Enhancement of interleukin-6 cytostatic effect on human breast carcinoma cells by soluble IL-6 receptor from urine and reversion by monoclonal antibodies. Cytokine, 4:6-11, 1992.
Oh J-W, Revel M i Chebath J. A soluble interleukin-6 receptor isolated from conditioned medium of human breast cancer cells is encoded by a differentially spliced mRNA. Cytokine, 8: 401-409, 1996.
Oh J-W. Expression of recombinant soluble human interleukin-6 receptors and analysis of their functions. Ph.D. Thesis Weizmann Institute of Science (promotor Revel M.), 1997.
Paonessa G, Graziani R, DeSerio A, Savino R, Ciapponi L, Lahmm A, Salvati AL, Toniatti C i Ciliberto G. Two distinct and independent sites on IL-6 trigger gp130 dimer formation and signalling. EMBO J., 14: 1942-1951, 1995.
Revel M. Host defense against infections and inflammations: Role of the multifunctional IL-6/IFN-2 cytokine. Experientia 45: 549-557, 1989.
Sambrook J, Fritsch EF i Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Press, 1989.
Sui X, Tsuji K, Tanaka R, Tajima S, Muraoka K, Ebihara Y, Ikebuchi K, Yasukawa K, Taga T, Kishimoto T i Nakahata T. Gp130 and c-kit signalings synergize for ex vivo expansion of human primitive hemopoietic progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 2859-2863, 1995.
Taga T, Hibi M, Hirata Y, Yamasaki K, Yasukawa K, Matsuda T, Hirano T i Kishimoto T. Interleukin-6 triggers the association of its receptor with a possible signal transducer gp130. Cell, 58: 573-581, 1989.
Vormoor J, Lapidot T, Pflumio F, Risdon G, Patterson B, Broxmeyer HE i Dick JE. SCID mice as an in vivo model of human cord blood hematopoiesis. Blood cells 20: 316-320, 1994.
Ward LD, Howlett GJ, Discolo G, Yasukawa K, Hammacher A, MoritzRL i Simpson RJ. High affinity interleukin-6 receptor is a hexameric complex consisting of two molecules each of interleukin-6, interleukin-6 receptor and gp130. J. Biol. Chem., 269: 23286-23289, 1994.
Yamasaki K, Taga T, Hirata Y, Yawata H, Kawanishi Y, Seed B, Taniguchi T, Hirano T i Kishimoto T. Cloning and expression of the human Interleukin-6 (BSF-2/ Interferon beta-2) receptor. Science, 241: 825-828, 1988.
Zilberstein A, Ruggieri R, Korn HJ i Revel M. Structure and expression of cDNA and genes for human interferon-beta-2, a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines. EMBO J., 5: 2529-2537, 1986.
PL 199 212 B1
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
ZGŁASZAJĄCY:
(A) NAZWA: Yeda Research and Development Co. Ltd.
i Bj ULICA: ’ Weizmann Institute of Science, P.O.B. 95
(C, MIASTO: RehoYot
(E! PAŃSTWO : Izrael
(F) KOD POCZTOWY: 76100
(G, TELEFON : 972-8-9344093
(H) TELEFAX : 972-8-9470739
(A) NAZWISKO: REYEL, Michel (B) ULIC-A: Beit Brazil 5, Weizmarm Institute of Science (C) MIASTO: Rehovot (E) PAŃSTWO: Izrael (F) KOD POCZTOWY: 76100 (A) NAZWISKO: CHEBATH, Judith (Bj ULICA: Rehov Miller 13 (C) MIASTO: Rehovot (E) PAŃSTWO: Izrael (F) KOD POCZTOWY: 76284 {Aj NAZWISKO: LAPIDOT, Tsvee (Bj ULICA: Rehov Boxer 6 (C) MIASTO: Ness-Ziona CE) PAŃSTWO: Izrael (F) KOD POCZTOWY: 74046 (Aj NAZWISKO: KOLLET, Orle (Bj ULICA: Rehov Ramat Chen 14 (Cj MIASTO: Ramat Gan (Ej PAŃSTWO: Izrael (F) KOD POCZTOWY: 52232 (ii, TYTUŁ WYNALAZKU: Chimerowe białko - rozpuszczalny receptor interleukiny 6/ligand, jego analogi. . i zastosowanie (iii) LICZBA SEKWENCJI: 8 (iv) SPOSÓB ODCZYTU KOMPUTEROWEGO:
(A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (Bj KOMPUTER: Zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Wersja #1.30 (EPO, (vi) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: IL 121284 (Bj DATA ZGŁOSZENIA: 10 LIPIEC 1997 (vi1 DATA POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: IL 122818 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 30 GRUDZIEŃ 1997 (2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI
PL 199 212 B1 (A) (B>
i O'
DŁUGOŚĆ: 13 aminokwasów TYP: aminokwasowa RODZAJ NICI : pojedyncza TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) INFORMACJE DLA SEK NR ID : 1:
Glu Phe Gly Ala Gly Leu Val Leu Gly Gly Gln Phe Met (2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 44 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TGFOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID : 2:
CTAGTGGGCC CGGGGTGGCG GGACCCGGGC CCCACCGCCC CTAG 44 (2) INFORMACJE DLA SEK NR LD : 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LINIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS: SEK NR ID : 3:
GACTAGTAGC TATGAACTCC TTCTC 25 (2) INFORMACJE DLA SEK NR ID : 4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (oj TOPOLOGIĄ: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (y.i) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID : 4:
PL 199 212 B1
AGGGCCATTT GCCGAAGAGC C 21 / 2 λ TNFOPNACJE DLA SEK NR ID : 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 62 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D! TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 5:
GATCCGGGCG GCGGGGGAGG GGGGCCCGGG CGCCCGCCGC CCCCTCCTCC CGGGCCCGGT 60
AC 62 (2! INFORMACJE DLA SEK NR ID : 6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniową (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 6:
Gly Gly Gly Gly Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gly
IG (2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 543 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 7:
Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro 15 10 15
Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gin Glu Val Ala Arg 20 25 30
PL 199 212 B1
Gly Val Leu 35 Thr Ser Leu Pro Gly 40 Asp Ser Val Thr Leu 45 Thr Cys Pro
Gly Val 50 Glu Pro Glu Asp Asn 55 Ala Thr Val His Trp 60 Val Leu Arg Lys
Pro 65 Ala Ala Gly Ser His 70 Pro Ser Arg Trp Ala 75 Gly Met Gly Arg Arg 80
Leu Leu Leu Arg Ser 85 Val Gin Leu His Asp 90* Ser Gly Asn Tyr Ser 95 Cys
Tyr Arg Ala Gly 100 Arg Pro Ala Gly Thr 105 Val His Leu Leu Val 110 Asp Val
P ro Pro Glu 115 Glu Pro Gin Leu Ser 120 Cys Phe Arg Lys Ser 125 Pro Leu Ser
Asn Val 130 Val Cys Glu Trp Gly 135 Pro Arg Ser Thr Pro 140 Ser Leu Thr Thr
Lys ] 4 5 Ala Val Leu Leu Val 150 Arg Lys Phe Gin Asn 155 Ser Pro Ala Glu Asp 160
Phe Gin Glu Pro Cys 165 Gin Tyr Ser Gin Glu 170 Ser Gin Lys Phe Ser 175 Cys
Gir. Leu Ala Val 180 Pro Glu Gly Asp Ser 185 Ser Phe Tyr Ile Val 190 Ser List
Cys Val Ala 195 Ser Ser Val Gly Ser 200 Lys Phe Ser Lys Thr 205 Gin Thr Phe
Gili Gly 210 Cys Gly Ile Leu Gin 215 Pro Asp Pro Pro Ala 220 Asn Ile Thr Val
Thr 225 Ala Val Ala Arg Asn 230 Pro Arg Trp Leu Ser 235 Val Thr Trp Gin Asp 240
Pro His Ser Trp Asn 245 Ser Ser Phe Tyr Arg 250 Leu Arg Phe Glu Leu 255 Arg
Tyr Arg Ala Glu 260 Arg Ser Lys Thr Phe 265 Thr Thr Trp Met Val 270 Lys Asp
Leu Gin His 275 His Cys Val Ile His 28 0 Asp Ala Trp Ser Gly n ej c Leu Arg His
Val Val 290 Gin Leu Arg Ala Gin 295 Glu Glu Phe Gly Gin 300 Gly Glu Trp Ser
Glu 3 0 o Trp Ser Pro Glu Ala 310 Met Gly Thr Pro Trp 315 Thr Glu Ser Arg Ser 32 0
Pro Pro Ala Glu Asn 32 5 Glu Val Ser Thr Pro 330 Met Gin Ala Leu Thr 335 Thr
Asn Lys Asp Asp 34 0 Asp Asn Ile Leu Phe 345 Arg Asp Ser Ala Asn 350 Ala Thr
Ser Leu Pro Val Glu Phe Met Pro Val. Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys
PL 199 212 B1
355 360 365
Asp Val Ala Ala Pro 370 His Arg Gin Pro Leu 375 Thr Ser Ser Glu Arg Ile 380
Asp . 385 Lys Gin Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly 390 Ile Ser Ala Leu Arg Lys 395 400
r i ·. ·. O_L U Thr Cys Asn Lys 405 Ser Asn Met Cys Glu 410 Ser Ser Lys Glu Ala Leu 415
Ala Glu Asn Asn Leu 420 Asn Leu Pro Lys Met 425 Ala Glu Lys Asp Gly Cys 430
PA X. Gin Ser Gly Phe 435 Asn Glu Glu Thr Cys 440 Leu Val Lys Ile Ile Thr 445
Gly Leu Leu Glu Phe 450 Glu Val Tyr Leu Glu 455 Tyr Leu Gin Asn Arg Phe 460
Glu 4 65 Ser Ser Glu Glu Gin Ala Arg Ala Val 470 Gin Met Ser Thr Lys Val 475 480
Leu Ile Gin Phe Leu A O C *± O Gin Lys Lys Ala Lys /i n r\ 37 U Asn Leu Asp Ala Ile Thr A Λ C 1 37
Thr Pro Asp Pro Thr 500 Thr Asn Ala Ser Leu 505 Leu Thr Lys Leu Gin Ala 510
Gin Asn Gin Trp Leu 515 ’ Gin Asp Met Thr Thr ' 520 His Leu Ile Leu Arg Ser 525
Phe Lys Glu Phe Leu Gin Ser Ser Leu Arg 530 535 (2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 8: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 471 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd Ala Leu Arg Gin Met 540
(xi) OPIS 1 SEKWENCJI: SEK NR ID : 8:
Met 1 Asn Ser Phe Ser 5 Thr Ser Ala Phe Gly 10 Pro Val Ala Phe Ser 15 Leu
Gly Leu Leu Leu 20 Val Leu Pro Ala Ala 25 Phe Pro Ala Pro Val 30 Pro Pro
Gly Glu Asp 35 Ser Lys Asp Val Ala 40 Ala Pro His Arg Gin 45 Pro Leu Thr
Ser Ser Glu Arg T T O As ρ Lys Gin Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile
55 60
PL 199 212 B1
Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser 65 70 75 80
Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala 85 90 95
Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gin Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu
100
105
110
Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr
115
120
125
Leu Gin Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gin Ala Arg Ala Val Gin
Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gin Phe Leu Gin Lys Lys Ala Lys Asn
145
150
155
160
Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu
170
175
Thr Lys Leu Gin Ala Gin Asn Gin Trp Leu Gin Asp Met Thr Thr Kis
180
185
190
Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gin Ser Ser Leu Arg Ala
195
200
205
IjCcł 210 Gin Met oly Gly PI TT 215 Asp Pro Gly Gly 220 Gly Gly Gly r* Ί τ τ
Pro Gly Val Pro Pro Glu Glu Pro Gin Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser
225 230 235 240
Pro Leu Ser Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser
250
255
Leu Thr Thr Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gin Asn Ser Pro
260
265
270
Ala Glu Asp Phe Gin Glu Pro Cys Gin Tyr Ser Gin Glu Ser Gin Lys
275
280
285
Phe Ser Cys Gin Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile
290
295
300
Val Ser Met Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr
305 310 315 320
Gin Thr Phe Gin Gly Cys Gly Ile Leu Gin Pro Asp Pro Pro Ala Asn
325 330 335
Ile Thr Val Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr 340 345 350
Trp Gin Asp Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe 355 360 365
Glu Leu Arg Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met 370 375 380
PL 199 212 B1

Claims (19)

1. Chimerowe glikozylowane białko rozpuszczalny receptor interleukiny-6(sIL-6R)-interleukina6(IL-6) (s-IL-6R/IL-6) i jego biologicznie aktywne analogi, zawierające produkt fuzji białkowej między sIL-6R i IL-6, przy czym s-IL-6R/IL-6 i jego analogi zachowują ten sam wzór glikozylacji jak naturalnie występujące sekwencje, kiedy są wyrażane w komórkach ssaków, sIL-6R i IL-6 są naturalnie występującymi postaciami lub charakteryzują się aminokwasowymi addycjami do 20 aminokwasów, delecjami do 30 aminokwasów i/lub substytucjami do 30 aminokwasów w sekwencji naturalnie występującej, a sIL-6R jest połączony z IL-6 bezpośrednio lub przez cząsteczkę łącznika peptydowego, który jest trójpeptydem o sekwencji E-F-M (Glu-Phe-Met) lub peptydem złożonym z 13 reszt aminokwasowych o sekwencji E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met).
2. Chimerowe białko sIL-6R/IL-6 według zastrz. 1, znamienne tym, że określane jako sIL6RδVal/IL-6 zawiera łącznik trójpeptydowy o sekwencji E-F-M pomiędzy C-końcową Val-356 sIL-6R i N-końcową Pro-29 IL-6, oraz ma sekwencję przedstawioną na fig. 3.
3. Chimerowe białko sIL-6R/IL-6 według zastrz. 1, znamienne tym, że określane jako sIL6RδVal/L/IL-6 zawiera 13-aminokwasowy łącznik peptydowy o sekwencji E-F-G-A-G-L-Y-L-G-G-Q-F-M pomiędzy C-końcową Val-356 sIL-6R i N-końcową Pro-29 IL-6 i ma sekwencję przedstawioną na fig. 3, przy czym trójpeptyd o sekwencji E-F-M między pozycjami 357-359 na fig. 3 jest zastąpiony przez wskazaną 13-aminokwasową sekwencję peptydu.
4. Chimerowe białko sIL-6R/IL-6 według zastrz. 1-3, znamienne tym, że jest otrzymywane in vitro w komórkach ssaków w postaci po całkowitej obróbce.
5. Chimerowe białko sIL-6R/IL-6 według zastrz. 4, znamienne tym, że jest otrzymywane w komórkach ludzkich.
6. Chimerowe białko sIL-SR/IL-6 i jego biologicznie aktywne analogi według zastrz. 1-5, znamienne tym, że są zdolne do hamowania wzrostu wysoce złośliwych komórek nowotworowych, do wywołania in vivo zasiedlania ludzkich komórek hematopoetycznych w przeszczepach szpiku kostnego lub do ochrony wątroby przed czynnikami hepatotoksycznymi.
7. Chimerowe białko sIL-6R/IL-6 i jego biologicznie aktywne analogi według zastrz. 6, znamienne tym, że złośliwymi komórkami nowotworowymi są złośliwe komórki czerniaka.
8. Sekwencja DNA kodująca chimerowe białko sIL-6R/IL-6 i jego biologicznie aktywne analogi określone w zastrz. 1-5.
9. Wektor DNA zawierający sekwencję DNA określoną w zastrz. 8 odpowiedni do ekspresji kodowanego przez nią chimerowego białka w komórkach ssaków.
10. Wektor DNA według zastrz. 9, znamienny tym, że jest odpowiedni do ekspresji chimerowego białka w komórkach ludzkich.
11. Wektor DNA według zastrz. 9 albo 10, znamienny tym, że kiedy ulega ekspresji we wskazanych komórkach, wyrażane chimerowe białko ma sekwencję, która pozwala na jego pełną obróbkę przez te komórki i wydzielanie chimerowego, poddanego całkowitej obróbce białka z komórek do pożywki hodowlanej, w której są hodowane te komórki.
12. Transformowane komórki ssaka, znamienne tym, że zawierają wektor DNA określony w zastrz. 9-11, są zdolne do ekspresji sekwencji chimerowego białka sIL-6R/IL-6 niesionej przez ten wektor i do całkowitej obróbki wyrażanego białka i wydzielenia go do pożywki hodowlanej, w której hodowane są te komórki.
13. Sposób wytwarzania chimerowego białka lub jego biologicznie aktywnych analogów określonych w zastrz. 1-7, znamienny tym, że obejmuje hodowanie transformowanych komórek określonych w zastrz. 12 w warunkach odpowiednich do ekspresji, obróbki i wydzielania białka lub analogów do pożywki hodowlanej, w której hodowane są komórki; oraz oczyszczanie białka lub analogów z pożywki hodowlanej.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że oczyszczanie prowadzi się przez chromatografię immunopowinowactwa z zastosowaniem monoklonalnych przeciwciał specyficznych wobec sIL-6R.
15. Zastosowanie chimerowego białka sIL-6R/IL-6 lub analogów określonych w zastrz. 1-5, soli dowolnego z nich i ich mieszanin jako inhibitora komórek nowotworowych ex vivo.
16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że komórkami nowotworowymi są wysoce złośliwe komórki czerniaka.
PL 199 212 B1
17. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że jako składnik czynny zawiera chimerowe białko sIL-6R/IL-6 lub jego analog określone w zastrz. 1-5, sole dowolnego z nich i ich mieszaniny lub sekwencję DNA określoną w zastrz. 8 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę.
18. Zastosowanie chimerowego białka sIL-6R/IL-6 lub jego analogu określonych w zastrz. 1-5, soli dowolnego z nich i ich mieszanin lub sekwencji DNA określonej w zastrz. 8 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia raka u ssaków przez hamowanie komórek rakowych ssaka, do wspomagania przeszczepu szpiku kostnego przez wywoływanie zasiedlenia ludzkich komórek hematopoetycznych w przeszczepach szpiku kostnego, do zwiększenia hematopoezy, do leczenia chorób wątroby lub chorób neurologicznych, lub do innych zastosowań, w których stosowane są IL-6 lub sIL-6R.
19. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że komórkami nowotworowymi ssaka są wysoce złośliwe komórki czerniaka.
PL338002A 1997-07-10 1998-07-09 Chimerowe glikozylowane białko rozpuszczalny receptor interleukiny-6 - interleukina-6 i jego biologicznie aktywne analogi, ich zastosowanie i sposób wytwarzania, kodująca je sekwencja DNA, wektor DNA, transformowane komórki oraz kompozycja farmaceutyczna PL199212B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL12128497A IL121284A0 (en) 1997-07-10 1997-07-10 Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein analogs thereof and uses thereof
IL12281897A IL122818A0 (en) 1997-07-10 1997-12-30 Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein analogs thereof and uses thereof
PCT/IL1998/000321 WO1999002552A2 (en) 1997-07-10 1998-07-09 Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein, analogs thereof and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL338002A1 PL338002A1 (en) 2000-09-25
PL199212B1 true PL199212B1 (pl) 2008-08-29

Family

ID=26323470

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL338002A PL199212B1 (pl) 1997-07-10 1998-07-09 Chimerowe glikozylowane białko rozpuszczalny receptor interleukiny-6 - interleukina-6 i jego biologicznie aktywne analogi, ich zastosowanie i sposób wytwarzania, kodująca je sekwencja DNA, wektor DNA, transformowane komórki oraz kompozycja farmaceutyczna

Country Status (27)

Country Link
US (2) US7198781B1 (pl)
EP (1) EP0991661B1 (pl)
JP (1) JP4402288B2 (pl)
KR (1) KR100505172B1 (pl)
CN (1) CN1185348C (pl)
AR (1) AR013201A1 (pl)
AT (1) ATE342915T1 (pl)
AU (1) AU758161B2 (pl)
BG (1) BG64680B1 (pl)
BR (1) BR9812096B1 (pl)
CA (1) CA2295936C (pl)
CY (1) CY1105895T1 (pl)
CZ (1) CZ302488B6 (pl)
DE (1) DE69836217T2 (pl)
DK (1) DK0991661T3 (pl)
EA (1) EA004793B1 (pl)
EE (1) EE05519B1 (pl)
ES (1) ES2271999T3 (pl)
HK (1) HK1031895A1 (pl)
HU (1) HU225855B1 (pl)
IL (2) IL122818A0 (pl)
NO (1) NO327397B1 (pl)
NZ (1) NZ502139A (pl)
PL (1) PL199212B1 (pl)
PT (1) PT991661E (pl)
SK (1) SK287039B6 (pl)
WO (1) WO1999002552A2 (pl)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL122818A0 (en) * 1997-07-10 1998-08-16 Yeda Res & Dev Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein analogs thereof and uses thereof
US5919763A (en) * 1998-06-01 1999-07-06 Hadasit Medical Research Services And Development Company Ltd. IL-6/SIL-6R complex for promotion of liver functions
DE69941406D1 (de) * 1998-07-06 2009-10-22 Tosoh Corp IL-6 Rezeptor IL-6-gekoppeltes Fusionsprotein
US20040170604A1 (en) 1998-07-06 2004-09-02 Tosoh Corporation IL-6 receptor IL-6 direct fusion protein
EP1165791B1 (en) * 1999-03-09 2007-10-31 ZymoGenetics, Inc. Human cytokine as ligand of the zalpha receptor and uses thereof
IL130586A0 (en) * 1999-06-21 2000-06-01 Yeda Res & Dev IL6RIL6 chimera for the treatment of demyelinating diseases
CA2447632C (en) * 2000-06-16 2011-08-02 Asterion Limited Fusion protein agonist comprising a growth hormone binding portion and an external domain of a growth hormone receptor
ATE324906T1 (de) * 2000-09-14 2006-06-15 Ares Trading Sa Verwendung von chimäres il6-il6r in huntingtonskrankheit
DE10106827A1 (de) * 2001-02-14 2002-09-05 Stefan Rose-John Verwendung eines Konjugats aus Interleukin-6(IL-6) und seinem Rezeptor zur Induktion der zellulären Expression des Stammzellfaktors (SCF) und von Flat-3-Ligand (Flt-3L)
DE10107737A1 (de) * 2001-02-16 2002-09-05 S Rose John Christian Albrecht Verwendung eines Konjugats aus IL-6 und einem IL-6 Rezeptor zur Tumortherapie
KR100453877B1 (ko) 2001-07-26 2004-10-20 메덱스젠 주식회사 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체
GB0119015D0 (en) * 2001-08-03 2001-09-26 Univ Cardiff A fusion protein
GB2389115B (en) * 2001-12-14 2005-03-16 Asterion Ltd Polypeptide having a plurality of modified growth hormone receptor binding domains of growth hormone
IL147412A0 (en) * 2001-12-31 2002-08-14 Yeda Res & Dev The use of il6r/il6 chimera in nerve cell regeneration
EP1499332A4 (en) * 2002-04-29 2006-12-06 Hadasit Med Res Service COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING CANCER WITH A VIRAL ONCOLYTIC AGENT
WO2004069173A2 (en) 2003-01-31 2004-08-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for modulating an inflammatory response
FR2850621B1 (fr) * 2003-02-04 2006-12-08 Journee Paul Connecteur reliant un bras d'essuie-glace a un balai d'essuyage, qui comporte deux languettes pour le verrouillage transversal de bras d'essuie-glace
DE10321317A1 (de) * 2003-05-13 2004-12-23 Christian-Albrechts-Universität Zu Kiel Verfahren zum Nachweis des funktionellen IL-6/ sIL-6-Rezeptor-Komplexes und Test-Kit zur Durchführung dieses Verfahrens
IL157309A0 (en) * 2003-08-07 2004-02-19 Applied Research Systems Method for the purification of a non-immunoglobulin protein
IL159558A0 (en) 2003-12-24 2004-06-01 Applied Research Systems Use of il-6 in liver injury
IL161672A0 (en) 2004-04-29 2004-09-27 Yeda Res & Dev Compositions and methods for therapy of chemotherapy-induced neuropathy
IL161673A0 (en) 2004-04-29 2004-09-27 Applied Research Systems Compositions and methods for therapy of chemotherapy-induced neuropathy
AU2012261726B2 (en) * 2005-08-29 2015-03-12 Technion Research & Development Foundation Ltd. Media for Culturing Stem Cells
AU2006286149B2 (en) 2005-08-29 2012-09-13 Technion Research And Development Foundation Ltd. Media for culturing stem cells
EP1777294A1 (en) * 2005-10-20 2007-04-25 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) IL-15Ralpha sushi domain as a selective and potent enhancer of IL-15 action through IL-15Rbeta/gamma, and hyperagonist (IL15Ralpha sushi -IL15) fusion proteins
ES2612383T3 (es) 2006-07-19 2017-05-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania WSX-1/IL-27 como una diana para respuestas antiinflamatorias
US9040297B2 (en) 2006-08-02 2015-05-26 Technion Research & Development Foundation Limited Methods of expanding embryonic stem cells in a suspension culture
US20090098529A1 (en) * 2006-10-16 2009-04-16 Nanhai Chen Methods for attenuating virus strains for diagnostic and therapeutic uses
US20090117034A1 (en) * 2007-06-15 2009-05-07 Nanhai Chen Microorganisms for imaging and/or treatment of tumors
GB0715216D0 (en) * 2007-08-03 2007-09-12 Asterion Ltd Leptin
EP2185583A2 (en) * 2007-08-03 2010-05-19 Asterion Limited Granulocyte colony stimulating factor
WO2010003118A1 (en) * 2008-07-02 2010-01-07 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Tgf-b antagonist multi-target binding proteins
CA2729747A1 (en) * 2008-07-02 2010-01-07 Emergent Product Development Seattle, Llc Il6 immunotherapeutics
WO2010081738A1 (en) 2009-01-16 2010-07-22 Agirx Limited Vaccine compositions
ES2932664T3 (es) 2009-11-12 2023-01-23 Technion Res & Dev Foundation Medios de cultivo, cultivos celulares y métodos de cultivo de células madre pluripotentes en estado no diferenciado
EP2516467A2 (en) 2009-12-23 2012-10-31 Emergent Product Development Seattle, LLC Compositions comprising tnf-alpha and il-6 antagonists and methods of use thereof
ES2746482T3 (es) 2010-09-07 2020-03-06 Technion Res & Dev Foundation Nuevos métodos y medios de cultivo para cultivar células madre pluripotentes
EP2832856A4 (en) 2012-03-29 2016-01-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTI-LAMP5 ANTIBODIES AND USE THEREOF
PL2986312T3 (pl) 2013-04-19 2022-04-19 Cytune Pharma Oparte na cytokinie leczenie z ograniczeniem zespołu przesiąkania naczyniowego
US20160194369A1 (en) * 2013-08-12 2016-07-07 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods and compositions for co-expression of polypeptides of inerest and il6
EP2915569A1 (en) 2014-03-03 2015-09-09 Cytune Pharma IL-15/IL-15Ralpha based conjugates purification method
CN104826093A (zh) * 2015-04-16 2015-08-12 刘永庆 用于治疗慢性传染性肝病的Th2免疫反应拮抗剂及卵黄抗体
CN104922659B (zh) * 2015-07-03 2018-04-20 刘永庆 防治肿瘤和/或慢性结核病的Th2免疫反应抑制剂及其应用
WO2022256688A1 (en) 2021-06-04 2022-12-08 Sonnet BioTherapeutics, Inc. Methods of treating age-related frailty with interleukin-6

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5216128A (en) * 1989-06-01 1993-06-01 Yeda Research And Development Co., Ltd. IFN-β2/IL-6 receptor its preparation and pharmaceutical compositions containing it
IL99803A (en) * 1991-10-20 1997-02-18 Yeda Res & Dev Pharmaceutical compositions comprising interleukin-6 for the treatment of chronic lymphocytic leukemia and B-cell lymphomas
PL190445B1 (pl) * 1995-05-15 2005-12-30 Akademia Medyczna Im K Marcink Genetyczna szczepionka przeciwrakowa
DE19608813C2 (de) * 1996-03-07 1998-07-02 Angewandte Gentechnologie Syst Konjugat zur Beeinflussung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen
IL122818A0 (en) * 1997-07-10 1998-08-16 Yeda Res & Dev Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein analogs thereof and uses thereof
JP4601163B2 (ja) * 1997-12-19 2010-12-22 メルク・セローノ・ソシエテ・アノニム Ｉｆｎａｒ２／ｉｆｎ複合体

Also Published As

Publication number Publication date
NZ502139A (en) 2002-03-28
BG104070A (en) 2000-11-30
US7374912B2 (en) 2008-05-20
EE200000012A (et) 2000-08-15
KR20010021522A (ko) 2001-03-15
DK0991661T3 (da) 2007-02-05
EP0991661B1 (en) 2006-10-18
HUP0002426A3 (en) 2003-01-28
AU758161B2 (en) 2003-03-20
BG64680B1 (bg) 2005-11-30
HK1031895A1 (en) 2001-06-29
SK287039B6 (sk) 2009-10-07
WO1999002552A3 (en) 1999-04-01
US7198781B1 (en) 2007-04-03
WO1999002552A2 (en) 1999-01-21
CZ302488B6 (cs) 2011-06-15
HUP0002426A2 (hu) 2000-11-28
NO327397B1 (no) 2009-06-22
DE69836217D1 (de) 2006-11-30
ATE342915T1 (de) 2006-11-15
NO20000086D0 (no) 2000-01-07
KR100505172B1 (ko) 2005-08-03
EE05519B1 (et) 2012-02-15
PT991661E (pt) 2007-01-31
ES2271999T3 (es) 2007-04-16
AU8127198A (en) 1999-02-08
DE69836217T2 (de) 2007-08-23
CZ200075A3 (cs) 2000-08-16
IL122818A0 (en) 1998-08-16
CY1105895T1 (el) 2011-02-02
HU225855B1 (en) 2007-11-28
AR013201A1 (es) 2000-12-13
EP0991661A2 (en) 2000-04-12
SK62000A3 (en) 2000-07-11
CN1269835A (zh) 2000-10-11
JP4402288B2 (ja) 2010-01-20
IL133972A (en) 2015-07-30
US20070172455A1 (en) 2007-07-26
BR9812096B1 (pt) 2011-09-06
JP2001509371A (ja) 2001-07-24
BR9812096A (pt) 2000-07-18
CN1185348C (zh) 2005-01-19
EA200000109A1 (ru) 2000-08-28
NO20000086L (no) 2000-03-08
CA2295936C (en) 2009-05-26
PL338002A1 (en) 2000-09-25
CA2295936A1 (en) 1999-01-21
EA004793B1 (ru) 2004-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU758161B2 (en) Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein, analogs thereof and uses thereof
KR100319359B1 (ko) flt3수용체에대한리간드
KR100320106B1 (ko) 트롬보포이에틴폴리펩티드분비방법
PT772624E (pt) Interleucina-15
CZ307995A3 (en) Ligands for flt3 receptors
JP2010279365A (ja) 修飾したヒト胸腺ストローマ細胞リンホポエチン
EP1148065B1 (en) Fusion proteins comprising two soluble gp130 molecules
NZ238659A (en) Mast cell growth factor, recombinant production and isolated sequences
FI117054B (fi) Interleukiini-15:n valmistusmenetelmä ja sitä koodaava DNA-sekvenssi
MXPA00000364A (en) Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein, analogs thereof and uses thereof
JP3689111B2 (ja) インターロイキン１５
KR20000029998A (ko) 발현벡터,세포,그리고혈소판조혈인자를제조하는방법
CN101166757A (zh) 新的嵌合多肽及其应用
Yasukawa et al. Fusion protein of interleukin-6 and interleukin-6 receptor without a polypeptide linker
MXPA94003806A (en) Ligands for receivers f